CN105154065B

CN105154065B - 一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105154065B
Application number: CN201510511943.5A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 王建勇; 刘展榕; 任明光; 邓贝贝
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: CN105154065A

Abstract

本发明公开了一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的结构式如下：。上述探针的合成只需要两步，并且后处理过程相对简单，易于操作。实验证明：本发明的羟基自由基荧光探针可以选择性的识别羟基自由基，该过程属于荧光打开过程。本发明所述荧光探针的特性对于检测生物体和环境中的羟基自由基水平具有突出优点，并在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。

Description

一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

活性氧物种在人体内起着非常重要的生理功能，其主要和多种重大疾病存在着关联。羟基自由基(·OH)作为活性氧物种之一，其产生主要是在细胞新陈代谢下由氧气还原得到。羟基自由基可以使蛋白质和DNA损坏，因此，其和许多疾病相关，比如：炎症，胚胎畸形，细胞凋亡以及杀死微生物等。所以，研究对羟基自由基具有灵敏度和选择性强的检测方法具有非常重要的实际意义。

传统的羟基自由基的检测方法主要有：自旋捕集-电子自旋磁共振法、高效液相法、电化学检测法、分光光度法和荧光光度法等。而近年来随着有机小分子荧光探针的不断发展逐渐显现出特有的性质，比如：灵敏度高、操作简便、重现性好、膜透性好、原位检测等众多优点，使得有机小分子荧光探针日益成为现代环境监测和生命科学以及疾病诊断等领域不可缺少的研究手段，已被越来越多地应用于多种复杂生物、环境样品中的羟基自由基检测及成像分析。因此，发展新型的有机小分子荧光探针应用于羟基自由基的检测中具有较强的应用价值。

综合分析目前发展的羟基自由基检测的荧光探针，其主要存在以下不足：第一，为了提高选择性大多数羟基自由基探针在有机溶剂中或含有机溶剂的组分中检测，对在生物体和环境检测的实用性大大降低；第二，羟基自由基探针的检测都是根据某一特定波长的变化来进行，容易受外界因素的干扰；第三，多数羟基自由基探针在细胞中对羟基自由基的识别都是在较短波长下激发，难以实现较长波长激发。因此，发展新型的检测羟基自由基的荧光探针，可以完全避免以上缺点，具有显著的优势。对在生物体内和环境中羟基自由基的检测有着重要的研究价值和科学意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针，其特征在于，该探针化学结构式如式(I)所示：

一种上述羟基自由基荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1)将0.2mmol化合物1和0.2mmol化合物2在氮气氛围下加入至1.0mL的乙醇溶剂中，氮气保护下加热回流，反应6h，用TCL板检测反应，反应完全后，浓缩，柱层析得到化合物3，产率为90％；

2)将0.1mmol化合物3溶于2.0mL MeOH置于0℃下搅拌，将0.5mmol硼氢化钠分批逐滴加入上述溶液中，室温下反应5h，用TCL板检测反应，反应完全后，用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析，得到目标探针，简记为CCy-OH，产率80％；

本发明羟基自由基荧光探针的应用：该荧光探针可以应用于生物体和水环境中羟基自由基的含量传感检测；所述的传感检测主要为荧光检测。

本发明的优点在于：(1)探针的合成只需要两步，并且后处理过程相对简单，易于操作；(2)本发明实现了羟基自由基的选择性快速检测，并且选择性好，抗其它分子干扰能力强。此外，在一般紫外灯(365nm)下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性和显著的颜色变化，该试剂可作为检测细胞中内源性羟基自由基存在的专一性指示剂，能够清楚的实现细胞成像。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的羟基自由基的特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是探针CCy-OH的¹H NMR图谱；

图2是探针CCy-OH(10μmol/L)随着·OH的加入荧光谱图的变化情况，以DMF/PBS(1:1,v/v)为溶剂 510nm为激发光；

图3是探针CCy-OH(10μmol/L)对不同反应时间的荧光谱图的变化情况，以DMF/H₂O(1:1,v/v)为溶剂 510nm为激发光；

图4是探针CCy-OH对不同金属离子或分子的选择性柱状图数据，其中1:none；2:^.OH；3:Ca²⁺；4:Ca^2++.OH；5:CH₃CO₃H；6:CH₃CO₃H+^.OH；7:ClO^-；8:ClO^-+.OH；9:Co²⁺；10:Co²⁺+.OH；11:H₂O₂；12:^.OH；13:NO₂；14:NO₂+^.OH；15:Zn²⁺；16:Zn²⁺+.OH；

图5是探针CCy-OH针对外源性·OH的细胞成像图，其中a)探针浓度为10μM加入到Hela细胞中培养30min后明场图，b)·OH加入前荧光成像图，c)·OH(25equiv)加入后15min后的绿通道荧光成像图，d)明场与荧光成像图重合图片；

图6是探针CCy-OH针对内源性·OH的细胞成像图，其中a)Hela细胞在PMA作用下刺激12h后明场图，b)CCy-OH加入前荧光成像图，c)CCy-OH(20μM)加入后30min后的绿通道荧光成像图，d)明场与荧光成像图重合图片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物的号码。

实施例1：荧光探针CCy-OH的合成

合成路线如下：

1)将化合物1(0.2mmol,1.0equiv)和化合物2(0.2mmol,1.0equiv)在氮气氛围下加入至1.0mL的乙醇溶剂中，氮气保护下加热回流，反应6h。用TCL板检测反应，反应完全后，浓缩，柱层析，可得到化合物3，产率为90％。

2)将化合物3(0.1mmol,1.0equiv)溶于MeOH(2.0mL)置于0℃下搅拌，将硼氢化钠(0.5mmol,5equiv)分批逐滴加入上述溶液中，室温下反应5h，用TCL板检测反应，反应完全后，用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析，可以以80％的产率得到探针CCy-OH。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.10-8.07(m,2H),7.55-7.52(m,1H),7.48-7.44(m,1H),7.40-7.37m,3H),7.35-7.29(m,3H),7.25-7.21(m,2H),7.08-7.01(m,2H),6.80-6.72(m,2H),6.39(d,J＝7.6Hz,1H),6.29(dd,J＝15.6,5.2Hz,1H),4.49(d,J＝16.0Hz,1H),4.32-4.27(m,2H),4.14(d,J＝16.0Hz,1H),3.80(d,J＝9.2Hz,1H),1.87-1.80(m,2H),1.49-1.34(m,8H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H).

实施例2：探针CCy-OH随·OH的加入当量的增加荧光谱图的变化

取实施例1制备的CCy-OH荧光探针溶于DMF中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量^.OH标准溶液，用DMF/PBS(1:1,v/v)稀释至3mL(10μM)，测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图2可见，CCy-OH随着·OH的加入量增大荧光强度逐渐增强，当增大到一定程度时，荧光强度反而下降，主要是由于产活性氧物种可以对探针进行漂白。

实施例3：探针CCy-OH对随时间变化的荧光谱图的变化

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入·OH(25equiv)标准溶液，用MeOH/H₂O(1:1,v/v)稀释至3mL(10μM)，测量其荧光性质。荧光光谱如图3所示。由图3可见，加入探针CCy-OH后，直接加入已制备好的·OH，可以在0.5min内，荧光强度迅速达到最大，实现了·OH的快速检测。

实施例4：探针CCy-OH对不同分子或离子的选择性

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL分别加入到2只5mL的离心管当中，其中一只加入竞争的不同分子或离子标准溶液，另一只除加入竞争金属离子标准溶液外，再加入等摩尔量的·OH标准溶液，用DMF/PBS(1:1,v/v)稀释至3mL(10μM)，0.5min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由图4可以发现，其他分子或离子对探针CCy-OH的荧光几乎没有影响，而·OH的加入使探针CCy-OH的荧光显著增强，荧光光谱如图4所示。

实施例5：探针CCy-OH针对细胞外源性·OH的细胞成像

我们将本发明探针应用与Hela细胞中对外源性的·OH进行荧光成像应用(图5)具体操作步骤如下：将探针CCy-OH(10μM)的DMF溶液加入到育有Hela细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min后用共聚焦显微镜进行成像。首先进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓(图5a)。然后用蓝光进行激发观察在未加入过氧化氢前的荧光成像情况(图5b)，此时观察不到荧光发射。向体系中加入·OH(25equiv)，等待15min后在用蓝光进行激发可以观察到有绿光发出(图5c)，说明此荧光探针可以对外源性的羟基自由基进行荧光成像。

实施例6：探针CCy-OH针对细胞内源性·OH的细胞成像

我们将本发明探针应用与Hela细胞中对内源性的·OH进行荧光成像应用(图6)。具体操作步骤如下：将Hela细胞在PMA下刺激12h，然后使用共聚焦显微镜进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓(图6a)；用蓝光进行激发观察在未加入探针前的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射(图6b)；向体系中加入探针CCy-OH(20μM)的DMF溶液，等待30min后在用蓝光进行激发可以观察到有绿光发出(图6c)，说明此荧光探针可以对内源性的羟基自由基进行荧光成像。

Claims

1.一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针，其特征在于，该探针化学结构式如式（I）所示：

。

2.一种权利要求1所述的羟基自由基荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）将0.2 mmol化合物1 和0.2 mmol化合物2在氮气氛围下加入至1.0mL的乙醇溶剂中，氮气保护下加热回流，反应6h，用TCL板检测反应，反应完全后，浓缩，柱层析得到化合物3，产率为90%；

；

2）将0.1 mmol化合物3溶于2.0 mL MeOH置于0℃下搅拌，将0.5 mmol硼氢化钠分批逐滴加入上述溶液中，室温下反应5h，用TCL板检测反应，反应完全后，用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析，得到目标探针CCy-OH，产率80%；

。

3.一种权利要求1所述的羟基自由基荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针可以应用于生物体和水环境中羟基自由基的含量传感检测；所述的传感检测为荧光检测。