CN112679569B

CN112679569B - 一种荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112679569B
Application number: CN202011140799.6A
Authority: CN
Inventors: 冯丽恒; 牛燕; 王皓萍
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112679569A

Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。本发明制备的荧光探针在β‑半乳糖苷酶存在下荧光强度显著增强，对β‑半乳糖苷酶具有良好的选择性和灵敏性，并且可以应用到生物系统中，通过荧光成像对β‑半乳糖苷酶进行原位检测。所采用的制备方法操作简单，反应条件温和。

Description

一种荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，可以将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，并且在调控多种细胞功能和参与疾病发病机制中起着重要作用。高活性的β-半乳糖苷酶可通过水解糖苷键使氨基多糖的侧链与核心蛋白分离，导致大分子蛋白多糖的崩解，破坏基底膜和细胞外间质屏障，因此，其功能障碍可促进癌细胞的浸润和转移。同时，β-半乳糖苷酶是细胞衰老以及原发性卵巢癌中非常重要的生物标志物，检测其活性的动态变化可以为癌症诊断提供新的信息。

无论在基础生物学研究还是早期癌症诊断中，开发准确、快速、有效的方法对监测β-半乳糖苷酶水平都至关重要。现有的技术，如电化学、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、和正电子发射断层扫描(PET)都可以应用于对β-半乳糖苷酶的检测，但这些方法无法实现对生物系统中的β-半乳糖苷酶进行原位检测。荧光成像技术因其可对生物系统中的酶进行原位追踪而成为生物学研究的重要工具。因此，构建具有高灵敏度和选择性的β-半乳糖苷酶荧光探针，实现对内源性β-半乳糖苷酶的检测是本发明的宗旨。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，并将其应用于溶液中和活细胞中β-半乳糖苷酶的检测。该荧光探针对β-半乳糖苷酶具有良好的选择性和灵敏性，采用的方法操作简单、反应条件温和。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种荧光探针，其特征在于，该探针的结构式为：

进一步，所述的一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，将7-羟基香豆素-3-羧酸和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯加到耐压瓶中，抽真空通氮气，加入超干DMF，冰水浴搅拌均匀后，在氮气氛围下，加入1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯和N,N-二异丙基乙胺（DIEA），再次搅拌，将蒸馏水加到耐压瓶中，用乙酸乙酯萃取耐压瓶中的反应液，之后水洗乙酸乙酯以除去少量的DMF，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯，旋除乙酸乙酯，经柱色谱分离得到黄色固体化合物1，即7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺，反应式如下：

步骤2，将四丁基硫酸氢铵和K₂CO₃加入5 mL水中，再将步骤1所得化合物7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺和2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物溶于5 mL氯仿，然后依次将所得水溶液和氯仿溶液加入圆底烧瓶中，进行搅拌反应，反应结束后，加入二氯甲烷进行稀释，并用水洗，用无水硫酸钠干燥，旋除二氯甲烷，经柱色谱分离得到黄色固体化合物2，即2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺，反应式如下：

步骤3，将CH₃ONa的甲醇溶液加入步骤2所得化合物2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺的甲醇溶液中，进行搅拌反应，反应结束后，旋除溶剂，用正己烷洗涤固体，干燥，得到黄色固体化合物3，即2-氧代-7-（（β-D-吡喃半乳糖基）氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺，反应式如下：

进一步，所述步骤1中的7-羟基香豆素-3-羧酸的用量为206.2 mg，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的用量为570.4 mg，超干DMF的用量为2 mL，1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯的用量为347.5 mg ，N,N-二异丙基乙胺（DIEA）的用量为387.8 mg，蒸馏水的用量为50 mL。

所述步骤1中通氮气的次数为3次，搅拌时间为0.5 h，再次搅拌温度为室温，搅拌时间过夜，萃取次数为3次，柱色谱分离用二氯甲烷:乙酸乙酯= 50:1过柱。

进一步，所述步骤2中的四丁基硫酸氢铵的用量为67.9 mg，K₂CO₃的用量为55.3mg，化合物7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺的用量为107.1 mg，2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物的用量为164.5 mg，二氯甲烷的用量为50 mL。

所述步骤2中搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为24 h，水洗次数为3次，柱色谱分离用石油醚:乙酸乙酯= 4:1过柱。

进一步，所述步骤3中的CH₃ONa的甲醇溶液的浓度为0.03mol/L，用量为2 mL，化合物2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺的甲醇溶液的浓度为0.012mol/L，用量为5mL，搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为1 h。

更进一步，所述荧光探针应用于溶液中的β - 半乳糖苷酶检测以及活细胞中β -半乳糖苷酶原位检测的步骤如下：

1.用于溶液中β - 半乳糖苷酶检测：

（1）将制备的荧光探针溶于DMSO中，制成10 mmol/L的荧光探针储备液；将β-半乳糖苷酶溶于10×PBS中，制备120 U/mL的储备液；

（2）取荧光探针的储备溶液到10×PBS中，使其浓度为10 μmol/L，随后加入β-半乳糖苷酶的储备溶液，最终浓度为3 U/mL，30 min后在荧光光谱仪上测试。对照组为不加β-半乳糖苷酶的10 μmol/L荧光探针溶液。

2.用于活细胞中β - 半乳糖苷酶的原位检测：

（1）将制备的荧光探针溶于DMSO中，制成10 mmol/L的荧光探针储备液；

（2）将培养好的SHIN3细胞接种到共聚焦培养皿中，每皿约10⁵个细胞，37 ℃，5%CO₂培养箱中培养24 h使细胞贴壁，弃去旧的培养基，然后加入含10 μmol/L荧光探针的无FBS的培养基，对照组为不加荧光探针的新鲜培养基，培养2 h后，弃去培养基，1×PBS洗三次，用荧光倒置显微镜成像。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明的荧光探针制备方法操作简单、反应条件温和，对β-半乳糖苷酶具有良好的选择性和灵敏性（检测限为8.4×10^-5U/mL），不仅可以用于检测溶液中的β-半乳糖苷酶，还具有良好的生物相容性，可以应用于生物系统中，通过荧光成像对β-半乳糖苷酶进行原位检测，有助于基础生物学研究和早期癌症的诊断。

附图说明

图1 为本发明荧光探针对不同酶或小分子的选择性柱状图，其中横坐标0-16分别代表：空白组，K⁺，Mg²⁺，NaNO₂，葡萄糖，H₂O₂，谷氨酸，葡萄糖氧化酶， DNase I，甘氨酸，胰蛋白酶，溶菌酶，GSH，Cys，NaHS ，NaClO，β-半乳糖苷酶；

图2 为本发明荧光探针的荧光发射强度随β - 半乳糖苷酶浓度变化的荧光图谱；

图3为本发明荧光探针的荧光发射强度随β - 半乳糖苷酶浓度变化的荧光线性图；

图4为本发明荧光探针在β - 半乳糖苷酶加入前后紫外灯下颜色对比图；

图5 为本发明荧光探针的细胞成像图；

图6为本发明荧光探针对SHIN3细胞毒性测试图。

具体实施方式

实施例1

荧光探针的制备，包括如下步骤：

1. 在15 mL的耐压瓶中加入化合物7-羟基香豆素-3-羧酸（206.2 mg，1.0 mmol）和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（570.4 mg，1.5 mmol），抽真空通氮气三次，再加入2 mL超干DMF，冰水浴中搅拌，反应0.5 h，加入化合物1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯（347.5 mg，1.0 mmol）和 N,N-二异丙基乙胺（DIEA）（387.8 mg，3.0mmol），室温搅拌过夜。反应完成后，将50 mL蒸馏水加到耐压瓶中，用乙酸乙酯萃取耐压瓶中的反应液3次，之后水洗乙酸乙酯以除去少量的DMF，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯相，旋除乙酸乙酯，用二氯甲烷:乙酸乙酯= 50:1过柱，得到黄色固体化合物1，即7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺（316.0 mg，产率为59.0 %）。化合物1的检测数据如下：¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.15 (s, 1H), 10.59 (s, 1H), 8.83(s, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.49 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.07-7.18 (m, 9H), 6.88-7.00(m, 9H), 6.84 (s, 1H)。反应式为：

2. 将四丁基硫酸氢铵（TBAHS）（67.9 mg，0.2 mmol）和K₂CO₃（55.3 mg，0.4 mmol）溶于5 mL水中，再将步骤1所得化合物7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺（107.1 mg，0.2 mmol）和2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物（164.5 mg，0.4 mmol）溶于5mL氯仿，然后依次将所得水溶液和氯仿溶液加入50 mL的圆底烧瓶中，室温搅拌反应24 h。反应结束后，加入50 mL二氯甲烷进行稀释，并用水洗3次，用无水硫酸钠干燥，旋除二氯甲烷，用石油醚:乙酸乙酯= 4:1过柱，得到黄色固体化合物2，即2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺（142.2 mg，产率82.1 %）。

化合物2的检测数据如下：¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.56 (s, 1H), 8.87(s, 1H), 7.99 (d, 1H), 7.50 (d, 2H), 7.06-7.20 (m,11H), 6.95-7.01 (m, 8H),5.73 (s, 1H),5.39 (s, 1H),5.28 (s, 2H), 4.54 (s, 1H), 4.13 (s, 2H), 1.96-2.15(m, 12H)。反应式为：

3. 在50 mL的圆底烧瓶中加入5mL化合物2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺（54.2 mg，0.06 mmol）的甲醇溶液，再将CH₃ONa(3.4 mg，0.06 mmol) 溶于2 mL甲醇中，加入到圆底烧瓶中，室温搅拌1 h进行反应。反应结束后，旋除溶剂，用正己烷洗涤固体，干燥，得到黄色固体化合物3，即2-氧代-7-（（β-D-吡喃半乳糖基）氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺（33.5 mg，产率80.0 %）。化合物3的检测数据如下：¹H NMR(600 MHz, DMSO) δ 10.58 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.50 (d, 2H),7.10-7.15 (m, 11H),7.01-6.95 (s, 8H), 5.33 (s, 1H), 5.07 (d, 2H), 4.72 (s,1H), 4.63 (s, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.63 (s, 1H), 3.53 (s, 2H), 3.43 (s, 1H).MALDI-TOF-MS for C₄₂H₃₅NO₉ [M+Na]⁺ m/z 720.8。反应式为：

实施例2

荧光探针选择性测试

将实施例1中制备的荧光探针溶于DMSO中，制备成10 mmol/L的荧光探针储备液。将β-半乳糖苷酶溶于10×PBS中，制备120 U/mL的储备液。将探针的储备溶液用10×PBS稀释至10 μmol/L，取2 mL于四通的比色皿中，分别向其中加入下列酶或小分子：K⁺，Mg²⁺，NaNO₂，葡萄糖，H₂O₂，谷氨酸，葡萄糖氧化酶， DNase I，甘氨酸，胰蛋白酶，溶菌酶，GSH，Cys，NaHS ，NaClO，β-半乳糖苷酶，使酶或小分子的最终浓度为3 U/mL（酶）或100 μmol/L（小分子）， 30 min后，获得荧光发射光谱（激发为380 nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为5.0nm）。如图1的柱状图所示，只有在加入β-半乳糖苷酶后，在波长为445nm处，荧光强度会有显著的增强，说明本发明荧光探针对β-半乳糖苷酶具有很高的选择性。

实施例3

荧光探针在不同浓度的β-半乳糖苷酶存在下的荧光变化

将β-半乳糖苷酶储备液加入荧光探针储备液中，用10×PBS稀释，使荧光探针的最终浓度为10 μmol/L，β-半乳糖苷酶的最终浓度为0 - 3 U/mL，30 min后，获得荧光发射光谱（激发为380 nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为5.0 nm）。如图2所示的荧光光谱图，随着β-半乳糖苷酶浓度的增加，在波长为445 nm处荧光强度逐渐增强，最后趋于稳定。经计算，检测限为8.4×10^-5U/mL，说明本发明荧光探针具有高灵敏性。

检测限计算过程如下：

其中，s为线性回归方程的斜率，如图3所示，在β-半乳糖苷酶浓度为0 - 0.4 U/mL时有一个良好的线性关系，斜率为：17308.17。σ定义为

表示空白组的荧光强度平均值，x_i表示空白组的荧光强度值，n表示空白组的测量次数。

实施例4

溶液中荧光探针对β - 半乳糖苷酶的检测的实物图过程：

（1）将制备的荧光探针溶于DMSO中，制成10 mmol/L的荧光探针储备液；将β-半乳糖苷酶溶于10×PBS中，制备120 U/mL的储备液。

（2）取荧光探针的储备溶液到10×PBS中，使其浓度为10 μmol/L，随后加入β-半乳糖苷酶的储备溶液，最终浓度为3 U/mL，对照组为不加β-半乳糖苷酶10 μmol/mL的荧光探针。30 min后，在365 nm的紫外灯下照射。如图4所示，紫外灯照射下，加入β-半乳糖苷酶后，发出蓝色荧光。

实施例5

活细胞中β - 半乳糖苷酶的荧光探针原位检测：

（1）将制备的荧光探针溶于DMSO中，制成10 mmol/LM的荧光探针储备液；

（2）将培养好的SHIN3细胞铺在共聚焦细胞皿中，每皿约10⁵个细胞，37℃，5% CO₂培养箱中培养24 h使细胞贴壁，弃去旧的培养基。然后加入含10 μmol/mL荧光探针的无FBS的培养基，对照组为不加荧光探针的新鲜培养基，培养2 h后，弃去培养基，1×PBS洗三次，用荧光倒置显微镜成像。测试结果见图5，SHIN3与荧光探针共同培养后，405 nm激发下，细胞发出蓝色的荧光，对照组细胞无蓝色荧光。

实施例6

细胞毒性实验

将培养好的SHIN3细胞铺在96孔板中，每孔约7000个细胞，37℃，5% CO₂培养箱中培养24 h使细胞贴壁，弃去旧的培养基，加入不同浓度的荧光探针(最终浓度分别为2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)的培养基。继续培养12 h后，弃去培养基，每孔加入10 μL的浓度为5 mg/mL的MTT溶液和90 μL新鲜培养基的混合溶液，再继续培养4 h后，弃去培养基，每孔加入100 μL DMSO，将其放入酶标仪中，震荡2 min，测得每孔在490 nm处的吸光度值。计算细胞活力（CR），计算方法为：

CR=A/A0×100%

其中A为荧光探针处理的实验组细胞的吸光度值，A0为不加荧光探针的对照组细胞的吸光度值。测试结果见图6，说明本发明荧光探针具有良好的生物相容性。

Claims

1.一种荧光探针，其特征在于，该探针的结构式为：

。

2.权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将7-羟基香豆素-3-羧酸和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯加到耐压瓶中，抽真空通氮气，加入超干DMF，冰水浴搅拌均匀后，在氮气氛围下，加入1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯和N,N-二异丙基乙胺（DIEA），再次搅拌，将蒸馏水加到耐压瓶中，用乙酸乙酯萃取耐压瓶中的反应液，之后水洗乙酸乙酯以除去少量的DMF，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯，旋除乙酸乙酯，经柱色谱分离得到黄色固体化合物1，即7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺；

步骤2，将四丁基硫酸氢铵和K₂CO₃溶于5 mL水中，再将步骤1所得化合物7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺和2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物溶于5 mL氯仿，然后依次将所得水溶液和氯仿溶液加入圆底烧瓶中，进行搅拌反应，反应结束后，加入二氯甲烷进行稀释，并用水洗，用无水硫酸钠干燥，旋除二氯甲烷，经柱色谱分离得到黄色固体化合物2，即2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺；

步骤3，将CH₃ONa的甲醇溶液加入步骤2所得化合物2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺的甲醇溶液中，进行搅拌反应，反应结束后，旋除溶剂，用正己烷洗涤固体，干燥，得到黄色固体化合物3，即2-氧代-7-（（β-D-吡喃半乳糖基）氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺。

3.根据权利要求2一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的7-羟基香豆素-3-羧酸的用量为206.2 mg，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的用量为570.4 mg，超干DMF的用量为2 mL，1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯的用量为347.5mg ，N,N-二异丙基乙胺（DIEA）的用量为387.8 mg，蒸馏水的用量为50 mL。

4.根据权利要求2一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中通氮气的次数为3次，搅拌时间为0.5 h，再次搅拌温度为室温，搅拌时间过夜，萃取次数为3次，柱色谱分离用二氯甲烷:乙酸乙酯= 50:1过柱。

5.根据权利要求2一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的四丁基硫酸氢铵的用量为67.9 mg，K₂CO₃的用量为55.3 mg，化合物7-羟基-2-氧代-N-（4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺的用量为107.1 mg，2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物的用量为164.5 mg，二氯甲烷的用量为50 mL。

6.根据权利要求2一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为24 h，水洗次数为3次，柱色谱分离用石油醚:乙酸乙酯= 4:1过柱。

7.根据权利要求2一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的CH₃ONa的甲醇溶液的浓度为0.03 mol/L，用量为2 mL，化合物2-氧代-7-（（2 ,3 ,4 ,6-四乙酰氧基-（alpha-D-吡喃半乳糖基））氧基）-N-（4-（ 1,2,2-三苯基乙烯基）苯基）-2H-色烯-3-羧酰胺的甲醇溶液的浓度为0.012mol/L，用量为5mL，搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为1h。

8.根据权利要求1所述的荧光探针或权利要求2~7任一项所述方法制备得到的荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针用于溶液中β - 半乳糖苷酶的检测以及活细胞中β -半乳糖苷酶的原位检测。

9.根据权利要求8一种荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针用于溶液中β - 半乳糖苷酶检测的步骤如下：

步骤1，将制备的荧光探针溶于DMSO中，制成10 mmol/L的荧光探针储备液；将β-半乳糖苷酶溶于10×PBS中，制备120 U/mL的储备液；

步骤2，取荧光探针的储备溶液到10×PBS中，使其浓度为10 μmol/L，随后加入β-半乳糖苷酶的储备溶液，最终浓度为3 U/mL，30 min后在荧光光谱仪上测试；对照组为不加β-半乳糖苷酶的10 μmol/L荧光探针溶液。

10.根据权利要求8一种荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针用于活细胞中β -半乳糖苷酶原位检测的步骤如下：

步骤1，将制备的荧光探针溶于DMSO中，制成10 mmol/L的荧光探针储备液；

步骤2，将培养好的SHIN3细胞接种到共聚焦培养皿中，每皿约10⁵个细胞，37 ℃，5% CO₂培养箱中培养24 h使细胞贴壁，弃去旧的培养基，然后加入含10 μmol/L荧光探针的无FBS的培养基，对照组为不加荧光探针的新鲜培养基，培养2 h后，弃去培养基，1×PBS洗三次，用荧光倒置显微镜成像。