CN114891054B - 一种镧系荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种镧系荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种镧系荧光探针及其制备方法和应用。该镧系荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示：其中，所述Ln为镧系金属元素；所述A选自或中的至少一种。本发明的镧系荧光探针与β‑半乳糖苷酶发生特异性反应，所述荧光探针的糖苷键可以识别β‑半乳糖苷酶，生成具有荧光属性的取代物，属于off‑on型荧光反应，从而实现复杂生物样品中β‑半乳糖苷酶含量的快速检测，具有较好的实用性、较高的检测灵敏度和较低的细胞毒性。

Description

一种镧系荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种镧系荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
光学成像工具是研究和理解从分子水平到整个生物体的复杂生物过程不可或缺的分析手段。小分子荧光团具有特别重要的意义，因为它们很容易调整和修饰，以结合特定的分子进而发挥特定功能，用于动态监测和测定生物活性。在这一背景下，发光稀土配合物受到了人们的广泛关注，因为它们比传统的有机荧光团具有一些固有的优势，使得它们在生物传感和生物成像等未来的医学应用中具有很好的应用前景。这些特点包括避免光谱串扰的大斯托克斯位移、允许时间选通检测而不受背景荧光干扰的长寿命发射、比较高的光稳定性以及允许比率分析的发射波长能够在可见光到近红外的范围内调节，以及依赖于镧系元素的指纹状发射波段。
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)作为一种典型的酶，由LacZ基因编码，因其作为食品添加剂的广泛应用和在生命活动中的重要功能而备受关注。它负责将β-D半乳糖苷水解成葡萄糖和半乳糖，并参与半乳糖转化反应。β-半乳糖苷酶是一种常用的检测转录和转染效率的酶。它也是细胞衰老和原发性卵巢癌非常重要的生物标志物。β-半乳糖苷酶缺乏可导致β-半乳糖苷血症或Morquio B综合征。它是多种生理和病理活动的重要标志物。例如，在真核细胞中，β-半乳糖苷酶的上调表达是细胞衰老的标志。因此，动态监测β-半乳糖苷酶的浓度和活性变化具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种镧系荧光探针。
本发明还提供了一种镧系荧光探针的制备方法。
本发明还提供了一种镧系荧光探针的应用。
本发明的第一方面提供了一种镧系荧光探针，所述镧系荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，所述Ln为镧系金属元素；
所述A选自中的至少一种。
本发明关于镧系荧光探针的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
本发明结构式的镧系荧光探针与β-半乳糖苷酶发生特异性反应，所述荧光探针的糖苷键可以识别β-半乳糖苷酶，生成具有荧光属性的取代物，属于off-on型荧光反应，从而实现复杂生物样品中β-半乳糖苷酶含量的快速检测，具有较好的实用性和较高的检测灵敏度。
本发明的镧系荧光探针含有类香豆素结构，对细胞毒性较小，且具有良好的生物相容性。本发明中的镧系荧光探针反应的检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可采用时间分辨技术用于各种生物体系中β-半乳糖苷酶的定量测定。
根据本发明的一些实施方式，所述镧系金属元素选自铥、铽、镝、铕、钐、镱、钕或铒中的至少一种。
本发明的第二方面提供一种镧系荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
S1、将化合物16与乙醇钠在第一有机溶剂中进行反应，得到第一中间体；
S2、将第一中间体与镧系化合物在乙腈中混合，调节pH值至6～6.5，反应2～5h，即得式(Ⅰ)化合物；化合物16的结构式如下：
根据本发明的一些实施方式，所述pH值通过加入碱性物质调节。
根据本发明的一些实施方式，所述碱性物质包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氧化钠或碳酸氢钠中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第一有机溶剂包括乙醇、甲醇或乙二醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物16通过如下方法制备：
将化合物15、哌啶、丙二酸二乙酯加入到第二有机溶剂中，在60～90℃下反应4～8h，即得化合物16；
所述化合物15的结构式如下：
根据本发明的一些实施方式，所述第二溶剂选自乙醇、甲醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物15通过如下方法制备：
将化合物14、甲磺酰氯和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)加入到第三有机溶剂中进行反应，得到第二中间体；
将第二中间体、化合物13和无机碱加入到第四有机溶剂中，在30～60℃下反应，得到化合物15；
所述化合物14和化合物13的结构式如下：
根据本发明的一些实施方式，所述第三有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或DMF中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第四有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或DMF中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，与第三溶剂混合后的反应温度为0～5℃。
根据本发明的一些实施方式，所述无机碱选自碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物14通过如下方法制备：
在保护气氛下，将化合物12、化合物11、铂催化剂、铜盐和DIPEA与第五有机溶剂在30～55℃下反应，即得化合物14；
所述化合物12和化合物11的结构式如下：
根据本发明的一些实施方式，所述铂催化剂选自Pd(PPh3)4和Pd(PPh3)4Cl2中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述铜盐选自CuI、CuCl中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第五有机溶剂选自四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷或DMF中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述保护气氛为氮气、氩气、氖气中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物12通过如下方法制备：
将化合物10、甲磺酰氯、DIPEA与第六有机溶剂混合反应，得到第三中间体；
将所述第三中间体、无机碱、化合物9与第七有机溶剂进行反应，得到化合物12；
所述化合物10和化合物9的结构式如下：
根据本发明的一些实施方式，所述第六有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或DMF中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第七有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃或DMF中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第六有机溶剂混合反应的温度为0～5℃。
根据本发明的一些实施方式，所述第七有机溶剂进行反应的温度为30～60℃。
本发明的第三方面提供所述镧系荧光在检测β-半乳糖甘酶中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述镧系荧光探针的浓度为1～20μM。
附图说明
图1是本发明实施例1中的化合物12的核磁共振氢谱图；
图2是本发明实施例1中的化合物12的核磁共振碳谱图；
图3是本发明实施例1中的化合物14的核磁共振氢谱图；
图4是本发明实施例1中的化合物14的核磁共振碳谱图；
图5是本发明实施例1中的化合物16的核磁共振氢谱图；
图6是本发明实施例1中的化合物16的核磁共振碳谱图；
图7是本发明实施例1的式(Ⅰ)化合物在不同pH值的荧光光谱图；
图8是本发明实施例1的不同浓度的式(Ⅰ)化合物的荧光光谱图；
图9是本发明实施例1的式(Ⅰ)化合物的细胞毒性图；
图10是本发明实施例1的式(Ⅰ)化合物与β-半乳糖苷酶的线性关系图；
图11是本发明实施例1的式(Ⅰ)化合物的特异选择性荧光光谱图；
图12是在抑制剂D-gal条件下本发明实施例1的式(Ⅰ)化合物测试β-半乳糖苷酶的荧光光谱图；
图13是在抑制剂ONPG条件下本发明实施例1的式(Ⅰ)化合物测试β-半乳糖苷酶的荧光光谱图；
图14是对比例1的化合物检测β-半乳糖苷酶的荧光光谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下实施例及对比例中采用的原料如下：
HeLa细胞：广州剪刀手基因科技有限公司；
OVCAR-3细胞：广州剪刀手基因科技有限公司；
化合物9：4-溴-2-羟基苯甲醛，CAS号22532-62-3，上海毕得医药股份有限公司；
化合物10：向1,4,7,10-四氮杂环十二烷(4.0g，23.22mmol)在CH3CN(150mL)的溶液中加入NaHCO3(19.50g，232.20mmol)。在室温下滴加2-溴-N-(叔丁基)乙酰胺4(13.97g，72.50mmol),将反应混合物在室温搅拌24小时，滤出固相并用CH3CN洗涤数次。合并有机相，除去溶剂，得到淡黄色固体。将固体溶解在250mL水中并用1M NaOH水溶液将溶液的pH调节至8。水相用DCM(3×50mL)洗涤。然后用1M NaOH水溶液将溶液的pH值调节至13，并用DCM(5×50mL)萃取。合并有机相，除去溶剂，将所得固体用水重结晶，真空干燥，得到化合物10(5.00g，42.3％产率)。
化合物11：向(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)甲醇(8.00g，38.96mmol)在250mL DCM中的溶液中滴加TBAF(14.26g，54.46mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。加入350mL水并用DCM(500mL x 3)萃取，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤并通过硅胶色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯(2:1，v/v)作为洗脱剂，得到化合物11(4.89g，94.3％产率)。
化合物13：将氧化银(5.64g，24.0mmol)和4-羟基苯甲醛(1.63g，13.0mmol)添加到α-D吡喃半乳糖基溴(5g，12.0mmol)的乙腈(125mL)溶液中。将混合物在室温搅拌16小时，在硅藻土上过滤并用EtOAc洗涤。将滤液真空浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化(EtOAc-庚烷3:7)，为白色粉末(3.27g，60％)。在0℃将硼氢化钠(1.85g,48.6mmol)分批添加到白色粉末(10.1g，22.2mmol)在CHCl3-iPrOH(250mL:80mL)中的冷却溶液中。使溶液达到室温并搅拌3小时，加入柠檬酸水溶液(10％(w/w)，250mL)。在用NaHCO3溶液(10％(w/w)，3x150mL)和水(150mL)洗涤后，有机相用MgSO4干燥。真空蒸发溶剂，残余物通过硅胶快速色谱法纯化(EtOAc-庚烷5:5)，得到化合物13(7.93g，78％)。
实施例1
实施例1提供一种镧系荧光探针，结构式如式(Ⅰ)所示，制备方法如下：
S1、在0℃下，将化合物10(1.54g，3.39mmol)，甲磺酰氯(0.662mL，8.48mmol)和DIPEA(5.8mL，33.9mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中。撤去冰浴，将混合溶液在室温下搅拌半个小时，然后用饱和NaHCO3溶液、饱和NH4Cl溶液和盐水依次进行洗涤。有机层使用无水硫酸钠干燥并真空减压蒸馏浓缩，得到第三中间体，不需要进一步的纯化直接作为下一步反应的原料。将第三中间体溶解在干燥的乙腈溶液中，然后向溶液中加入化合物9(0.477g，2.37mmol)和无水K2CO3(4.69g，33.9mmol)。将混合物溶液在50℃下搅拌12个小时。用滤纸过滤溶液并用乙酸乙酯洗涤。浓缩有机滤液，并通过氧化铝色谱柱进行纯化，得到淡黄色固体产物即为化合物12(1.36g，2.14mmol，63％)；1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ10.42(s,1H),7.70(d,J＝8.2Hz,1H),7.38(d,J＝8.6Hz,2H),7.24(s,1H),7.20(d,J＝8.3Hz,1H),7.06(d,J＝8.6Hz,2H),5.51(dd,J＝10.5,7.9Hz,1H),5.47(d,J＝3.4Hz,1H),5.16–5.12(m,1H),5.12(s,2H),5.10(d,J＝7.9Hz,1H),4.24(dd,J＝11.3,7.0Hz,1H),4.17(dd,J＝11.3,6.3Hz,1H),4.10(t,J＝6.6Hz,1H),2.19(s,3H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),2.02(s,3H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ188.68,170.39,170.29,170.17,169.44,161.04,157.01,130.50,130.15,129.69,129.18,124.57,123.96,117.17,116.59,99.44,71.06,70.79,70.41,68.57,66.84,61.35,22.65,20.76,20.68,20.61.
S2、在氮气保护的环境中，将化合物12(1.96g，3.08mmol)，化合物11(0.137g，1.03mmol)，Pd(PPh3)4(0.036g，3mol％)，CuI(0.006g，3mol％)和DIPEA(0.249g，1.93mmol)溶解在四氢呋喃中，45℃加热下搅拌18小时。用滤纸过滤并用乙酸乙酯洗涤。滤液通过减压蒸馏，在真空下浓缩并通过硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝2:1)，得到化合物14(0.285g，0.41mmol，40％)；1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ10.49(s,1H),8.58(d,J＝5.2Hz,1H),7.86(d,J＝8.2Hz,1H),7.45(s,1H),7.42–7.39(m,2H),7.33(dd,J＝5.1,1.5Hz,1H),7.23(dd,J＝4.4,3.0Hz,2H),7.08–7.05(m,2H),5.51(dd,J＝10.4,7.9Hz,1H),5.49–5.46(m,1H),5.17(s,2H),5.14(dd,J＝10.4,3.4Hz,1H),5.10(d,J＝8.0Hz,1H),4.80(s,2H),4.25(dd,J＝11.3,6.9Hz,1H),4.17(dd,J＝11.3,6.4Hz,1H),4.12–4.09(m,1H),2.09(s,3H),2.06(s,3H),2.03(s,3H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ188.90,170.43,170.30,170.21,169.46,160.50,159.59,156.97,148.73,131.27,130.38,129.26,129.12,128.67,125.28,124.72,124.23,122.42,117.19,116.05,99.46,92.75,89.92,71.06,70.80,70.27,68.57,66.81,64.13,61.31,29.72,20.79,20.71,20.63.
S3、使用冰浴在0℃下，将化合物14(0.15g，0.22mmol)，甲磺酰氯(0.063mL，0.55mmol)和DIPEA(0.383mL，2.2mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中。待原料混合均匀之后停止冰浴并逐渐恢复到室温，在室温下继续搅拌半个小时，采用薄层色谱法监测反应进展。待化合物14反应完全后，将混合溶液转移到分液漏斗中，用饱和NaHCO3溶液、饱和NH4Cl溶液和饱和NaCl溶液依次对二氯甲烷有机相进行洗涤，采用无水硫酸钠干燥二氯甲烷有机相并真空减压浓缩，得到第二中间体，不需要进一步的纯化直接用作下一步的反应原料。将第二中间体溶解在干燥的乙腈溶液中，然后向溶液中加入化合物13(0.082g，0.2mmol)和无水K2CO3(0.304g，2.2mmol)。将混合物溶液在50℃下搅拌12个小时。用滤纸过滤溶液并用乙酸乙酯洗涤。浓缩有机滤液，并通过氧化铝色谱柱进行纯化，得到化合物15(0.114g，0.096mmol，60％).1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ10.50(d,J＝0.8Hz,1H),8.61(dd,J＝5.0,0.8Hz,1H),7.87(d,J＝7.9Hz,1H),7.43–7.40(m,3H),7.33(dd,J＝5.0,1.5Hz,1H),7.27(d,J＝1.3Hz,1H),7.25–7.23(m,1H),7.07(d,J＝8.6Hz,2H),5.51(dd,J＝10.5,7.9Hz,1H),5.48(dd,J＝3.5,1.2Hz,1H),5.18(s,2H),5.15–5.12(m,1H),5.10(d,J＝7.9Hz,1H),4.27–4.23(m,1H),4.17(dd,J＝11.3,6.4Hz,1H),4.12–4.09(m,1H),3.83(s,2H),3.13(d,J＝11.9Hz,6H),2.87(s,12H),2.78(t,J＝5.4Hz,4H),2.20(s,3H),2.09(s,3H),2.07(s,3H),2.03(s,3H),1.36(s,27H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ170.39,170.27,170.16,169.79,169.66,169.45,166.54,164.07,158.15,156.90,156.82,149.51,136.83,131.35,130.79,129.16,128.85,127.22,125.22,125.16,124.61,124.21,124.06,117.12,115.29,99.55,93.53,88.37,71.05,70.83,70.15,68.60,66.85,61.68,61.65,61.33,60.66,60.28,60.07,53.12,52.98,52.34,52.03,50.98,50.87,28.90,20.78,20.69,20.61,14.14,13.94.
S4、将化合物15(0.159g，0.134mmol)，哌啶(0.164ml，1.8mmol)和丙二酸二乙酯(1.03g，6.42mmol)溶解在乙醇(40mL)中，在80℃加热下搅拌6个小时，然后进行真空减压蒸馏。将残留的有机溶液溶解在3mL的乙腈中，通过全制备液质联用仪对乙腈溶液进行纯化，获得固体产物即为化合物16(0.130g，0.098mmol，73％).1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.58(d,J＝5.1Hz,1H),8.10(s,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),7.38(d,J＝2.4Hz,1H),7.30(dd,J＝5.1,1.5Hz,1H),7.28(s,1H),7.13(d,J＝7.6Hz,2H),7.12–7.09(m,1H),7.06–7.04(m,2H),5.51(dd,J＝10.5,7.9Hz,1H),5.47(dd,J＝3.5,1.1Hz,1H),5.12(d,J＝2.8Hz,2H),5.09(d,J＝7.9Hz,1H),4.31(d,J＝7.1Hz,2H),4.29(d,J＝7.2Hz,2H),4.25–4.22(m,1H),4.18(t,J＝5.6Hz,1H),4.11–4.08(m,1H),3.81(s,2H),3.06(d,J＝6.5Hz,6H),2.87–2.74(m,16H),2.20(s,3H),2.09(s,3H),2.07(s,3H),2.03(s,3H),1.36(s,27H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ170.39,170.27,170.16,169.79,169.66,169.45,166.54,164.07,158.15,156.90,156.82,149.51,136.83,131.35,130.79,129.16,128.85,127.22,125.22,125.16,124.61,124.21,124.06,117.12,115.29,99.55,93.53,88.37,71.05,70.83,70.15,68.60,66.85,61.68,61.65,61.33,60.66,60.28,60.07,53.12,52.98,52.34,52.03,50.98,50.87,28.90,20.78,20.69,20.61,14.14,13.94.
S5、在10mL的烧瓶中以无水乙醇(3mL)作为溶剂，将化合物16(0.008g，0.006mmol)充分溶解在乙醇中，用针筒逐滴加入乙醇钠溶液(8.2μl，0.012mmol)。在室温下搅拌半个小时，待反应完成后，加入3mL水终止反应。真空减压蒸馏除去溶剂，得到第一中间体。将第一中间体用乙腈/H2O(4mL，v:v＝1:1)混合溶剂溶解，之后加入六水合氯化铕(6mg，0.016mmol)，使用NaOH溶液(0.4M)将溶液调整到6.0-6.5的pH值范围内，并在室温下搅拌4h。反应完成后，真空减压蒸馏除去溶剂，将残留的溶液溶解在1mL的乙腈中，通过全制备液质联用仪对乙腈溶液进行纯化，即得式(Ⅰ)化合物(4mg，0.0031mmol，55％)。EI-MS(m/z)[M–H2O+HCOO-]2+ calcd for C61H90EuN8O15,677.28,found:677.33.
其中，化合物9～16和式(I)的结构式如下：
对比例1
对比例1提供一种类似结构的化合物，其结构式如式(Ⅱ)所示：
该制备方法同实施例1，其区别在于，实施例1中的化合物10的结构替换成
实验例1
将实施例1制备的镧系荧光用于在不同pH值缓冲液中进行测试荧光强度，其测试方法如下：
使用超纯水作为溶剂制备式(Ⅰ)化合物的储备溶液(1mM)。通过添加20μL的储备溶液(1mM)到含有2mL PBS缓冲液(0.1mM)的1cm×1cm石英比色皿中来制备10μM的工作溶液。通过加入NaOH(0.1M)或HCl(0.2M)调节溶液的pH值。使用PBS缓冲液(0.1mM)制备1000U/mLβ-半乳糖苷酶的储备溶液。
具体：其中图7中的a表示为：调整在PBS缓冲溶液探针式(Ⅰ)化合物(10μM)pH值为4.0-9.0后，等待15min后测定的荧光光谱图；图7中的b表示为：调整在PBS缓冲溶液探针式(Ⅰ)化合物(10μM)pH值为4.0-9.0后，加入β-半乳糖苷酶(3U/mL)，等待15min后测定荧光光谱；
结果如图7所示，PBS缓冲液的pH值在4～9之间变化，均具有较好的荧光强度，说明探针适合用于生理环境下的测试。
实验例2
实验例2探究了实施例1制备的镧系荧光探针与β-半乳糖苷酶作用的反应动力学，其测试方法如下：
使用pH值为7.4的PBS缓冲液(0.1mM)，制备不同浓度的LDEu01探针溶液(1,5,10，20μm)。各自加入β-葡萄糖苷酶使其最终浓度为3U/ml。测定在激发光为356nm下，0-15min内LDEu01探针溶液的荧光强度变化。初始反应速率由线性响应范围内的数据确定，反应过程的动力学参数(如Km和kcat)由Michaelis-Menten双倒数方程(公式3-1)通过非线性回归得出。
公式中V表示酶催化的反应速率，[S]表示探针的浓度，Vmax表示在酶的浓度一定时的最大反应速率，Km表示米式常数，即酶反应到达最大反应速率一半时探针的浓度。
结果如图8和表1所示：
表1
实验例3
实验例3探究了实施例1制备的镧系荧光探针的细胞毒性，以HeLa细胞和OVCAR-3细胞为检测对象，其测试方法如下：
将HeLa(OVCAR-3)细胞分别接种到96孔板中，将最终浓度为0、10、20、30、40、50μM的镧系荧光探针与HeLa(OVCAR-3)细胞在37℃，5％CO2和95％O2的环境下培养一天后，采用PBS缓冲液洗涤HeLa(OVCAR-3)细胞，之后加入DMEM培养基(100μL)，将10μL MTT(5mg/mL)加入到每个孔中再次孵育4个小时。用DMSO(100μL)溶解产生的紫色甲臜结晶。通过多功能酶标仪测定每个小孔在490nm处的吸光度值，重复测定三次取吸光度平均值。假设无探针的孔中细胞活力为100％来计算细胞活力，重复三次取平均值并记录。细胞存活率按照公式3-2进行计算。
结果如图9所示，其中图9中a表示，HeLa细胞在不同浓度实施例1中式(Ⅰ)化合物下孵育24h的细胞存活率，图9中b表示，OVCAR-3细胞在不同浓度实施例1中式(Ⅰ)化合物下孵育24h的细胞存活率，因此说明式(Ⅰ)化合物对细胞毒性较小，可以用于细胞成像。
实验例4
探究了实施例1的式(Ⅰ)化合物与β-半乳糖苷酶的线性关系，其测试方法如下：
具体：在PBS缓冲溶液中，固定镧系荧光探针(10μM)，不断的增加β-半乳糖苷酶(0-3U/mL)的浓度，并测定荧光强度检出限的计算方法：根据荧光滴定实验结果，利用检出限方程计算探针LDEu02检测β-葡萄糖苷酶的检出限。
在公式3-3中，σ代表多次测定探针荧光强度后得到的标准偏差，S代表发射波长615nm处，镧系荧光探针的荧光强度与不同浓度β-葡萄糖苷酶的线性关系曲线的斜率。
结果如图10所示，其中图10中的a为荧光强度变化，图10中的b为拟合曲线，在实验条件下，镧系荧光探针在615nm处的荧光强度与β-半乳糖苷酶的浓度之间存在着线性关系，相关系数0.99，计算得出检出限LOD＝0.0023U/mL，表明镧系荧光探针对β-半乳糖苷酶具有较高的灵敏度，可以作为检测β-半乳糖苷酶的有效工具。
实验例5
探究了实施例1式(Ⅰ)化合物的特异性选择性，以β-gal(序号1，13U/mL)，Amy(序号2，1mM)，Lyso(序号3，3U/mL)，Glu(序号4，3U/mL)，Cel(序号5，3U/mL)，Pep(序号6，3U/mL)，Cys(序号7，1mM)，GSH(序号8，1mM)，BSA(序号9，1mM)，HAS(序号10，1mM)，H2O2(序号11，1mM)，DTT(序号12，1mM)，NaSH(序号13，1mM)，Ca2+(序号14，1mM)，Cu2+(序号15，1mM)，Fe3+(序号16，1mM)，Zn2+(序号17，1mM)，Mg2+(序号18，1mM)为干扰物，其测试方法如下：
具体：在PBS缓冲溶液中，固定荧光探探针浓度(10μM)，分别在不同的比色皿中加入不同的干扰物的浓度，反应15min后测定荧光强度：结果如图11所示，
可以直观地看到，与β-半乳糖苷酶相比，镧系荧光探针对其他干扰物几乎没有反应(图11中的a)，但向探针LDEu01中加入β-半乳糖苷酶后，溶液的荧光强度会出现大的增强，在615nm处增强43倍(图11中的b)。因此，镧系荧光探针可以从其他干扰物分子的中高选择性的检测β-半乳糖苷酶。
实验例6
探究了在存在抑制剂D-gal条件下，实施例1的式(Ⅰ)化合物与β-半乳糖苷酶反应，测试方法如下：
在PBS缓冲溶液(pH＝7.4,37℃)中，将镧系荧光探针(10μM)先与不同浓度抑制剂D-半乳糖(0mM，1mM，10mM，20mM，50mM和100mM)混合5min，之后加入3U/ml的β-半乳糖苷酶，反应15min后测定荧光强度。
为了说明探针与β-半乳糖苷酶反应的机理，在镧系荧光探针与β-半乳糖苷酶反应时中加入不同浓度的β-半乳糖苷酶抑制剂D-半乳糖(0mM，1mM，10mM，20mM，50mM和100mM)。由于D-半乳糖分子不含糖苷键，只会影响探针与β-半乳糖苷酶的结合速率，而不影响反应完成后β-半乳糖苷酶水解探针中糖苷键的总量。由图12所示，通过计算伪一级动力学常数，当D-半乳糖的浓度逐渐增大时，探针与β-半乳糖苷酶反应的伪一级动力学常数逐渐减小，反应速率降低。当镧系荧光探针与β-半乳糖苷酶反应完成后测定荧光增强比，探针溶液的荧光增强比不随D-半乳糖的浓度变化。该实验从侧面说明了探针荧光增强是由于与β-半乳糖苷酶的反应所导致的，反应位点是糖苷键的位置。
实验例7
探究了在存在抑制剂ONPG条件下，实施例1的式(Ⅰ)化合物与β-半乳糖苷酶反应，测试方法如下：
在PBS缓冲溶液(pH＝7.4，37℃)中，将镧系荧光探针(10μM)先与不同浓度抑制剂ONPG(0，5，10，20，50，80和100μM)混合5min，之后加入3U/ml的β-半乳糖苷酶，反应15min后测定荧光强度。
为了进一步说明探针与β-半乳糖苷酶反应的位点，在镧系荧光探针与β-半乳糖苷酶反应时中加入不同浓度的抑制剂ONPG(0，5，10，20，50，80和100μM)。由图13所示，通过计算伪一级动力学常数，当ONPG的浓度超过5μM后，探针与β-半乳糖苷酶反应的伪一级动力学常数基本不变，反应速率基本不变。由于ONPG含糖苷键，当镧系荧光探针与β-半乳糖苷酶反应完全后测定荧光增强比，探针溶液的荧光增强比随ONPG的浓度增加而减小，这是因为一部分β-半乳糖苷酶水解了ONPG上糖苷键所致。该实验从侧面说明了镧系荧光探针的反应位点是糖苷键的位置，与之前的设计机理一致。
实验例8
将对比例1的化合物检测β-半乳糖苷酶的荧光强度，其测试方法如下：
在两个比色皿中制备同样浓度的对比例1和实施例1的探针(10μM)，之后加入3U/ml的β-半乳糖苷酶，检测15min内测定荧光强度。
结果如图14所示，可以看到实施例1的镧系探针荧光强度增强而对比例1没有荧光强度的变化。因此，对比例1的化合物不能用于检测β-半乳糖苷酶。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种镧系荧光探针，其特征在于，所述镧系荧光探针的结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
其中，所述Ln为镧系金属元素；
所述A选自、/>、/>或/>中的一种。
2.根据权利要求1所述的镧系荧光探针，其特征在于，所述镧系金属元素选自铥、铽、镝、铕、钐、镱、钕或铒中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将化合物16与乙醇钠在第一有机溶剂中进行反应，得到第一中间体；
S2、将第一中间体与镧系化合物在乙腈中混合，调节pH值至6~6.5，反应2~5h，即得式（Ⅰ）化合物；所述化合物16的结构式如下：
。
4.根据权利要求3所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，所述pH值通过加入碱性物质调节。
5.根据权利要求3所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂包括乙醇、甲醇或乙二醇中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物16通过如下方法制备：
将化合物15、哌啶、丙二酸二乙酯加入到第二有机溶剂中，在60~90℃下反应4~8h，即得化合物16；
所述化合物15的结构式如下：
。
7.根据权利要求6所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物15通过如下方法制备：
将化合物14、甲磺酰氯和DIPEA加入到第三有机溶剂中进行反应，得到第二中间体；
将第二中间体、化合物13和无机碱加入到第四有机溶剂中，在30~60℃下反应，得到化合物15；
所述化合物14和化合物13的结构式如下：
。
8.根据权利要求7所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物14通过如下方法制备：
在保护气氛下，将化合物12、化合物11、铂催化剂、铜盐和DIPEA与第五有机溶剂在30~55℃下反应，即得化合物14；
所述化合物12和化合物11的结构式如下：
。
9.根据权利要求8所述的镧系荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物12通过如下方法制备：
将化合物10、甲磺酰氯、DIPEA与第六有机溶剂混合反应，得到第三中间体；
将所述第三中间体、无机碱、化合物9与第七有机溶剂进行反应，得到化合物12；
所述化合物10和化合物9的结构式如下：
。
10.根据权利要求1或2所述的镧系荧光探针在制备检测β-半乳糖甘酶试剂中的应用。
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