CN101270105A - 用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物及合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物,其具有如右结构通式,其中R1为H原子、或由脂肪族或芳香族羧酸的羧基替代OH的氢得到的酯,或从甾醇类醇、单糖、多聚糖来替换OH的氢获得的醚;R2、R3和R4可以是H、含1-18C原子的烃基、含1-18C原子的全氟代烃基、-CN、-Ar、杂芳基、或羰基和羧基酰胺。本发明采用Pechmann反应或Knovenagel反应在苯环上即6-位和8-位引入卤原子,得到二卤代的7-羟基香豆素类化合物。本发明在生物技术研究中作为荧光探针进行标记分析,具有操作简便、高稳定性、高灵敏度、高选择性等特点。主要用于酶活性分析和酶抑制剂筛选,也可用于细胞活性的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一类用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物及合成方法,具体包括作为酶底物的6-氯-8-氟-7-羟基香豆素和其衍生物的合成和应用。
背景技术
荧光染料特别适合应用于高灵敏度的生物检测。羟基取代的香豆素已被广泛运用于制备荧光染料和蛋白质分子共价结合物和荧光标记的酶底物(BrunM P;et al,Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43(26):3432~3436;Grant S K;et al,J.Biomol.Screen,2002,7(6):531~540;Zhao Y R;et al,J.Am.Chem.Soc.,2004,126(14):4653~4663)。7-羟基-4-甲基香豆素(亦称4-甲基-7-羟基香豆素)是制备含荧光基团的酶底物的母体化合物。7-位羟基的磷酸化生成了一系列能广泛用于碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶检测的含荧光基团的底物磷酸单酯(MUP)。另外,4-甲基-7-羟基香豆素对-胍基苯甲酸酯已被用来确定丝蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶和凝血因子Xa。许多以7-羟基-4-甲基香豆素为原料的含荧光基团的糖苷酶底物已被合成,如4-甲基-7-羟基香豆素的半乳糖苷(MUG)、吡喃糖苷和葡萄糖苷。
然而,7-羟基香豆素化合物只有在去质子化的情况下才具有最大限度的荧光强度。也就是说普通7-羟基香豆素只有在pH≥9的环境下才具有最强的荧光强度(Meng Y;et al,Anal Biochem 345,227-36(2005);Loster K;et al,Micron,31,41-53(2000).)。因此,在使用中主要存在如下问题:①在生理pH值(中性)的情况下,羟基不能去质子化,因而使用时荧光量子效率较低(Hamid ME;et al,Zentralbl Bakteriol 280,476-487(1994))。②因为许多酶只有在中性或pH值<7时才具有最佳的酶解速率,因此使用普通非卤代7-羟基香豆素检测酶的灵敏度和准确度偏低(Obzansky DM,Rabin BR;et al,Clin Chem 37,1513-1518(1991).)。③很多7-羟基香豆素的蛋白质共价结合物在取得最大荧光标记所需的基本条件方面是不稳定的。④目前在生理pH值情况下用于酶检测的香豆素类荧光染料种类较少。
发明内容
本发明针对目前在香豆素类荧光底物研究中存在的问题,提供一种用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物及合成方法。采用Pechmann反应或Knovenagel反应在苯环上即6-位和8-位引入卤原子,得到了二卤代的7-羟基香豆素类化合物。这些香豆素类染料在生理pH值范围内比现有的同类化合物具有更高的光稳定性和更低的pH值敏感性。其吸收光谱和发射光谱与现有的香豆素类荧光染料接近,但具有更高的荧光量子产率,适合用作酶活性分析和酶抑制剂筛选的荧光底物。
本发明的技术解决方案:荧光的有无与强弱,与分子中取代基的种类和取代位置有关,如7-羟基香豆素有强烈的蓝色荧光,而7,8-二羟基香豆素几无荧光。但7-羟基香豆素只有pH≥9的碱性环境下才具有最强的荧光强度,而许多酶,如糖苷酶和酸性磷酸酯酶只有在中性或pH值<7时具有最佳的酶解速率,因此,使用普通非卤代7-羟基香豆素作为酶底物,其检测糖苷酶和酸性磷酸酯酶的灵敏度在生理pH值的情况下大大降低。本发明通过向香豆素的苯环引入两个吸电子的卤素原子,得到二卤代7-羟基香豆素,其吸收光谱和发射光谱与非卤代的同类化合物接近,但这些卤代香豆素化合物表现出比非卤代的同类化合物更高的荧光量子产率,而且在生理pH值范围内比非卤代的同类化合物具有更高的光稳定性和更低的pH值敏感性。此特性对低pH值环境的酶系统特别有用,如酸性磷酸酯酶和β-半乳糖苷酶,可以提高酶检测的灵敏度。
本发明所述的香豆素类化合物具有如下结构通式:
其中R1为H原子、或由脂肪族或芳香族羧酸的羧基替代OH的氢得到的酯,或从甾醇类醇、单糖、多聚糖来替换OH的氢获得的醚;R2、R3和R4可以是H、含1-18C原子的烃基、含1-18C原子的全氟代烃基、-CN、-Ar、杂芳基、或羰基和羧基酰胺。
R1是来自于单糖或多糖。R1由单糖衍生而来,最适宜的单糖为β-D-半乳糖、β-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖。
本发明所述的香豆素类化合物的合成方法:采用Pechmann反应或Knovenagel反应在苯环上即6-位和8-位引入卤原子,得到二卤代的7-羟基香豆素类化合物。
具体合成方法一:以4-氯-2-氟间苯二酚作起始原料与β-酮酯,像乙酰乙酸乙酯,在强酸性介质中经Pechmann缩合反应,合成了6-氯-8-氟-7-羟基香豆素。
具体合成方法二:以5-氯-3-氟-2,4-二羟基苯甲醛为原料与活性亚甲基化合物,经Knoevnagel缩合反应,可生成相应的6-氯-8-氟香豆素类化合物。而5-氯-3氟-2,4-二羟基苯甲醛可容易地从4-氯-2-氟间苯二酚甲酰化得到,如用六亚甲基四胺处理即可。
具体合成方法三:以6-氯-8-氟-7-羟基香豆素-3-羧酸为原料,与邻氨基苯硫酚缩合生成3-(2’-苯基噻唑基)-7-羟基香豆素。
具体合成方法四:以由邻氨基苯酚或邻苯二胺与6-氯-8-氟-7-羟基香豆素-3-羧酸缩合可制备其它3-杂芳基取代的6-氯-8-氟-7-羟基香豆素。
具体合成方法五:以5-氯-3-氟-2,4-二羟基苯甲醛为原料,与3-杂芳基乙酸或3-杂酰基乙酸反应可制得3-杂芳基和3-杂环酰基6-氯-8-氟-7-羟基香豆素。
本发明具有的优点和效果:
1、由于卤原子的吸电子效应,使其比非卤代香豆素具有较低的pKa值,这导致酚羟基在中性介质下有较高程度的去质子化作用,从而产生良好的可溶性和更强的荧光强度。例如,在同样条件下,6-氯-8-氟-7-羟基香豆素比非卤代的7-羟基香豆素具有更高的量子产率、较低的pKa值和较低的光致脱敏作用。在酶底物的荧光标记分析中,pKa值的差异是非常重要的。例如,本发明描述的6-氯-8-氟-7-羟基香豆素,在中性条件下(即生理pH范围内),即可完全电离。由于大部分的酶反应均在生理pH范围内进行,在测定酶活性之时使用本发明中的卤代香豆素化合物比其它香豆素将会更方便,极大地提高了酶检测的灵敏度。经实验证明本发明所述的新型卤代香豆素类荧光底物可以提高在生理pH值的条件下对糖苷酶、酸性磷酸酯酶的荧光量子效率、检测灵敏度准确度和检测速度。
2、本发明所述的的卤代香豆素化合物可以被方便地用于多种生物活性检测。例如,将本发明的香豆素化合物与被测生物样品结合,则可通过检测样品荧光强度的变化检测生物样品某种酶的活性。将本发明的卤代香豆素底物也可用于细胞活性的检测。例如,亲酯性香豆素衍生物被动地透过或进入细胞膜内,在细胞内被酶水解而发出更强的荧光。细胞的活性与卤代香豆素酶底物产生的荧光强度成正比。相对于它们的非卤代香豆素类似物,6-氯-8-氟-7-羟基香豆素具有更高酶解速率,它们的酶解产物表现出更高的荧光强度。在许多时候,因高的酶解速率而提高了生物检测的灵敏度和检测速度。6-氯-8-氟-7-羟基香豆素衍生物作为酶底物可广泛地用于酶的活性测定。例如,检测或定量分析酸性磷酸酶及碱性磷酸酶,或检测在酸性细胞器中发现的酶,像溶酶体糖苷酶。使用本发明所述的卤代香豆素衍生物测定细胞活性时,它们可选择性地与一种或更多其它不同颜色的荧光试剂结合使用。本发明中的典型香豆素具有明亮的蓝色到蓝-绿色荧光,与那些给出绿色、黄色、橙色和红色荧光形成了鲜明的对比。因此,这些卤代香豆素衍生物与其它现有的不同颜色的荧光试剂结合,可以同时分析细胞的多种生物功能。
3、本发明在生物技术研究中作为荧光探针进行标记分析,具有操作简便、高稳定性、高灵敏度、高选择性等特点。例如,将本发明的香豆素化合物与被测生物样品结合,则可通过检测样品荧光强度的变化检测生物样品某种酶的活性;或可用于细胞活性的检测,细胞的活性与卤代香豆素酶底物产生的荧光强度成正比。
附图说明
图1为不同pH值下卤代和非卤代香豆素的荧光强度示意图,
图2为磷酸酯酶的荧光强度示意图,
图3为不同底物浓度的荧光强度示意图。
具体实施方式
本发明实施例1:6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素(化合物2)的合成
①5-氯-3-氟-间苯二酚(化合物1)的合成。
在2000毫升三径瓶中加入100g(0.565mole)2,3,4-三氟硝基苯和1000毫升无水甲醇,用冰盐浴冷至0~-5℃以下,电磁搅拌,在此温度2-2.5h内滴加20%甲醇钠的甲醇溶液335.6g(1.243mole)。室温搅拌10h。用TLC检测反应进程,反应结束后用1mole/L柠檬酸中和pH=7。将上述反应体系分散于2000毫升水中,所析出浅黄色固体经过滤、水洗、干燥。经无水乙醇重结晶,得2-氟-4-硝基-1,3-苯二酚二甲醚浅黄色晶体。
向1000毫升圆底烧瓶中,加入20g 2-氟-4-硝基-1,3-苯二酚二甲醚(0.099mole),250毫升无水乙醇/乙酸乙酯(1/2体积比)。电磁搅拌使固体溶解完全后,加入4g 10%Pd/C,搅拌下催化加氢约12h。用TLC检测反应进程,反应完全后真空浓缩,加入30毫升浓HCl和30毫升水的混合物。将混合物冷至0-5℃,电动搅拌,30min内滴加预先冷却的7.35g NaNO2和20毫升水的溶液,加完后在此温度继续搅拌40min。在500毫升三径瓶中使11.9g氯化亚铜溶于50毫升冷的浓HCl中,电动搅拌,用冰盐浴冷至0~5℃,将上述制备的预先冷却的重氮盐溶液在30min内缓慢加入。滴加完毕后,搅拌30min,撤去冰浴,水浴加热至50~55℃搅拌至无气体溢出。将反应体系用2mole/L NaOH调pH=4~5,35℃以下用乙醚萃取(200毫升×2),有机相一次用水洗、饱和盐水洗,无水Na2SO4干燥。真空浓缩,柱层析分离(100~200目硅胶,乙酸乙酯/石油醚=25∶1),得2-氟-4-氯-1,3-苯二酚二甲醚无色油装液体。
在1000毫升圆底烧瓶中加入20g 2-氟-4-氯-1,3-苯二酚二甲醚,71.4毫升冰乙酸,71.4毫升氢溴酸,回流24h,反应完全后真空浓缩得棕色固体,氯仿重结晶得2-氟-4-氯-1,3-苯二酚白色晶体。
②6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素(化合物2)的合成:
在250毫升圆底烧瓶中加入70毫升70%硫酸,用冰盐浴冷却后加入2.0g 2-氟-4-氯-1,3-苯二酚,搅拌溶解完全,滴加1.6毫升乙酰乙酸乙酯,升至室温搅拌2h。将反应混合物倒缓慢入冰水中,过滤、水洗、干燥、无水乙醇重结晶得6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素白色晶体。
本发明实施例2:6-氯-8氟-7-羟基-3-羧基香豆素(化合物4)的合成
①5-氯-3-氟-2,4-二羟基苯甲醛(化合物3)的合成:
向250毫升三口瓶中依次加入10g 2-氟-4-氯-1,3-苯二酚、117.2g六次甲基四胺、L 80毫升三氟乙酸。电磁搅拌至完全溶解,升温至90℃反应24h。反应完全后冷至室温,加入100毫升20%H2SO4,搅拌1h后将反应混合物倒如水中,用乙酸乙酯萃取(500毫升×2)。有机相经饱和盐水洗、无水MgSO4干燥、浓缩、乙酸乙酯/正己烷冲结晶得3-氟-5-氯-2,4-二羟基苯甲醛白色晶体。
②6-氯-8-氟-7-羟基-3-羧基香豆素(化合物4)的合成:
取20毫升甲磺酸,在100毫升圆底烧瓶中与2g 3-氟-5-氯-2,4-二羟基苯甲醛,搅拌溶解后加入6.4毫升丙二酸二乙酯。室温反应6h。反应完全后,将其倒入300毫升冰水中,用乙酸乙酯萃取(200毫升×2)。有机相经饱和盐水洗涤,无水Na2SO4干燥,真空浓缩,柱层析分离(1%,2%,3%CH3OH/CHCl3)得6-氯-8-氟-7-羟基-3-乙氧基酰基香豆素白色晶体。
在250毫升圆底烧瓶中加入1.0g 6-氯-8氟-7-羟基-3-乙氧基酰基香豆素70毫升THF∶CH3OH∶H2O=5∶5∶1(体积比)和1.0g KOH,电磁搅拌。升温至60℃反应5~5.5h。反应完全后将其分散与500毫升CHCl3中,乙酸乙酯萃取(200毫升×2),饱和盐水洗,无水Na2SO4干燥,真空浓缩至干,乙酸乙酯/正己烷冲结晶得6-氯-8氟-7-羟基-3-羧基香豆素白色晶体。
本发明实施例3:磷酸酯酶作用物-6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素磷酸酯(化合物5)的合成
在0℃,N2保护下,将溶有化合物2的嘧啶溶液加到溶有POCl3(2摩尔)的嘧啶溶液中,用TLC跟踪反应。反应结束后,将溶液倒入盛有碎冰的烧杯中,用氨水调节溶液pH=5。然后,用氯仿萃取嘧啶,将水相部分冻干,即为粗品。
通过葡聚糖凝胶色谱法纯化产品,采用SEPHADEX LH 20凝胶柱,以水做洗脱剂。收集纯品,冷冻得无色晶体。将此固体溶于水中,搅拌下加入DOWEX 50.4-200强酸性阳离子交换树脂,然后过滤除去树脂,并用水洗涤树脂,合并滤液,冷冻得化合物5,为无色晶体,没有荧光。
本发明实施例4:脱烷基化酶底物 6-氯-8-氟-7-乙氧基-4-甲基香豆素(化合物6)的合成
将化合物2(100mg)和碘乙烷(150μL)加入到DMF(10毫升)中,再加入碳酸钾(250mg),回流搅拌反应72h。在反应进行到24h和48h时,分别添加200uL的碘乙烷。反应结束后,冷却,然后过滤。将滤液浓缩得无色晶体,用硅胶柱精制纯化产品,经乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱,得到80mg化合物6,为无色晶体,没有荧光。
本发明实施例5:6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素-β-D-吡喃型半乳糖苷四乙酸酯(化合物7)的合成
将6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素(100mg,0.47mmol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴化物(300mg)和四丁基溴化铵(250mg)溶于7毫升CH2Cl2中,再加入NaOH(30mg,0.75mmol,溶于3毫升蒸馏水中)溶液,充分搅拌反应16h,然后将反应液倒入50毫升水中。用CHCl3萃取产品,饱和盐水洗涤有机相,然后用无水MgSO4干燥,真空浓缩,经硅胶柱分离精制(CHCl3/MeOH 98∶2)得210mg(82%)的化合物7。
本发明实施例6:6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物8)的合成
将新制备的NaOMe/无水甲醇溶液(15μL,1N)加入到溶有化合物7(100mg)的无水甲醇(5毫升)溶液中,室温下搅拌反应16h,得到白色沉淀。过滤,并用甲醇洗涤沉淀物,得一部分化合物8。合并洗涤液到滤液中,用HRC树脂处理,然后过滤,将滤液真空浓缩,经SEPRADEX LH-20凝胶柱分离,用水洗脱得第二部分化合物8。
本发明实施例7:用6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素磷酸酯(化合物5)检测酸性磷酸酯酶的活性
作为酸性和碱性磷酸酯酶的底物,可将化合物5与非卤代的类似物,4-甲基香豆素磷酸酯(MUP)做比较。具体的比较是,使两个底物的浓度(初始浓度约为10mM)相同,在319nm(pH10)处测每一个底物溶液的吸光率为0.52(经测定它们的消光系数近似相等),然后将1∶10稀释后的底物样品加入到过量的酶缓冲液(10units/毫升)里,记录不同时间的荧光信号(激发波长360nm,发射波长450nm)。化合物5与酸性磷酸酯酶(pH4.8,柠檬酸盐缓冲液)作用,其1h之后的荧光量子产率要远高于MUP(见图2)。即使将反应液的pH值提高到10(此为甲基香豆素的最大荧光辐射),化合物5与酸性磷酸酯酶作用产生的荧光信号也比MUP强的多。化合物5与碱性磷酸酯酶(pH10.4,含1mM MgCl2的氨基乙酸作缓冲液)作用,其荧光量子产率比MUP高出约25%(见图2)。
如果每一个底物大大过量(50mM to 0.01酶单位/毫升),在pH=4.8(柠檬酸盐缓冲液)、酸性磷酸酯酶存在下,化合物5水解反应的初始速率比MUP高的多(见图2)。如同上文,底物样品的浓度相当,即在316nm处的标准吸光率为0.525,然后1∶10稀释。
本发明实施例8:用6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素半乳糖苷(化合物8)测定β-半乳糖苷酶的活性
作为β-半乳糖苷酶的底物,可将化合物8与非卤代类似物,4-甲基香豆素β-半乳糖苷(MUG)作对比。具体的比较是,将两个底物的浓度(初始浓度约为10mM)调整到相等,在316nm(pH8.3,20mM的碳酸氢钠)处测每一个底物溶液的标准吸光率为0.5(经测定它们的消光系数近似相等),然后将1∶10稀释后的底物样品加入到β-半乳糖苷酶缓冲液里,pH=7.0,2酶单位/毫升。记录游离染料的发射光谱(发射波长460nm,激发波长360nm),结果见图3。在反应的pH下测量荧光,用化合物8做该酶的底物,比用MUG产生更高的信号增强。由于香豆素的pKa值为7.8(可从未糖苷化的MUG得到),在反应液中加NaOH使溶液的pH值提高到10,能够获得最佳的荧光信号。然而即使对MUG单方面优化以后,使用化合物8(在pH7.0)产生的信号仍强于MUG(在pH 10)。
本发明实施例9:测定卤化香豆素的pH效应。首先将我们对照香豆素和卤化香豆素溶解在一系列缓冲溶液中,该缓冲溶液已用pH计校正过。在pH4-6,可选用醋酸盐作缓冲剂,在pH6-8范围,一般用磷酸盐缓冲液。在溶液浓度大约10μM下测定吸光值,而进行荧光测定时,溶液的浓度约为1μM。以吸收或发射数据对pH作图,可以确定pKa值。例如图1所示,6-氯-8-氟-7-羟基-4-甲基香豆素和7-羟基-4-甲基香豆素的荧光发射数据对溶液的pH值作图。数据显示出,荧光团的卤化作用明显降低了7-羟基香豆素的pKa值。
Claims (9)
2、根据权利要求1所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物,其特征是:R1来自于单糖或多糖。
3、根据权利要求1或2所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物,其特征是:R1由单糖衍生而来,最适宜的单糖为β-D-半乳糖、β-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖。
4、一种如权利要求1所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物的合成方法,其特征是:采用Pechmann反应或Knovenagel反应在苯环上即6-位和8-位引入卤原子,得到二卤代7-羟基香豆素类化合物。
5、根据权利要求4所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物的合成方法,其特征是:以4-氯-2-氟间苯二酚作起始原料与β-酮酯,像乙酰乙酸乙酯,在强酸性介质中经Pechmann缩合反应,合成6-氯-8-氟-7-羟基香豆素。
6、根据权利要求4所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物的合成方法,其特征是:以5-氯-3-氟-2,4-二羟基苯甲醛为原料与活性亚甲基化合物,经Knoevnagel缩合反应,可生成相应的6-氯-8-氟香豆素类化合物。
7、根据权利要求4所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物的合成方法,其特征是:以6-氯-8-氟-7-羟基香豆素-3-羧酸为原料,与邻氨基苯硫酚缩合生成3-(2’-苯基噻唑基)-7-羟基香豆素。
8、根据权利要求4所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物的合成方法,其特征是:以邻氨基苯酚或邻苯二胺与6-氯-8-氟-7-羟基香豆素-3-羧酸缩合可制备其它3-杂芳基取代的6-氯-8-氟-7-羟基香豆素。
9、根据权利要求4所述的用于酶活性分析和酶抑制剂筛选的香豆素类化合物的合成方法,其特征是:以5-氯-3-氟-2,4-二羟基苯甲醛为原料,与3-杂芳基乙酸或3-杂酰基乙酸反应可制得3-杂芳基和3-杂环酰基6-氯-8-氟-7-羟基香豆素。
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