CN113354584A - 一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光探针领域，公开了一种可区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法与应用，具体涉及通过氨基甲酸酯连接体将萘酰亚胺荧光发色基团和丙烯酰酯识别基团链接起来，获得检测生物硫醇的荧光探针（Z1、Z2），它们的结构如下所示：
Figure 258923DEST_PATH_IMAGE002
Figure 363014DEST_PATH_IMAGE004
上述探针本身具有蓝色荧光，与Cys和Hcy作用后发出波长更长的黄绿色荧光，可以实现对Cys、Hcy、GSH的区分检测。荧光探针Z1、Z2对Cys作用速度快、选择强、灵敏性高，可以用于细胞内半胱氨酸的检测和成像，且合成方法简单，原料易得，易于推广。

Description

一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及荧光探针领域，具体涉及两个新型的基于萘酰亚胺结构单元的区分Cys、Hcy和GSH的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物硫醇是一类含硫化合物的总称，主要包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)。研究表明，生物硫醇含量异常与多种疾病有关。例如：半胱氨酸水平异常会导致神经毒性、脱发、水肿、肝损害、皮肤损害等严重后果；血浆Hcy水平失衡会导致心血管疾病。此外，血浆中Hcy的总浓度也与认知障碍有关；谷胱甘肽失衡也与癌症、心血管和阿尔茨海默氏病等许多疾病有着直接的关系。鉴于生物硫醇的重要性，开发能够监测生物硫醇含量的方法具有迫切的需求和十分重要的意义。
迄今为止，已有各种分析技术用于检测生物硫醇。然而，由于昂贵的仪器和耗时繁琐的程序，这些技术在常规检测方面仍然受到限制。因此，迫切需要开发快速、灵敏、廉价的生物硫醇检测方法。荧光探针法以其灵敏度高、选择性好、实时检测、操作简单等优点成为一种很有前途的替代方法。然而，由于不同类型的生物硫醇具有很大的相似性，设计合成特异性高、专一性强的荧光探针仍然具有很大的挑战。
发明内容
基于上述研究背景，本发明设计合成了一种基于萘酰亚胺结构单元的识别探针，用于生物硫醇的特异性检测和成像。为此，本发明的目的在于提供能区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法。
另一目的是提供该探针在区分检测Cys、Hcy和GSH方面的应用。
为实现本发明目的，本发明通过连接体将萘酰亚胺荧光发色基团和丙烯酰酯识别基团链接起来，得到荧光探针Z1、Z2。
本发明所述荧光探针具体为如下所示结构：
Figure BDA0003114700950000021
该探针可以用于溶液中生物硫醇的特异检测，还可用于活细胞Cys的成像(由蓝色荧光到黄绿色荧光的转变)。
上述基于萘酰亚胺的区分生物硫醇的荧光探针Z1，其合成路线如下：
Figure BDA0003114700950000022
步骤a：称取对羟基苯甲醇与丙烯酰氯，以碳酸钾作为缚酸剂，丙酮和水为混合溶剂，室温下进行反应，得到中间体2；
步骤b：将4-硝基-1,8-萘二甲酸酐溶于无水乙醇，加入氯化亚锡和催化量的浓盐酸，在回流温度下进行还原，重结晶后得到中间体4；
步骤c：将中间体4溶于无水乙醇中，加入过量的乙胺溶液，在回流搅拌下，进行脱水缩合反应，即可得到中间体5；
步骤h：先将上述得到的中间体5溶于无水二氯甲烷中，依次加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)以及三光气，冰浴条件下进行反应，最后再加入中间体2，柱色谱分离后，得到目标荧光探针Z1。
基于萘酰亚胺的区分生物硫醇的荧光探针Z2，其合成路线如下：
Figure BDA0003114700950000031
步骤d：首先，将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于无水乙醇中，加入乙胺溶液，在回流搅拌的条件下，进行脱水缩合反应，得到中间体7；
步骤e：中间体7与水合肼在乙二醇单甲醚为溶剂，回流条件下，进行反应得到中间体8；
步骤f：将中间体8溶于3-甲基-2-丁酮中，缓慢加入催化量的浓硫酸，在回流状态下进行Fisher吲哚成环反应，得到中间体9；
步骤g：中间体9溶于甲醇中，分批加入硼氢化钠，在冰浴下进行还原反应，得到化合物10；
步骤h：将中间体10和中间体2在三光气、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)下反应，即可得到目标荧光探针Z2。
本发明还提供了一种溶液中区分Cys、Hcy、GSH的检测方法，包括以下步骤：
(1)用二甲基亚砜和水(10mM，v：v＝1:1，pH＝7.4)配置20μM荧光探针Z1、Z2的储备液；用蒸馏水分别配置100μM的Cys、Hcy|和GSH溶液；
(2)将配置好的荧光探针储备液分别与Cys、Hcy和GSH溶液进行混合使其终浓度为10μM，使用荧光分光分度计测定其荧光光谱。当加入Cys、Hcy时，探针Z1、Z2分别在535nm、565nm出现新的吸收峰，而GSH不会产生新的吸收峰；此外探针Z1、Z2对Cys的响应速度要快Hcy。由此，实现了生物硫醇的区分检测。
对于活细胞Cys荧光成像实验，首先，加入探针与细胞孵育，在绿色通道观察内源性的半胱氨酸水平；其次，加入生物硫醇的清除剂NEM，再孵育探针后进行观察；最后再加入外源性的Cys，观察其荧光变化。实验结果证实，探针Z1、Z2具有良好的膜通透性，探针Z1、Z2具有细胞膜通透性，可以用于细胞内源性和外源性半胱氨酸的成像。
本发明探针以萘酰亚胺为荧光发色团，氨基甲酸酯为中间连接体，丙烯酸酯为识别基团，实现对半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)的区分识别和检测，从而为进一步研究复杂的、多层面的细胞事件提供强有力的工具。其具有如下优点：1)本发明合成的这类荧光探针具有选择性强、灵敏性高、不受其它氨基酸和金属离子的干扰，实现了对生物硫醇的区分检测。(2)其合成方法简单、原料易得、易于推广。((3)该荧光探针具有良好的膜通透性，可以有效用于活细胞染色以及半胱氨酸的成像检测。
附图说明
图1为本发明荧光探针Z1的荧光光谱图；
图2为本发明荧光探针Z2的荧光光谱图；
图3为本发明荧光探针对Cys的检测限测定图，其中(a)为探针Z1在535nm下不同浓度Cys的荧光强度曲线，由下至上Cys浓度依次为20、40、60、80、100μM；(b)为探针Z2在565nm下不同浓度Cys的荧光强度曲线，由下至上Cys浓度依次为20、40、60、80、100μM；(c)-为探针Z1对半胱氨酸线性关系；(d)为探针Z2对半胱氨酸线性关系；
图4为本发明荧光探针对不同的分子以及离子的选择性和抗干扰实验；
图5为本发明荧光探针对Cys、Hcy的时间响应图，其中(a)为探针Z1对Cys的时间响应，(b)为探针Z1对Hcy的时间响应，(c)为探针Z2对Cys的时间响应,，(d)为探针Z2对Hcy的时间响应；
图6为本发明荧光探针Z1、Z2对细胞Cys的荧光成像图,其中，(a)为荧光探针Z1，(b)为荧光探针Z2。
具体实施方式
通过以下具体实例进一步说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。以下没有特别说明，所述百分含量均为质量百分含量。
实施例1化合物2的制备
称取对羟基苯甲醇(1g,1eq)置于50mL的茄形烧瓶中，加入丙酮与水(4:1)的混合溶剂，随后加入K2CO3(1.67g,1.5eq)，在冰浴下搅拌，再加入651μL的丙烯酰氯(1eq)反应4h停止反应。将反应液过滤，旋去多余的丙酮，用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次，合并有机相，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，柱色谱纯化，得到无色油状液体化合物2，产率40％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.12(d,J＝8.5Hz,2H),6.61(dd,J＝17.3,1.0Hz,1H),6.32(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),6.02(dd,J＝10.4,1.0Hz,1H),4.67(s,2H),1.86(s,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.80,150.84,137.63,134.24,128.78,128.65,127.63,122.21,121.89,65.24.
实施例2中间体4的制备
先将4-硝基-1,8-萘二甲酸酐(1g,1eq)溶于无水乙醇中，随后加入氯化亚锡(3.9g,5eq)和催化量的浓盐酸(2mL)，75℃回流反应5-10h，TLC检测反应。待反应完成后，将生成的滤液过滤，得到粗产物4。将粗产物4用冷乙醇洗涤，干燥，得到桔红色固体中间体4，产率72％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.75–8.64(m,1H),8.43(dd,J＝7.3,0.8Hz,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),7.78(s,2H),7.73–7.63(m,1H),6.88(d,J＝8.5Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ162.00,160.33,153.88,135.87,133.03,132.53,130.65,124.39,119.26,118.18,108.73,102.19.
实施例3中间体5的制备
将4-氨基-1,8-萘二甲酸酐(1eq)溶于无水乙醇中，加入过量的70％的乙胺水溶液，回流反应1h即可反应完全，旋干可得黄色固体中间体5，产率75％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.43(d,J＝7.2Hz,1H),8.20(d,J＝8.3Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.45(s,2H),6.85(d,J＝8.4Hz,1H),4.05(q,J＝6.7Hz,2H),1.18(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ163.56,162.70,152.65,133.86,130.93,129.60,129.23,123.96,121.76,119.32,108.14,107.57,34.21,13.27.
实施例4荧光探针Z1的制备
将中间体5(50mg,1eq)、DIPEA(206μL,6eq)以及催化量的DMAP(13mg,0.5eq)溶于无水二氯甲烷，在冰浴下加入三光气(62mg,1eq)，搅拌反应10h后，再加入1.2eq的化合物2，室温反应过夜，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，收集有机相，旋干过柱纯化，可得黄色固体荧光探针Z1，产率60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(dd,J＝11.8,7.7Hz,2H),8.34(d,J＝8.2Hz,1H),8.18(d,J＝8.4Hz,1H),7.76–7.69(m,1H),7.60(s,1H),7.46(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),6.65–6.58(m,1H),6.33(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),6.09–6.00(m,1H),5.28(s,2H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.48,163.96,163.46,153.03,150.81,138.86,133.05,132.97,132.39,131.20,129.95,128.89,127.72,126.60,126.02,123.45,123.01,121.90,118.03,116.92,67.23,35.48,13.35.
实施例5化合物7的制备
将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(100mg,1eq)溶于10mL的无水乙醇中，随后加入70％的乙胺水溶液(66μL,2eq)，75℃回流反应2-3h，过滤，将滤饼用冷的无水乙醇洗涤3次，干燥可得棕色固体化合物7，产率65％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.52(dd,J＝14.6,7.8Hz,2H),8.29(d,J＝7.8Hz,1H),8.18(d,J＝7.8Hz,1H),7.97(t,J＝7.8Hz,1H),4.06(dd,J＝13.8,6.8Hz,2H),1.22(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ162.66,162.61,132.56,131.50,131.33,130.89,129.79,129.04,128.78,128.28,122.82,122.05,34.90,13.01.
实施例6中间体8的制备
称取一定量的化合物7(1eq)加入20mL的乙二醇单甲醚，随后再加入过量的80％的水合肼，在125℃回流直至出现不溶的红色固体，停止反应，冷却至室温，过滤，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次，干燥可得红色的化合物8，产率50％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.11(s,1H),8.60(d,J＝8.3Hz,1H),8.41(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.6Hz,1H),7.62(t,J＝7.8Hz,1H),7.24(d,J＝8.6Hz,1H),4.67(s,2H),4.12–3.96(m,2H),1.18(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ163.52,162.67,153.13,134.10,130.46,129.23,128.18,124.05,121.74,118.40,107.39,103.95,34.19,13.29.
实施例7中间体9的制备
将化合物8(1eq)溶于过量的3-甲基-2-丁酮中，室温搅拌状态下，缓慢滴加0.5mL的浓硫酸催化，95℃回流3-5h,冷却至室温，加入饱和的NaHCO3溶液，旋去多余的3-甲基-2-丁酮，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取3次，收集有机相，旋干过柱，可得黄色固体中间体9，产率55％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H),8.62(dd,J＝7.3,1.2Hz,1H),8.59(s,1H),7.81(dd,J＝8.2,7.3Hz,1H),4.27(q,J＝7.1Hz,2H),2.48(s,3H),1.46(s,6H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ194.16,164.37,164.23,154.75,143.01,131.12,129.90,128.85,126.75,124.79,122.81,119.54,55.49,35.51,22.48,16.11,13.39.
实施例8中间体10的制备
将化合物9(1eq)溶于无水甲醇中，在冰浴条件下，分批加入2eq的硼氢化钠，进行反应2h，LC-MS检测反应完全，加入饱和NaHCO3淬灭反应，旋去多余的甲醇，用二氯甲烷萃取3次，旋干，柱色谱分离，可得红色固体中间体10，产率67％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.31(s,1H),8.06(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H),7.53(dd,J＝8.1,7.4Hz,1H),5.48(s,1H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.89(d,J＝6.3Hz,1H),1.39(s,3H),1.35–1.28(m,6H),1.18(s,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ164.55,164.17,151.86,133.50,131.18,129.58,128.21,127.53,124.40,123.04,116.87,111.42,66.15,43.83,35.24,27.37,22.67,15.51,13.48.
实施例9荧光探针Z2的制备
将中间体10(100mg,1eq)、DIPEA(420μL,6eq)以及催化量的DMAP(32mg,0.5eq)溶于无水二氯甲烷，在冰浴下加入三光气(132mg,1eq)，搅拌反应12h后，再加入1.2eq的化合物2，室温反应过夜，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，收集有机相，旋干过柱纯化，可得黄色固体荧光探针Z2，产率45％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(dd,J＝7.2,1.1Hz,1H),8.42(s,1H),8.40(dd,J＝8.6,1.1Hz,1H),7.63(dd,J＝8.6,7.3Hz,1H),7.48–7.40(m,2H),7.20–7.11(m,2H),6.67–6.57(m,1H),6.33(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),6.04(dd,J＝10.4,1.2Hz,1H),5.41(d,J＝12.2Hz,1H),5.25(d,J＝12.2Hz,1H),4.55(q,J＝6.7Hz,1H),4.24(q,J＝7.1Hz,2H),1.42(d,J＝3.0Hz,3H),1.35–1.29(m,6H),1.23(d,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.44,164.17,163.77,154.16,150.71,141.93,139.85,133.38,132.90,132.27,131.17,129.64,129.28,127.76,126.30,125.55,122.81,122.44,121.88,120.18,70.88,67.52,44.06,35.45,30.19,26.92,20.22,16.62,13.38.
实施例10探针荧光光谱的测定
在荧光比色皿中加入5mL的DMSO/H2O(10mM，v：v＝1:1，pH＝7.4)和荧光探针储备液，再加入100μM的Cys、Hcy、GSH水溶液，使其终浓度为10μM。以紫外最大吸收波长为激发波长，狭缝宽度为5nm，使用荧光分光光度计测定待测样品的荧光图谱。测定结果如图1、2所示。从图1中我们可以发现，探针Z1的荧光发射波长为465nm，当加入Cys、Hcy时，波长红移到535nm，而加入GSH后，荧光曲线并未有明显的变化。从图2中可以看出，探针Z2的发射波长为475nm，而加入Cys、Hcy时，荧光发射波长为565nm，波长红移91nm。同样GSH的荧光曲线并未有明显的变化。这说明了探针Z1、Z2与Cys、Hcy有良好的反应性，而与GSH则不反应。
实施例11探针检测限的测定
检测限是衡量荧光探针灵敏性的重要指标。为了获得荧光探针Z1、Z2对半胱氨酸的检测限，首先配置浓度为10μM探针溶液，随后加入不同浓度的半胱氨酸溶液(20μM、40μM、60μM、80μM、100μM)，使用荧光分光光度计，分别测定了不同浓度梯度的待测样品在535nm、565nm下的荧光曲线。然后以不同浓度梯度的Cys作为横坐标，以535nm、565nm处的荧光强度作为纵坐标，使用Origin对其进行拟合，结果如图3所示。从图中可以看出探针Z1、Z2与半胱氨酸呈现良好的线性关系，线性方程分别为：y＝5.937x+60.809，y＝5.941x+80.428；相关系数平方分别为R2＝0.986、R2＝0.987。根据公式计算了探针Z1、Z2对半胱氨酸的检测限(LOD)。公式LOD＝3s/k，其中s为连续测量10次探针的标准偏差，k为线性方程的斜率，由此得到了探针Z1、Z2的检测限分别为1.73μM、1.20μM。
实施例12探针选择性与抗干扰实验
内环境是复杂多变的，某些氨基酸、金属离子会对探针检测产生干扰。为了验证探针Z1、Z2的选择性和抗干扰能力，我们量取了50μL的探针储备液，分别加入以下可能产生干扰的分析物：1-12：probe z1或z2、Cys、Hcy、GSH、Glu、Arg、Ala、His、Cu2+、Hg2+、Fe3+、Zn2+，使其终浓度为10μM。使用荧光分光光度计分别在发射波长为535nm、565nm下，测定荧光强度。其结果如图4所示。从图中可以看出，探针Z1、Z2对半胱氨酸、同型半胱氨酸有着良好的识别，且均对半胱氨酸的选择识别要优于同型半胱氨酸。同时在其他物质存在的条件下，探针Z1、Z2对它们没有响应，这说明了我们所设计合成的荧光探针Z1、Z2具有良好的选择性和抗干扰性，值得进一步的研究开发。
实施例13探针的时间响应实验
在不同的荧光比色皿中加入50μL的探针储备液，随后加入等浓度的Cys、Hcy(100μM)，用溶剂稀释至10μM。使用荧光分光光度计记录不同时间点的荧光强度。使用origin软件作图，其结果如图5所示。从图中可以看出，当不加入Cys、Hcy时，探针Z1、Z2的荧光强度基本不变，这证明我们所设计合成的探针具有较高的稳定性；当加入Cys时，探针Z1在30min左右荧光强度达到最大，探针Z2则在20min左右达到最大；加入Hcy时，探针Z1在24h荧光强度达到饱和，而探针Z2则在20h左右荧光强度达到最大。由上述结果可知，探针Z1、Z2均可有效识别Cys和Hcy，其中探针Z2对Cys、Hcy有着更好的响应性。
实施例14探针的细胞荧光成像实验
探针Z1、Z2对半胱氨酸具有良好的识别和响应，可以实现探针由蓝色荧光到黄绿色荧光的转变。因此，为了探究探针Z1、Z2是否具有在细胞内进行荧光成像的能力，进一步将探针Z1、Z2应用于活细胞中半胱氨酸的检测和成像。以正常肝细胞作为受试细胞，设置了三个平行实验组，第一组：细胞分别与探针Z1、Z2(10μM)孵育1h；第二组：细胞先与500μM的NEM(生物硫醇消除剂)孵育30min，再加入10μM的探针Z1、Z2孵育1h；第三组：细胞先与500μM的NEM(生物硫醇消除剂)孵育30min，加入外源性的Cys(100μM)培养1h，再和探针Z1、Z2进行孵育培养1h。采用荧光显微镜对其进行了拍照。其结果如图6所示。从图6中(a)和(b)可以明显看出，在蓝色通道，探针Z1、Z2均可呈现明亮的蓝色荧光，说明了我们所设计合成的探针有着良好的细胞膜通透性，可以用于细胞荧光成像的研究。从第一排中可以看出，在绿色通道中呈现出绿色荧光，说明了探针可以检测内源性的半胱氨酸；第二排加入生物硫醇的消除剂(NEM)后，发现探针在绿色通道的荧光强度显著下降；第三排，在加入外源性的半胱氨酸后，发现探针的绿色荧光强度增强。这些结果说明了探针Z1、Z2不仅具有良好的细胞膜通透性，而且还可以用于细胞内源性和外源性半胱氨酸的成像检测。

Claims (7)

1.一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针，其特征在于，具有如下所示结构：
Figure 980073DEST_PATH_IMAGE001
或
Figure 315240DEST_PATH_IMAGE002
。
2.合成如权利要求1所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针Z1的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：
Figure 981844DEST_PATH_IMAGE003
（1）称取对羟基苯甲醇与丙烯酰氯，以碳酸钾作为缚酸剂，丙酮和水为混合溶剂，室温下进行反应，得到中间体2；
（2）将4-硝基-1,8-萘二甲酸酐溶于无水乙醇，加入氯化亚锡和催化量的浓盐酸，在回流温度下进行还原，重结晶后得到中间体4；
（3）将中间体4溶于无水乙醇中，加入过量的乙胺溶液，在回流搅拌下，进行脱水缩合反应，得到中间体5；
（4）将上述得到的中间体5溶于无水二氯甲烷中，依次加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶（DMAP）以及三光气，冰浴条件下进行反应，最后再加入中间体2，柱色谱分离后，得到目标荧光探针Z1。
3.如权利要求2所述的合成区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针Z1的方法，其特征在于，中间体5、三光气、DIPEA、DMAP、中间体2的摩尔比为1：1：6：0.5：1.2-2。
4.合成如权利要求1所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类探针Z2的合成方法，其特征在于，通过如下步骤实现：
Figure 60659DEST_PATH_IMAGE004
（1）首先，将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于无水乙醇中，加入乙胺溶液，在回流搅拌的条件下，进行脱水缩合反应，得到中间体7；
（2）中间体7与水合肼在乙二醇单甲醚为溶剂，回流条件下，进行反应得到中间体8；
（3）将中间体8溶于3-甲基-2-丁酮中，加入催化量的浓硫酸，在回流状态下进行Fisher吲哚成环反应，得到中间体9；
（4）中间体9溶于甲醇中，分批加入硼氢化钠，在冰浴下进行还原反应，得到化合物10；
（5）将上述得到的中间体10溶于无水二氯甲烷中，依次加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶（DMAP）以及三光气，冰浴条件下进行反应，最后再加入中间体2，柱色谱分离后，得到目标荧光探针Z2；
Figure 558636DEST_PATH_IMAGE005
。
5.如权利要求4所述的合成区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类探针Z2的方法，其特征在于，中间体10、三光气、DIPEA、DMAP、中间体2的摩尔比为1：1：6：0.5：1.2-2。
6.如权利要求1所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类荧光探针的应用，其特征在于，将其用于溶液中Cys、Hcy、GSH的区分检测或非诊断性细胞内Cys的特异成像。
7.如权利要求6所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类荧光探针的应用，其特征在于，所述溶液中Cys、Hcy、GSH的区分检测方法包括以下步骤：
（1）用二甲基亚砜和水配置荧光探针Z1或Z2的储备液；用蒸馏水分别配置Cys、Hcy|和GSH溶液；
（2）将配置好的荧光探针Z1储备液分别与Cys、Hcy和GSH溶液进行混合，使用荧光分光分度计进行波长检测，检测到Cys、Hcy在535 nm处出现吸收峰，而GSH没有吸收峰；而且探针Z1对Cys的响应速度快于Hcy，据此，实现Cys、Hcy、GSH的区分检测；
或将配置好的荧光探针Z2储备液分别与Cys、Hcy和GSH溶液进行混合，使用荧光分光分度计进行波长检测，检测到Cys、Hcy在565 nm处出现吸收峰，而GSH没有吸收峰；而且探针Z1对Cys的响应速度快于Hcy，据此，实现的Cys、Hcy、GSH的区分检测。
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