CN104277826A

CN104277826A - 细胞内Hg2+检测用以氧原子为结合位点的荧光探针

Info

Publication number: CN104277826A
Application number: CN201410545777.6A
Authority: CN
Inventors: 颜范勇; 付杨; 邹宇; 郑坦诚; 史德超; 陈莉
Original assignee: Tianjin Polytechnic University
Current assignee: Tianjin Polytechnic University
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2014-10-16
Publication date: 2015-01-14

Abstract

本发明涉及细胞内Hg²⁺检测用以氧原子为结合位点的荧光探针。本发明涉及精细化工领域中一类Hg²⁺荧光分子探针，该探针通过罗丹明类荧光染料与氨基酸和苯酐反应制成。激发和发射波长在可见光区。在pH 5-8的范围内，探针对Hg²⁺有很好的选择性，而Mg²⁺，Mn²⁺，Fe³⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Ag⁺等金属离子对检测没有干扰，可以检测微摩尔浓度的Hg²⁺。细胞成像实验表明这类探针对HL-7702细胞等各类细胞或组织渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，特别适合细胞内Hg²⁺浓度变化和分布的检测。

Description

细胞内Hg2+检测用以氧原子为结合位点的荧光探针

技术领域：

本发明属于精细化工领域中细胞内Hg²⁺检测用荧光分子探针。

背景技术：

汞是一种重要的重金属以及过渡金属，并且它长期以氧化物形式存在于各个系统中，主要以Hg²⁺为主。随着科学技术不断发展，越来越多的化学工厂向淡水及海水中排放大量含Hg²⁺的废水，使得人类周围环境遭到了严重地破坏和污染，同时给人类的生活带来了巨大问题。由于食物链关系，腹中积累大量Hg²⁺的水生动物被人类长期食用，进一步会产生严重的呕吐、腹痛等中毒病症，对人类的健康带来极大损害。所以对于细胞内或组织中的Hg²⁺的检测以及生物学研究已经成为近年来的研究热点。

荧光分子探针法具有识别选择性好、响应快速、灵敏等优点，是实现生物微环境中微量组分原位检测与成像理想的工具。而罗丹明及其衍生物由于其在可见光区具有宽的荧光光谱，高的荧光量子产率和光稳定性，因此被广泛的用于荧光探针。

荧光探针对目标物的检测是通过将化学信号转化为荧光信号完成的，具有快速高效、低成本和选择性好等优点，与比色法相比更加灵敏。此外，荧光探针还可以不破坏细胞结构直接穿透细胞壁进入活细胞内对金属离子进行荧光检测。近些年设计开发新型的重金属离子荧光探针已成为研究的热点。

罗丹明衍生物处于螺环结构时是无色、无荧光的，当金属离子诱导闭环结构打开，颜色由无色变成红色，同时伴随着发出强烈的荧光，体现出典型的“OFF-ON”型荧光特征。基于此种原理，已开发出许多罗丹明类荧光探针，但是在选择性及测试条件要求方面还存在缺点，因此开发新型的荧光探针仍然是一个挑战。

通过阅读大量文献，发现罗丹明底环上的氧原子会参与对金属离子的络合，比如Yoon等向罗丹明螺环结构中引入尿素基团，通过罗丹明母体羰基上的O和脲基上的O与Hg²⁺络合使闭环机构打开。因此设想通过将不同的氨基酸与苯酐相连引入到罗丹明螺环结构中，期望增加更多与金属离子结合的位点，来增加探针的选择性及灵敏性。结合以上想法，我们成功合成了三种罗丹明类荧光探针，能够选择性识别环境中的Hg²⁺，且能在活细胞中对金属离子进行荧光成像。

发明内容：

本发明改进现有的Hg²⁺荧光探针结构和性能上的不足，设计合成出适用于活细胞内Hg²⁺检测、性能优良的基于氧原子为结合位点的荧光探针作为研究目标。

本发明以罗丹明乙二胺为母体，向其中引入以不同氨基酸和苯酐制成的中间体，合成了3种可以选择性识别Hg²⁺的新型荧光探针，使整个分子的紫外吸收和荧光都发生明显增强。

本发明的细胞内Hg²⁺检测用以氧原子为结合位点的荧光探针具有下列结构通式(I)：

通式I中：R₁、R₂为相同或不相同的R；R₁为H或甲基；R₂为H或Cl。

本发明代表性的化合物的合成方法，是以罗丹明乙二胺为母体(II)，与由不同氨基酸和苯酐制成的中间体(III)反应，经过柱分离得到探针纯品。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和分析检测方法。

本发明的细胞内Hg²⁺检测用以氧原子为结合位点的荧光探针使用方法没有特殊的限制。通常，可以将探针分子溶解在缓冲溶液或乙醇等水溶性有机溶剂，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。

本发明的以氧原子为结合位点的荧光探针的具体特征如下：

探针分子络合Hg²⁺前，在556nm处吸光度非常小，且荧光量子产率较低，络合Hg²⁺后吸光度和荧光量子产率显著的增加，并且溶液颜色由无色变为粉红色；探针分子对Hg²⁺有很好的选择性，Mg²⁺，Mn²⁺，Fe³⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，A^g+，Ba²⁺，pb²⁺，Cu²⁺等金属离子对检测没有干扰；探针分子具有较宽的pH范围检测Hg²⁺；随着络合Hg²⁺后，探针分子在581nm处的荧光强度在pH值4.0-8.0之间显著增强，因此，可以在近中性pH范围内对Hg²⁺进行检测；探针分子与Hg²⁺之间的络合常数在微摩范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞Hg²⁺，且络合过程为可逆，络合比为1∶1。探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适用于细胞内Hg²⁺检测。

附图说明

图1是本发明的荧光探针分子RW1和RW2在加入1当量的Hg²⁺前后荧光强度随pH的变化关系曲线。

图2是本发明的荧光分子探针对金属离子选择性的荧光光谱实验。图2(a)是荧光分子探针RW1和RW2本身及加入1当量Hg²⁺的荧光光谱图。图2(b)是RW1和RW2加入Hg²⁺和其它金属离子时引起的荧光强度变化。

图3是本发明的荧光探针分子在其他竞争金属离子中检测Hg²⁺的竞争性试验。红柱是荧光探针分子RW1，蓝柱是荧光探针分子RW2。

图4是本发明的荧光探针分子RW1在HL-7702细胞中对Hg²⁺成像图。图4(a)和(c)是在荧光探针分子RW1和Hg²⁺中培养30分钟的细胞明场照片；图4(b)和(d)是在荧光探针分子RW1和Hg²⁺中培养30分钟的细胞荧光照片。

图5是本发明的荧光探针分子RW3在加入1当量的Hg²⁺前后荧光强度随pH的变化曲线。

图6是本发明的荧光探针分子RW3在其他竞争金属离子中检测Hg²⁺的竞争性试验。

研究探针对Hg²⁺选择性的方法是将探针分子加入1当量的Hg²⁺和10当量的不同金属离子的溶液和未加金属离子的探针分子溶液的荧光强度比较。另外，比较干扰离子存在下对Hg²⁺的响应，通常是将探针分子加到10当量的不同金属离子与1当量的Hg²⁺混合的缓冲液中，荧光强度与仅加相同量的Hg²⁺探针分子溶液比较。

研究探针pH的响应的方法是通过改变探针分子溶液的pH，缓慢增大，记录相应的荧光强度变化，以荧光变化对pH作图。

探针的应用方法是将溶解于有机溶剂或者有机/水混合溶剂中的这类探针分别加入到已培育好的不含汞离子和含10μM Hg²⁺的两组相同细胞的培养液中，使探针浓度达到10μM，细胞与探针在37℃和含1-10％CO₂气氛的细胞培养箱中孵育0.5-1小时后，探针透过细胞膜，与细胞内Hg²⁺络合发出荧光，用不含探针和Hg²⁺的PBS缓冲液充分洗涤三次后，细胞在倒置荧光显微镜下进行拍照得到Hg²⁺分布的荧光图像，根据荧光变化，由此得到Hg²⁺的存在。

本发明涉及的荧光探针分子具有极其重要的应用价值。这类探针具有如下特点：

1.RW1、RW2在溶液中可以高选择性的识别Hg²⁺，并伴有明显的颜色和荧光变化。两种探针都可以和Hg²⁺以1∶1方式进行可逆性的结合。检测Hg²⁺的最低检测限分别为：2.5×10^-8M和4.2×10^-8M。由于RW2中含有的Cl原子导致的重原子效应，使探针RW2对检测Hg²⁺的荧光强度与性能相比于RW1来说都会减弱。荧光成像实验表明RW1和RW2成功应用于HL-7702细胞中Hg²⁺的检测。

2.在pH 5-9之间，RW3和Hg²⁺是以1∶1方式进行可逆性络合，使溶液的紫外吸收和荧光增强。选择性和竞争性实验结果表明其它金属离子对RW3检测Hg²⁺没有明显干扰。线性检测范围为：0-1μM，最低检测限为2.8×10^-8M。

具体实施方式

实施例1

探针RW1的合成：

(1)中间体2的合成

将邻苯二甲酸酐(0.59g，4mmol)和丙氨酸(0.35g，4mmol)溶解于无水甲苯中，回流反应4小时，减压蒸馏除去甲苯，所得固体加入到50mL圆底烧瓶中，向其中加入10mL氯化亚砜并滴加2滴DMF搅拌下回流反应3小时，尾气吸收，减压蒸馏除去过量氯化亚砜溶剂，所得固体用5mL二氯甲烷洗涤3次，除去二氯甲烷后得到浅黄色固体。(2)探针3(RW1)的合成

将罗丹明乙二胺(1.93g，4mmol)置于100mL三口瓶中，加入20mL二氯甲烷将其溶解，再向其中加入4mL三乙胺及一定量的碳酸氢钠作为缚酸剂。将三口瓶放入低温恒温反应浴中边搅拌变降温，待温度降至0℃时，缓慢滴加用15mL二氯甲烷溶解的中间体2，滴加过程维持在温度0℃左右，可以观察到有白烟生成，大约半小时左右滴加完毕，低温继续反应2h(薄层色谱TLC监测反应)，用40mL双蒸水洗涤2次，收集有机相，减压蒸除溶剂，湿法上样经柱色谱分离(甲醇/二氯甲烷＝1∶5，V/V)得1.5g浅黄色固体RW1。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ＝7.95(s，1H)，7.90(m，2H)，7.79(m，2H)，7.05(dd，1H)，7.29-7.40(m，3H)，6.46(dd，1H)，6.32-6.38(m，4H)，6.27(dd，1H)，4.91(q，1H)，3.34(m，10H)，2.96(m，2H)，1.74(t，3H)，1.17(m，12H).¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ＝168.19，163.09，153.93，153.24，153.07，149.00，148.93，139.87，132.86，129.67，128.49，128.23，128.11，128.03，123.90，122.24，108.44，97.65，65.93，49.48，44.35，42.08，39.20，14.63，12.59.IR(KBr，v/cm^-1)：3425，3003，2856，1673，1612，1460，1224，1118，976.ESI-MS(M+H⁺)：m/z＝686.33(C₄₁H₄₃N₅O₅).

探针RW2的合成：

(1)中间体5的合成

将四氯苯酐(1.14g，4mmol)和丙氨酸(0.35g，4mmol)溶解于无水甲苯中，回流反应4小时，减压蒸馏除去甲苯，所得固体加入到50mL圆底烧瓶中，向其中加入10mL氯化亚砜并滴加2滴DMF搅拌下回流反应3小时，尾气吸收，减压蒸馏除去过量氯化亚砜溶剂，所得固体用5mL二氯甲烷洗涤3次，除去二氯甲烷后得到棕色粘稠液体。

(2)探针6(RW2)的合成

将罗丹明乙二胺(1.93g，4mmol)置于100mL三口瓶中，加入20mL二氯甲烷将其溶解，再向其中加入4mL三乙胺及一定量的碳酸氢钠作为缚酸剂。将三口瓶放入低温恒温反应浴中边搅拌变降温，待温度降至0℃时，缓慢滴加由15mL二氯甲烷溶解的中间体5，可以观察到有白烟生成，滴加过程维持在温度0℃左右，半小时左右滴加完毕，低温继续反应2h(薄层色谱TLC监测反应)，用40mL双蒸水洗涤2次，收集有机相，减压蒸除溶剂，湿法上样经柱色谱分离(甲醇/二氯甲烷＝1∶10，V/V)得1.41g浅黄色固体RW2。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ＝8.05(s，1H)，7.06(dd，1H)，7.29-7.45(m，3H)，6.26-6.45(m，6H)，4.91(q，1H)，3.74(q，1H)，3.36(q，8H)，3.25(m，2H)，2.97(dd，1H)，1.73(dd，3H)，1.17(m，12H).¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ＝168.29，163.07，153.98，153.22，153.17，149.07，148.94，139.86，132.83，129.65，128.52，128.27，128.10，128.13，123.96，122.23，108.45，97.67，65.91，49.43，44.36，42.02，39.21，14.61，12.57.IR(KBr，v/cm^-1)：3426，3004，2858，1673，1615，1457，1220，1112，979.ESI-MS(M+H⁺)：m/z＝824.17(C₄₁H₃₉Cl₄N₅O₅).

探针RW3的合成：

(1)中间体8的合成

将邻苯二甲酸酐(0.59g，4mmol)和甘氨酸(0.30g，4mmol)溶解于无水甲苯中，回流反应4小时，减压蒸馏除去甲苯，所得固体加入到50mL圆底烧瓶中，向其中加入10mL氯化亚砜并滴加2滴DMF搅拌下回流反应3小时，尾气吸收，减压蒸馏除去过量氯化亚砜溶剂，所得固体用5mL二氯甲烷洗涤3次，除去二氯甲烷后得到淡黄色固体。

(2)探针9(RW3)的合成

将罗丹明乙二胺(1.93g，4mmol)溶解到15mL二氯甲烷中，再向其中加入4mL三乙胺及一定量的碳酸氢钠作为缚酸剂。并放入低温恒温反应浴中冷却到0℃。在搅拌的情况下，缓慢滴入中间体8的二氯甲烷溶液，并伴随着白烟的生成，滴加过程维持在温度0℃左右，滴加完毕后，低温继续反应2h(薄层色谱TLC监测反应)，用40mL双蒸水洗涤2次，收集有机相，减压蒸出溶剂，湿法上样经柱色谱分离(甲醇/二氯甲烷＝1∶5，V/V)得2.1g产物RW3。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ＝7.92(dd，2H)，7.80(dd，2H)，7.39-7.49(m，3H)，7.07(dd，1H)，6.30-6.37(m，6H)，4.29(s，2H)，3.29-3.34(m，12H)，1.16(t，12H).¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)：δ＝170.19，167.87，166.16，153.79，153.17，148.96，133.96，132.84，132.55，130.11，128.43，128.04，123.86，123.47，122.68，108.46，104.49，97.74，65.67，44.38，41.55，40.76，39.29，12.57.IR(KBr，v/cm^-1)：3396，3001，2863，1632，1613，1546，1221，1117，996.

实施例2

探针对Hg²⁺的选择性：

使用上述合成的三种化合物评价对Hg²⁺的选择性。在10mL容量瓶中将探针分子母液用其相应的测试溶液稀释为浓度10M，再分别加入10M被测金属离子和100M(10当量)的其他金属离子，待平衡时间之后测定荧光光谱的变化。测试结果显示于图2。从图中可以看到，探针对Hg²⁺具有很高的选择性，Hg²⁺加入使得荧光强度明显的增强，另外其它金属离子对检测没有干扰。

实施例3

探针的阳离子干扰性：

在相应的的测试溶液中，将10M(1当量)的被测离子分别加入到100M(10当量)的上述不同金属离子中形成竞争体系，然后再向其中加入探针分子(10M)，待平衡时间之后观察相应的荧光变化。测试结果显示于图3和图6中。从图中可以看出，10当量的其它金属离子对探针检测Hg²⁺均无明显影响。这说明探针对Hg²⁺的识别具有很强的抗干扰能力。

实施例4

探针的pH滴定：

用1M盐酸和氢氧化钠溶液调节测试体系的酸碱性，测试pH范围在3.0-10.0时的探针溶液和探针加被测离子溶液的荧光光谱变化。测试结果显示于图1和图5中。从图1中可以看出，探针RW1和探针RW2自身在pH为3.0-4.0范围内荧光增加，当pH大于4.0时探针的荧光强度非常低。然而，在加入Hg²⁺离子后，其荧光强度在pH值4.0-8.0之间显著增强。因此，探针RW1和探针RW2可以在较宽的pH范围内检测Hg²⁺。从图5中可以看出，探针RW3溶液中加入Hg²⁺后，在pH为5-9之间，有明显的荧光增强，这说明RW3可以在近中性pH范围内对Hg²⁺进行检测。

实施例5

细胞成像：

探针分子成像所用的细胞为HL-7702人肝细胞。首先在培养好的HL-7702细胞中加入5μM的探针分子，在恒温培养箱中继续培养30分钟，使得探针尽可能多的进入细胞内部。然后用PBS缓冲液冲洗3次后，放置到荧光显微镜下拍照，由图4(a)可以看出，细胞形态完整，表明探针分子的毒性很小。在图4(b)可以看出上述细胞没有出现明显的荧光。随后在细胞培养液中加入5μM的Hg²⁺后继续培养30分钟。再放到荧光显微镜下观察时，可以清楚的看到HL-7702细胞发出强烈的红色荧光(图4(d))。

Claims

1.一类以氧原子为结合位点的荧光探针，其特征在于该氧原子为结合位点的荧光探针具有下列结构通式I：

2.按照权利要求1所述的氧原子为结合位点的荧光探针的用途，其特征在于将溶解于有机溶剂或有机/水混合溶剂中的这类探针分别加入到已培育好的不含Hg²⁺和含10μM Hg²⁺的两组相同细胞的培养液中，使探针浓度达到10μM，细胞与探针在37℃和含1-10％CO₂气氛的细胞培养箱中孵育0.5-1小时后，探针透过细胞膜，与细胞内Hg²⁺络合发出荧光，用不含探针和Hg²⁺的PBS缓冲液充分洗涤三次后，细胞在倒置荧光显微镜下进行拍照得到Hg²⁺分布的荧光图像，根据荧光变化，由此得到Hg²⁺的存在。