CN110698401A - 一种检测生物硫醇新型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种检测生物硫醇新型荧光探针的制备方法及应用，其属于生物硫醇分析检测技术领域。探针采用蒽酰亚胺为荧光母体，丙烯基为反应基团与生物硫醇反应，通过探针的荧光变化实现生物硫醇的检测。荧光探针与半胱氨酸反应仅5 min即可达到最大响应值，在601 nm处荧光强度显著增强121倍；检测下限为1.0 x10‑5mol/L；荧光探针和反应后的产物，在pH>6.5时荧光强度不受pH变化影响。检测时，观察到溶液颜色从无色至紫色，裸眼能直接判断有无生物硫醇存在。探针检测谷胱甘肽和同型半胱氨酸具有类似的效果。因此，所述荧光探针可用于检测生物硫醇，具有响应快速、灵敏度高、可在生理pH下工作的特点，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种检测生物硫醇新型荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测生物硫醇新型荧光探针及其制备方法和应用，属于生物硫醇探针的制备技术领域。
背景技术
生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(CYS)，同型半胱氨酸(HCY)在人的生理活动中有着重要的作用，当人体中的半胱氨酸水平异常时会引起生长缓慢，皮肤松弛，身体虚弱等症状。在人体中同型半胱氨酸浓度过高有可能引起心血管疾病和阿兹海默症。谷胱甘肽是细胞内最多的小分子生物硫醇(1-10mM)，在维持细胞的氧化还原动态平衡起着重要的作用，若其在人体中浓度异常，这又会与癌症有关，因此检测生物硫醇对人体有着重大意义。
目前检测生物硫醇的主要方法有电化学方，元素分析法，高效液相色谱法，质谱法，然而这些检测方法样品制备过程比较复杂，检测过程对样品损伤较大，仪器昂贵，检测时间长等缺点。近年，荧光探针方法广泛应用于分析检测领域，因其具有选择性好，灵敏度高，快速简便等优点，但是目前报道的生物硫醇荧光探针仍有不足之处，例如，专利CN106046012A与CN108947994A报道的探针反应时间较长，分别为50min和30min；论文中X.Dai,Q.H.Wu,P.C.Wang,J.Tian,Y.Xu,S.Q.Wang,J.Y.Miao,B.X.Zhao,BiosensBioelectron 2014,59,35-39.报道的检测生物硫醇荧光探针反应时间为90min；论文J.Zhou,S.Xu,X.Dong,W.Zhao,Q.Zhu,Dyes and Pigments 2019,167,157-163.报道的检测生物硫醇荧光探针反应时间为10min；专利CN107721922A报道的探针受pH影响较大。因此，发明快速响应，选择性好，灵敏度高，并且在生理条件下几乎不受pH影响的生物硫醇荧光探针，显得十分重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种选择性好，灵敏度高，快速便捷并且在生理条件下几乎不受pH影响的生物硫醇荧光探针，还提供该生物硫醇荧光探针的制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种检测生物硫醇荧光探针，其特征在于，该探针的分子式为C23H19NO4，具体结构式如下：
Figure BDA0002254298990000011
本发明的生物硫醇荧光探针，以半胱氨酸为例，对半胱氨酸的响应时间5min。所述响应时间为本发明的硫醇探针作用于含有半胱氨酸的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到最大所需时间。
本发明的生物硫醇荧光探针，能抗Gly，Arg，Trp，Lys，Trp，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+，ClO-，NO3 -，CO3 2-，SO4 2-，HCO3 -的干扰，选择特异性好。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的检测生物硫醇新型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)氮气保护下，将20mmol 9-溴蒽与25mmol无水三氯化铝溶于二硫化碳中，冰浴条件下滴加7.68ml草酰氯溶液，反应30分钟后，撤除冰浴，常温搅拌5-6小时；反应完全后逐渐滴加50ml 1M HCl溶液；冷却至室温，将反应液倒入水中，过滤，收集固体，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物6，其中化合物6结构式如下：
Figure BDA0002254298990000021
(2)氮气保护下，将3.82mol步骤(1)中所得的化合物6溶于甲醇，加入19.1mmol过氧单磺酸钾，加热至回流，搅拌反应48h，冷却至室温，将反应液倒入水中，过滤，收集固体，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物1，其中化合物5的结构式如下：
Figure BDA0002254298990000022
(3)氮气保护下，将1.98mmol步骤(2)所得的化合物溶于乙醇，滴加2.38mmol正丁胺溶液，加热至回流，搅拌8～12h，冷却至室温，旋干溶剂，最用硅胶层析柱进行纯化得到化合物4，其中化合物4结构式如式如下：
Figure BDA0002254298990000023
(4)氮气保护下，将0.523mmol步骤(3)所得的化合物溶于甲醇中，加入3.139mmol甲醇钠，加热至回流，搅拌1～2h，冷却至室温，旋干溶剂，最用硅胶层析柱进行纯化得到化合物3，其中化合物3结构如下：
(5)氮气保护下，将0.3mmol步骤(4)所得化合物溶于10ml氢碘酸中，加热至132℃，反应8～12h，反应结束后，冷却至室温，加入2M氢氧化钠溶液，调至pH＝4～5，过滤，最用硅胶层析柱进行纯化得到化合物2，其中化合物2结构如下：
Figure BDA0002254298990000032
(6)氮气保护下，将0.157mmol步骤(5)所得化合物溶于二氯甲烷中，冰浴下滴加1ml三乙胺溶液，搅拌30min后，滴加0.309mmol丙烯酰氯溶液，搅拌1～2h，反应完全后将反应液倒入水中并用二氯甲烷萃取，收集有机相，最后硅胶层析柱进行纯化即得到探针1。
所述步骤(1)中9-溴蒽与草酰氯的摩尔比为1:2～3，柱层析所用洗脱剂为体积比10:1的石油醚：乙酸乙酯。
所述步骤(2)中6-溴醋蒽烯-1,2-二酮与过氧单磺酸钾的摩尔比为1:4～5，柱层析所用洗脱剂为体积比1.5:1的二氯甲烷：石油醚。
所述的步骤(3)中6-溴-1,2二羧基蒽酸酐与正丁胺的摩尔比为1:1.2～1.5，柱层析所用洗脱剂为体积比2:1的二氯甲烷：石油醚。
所述的步骤(4)中N-正丁基-6-溴-蒽酰亚胺与甲醇钠的摩尔比为1:5～6，柱层析所用洗脱剂为体积比1:1的二氯甲烷：石油醚。
所述的步骤(5)中N-正丁基-6-甲氧基-蒽酰亚胺与氢碘酸的摩尔比为1:1～1.2，柱层析所用洗脱剂为体积比20:1的二氯甲烷：甲醇。
所述的步骤(6)中N-正丁基-6-羟基-蒽酰亚胺与丙烯酰氯的摩尔比为1:0.8～1，柱层析所用洗脱剂为体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯。
上述的生物硫醇荧光探针的合成路线如下：
Figure BDA0002254298990000041
化合物1即为探针。
该荧光探针可以利用荧光光谱仪检测水环境中的生物硫醇(以半胱氨酸为例)。
上述应用，具体的，包括：
观察加入生物硫醇荧光探针前后待测水环境的荧光光谱变化，荧光的激发波长为549nm。
所述荧光光谱变化是指：荧光光谱中，601nm处荧光峰值的变化；如果峰值增强，说明测试液中含有硫醇。优选的，采用荧光光谱仪对荧光光谱测试。
上述应用，具体的，包括以下步骤：
(1)将探针1溶于DMSO中，制成探针母液；
(2)将探针母液加入到待测液中；
用荧光光谱仪测试待测液中的荧光光谱，在601nm处的荧光峰值的变化，如果峰值增强，则说明测试液体中含有半胱氨酸；其中荧光光谱仪激发波长为549nm。
首先，水溶液中的半胱氨酸可以引起荧光探针的荧光光谱的变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中荧光光谱的变化情况判断溶液中半胱氨酸的含量，从而定量检测；其检测下限为1.0x10-5mol/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明的一种检测生物硫醇的新型荧光探针是以丙烯基为识别单元的荧光探针，实践表明，本发明的荧光探针分子在对生物硫醇进行检测时表现出较高选择性和灵敏度。
2.本发明的一种检测生物硫醇的新型荧光探针对半胱氨酸响应极快，反应5min就可以达到最大荧光强度，并且在生理环境下不受pH影响，半胱氨酸的检测下限为10x10- 6mol/L。
3.本发明的一种检测生物硫醇的新型荧光探针能抗Gly，Arg，Trp，Lys，Trp，Na+，K+,Mg2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+，ClO-，NO3 -，CO3 2-，SO4 2-，HCO3 -的干扰，选择特异性好。
附图说明
图1为实施例1化合物6的1H NMR图谱
图2为实施例1化合物5的1H NMR图谱。
图3为实施例1化合物4的1H NMR图谱。
图4为实施例1化合物3的1H NMR图谱。
图5为实施例1化合物2的1H NMR图谱。
图6为实施例1探针1的1H NMR图谱。
图7为实施例1探针1的13C NMR图谱。
图8为实施例1探针1的TOF-MS图谱。
图9为实施例2探针1与CYS反应前后吸收谱图。
图10为实施例3探针1与CYS，GSH，HCY反应前后荧光发射谱图。
图11为实施例4探针1在加入不同浓度CYS后在601nm处荧光变化谱图。
图12为实施例5探针1在不同pH下与CYS反应前后在601nm处荧光变化谱图。
图13为实施例6探针1化合物加入CYS反应前后，在601nm处荧光强度随时间变化谱图。
图14为实施例7探针1与其它氨基酸和常见阳离子与阴离子反应后在601nm处荧光谱图。
具体实施方式
实施例1
化合物6的合成：
Figure BDA0002254298990000051
具体过程为：氮气保护下，将9-溴蒽(4.21g，20mmol)与无水三氯化铝(3.24g，25mmol)，搅拌溶于二硫化碳(20～30ml)中，在冰浴条件下滴加草酰氯溶液(7.6ml)反应30分钟后，撤除冰浴，常温搅拌5-6小时；反应完全后逐渐滴加50ml1M HCl溶液；冷却至室温，将反应液倒入水中，过滤，收集固体，最后用硅胶层析柱进行纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到棕色固体(2.2g，产率35.5％)，所得固体为化合物6。通过核磁共振氢谱对该化合物进行表征结果如图1所示，具体结果为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.23(d,J＝8.5Hz,1H),8.70(d,J＝8.8Hz,1H),8.65(d,J＝8.8Hz,1H),8.12(d,J＝6.7Hz,1H),7.90(dd,J＝8.7,6.7Hz,2H),7.86(dd,J＝8.7,1.2Hz,1H).
化合物5的合成：
Figure BDA0002254298990000061
具体过程为：在氮气保护下，将化合物6(6-溴醋蒽烯-1,2-二酮1.2g，3.82mol)和过氧单磺酸钾(11.74g，19.1mmol)溶解于甲醇中(60～120ml)加热至70℃搅拌回流48小时，冷却至室温后，将反应液倒入水中，过滤，得到粗提取物(滤渣)固体经硅胶层析柱纯化(二氯甲烷：石油醚＝1.5:1)；得到黄色固体(0.79g，62.6％)，所得固体为化合物5。通过核磁共振氢谱对该化合物进行表征结果如图2所示，具体结果为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.83(d,J＝9.0Hz,1H),9.05(d,J＝5.2Hz,1H),8.84(d,J＝6.9Hz,1H),8.78(d,J＝8.9Hz,1H),8.00–7.87(m,2H),7.87–7.78(m,1H).
化合物4的合成：
具体过程为：在氮气保护下，将化合物5(6-溴-1，2二羧基蒽酸酐0.65g，1.98mmol)溶于乙醇(50～60ml)，滴加正丁胺溶液(200ul，2.38mmol)搅拌升温至80℃，回流反应8-12小时，冷却至室温后，旋干溶剂，得到粗提取物固体经硅胶层析柱纯化(二氯甲烷：石油醚＝2:1)得到橘色固体(0.32g，42.67％)，所得固体为化合物4。通过核磁共振氢谱对该化合物进行表征结果如图3所示，具体结果为：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ10.07(d,J＝9.0Hz,1H),8.90(d,J＝8.7Hz,1H),8.78(d,J＝6.9Hz,1H),8.70(d,J＝8.8Hz,1H),7.82(dt,J＝15.3,7.7Hz,2H),7.77–7.67(m,1H),4.33–4.19(m,2H),1.85–1.70(m,2H),1.51(dd,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.01(t,J＝7.4Hz,3H).
化合物3的合成：
Figure BDA0002254298990000063
具体过程为：在氮气保护下，化合物4(N-正丁基-6-溴-蒽酰亚胺0.2g，0.523mmol)与甲醇钠(0.169g，3.139mmol)溶于甲醇(50ml～100ml)，搅拌升温至70℃，反应回流1-2小时，冷却至室温后，旋干溶剂，得到粗提取物固体经硅胶层析柱纯化(二氯甲烷：石油醚＝1:1)得到黄色固体(0.108g，62％)，即化合物3。通过核磁共振氢谱对该化合物进行表征结果如图4所示，具体结果为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.10(d,J＝9.2Hz,1H),8.80(d,J＝6.2Hz,1H),8.69(d,J＝9.3Hz,1H),8.47(d,J＝8.7Hz,1H),7.92–7.81(m,1H),7.80–7.72(m,1H),7.72–7.63(m,1H),4.31(d,J＝6.9Hz,2H),4.27(d,J＝5.4Hz,3H),1.86–1.75(m,2H),1.53(dd,J＝15.1,7.5Hz,2H),1.03(t,J＝7.4Hz,3H).
化合物2的合成：
Figure BDA0002254298990000071
具体过程为：在氮气保护下，化合物3(N-正丁基-6-甲氧基-蒽酰亚胺0.1g，0.3mmol)溶于氢碘酸(10ml)，搅拌升温至132℃，反应回流8-12小时，冷却至室温后，加入2M氢氧化钠溶液，调至pH＝4～5，过滤，将粗提取物(滤渣)固体经硅胶层析柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)，得到深紫色固体(0.078g，82％)，即化合物2。通过核磁共振氢谱对该化合物进行表征结果如图5所示，具体结果为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.96(d,J＝9.1Hz,1H),8.94(d,J＝8.5Hz,1H),8.75–8.61(m,2H),7.94–7.81(m,1H),7.75(t,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝5.8Hz,1H),4.18–4.06(m,3H),1.71–1.57(m,2H),1.45–1.31(m,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).
探针1的合成：
Figure BDA0002254298990000072
具体过程为：氮气保护下，化合物2(N-正丁基-6-羟基-蒽酰亚胺0.05g，0.157mmol)溶于二氯甲烷(10ml)，冰浴下滴加三乙胺(1ml)，搅拌30分钟后，滴加丙烯酰氯溶液(0.028g，0.309mmol)，滴加完毕后，除去冰浴，室温搅拌1-2小时，反应完全后将反应液倒入水中并用二氯甲烷萃取，收集有机相，经硅胶层析柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到黄色固体(0.03g，51.7％)，即探针1。通过核磁共振氢谱对该化合物进行表征结果如图6所示，具体结果为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.12(d,J＝9.2Hz,1H),8.79(d,J＝7.0Hz,1H),8.32(d,J＝8.6Hz,1H),8.12(d,J＝8.7Hz,1H),7.91–7.81(m,1H),7.82–7.72(m,1H),7.70–7.61(m,1H),6.93(d,J＝17.3Hz,1H),6.67(dd,J＝17.3,10.5Hz,1H),6.33(d,J＝10.5Hz,1H),4.32–4.25(m,2H),1.79(dt,J＝15.3,7.7Hz,2H),1.51(dd,J＝15.1,7.5Hz,2H),1.01(t,J＝7.4Hz,3H).
探针1的13C NMR图谱如图7所示，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.69,163.87,163.47,149.41,135.06,134.64,133.55,131.24,128.89,128.35,127.26,127.22,126.59,126.06,125.20,122.93,122.38,121.89,114.24,40.54,30.27,20.51,13.89.
探针1所示的化合物的TOF-MS图谱如图8所示，ESI-MS m/z for C23H20NO4 +([M+H]+):calcd:374.1314，found:374.1381
实施例2
探针1与CYS反应前后吸收谱图变化
取实施1中制备的探针1溶于DMSO中，制成1.0mmol/L探针母液(探针1的浓度为1.0mmol/L)；将半胱氨酸配成浓度为10mmol/L的母液，并稀释至所需浓度。取两只离心管一只从探针母液中取30μL加入4mL的离心管中，加入300μL的PBS缓冲溶液(浓度100mmol/L，pH＝7.4)和2370μL去离子水，在加入300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸溶液，配制探针浓度为10μmol/L，半胱氨酸为1.0mmol/L，含1％DMSO的测试溶液，另一只不加入300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸溶液，用等量的水替代。首先测试吸收光谱，由图9实验结果说明最大吸收波长由492nm红移至549nm处.
实施例3
探针1与CYS，GSH，HCY反应前后荧光变化谱图
取实施1中制备的探针1溶于DMSO中，制成1.0mmol/L探针母液(探针1的浓度为1.0mmol/L)；将半胱氨酸，谷胱甘肽，同型半胱氨酸配成浓度为10mmol/L的母液，并稀释至所需浓度。取四只离心管其中三只分别加入30μL的探针1母液，加入300μL的PBS缓冲溶液(浓度100mmol/L，pH＝7.4)和2370μL去离子水，在加入300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸谷胱甘肽，同型半胱氨酸溶液。另一只除不加入氨基酸溶液，用等量的水代替，其它同以上三只。由图10实验结果说明无生物硫醇时，体系几乎无荧光，加入半胱氨酸后，荧光强度增强121倍，在601nm处荧光最强。
实施例4
探针1与不同浓度的CYS反应的荧光光谱变化
从实施例2中探针母液取出30μL加入4mL的离心管中，加入不同浓度的半胱氨酸溶液，用300μL的PBS缓冲溶液(浓度100mmol/L，pH＝7.4)和不同体积的去离子水稀释至3mL，配成探针浓度为10μmol/L，含1％DMSO的测试溶液。反应5min后荧光光谱仪测试探针与不同浓度半胱氨酸反应液的荧光光谱变化(激发波长为549nm)，荧光光谱情况如图10所示，随着加入半胱氨酸的浓度增大，探针1在601nm处的荧光值逐渐增强。当荧光值强度达到最大时，探针溶液的荧光强度增强121倍。实验结果说明，探针1可以通过荧光光谱仪检测半胱氨酸。
实施例5
探针1在不同pH下与CYS反应前后的荧光光谱变化
从实施例2中探针母液取出30μL加入4mL的离心管中，加入300μL不同pH的PBS缓冲溶液，在加入2370μL去离子水和300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸溶液，反应5min后荧光光谱仪测试探针的荧光光谱变化(激发波长为549nm)，由图11所示，在未加入半胱氨酸时，探针1的荧光强度在pH＝4.0-11.0时无明显变化；在加入半胱氨酸后，在pH＝2.0-6.0在荧光强度变化明显，在pH＝7.4左右荧光强度达到顶峰，pH＝7.4-11.0荧光强度几乎保持不变。
实施例6
探针1与CYS反应随时间变化的荧光变化
从实施例2中探针母液取出30μL加入4mL的离心管中，加入300μL的PBS缓冲溶液(浓度100mmol/L，pH＝7.4)和去离子水2370μL稀释，再加入300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸溶液，配成探针浓度为10μmol/L，含1％DMSO的测试溶液。用549nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱图。由图12所示，随着时间增加601nm处的荧光逐渐升高后保持平稳，在5min是荧光强度达到最大值。
实施例7
探针1对不同干扰物的选择性研究
从实施例2中探针母液取出30μL加入4mL的离心管中，分别加入以下不同的分析物(干扰物浓度为1.0mmol/L；半胱氨酸，谷胱甘肽，同型半胱氨酸浓度为1.0mmol/L):Gly，Arg，Trp，Lys，Trp，Na+，K+,Mg2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+，ClO-，NO3 -，CO3 2-，SO4 2-，HCO3 -，用300μL的PBS缓冲溶液(浓度100mmol/L，pH＝7.4)和不同体积的去离子水稀释至3mL，配成探针浓度为10μmol/L，含1％DMSO的测试溶液，反应5min后检测测试液的荧光光谱变化。由图13可以发现，加入各种离子和氨基酸的测试荧光强度没有明显变化。然而，加入半胱氨酸，谷胱甘肽，同型半胱氨酸的测试液荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针1对生物硫醇有很好选择性。

Claims (6)

1.一种检测生物硫醇的荧光探针，其特征在于，该探针的分子式为C23H19NO4，具体结构式如下：
Figure FDA0002254298980000011
2.根据权利要求1所述的一种检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)氮气保护下，将9-溴蒽与无水三氯化铝溶于二硫化碳中，冰浴条件下滴加草酰氯溶液，反应30分钟后，撤除冰浴，常温搅拌5-6小时；反应完全后逐渐滴加50ml 1M HCl溶液；冷却至室温，将反应液倒入水中，过滤，收集固体，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物6，其中化合物6结构式如下：
Figure FDA0002254298980000012
(2)氮气保护下，将步骤(1)中所得的化合物6溶于甲醇，加入过氧单磺酸钾，加热至回流，搅拌反应48h，冷却至室温，将反应液倒入水中，过滤，收集固体，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物5，其中化合物5的结构式如下：
Figure FDA0002254298980000013
(3)氮气保护下，将步骤(2)所得的化合物溶于乙醇，滴加正丁胺溶液，加热至回流，搅拌8-12h，冷却至室温，旋干溶剂，最用硅胶层析柱进行纯化得到化合物4，其中化合物4结构式如式如下：
Figure FDA0002254298980000014
(4)氮气保护下，将步骤(3)所得的化合物溶于甲醇中，加入甲醇钠，加热至回流，搅拌1-2h，冷却至室温，旋干溶剂，最用硅胶层析柱进行纯化得到化合物3，其中化合物3结构如下：
Figure FDA0002254298980000021
(5)氮气保护下，将步骤(4)所得化合物溶于氢碘酸中，加热至132℃，反应8-12h，反应结束后，冷却至室温，加入2M氢氧化钠溶液，调至pH＝4～5，过滤，最用硅胶层析柱进行纯化得到化合物2，其中化合物2结构如下：
Figure FDA0002254298980000022
(6)氮气保护下，将步骤(5)所得化合物溶于二氯甲烷中，冰浴下滴加1ml三乙胺溶液，搅拌30min后，滴加丙烯酰氯溶液，搅拌1-2h，反应完全后将反应液倒入水中并用二氯甲烷萃取，收集有机相，最后硅胶层析柱进行纯化即得到探针1。
3.根据权利要求2所述的一种检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中9-溴蒽与草酰氯的摩尔比为1:2～3，柱层析所用洗脱剂为体积比10:1的石油醚：乙酸乙酯；
所述步骤(2)中6-溴醋蒽烯-1,2-二酮与过氧单磺酸钾的摩尔比为1:4～5，柱层析所用洗脱剂为体积比1.5:1的二氯甲烷：石油醚；
所述的步骤(3)中6-溴-1,2二羧基蒽酸酐与正丁胺的摩尔比为1:1.2～1.5，柱层析所用洗脱剂为体积比2:1的二氯甲烷：石油醚；
所述的步骤(4)中N-正丁基-6-溴-蒽酰亚胺与甲醇钠的摩尔比为1:5～6，柱层析所用洗脱剂为体积比1:1的二氯甲烷：石油醚；
所述的步骤(5)中N-正丁基-6-甲氧基-蒽酰亚胺与氢碘酸的摩尔比为1:1～1.2，柱层析所用洗脱剂为体积比20:1的二氯甲烷：甲醇；
所述的步骤(6)中N-正丁基-6-羟基-蒽酰亚胺与丙烯酰氯的摩尔比为1:0.8～1，柱层析所用洗脱剂为体积比5:1的石油醚：乙酸乙酯。
4.根据权利要求1所述的一种检测生物硫醇的新型荧光探针的应用，其特征在于，将所述生物硫醇荧光探针与磷酸盐缓冲液和二甲基亚砜的缓冲溶液混合，加入待测溶液，利用两个不同发射波长处荧光强度的变化来检测生物硫醇的存在与否。
5.根据权利要求4所述的一种检测生物硫醇的新型荧光探针的应用，其特征在于：所述待测溶液中无生物硫醇时，反应溶液的最大激发波长位于492nm处，当加入生物硫醇后，最大激发波长位于549nm，最大荧光发射波长601nm。
6.根据权利要求4所述的一种检测生物硫醇的新型荧光探针的应用，其特征在于，所述生物硫醇包括半胱氨酸，同行半胱氨酸，谷胱甘肽的任意一种。
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