CN116656147B - 一种可猝灭血液背景荧光的染料、硫化氢探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种可猝灭血液背景荧光的染料、硫化氢探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可猝灭血液背景荧光的染料、硫化氢探针及其制备方法和应用，本发明提出了利用探针本身去猝灭血液的背景荧光，设计了两种荧光探针(BOD‑H2S、Np‑BOD‑H2S)，荧光探针与H2S反应后，释放出荧光团，产生很强的荧光信号。本发明所述荧光探针能够有效猝灭血液背景荧光信号，显著提高探针的灵敏度，为全血样品中微量分析物的定量检测提供可能；本发明所述荧光探针对H2S的响应快速，30min左右能够响应饱和；本发明所述荧光探针对H2S的选择性好；本发明所述荧光探针实现了小鼠/人体全血样品中H2S的定量检测；本发明所述荧光探针实现了临床心血管病人全血样品中H2S的定量检测，体现了本发明临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于全血荧光分析技术领域，具体涉及一种可猝灭血液背景荧光的染料、硫化氢探针及其制备方法和应用。
背景技术
血液检测是临床上一种常见的检测方法，会对血液中各种细胞的数量、形态、比例以及血液组分进行检测。在当前的医疗条件下，血液细胞分析仪，血球分析仪，血球计数仪等仪器作为医院临床检测中应用特别广泛的仪器，但是这些方法仍存在灵敏度不够、操作复杂、需要对血液进行样品预处理等问题。荧光分析法则可以很好地解决上述问题，简化血液检测的步骤，提高分析的灵敏度。但是由于血液背景荧光很高，而现有荧光分析法，往往需要离心分离得到血浆，不仅去除了血液中的很多成分，而且会造成一些不稳定物质的含量降低，易造成检测结果不准确。同时血液是非均相的，有机荧光探针往往水溶性不好，需要添加有机溶剂，如DMSO来辅助探针溶解。而有机溶剂超过一定比例(>10％)会引起血液变性。
硫化氢(H2S)是一种气体信号分子，是人体血液中的一种高活性微量成分，参与一系列生理和病理过程。许多研究表明，H2S的异常浓度与心血管疾病和癌症密切相关。血液中H2S的正常浓度约为40-50μM，但在发生心血管疾病时，血液中H2S的含量会降至20-30μM。将正常血液样本或心血管疾病血液样本稀释20倍后，其浓度将变为1.0-2.5μM。因此，精确检测全血样本中的H2S浓度至关重要，但仍具有挑战性。
现有技术中，硫化氢荧光探针均无法实现全血中H2S含量的准确定量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可猝灭血液背景荧光的染料、硫化氢探针及其制备方法和应用，以解决全血样品背景荧光高导致传统荧光探针无法直接用于全血样品的高灵敏检测的问题。
本发明提供一种可猝灭血液背景荧光的染料，所述染料的结构式如下：
本发明提供一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针(BOD-H2S)，其结构式如下：
本发明还提供所述一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氟硼荧类染料(化合物BOD)和对羟基苯甲醛溶于冰醋酸中，滴加适量的哌啶，在预定温度下进行加热回流，反应完全后，减压蒸馏去掉溶剂，重新溶解粗产物后，纯化后得到所述可猝灭血液背景荧光的染料；
(2)将步骤(1)所得染料溶于溶剂中，加入碳酸钾，常温搅拌预定时间后，然后加入NBD-Cl(4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)，继续反应设定时间，反应完全后，减压蒸馏去掉溶剂，重新溶解粗产物后，纯化后得到硫化氢探针BOD-H2S；
其反应式为：
优选的，步骤(1)中，BOD、对羟基苯甲醛的物质的量之比为1：(1～6)。
优选的，步骤(1)中，通过硅胶柱分离纯化，以二氯甲烷和乙醇的混合溶液为洗脱剂。
进一步，步骤(1)中，二氯甲烷和乙醇的体积比为100：(1～10)。
优选的，步骤(2)中，染料、NBD-Cl和碳酸钾的物质的量之比为1：(1～1.5)：(1.5～3)。
优选的，步骤(2)中，通过硅胶柱分离纯化，以二氯甲烷和乙醇的混合溶液为洗脱剂。
进一步，步骤(2)中，二氯甲烷和乙醇的体积比为100：(1～5)。
本发明提供一种可猝灭血液背景荧光的聚合物负载纳米探针，由所述的硫化氢探针、聚合物制成，合成过程如图1所示。
本发明还提供所述聚合物负载纳米探针的合成方法，包括：
将硫化氢探针BOD-H2S、聚合物溶于溶剂中，进行超声处理，然后迅速加入到去离子水中，继续超声处理；所述聚合物为mPEG-PPG-PEG；
通过蒸发去除混合溶液的溶剂，加入DPBS缓冲液，得到聚合物负载纳米探针Np-BOD-H2S，置于0～8℃保存备用。
优选的方案，BOD-H2S、mPEG-PPG-PEG的质量之比为1：(100～500)，测试效果较好。
更优选的方案，BOD-H2S、mPEG-PPG-PEG的质量之比为1：240，可得到最佳测试效果。
本发明还提供所述可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针的应用，将其作为荧光探针应用于检测全血、血浆、细胞、组织、体外缓冲溶液中硫化氢。
本发明还提供所述可猝灭血液背景荧光的聚合物负载纳米探针的应用，将其作为荧光探针应用于检测全血、血浆、细胞、组织、体外缓冲溶液中硫化氢。
本发明提出了利用探针本身去猝灭血液的背景荧光，设计了两种荧光探针(BOD-H2S、Np-BOD-H2S)，荧光探针与H2S反应后，释放出荧光团，产生很强的荧光信号。探针和荧光团都能高效猝灭血液背景荧光，从而检测体系具有极低的背景，实现全血样品中H2S的高灵敏检测。
因此，针对目前荧光探针不能够准确检测全血中微量物质等问题，基于荧光内滤效应，研究出一种探针及荧光团本身可以猝灭血液背景荧光的硫化氢探针，以准确定量全血中微量物质或不稳定物质。本发明提出的抑制血液背景荧光的传感策略，并在此基础上发展的探针能够实现快速、高灵敏检测全血中微量分析物，本发明具有较大的原始创新性和广泛的临床应用前景。
本发明发展了可猝灭血液背景荧光且具有良好水溶性的聚合物负载纳米探针，用于准确检测全血中硫化氢(H2S)含量。本发明能够很好地克服血液背景荧光的干扰，有望提高血液荧光分析的准确性和灵敏度。
与现有技术相比，具有的有益技术效果为：
1)所述荧光探针能够有效猝灭血液背景荧光信号，显著提高探针的灵敏度，为全血样品中微量分析物的定量检测提供可能；
2)所述荧光探针对H2S的响应快速，30min左右能够响应饱和；
3)所述纳米荧光探针对H2S的选择性好；
4)所述纳米荧光探针实现了小鼠/人体全血样品中H2S的定量检测；
5)所述纳米荧光探针实现了临床心血管病人全血样品中H2S的定量检测，体现了本发明临床应用前景。
附图说明
图1为聚合物负载纳米探针的合成过程。
图2为含5％血液的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)的紫外可见吸收光谱(A)、416nm激发下荧光发射光谱(B)、580nm激发下荧光发射光谱(C)。
图3为含5％血液的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)的荧光发射光谱随着所述荧光染料浓度增加的变化曲线，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。
图4为含5％血液的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)的荧光发射光谱随着所述探针BOD-H2S浓度增加的变化曲线，(A)416nm激发；(B)543nm激发；(C)580nm激发；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。
图5为含5％血液的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)的荧光发射光谱随着所述探针Np-BOD-H2S浓度增加的变化曲线，(A)416nm激发；(B)580nm激发；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。
图6为所述荧光探针BOD-H2S与H2S反应荧光滴定曲线，横坐标为荧光发射波长，纵坐标为荧光发射强度，测试体系为DPBS/MeCN，pH 7.4，探针浓度为10μM。
图7为所述荧光探针Np-BOD-H2S与H2S反应荧光滴定曲线，(A)0-50μM H2S；(B)0-5μM H2S；(C)依据图7B获得的探针工作曲线；横坐标为荧光发射波长，纵坐标为荧光发射强度，测试体系为DPBS，探针浓度为10μM。
图8为所述荧光纳米探针Np-BOD-H2S检测含5％小鼠血液中H2S的荧光滴定曲线(A)，(B)依据图8A获得的探针工作曲线，横坐标为荧光发射波长，纵坐标为荧光发射强度，测试体系为DPBS，探针浓度为30μM。
图9为所述荧光纳米探针Np-BOD-H2S检测含5％人体血液中H2S的荧光滴定曲线(A)，(B)依据图9A获得的探针工作曲线，横坐标为荧光发射波长，纵坐标为荧光发射强度，测试体系为DPBS，探针浓度为30μM。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原料如无说明均能从公开商业途径获得。
实施例1一种可猝灭血液背景荧光的H2S探针BOD-H2S的合成
(1)将化合物BOD(1.20g,3.14mmol)即一种氟硼荧类染料和3倍当量的对羟基苯甲醛(0.86g,7.00mmol)溶于100mL甲苯和1mL冰醋酸中，加入3-5滴哌啶，加热回流下5h，监控反应完全后，减压蒸馏去掉溶剂，重新溶解粗产物后，柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷与乙醇的体积比为100:1到10:1)得到紫黑色固体(1.10g,60％)，即为染料；
染料的结构：
染料的质谱及核磁表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.49(d,J＝8.7Hz,4H),7.47-7.45(m,2H),7.36(d,J＝11.0Hz,2H),7.33(s,2H),7.13(d,J＝8.3Hz,2H),6.92(s,2H),6.88(d,J＝8.1Hz,4H),4.90(d,J＝32.7Hz,2H),4.20(q,J＝7.0Hz,2H),1.47(s,6H),1.22(m,J＝9.4Hz,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝137.92,135.64,132.05,129.08,128.86,128.56,125.33,122.82,120.47,119.55,119.53,110.97,101.83,101.80,77.39,77.07,76.75,30.41,30.10,29.79.
HR-MS(MALDI-TOF-MS):m/z＝634.2453,calcd for[C37H33BF2N2O5]+＝634.2452
([M+H]+).
(2)将上述得到的染料(0.25g,0.40mmol)溶于DMF中，加入2倍当量的碳酸钾，常温搅拌10分钟后，加入1.2倍当量的NBD-Cl(4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)后继续反应1h，监控反应完全后，减压蒸馏去掉溶剂，重新溶解粗产物后，通过硅胶柱分离纯化，以二氯甲烷和乙醇的混合溶液(100:1到100:5，v/v)为洗脱剂，分离纯化得探针BOD-H2S；(0.32g,70％)；
BOD-H2S的结构：
BOD-H2S的质谱及核磁表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.62(d,J＝21.8Hz,2H),7.83(d,J＝8.3Hz,4H),7.70(d,J＝16.4Hz,2H),7.56(d,J＝16.3Hz,2H),7.53(d,J＝13.5Hz,4H),7.39(d,J＝8.3Hz,2H),7.16(d,J＝8.3Hz,2H),7.04(s,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,2H),4.91(s,2H),4.21(m,2H),1.51(s,6H),1.24(m,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝179.16,169.02,162.45,159.00,157.43,156.38,153.87,153.32,152.38,150.54,145.87,144.79,136.08,135.86,135.15,133.85,133.29,130.97,129.90,128.10,122.07,117.42,115.97,64.36,61.17,14.91,14.50,13.85.
HR-MS(MALDI-TOF-MS):m/z＝960.2461,calcd for[C49H35BF2N8O11]+＝960.2489
([M+H]+).
实施例2BOD-H2S的聚合物封装即纳米探针Np-BOD-H2S的合成
将0.8mg探针BOD-H2S与220mg聚合物(mPEG-PPG-PEG)溶于2mL THF中，然后在剧烈超声处理下迅速倒入含有18mL蒸馏去离子水的小瓶中，继续超声20分钟。然后通过蒸发去除混合溶液的THF，并用DPBS缓冲液将混合溶液的体积补充至20.00ml，得到的纳米探针Np-BOD-H2S在4℃保存备用；
其中，BOD-H2S、mPEG-PPG-PEG的质量之比为1:240，可得到最佳测试效果。
实施例3染料和BOD-H2S探针在缓冲体系里对全血样品背景荧光的猝灭
将染料和BOD-H2S探针配成1mM的DMSO储备溶液，于-20℃下保存。检测体系为DPBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4，含5％的DMSO)。将BOD-H2S探针与5％小鼠血液的反应体系在室温下下摇荡30分钟，然后测量血液的背景荧光发射光谱。
设置荧光仪的激发波长为416nm，543或580nm，发射波长接收范围为600-800nm。其结果如图3，4所示，从图3可以看出，所述染料对血液背景荧光有很好的猝灭效果，当染料的浓度达到30μM时对血液背景荧光的猝灭效率达到约70％；从图4可以看出，所述BOD-H2S探针对血液背景荧光有很好的猝灭效果，当BOD-H2S探针的浓度达到30μM时对血液背景荧光的猝灭效率达到约80％。
实施例4Np-BOD-H2S纳米探针在缓冲体系里对全血样品背景荧光的猝灭
检测体系为DPBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)。将按照实施例2合成好的Np-BOD-H2S纳米探针与5％小鼠血液的反应体系在室温下摇荡30分钟，然后测量血液的背景荧光发射光谱。
设置荧光仪的激发波长为416nm或580nm，发射波长接收范围为600-800nm。其结果如图5所示，从图5可以看出，所述Np-BOD-H2S纳米探针对血液背景荧光有很好的猝灭效果，当染料和BOD-H2S探针的浓度达到30μM时对血液背景荧光的猝灭效率达到约80％。
实施例5BOD-H2S探针在缓冲体系里对H2S的检测
将BOD-H2S探针配成1mM的DMSO储备溶液，于-20℃下保存。检测体系为DPBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4，含50％的乙腈)。将BOD-H2S探针与硫化氢的反应体系在37℃下摇荡30分钟，然后测量其荧光发射光谱。设置荧光仪的激发波长为580nm，发射波长接收范围为600-800nm。其结果如图6所示，从图6可以看出，所述BOD-H2S探针对硫化氢有很好的响应。
实施例6Np-BOD-H2S探针在缓冲体系里对H2S的检测
检测体系为DPBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)。将按照实施例2合成好的Np-BOD-H2S纳米探针与硫化氢的反应体系在37℃下摇荡30分钟，然后测量检测体系的荧光发射光谱。
设置荧光仪的激发波长为580nm，发射波长接收范围为600-800nm。其结果如图7所示，从图7可以看出，所述Np-BOD-H2S纳米探针对硫化氢有很好的响应。
实施例7Np-BOD-H2S探针在缓冲体系里对小鼠血液样品中H2S的检测
检测体系为DPBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)。将按照实施例2合成好的Np-BOD-H2S纳米探针与含5％的小鼠血液样品反应体系在37℃下摇荡30分钟，然后测量检测体系的荧光发射光谱。
设置荧光仪的激发波长为580nm，发射波长接收范围为600-800nm。其结果如图8所示，从图8可以看出，所述Np-BOD-H2S纳米探针对硫化氢有很好的响应，且探针在0-4μM的硫化氢浓度范围内具有良好的线性，可用于小鼠血液样品硫化氢含量的测定。
实施例8Np-BOD-H2S探针在缓冲体系里对人血液样品中H2S的检测
检测体系为DPBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)。将按照实施例2合成好的Np-BOD-H2S纳米探针与含5％的人血液样品反应体系在37℃下摇荡30分钟，然后测量检测体系的荧光发射光谱。
设置荧光仪的激发波长为580nm，发射波长接收范围为600-800nm。其结果如图9所示，从图9可以看出，所述Np-BOD-H2S纳米探针对硫化氢有很好的响应，且探针在0-4μM的硫化氢浓度范围内具有良好的线性，可用于实际血液样品硫化氢含量的测定。
本发明公开了一种可猝灭血液背景荧光的染料、硫化氢探针及其制备方法和应用，研究了荧光染料、荧光探针、纳米探针在缓冲溶液中对血液背景荧光的猝灭性能；并考察了两种探针在缓冲溶液中对硫化氢的响应性能；及考察了所述纳米探针在缓冲溶液中对血液样品中的硫化氢的检测性能。本发明首次提出了基于荧光内滤效应，构建荧光探针以猝灭血液背景荧光，克服了现有荧光探针不适用于全血检测及灵敏度不高的问题；合成了一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针，且所述荧光探针能够有效猝灭血液背景荧光，能够有效降低背景荧光信号，提高探针的灵敏度；所述荧光纳米探针对硫化氢选择性好、灵敏度高，可实现血液样品中硫化氢的高灵敏检测。
Claims (8)
1.一种可猝灭血液背景荧光的染料，其特征在于，所述染料的结构式如下：
2.一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针，其特征在于，其结构式如下：
3.根据权利要求2所述一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氟硼荧类染料和对羟基苯甲醛溶于冰醋酸中，滴加适量的哌啶，在预定温度下进行加热回流，反应完全后，减压蒸馏去掉溶剂，重新溶解粗产物后，纯化后得到所述可猝灭血液背景荧光的染料；
(2)将步骤(1)所得染料溶于溶剂中，加入碳酸钾，常温搅拌预定时间后，然后加入NBD-Cl，继续反应设定时间，反应完全后，减压蒸馏去掉溶剂，重新溶解粗产物后，纯化后得到硫化氢探针BOD-H2S；
其反应式为：
4.根据权利要求3所述一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，BOD、对羟基苯甲醛的物质的量之比为1：(1～6)。
5.根据权利要求3所述一种可猝灭血液背景荧光的硫化氢探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，染料、NBD-Cl和碳酸钾的物质的量之比为1：(1～1.5)：(1.5～3)。
6.一种可猝灭血液背景荧光的聚合物负载纳米探针，其特征在于，由权利要求2所述的硫化氢探针、聚合物制成。
7.根据权利要求6所述聚合物负载纳米探针的合成方法，其特征在于，包括：
将硫化氢探针BOD-H2S、聚合物溶于溶剂中，进行超声处理，然后迅速加入到去离子水中，继续超声处理；所述聚合物为mPEG-PPG-PEG；
通过蒸发去除混合溶液的溶剂，加入DPBS缓冲液，得到聚合物负载纳米探针Np-BOD-H2S，置于0～8℃保存备用。
8.根据权利要求7所述聚合物负载纳米探针的合成方法，其特征在于，BOD-H2S、mPEG-PPG-PEG的质量之比为1：(100～500)。
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