CN115109081B - 一种辣椒素衍生化光敏剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辣椒素衍生化光敏剂及其制备方法与应用，该光敏剂以氟硼二吡咯为母核，通过扩大π体系使其最大吸收峰红移到近红外区，并将辣椒素靶向基团引入氟硼二吡咯结构中，构建得到辣椒素衍生化光敏剂cap‑BDP，具有高效TRPV1蛋白靶向性。本发明制备的光敏剂，在低功率LED光照下产生的单线态氧能够靶向激活TRPV1蛋白通道，引起显著钙离子内流，诱导肿瘤细胞凋亡，同时产生的单线态氧可直接氧化细胞内源性物质(如蛋白质、脂肪酸或核酸等)导致细胞凋亡，最终实现光诱导的双功能协同治疗。此外，本发明采用两亲性嵌段聚合物作为药物载体与光敏剂cap‑BDP在水体系中组装形成纳米光敏剂cap‑BDP‑NPs，可用于光诱导三阴性乳腺癌治疗。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料及生物医药技术领域，具体涉及一种辣椒素衍生化光敏剂及其制备方法与应用。
背景技术
TRPV1蛋白是2021年诺贝尔生理学奖获得者Julius教授及其团队于20世纪末成功克隆并命名。研究发现TRPV1蛋白能被辣椒素或热(>43℃)特异性激活，这些物理刺激可通过细胞膜上TRPV1通道统一转化为电信号，在神经细胞间连续传导，最终可到达大脑皮层，产生不同的感受。此发现不仅解释了人摄取辣椒时感受的刺激感，同时揭示了人感受温度的生物机理。TRPV1蛋白被激活后，引起Ca2+离子内流、K+离子外流，从而调控细胞钙信号或胞膜去极化，并介导机体对内、外源性化学刺激和温度等物理刺激做出反应，将相关信号传递给中枢神经并产生痛觉。除辣椒素、香草素衍生物、热(>43℃)、酸性(pH值<6)外，TRPV1蛋白能被花生四烯代谢物、过氧化氢、一氧化氮、活性氧物质等机体内源性物质激活，表现出丰富的生物学效应。已有多家药企尝试开发TRPV1靶向药物，目前已获批上市的有辣椒碱(Capsaicin)和西维酰胺(Zucapsaicin)，用于骨关节炎、带状疱疹后神经痛、糖尿病周围神经痛。仍有20余种TRPV1靶向药物处于研发阶段。
此外，近年来研究发现TRPV1蛋白在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌等多种类型肿瘤的发生和发展中同样发挥着重要作用，与肿瘤细胞增殖、死亡和转移之间存在直接关联。研究者将辣椒素(Capsaicin)作用于肠道上皮细胞的TRPV1蛋白用于激活钙蛋白酶，导致蛋白酪氨酸磷酸酶1B活化，从而抑制EGFR诱导的上皮细胞增殖，最终抑制肠肿瘤发生。另有数据显示TRPV1激动剂能有效激活TRPV1蛋白的Ca2+离子通道，引起Ca2+离子内流，最终诱导肿瘤细胞死亡。然而，TRPV1蛋白广泛分布于人体内多种器官、组织和细胞，表现出复杂的生理、病理功能。但目前TRPV1激动剂普遍存在水溶性差、靶向性不够、给药剂量高等缺陷，易导致严重的毒副作用。
Pu课题组基于TRPV1蛋白的热敏感性，利用纳米递送技术设计合成了具有高光热转换效率的半导体纳米聚合物SPN，利用光热效应精准控制神经元细胞TRPV1蛋白激活(J.Am.Chem.Soc.2016,138,9049-9052)。SPN表现出较高的光热转换能力，能与温度敏感的TRPV1离子蛋白靶向结合，并以安全可逆的方式快速地激活神经细胞Ca2+离子内流。随后，Pu课题组在SPN化合物基础上，将辣椒素(CAP)包封形成离子通道靶向纳米药物SPN-C，可以通过光热激活TRPV1蛋白(Nano Lett,2018,18,1498-1505)。在短时间内多次照射，纳米胶束可反复释放TRPV1激动剂CAP，从而多重激活细胞膜上的TRPV1通道，造成累积效应，诱导细胞凋亡。另有研究者设计合成光热激活TRPV1蛋白的纳米胶束(iScience,2020,23,101049)。他们将具有高光热转换率的CuS包裹于CaCO3纳米胶束中，通过修饰聚乙二醇提高生物相容性，最终得到CuS@CaCO3-PEG纳米胶束。CuS@CaCO3-PEG通过EPR效应被动靶向至肿瘤细胞，并在肿瘤微酸环境中发生响应性分解，释放出CuS和Ca2+。在光照条件下，CuS纳米粒产生的高热激活TRPV1蛋白，游离Ca2+涌入至细胞内，使胞内钙离子浓度迅速上升，引起线粒体功能异常(Caspase-3，细胞色素c的上调以及Bcl-2和ATP的下调)，从而杀伤细胞。光热效应虽然表现出良好的TRPV1蛋白激活特性，但此过程往往需要较高浓度的光热试剂靶向于肿瘤组织。此外，高热的传递严重依赖于周围介质的热交换效率，其精准性较差且难以控制，易造成周围正常组织或细胞的损害。
因此，如何提高TRPV1激动剂的靶向性，实现TRPV1蛋白精准激活是当前亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种辣椒素衍生化光敏剂及其制备方法与应用，以氟硼二吡咯(BODIPY)为母核，通过扩大π体系使其最大吸收峰红移到近红外区，并将辣椒素靶向基团引入BODIPY结构中，构建得到TRPV1靶向近红外光敏剂cap-BDP。在低功率LED光照下，可实现光诱导TRPV1蛋白通道激活，并利用其光动力活性实现双功能肿瘤协同治疗；由cap-BDP与两亲性嵌段聚合物自组装形成的纳米光敏剂可用于光诱导三阴性乳腺癌治疗。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种辣椒素衍生化光敏剂，所述光敏剂的结构通式如下所示：
其中，n为1～10的任一整数；
R选自氢、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基中的一种。
进一步地，R为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、已基、辛基、甲氧基、乙氧基、4-丙炔氧基或叔丁氧基。
本发明第二方面提供了一种第一方面所述辣椒素衍生化光敏剂的制备方法，包括以下步骤：在惰性气氛下，
(1)将式(I)所示的化合物与2,4-二甲基吡咯在三氟乙酸以及有机溶剂存在下反应，然后加入氧化剂继续反应，反应结束后向体系中加入三氟化硼乙醚和有机胺，反应得到式(II)所示的化合物；
(2)将式(II)所示的化合物与碘化试剂在有机溶剂存在下反应，得到式(III)所示的化合物；
(3)将式(III)所示的化合物与式(IV)所示的化合物在醋酸、哌啶和有机溶剂存在下反应，得到式(V)所示的化合物；
(4)将式(V)所示的化合物与香兰素胺或其盐在缩合剂和有机溶剂存在下反应，制备得到所述辣椒素衍生化光敏剂；
上述式(I)～式(V)如下：
其中，n为1～10的任一整数，R选自氢、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基中的一种。
进一步地，在惰性气氛下，式(I)所示的化合物由对羟基苯甲醛与卤代烷基酸在缚酸剂、催化剂以及有机溶剂存在下回流反应得到；所述卤代烷基酸为Br-CH2(CH2)nCOOH或I-CH2(CH2)nCOOH，n为1～10的任一整数；所述缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠或碳酸铯；所述催化剂为苯并-18-冠-6-醚；所述有机溶剂优选为乙腈。
进一步地，步骤(1)中，所述氧化剂为2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌或二氧化硒。
进一步地，步骤(1)中，在冰浴条件下，向体系中加入三氟硼乙醚和有机胺并反应。
进一步地，步骤(1)中，所述有机胺为三乙胺或二异丙基乙胺。
进一步地，步骤(1)中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃。
进一步地，步骤(2)中，所述碘化试剂包括但不限于N-碘代丁二酰亚胺、单质碘、N-碘代糖精。
进一步地，步骤(2)中，所述有机溶剂为二氯甲烷。
进一步地，步骤(2)中，所述反应优选在避光条件下进行。
进一步地，步骤(3)中，所述有机溶剂为乙腈。
进一步地，步骤(3)中，所述反应的温度为50～130℃，反应的时间不小于0.5h。
进一步地，步骤(4)中，所述香兰素胺的盐包括香兰素胺盐酸盐。
进一步地，步骤(4)中，所述缩合剂为(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐、二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
进一步地，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
进一步地，步骤(4)中，所述反应在缚酸剂和/或催化剂的存在下进行；所述缚酸剂为二异丙基乙胺或三乙胺，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
本发明第三方面提供了一种纳米光敏剂，所述纳米光敏剂由第一方面所述的辣椒素衍生化光敏剂与两亲性嵌段聚合物于水中自组装形成。
进一步地，所述两亲性嵌段聚合物为聚乙二醇-b-聚己内酯、聚乙二醇-聚谷氨酸、聚2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯中的一种或多种。
本发明第四方面提供了一种第三方面所述的纳米光敏剂的制备方法，将第一方面所述的辣椒素衍生化光敏剂与两亲性嵌段聚合物溶于有机溶剂中，向得到的溶液中加水，经透析处理后得到所述纳米光敏剂；所述透析处理的透析介质为水。
进一步地，所述水加入的量与溶液的体积比为1～10：1；通过调节水加入的量可以调控纳米光敏剂的粒径。
本发明第五方面提供了一种第三方面所述的纳米光敏剂在制备用于光诱导三阴性乳腺癌治疗的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.本发明以氟硼二吡咯(BODIPY)为母核，通过扩大π体系使其最大吸收峰红移到近红外区，并将辣椒素靶向基团引入BODIPY结构中，构建得到TRPV1靶向近红外光敏剂cap-BDP。在低功率LED(660nm，20mW cm-2)光照下，光敏剂cap-BDP表现出较强的单线态氧产生能力，其单线态量子产率为0.73。另外，本发明通过体外细胞实验，发现光敏剂cap-BDP能有效激活TRPV1蛋白并改变细胞内钙离子浓度，且光照条件能有效提升光敏剂cap-BDP的钙离子调控能力，通过单线态氧(1O2)进一步激活TRPV1蛋白从而增加细胞内钙离子浓度，从而诱导肿瘤细胞凋亡，同时产生的单线态氧可直接作用细胞内其他内源性物质，杀伤肿瘤细胞。此外，本发明从细胞水平上验证了钙离子内流是通过TRPV1通道实现的。
2.本发明采用两亲性嵌段聚合物作为药物载体与光敏剂cap-BDP在水体系中组装形成纳米光敏剂cap-BDP-NPs，制备得到的纳米光敏剂尺寸均一，可用于在体内的生物效应测试。本发明通过动物实验研究了纳米光敏剂cap-BDP-NPs的药代动力学以及体内抑瘤情况，试验结果表明，纳米光敏剂cap-BDP-NPs具有良好长循环效果，有利于在肿瘤部位富集；且纳米光敏剂cap-BDP-NPs光照后能有效产生活性氧物质，同时引起小鼠肿瘤部位钙离子内流，从而起到协同治疗效果，可有效抑制肿瘤甚至达到部分肿瘤达到消融的效果，表现出优越的体内治疗效果，有望实现三阴乳腺癌的高效治疗。
附图说明
图1为光敏剂cap-BDP的合成路线；
图2为实施例1制备的光敏剂cap-BDP的核磁共振氢谱；
图3为实施例1制备的光敏剂cap-BDP的紫外-可见吸收光谱(UV-vis)和荧光发射光谱(FL)；
图4为实施例7制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs的紫外-可见吸收光谱(UV-vis)和荧光发射光谱(FL)；
图5为实施例1制备的光敏剂cap-BDP和酞箐锌(ZnPc)在光照条件下对二苯基异苯并呋喃(DPBF)的淬灭情况；
图6为光照前后细胞内钙离子浓度变化的荧光图像，标尺为20μm；
图7为光照前后细胞内钙离子浓度变化的荧光强度统计条形图；
图8为TRPV1通道抑制实验的荧光成像图，标尺为100μm；
图9为光敏剂BDP和cap-BDP在非光照(左)和光照(右)条件下对4T1细胞的毒性测试；
图10为钙源存在情况下光敏剂BDP和cap-BDP对三阴乳腺癌4T1细胞的光毒性测试；
图11为纳米光敏剂cap-BDP-NPs的动态光散射图；
图12为纳米光敏剂cap-BDP NPs的透射电镜图，标尺为200nm；
图13为纳米光敏剂125I-cap-BDP-NPs和光敏剂125I-cap-BDP的体内循环半衰期；
图14为纳米光敏剂125I-cap-BDP-NPs和光敏剂125I-cap-BDP的组织分布情况；
图15为纳米光敏剂125I-cap-BDP-NPs和光敏剂125I-cap-BDP在小鼠体内的SPECT-CT成像图；
图16为肿瘤部位的钙离子成像图，标尺为200μm；
图17为不同组别小鼠肿瘤变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明以下实施例中，化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)确定的。NMR是用安捷伦400MHz或600MHz仪测定，测定溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，内标为四甲基硅烷(TMS)，MS用GCT PremierTM(CI)质谱仪测定，除注明外均为CI源(70ev)。
实施例1
本实施例涉及以下化合物的制备，其结构式如下所示：
上述化合物通过如图1所示的合成路线制备得到，具体包括以下步骤：
(1)化合物1的合成：称取对羟基苯甲醛、6-溴己酸和碳酸钾以摩尔比1：2：2置于反应容器中，再将6-溴己酸5倍重量的乙腈作为反应溶剂加入至反应容器，最后加入微量催化剂苯并-18-冠-6-醚，在氩气保护下回流12小时。反应结束后，将圆底烧瓶放置于冰浴中，有白色沉淀生成，将所得沉淀过滤，用冷乙腈洗涤得到白色粗产物。将白色粗产物溶解于超纯水中，然后用4摩尔每升的盐酸中和得到白色沉淀，将沉淀冻干，得到化合物1，产率为80％。
(2)化合物2的合成：称取化合物2,4-二甲基吡咯、化合物1以摩尔比2：1置于反应容器中，加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的无水四氢呋喃作为反应溶剂，向瓶内滴加3～5滴三氟乙酸，在氩气保护下常温反应24小时，随后向反应体系中加入与化合物1摩尔质量相同的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与反应容器中继续反应24小时，之后在冰浴条件下缓慢加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的三乙胺溶液和三氟化硼乙醚溶液，反应24小时后终止反应。用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，加入乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到橙红色的固体产物2，产率为60％。
(3)化合物3的合成：称取化合物2、N-碘代丁二酰亚胺以摩尔比1：2置于反应容器中，加入N-碘代丁二酰亚胺10倍重量的无水二氯甲烷作为溶剂，在氩气保护下常温避光反应30分钟。反应结束后用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到砖红色的固体产物3，产率为90％。
(4)光敏剂BDP的合成：称取化合物3和对甲氧基苯甲醛以摩尔比1：1置于反应容器中，加入对甲氧基苯甲醛20倍摩尔质量的醋酸和哌啶，再将对甲氧基苯甲醛20倍质量的乙腈加入至反应容器中作为溶剂。在氩气保护下80摄氏度反应2小时。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，得到青绿色的固体产物BDP，产率为65％。
(5)光敏剂cap-BDP的合成：称取化合物二异丙基乙胺和香兰素胺盐酸盐以3：2的摩尔比置于反应容器中，加入二异丙基乙胺5倍重量的N,N-二甲基甲酰胺溶液作为溶剂，在氩气保护下45摄氏度搅拌15分钟。然后将反应体系置于冰浴，待温度降至0摄氏度时，加入二异丙基乙胺摩尔质量0.5倍的BDP与反应容器中，在搅拌条件下继续反应30分钟；将二异丙基乙胺摩尔质量2倍缩合剂(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐缓慢加至反应体系中，冰浴条件下继续搅拌反应3小时。反应结束后用冷冻干燥机将反应体系中的N,N-二甲基甲酰胺冻干除去，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为乙酸乙酯和二氯甲烷)，得到深绿色的产物cap-BDP，产率为65％。光敏剂cap-BDP的核磁氢谱如图2所示。
实施例2
本实施例涉及以下化合物的制备，其结构式如下所示：
上述化合物通过如图1所示的合成路线制备得到，具体包括以下步骤：
(1)化合物1的合成：称取对羟基苯甲醛、2-溴乙酸和碳酸钾以摩尔比1：2：2置于反应容器中，再将2-溴乙酸10倍重量的乙腈作为反应溶剂加入至反应容器，最后加入微量催化剂苯并-18-冠-6-醚，在氩气保护下回流12小时。反应结束后，将圆底烧瓶放置于冰浴中，有白色沉淀生成，将所得沉淀过滤，用冷乙腈洗涤得到白色粗产物。将白色粗产物溶解于超纯水中，然后用4摩尔每升的盐酸中和得到白色沉淀，将沉淀冻干，得到化合物1，产率为70％。
(2)化合物2的合成：称取化合物2,4-二甲基吡咯、化合物1以摩尔比2：1置于反应容器中，加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的无水乙腈作为反应溶剂，向瓶内滴加3～5滴三氟乙酸，在氩气保护下常温反应24小时，随后向反应体系中加入与化合物1摩尔质量相同的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与反应容器中继续反应24小时，之后在冰浴条件下缓慢加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的三乙胺溶液和三氟化硼乙醚溶液，反应24小时后终止反应。用旋转蒸发仪除去乙腈溶液，加入乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和乙酸乙酯)，最终得到橙红色的固体产物2，产率为70％。
(3)化合物3的合成：称取化合物2和N-碘代丁二酰亚胺以摩尔比1：2置于反应容器中，加入N-碘代丁二酰亚胺10倍重量的无水四氢呋喃作为溶剂，在氩气保护下常温避光反应30分钟。反应结束后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到砖红色的固体产物3，产率为90％。
(4)光敏剂BDP的合成：称取化合物3和苯甲醛以摩尔比1：1置于反应容器中，加入苯甲醛30倍摩尔质量的醋酸和哌啶，再将苯甲醛30倍质量的乙腈加入至反应容器中作为溶剂。在氩气保护下80摄氏度反应2小时。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，得到青绿色的固体产物BDP，产率为65％。
(5)光敏剂cap-BDP的合成：称取化合物二异丙基乙胺和香兰素胺盐酸盐以3：2的摩尔比置于反应容器中，加入二异丙基乙胺5倍重量的N,N-二甲基甲酰胺溶液作为溶剂，在氩气保护下45摄氏度搅拌15分钟。然后将反应体系置于冰浴，待温度降至0摄氏度时，加入二异丙基乙胺摩尔质量0.5倍的BDP与反应容器中，在搅拌条件下继续反应30分钟；将二异丙基乙胺2倍摩尔质量的缩合剂(二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶缓慢加至反应体系中，冰浴条件下继续搅拌反应3小时。反应结束后用冷冻干燥机将反应体系中的N,N-二甲基甲酰胺冻干除去，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为乙酸乙酯和二氯甲烷)，得到深绿色的产物cap-BDP，产率为65％。
实施例3
本实施例涉及以下化合物的制备，其结构式如下所示：
上述化合物通过如图1所示的合成路线制备得到，具体包括以下步骤：
(1)化合物1的合成：称取对羟基苯甲醛、4-溴丁酸和碳酸钠以摩尔比1：2：2置于反应容器中，再将4-溴丁酸10倍重量的乙腈作为反应溶剂加入至反应容器，最后加入微量催化剂苯并-18-冠-6-醚，在氩气保护下回流12小时。反应结束后，将圆底烧瓶放置于冰浴中，有白色沉淀生成，将所得沉淀过滤，用石油醚洗涤得到白色粗产物。将白色粗产物溶解于超纯水中，然后用4摩尔每升的盐酸中和得到白色沉淀，将沉淀冻干，得到化合物1，产率为64％。
(2)化合物2的合成：称取化合物2,4-二甲基吡咯、化合物1以摩尔比2：1置于反应容器中，加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的无水丙酮作为反应溶剂，向瓶内滴加3～5滴三氟乙酸，在氩气保护下常温反应24小时，随后向反应体系中加入与化合物1摩尔质量相同的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与反应容器中继续反应24小时，之后在冰浴条件下缓慢加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的三乙胺溶液和三氟化硼乙醚溶液，反应24小时后终止反应。用旋转蒸发仪除去丙酮溶液，加入乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和乙酸乙酯)，最终得到橙红色的固体产物2，产率为83％。
(3)化合物3的合成：称取化合物2和N-碘代丁二酰亚胺以摩尔比1：2置于反应容器中，加入N-碘代丁二酰亚胺10倍重量的无水乙腈作为溶剂，在氩气保护下常温避光反应30分钟。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到砖红色的固体产物3，产率为90％。
(4)光敏剂BDP的合成：称取化合物3和4-(丙炔氧基)苯甲醛以摩尔比1：1置于反应容器中，加入4-(丙炔氧基)苯甲醛30倍摩尔质量的醋酸和哌啶，再将4-(丙炔氧基)苯甲醛30倍质量的乙腈加入至反应容器中作为溶剂。在氩气保护下80摄氏度反应2小时。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，得到青绿色的固体产物BDP，产率为60％.
(5)光敏剂cap-BDP的合成：称取化合物二异丙基乙胺和香兰素胺盐酸盐以3：2的摩尔比置于反应容器中，加入二异丙基乙胺5倍重量的乙腈溶液作为溶剂，在氩气保护下45摄氏度搅拌15分钟。然后将反应体系置于冰浴，待温度降至0摄氏度时，加入二异丙基乙胺摩尔质量0.5倍的BDP与反应容器中，在搅拌条件下继续反应30分钟；将二异丙基乙胺2倍摩尔质量的缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶缓慢加至反应体系中，冰浴条件下继续搅拌反应3小时。反应结束后用冷冻干燥机将反应体系中的N,N-二甲基甲酰胺冻干除去，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为乙酸乙酯和二氯甲烷)，得到深绿色的产物cap-BDP，产率为70％。
实施例4
本实施例涉及以下化合物的制备，其结构式如下所示：
上述化合物通过如图1所示的合成路线制备得到，具体包括以下步骤：
(1)化合物1的合成：称取对羟基苯甲醛、6-溴己酸和碳酸钠以摩尔比1：2：2置于反应容器中，再将6-溴己酸5倍重量的乙腈作为反应溶剂加入至反应容器，最后加入微量催化剂苯并-18-冠-6-醚，在氩气保护下回流12小时。反应结束后，将圆底烧瓶放置于冰浴中，有白色沉淀生成，将所得沉淀过滤，用冷乙腈洗涤得到白色粗产物。将白色粗产物溶解于超纯水中，然后用4摩尔每升的盐酸中和得到白色沉淀，将沉淀冻干，得到化合物1，产率为80％。
(2)化合物2的合成：称取化合物2,4-二甲基吡咯、化合物1以摩尔比2：1置于反应容器中，加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的无水乙腈作为反应溶剂，向瓶内滴加3～5滴三氟乙酸，在氩气保护下常温反应24小时，随后向反应体系中加入与化合物1摩尔质量相同的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与反应容器中继续反应24小时，之后在冰浴条件下缓慢加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的三乙胺溶液和三氟化硼乙醚溶液，反应24小时后终止反应。用旋转蒸发仪除去乙腈溶液，加入乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和乙酸乙酯)，最终得到橙红色的固体产物2，产率为60％。
(3)化合物3的合成：称取化合物2、N-碘代丁二酰亚胺以摩尔比1：2置于反应容器中，加入N-碘代丁二酰亚胺10倍重量的无水四氢呋喃作为溶剂，在氩气保护下常温避光反应30分钟。反应结束后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到砖红色的固体产物3，产率为90％。
(4)光敏剂BDP的合成：称取化合物3和对甲基苯甲醛以摩尔比1：1置于反应容器中，加入对甲基苯甲醛30倍摩尔质量的醋酸哌啶盐，再将对甲基苯甲醛30倍质量的乙腈加入至反应容器中作为溶剂。在氩气保护下80摄氏度反应2小时。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的二氯甲烷和甲醇)，得到青绿色的固体产物BDP，产率为65％。
(5)光敏剂cap-BDP的合成：称取化合物二异丙基乙胺和香兰素胺盐酸盐以3：2的摩尔比置于反应容器中，加入二异丙基乙胺5倍重量的N,N-二甲基甲酰胺溶液作为溶剂，在氩气保护下45摄氏度搅拌15分钟。然后将反应体系置于冰浴，待温度降至0摄氏度时，加入二异丙基乙胺摩尔质量0.5倍的BDP与反应容器中，在搅拌条件下继续反应30分钟；将二异丙基乙胺2倍摩尔质量的缩合剂(二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶缓慢加至反应体系中，冰浴条件下继续搅拌反应3小时。反应结束后用冷冻干燥机将反应体系中的N,N-二甲基甲酰胺冻干除去，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇)，得到深绿色的产物cap-BDP，产率为65％。
实施例5
本实施例涉及以下化合物的制备，其结构式如下所示：
上述化合物通过如图1所示的合成路线制备得到，具体包括以下步骤：
(1)化合物1的合成：称取对羟基苯甲醛、5-溴戊酸和碳酸钠以摩尔比1：2：2置于反应容器中，再将5-溴戊酸10倍重量的乙腈作为反应溶剂加入至反应容器，最后加入微量催化剂苯并-18-冠-6-醚，在氩气保护下回流12小时。反应结束后，将圆底烧瓶放置于冰浴中，有白色沉淀生成，将所得沉淀过滤，用冷乙腈洗涤得到白色粗产物。将白色粗产物溶解于超纯水中，然后用4摩尔每升的盐酸中和得到白色沉淀，将沉淀冻干，得到化合物1，产率为65％。
(2)化合物2的合成：称取化合物2,4-二甲基吡咯、化合物1以摩尔比2：1置于反应容器中，加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的无水二甲基亚砜作为反应溶剂，向瓶内滴加3～5滴三氟乙酸，在氩气保护下常温反应24小时，随后向反应体系中加入与化合物1摩尔质量相同的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与反应容器中继续反应24小时，之后在冰浴条件下缓慢加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的三乙胺溶液和三氟化硼乙醚溶液，反应24小时后终止反应。用旋转蒸发仪除去二甲基亚砜溶液，加入乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和乙酸乙酯)，最终得到橙红色的固体产物2，产率为53％。
(3)化合物3的合成：称取化合物2、N-碘代丁二酰亚胺以摩尔比1：2置于反应容器中，加入N-碘代丁二酰亚胺10倍重量的无水丙酮作为溶剂，在氩气保护下常温避光反应30分钟。反应结束后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到砖红色的固体产物3，产率为87％。
(4)光敏剂BDP的合成：称取化合物3和对叔丁氧基苯甲醛以摩尔比1：1置于反应容器中，加入对叔丁氧基苯甲醛30倍摩尔质量的醋酸哌啶盐，再将对叔丁氧基苯甲醛30倍质量的乙腈加入至反应容器中作为溶剂。在氩气保护下80摄氏度反应2小时。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的二氯甲烷和甲醇)，得到青绿色的固体产物BDP，产率为65％。
(5)光敏剂cap-BDP的合成：称取化合物BDP，以香兰素胺盐酸盐3倍的摩尔质量比置于反应容器中，加将4溶于50倍重量的N,N-二甲基甲酰胺，再加入香兰素胺盐酸盐3倍摩尔质量的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和的香兰素胺盐酸盐1倍摩尔质量的4-二甲氨基吡啶，冰浴下搅拌半小时，加入香兰素胺盐酸盐，并在氮气保护下室温搅拌12小时。反应结束后用冷冻干燥机将反应体系中的N,N-二甲基甲酰胺冻干除去，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇)，得到深绿色的产物cap-BDP，产率为65％。
实施例6
本实施例涉及以下化合物的制备，其结构式如下所示：
上述化合物通过如图1所示的合成路线制备得到，具体包括以下步骤：
(1)化合物1的合成：称取对羟基苯甲醛、5-溴戊酸和碳酸钠以摩尔比1：2：2置于反应容器中，再将5-溴戊酸10倍重量的乙腈作为反应溶剂加入至反应容器，最后加入微量催化剂苯并-18-冠-6-醚，在氩气保护下回流12小时。反应结束后，将圆底烧瓶放置于冰浴中，有白色沉淀生成，将所得沉淀过滤，用冷乙腈洗涤得到白色粗产物。将白色粗产物溶解于超纯水中，然后用4摩尔每升的盐酸中和得到白色沉淀，将沉淀冻干，得到化合物1，产率为81％。
(2)化合物2的合成：称取化合物2,4-二甲基吡咯、化合物1以摩尔比2：1置于反应容器中，加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的无水二甲基亚砜作为反应溶剂，向瓶内滴加3～5滴三氟乙酸，在氩气保护下常温反应24小时，随后向反应体系中加入与化合物1摩尔质量相同的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与反应容器中继续反应24小时，之后在冰浴条件下缓慢加入2,4-二甲基吡咯10倍重量的三乙胺溶液和三氟化硼乙醚溶液，反应24小时后终止反应。用旋转蒸发仪除去二甲基亚砜溶液，加入乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和乙酸乙酯)，最终得到橙红色的固体产物2，产率为53％。
(3)化合物3的合成：称取化合物2、N-碘代丁二酰亚胺以摩尔比1：2置于反应容器中，加入N-碘代丁二酰亚胺10倍重量的无水四氢呋喃作为溶剂，在氩气保护下常温避光反应30分钟。反应结束后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的石油醚和二氯甲烷)，最终得到砖红色的固体产物3，产率为87％。
(4)光敏剂BDP的合成：称取化合物3和对乙氧基苯甲醛以摩尔比1：1置于反应容器中，加入对乙氧基苯甲醛30倍摩尔质量的醋酸哌啶盐，再将对乙氧基苯甲醛30倍质量的乙腈加入至反应容器中作为溶剂。在氩气保护下80摄氏度反应2小时。反应结束后用旋转蒸发仪除去乙腈，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为含1％乙酸的二氯甲烷和甲醇)，得到青绿色的固体产物BDP，产率为65％。
(5)光敏剂cap-BDP的合成：称取化合物BDP，以香兰素胺盐酸盐3倍的摩尔质量比置于反应容器中，将4溶于50倍重量的N,N-二甲基甲酰胺，再加入香兰素胺盐酸盐3倍的摩尔质量的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和香兰素胺盐酸盐1倍摩尔质量的4-二甲氨基吡啶，冰浴下搅拌半小时，加入香兰素胺盐酸盐，在氮气保护下室温搅拌12小时。反应结束后用冷冻干燥机将反应体系中的N,N-二甲基甲酰胺冻干除去，加入二氯甲烷萃取。收集有机试剂层，用无水硫酸钠干燥后过滤，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇)，得到深绿色的产物cap-BDP，产率为65％。
实施例7
本实施例涉及纳米光敏剂cap-BDP-NPs的合成，由实施例1制备的光敏剂cap-BDP与两亲性嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚己内酯自聚合得到，具体过程如下：
将实施例1制备的化合物cap-BDP(5mg)、两亲性嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚己内酯(PEG114-b-PCL66，40mg)在超声条件下分别溶解到N,N-二甲基甲酰胺溶液(DMF,500mL)中。完全溶解后，将上述cap-BDP溶液注入PEG114-b-PCL66溶液中继续超声15分钟，随后将4.2mL去离子水缓慢滴加至上述混合溶液当中，再次超声15分钟后，将上述混合水溶液用胶头滴管加入至透析袋(分子量：3500KDa)中，透析除去杂质，分别于透析后的2、4、6、12、24小时对透析介质进行更新，所用透析介质为去离子水。透析48小时后将上述液体转移至超滤管(3500KDa)中，用离心机(3000rpm)超滤离心15分钟后，超滤管上层透明液体即为纳米光敏剂cap-BDP-NPs。
此外，本发明还采用其它两亲性嵌段聚合物：聚乙二醇-聚谷氨酸、聚2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚乙二醇－聚谷氨酸苄酯替换聚乙二醇-b-聚己内酯，均可制备得到纳米胶束cap-BDP-NPs。
性能测试
(1)紫外-可见吸收光谱以及荧光发射光谱测试
对实施例1制备的游离分子化合物cap-BDP以及纳米胶束cap-BDP-NPs进行紫外-可见吸收光谱以及荧光发射光谱测试，具体操作如下：
将cap-BDP以及纳米胶束cap-BDP-NPs分别用N,N-二甲基甲酰胺溶液和超纯水配置成10mg mL-1的溶液，放入比色皿中，用紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计进行测试。测试结果如图3和图4所示，cap-BDP最大吸收波长位于660nm处，纳米胶束cap-BDP-NPs位于665nm处，同时半峰宽变宽，发生了J型聚集。当固定激发波长在600nm时，cap-BDP最大发射波长位于692nm，而cap-BDP-NPs位于702nm。
(2)单线态氧量子产率测试
对实施例1制备的光敏剂cap-BDP与市售的ZnPc在光照条件下的单线态氧量子产率进行测试，具体操作如下：
分别配置ZnPc、cap-BDP的N,N-二甲基甲酰胺溶液。各取2.97mL的样品溶液，再加入30mL的DPBF溶液(800.0mg mL-1)，混合均匀，放入石英比色皿中。使用LED灯(660nm，20mWcm-2)分别照射上述样品，并记录光照后0、1、2、3、4、5秒在415nm处的吸光度。由吸光度变化情况绘图得到折线图，结果如图5所示，光照条件下cap-BDP、cap-BDP-NPs表现出较强的单线态氧产生能力。以ZnPc(ΦΔ＝0.56)为参比计算得到cap-BDP单线态氧量子产率分别为0.73。
(3)钙离子调控测试
测试实施例1制备的光敏剂cap-BDP在细胞水平上的钙离子调控情况，具体操作如下：
配制含有10％胎牛血清、5％双抗的高糖DMEM细胞培养基(下列培养基均含10％胎牛血清和5％双抗)。将对数生长期的三阴性乳腺癌4T1细胞接种于细胞Confocal培养皿中培养，每孔细胞数为1.0×104个，并置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育12小时。设置光照组和非光照组，并分别加入浓度为5.0μg mL-1辣椒素(CAP)、BDP和cap-BDP溶液1.0mL(下列BDP和cap-BDP溶液均含1％DMSO)。将细胞置于培养箱中继续孵育12小时，孵育后更换培养基，光照组采用LED灯(660nm，20mW cm-2)光照15分钟(非光照组不做处理)。光照后，弃去旧培养基，加入PBS漂洗三次，漂洗后加入细胞钙离子荧光染料Fluo-8 AM(50.0μmol L-1，1.0mL)对细胞进行染色(10分钟)。染色结束后PBS漂洗三次，采用激光共聚焦显微镜进行观察。
结果如图6所示，无论光照与否，PBS组的荧光强度都未发生明显改变，表明仅光照条件不能引起细胞内钙离子浓度变化。而无辣椒素修饰的光敏剂BDP组，光照后荧光强度略有提高。相较于PBS和BDP组，CAP组在非光照和光照条件下均表现出较强的绿色荧光，但光照前后荧光强度变化不明显，表明CAP能有效激活TRPV1蛋白并引起钙离子内流，但光照不能提升CAP的钙离子调控能力。而经辣椒素修饰的cap-BDP组经光照激发后荧光显著增加，强度是光照前的四倍(图7)。此外，非光照条件下cap-BDP组的荧光强度略高于CAP组。
由上述实验结果可知，本发明制备的辣椒素修饰的光敏剂cap-BDP与CAP相似，能有效激活TRPV1蛋白并改变细胞内钙离子浓度。此外，光照条件能有效提升光敏剂cap-BDP的钙离子调控能力，通过单线态氧(1O2)进一步激活TRPV1蛋白从而增加细胞内钙离子浓度。
(4)钙离子通道类型测试
测试实施例1制备的光敏剂cap-BDP在细胞水平上的钙离子通道类型测试，具体操作如下：
将对数生长期的三阴性乳腺癌4T1细胞接种于12孔板培养，每孔细胞数为2.0×104个，并置于培养箱(37℃，5％CO2)中孵育12小时。另取相同数目的MCF-7细胞接种于12孔板培养，加入含TRPV1抑制剂钌红(Ruthenium Red，100.0μmol L-1，1.0mL)的高糖DMEM培养基，并置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育12小时。孵育后弃去旧培养基，加入PBS漂洗三次。随后加入cap-BDP溶液(5.0μg mL-1，1.0mL)，将细胞置于培养箱中继续孵育12小时。孵育后更换培养基，用LED灯(660nm，20mW cm-2)光照15分钟。光照结束后，弃去旧培养基，加入PBS对细胞漂洗三次，漂洗后加入钙离子荧光探针Fluo-8 AM(50.0μmol L-1，1.0mL)进行染色(10分钟)。染色结束后用PBS洗涤三次，通过荧光倒置显微镜进行观察。
结果如图8所示，未经钌红处理的cap-BDP组表现出强的绿色荧光，而钌红处理的cap-BDP组仅表现出微弱的绿色荧光。说明cap-BDP可刺激TRPV1通道开放，加入钌红后，TRPV1通道被抑制，阻碍了钙离子内流，从而导致绿色荧光强度显著降低。说明cap-BDP光照后打开的钙离子通道为TRPV1通道。
(5)细胞毒性测试
测试光照、非光照条件下以及外加钙离子条件下实施例1制备的光敏剂BDP与cap-BDP的细胞毒性，具体操作如下：
无外加钙源时细胞毒性：将对数生长期的三阴性乳腺癌4T1细胞接种于96孔板中培养，每孔细胞数目为8.0×104个，并置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育12小时。设置光照组和非光照组。分别加入BDP、cap-BDP溶液，每个浓度设置六个复孔，浓度为10.0、5.0、2.5、1.25、0.62、0.36、0.18μg mL-1(每孔100.0μL)。将细胞置于培养箱中继续孵育24小时，孵育后更换培养基，光照组用LED灯(660nm，20mW cm-2)照射15分钟(非光照组不做处理)后孵育24小时。孵育完成后每孔加入MTT(5.0mg mL-1，20.0μL)溶液，并置于培养箱继续培养4小时。移去溶液后加入二甲基亚砜(150.0μL)震荡10分钟。最后，用酶标仪检测细胞样品在490nm处的吸光度(OD)并计算。
外加钙源时细胞毒性：将对数生长期的三阴性乳腺癌4T1细胞接种于96孔板中培养，每孔细胞数为8.0×104个，并置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育12小时。分别加入BDP、cap-BDP溶液，每个浓度设置六个复孔，浓度设置为10.0、5.0、2.5、1.25、0.62、0.36、0.18μg mL-1(每孔100.0μL)。将细胞置于培养箱中继续孵育12小时，孵育完成后更换培养基(含60.0μg mL-1CaCl2，100.0μL)，用LED灯(660nm，20mW cm-2)照射15分钟后继续孵育12小时。孵育完成后每孔加入MTT(5.0mg mL-1，20.0μL)溶液，并置于培养箱继续培养4小时。移去溶液后加入二甲基亚砜(150.0μL)震荡10分钟。利用酶标仪检测样品在490nm的吸光度(OD)并计算。
无钙源条件下，光敏剂BDP和cap-BDP在非光照和光照条件下对4T1细胞的毒性测试结果如图9所示(左图为非光照条件，右图为光照条件)。由图可知，非光照条件下，cap-BDP对4T1细胞均未表现出明显的毒性，而在光照条件下，cap-BDP和BDP均表现出较强的光毒性，其IC50值分别为1.3±0.1μgmL-1和1.4±0.1μg mL-1。
存在钙源情况下光敏剂BDP和cap-BDP对三阴乳腺癌4T1细胞的光毒性测试结果如图10所示。加钙后，光敏剂BDP对4T1细胞的IC50值未有较大改变，而光敏剂cap-BDP对4T1细胞的IC50值由1.3±0.1μg mL-1降至0.6±0.1μgmL-1，表明光敏剂cap-BDP不仅具有较好的光动力活性，并能通过引起钙离子内流进一步诱导细胞凋亡。
(6)cap-BDP-NPs粒径分布与形貌表征测试
测试实施例7制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs的粒径分布与形貌，具体操作如下：
粒径分布情况(DLS)：取新制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs溶液，用超纯水稀释至30.0μg mL-1，取1.5mL加入粒径皿中，用动态光散射仪(DLS)测其粒径分布。样品测试3次，每次测试11轮。
形貌表征情况(TEM)：取10.0μL纳米光敏剂cap-BDP-NPs溶液滴加到铜网上，放入电子防潮干燥箱，自然挥干后用透射电子显微镜(TEM，200kV)进行扫描观察。
结果如图11所示，cap-BDP-NPs在超纯水中的平均水合粒径为128±20nm，PDI为0.117。从图12可以看出cap-BDP-NPs均为较规则的球形结构，106±12nm。DLS和TEM电镜测试结果显示本发明制备出的纳米光敏剂粒径大小合适且分散性较好，具有较为均一纳米尺寸的纳米光敏剂可用于体内生物效应测试。
(7)cap-BDP-NPs药代动力学测试
测试实施例1制备的游离化合物cap-BDP与实施例7制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs在小鼠体内的药代动力学情况，具体操作如下：
取雌性BALB/c小鼠3只，将125I标记的纳米光敏剂cap-BDP-NPs(400.0μgmL-1，40.0μCi)通过尾静脉注射方式给药。设置11个时间点(5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时)。每个时间点对小鼠进行眼眶取血并称重，利用伽马免疫计数仪测试血液中放射性含量，即为药物含量。同时，设置cap-BDP组进行放射性核素标记，操作过程同上。
结果如图13所示，光敏剂cap-BDP的体内消除半衰期为1.1小时，而纳米光敏剂cap-BDP-NPs的消除半衰期为15.1小时，说明当光敏剂cap-BDP进入小鼠体内后，会以很快的速度代谢排出，而纳米光敏剂cap-BDP-NPs在体内具有良好的长循环效果，能较长时间停留在血浆中，有利于药物在肿瘤部位富集。
(8)cap-BDP-NPs组织分布与SPECT-CT成像测试
测试实施例1制备的游离化合物cap-BDP与实施例7制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs在小鼠体内的组织分布情况，具体操作如下：
组织分布：选取肿瘤体积为200mm3左右的雌性BALB/c荷瘤小鼠3只，将125I标记的纳米光敏剂cap-BDP-NPs(400.0μg mL-1，60.0μCi)通过尾静脉注射方式给药。24小时后，解剖并取出小鼠组织脏器(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)。将各个组织称重后放到流式管内，使用伽马免疫计数仪测试组织中的放射性含量，并通过计算进行定量。同时，设置cap-BDP组进行放射性核素标记，操作过程同上。
SPECT-CT成像：选取肿瘤体积为200mm3左右的雌性BALB/c荷瘤小鼠1只，将125I标记的纳米光敏剂cap-BDP-NPs(400.0μg mL-1，100.0μCi)通过尾静脉注射方式给药。24小时后，将小鼠麻醉后使用小动物SPECT-CT活体成像仪扫描。观察纳米光敏剂cap-BDP-NPs在小鼠体内的靶向和循环情况。同时，设置cap-BDP组进行放射性核素标记，操作过程同上。
组织分布结果如图14所示，光敏剂cap-BDP在小鼠体内总体分布较低，且瘤内药物分布极少，说明药物基本被代谢排出体内。而纳米光敏剂cap-BDP-NPs在肿瘤部位有较高的蓄积程度，约为125I-cap-BDP的十倍。SPECT-CT成像结果如图15所示，光敏剂cap-BDP在给药后24小时时在肝脏和膀胱内蓄积较多，但肿瘤内未见分布。而纳米光敏剂cap-BDP-NPs在24小时就有着较高的蓄积浓度。表明纳米光敏剂cap-BDP-NPs具有良好的肿瘤靶向性。
(9)cap-BDP-NPs体内钙离子调控测试
测试实施例7制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs在小鼠体内的钙离子调控情况，具体操作如下：
选取肿瘤体积为200mm3左右的雌性BALB/c荷瘤小鼠6只，随机分为2组(每组3只)，具体分组情况为：PBS组和cap-BDP-NPs组。将PBS、纳米光敏剂cap-BDP-NPs溶液分别通过尾静脉注射方式给药(8.0mg kg-1)。48小时后，瘤内注射Fluo-8 AM荧光染料(400.0μmol L-1，100.0μL)，随后使用LED灯(660nm，50mW cm-2)照射小鼠肿瘤部位，时间为15分钟。结束后，采用小鼠颈椎脱臼法处死小鼠，剖出肿瘤，用4％多聚甲醛溶液避光固定24小时，结束后包埋肿瘤组织，并使用冷冻切片机对肿瘤组织进行切片处理，通过荧光倒置显微镜对切片进行观察和拍摄。
结果如图16所示，PBS组未观测到明显的绿色荧光，而cap-BDP-NPs光照组表现出明显的绿色荧光，表明纳米光敏剂cap-BDP-NPs经光照后能有效引起肿瘤部位钙离子内流，提高肿瘤组织钙离子浓度。
(10)cap-BDP-NPs抑瘤情况测试
测试实施例1制备的游离化合物cap-BDP与实施例7制备的纳米光敏剂cap-BDP-NPs在小鼠体内的组织分布情况，具体操作如下：
选取肿瘤体积为60mm3左右的雌性BALB/c荷瘤小鼠30只，随机分为6组(每组5只)，具体分组情况为：PBS光照组和非光照组，cap-BDP光照组和非光照组，cap-BDP-NPs光照组和非光照组。将各组化合物通过尾静脉注射方式给药(8.0mg kg-1)，给药48小时后使用LED灯(660nm，50mW cm-2)对小鼠肿瘤部位进行照射，时间为15分钟，然后记录小鼠光照后21天内肿瘤体积的变化情况，并绘制肿瘤体积随时间变化曲线，评价制剂的抗肿瘤效果。
结果如图17所示，从抑瘤曲线可知，PBS光照组和PBS非光照组的肿瘤生长曲线无显著差异，表明仅通过光照不能有效抑制肿瘤生长，其肿瘤体积约为初始体积的24倍。cap-BDP光照组也并未产生明显的抑瘤效果，其肿瘤体积约为初始的17倍，这可能是由于光敏剂cap-BDP的体内代谢较快、肿瘤组织蓄积较少所致。而cap-BDP-NPs光照组表现出显著的肿瘤抑制效果，部分肿瘤达到消融效果，且21天内无复发。上述结果表明，纳米光敏剂cap-BDP-NPs光照后能有效产生活性氧物质，且引起小鼠肿瘤部位钙离子内流，从而起到协同治疗效果，可有效抑制小鼠肿瘤生长，具有优越的体内治疗效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种辣椒素衍生化光敏剂，其特征在于，所述光敏剂的结构通式如下所示：
其中，n为1～10的任一整数；
R选自氢、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基中的一种。
2.一种权利要求1所述的辣椒素衍生化光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在惰性气氛下，
(1)将式(I)所示的化合物与2,4-二甲基吡咯在三氟乙酸以及有机溶剂存在下反应，然后加入氧化剂继续反应，反应结束后向体系中加入三氟化硼乙醚和有机胺，反应得到式(II)所示的化合物；
(2)将式(II)所示的化合物与碘化试剂在有机溶剂存在下反应，得到式(III)所示的化合物；
(3)将式(III)所示的化合物与式(IV)所示的化合物在醋酸、哌啶和有机溶剂存在下反应，得到式(V)所示的化合物；
(4)将式(V)所示的化合物与香兰素胺或其盐在缩合剂和有机溶剂存在下反应，制备得到所述辣椒素衍生化光敏剂；
上述式(I)～式(V)的结构如下：
其中，n为1～10的任一整数，R选自氢、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基中的一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氧化剂为2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌或二氧化硒；所述有机胺为三乙胺或二异丙基乙胺。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碘化试剂为N-碘代丁二酰亚胺、单质碘或N-碘代糖精。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述缩合剂为(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐、二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述反应在缚酸剂和/或催化剂的存在下进行；所述缚酸剂为二异丙基乙胺或三乙胺，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
7.一种纳米光敏剂，其特征在于，所述纳米光敏剂由权利要求1所述的辣椒素衍生化光敏剂与两亲性嵌段聚合物于水中自组装形成。
8.根据权利要求7所述的纳米光敏剂，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物为聚乙二醇-b-聚己内酯、聚乙二醇-聚谷氨酸、聚2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯中的一种或多种。
9.一种权利要求7或8所述的纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的辣椒素衍生化光敏剂与两亲性嵌段聚合物溶于有机溶剂中，向得到的溶液中加水，经透析处理后得到所述纳米光敏剂；所述透析处理的透析介质为水。
10.一种权利要求7或8所述的纳米光敏剂在制备用于光诱导三阴性乳腺癌治疗的药物中的应用。
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