CN111187289B - 一种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用，该过氧化氢荧光探针具有式(1)中的化学结构式：
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，尤其涉及种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
过氧化氢(H2O2)是一种重要的生理活性氧分子，研究表明过氧化氢的非正常水平与多种疾病相关，如炎症性疾病、心血管疾病、神经组织退化疾病和癌症。但研究发现过氧化氢的非正常水平也与许多疾病有关。因此，开发一种简单可靠的方法检测过氧化氢的对相关疾病的诊断及病理机制的研究有着重要的意义。
基于分子探针的荧光法检法具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了发展与利用。而目前报道的用于过氧化氢检测的荧光探针分子大部分存在合成复杂、响应慢、需要使用有机溶剂、斯托克斯位移值小(Ren M,AnalyticalChemistry,2017,89,552；Chan J,Nature Chemistry,2012,4,973.)等问题。因此亟待开发易于合成、成本低、水溶性好荧光探针分子来实现对过氧化氢的高效快速检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种新的易于制备、性能稳好的荧光分子探针及其制备方法的合成方法，还在此基础开发出对过氧化氢进行有效的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种过氧化氢荧光探针，其具有式(1)中的化学结构式：
本技术方案为实现本发明目的，设计了一种新型的、具有特殊结构及光谱性质的荧光探针分子，具备式(1)结构的探针分子能够抑制分子内电荷的转移效应，使得该荧光探针分子在单独存在时几乎不具有任何荧光发射特性；同时，利用过氧化氢可以特异性地与探针分子中的苯硼酸识别单元反应，释放出具有强荧光发射的物质的特点，在设计过程中在该荧光探针分子引入了苯硼酸基团作为过氧化氢的响应基团，采用荧光法检测过氧化氢时，分子探针溶解于水的磷酸缓冲溶液中，当加入过氧化氢后，过氧化氢能与探针的苯硼酸基团反应，使与酚羟基相连的亚甲基苯硼酸脱除，从而释放出具有强荧光发射的荧光团，且荧光强度随着过氧化氢浓度的增加不断增大，荧光发射在475nm处。该过氧化氢荧光探针具有良好的稳定性和光学性质以及较大的斯托克斯位移值，光学性能稳定、水溶性好，同时具有高选择性和高灵敏度，对过氧化氢识别能力强，且响应速度较快(反应耗时小于5分钟)，响应范围为0～60μmol·L-1，检测限低(3.8nmol·L-1)。
基于同一技术构思，本发明还提供一种上述过氧化氢荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)准备原料；
(2)将化合物A、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碱溶于溶剂中，反应1～24h，得到混合溶液；其中化合物A具有式(2)中的化学结构式：
(3)将混合溶液进行分离纯化，得到过氧化氢荧光探针。
上述过氧化氢荧光探针通过4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的苄溴与氰基联苯酚的酚羟基，通过脱除HBr得到，制备方法的反应流程如下：
本技术方案选择了氰基联苯酚与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯作为原料，通过一步反应即制备得到上述过氧化氢荧光探针，反应程度高，因此具有较高的合成产率，且反应条件温和、设备简单、步骤简便，为新型的荧光探针的产业化生产提供了理论指导，并且通过本技术方案的方法制备得到的荧光探针具有性能稳定、分析性能优良的优点。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)的反应时间为8h。
作为上述技术方案的优选，碱为哌啶、三乙胺、碳酸钾和碳酸钠中的一种或多种；进一步地，碱选为碳酸钾。上述种类的碱可以很好地中和反应中生成的HBr，促进反应平衡进一步向生成产物的方向移动，从而提高产物产率。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)的反应温度为40～100℃；进一步地，反应温度为85℃。应温度过低则可能导致反应不完全，温度过高则容易产生副反应，影响最终产物收率。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中混合溶液分离纯化操作，通过将混合溶液进行减压旋干去除溶剂后再经层析柱纯化实现。
作为上述技术方案的优选，溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中的一种或多种；进一步地，溶剂选为乙腈。
基于同一技术构思，本发明还提供了一种上述过氧化氢荧光探针的应用，该过氧化氢荧光探针可应用于水体中过氧化氢以及生物样品中过氧化氢的测定。
作为上述技术方案的优选，上述过氧化氢荧光探针应用于水体中过氧化氢的测定时，具体包括以下步骤：
(1)绘制标准曲线：将过氧化氢荧光探针溶于磷酸缓冲溶液中，得到探针溶液；向探针溶液中加入不同浓度的过氧化氢并测量特定波长下加入过氧化氢后探针溶液的荧光强度，以所得的荧光发射强度对探针溶液中过氧化氢的浓度绘制标准曲线；
(2)将待测水体样品配置成待测溶液，在待测溶液中加入过氧化氢荧光探针，测定其在特定波长下的荧光强度，根据该荧光强度和标准曲线即得到待测溶液中过氧化氢的浓度。
作为上述技术方案的优选，上述荧光探针应用于生物样品中过氧化氢的测定时，具体包括以下步骤：将生物样品与过氧化氢荧光探针一同进行培育后，利用荧光成像的方法对生物样品进行分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种新型的荧光探针及其制备方法，还提供了该荧光探针在检测过氧化氢领域的应用；
(2)本发明的荧光探针具有良好的稳定性(荧光探针母液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变)和光学性质，斯托克斯位移值大(达到180nm)，反应前单独荧光探针溶液几乎无任何荧光发射，随着过氧化氢的加入，荧光探针在～475nm处有强的荧光发射性质；且本发明的过氧化氢荧光探针具有高选择性和高灵敏度，对过氧化氢识别能力强，响应速度较快(反应耗时小于5分钟)，响应范围为0～60μmol·L-1，检测限低(3.8nmol·L-1)，用于过氧化氢的检测时各项性能优越；
(3)本发明的荧光探针的制备方法一步反应即可制得过氧化氢荧光探针，所用原料易得，合成产率较高(达87％以上)，且反应条件温和、设备简单、步骤简便，为新型的荧光探针的产业化生产提供了理论指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中过氧化氢荧光探针的核磁共振氢谱图；
图2为实施例5中加入过氧化氢后的荧光探针溶液的荧光发射强度对过氧化氢浓度的曲线图；
图3为实施例5中荧光强度对过氧化氢的浓度标准曲线图；
图4为实施例5中过氧化氢荧光探针对过氧化氢选择性的测试结果；
图5为实施例6中过氧化氢荧光探针检测HeLa细胞内过氧化氢的成像图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
过氧化氢荧光探针的合成：
实施例1：
将化合物A(0.195g,1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(0.296g,1.0mmol)溶于50mL乙腈中，加入碳酸钾(0.690g,5.0mmol)，85℃回流反应8h。反应完后，减压蒸馏旋干溶剂，然后用二氯甲烷与甲醇溶解，经柱层析纯化过柱，最后得到近红色固体粉末0.357g(收率为87％)。产物经过核磁共振氢谱分析后，其结构式如式(1)所示：
其中化合物A的结构式如式(2)所示：
核磁共振氢谱图如图1所示，对该图谱的描述如下：
1H NMR(400MHz,DMSO):δ7.88–7.83(m,4H),7.72–7.70(m,4H),7.48–7.47(m,2H),7.14–7.12(m,2H),5.23(s,2H),1.29(s,12H).MS:m/z,理论值：[M+H]+412.21；计算值：412.13。
实施例2：
将化合物A(0.195g,1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(0.296g,1.0mmol)溶于50mL乙腈中，加入碳酸钠(0.530g,5.0mmol)，40℃回流反应8h。反应完后，减压蒸馏旋干溶剂，然后用二氯甲烷与甲醇溶解，经柱层析纯化过柱，最后得到近红色固体粉末0.243g(收率为85.9％)。
实施例3：
将化合物A(0.195g,1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(0.296g,1.0mmol)溶于50mL乙腈中，加入碳酸钾(0.690g,5.0mmol)，85℃回流反应12h。反应完后，减压蒸馏旋干溶剂，然后用二氯甲烷与甲醇溶解，经柱层析纯化过柱，最后得到近红色固体粉末0.318g(收率为77％)。
过氧化氢荧光探针对过氧化氢的荧光检测：
实施例4：
将实施例1制得的过氧化氢荧光探针溶解于水的磷酸缓冲溶液(10mM,pH 7.4)中，配制成10μmol·L-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的10μmol·L-1的上述探针溶液，然后加入100μmol·L-1的过氧化氢。然后测试不同时间的荧光响应。发现10分钟时荧光强度既达到最大值。
实施例5：
将实施例1制得的过氧化氢荧光探针溶解于水的磷酸缓冲溶液(10mM,pH 7.4)中，配制成10μmol·L-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的10μmol·L-1的上述探针溶液，然后分别加入不同浓度的过氧化氢均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图2所示。以溶液在475nm处荧光发射强度对过氧化氢的浓度作图，所得标准曲线如图3所示，从a至u，过氧化氢浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100μmol·L-1，溶液体系为水的磷酸缓冲溶液(10mM,pH 7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；由图2可知，过氧化氢浓度在0～60μmol·L-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系，能实现该浓度范围内过氧化氢的定量检测。
取10μM上述分子探针，加入100μmol·L-1不同物质(过氧化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、Li+、K+、Na+、Al3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、BrO3 -、CO3 2-、H2PO4 -、NO3 -、S2O3 2-、SO4 2-、S2-、ClO4 -、F-、Cl-、Br-)后，在475nm处荧光发射强度的变化，并以测试的干扰物质为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，得到荧光探针对过氧化氢选择性测试结果图，如图4所示；由图可见，上述过氧化氢荧光探针不受其它一些常见物质的影响，如半胱氨酸、谷胱甘肽、Li+、K+、Na+、Al3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、BrO3 -、CO3 2-、H2PO4 -、NO3 -、S2O3 2-、SO4 2-、S2-、ClO4 -、F-、Cl-、Br-，在上述干扰物存在的条件下，对过氧化氢仍具有良好的选择性和灵敏度。
过氧化氢荧光探针对细胞中过氧化氢的测试：
实施例6：
将培养好的HeLa细胞在37℃下置于10μM实施例1制备的探针的PBS溶液中培养1h后，进行分析得到的细胞图像无荧光。而将HeLa细胞在37℃下含本发明探针培养液培养1h后，再加入过氧化氢，与含过氧化氢的溶液中培养1h、经PBS缓冲液冲洗之后能够获得细胞的荧光成像如图5所示，图5中(A)、(B)分别是实施例1制备的荧光探针(10μmol·L-1)培养的HeLa细胞的明场图片和荧光图片；(C)、(D)分别是实施例1制备的荧光探针(10μmol·L-1)和过氧化氢(50μmol·L-1)培养的HeLa细胞的明场图片和荧光图片。由此说明本发明过氧化氢荧光探针具有良好的细胞膜渗透性、可用于生物医学领域的细胞成像分析。
Claims (8)
1.一种过氧化氢荧光探针，其特征在于，具有式（1）中的化学结构式：
2.一种权利要求1所述的过氧化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）准备原料；
（2）将化合物A、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碱溶于溶剂中，反应1~24h，得到混合溶液；所述化合物A具有式（2）中的化学结构式：
（3）将所述混合溶液进行分离纯化，得到所述过氧化氢荧光探针。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱为哌啶、三乙胺、碳酸钾和碳酸钠中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）的反应温度为40~100℃。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述混合溶液分离纯化操作，通过将所述混合溶液进行减压旋干去除溶剂后再经层析柱纯化实现。
6.如权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中的一种或多种。
7.一种权利要求1所述的过氧化氢荧光探针的应用，其特征在于，所述过氧化氢荧光探针应用于水体中过氧化氢的测定。
8.如权利要求7所述的过氧化氢荧光探针的应用，其特征在于，所述过氧化氢荧光探针应用于水体中过氧化氢的测定，具体包括以下步骤：
（1）绘制标准曲线：将所述过氧化氢荧光探针溶于磷酸缓冲溶液中，得到探针溶液；向所述探针溶液中加入不同浓度的过氧化氢并测量特定波长下加入过氧化氢后所述探针溶液的荧光强度，以所得的荧光发射强度对探针溶液中过氧化氢的浓度绘制标准曲线；
（2）将待测水体样品配置成待测溶液，在所述待测溶液中加入所述过氧化氢荧光探针，测定其在所述特定波长下的荧光强度，根据该荧光强度和所述标准曲线即得到所述待测溶液中过氧化氢的浓度。
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