CN106588966A

CN106588966A - 一种开型过氧化氢荧光探针化合物的制备与应用

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Publication number: CN106588966A
Application number: CN201610999308.0A
Authority: CN
Inventors: 吕正亮; 史孝民; 范春华
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: CN106588966B

Abstract

本发明涉及一种开型过氧化氢荧光探针化合物及其制备与应用，所述过氧化氢荧光探针化合物具有式I的结构。制备方法是：在氮气保护下将氰基联苯酚、多聚甲醛和无水氯化镁并以三乙胺为催化剂反应得到化合物Ⅲ；将化合物Ⅲ与4‑硼酯苄溴以无水碳酸钾为催化剂，在乙腈中回流搅拌得到产物II。最后产物Ⅱ与9,10菲醌以乙酸铵为催化剂，在乙醇中回流得到最终的探针Ⅰ。该探针化合物对过氧化氢具有很好的选择性和灵敏性，检测限低，且对细胞没有毒性，不仅可应用于细胞内过氧化氢的检测和成像，而且还可应用于深层活体组织成像。

Description

一种开型过氧化氢荧光探针化合物的制备与应用

技术领域

本发明涉及一种开型过氧化氢荧光探针化合物及其制备与应用，属于荧光探针技术领域。

技术背景

过氧化氢是人体内活性氧物种中的一种，其可通过氧气的代谢及酶的催化而产生。适量含量的过氧化氢对免疫细胞的活化、细胞的生长和增殖具有促进作用，然而过量的过氧化氢可能会造成许多严重的疾病，例如，阿兹海默症、帕金森症、心脑血管疾病以及癌症等。因此，识别以及实时监测细胞内过氧化氢的含量具有十分重要的意义。

目前，生物体内过氧化氢探测及其含量的检测方法主要有电化学方法、元素分析质谱等方法。这些方法具有诸多劣势如下：样品准备过程复杂、检测过程对样品的损伤较大、难以进行实时的监测。与之对比，作为一种价格低廉的检测手段，荧光探针检测法由于其不仅具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、能够进行实时可视化监测等优点，而且可在生物医学成像方面进行非破坏性检测，近几年来备受研究人员的关注。

在现有的荧光探针技术中，过氧化氢探针种类较少，选择性低，检测不够灵敏等问题。比如DCFH是检测体内ROS的探针，但它容易被空气中的氧气氧化，容易对过氧化氢的检测产生干扰，降低灵敏度。另外，由于过氧化氢时间短容易氧化分解，易与其它物质反应生成新的活性氧物种，因此对过氧化氢的检测本身就存在一定的难度，因此，设计一种响应时间短、灵敏度高、选择性强的探针具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种反应型过氧化氢荧光探针化合物，既可以检测水中的过氧化氢，还可以在生物体内识别和检测过氧化氢，此外，还可应用于深层活体组织成像。

本发明还提供所述反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种反应型过氧化氢荧光探针化合物，具有式I所示的结构：

。

本发明所述的过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）将氰基联苯酚、无水氯化镁和多聚甲醛，以三乙胺为催化剂，无水乙腈为溶剂，在氮气保护下回流，得到化合物Ⅲ；

（2）上步制得的化合物Ⅲ溶于丙酮中，加入4-硼酯溴苄，以无水碳酸钾为催化剂，在50℃下搅拌过夜反应，得到化合物Ⅱ：

（3）上步制得的化合物Ⅱ和9,10菲醌,以乙酸铵为催化剂，在乙醇中回流得到最终的探针Ⅰ：

根据本发明，优选的，步骤（1）所述氰基联苯酚与无水氯化镁的摩尔比为1:1.5；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述Ⅲ与4-硼酯溴苄的摩尔比为1:1.1；

根据本发明，优选的，步骤（3）所述Ⅱ与9,10菲醌的摩尔比为1:1；

根据本发明，优选的，步骤（1）、（2）全程在氮气保护下进行；

根据本发明，优选的，步骤（1）反应温度为80℃；

根据本发明，优选的，步骤（2）反应温度为50℃；

根据本发明，优选的，步骤（3）反应温度为75℃；

更为详细的，所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，步骤如下：

(a) N₂保护下氛围中，将6.24g（约32mmol）的氰基联苯酚和4.56g（约48mmol）的无水MgCl₂于三口的圆底烧瓶中，加入16.32mL（约122mmol）三乙胺，然后加入80mL无水乙腈作溶剂，最后加入干燥的多聚甲醛12.3 g（约440 mmol）。该混合物加热到70^oC回流8个小时。反应完成后，冷却至室温，少量水进行淬灭。再加入大量的6M盐酸进行酸化，直到混合物由黄绿色变为白色。将上述粗产物用CH₂Cl₂进行萃取（3*50 mL），有机层用无水MgSO₄干燥，制样，柱色谱提纯。得到白色产物Ⅲ3.5g，产率约为50%。

(b) 取Ⅲ（0.1g, 0.45mmol），溴苄硼酯（0.133g, 0.45mmol）,K₂CO₃（0.62g，0.45mmol）10mL丙酮，50℃下回流过夜，旋干制样，柱色谱提纯，得白色产物Ⅱ0.134g，产率68%。

(c) 取9,10-菲醌（0.04g, 0.2mmol），乙酸铵（0.159g, 2mmol），溶于8mL乙醇中，加热片刻，再加入Ⅱ（0.288g，0.2mmol），冷却后，抽滤的固体产物Ⅰ0.098g，产率79%。

本发明所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的应用，可用于测试细胞、组织和水中的过氧化氢含量。

进一步优选的，所述荧光探针用于在pH=7.4的DMF和水体积比1:1的溶液中过氧化氢的快速检测。在50%DMF溶液中最低可探测的过氧化氢浓度为1.58*10^-7mol/L。

本发明通过实验验证，所述荧光探针在pH=7.4的DMF和水体积比1:1的溶液中，用波长365nm的光作为激发波长，其荧光很弱，当加入过氧化氢十五分钟后检测，溶液在470nm处荧光迅速增强，而其他活性氧物种加入后溶液的荧光没有明显变化，该探针对过氧化氢具有很高的选择性。

将本发明的荧光探针化合物加入含有50%DMF的水溶液中，配成荧光探针化合物浓度为10微摩尔每升的溶液，用PBS缓冲溶液调节pH=7.4，加入不同浓度的过氧化氢，用波长365nm的光激发，在波长470nm处的荧光依次增强。得出工作曲线如图2所示，通过测定待测样品的荧光强度，就可以定量的计算出过氧化氢的浓度。

本发明所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物不仅可以用于水中过氧化氢的检测，还可以应用于组织细胞内过氧化氢的检测和成像。

将MCF-7细胞在含有10%牛胎儿血清的1毫升细胞培养基培养12小时，然后用100微摩尔每升的过氧化氢溶液处理10分钟，在用10微摩尔每升的本发明的荧光探针处理30分钟。细胞用激发波长为365nm的光源激发，在共聚焦显微镜下成像。

与现有的检测技术相比，本发明的荧光探针设计新颖，选择性好，且具有良好的水溶性，而不具有生物毒性，在制备方面，均使用常用试剂，合成步骤简单。

本发明的优良效果如下：

1、本发明的荧光探针化合物具有较好的水溶性、生物相容性以及较好的膜穿透性，可用于细胞内过氧化氢的探测及成像；

2、本发明的荧光探针化合物由于能用于水体中的定量过氧化氢检测且检测限较低；

3、本发明的荧光探针化合物具有良好的灵敏度和选择性，测试样品前处理简单；

4、本发明的荧光探针化合物为固体粉末，便于储存使用，并且合成方法简单、收率高、成本低、具有良好的推广前景；

5、与现有的技术相比，本发明的荧光探针的选择性高，灵敏度高，检测限低，并且在细胞成像研究对组织细胞几乎无损伤。

附图说明

图1为本发明实施例1荧光离子探针的结构示意图。

图2本发明的荧光探针的核磁图。

图3为本发明实施例1荧光离子探针在含有50%DMF的水溶液中(pH=7.4)，与不同活性氧物种作用后的荧光强度。

图4为本发明的荧光探针与不同浓度的过氧化氢的荧光强度工作曲线图。

图5本发明的荧光探针用于细胞成像。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。

实施例1、探针I的合成

(a)氮气氛围中，将6.24g（约32mmol）的氰基联苯酚和4.56g（约48mmol）的无水MgCl₂于三口的圆底烧瓶中，绕后加入16.32mL（约122mmol）三乙胺，然后加入80mL无水乙腈作溶剂，最后加入干燥的多聚甲醛12.3g（约440mmol）。该混合物加热到70^oC回流8个小时。反应完成后，冷却至室温，然后用少量水进行淬灭。再加入大量的6M盐酸进行酸化。将上述粗产物用CH₂Cl₂进行萃取（3*50 mL），有机层用无水MgSO₄进行干燥，制样，柱色谱提纯，得到白色化合物Ⅲ3.5 g，产率约为50%。

(b)将化合物Ⅲ（0.1g，0.45mmol），溴苄硼酯（0.133g, 0.45mmol）,K₂CO₃（0.62g，0.45mmol）10mL丙酮，50℃下回流过夜，旋干制样，柱色谱提纯，得白色化合物Ⅱ0.134g，产率68%

(c)取9,10-菲醌（0.04g, 0.2mmol），乙酸铵（0.159g, 2mmol），混合溶于8mL乙醇中，加热片刻，再加入Ⅱ（0.288g，0.2mmol），冷却后，抽滤的固体产物Ⅰ0.098g，产率79%。结构如图1所示，核磁氢谱如图2。

实施例2、荧光实验

取实施例1制备的荧光探针化合物，溶解到含有50%DMF的水溶液中，用PBS缓冲溶液调节pH=7.4；得荧光探针溶液，备用。

1、取荧光探针溶液，分12组，每组10毫升，其中1组不加活性氧物种，11组分别加入含有CH₃COOOH, GSH, H₂O₂, HOCl, O₂ ^•-, •OH , otBU, TBHP, Vc溶液，使得每组溶液中含有探针化合物的浓度为10μΜ，活性氧物种浓度为200μM，使得活性氧物种与探针化合物的摩尔比为30:1；采用激发波长为365nm，荧光光度计测试其荧光强度，如图3所示，结果显示：本发明探针溶液本身没有荧光，一旦加入过氧化氢，溶液在470nm荧光迅速增强，而其他离子加入后溶液的荧光没有变化，对过氧化氢具有很高的选择性。

2、取荧光探针溶液，分15组，每组10毫升，分别加入不同浓度的过氧化氢溶液，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为10μM，过氧化氢的浓度分别为探针化合物浓度的0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30倍，显示：溶液在470nm荧光迅速增强，如图4。根据测试计算，本探针化合物的最低检测限为1.58*10^-7mol/L。

实施例3、细胞成像实验

将MCF-7细胞在含有10%牛胎儿血清的1毫升细胞培养基培养12小时，然后用100微摩尔每升的氟离子处理10分钟，在用10微摩尔每升的本发明的荧光探针处理30分钟。细胞用激发波长为365光源激发，在共聚焦显微镜下成像，如图5。

Claims

1.一种开型过氧化氢探针，具有式I所示的结构。

2.一种权利要求1所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

（2）化合物Ⅲ溶于丙酮中，加入4-硼酯溴苄，以无水碳酸钾为催化剂，在50℃下搅拌过夜反应，得到化合物Ⅱ；

（3）上步制得的化合物Ⅱ和9,10-菲醌，以乙酸铵为催化剂，在乙醇中回流得到最终的探针Ⅰ。

3.如权利要求2所述的开型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）所述氰基联苯酚、无水氯化镁的摩尔比为1:1.5；步骤（2）所述的Ⅲ与溴苄硼酯的摩尔比为1:1.1；步骤（3）所述的Ⅱ、9,10菲醌的摩尔比为1:1。

4.如权利要求2所述的开型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）、（2）全程在氮气保护下进行。

5.如权利要求2所述的开型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）反应温度为80℃。

6.如权利要求2所述的开型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（2）反应温度为50℃。

7.如权利要求2所述的开型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（3）反应温度为75℃。

8.如权利要求2所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，详细步骤如下：

(a) N₂氛围中将6.24g（约32 mmol）的氰基联苯酚和4.56g（约48 mmol）的无水MgCl₂于三口的圆底烧瓶中，再加入16.32mL（约122mmol）三乙胺，然后加入80 mL无水乙腈作溶剂，最后加入干燥的多聚甲醛12.3g（约440mmol）；该混合物加热到70^oC回流8个小时，之后冷却至室温，然后用水进行淬灭；再加入大量的6M盐酸进行酸化，将上述粗产物用CH₂Cl₂进行萃取（3*50 mL），有机层用无水MgSO₄进行干燥，制样，柱色谱提纯得白色化合物Ⅲ3.5 g，产率约为50%;

(b) 取化合物Ⅲ（0.1g，0.45mmol），溴苄硼酯（0.133g，0.45mmol），K₂CO₃（0.062g，0.45mmol）10ml丙酮，50℃下回流过夜，旋干制样，柱色谱提纯，得白色化合物Ⅱ0.134g，产率68%；

(c) 将9,10-菲醌（0.04g，0.2mmol），乙酸铵（0.159g 2mmol），混合溶于8mL乙醇中，加热回流至产物溶解，稍冷后，加入Ⅱ（0.288g，0.2mmol），冷却后，抽滤得固体产物Ⅰ0.098g，产率79%。

9.权利要求1所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的应用，可以用于检测水体中的过氧化氢含量以及细胞内成像研究。