CN113788821A - 近红外联氨化合物、制备方法以及甲醛检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于甲醛检测技术领域，涉及一种近红外联氨化合物、制备方法以及甲醇检测试剂盒和应用，结构式如式(I)所示：

并提供近红外联氨化合物的制备方法，花菁类近红外荧光染料IR‑780为骨架，衍生出带氨基的半菁近红外荧光团，再进一步合成出用于甲醛检测的近红外荧光探针；同时，提供基于近红外联氨化合物的甲醛检测试剂盒，可用于甲醛的定量检测和快速检测，具有荧光反应速度快、显色稳定，抗干扰能力强，灵敏度高的特性。

Description

近红外联氨化合物、制备方法以及甲醛检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于甲醛检测技术领域，涉及一种近红外联氨化合物、制备方法以及甲醛检测试剂盒和应用。

背景技术

而随着现代食品企业的快速发展，食品的种类和加工技术均得到了大力发展，但是食品添加剂的非法添加、农药残留及食物劣变因子等使得食品安全问题层见叠出，在众多的食品安全问题中，食品添加剂的问题尤为突出，这是因为甲醛(Formaldehyde，HCHO)是一种重要的活性羰基物质(RCS)，可以形成稳定的亚甲基桥而与蛋白质和DNA等大分子交联，根据相关的研究，35％～40％的甲醛水溶液对新鲜的蔬菜、水果和海产品等具有保鲜、增色的功效，因此在食品添加剂中可能会加入微量的甲醛；但是将甲醛添加到食物中时，甲醛就会作为一种致病残留物存在于食物中，若摄入含有过量甲醛的食物会导致体内甲醛的高水平积累(甲醛胁迫)，诱发许多的疾病，包括哮喘、心脏病、慢性肝病、阿尔兹海默症和癌症等；世界卫生组织(WHO)建议甲醛的日最大容忍吸收量为0.15mg/kg。人体内正常水平的甲醛与空间记忆能力和认知能力密切相关，在生物代谢过程中亦可内产生内源性的甲醛，包括线粒体中单碳代谢循环、组蛋白去甲基化酶(LSD1)的代谢氧化和氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)的催化等过程。所以，在生物系统、食品和环境等领域内构建简单、快速检测甲醛的方法是迫在眉睫的。

荧光探针技术快速发展，可以与周围的环境或目标物质发生相互作用，从而改变探针分子的结构或电荷分布，通过光学性质(颜色、荧光或发光)的变化，实现对目标物质的检测分析。借助于如荧光光谱仪、荧光成像显微镜等手段，可以定性甚至定量外界刺激的强弱，从而实现分析检测的目的；荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强、猝灭或者发光波长的变化。近红外荧光探针因其特有的长波长激发和发射(600～900nm)，其背景干扰小、时空采样能力强、灵敏度高、选择性高、生物安全性好等优良性能，可以实现对生物分子的实时可视化成像检测，并进一步扩展实际应用到相关疾病的预防、诊断和治疗过程中。但是现有的近红外荧光探针在检测食品中甲醛时，样品前处理程序繁杂，在可见光区的单一显色特性，检测灵敏度低和生物样本损伤性大等问题。

发明内容

针对现有食品中甲醛检测存在的技术问题，本发明提供一种近红外联氨化合物、制备方法以及甲醛检测试剂盒和应用，以花菁类近红外荧光染料IR-780为骨架，合成出近红外联氨化合物，可作为甲醛检测的近红外荧光探针，并提供一种基于近红外联氨化合物的甲醛检测试剂盒，可用于甲醛的定量检测和快速检测，具有荧光反应速度快、显色稳定，抗干扰能力强，灵敏度高的特性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种近红外联氨化合物，结构式如式(I)所示：

一种近红外联氨化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)制备结构式为式(III)的化合物，备用；

1.1)将反应溶剂分为等体积的两份，将间硝基苯酚和碳酸钾溶于第一份反应溶剂中，在氮气保护下搅拌，然后加入溶有IR-780碘化物的第二份反应溶剂，混合后在室温下反应直至合成中间体；

1.2)采用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，将得到的中间体进行分离提纯；

1.3)将氯化亚锡溶解于浓盐酸中，再加入步骤1.2)提纯的中间体，混匀，在60～70℃下反应过夜，将得到的反应液依次经中和、过滤、提纯得到式(III)所示的化合物

2)制备式(I)所示的近红外联氨化合物

2.1)将步骤1.3)得到的式(III)所示的化合物溶于酸性溶液中，并滴加溶于水的NaNO₂溶液，整个反应体系在-5～-10℃的冰浴中反应，得到反应混合液A；

2.2)氯化亚锡溶解于浓盐酸溶液，并滴加在步骤2.1)的反应混合液A中，在0℃下搅拌，最后调节反应液的pH至中性，得到反应混合液B；

2.3)用萃取剂萃取反应混合液B中的有机相，有机相脱水后，在减压下蒸发得到蓝色固体粉末，即为粗产物；

2.4)合成的粗产物用二氯甲烷/甲醇洗脱、分离得到固体粉末，即为式(I)所示的近红外联氨化合物。

进一步的，所述步骤1.1)中，间硝基苯酚、碳酸钾和IR-780碘化物的物料比为1：1：1.5～2；反应溶剂体积为6～10mL；所述反应溶剂为甲醇、乙腈或二氯甲烷中的至少一种；

所述步骤1.2)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为20：1～100：1；

所述步骤1.3)中，中间体和氯化亚锡投料质量比为1：5～10；所述氯化亚锡与浓盐酸的质量体积比为1～1.2g：1mL。

进一步的，所述式(III)化合物、NaNO₂和氯化亚锡的物料质量比为1：0.5～1.5：3.8～5.8；

所述步骤2.1)中，式(III)化合物与浓盐酸的质量体积比为60～65mg：1mL；所述NaNO₂与水的摩尔体积比为2.17mmol：1.00～3.00mL；

所述步骤2.2)中，所述氯化亚锡与浓盐酸的摩尔体积比为3.82mmol：1.50～2.50mL；

所述步骤2.3)中，萃取剂为甲醇、乙腈或二氯甲烷中的至少一种；

所述步骤2.4)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为15:1～100:1。

一种甲醛检测试剂盒分别包含试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b两种溶液；所述试剂储备液a与荧光探针试剂储备液b的体积比为200：1；所述试剂储备液a由二甲基亚砜和磷酸盐组成；所述荧光探针试剂储备液b包括权利要求1所述的近红外联氨化合物以及有机溶剂。

进一步的，所述试剂储备液a的pH值为7.4；所述二甲基亚砜的体积浓度为10％，所述磷酸盐的摩尔浓度为5mmol/L～15mmol/L；所述近红外联氨化合物的浓度为0.01mmol/L～1mmol/L。

进一步的，所述磷酸盐是Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种；所述有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇和乙腈中的至少一种。

一种所述的甲醛检测试剂盒在甲醛快速检测和甲醛定量检测中的应用。

进一步的，所述甲醛检测试剂盒在甲醛定量检测中的应用过程是：

A1)以635nm～690nm作为激发波长，测定空白样品在发射波长为706nm处的荧光强度，记为F0；所述空白样品是由甲醛检测试剂盒中两种溶液混合而成的；

A2)将空白样品用试剂储备液a定容得到混合溶液，混合溶液中近红外联氨化合物浓度为10μmol/L；取多份等体积的混合溶液，分别对应加入不同已知浓度的甲醛作为甲醛标准品溶液，以635nm～690nm作为激发波长，分别测定甲醛标准品溶液在发射波长690nm～750nm处的荧光强度记为F，得到多个不同的荧光强度差值ΔF＝F–F0；以甲醛的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制曲线并拟合得到标准方程；

A3)取含有甲醛的待检测样品，加入空白样品中，以635nm～690nm作为激发波长，检测待测样品在发射波长690nm～750nm处的荧光强度F’，将F’代入步骤A2)所得标准方程中，计算得出待测样品中甲醛的浓度。

进一步的，所述甲醛检测试剂盒在甲醛快速检测中的应用过程是：

B1)将试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b依次负载在滤纸片上，将滤纸风干；

B2)取两片滤纸，分别将待检测样本和纯水对应滴加在两片滤纸，并将两片滤纸放置在载玻片上，观察635nm激发波长下荧光成像；所述空白样品是由甲醛检测试剂盒中两种溶液混合而成的；

B3)当待测检测样本的荧光成像亮度比纯水的荧光成像亮度强时，说明待测检测样本中含有甲醛。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用花菁类近红外荧光染料IR-780为骨架，衍生出带氨基的半菁近红外荧光团，再经进一步合成出用于甲醛检测的近红外荧光探针，该荧光探针，荧光产生反应速度快，准确性和灵敏度较高，具有近红外荧光发射波长，可用荧光光谱法检测；同时，制备方法简便易行，后处理简单，易于规模化生产。

2、本发明提供的甲醛检测试剂盒的检测原理是，试剂储备液b本身荧光较弱，而与甲醛反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm处产生强吸收，并在706nm处荧光显著增强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，不受其他常见的典型氧化活性物种的干扰，因此具有较高的准确性和灵敏度。

3、本发明提供的甲醛检测试剂盒，采用近红外联氨化合物作为荧光探针，具有近红外荧光发射波长，荧光产生反应速度快，10分钟内即可显色稳定，可用荧光光谱法检测，检测时，背景信号较低、噪音少，适于检测成分复杂的生物样品，还适合于监测活体样本中甲醛的分布。

4、本发明提供的甲醛检测试剂盒，检测灵敏度高，灵敏度高，荧光强度随甲醛浓度的增加而增强，甲醛浓度在20μmol/L～140μmol/L之间时，荧光强度与甲醛浓度之间呈线性关系，相关度R的平方达到0.99以上，可以用于甲醛的定量检测。

5、本发明提供的甲醛检测试剂盒，使得甲醛对荧光的增强反应具有特异性，因此，可将甲醛检测试剂盒包含的试剂负载在滤纸上，然后将空白液或者待测样本滴加在滤纸上，在观察635nm激发波长下荧光成像，通过荧光成像的亮度，说明待测检测样本中是否含有甲醛，能快速检测样本中是否含有甲醛，方便快捷。

附图说明

图1为试剂盒与不同浓度的甲醛反应的荧光发射光谱；

图2为试剂盒用于检测甲醛浓度时的标准曲线；

图3为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱；

图4为试剂盒检测纸芯片中不同浓度甲醛的荧光强度变化；

图5为试剂盒检测孕育甲醛后的斑马鱼荧光强度变化。

具体实施方式

下面结合附图以及实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。根据本发明反应条件做一些常规的修改，用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。

本发明中，化合物的结构是通过核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR)来确定的。¹H-NMR、¹³C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。¹H-NMR、¹³C-NMR的测定是用BrukerAvanceIII HD 600核磁共振谱仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)。用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰),d(doublet，双峰),t(triplet，三重峰),m(multiplet，多重峰),br(broadened，宽峰),dd(doublet of doublets，双二重峰),brs(broadened singlet，宽单峰)。偶合常数，用赫兹(Hz)表示。

本发明中，采用柱层析进行提纯分离时，柱层析采用青岛海洋化工200目～300目硅胶为载体。

本发明实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；试剂如IR-780碘代物和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。

本发明实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行。氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球或钢釜。

本发明中涉及的室温为20℃～30℃。

本发明中，反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂的体系有：二氯甲烷和甲醇体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。

本发明中提供的制备路线包括：

1)化合物(III)的制备

在酸存在的条件下，式(V)所示的化合物与式(IV)所示的化合物经取代分解重排反应，得到式(III)所示化合物；

化合物(V)为IR-780碘化物，式(IV)为间硝基苯酚，均可直接购买得到，化合物并按照以下方法制备化合物(III)；

2)制备结构式为式(I)所示的近红外荧光探针

在酸存在的条件下，式(III)所示的化合物与NaNO₂发生亲核取代反应，得到式(I)所示近红外联氨化合物；

具体的制备包括以下步骤：

1)制备结构式为式(III)的化合物，备用；

1.1)将反应溶剂分为等体积的两份，将间硝基苯酚和碳酸钾溶于第一份反应溶剂中，在氮气保护下搅拌，然后加入溶有IR-780碘化物的第二份反应溶剂，混合后在室温下反应直至合成中间体；在室温下反应时间在2～5h，实施时，选择3.5h，4.0h、4.5h；最优反应时间为4h；

1.2)采用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，将得到的中间体进行分离提纯；

1.3)将氯化亚锡溶解于浓盐酸中，再加入步骤1.2)提纯的中间体，混匀，在60～70℃下反应过夜，将得到的反应液依次经中和、过滤、提纯得到式(III)所示的化合物

反应过夜为化学反应常用，一般最少12h，实施时，常用12～18h。

2)制备式(I)所示的近红外联氨化合物

2.1)将步骤1.3)得到的式(III)所示的化合物溶于酸性溶液中，并滴加溶于水的NaNO₂溶液，整个反应体系在-5～-10℃的冰浴中反应，得到反应混合液A；冰浴反应时间为0.5～2.5h，实施时，选择0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h和2.5h，最优的为1h；

2.2)氯化亚锡溶解于浓盐酸溶液，并滴加在步骤2.1)的反应混合液A中，在0℃下搅拌，最后调节反应液的pH至中性，得到反应混合液B；搅拌时间为1～3h，实施时，选择0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h，最优的为1.5h；用10％的NaOH溶液调节反应液的pH至中性；

2.3)用萃取剂萃取反应混合液B中的有机相，有机相脱水后，在减压下蒸发得到蓝色固体粉末，即为粗产物；脱水时，用无水硫酸钠除去多余的水；

2.4)合成的粗产物用二氯甲烷/甲醇洗脱、分离得到固体粉末，即为式(I)所示的近红外联氨化合物。

本发明步骤1.1)中，间硝基苯酚、碳酸钾和IR-780碘化物的物料比为1：1：1.5～2；反应溶剂体积为6～10mL；反应溶剂为甲醇、乙腈或二氯甲烷中的至少一种；

本发明步骤1.2)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为20：1～100：1；

本发明步骤1.3)中，中间体和氯化亚锡投料质量比为1：5～10；所述氯化亚锡与浓盐酸的质量体积比为1～1.2g：1mL。

本发明式(III)化合物、NaNO₂和氯化亚锡的物料质量比为1：0.5～1.5：3.8～5.8；

本发明步骤2.1)中，式(III)化合物与浓盐酸的质量体积比为60～65mg：1mL；所述NaNO₂与水的摩尔体积比为2.17mmol：1.00～3.00mL；

本发明步骤2.2)中，所述氯化亚锡与浓盐酸的摩尔体积比为3.82mmol：1.50～2.50mL；

本发明步骤2.3)中，萃取剂为甲醇、乙腈或二氯甲烷中的至少一种；

本发明步骤2.4)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为15:1～100:1。

本发明中，浓盐酸质量分数为36～38％，为市售产品。

下面以几组具体的实施方式对本发明提供的制备方法进行详细的说明。

实施例1

1)化合物(III)的制备

首先，合成中间体：

1.1)取10mL乙腈溶液分为等体积的两份，将间硝基苯酚(174mg，1.25mmol)、碳酸钾(173mg，1.25mmol)溶于5mL乙腈溶液中，在氮气保护下室温搅拌10分钟，然后将溶有IR-780碘化物(334mg，0.5mmol)的5mL溶液通过注射器加入，混合物在室温下反应4小时，反应结束后减压蒸干溶剂；

1.2)粗产品以二氯甲烷/甲醇(100/1到20/1，v/v)为洗脱剂，经柱层析得到中间体(230mg，产率72％)；

1.3)氯化亚锡(900mg，4mmol)溶于0.8mL酸性溶液(浓盐酸)中，搅拌下缓慢滴入溶有中间体(128mg，0.2mmol)的甲醇溶液中；将反应液加热到70℃反应过夜，反应完毕之后加入2mol/L的氢氧化钠中和反应液，滤去沉淀，残渣用二氯甲烷洗涤三次；滤液及洗涤液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干，得到粗产品；粗产品用二氯甲烷/甲醇(100/1到10/1，v/v)为洗脱液，经柱层析分离后得到绿色固体(45mg，产率55％)；

2)制备结构式为式(I)所示的近红外荧光探针

2.1)化合物(III)(150mg，0.36mmol)溶于浓盐酸(2.42mL)，将反应瓶置于冰浴中。在0℃下，用注射器向反应瓶中滴加溶于2.00mL去离子水的NaNO₂(150mg，2.17mmol)溶液，整个反应体系在-5～0℃的冰浴中反应1小时，得到反应混合液A；

2.2)向反应混合液A中滴加溶于2.40mL浓盐酸的氯化亚锡(725mg，3.82mmol)，另外在0℃下搅拌反应1.5小时；反应结束后，用10％的NaOH溶液调节反应液的pH至中性，得到反应混合液B；

2.3)在去离子水中用DCM萃取收集反应混合液B中的有机相；用无水硫酸钠除去多余的水，在减压下蒸发得到蓝色固体粉末，即为粗产物；

2.4)合成的粗产物经二氯甲烷/甲醇(v/v，100:1～15:1)柱层析分离，得到固体粉末，即为近红外荧光探针(105.91mg，产率68.12％)。

实施例2～实施例5

不同参数下制备式(I)所示的近红外荧光探针。

与实施例1不同的是制备过程中的参数不同，具体参见表1。

表1实施例2～实施例5制备参数

进一步的，为了说明本发明制备的近红外联氨化合物的性能，进行下列试验验证。

试验1化合物的结构表征

采用核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR)来确定的实施例1制备的近红外联氨化合物的结构特征。式(I)所示的化合物的结构表征数据结果如下：

氢谱：¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.42(d,J＝14.6Hz,1H),7.73(d,J＝7.4Hz,1H),7.65-7.51(m,2H),7.51-7.41(m,2H),7.35(d,J＝7.4Hz,1H),7.25(d,J＝8.8Hz,1H),7.06(s,1H),6.24(d,J＝14.4Hz,1H),4.23(t,J＝7.5Hz,2H),2.78-2.64(m,2H),2.56(d,J＝6.1Hz,2H),1.85-1.72(m,10H),1.03-0.95(m,3H)。

碳谱：¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ206.98,174.84,170.81,162.46,155.49,151.23,149.73,142.41,141.60,137.53,129.68,129.18,126.15,124.20,123.15,114.66,112.54,101.67,96.83,60.23,49.94,31.17,28.27,25.55,21.00,17.97,14.55,11.58。

试验2

先配制试剂储备液a，向磷酸盐溶液(PBS)中加入二甲基亚砜，按照本领域常规操作方法配制得到磷酸盐浓度为10mmol/L，pH为7.4的含二甲基亚砜的磷酸盐溶液。其中二甲基亚砜的体积百分浓度为10％，磷酸盐溶液(PBS)配制使用NaHPO₄-KH₂PO₄体系，因此磷酸盐浓度指的是NaHPO₄和KH₂PO₄的总浓度。

采用实施例1制备得到的近红外联氨化合物与二甲基亚砜配制成荧光探针试剂储备液b，其中近红外联氨化合物浓度为1mmol/L。

试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b两种溶液的体积比为200/1，构成甲醛检测试剂盒。实施时，两种溶液单独分开装，检测时根据需要进行混合。

试验过程是：

1)荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长，测定试剂空白在发射波长为706nm处的荧光强度，记为F0，试剂空白为试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b按照体积比为200/1混合而成的；

2)将荧光探针试剂储备液b(1mmol/L，20μL)溶于试剂储备液a中，用试剂储备液a定容到2mL形成混合溶液，此时，混合溶液中，近红外联氨化合物即探针浓度为10μmol/L；

然后，取等量的上述混合溶液多份，通过加入不同体积的甲醛标准储备溶液(浓度为1mmol/L)，最终配制得到一系列不同浓度的甲醛标准品溶液，其中甲醛的浓度依次为：0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L、160μmol/L、180μmol/L和200μmol/L；一系列含不同浓度的甲醛标准品的反应液的体积均为2mL；

配制的一系列甲醛标准品溶液，在37℃下反应10min，荧光仪F-7000测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度为10nm，荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长，得到不同浓度的甲醛标准品溶液的发射光谱如图1所示。

同时，荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长，测定一系列不同浓度的甲醛标准品溶液在发射波长为706nm处的荧光强度，记为F，F有多组值，得到不同甲醛浓度对应的多组荧光强度差值ΔF＝F–F0，以甲醛的浓度C为横坐标，对应的荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线如图2所示；

经过浓度和荧光强度之间的线性拟合，线性拟合的回归方程为：ΔF＝4.62×[FA]–29.15，(R²＝0.9951)。经过标准曲线方程，发现甲醛浓度在20μmol/L～140μmol/L之间呈线性关系，相关度R的平方达到0.99以上；其中，[FA]为甲醛的浓度，单位为μmol/L；

3)在线性范围内，向待测样品中加入体积比为200/1的试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b，以670nm为激发波长，测定待测样品在发射波长为706nm处的荧光强度F’，将该荧光强度F’代入标准曲线，就可得到待测样品中甲醛的浓度。

计算时，F’要先减去F0，得到荧光差值，再代入ΔF＝4.62×[FA]–29.15中，得到对应的待测样品中甲醛的浓度。

根据本领域常规试验方法，在11次重复实验后得出该探针的检测限(S/N＝3)为0.68μM。

本试验中，磷酸盐溶液按照本领域常规的PBS配制方法配制，试剂储备液a中的磷酸盐选自Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种，磷酸盐的摩尔浓度可以为5mmol/L～15mmol/L；荧光探针试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度为0.01mmol/L～1mmol/L。

优选的，试剂储备液a为浓度10mmol/L，pH为7.4，含10％二甲基亚砜的PBS缓冲液，荧光探针试剂储备液b中，近红外联氨化合物的浓度1mmol/L。

通过本试验，结果表明，本发明提供的式(I)所示的荧光探针近红外联氨化合物具有以下特点：

1、荧光探针近红外联氨化合物本身在溶液中荧光信号极低，背景信号较低；但是随着甲醛的加入，近红外联氨化合物与甲醛反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm处产生强吸收，并在706nm处荧光最强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，此探针具有较高的准确性和灵敏度。

2、荧光探针近红外联氨化合物，荧光产生反应速度快，10分钟内即可显色稳定。

3、荧光探针近红外联氨化合物与甲醛反应，荧光强度随甲醛浓度的增加而增强，在甲醛浓度在20μmol/L～140μmol/L之间时，荧光强度与甲醛浓度，呈线性关系，可进行甲醛的定量检测。

试验3

与试验2的方法相同，准备试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b。

试验过程：

1)将近红外联氨化合物浓度1mmol/L的试剂储备液b溶于试剂储备液a(10mmol/L，pH7.4)中配制成10μmol/L的荧光探针溶液；

2)向荧光探针溶液中加入可能存在干扰的无机盐、氨基酸和醛类物质，如30μmol/L的无机盐(CaCl₂、MgCl₂、Na₂SO₃、NaHSO₃、NaHS)，H₂O₂；100μmol/L的的氨基酸(半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸)，谷胱甘肽，葡萄糖，VC；50μmol/L的甲酸，丙酮酸钠，脱氢抗坏血酸，醛类(乙醛、丙酮醛、苯甲醛、吡哆醛，4-硝基苯甲醛、乙二醛)；200μmol/L的甲醛等在相同条件下进行平行检测。

向干扰物质以浓度为10mmol/L的试剂储备液a作为溶剂，得到一组混合溶液，均在37℃下反应10分钟后，使用荧光仪F-7000分别测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以670nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm，得到个物质的荧光强度，结果如图3所示。

图3为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱，其中：1为空白,2为氯化钙(浓度30μmol/L),3为氯化镁(浓度30μmol/L),4为亚硫酸钠(浓度30μmol/L),5为亚硫酸氢钠(浓度30μmol/L),6为硫氢化钠(浓度30μmol/L),7为过氧化氢(浓度30μmol/L),8为半胱氨酸(浓度100μmol/L),9为谷胱甘肽(浓度100μmol/L),10为精氨酸(浓度100μmol/L),11为丝氨酸(浓度100μmol/L),12为甘氨酸(浓度100μmol/L),13为葡萄糖(浓度100μmol/L),14为维生素C(浓度100μmol/L),15为甲酸(浓度50μmol/L),16为乙醛(浓度50μmol/L),17为丙酮醛(浓度50μmol/L),18为苯甲醛(浓度50μmol/L),19为吡哆醛(浓度50μmol/L),20为4-硝基苯甲醛(浓度50μmol/L),21为丙酮酸钠(浓度50μmol/L),22为脱氧抗坏血酸(浓度50μmol/L),23为乙二醛(浓度50μmol/L),24为甲醛(浓度200μmol/L)。

参见图3的结果表明，只有甲醛可引起荧光探针产生明显的光信号显著变化响应，证明该荧光探针对甲醛具有高度的选择性；其他常见的无机盐、氨基酸和醛类物质干扰作用不明显。

试验4

本实验以定量的白色滤纸作为纸芯片甲醛快速检测的载体材料。

首先，将滤纸裁剪成1.0cm×1.0cm正方形小纸片，置于玻璃皿中；

然后，用不同浓度的甲醛溶液(0、20、50、100、150和200μmol/L)提前污染浸染1小时；甲醛溶液为0μmol/L为空白对照组；

接着，在37℃下，经甲醛化学修饰的纸芯片经10μmol/L的实施例1提供的联氨化合物与二甲基亚砜配制成的荧光探针试剂储备液b浸染10min；整个浸染过程在摇床中进行，将载有纸芯片的玻璃皿进行连续摇荡，以保证纸芯片化学浸染均匀。

反应结束后，除空白组外，其余几组试纸用磷酸盐溶液(PBS)冲洗2～3次，纸芯片被置于快速流动的空气中风干，放置在载玻片上进行激光共聚焦荧光成像。

用激光共聚焦显微镜(Leica，Germany)在635nm的激发波长下观察试纸的荧光成像，实验结果如图4所示，图4为试剂盒检测纸芯片中不同浓度甲醛的荧光强度变化。

图4中，4A为空白对照的荧光成像，4B、4C、4D、4E和4F分别为用浓度20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L的甲醛处理过的细胞样品，加入试剂储备液b后的荧光成像，图4G～4L为图4A～4F为对应的明场细胞图。

由图4中的4A～4F对比可知：纸芯片本身无荧光，由图4中的4B、4C、4D、4E和4F可知，纸芯片荧光强度均较4A有不同程度的显著增强，说明在纸芯片中，由于甲醛的引入，触发了近红外联氨化合物(I)分子中肼基的席夫碱反应，释放出近红外荧光信号，从而表现出不同程度的增强作用，且随着甲醛浓度的增大，荧光增强；荧光强度变化明显，可以依靠荧光强度判断出甲醛的浓度差别。

因此，根据上述甲醛的判断原理，提供一种采用甲醛试剂盒快速检测甲醛的方法，具体过程是：

B1)将试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b分别负载在滤纸片上，将滤纸风干；

B2)取两片滤纸，分别将待检测样本和纯水对应滴加在两片滤纸，并将两片滤纸放置在载玻片上，观察635nm激发波长下荧光成像；

B3)当待测检测样本荧光成像亮度比空白样品荧光成像亮度强时，说明待测检测样本中含有甲醛。

试验5

试验过程是：斑马鱼培养于E3胚胎培养液中(营养液中包括15mmol/L氯化钠，0.5mmol/L氯化钾，1mmol/L硫酸镁，1mmol/L氯化钙，0.15mmol/L磷酸二氢钠，0.05mmol/L磷酸氢二钠，0.7mmol/L碳酸氢钠，5～10％的亚甲蓝，营养液pH 7.5)，用生长3～5天的斑马鱼进行荧光呈像。

在活体内成像斑马鱼之前，本试验选择四氢叶酸(Tetrahydrofolate，THF)作为诱导剂，在斑马鱼体内降解产生内源性甲醛。

在进行甲醛处理前，将斑马鱼分为两组，一组斑马鱼作为空白对照(图5A1～5J1)，另一组(图5A2～5J2)斑马鱼经四氢叶酸诱导产生的内源性甲醛再经10μmol/L的试剂储备液b处理，经近红外联氨化合物共培养，然后用试剂储备液a(浓度为10mmol/L、pH为7.4)清洗三次，分别在0分钟、5分钟、10分钟和15分钟时获取激光共聚焦荧光成像图，激发波长为635nm，发射波长为690nm～750nm。

实验结果如图5所示，空白组卵黄囊部的荧光强度无明显变化(图5A1～5D1)，经四氢叶酸处理的实验组斑马鱼的荧光强度呈时间响应性的变化(图5A2～5D2)，在10分钟时达到荧光强度的顶点(图5C2)，15分钟时的荧光强度又有所下降(图5D2)。图5E1和图5E2为经试剂储备液b处理的斑马鱼，通过碳酸氢钠(NaHCO₃)进行了抑制性研究。碳酸氢钠是一种有效的甲醛清除剂。图5E1的荧光强度无明显变化，而图5E2的荧光强度较图5C2显著降低。作为对比，图5F1～5J1为图5A1～5E1在非荧光状态下的原始照片，图5F2～5J2为图5A2～5E2在非荧光状态下的原始照片。

同时，为直观观测荧光强度的变化对斑马鱼体内的荧光强度进行量化检测，并荧光强度值在0～1.0范围内进行数量化分析，在图5B2～5E2中的荧光强度依次为35.28％、63.61％、92.54％、89.30％，抑制组图5F2的荧光强度为42.63％。

通过上述试验4和试验5可以验证得到，采用含有本发明式(I)所示的近红外联氨化合物的甲醛检测试剂盒，可以通过对比荧光强度或荧光成像的方式，直观地判断待测生物样品是否含有甲醛，也可以对甲醛浓度进行定量的测定；不仅适用于纸芯片上的快速成像检测，对于复杂生物活体样本(如斑马鱼)同样适用，并且在检测甲醛方面，本发明所提供的甲醛检测试剂盒反应迅速，灵敏程度高，操作简单，适于广泛应用。

综上所述，本发明的甲醛检测试剂盒是一种性能优良、使用方便的甲醛检测设备，在食品、环境和活体生物成像等领域中有着巨大的应用前景。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种近红外联氨化合物，其特征在于：所述结构式如式(I)所示：

2.一种如权利要求1所述的近红外联氨化合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)制备结构式为式(III)的化合物，备用；

1.1)将反应溶剂分为等体积的两份，将间硝基苯酚和碳酸钾溶于第一份反应溶剂中，在氮气保护下搅拌，然后加入溶有IR-780碘化物的第二份反应溶剂，混合后在室温下反应直至合成中间体；

1.2)采用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，将得到的中间体进行分离提纯；

1.3)将氯化亚锡溶解于浓盐酸中，再加入步骤1.2)提纯的中间体，混匀，在60～70℃下反应过夜，将得到的反应液依次经中和、过滤、提纯得到式(III)所示的化合物

2)制备式(I)所示的近红外联氨化合物

2.1)将步骤1.3)得到的式(III)所示的化合物溶于酸性溶液中，并滴加溶于水的NaNO₂溶液，整个反应体系在-5～-10℃的冰浴中反应，得到反应混合液A；

2.2)氯化亚锡溶解于浓盐酸溶液，并滴加在步骤2.1)的反应混合液A中，在0℃下搅拌，最后调节反应液的pH至中性，得到反应混合液B；

2.3)用萃取剂萃取反应混合液B中的有机相，有机相脱水后，在减压下蒸发得到蓝色固体粉末，即为粗产物；

2.4)合成的粗产物用二氯甲烷/甲醇洗脱、分离得到固体粉末，即为式(I)所示的近红外联氨化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1.1)中，间硝基苯酚、碳酸钾和IR-780碘化物的物料比为1：1：1.5～2；反应溶剂体积为6～10mL；所述反应溶剂为甲醇、乙腈或二氯甲烷中的至少一种；

所述步骤1.2)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为20：1～100：1；

所述步骤1.3)中，中间体和氯化亚锡投料质量比为1：5～10；所述氯化亚锡与浓盐酸的质量体积比为1～1.2g：1mL。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述式(III)化合物、NaNO₂和氯化亚锡的物料质量比为1：0.5～1.5：3.8～5.8；

所述步骤2.1)中，式(III)化合物与浓盐酸的质量体积比为60～65mg：1mL；所述NaNO₂与水的摩尔体积比为2.17mmol：1.00～3.00mL；

所述步骤2.2)中，所述氯化亚锡与浓盐酸的摩尔体积比为3.82mmol：1.50～2.50mL；

所述步骤2.3)中，萃取剂为甲醇、乙腈或二氯甲烷中的至少一种；

所述步骤2.4)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为15:1～100:1。

5.一种甲醛检测试剂盒，其特征在于：所述甲醛检测试剂盒分别包含试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b两种溶液；所述试剂储备液a与荧光探针试剂储备液b的体积比为200：1；所述试剂储备液a由二甲基亚砜和磷酸盐组成；所述荧光探针试剂储备液b包括权利要求1所述的近红外联氨化合物以及有机溶剂。

6.根据权利要求5所述的甲醛检测试剂盒，其特征在于：所述试剂储备液a的pH值为7.4；所述二甲基亚砜的体积浓度为10％，所述磷酸盐的摩尔浓度为5mmol/L～15mmol/L；所述近红外联氨化合物的浓度为0.01mmol/L～1mmol/L。

7.根据权利要求6所述的甲醛检测试剂盒，其特征在于：所述磷酸盐是Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种；所述有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇和乙腈中的至少一种。

8.一种如权利要求7所述的甲醛检测试剂盒在甲醛快速检测和甲醛定量检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的甲醛检测试剂盒在甲醛快速检测和甲醛定量检测中的应用，其特征在于：所述甲醛检测试剂盒在甲醛定量检测中的应用过程是：

A1)以635nm～690nm作为激发波长，测定空白样品在发射波长为706nm处的荧光强度，记为F0；所述空白样品是由甲醛检测试剂盒中两种溶液混合而成的；

A2)将空白样品用试剂储备液a定容得到混合溶液，混合溶液中近红外联氨化合物浓度为10μmol/L；取多份等体积的混合溶液，分别对应加入不同已知浓度的甲醛作为甲醛标准品溶液，以635nm～690nm作为激发波长，分别测定甲醛标准品溶液在发射波长690nm～750nm处的荧光强度记为F，得到多个不同的荧光强度差值ΔF＝F–F0；以甲醛的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制曲线并拟合得到标准方程；

A3)取含有甲醛的待检测样品，加入空白样品中，以635nm～690nm作为激发波长，检测待测样品在发射波长690nm～750nm处的荧光强度F’，将F’代入步骤A2)所得标准方程中，计算得出待测样品中甲醛的浓度。

10.根据权利要求8所述的甲醛试剂盒在甲醛快速检测和甲醛定量检测中的应用，其特征在于：所述甲醛检测试剂盒在甲醛快速检测中的应用过程是：

B1)将试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b依次负载在滤纸片上，将滤纸风干；

B2)取两片滤纸，分别将待检测样本和纯水对应滴加在两片滤纸，并将两片滤纸放置在载玻片上，观察635nm激发波长下荧光成像；

B3)当待测检测样本的荧光成像亮度比纯水的荧光成像亮度强时，说明待测检测样本中含有甲醛。

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