CN115322178A - 近红外化合物、制备方法以及丁酰胆碱酯酶检测试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于丁酰胆碱酯酶检测技术领域,涉及一种近红外化合物、制备方法以及丁酰胆碱酯酶检测试剂盒和应用。
背景技术
丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BChE)是一种重要的水解酶,在人体内由肝脏合成,而后经血液循环进入血浆中,是临床上判断肝功能的生理指标,也是诊断有机磷中毒的重要指标。此外,丁酰胆碱酯酶与神经系统生理功能密切相关,是一种在阿尔兹海默症后期发展过程中重要的生物标志物,值得注意的是,阿尔兹海默症是一种无法治愈的退行性神经系统疾病,发病隐匿。随着阿尔兹海默症的进展,患者脑内丁酰胆碱酯酶水平显着升高,而乙酰胆碱酯酶水平降低,这种现象意味着通过对丁酰胆碱酯酶的监测可能在阿尔兹海默症后期的治疗中发挥关键作用。目前阿尔兹海默症的诊治仍存在病因不明确、后期药物治疗效果不佳等问题,这意味着丁酰胆碱酯酶的监测和影像学检查可能会促进阿尔兹海默症的治疗进展。目前对于丁酰胆碱酯酶的实时无损监测,仅研究出极少数的工具或者方法。因此,构建一种用于实时监测丁酰胆碱酯酶的检测方法,对于阐明丁酰胆碱酯酶的生理和病理功能,促进阿尔兹海默症诊治的进一步发展具有重要意义。
荧光探针法是一种新型的光学分析检测技术,主要由荧光基团、识别基团以及桥联键组成,其中,荧光基团是探针的主要骨架,负责输出荧光信号,与检测的灵敏度密切相关;识别单元能够选择性的与目标物质发生反应,通过桥联键与荧光团发生特异性结合。探针能够与特定目标物质发生相互作用,使得其分子的结构或电荷分布发生变化,通过光学性质(颜色、荧光或发光)的变化,实现对目标物质的检测分析。同时借助于如荧光光谱仪、荧光成像显微镜等手段,可以定性甚至定量外界刺激的强弱,从而实现分析检测的目的;荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段,通常有荧光的增强、猝灭或者发光波长的变化。近红外荧光探针因其特有的长波长激发和发射(600~900nm),其具有低背景干扰、高时空分辨率、高灵敏度、高选择性及良好的生物安全性等优良性能,可以实现对生物分子的实时可视化成像检测,并进一步扩展实际应用到相关疾病的预防、诊断和治疗过程中。但是现有的基于丁酰胆碱酯酶特异性响应的光学探针较少,主要通过利用同位素标记胆碱方法、催化乙酰硫代胆碱水解方法及基于胆碱酯酶抑制剂选择识别单元的紫外光谱吸收法,实现对丁酰胆碱酯酶的监测,但是存在以下问题:紫外光谱吸收法和催化乙酰硫代胆碱水解方法均存在检测灵敏度低,容易出现假阳性效果等缺点;通过利用同位素标记胆碱以实现对丁酰胆碱酯酶活性检测的方法存在反应时间长,操作复杂,需要大型仪器及昂贵的检测费用等缺点;现有的荧光探针在检测丁酰胆碱酯酶时,不能有效排除乙酰胆碱酯酶的干扰。
发明内容
针对现有丁酰胆碱酯酶检测存在的干扰大、荧光响应灵敏度低和检测成本高的技术问题,本发明提供一种近红外化合物、制备方法以及丁酰胆碱酯酶检测试剂盒和应用,对丁酰胆碱酯酶有很强的特异性,准确性和灵敏度高,抗干扰能力强,成本低,能有效的用于丁酰胆碱酯酶的定量检测和快速检测。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种近红外化合物的制备方法,包括以下步骤:
1)制备式(III)所示的化合物,备用;
1.1)将反应溶剂分为等体积的两份,将间苯二酚和碳酸钾溶于第一份反应溶剂中,在氮气保护下搅拌,然后加入溶有IR-780碘化物的第二份反应溶剂,混合后,在45℃~55℃下反应2h~5h得到粗产物;
2)制备式(I)所示的近红外化合物
2.1)将步骤1.2)得到的式(III)所示的化合物与碳酸钾混合,并溶于乙腈中,在室温和氮气保护下,搅拌20~40min得到反应混合液A;
2.2)向步骤2.1)的反应混合液A中加入1mL二甲氨基甲酰氯,在室温下,每反应24h加入0.5mL二甲氨基甲酰氯,反应结束时,共加入2.5mL二甲氨基甲酰氯;最后在减压下蒸发得到蓝紫色固体粉末,即为粗产物;
2.3)步骤2.2)合成的粗产物用二氯甲烷/甲醇洗脱、分离得到固体粉末,即为式(I)所示的近红外化合物
进一步的,所述步骤1.1)中,间苯二酚、碳酸钾和IR-780碘化物的物料摩尔比为1:1:1.5~2;反应溶剂总体积用量为6~10mL;所述反应溶剂为乙腈;
所述步骤1.2)中,二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1~100:1。
进一步的,所述步骤2.1)中,式(III)化合物和碳酸钾的质量比为1:1.5~2;所述乙腈用量比为5ml;所述步骤2.3)中,二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1~100:1。
一种近红外化合物的制备方法所制备的近红外化合物,近红外化合物的结构式如式(I)所示:
一种丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,所述丁酰胆碱酯酶检测试剂盒包含试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b;所述试剂储备液a与荧光探针试剂储备液b的体积比为100:1;所述试剂储备液a由磷酸盐组成;所述荧光探针试剂储备液b包括权利要求4所述的近红外化合物以及二甲基亚砜。
进一步的,所述试剂储备液a的pH值为7.4;所述磷酸盐的浓度为10mmol/L;所述荧光探针试剂储备液b中,近红外化合物的浓度为0.01mmol/L~1mmol/L;所述磷酸盐是Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种。
一种所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒在丁酰胆碱酯酶定量检测中的应用。
进一步的,所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒在丁酰胆碱酯酶定量检测中的应用,包括以下步骤:
A1)以600nm作为激发波长,测定空白样品在发射波长为677nm处的荧光强度,记为F0;所述空白样品是由试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b混合而成的;
A2)将空白样品用试剂储备液a定容得到混合溶液,混合溶液中近红外化合物浓度为10μmol/L;取多份等体积的混合溶液,分别对应加入不同已知浓度的丁酰胆碱酯酶作为丁酰胆碱酯酶标准品溶液,以600nm作为激发波长,分别测定丁酰胆碱酯酶标准品溶液在发射波长630nm~850nm处的荧光强度记为F,得到多个不同的荧光强度差值ΔF=F–F0;以丁酰胆碱酯酶的浓度C为横坐标,荧光强度差值ΔF为纵坐标,绘制曲线并拟合得到标准方程;
A3)取含有丁酰胆碱酯酶的待检测样品,加入空白样品中,以600nm作为激发波长,检测待测样品在发射波长630nm~850nm处的荧光强度F’,将(F’-F0)的差值代入步骤A2)所得标准方程中,计算得出待测样品中丁酰胆碱酯酶的浓度。
一种所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒在丁酰胆碱酯酶快速检测中的应用。
本发明的有益效果是:
1、本发明采用花菁类近红外荧光染料IR-780为骨架,衍生出带羟基的半菁近红外荧光团,再经进一步结合二甲氨基甲酰基,合成出用于丁酰胆碱酯酶检测的近红外荧光探针,该荧光探针荧光产生反应速度快,反应时间≤3s,选择性和灵敏度较高,具有近红外荧光发射波长,可用荧光光谱法检测。
2、本发明提供的近红外化合物的制备方法,简便易行,制备温度为室温,条件温和,成本低廉,无需饱和食盐水萃取,处理简单,易于规模化生产。
3、本发明提供的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,试剂储备液b本身荧光较弱,而与丁酰胆碱酯酶反应后则荧光强度会明显增强,在630nm~850nm处产生强吸收,并在677nm处荧光显著增强,该荧光发射波段为近红外光区,检测时,背景信号较低、噪音少,能够排除复杂生物体系中多至32种物质的干扰,因此具有较高的准确性和灵敏度;适于检测成分复杂的生物样品,还适合于监测样本中丁酰胆碱酯酶的分布。
4、本发明提供的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,检测灵敏度高,灵敏度高,荧光强度随丁酰胆碱酯酶浓度的增加而增强,荧光强度变化较大,且反应现象明显(伴有明显光学性质的改变);丁酰胆碱酯酶浓度在3U/mL~24U/mL之间时,荧光强度与丁酰胆碱酯酶浓度之间呈线性关系,相关度R的平方达到0.99以上,可以用于丁酰胆碱酯酶的定量检测。
5、本发明提供的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,基于二甲氨基甲酰基为识别部分,通过利用乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的空间结构差异,有效排除乙酰胆碱酯酶的干扰,使得丁酰胆碱酯酶对荧光的增强反应具有特异性,通过观察荧光成像的亮度,能快速检测样本中丁酰胆碱酯酶水平,方便快捷。
附图说明
图1为不同浓度的丁酰胆碱酯酶反应的荧光发射光谱;
图2为检测丁酰胆碱酯酶浓度时的标准曲线;
图3为各种干扰物质反应的荧光发射光谱;
图4为APP/PS1小鼠颅脑中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果;
图5为腹腔注射进入APP/PS1小鼠中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果;
图6为尾静脉注射进入APP/PS1小鼠中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果;
图7为尾静脉注射进入抑制剂组APP/PS1小鼠中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果;
图8为两种注射方式下APP/PS1小鼠主要器官中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果;
图9为斑马鱼内源性丁酰胆碱酯酶荧光强度变化。
具体实施方式
下面结合附图以及实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。根据本发明反应条件做一些常规的修改,用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。
本发明中,化合物的结构是通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)来确定的。1H-NMR、13C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。1H-NMR、13C-NMR的测定是用BrukerAvanceIII HD 600核磁共振谱仪,测定溶剂为氘代甲醇(Methanol-d4)。当出现多重峰的时候,将使用下面的缩写:s(singlet,单峰),d(doublet,双峰),t(triplet,三重峰),m(multiplet,多重峰),br(broadened,宽峰),dd(doublet of doublets,双二重峰),brs(broadenedsinglet,宽单峰)。偶合常数,用赫兹(Hz)表示。
本发明中,采用柱层析进行提纯分离时,柱层析采用青岛海洋化工200目~300目硅胶为载体。
本发明实施例中所涉及的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;试剂如IR-780碘代物和生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得,或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。
本发明实施例中无特殊说明,反应均在氮气氛下进行。氮气氛是指反应瓶连接1L容积的氮气气球或钢釜。
本发明中涉及的室温为20℃~30℃。
本发明中,反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC),反应所使用的展开剂的体系有:二氯甲烷和甲醇体系,溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
本发明中提供的制备路线包括:
1)化合物(III)的制备
在碱性条件下,式(V)所示的化合物与式(IV)所示的化合物经取代分解重排反应,得到式(III)所示化合物;
化合物(V)为IR-780碘化物,式(IV)为间苯二酚,均可直接购买得到。
2)制备结构式为式(I)所示的近红外荧光探针
在碱性条件下,式(III)所示的化合物与二甲氨基甲酰氯(式Ⅱ)发生取代反应,得到式(I)所示近红外化合物
本发明提供的制备方法,具体包括以下步骤:
1)制备结构式为式(III)的化合物
1.1)将反应溶剂分为等体积的两份,将间苯二酚和碳酸钾溶于第一份反应溶剂中,在氮气保护下搅拌,然后加入溶有IR-780碘化物的第二份反应溶剂,混合后在45~55℃下反应2~5h,得到如式(III)所示化合物的粗产物。
实施时,反应时间选择2.0h,3.0h,4.0h、4.5h,5h;最优反应时间为4h;反应温度为45℃、50℃和55℃;优选的温度为50℃。
实施时,间苯二酚、碳酸钾和IR-780碘化物的物料比为1:1:1.5~2;反应溶剂体积为6~10mL;反应溶剂为乙腈。
本发明中,当采用400mg内的IR-780碘化物,所用乙腈体积为6~10mL,当IR-780碘化物的质量大于400mg时,乙腈的体积用量以此为基础递增。
1.2)采用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂,将粗产物进行分离提纯得到式(III)所示的化合物。化合物的结构式为
本发明步骤1.2)中,二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1~100:1。
2)制备式(I)所示的近红外化合物
2.1)将步骤1.2)得到的式(III)所示的化合物与碳酸钾混合溶于乙腈中,在室温和氮气保护下,搅拌得到反应混合液A;反应时间为20~40min。
实施时,选择20min,30min,35min和40min,最优的为30min。
本步骤中,式(III)化合物和碳酸钾的物料质量比为1:1.5~2,乙腈用量比为5ml。
本发明中,200mg以内的式(III)化合物所用乙腈体积为5mL,当式(III)化合物的质量大于200mg时,乙腈的体积用量以此为基础递增。
2.2)将二甲氨基甲酰氯(1mL)加入步骤2.1)的反应混合液A中,在室温下每反应24h加入0.5mL二甲氨基甲酰氯,共加入2.5mL,在减压下蒸发得到蓝紫色固体粉末,即为粗产物。
本发明中,二甲氨基甲酰氯的加入量与式(III)化合物无需具体比例关系,200mg以内的式(III)化合物均用2.5mL二甲氨基甲酰氯,当式(III)化合物的质量大于200mg时,以此为基础递增。
2.3)合成的粗产物用二氯甲烷/甲醇洗脱、分离得到固体粉末,即为式(I)所示的近红外化合物。
本步骤中,二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1~100:1。
本发明利用制备的近红外化合物形成检测试剂盒,用于丁酰胆碱酯酶的快速检测和定量检测。
本发明提供的检测试剂盒,包含试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b;试剂储备液a与荧光探针试剂储备液b的体积比为100:1;试剂储备液a由磷酸盐组成;荧光探针试剂储备液b包括近红外化合物以及二甲基亚砜。
试剂储备液a的pH值为7.4;磷酸盐的浓度为10mmol/L;磷酸盐是Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种。本试验中,磷酸盐溶液按照本领域常规的PBS缓冲溶液的配制方法配制。
荧光探针试剂储备液b中,近红外化合物的浓度为0.01mmol/L~1mmol/L;优选的,荧光探针试剂储备液b中,近红外化合物的浓度1mmol/L。
本实施例中,当近红外化合物的浓度1mmol/L,是将4.83mg近红外化合物与10mL二甲基亚砜混合形成荧光探针试剂储备液b。
下面以几组具体的实施方式对本发明提供的制备方法进行详细的说明。
实施例1
1)化合物(III)的制备
1.1)取10mL乙腈溶液分为等体积的两份,将间苯二酚(110mg,0.5mmol)和碳酸钾(138mg,1mmol)溶于5mL乙腈溶液中,在氮气保护下室温搅拌20分钟,然后将溶有IR-780碘化物(333mg,0.5mmol)的5mL溶液通过注射器加入,混合物在50℃下反应4小时,反应结束后减压蒸干溶剂,所得半花菁荧光团粗产物用二氯甲烷/甲醇(v/v,20:1)柱层析分离。
1.2)粗产品以二氯甲烷/甲醇(100/1到20/1,v/v)为洗脱液,经柱层析分离后得到绿色固体(150mg,产率73%);
2)制备结构式为式(I)所示的近红外荧光探针
2.1)化合物(III)(164.8mg,0.4mmol)和碳酸钾(110.4mg,0.8mmol)溶于乙腈(5mL)中,在室温和氮气保护下搅拌30min,得到反应混合液A;
2.2)向反应混合液A中滴加1mL二甲氨基甲酰氯搅拌,另外每天向反应液中加入0.5mL二甲氨基甲酰氯,共反应3天,在减压下蒸发得到蓝紫色固体粉末,即为粗产物;
2.3)合成的粗产物经二氯甲烷/甲醇(v/v,100:1~20:1)柱层析分离,得到固体粉末,即为近红外荧光探针(133.5mg,产率69.1%)。
实施例2~实施例5
不同参数下制备式(I)所示的近红外荧光探针。
与实施例1不同的是制备过程中的参数不同,具体参见表1。
表1实施例2~实施例5提供的制备参数
进一步的,为了说明本发明制备的近红外化合物的性能,进行下列试验验证。
试验1化合物的结构表征
采用核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)来确定的实施例1制备的近红外化合物的结构特征。
式(I)所示的化合物的结构表征数据结果如下:
氢谱:1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ8.76(d,J=15.1Hz,1H),7.72(d,J=7.3Hz,1H),7.66(d,J=8.0Hz,1H),7.60–7.57(m,1H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),7.35–7.28(m,2H),7.11(dd,J=8.4,2.2Hz,1H),6.64(d,J=15.1Hz,1H),4.43(t,J=7.4Hz,2H),3.18(s,3H),3.06(s,3H),2.82–2.77(m,2H),2.74(d,J=8.2Hz,2H),1.97(dt,J=12.2,6.5Hz,4H),δ1.84(d,J=7.7Hz,6H),1.10(t,J=7.4Hz,3H)。
碳谱:13C NMR(151MHz,Methanol-d4)δ179.00,160.19,154.36,153.81,153.02,146.25,142.46,141.46,131.48,128.95,128.00,127.63,122.52,119.28,119.02,114.55,109.25,105.13,51.04,46.61,35.67,35.50,34.04,28.88,26.87,23.64,21.09,20.13,10.23。
试验2
先配制试剂储备液a,按照本领域常规操作方法配制得到磷酸盐浓度为10mmol/L,pH为7.4的磷酸盐溶液。磷酸盐溶液(PBS)配制使用NaHPO4-KH2PO4体系,因此磷酸盐浓度指的是NaHPO4和KH2PO4的总浓度。
采用实施例1制备得到的近红外化合物与二甲基亚砜配制成荧光探针试剂储备液b,其中,近红外化合物浓度为1mmol/L。
试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b两种溶液的体积比为100/1,构成丁酰胆碱酯酶检测试剂盒。实施时,两种溶液单独分开装,检测时根据需要进行混合。
试验过程是:
1)荧光发射光谱测定时以600nm为激发波长,测定试剂空白在发射波长为677nm处的荧光强度,记为F0,试剂空白为试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b按照体积比为100/1混合而成的。
2)将荧光探针试剂储备液b(1mmol/L,20μL)溶于试剂储备液a中,用试剂储备液a定容到2mL形成混合溶液,此时,混合溶液中,近红外化合物即探针浓度为10μmol/L。
然后,取等量的上述混合溶液多份,通过加入不同浓度的丁酰胆碱酯酶储备溶液,其中丁酰胆碱酯酶的浓度依次为:0U/mL、3U/mL、6U/mL、9U/mL、12U/mL、15U/mL、18U/mL、21U/mL、24U/mL、27U/mL和30U/mL;得到一系列含不同浓度丁酰胆碱酯酶的反应液,反应液体积均为2mL。
上述配制的一系列含不同浓度的丁酰胆碱酯酶反应液,利用荧光仪F-7000测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱,激发和发射的狭缝宽度为10nm,荧光发射光谱测定时以600nm为激发波长,得到不同浓度的丁酰胆碱酯酶溶液的发射光谱如图1所示。图1中共有11组荧光发射光谱曲线,曲线从下自上丁酰胆碱酯酶浓度依次增大。
同时,荧光发射光谱测定时以600nm为激发波长,测定11组不同浓度的丁酰胆碱酯酶溶液在发射波长为677nm处的荧光强度,记为F。根据波长677nm对应的荧光强度F,得到11组不同丁酰胆碱酯酶浓度对应的荧光强度差值ΔF=F–F0,以丁酰胆碱酯酶的浓度C为横坐标,对应的荧光强度差值ΔF为纵坐标,绘制标准曲线,得到标准曲线如图2所示。
经过浓度和荧光强度之间的线性拟合,线性拟合的回归方程为:ΔF=61.81×C+178.1(R2=0.996)。经过标准曲线方程,发现丁酰胆碱酯酶浓度在3U/mL~24U/mL之间呈线性关系,相关度R的平方达到0.99以上;其中,C为丁酰胆碱酯酶的浓度,单位为U/mL。
3)在线性范围内,向待测样品中加入体积比为100/1的试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b,以600nm为激发波长,测定待测样品在发射波长为677nm处的荧光强度F’,该荧光强度F’代入标准曲线,就可得到待测样品中丁酰胆碱酯酶的浓度。
计算时,F’要先减去F0,得到荧光差值,再代入ΔF=61.81×C+178.1中,得到对应的待测样品中丁酰胆碱酯酶的浓度。
根据本领域常规试验方法,在11次重复实验后得出该探针的检测限(S/N=3)为0.0376U/mL。
通过本试验,结果表明,本发明提供的式(I)所示的荧光探针近红外化合物具有以下特点:
1、荧光探针近红外化合物本身在溶液中荧光信号极低,背景信号较低;但是随着丁酰胆碱酯酶的加入,近红外化合物与丁酰胆碱酯酶反应后则荧光强度会明显增强,在630nm~850nm处产生强吸收,并在677nm处荧光最强,该荧光发射波段为近红外光区,背景干扰少,此探针具有较高的准确性和灵敏度。
2、荧光探针近红外化合物,荧光产生反应速度快,约在3s内即可显色稳定。
3、荧光探针近红外化合物与丁酰胆碱酯酶反应,荧光强度随丁酰胆碱酯酶浓度的增加而增强,在丁酰胆碱酯酶浓度在3U/mL~24U/mL之间时,荧光强度与丁酰胆碱酯酶浓度,呈线性关系,可进行丁酰胆碱酯酶的定量检测。
试验3
与试验2的方法相同,准备试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b。
试验过程:
1)将近红外化合物浓度1mmol/L的试剂储备液b溶于试剂储备液a(10mmol/L,pH7.4)中配制成10μmol/L的荧光探针溶液。
2)向荧光探针溶液中加入可能存在干扰的各类物质,然后在相同条件下进行平行检测。
干扰的物质为:浓度分别为1mmol/L的K+、Ca2+、Na+、Fe3+、H2O2、·OH、ONOO-、NO2 -、H2S、SO3 2-、甘氨酸Gly、异亮氨酸Ile、半胱氨酸Cys、缬氨酸Val、酪氨酸Tyr、亮氨酸Leu、苏氨酸Thr、谷氨酸Glu、赖氨酸Lys、同型半胱氨酸Hcy、甲硫氨酸Met和苯丙氨酸Phe。
浓度分别为2.5mmol/L的维生素C和谷胱甘肽(GSH);浓度分别为50U/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、溶菌酶和羧酸酯酶浓度;浓度为500μg/mL的β-乳球蛋白,浓度为500μg/mL的α-糜蛋白酶原,浓度为10μg/mL的牛血清清蛋白BSA;浓度为500U/mL的乙酰胆碱酯酶AChE和30U/mL的丁酰胆碱酯酶BChE,
上述各干扰物质以浓度为10mmol/L的试剂储备液a作为溶剂,得到一组混合溶液,使用荧光仪F-7000分别测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以600nm去激发;激发和发射的狭缝宽度为10nm,得到各物质的荧光强度,结果如图3所示。
图3为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱,其中:1为空白,2为氯化钾,3为氯化钙,4为氯化钠,5为氯化铁,6为过氧化氢,7为羟基自由基,8为过氧亚硝基阴离子,9为亚硝酸钠,10为硫化氢,11为亚硫酸钠,12为甘氨酸,13为异亮氨酸,14为半胱氨酸,15为缬氨酸,16为酪氨酸,17为亮氨酸,18为苏氨酸,19为谷氨酸,20为赖氨酸,21为同型半胱氨酸,22为甲硫氨酸,23为苯丙氨酸,24为维生素C,25为谷胱甘肽,26为胰蛋白酶,27为胃蛋白酶,28为溶菌酶,29为羧酸酯酶,30为β-乳球蛋白,31为α-糜蛋白酶原,32为牛血清清蛋白,33为乙酰胆碱酯酶,34为丁酰胆碱酯酶。
图3的结果表明,只有丁酰胆碱酯酶可引起荧光探针产生明显的光信号显著变化响应,证明该荧光探针对丁酰胆碱酯酶具有高度的选择性;其他常见的无机盐、氨基酸、活性氧和其他相关酶类等物质干扰作用不明显,能够排除复杂生物体系中多至32种物质的干扰,因此具有较高的准确性和灵敏度。
试验4
本实验选择阿尔兹海默症表型的小鼠(APP/PS1小鼠)为小鼠动物模型,分别为2月龄和7月龄大,且在成像之前,对所有小鼠提前禁食禁水12h,在成像过程中用异氟醚作为吸入麻醉剂麻醉小鼠。
(1)将实施例1提供的近红外化合物与二甲基亚砜配制成的荧光探针试剂储备液b(1mmol/L,10μL)注射到2月龄的小鼠的颅内和7月龄的小鼠的颅内,并于1小时后用IVISSpectrum成像系统捕获小鼠颅内荧光图像。
实验结果如图4所示,图4为APP/PS1小鼠颅脑中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果。
图4中,图4a为2月龄小鼠的荧光成像,图4b为7月龄小鼠的荧光成像,不难看出,7月龄小鼠颅内荧光信号明显强于2月龄小鼠,这说明,随着阿尔兹海默症病龄的增加,小鼠颅脑中丁酰胆碱酯酶水平上升。
(2)将实施例1提供的近红外化合物与二甲基亚砜配制成的荧光探针试剂储备液b(100μmol/L,200μL)通过腹腔注射的方式注射到2月龄的小鼠体内和7月龄的小鼠体内,并在注射后第15min、30min、60min和120min捕获荧光图像。
实验结果如图5所示,图5为通过腹腔注射进入APP/PS1小鼠中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果。
图5中,图5a、5b、5c和5d分别为2月龄小鼠在注射后第15min、30min、60min和第120min时的荧光成像,图5e、5f、5g和5h分别为7月龄小鼠在注射后第15min、30min、60min和第120min时的荧光成像。
从图5可以看出,腹腔注射荧光成像效果稳定,小鼠的荧光强度随时间推移持续增加,并在约60min后保持稳定。值得注意的是,相比2月龄APP/PS1小鼠,7月龄小鼠出现更强的荧光信号,这意味着内源性丁酰胆碱酯酶的水平可能随着阿尔兹海默症发病年限的增加而增加。
(3)将实施例1提供的近红外化合物与二甲基亚砜配制成的荧光探针试剂储备液b(100μmol/L,200μL)通过尾静脉注射的方式注射到2月龄的小鼠体内和7月龄的小鼠体内,并在注射后第0.5h、1h、3h、6h、9h和12h捕获荧光图像。
设置抑制剂组小鼠,将iso-OMPA(500μmol/L,200μL)通过尾静脉注射到小鼠体内,于1h后将实施例1提供的近红外化合物与二甲基亚砜配制成的荧光探针试剂储备液b(100μmol/L,200μL)通过尾静脉注射的方式注射到2月龄小鼠体内,并在注射后第0.5h、1h和6h捕获荧光图像。
实验结果如图6和7所示,图6为通过尾静脉注射进入APP/PS1小鼠中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果,图7为通过腹腔注射进入抑制剂组APP/PS1小鼠中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果。
图6中,图6a、6b、6c、6d、6e和6f分别为2月龄小鼠在注射后第0.5h,1.0h、3.0h、6h、9h和第12h时的荧光成像,图6g、6h、6i、6j、6k和6l分别为7月龄小鼠在注射后第0.5h,1.0h、3.0h、6h、9h和第12h时的荧光成像。可以明显观察到,大约在注射后第3小时,小鼠的荧光信号最强,说明在注射后约3h可达到最佳的成像效果。
图7中,相对于正常处理的2月龄APP/PS1小鼠,抑制剂组小鼠的荧光信号显着降低,这表明系统中的荧光信号是由丁酰胆碱酯酶引起的。
(4)将(2)腹腔注射和(3)尾静脉注射下的小鼠处死并解剖,对主要器官(心、肝、脾、肺、肾)进行成像。实验结果如图8所示,图8为两种注射方式下检测APP/PS1小鼠主要器官中丁酰胆碱酯酶的荧光成像结果。
可以明显从图8中观察到,荧光信号主要集中在小鼠的肝脏部分,证明了丁酰胆碱酯酶是由肝脏产生,且7月龄小鼠的肝脏荧光信号明显强于2月龄小鼠。此外,相对于正常处理的2月龄APP/PS1小鼠,抑制剂组小鼠肝脏的荧光信号显着降低,这进一步证明了系统中的荧光信号是由丁酰胆碱酯酶引起的。
试验5
试验过程是:斑马鱼培养于E3胚胎培养液中(营养液中包括15mmol/L氯化钠,0.5mmol/L氯化钾,1mmol/L硫酸镁,1mmol/L氯化钙,0.15mmol/L磷酸二氢钠,0.05mmol/L磷酸氢二钠,0.7mmol/L碳酸氢钠,5~10%的亚甲蓝,营养液pH 7.5),用生长3~5天的斑马鱼进行荧光成像。
将斑马鱼分为三组,第一组斑马鱼作为空白对照(图9A1、9A2、9A3和9A4),第二组(图9B1、9B2、9B3和9B4)斑马鱼经30μmol/L的试剂储备液b处理40min,然后用试剂储备液a(浓度为10mmol/L、pH为7.4)清洗三次,而后获取激光共聚焦荧光成像图;第三组(图9C1、9C2、9C3和9C4)斑马鱼先经iso-OMPA(浓度为50μmol/L)处理1h,后经30μmol/L的试剂储备液b处理40min,然后用试剂储备液a(浓度为10mmol/L、pH为7.4)清洗三次,而后用激光共聚焦显微镜(Leica,Germany)获取激光共聚焦荧光成像图。
实验结果如图9所示,空白组卵黄囊部的无明显荧光信号(图9A1和9A2),经试剂储备液b处理的实验组斑马鱼级抑制剂组斑马鱼的荧光信号主要集中在卵黄囊和大脑部位(图9B1和9B2,9C1和9C2)。作为对比,图9A3和9A4为图9A1和9A2在非荧光状态下的原始照片,图9B3和9B4为图9B1和9B2在非荧光状态下的原始照片,图9C3和9C4为图9C1和9C2在非荧光状态下的原始照片。
通过上述试验4和试验5可以验证得到,采用本发明制备的近红外化合物形成的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,可以通过对比荧光强度或荧光成像的方式,直观地判断待测生物样品丁酰胆碱酯酶的存在,也能够对丁酰胆碱酯酶浓度进行定量的测定,适用于丁酰胆碱酯酶的快速成像检测,对于复杂生物样本(如小鼠和斑马鱼)同样适用,本发明所提供的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒反应迅速,灵敏程度高,操作简单,适于广泛应用。
综上所述,本发明的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒是一种性能优良、使用方便的丁酰胆碱酯酶检测设备,在食品、医药及生物领域中有着巨大的应用前景。
Claims (9)
1.一种近红外化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)制备式(III)所示的化合物,备用;
1.1)将反应溶剂分为等体积的两份,将间苯二酚和碳酸钾溶于第一份反应溶剂中,在氮气保护下搅拌,然后加入溶有IR-780碘化物的第二份反应溶剂,混合后,在45℃~55℃下反应2h~5h得到粗产物;
2)制备式(I)所示的近红外化合物
2.1)将步骤1.2)得到的式(III)所示的化合物与碳酸钾混合,并溶于乙腈中,在室温和氮气保护下,搅拌20~40min得到反应混合液A;
2.2)向步骤2.1)的反应混合液A中加入1mL二甲氨基甲酰氯,在室温下,每反应24h加入0.5mL二甲氨基甲酰氯,反应结束时,共加入2.5mL二甲氨基甲酰氯;最后在减压下蒸发得到蓝紫色固体粉末,即为粗产物;
2.3)步骤2.2)合成的粗产物用二氯甲烷/甲醇洗脱、分离得到固体粉末,即为式(I)所示的近红外化合物
2.根据权利要求1所述的近红外化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤1.1)中,间苯二酚、碳酸钾和IR-780碘化物的物料摩尔比为1:1:1.5~2;反应溶剂总体积用量为6~10mL;所述反应溶剂为乙腈;
所述步骤1.2)中,二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1~100:1。
3.根据权利要求2所述的近红外化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤2.1)中,式(III)化合物和碳酸钾的质量比为1:1.5~2;所述乙腈用量比为5ml;所述步骤2.3)中,二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1~100:1。
5.一种丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,其特征在于:所述丁酰胆碱酯酶检测试剂盒包含试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b;所述试剂储备液a与荧光探针试剂储备液b的体积比为100:1;所述试剂储备液a由磷酸盐组成;所述荧光探针试剂储备液b包括权利要求4所述的近红外化合物以及二甲基亚砜。
6.根据权利要求5所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒,其特征在于:所述试剂储备液a的pH值为7.4;所述磷酸盐的浓度为10mmol/L;所述荧光探针试剂储备液b中,近红外化合物的浓度为0.01mmol/L~1mmol/L;所述磷酸盐是Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种。
7.一种如权利要求6所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒在丁酰胆碱酯酶定量检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒在丁酰胆碱酯酶定量检测中的应用,其特征在于,包括以下步骤:
A1)以600nm作为激发波长,测定空白样品在发射波长为677nm处的荧光强度,记为F0;所述空白样品是由试剂储备液a和荧光探针试剂储备液b混合而成的;
A2)将空白样品用试剂储备液a定容得到混合溶液,混合溶液中近红外化合物浓度为10μmol/L;取多份等体积的混合溶液,分别对应加入不同已知浓度的丁酰胆碱酯酶作为丁酰胆碱酯酶标准品溶液,以600nm作为激发波长,分别测定丁酰胆碱酯酶标准品溶液在发射波长630nm~850nm处的荧光强度记为F,得到多个不同的荧光强度差值ΔF=F–F0;以丁酰胆碱酯酶的浓度C为横坐标,荧光强度差值ΔF为纵坐标,绘制曲线并拟合得到标准方程;
A3)取含有丁酰胆碱酯酶的待检测样品,加入空白样品中,以600nm作为激发波长,检测待测样品在发射波长630nm~850nm处的荧光强度F’,将(F’-F0)的差值代入步骤A2)所得标准方程中,计算得出待测样品中丁酰胆碱酯酶的浓度。
9.一种如权利要求6所述的丁酰胆碱酯酶检测试剂盒在丁酰胆碱酯酶快速检测中的应用。
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