CN111499604B - 一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析检测技术领域，提供了溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针及其制备方法和应用。该近红外荧光探针为3‑(2‑(3‑(二氰基亚甲基)‑5,5‑二甲基环己烯‑1‑基)乙烯基)‑4‑吗啉基香豆素‑7‑丙烯酸酯，简写为DCICA，所制备的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针，具有结构新颖、溶酶体靶向、近红外荧光发射（发射波长为680 nm）的特点，不仅能高选择性、高灵敏度地检测溶液中Cys含量，而且还能利用激光共聚焦成像技术对细胞溶酶体中的Cys进行特异性检测，对研究Cys参与溶酶体生命活动的分子机制有重要的指导意义，应用前景广阔。

Description

一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体属于一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
半胱氨酸（Cys）是生物体所必须的一种含硫氨基酸，几乎存在于哺乳动物的所有细胞之中，具有维持细胞和组织健康生长以及延缓衰老的生理功能。人体中的半胱氨酸水平异常会引起生长缓慢、毛发脱色、水肿、嗜睡、肝功能损伤、皮肤松弛、身体虚弱等不良症状。因此，高选择性高灵敏度地检测Cys对疾病的早期诊断和治疗意义重大。在众多Cys的检测方法中，荧光检测法由于具有操作简单、灵敏度高、能够实时、在线检测等优点，受到广泛关注。截止目前，已有大量的检测 Cys 的荧光探针被报道（王军，虎良军，申婧，姜吉泉，郁科勇，孙荣国. L-半胱氨酸可视化传感器/体系的研究进展，有机化学，2018，38：760-774），但是由于在生物体系中还存在其他结构和反应活性与Cys相似的生物硫醇，如同型半胱氨酸（Hcy）和还原谷胱甘肽（GSH），或多或少对Cys的检测有一定的干扰，而且大多数荧光探针的发射波长较短，存在不能在生物体内应用的局限性。因此，开发新的特异性识别Cys的近红外荧光探针一直是该领域的研究热点。
溶酶体是细胞的消化器官，在细胞各种生命活动如物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡中发挥着重要作用。随着人们对溶酶体结构的深入研究，逐步了解溶酶体中的各类活性小分子参与了溶酶体内的各种生物化学反应，其浓度与分布都会影响细胞的多种生理过程（李美含，王宇童，刘广建，吕海娟，邢国文. 溶酶体荧光探针研究新进展，有机化学，2017，37：356-374）。Cys是溶酶体内组织蛋白酶的重要组成部分，它的浓度变化直接影响组织蛋白酶正常功能的发挥，因此，准确测定细胞溶酶体内Cys含量的动态变化具有十分重要的生物学和医学价值。
综上所述，发展具有溶酶体靶向的、近红外荧光发射的、特异性识别Cys荧光探针，并研究其在生物体内的成像应用，不仅有助于理解Cys参与溶酶体生命活动的分子机制，而且对疾病的治疗具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针，该荧光探针具有近红外发射、溶酶体靶向和特异性识别Cys的特点。
本发明的另一目的是提供该溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的制备方法及其在溶液和细胞溶酶体中Cys检测中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针，该近红外荧光探针为3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯，简写为DCICA，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
制备所述的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的方法，以间苯二酚为起始原料，与丙二酸反应得到4,7-二羟基香豆素，再与三氯氧磷/DMF反应制得7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛；在吗啉催化下，7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛与(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈反应一步生成(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再与丙烯酰氯发生酰化反应制得3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯。
具体步骤如下：
（1）制备4,7-二羟基香豆素；
（2）制备7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛；
（3）7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛和(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈溶于DMF中，加入吗啉，室温搅拌反应10~12小时，然后倒入水中，过滤，柱色谱分离得(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈；其中：7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛、(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、吗啉与DMF的用量比例为：1mmol：1~1.5mmol：1.5~3mmol：0.5~2mL；柱色谱条件为：用硅胶填充色谱柱，用甲醇：二氯甲烷 = 1：30洗脱剂洗脱；
（4）制得的(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈和三乙胺溶于二氯甲烷中，然后在冰水浴冷却下滴加丙烯酰氯，控制滴加速度使反应体系的温度保持在0℃，加完后在0℃搅拌反应4~6小时，然后倒入冰水中，分液，有机相减压浓缩，残留物柱色谱分离得3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯；其中：(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、丙烯酰氯、三乙胺与二氯甲烷的用量比例为：1mmol：1~3mmol：1~3mmol：5~20mL；柱色谱条件为：用硅胶填充色谱柱，用乙酸乙酯：石油醚 = 2：1洗脱剂洗脱。
所述4,7-二羟基香豆素，按照文献《“Hydroxycoumarin Derivatives: Novel andPotent r-Glucosidase Inhibitors”, Qiong Shen, Jialiang Shao, Quan Peng,Wanjin Zhang, Lin Ma, Albert S. C. Chan, Lianquan Gu, J. Med. Chem., 2010,53, 8252–8259, 2010年11月5日》合成；
所述7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛，按照文献《“NIR-fluorescent coumarin-fusedBODIPY dyes with large Stokes shifts”, Andrei Y. Bochkov, Igor O. Akchurin,Oleg A. Dyachenko, Valery F. Traven, Chem. Commun., 2013, 49, 11653-11655,2013年10月21日》合成；
步骤（3）中吗啉所起的作用既是缩合反应的催化剂，又是亲核取代反应的反应试剂。
所述的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的应用，该近红外荧光探针用于特异性检测溶液和细胞溶酶体中的Cys。
本发明提供的一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针，具有结构新颖、溶酶体靶向、近红外荧光发射的特点。本发明的检测方法能对细胞溶酶体中的Cys进行特异性检测，对研究Cys参与溶酶体生命活动的分子机制有重要的指导意义。本发明的检测方法检测快速、灵敏度高，该检测方法在溶液中进行检测快速，在5分钟内即可完成检测。检测过程不受其他分析物的干扰。
附图说明
图1为本发明所述近红外荧光探针DCICA的合成反应式；
图2为荧光探针DCICA的1H NMR图；
图3为荧光探针DCICA的13C NMR图；
图4为荧光探针DCICA检测Cys的荧光滴定图；
图5为荧光探针DCICA检测Cys的工作曲线；
图6为荧光探针DCICA检测Cys的响应时间图；
图7为荧光探针DCICA与不同氨基酸以及生物体内常见离子作用的荧光发射图，其中，1、空白，2、Cys，3、Hcy，4、GSH，5、Ala，6、Glu，7、Lys，8、Asp，9、Gly，10、Leu，11、Ile，12、Gln，13、Tyr，14、His，15、Trp，16、Thr，17、Phe，18、Asn，19、Met，20、Val，21、Pro，22、Ser，23、Arg，24、Na+，25、Ca2+，26、Zn2+，27、K+，28、Mg2+，29、Al3+，30、Fe2+，31、Cr3+，32、Cu2+，33、S2O3 2—，34、HSO3 —，35、NO2 —，36、HS—，37、SO4 2—；
图8为荧光探针DCICA对细胞内源Cys特异性识别的成像图；
图9为荧光探针DCICA对细胞内源Cys特异性识别的成像图与商业化溶酶体染料LysoTracker Green DND-26的共定位成像图；图中： A为绿色通道（500-550 nm，激发波长为488 nm）的成像图；B为红色通道（630-700 nm，激发波长为514 nm）的成像图；C为明场成像图；D为A、B和C的叠加图；E为D图中感兴趣区域（ROI）；F为共定位散点图；
图10为荧光探针DCICA对不同生物硫醇（Cys、Hcy和GSH）的荧光响应图。
具体实施方式
下述实施例将有助于理解本发明，但不限于本发明。
实施例1：3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯的制备，其反应式如图1所示。
（1）4,7-二羟基香豆素的制备：将间苯二酚（50 mmol，5.505 g）、丙二酸（60 mmol，6.244 g）和无水氯化锌（161.5 mmol，22.009 g）加到16.5 mL三氯氧磷中，然后加热至60-65 ℃搅拌反应12小时，冷却，加入200 mL冰水淬灭反应，过滤，将得到的固体溶于5% 碳酸钠水溶液，用稀盐酸调节pH为3-4，析出黄色固体，过滤得6.95 g 4,7-二羟基香豆素，产率78%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 12.23 (s, 1H), 10.52 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.6Hz, 1H), 6.76 (dd, J
= 8.6, 2.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.38 (s, 1H)。该反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
（2）7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛的制备：将步骤（1）制得的4,7-二羟基香豆素（5.8mmol，1.033 g）溶于5 mL DMF中，加热至40 ℃，然后加入三氯氧磷（14.5 mmol，2.223 g），在40 ℃搅拌反应0.5小时，冷却，倒入100 mL冰水中，搅拌1小时，过滤，水洗，干燥得0.912g 7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛，产率70%。1H NMR (600 MHz, Acetone-d 6) δ 10.23 (s,1H), 8.05 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 6.85 (d, J =2.4 Hz, 1H)。该反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
（3）(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈的制备：将步骤（2）制得的7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛（1 mmol，0.224 g）和(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（1 mmol，0.186 g）溶于0.5 mL DMF中，加入吗啉（2 mmol，0.174 mL），室温搅拌反应10~12小时，然后倒入10 mL水中，过滤得粗产物，经柱色谱分离（甲醇/二氯甲烷 =1/30）得0.155 g (3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，收率35%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 10.76 (s, 1H), 7.78 (d, J = 9.0 Hz, 1H),7.41 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz,1H), 6.70 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.83-3.80 (m, 4H), 3.54 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 2.61(s, 2H), 2.55 (s, 2H), 1.03 (s, 6H). 13C NMR (151 MHz, DMSO-d 6) δ 170.60, 162.09,160.96, 159.96, 157.16, 155.10, 132.85, 131.19, 128.49, 122.25, 114.53, 113.69,113.55, 110.32, 105.77, 102.84, 75.76, 67.36, 53.36, 42.78, 38.49, 32.20, 27.94.HRMS(ESI): m/z Calcd. for C26H24N3O4 ([M-H]－): 442.1772; Found 442.1772。该反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
（4）3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯的制备：将步骤（3）制得的(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（1 mmol，0.443 g）和三乙胺（2 mmol，0.278 mL）溶于10 mL 二氯甲烷中，然后在冰水浴冷却下滴加丙烯酰氯（2 mmol，0.162 mL），控制滴加速度使反应体系的温度保持在0 ℃，加完后在0 ℃搅拌反应4~6小时，然后倒入10 mL冰水中，分液，有机相减压浓缩，残留物柱色谱分离（乙酸乙酯/石油醚 = 2/1）得0.248 g 3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯，收率50%。1H NMR(600 MHz, DMSO-d 6) δ 7.98 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 15.8 Hz, 1H),7.37 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 15.8Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.59 (d, J = 17.3 Hz, 1H), 6.48-6.43 (m, 1H), 6.22 (d,J = 10.4 Hz, 1H), 3.89-3.80 (m, 4H), 3.60-3.52 (m, 4H), 2.63 (s, 2H), 2.58(s, 2H), 1.04 (s, 6H)（图2）. 13C NMR (151 MHz, DMSO-d 6) δ 170.65, 164.06,160.57, 158.32, 156.56, 153.58, 153.15, 134.98, 132.89, 132.00, 127.90,127.74, 123.05, 118.62, 116.37, 114.39, 113.53, 110.92, 108.64, 76.66, 67.31,53.22, 42.79, 40.49, 38.42, 32.21, 27.93（图3）. HRMS(ESI): m/z Calcd. forC29H26N3O5
([M-H]－): 496.1878; Found: 496.1879。该反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
实施例2-7为荧光探针DCICA检测溶液和细胞溶酶体中Cys的应用实施例。
实施例2：荧光探针DCICA与Cys作用的荧光光谱的测定
（1）配制溶液：用二甲基亚砜（DMSO）配制2 mM荧光探针DCICA的储备液；用蒸馏水配制2 mM的Cys溶液；
（2）将2 mL EtOH/PBS 缓冲液（v/v = 1/1，pH = 7.4）和10 µL荧光探针DCICA储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱（激发波长510 nm），然后逐步加入Cys溶液，按照每次增长5 µL，由5 µL开始逐步加入，最终加入体积为50 µL，每次加完后放置5分钟，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys后探针在680 nm处出现了新的荧光发射峰，而且随着Cys的加入荧光强度逐渐增强，当Cys的浓度加到探针DCICA浓度的5倍量时，荧光强度基本不发生变化（见图4）；以Cys浓度C为横坐标，探针在680 nm处的荧光强度F为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的最佳线性响应范围为0-40 µM，回归方程为：F＝28.2504×C + 131.2948（见图5），线性相关系数R2＝0.9960，检出限为0.053 μM。（这里尽量补充完善不同体积具体是实验了那些体积的溶液，或者是以什么样的增长从多少至多少体积）
实施例3：荧光探针DCICA与Cys作用的响应时间的测定
在荧光比色皿中，加入2 mL EtOH/PBS 缓冲液（v/v = 1/1，pH = 7.4）和10 µL荧光探针DCICA储备液，再加入5摩尔当量Cys溶液，在荧光分光光度仪上测定探针在680 nm处的荧光强度变化（激发波长510 nm），随着反应时间的延长，荧光强度不断增大，反应进行到300 s时，荧光强度基本恒定（见图6），说明该检测方法检测快速，在5分钟内即可完成检测。
实施例4：荧光探针DCICA对Cys选择性的测定
在不同的荧光比色皿中，分别加入2 mL EtOH/PBS 缓冲液（v/v = 1/1，pH = 7.4）和10 µL荧光探针DCICA储备液，此时探针DCICA的浓度为10 μM，再分别加入不同的氨基酸和生物体内常见离子的水溶液，包括Cys、Hcy、GSH、Ala、Glu、Lys、Asp、Gly、Leu、Ile、Gln、Tyr、His、Trp、Thr、Phe、Asn、Met、Val、Pro、Ser、Arg、Na+、Ca2+、Zn2+、K+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cr3+、Cu2+、S2O3 2—、HSO3 —、NO2 —、HS—、SO4 2—，使其最终浓度为500 μM，在荧光分光光度仪上测定荧光光谱（激发波长510 nm），绘制加入不同分析物在680 nm处荧光强度的柱状图，见图7。实验证明，其他氨基酸（包括Hcy和GSH）和生物体内常见离子不干扰体系对Cys的检测。
实施例5：荧光探针DCICA在活细胞中的应用
利用激光共聚焦显微镜研究了探针DCICA对Hela细胞内源Cys的响应情况。细胞成像实验分为5组，其中A组为实验组，B、C、D、E为对照组。A组实验为在育有Hela细胞的培养皿中加入探针DCICA溶液（10 µM），在培养箱中培养15分钟后进行成像实验；B组实验为在育有Hela细胞的培养皿中加入硫醇清除剂NEM溶液（1 mM），在培养箱中培养15分钟去除细胞内的生物硫醇，再加入荧光探针DCICA溶液（10 µM），在培养箱中培养15分钟后进行成像实验；C、D、E组实验为先用NEM预处理Hela细胞，然后分别与Cys（20 µM）、Hcy（20 µM）和GSH（1 mM）培养15分钟，再加入探针DCICA溶液（10 µM）培养15分钟后进行成像实验。如图8所示，A组和C组细胞在红色通道（630-700 nm，激发波长为514 nm）中有明显的红色荧光发射，而B、D、E组细胞无荧光发射，说明探针DCICA能特异性检测细胞内的Cys。
为了考察荧光探针DCICA对细胞溶酶体的定位能力，我们研究了荧光探针DCICA与商业化溶酶体染料LysoTracker Green DND-26对Hela细胞溶酶体的共定位实验。在育有Hela细胞的培养皿中加入探针DCICA溶液（10 µM），在培养箱中培养15分钟，再加入LysoTracker Green DND-26溶液（0.5 µM），培养20分钟后进行成像实验。如图9所示，在绿色通道（500-550 nm，激发波长为488 nm）和红色通道（630-700 nm，激发波长为514 nm）都有强的荧光发射（图9A和9B），而且LysoTracker Green DND-26的绿色荧光与探针DCICA的红色荧光有很好的匹配度（图9D-9F），皮尔森相关系数达0.88，说明探针DCICA具有很好的溶酶体定位能力，能特异性检测细胞溶酶体内的Cys。

Claims (6)

1.一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针，其特征在于：该近红外荧光探针为3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯
酸酯，简写为DCICA，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.制备权利要求1所述的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的方法，其特征在于：以间苯二酚为起始原料，与丙二酸反应得到4,7-二羟基香豆素，再与三氯氧磷/DMF反应制得7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛；在吗啉催化下，7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛与(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈反应一步生成(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再与丙烯酰氯发生酰化反应制得3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯。
3.根据权利要求2所述的制备溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）制备4,7-二羟基香豆素；
（2）制备7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛；
（3）7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛和(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈溶于DMF中，加入吗啉，室温搅拌反应10~12小时，然后倒入水中，过滤，柱色谱分离得(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈；其中：7-羟基-4-氯香豆素-3-甲醛、(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、吗啉与DMF的用量比例为：1mmol：1~1.5mmol：1.5~3mmol：0.5~2mL；柱色谱条件为：用硅胶填充色谱柱，用甲醇：二氯甲烷 = 1：30洗脱剂洗脱；
（4）制得的(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈和三乙胺溶于二氯甲烷中，然后在冰水浴冷却下滴加丙烯酰氯，控制滴加速度使反应体系的温度保持在0℃，加完后在0℃搅拌反应4~6小时，然后倒入冰水中，分液，有机相减压浓缩，残留物柱色谱分离得3-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)-4-吗啉基香豆素-7-丙烯酸酯；其中：(3-(7-羟基-4-吗啉基香豆素-3-乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、丙烯酰氯、三乙胺与二氯甲烷的用量比例为：1mmol：1~3mmol：1~3mmol：5~20mL；柱色谱条件为：用硅胶填充色谱柱，用乙酸乙酯：石油醚 = 2：1洗脱剂洗脱。
4.权利要求1所述的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的应用，其特征在于：该近红外荧光探针在非疾病诊断和治疗目的的特异性检测溶液和细胞溶酶体中的Cys的应用。
5.根据权利要求4所述的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述溶液中，近红外荧光探针DCICA与Cys作用的荧光检测方法具体为：
（1）配制溶液：用二甲基亚砜DMSO配制2 mM荧光探针DCICA的储备液；用蒸馏水配制2mM的Cys溶液；
（2）将2 mL v/v = 1/1，pH = 7.4的 EtOH/PBS 缓冲液和10 µL荧光探针DCICA储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱，然后逐步加入Cys溶液，按照每次增长5 µL，由5 µL开始逐步加入，最终加入体积为50 µL，每次加完后放置5分钟，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys后探针在680 nm处出现新的荧光发射峰，而且随着Cys的加入荧光强度逐渐增强，当Cys的浓度加到探针DCICA浓度的5倍量时，荧光强度基本不变化；以Cys浓度C为横坐标，探针在680 nm处的荧光强度F为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的最佳线性响应范围为0-40 µM，回归方程为：F＝28.2504×C +131.2948，线性相关系数R2＝0.9960，检出限为0.053 μM。
6.如权利要求5所述的溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针的应用，其特征在于：荧光检测溶液中Cys的激发波长为510 nm，发射波长为680 nm。
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