CN112409377B - 用于特异性检测和激动pkm2蛋白的小分子荧光探针及制备方法 - Google Patents

用于特异性检测和激动pkm2蛋白的小分子荧光探针及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及其制备方法。将EDC、HOBt、香豆素‑3‑羧酸的混合物在DMF中溶解，加入TEPP46搅拌，经脱水缩合反应后制得固体TEPC466。该荧光探针具有聚集诱导发光性质，与PKM2蛋白特异性结合后，诱导PKM2形成四聚体使分散的探针聚集，光化学效应显著增强，灵敏度高，在检测过程中不易受生物体系中其它成分干扰，对PKM2蛋白具有高选择性。该探针对细胞毒性小，有良好的生物相容性，可用于细胞内PKM2蛋白的成像检测和特异性靶向激动。该探针作为PKM2蛋白靶点的定量定性检测和激动剂，对临床诊疗一体化提供了一种有价值的方法。

Description

用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及制备 方法
技术领域
本发明涉及化学探针及制备方法，特别涉及用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及制备方法。
背景技术
丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是糖酵解途径中催化最后一步反应的关键限速酶，它催化磷酸基团从磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)转移至二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)，生成三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)和丙酮酸。
PK具有四种同工酶形式，分别为PKM1、PKM2、PKL和PKR。每种同工酶都具有独特的组织表达特异性。PKL、PKR和PKM1均作为稳定的四聚体存在，具有高度的代谢酶活性，而PKM2亚基可形成四聚体和二聚体。与PKM2的四聚体形式相比，二聚体PKM2对底物PEP具有较高的Km值，在生理浓度PEP时不具有活性。PKM2在肿瘤细胞中的高表达和二聚体低酶活性赋予糖酵解表型，有助于增加葡萄糖摄取，抑制丙酮酸进入三羧酸循环进行氧化磷酸化代谢，促进快速能量产生和糖酵解中间体向侧支途径流动以合成核酸、氨基酸和脂质等生物大分子，有利于肿瘤的生长而不积累活性氧。在肿瘤细胞内用组成型活性同工酶PKM1替代PKM2会导致乳酸生成减少，耗氧量增加，抑制肿瘤的生长。
已有研究表明，许多疾病如结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌的发生与PKM2的高表达密切相关，PKM2的高表达可能是肿瘤发生的早期事件，且与预后相关。因此，PKM2可以作为早期发现肿瘤的有用的生物标志物和治疗靶点，开发一种可直接高灵敏度地检测和靶向生物体系中PKM2蛋白的荧光探针具有非常好的应用前景和重要的生物医学价值。
近年来，小分子荧光探针作为一种新型的研究工具，可以对靶分子进行示踪和靶向，在生命科学、肿瘤诊断和治疗等研究领域中都大显身手。然而，目前还未有针对PKM2蛋白的荧光探针的发明创造。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针。
本发明的另一目的提供所述用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针的制备方法。
技术方案：本发明通过对PKM2的高效选择性激活剂TEPP46(结构如式II所示)进行结构改造，设计、合成了一种基于TEPP46的可定位检测PKM2蛋白四聚体的AIE新型荧光探针TEPC466，其结构如式I所示。
Figure BDA0002799721720000021
进一步地，该探针具有聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)特性，当加入TEPC466时，二聚体的PKM2在生理条件下被诱导形成四聚体，分散的TEPC466积累并发出荧光。
进一步地，该探针可定量和定性检测PKM2蛋白。
进一步地，该探针与PKM2蛋白反应的最大激发波长为310nm，发射波长范围为330-500nm，且荧光发射强度与PKM2蛋白浓度相关。
进一步地，当探针浓度为10μM时，定量检测PKM2蛋白的浓度线性范围为0.0625-4μg/mL，R2＝0.9997。
进一步地，可作为细胞中PKM2蛋白靶向激动剂。
所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针的制备方法，将EDC、HOBt、香豆素-3-羧酸的混合物在DMF中溶解，加入TEPP46搅拌，经脱水缩合反应后制得固体TEPC466。
本发明所公开的特异性检测PKM2蛋白的小分子荧光探针，将香豆素结构引入TEPC466，当加入TEPC466时，二聚体的PKM2在生理条件下被诱导形成四聚体，分散的TEPC466聚集并发出强烈的荧光。本发明公开的特异性检测PKM2蛋白的小分子荧光探针的最大激发波长为310nm，在不含有PKM2蛋白的情况下，几乎无荧光发射，一旦加入PKM2蛋白后，在330-500nm发射波长范围内可发出荧光，最大发射波长为386nm。探针具有较大的斯托克斯位移，可以很好地消除背景干扰。另外，探针的荧光强度随PKM2蛋白浓度梯度的升高而增强，检测灵敏，在0.0625-4μg/mL的PKM2蛋白浓度范围内，荧光强度与蛋白浓度呈线性相关，R2＝0.9997。
有益效果：本发明首次合成了基于PKM2激动剂TEPP46结构的新型荧光探针TEPC466。TEPC466具有AIE性质，可特异性定量定性检测和激动PKM2蛋白。本发明的特异性检测PKM2蛋白的小分子荧光探针不受生物体系中其他物质的干扰，在PKM2蛋白存在下荧光强度发生显著改变，检测限低，灵敏度高，对PKM2蛋白具有高选择性。本发明的小分子荧光探针对细胞的毒性低，细胞通透性好，生理pH条件下稳定，具有良好的生物相容性，检测直观稳定，成功应用于细胞内PKM2蛋白的成像检测和PKM2的代谢酶激动剂，可为进一步研究细胞中PKM2蛋白的生物学功能和治疗肿瘤提供可靠的工具。
附图说明
图1为TEPP46和TEPC466固体粉末在紫外线(365nm)照射下的荧光图，左上角为固体粉末在白炽灯照射下的对比图；
图2为不同比例的水和四氢呋喃(THF％＝0-100)对TEPC466(10μM)荧光发射光谱的影响；
图3为TEPC466(10μM)与不同浓度的PKM2(0-20μg/mL)反应的荧光发射光谱；
图4为在386nm处TEPC466(10μM)与0.0625-4μg/mL PKM2反应，荧光强度与浓度呈线性相关；
图5为TEPC466(10μM)与1mM各种干扰物质(Na+、K+、Cl-、His、Ala、Cys、Gly、Arg、Tyr、GSH、Glc)以及PKM2(16μg/mL)反应的荧光发射光谱；
图6为在386nm处TEPC466(10μM)与1mM各种干扰物质(Na+、K+、Cl-、His、Ala、Cys、Gly、Arg、Tyr、GSH、Glc)以及PKM2(16μg/mL)反应的荧光强度变化；
图7为TEPC466对细胞毒性的评估；
图8为TEPC466在细胞中的共聚焦成像；
图9为TEPC466对PKM2蛋白的靶向激动作用测定。ns：p＞0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的试剂和材料，如无特别说明，均可从市售渠道购买。
实施例1：TEPC466的合成
将EDC(46mg，0.24mmol)，HOBt(36.48mg，0.24mmol)，香豆素-3-羧酸(38mg，0.2mmol)的混合物在DMF(10mL)中溶解，室温下搅拌约半小时，然后加入TEPP46(74.4mg，0.2mmol)，搅拌4小时。将混合物倒入50mL水中，并用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层先用饱和NH4Cl(20mL×2)洗涤，随后盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。用硅胶柱层析对其进行纯化，得到黄色固体TEPC466。
Figure BDA0002799721720000041
实施例2：TEPC466的AIE特性
如说明书附图1所示，在365nm激发波长的紫外线下，我们发现固体TEPC466发出强烈的黄色荧光，而TEPP46没有。TEPC466的低溶解性会通过激发态分子内质子转移导致荧光特征的沉淀。TEPC466作为一种具有AIE性质的化合物，在固态时能够发出强烈的荧光，可能是因为碳-碳键旋转受到限制。
为了进一步证明TEPC466具有AIE特性，我们用二甲基亚砜(DMSO)制备了TEPC466母液，浓度为10mM，研究TEPC466(10μM)在四氢呋喃(THF)/H2O系统中的荧光发射光谱。如说明书附图2所示，采用岛津RF6000荧光分光光度计，在310nm的最大激发波长下，设置激发光狭缝宽度为3nm，发射光狭缝宽度为5nm，扫描320-500nm范围内的荧光发射光谱。与THF相比，水是TEPC466的更好溶剂，当THF比率越来越高时，在420nm附近的发射峰有轻微的蓝移。所以TEPC466几乎不溶于有机介质，并在固态时发出强烈的荧光。
实施例3：His-Tagged-PKM2质粒转染和蛋白纯化
在37℃，含5％CO2的细胞培养箱中，用含10％胎牛血清(Biological Industries)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基培养293T细胞(中国科学院细胞库)。待培养皿中的细胞覆盖率达70％左右，根据制造商的说明，使用LipofectamineTM 3000转染试剂(Invitrogen)，在无抗生素的DMEM培养基中，将His-Tagged-PKM2质粒(EX-Z7438-M01，GeneCopoeia)转染293T细胞。待293T细胞转染质粒24h后，使用His-Tagged蛋白镍柱纯化试剂盒(TaKaRa)纯化His-Tagged-PKM2蛋白，随后用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)对已纯化出来的His-Tagged-PKM2蛋白进行浓度测定，蛋白保存于-80℃冰箱备用。
实施例4：TEPC466与不同浓度的PKM2蛋白反应的荧光发射光谱测定
将TEPC466用适量的DMSO充分溶解配制成10mM储备液，保存于4℃的冰箱备用。应注意，在所有的光谱测定中，反应液均需现配现用。取实施例3中所制备的His-Tagged-PKM2蛋白，用PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)将蛋白梯度稀释至0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16和20μg/mL。随后加入TEPC466母液使其反应工作浓度为10μM，将TEPC466与不同浓度的PKM2蛋白在37℃水浴下准确反应10min，按顺序将上述反应液依次加入至石英比色皿中，扫描TEPC466与PKM2蛋白反应的激发光谱和发射光谱，最终确定反应的最大激发波长为310nm。在反应最大激发波长310nm处，设置激发光狭缝宽度为3nm，发射光狭缝宽度为5nm，测定并记录330-500nm波长范围内的荧光发射光谱。其结果如说明书附图3所示，单独的10μM TEPC466在最大激发波长为310nm的激发光下仅在330-350nm波长范围内有微弱的荧光，而当TEPC466与PKM2蛋白混合反应后，在386nm处显示出明显的荧光增强信号，且荧光强度随PKM2蛋白浓度的增加而增强，检测灵敏度高。此外，如说明书附图4所示，在386nm处TEPC466与PKM2蛋白反应荧光强度在0.0625-4μg/mL的蛋白浓度范围内有良好的线性关系(R2＝0.9997)。这些结果表明，TEPC466对PKM2蛋白有较高的检测灵敏度，能够快速响应并产生强烈的荧光。
实施例5：TEPC466对PKM2的选择性评估
为了验证TEPC466对PKM2蛋白具有高选择性，我们将10μM TEPC466分别与各种干扰物质(用PBS缓冲溶液配制成反应工作浓度为1mM)，包括多种离子(Na+、K+、Gl-)、氨基酸(His、Ala、Cys、Gly、Arg、Tyr)、谷胱甘肽(GSH)和葡萄糖(Glc)在37℃水浴下准确反应10min，为了进行对比，我们还将TEPC466与PKM2(16μg/ML)在相同条件下反应10min，随后立即测定在310nm最大激发波长下，330-500nm波长范围内的荧光发射光谱。如说明书附图5所示，在TEPC466中分别加入其它干扰物质后，330-500nm波长范围内几乎无荧光响应。但在TEPC466中加入PKM2蛋白后荧光强度显著增强，在386nm处显示出明显的荧光发射峰。此外，柱状图(说明书附图6)显示TEPC466与各种干扰物质以及PKM2反应后在386nm处的荧光强度。结果表明，TEPC466仅在PKM2存在时才产生极强的荧光，说明TEPC466对PKM2具有很高的选择性。
实施例6：TEPC466的细胞毒性评估
在TEPC466应用于细胞共聚焦成像之前，对TEPC466在肿瘤细胞中的细胞毒性进行了评估。选用肠癌细胞系HCT116和HT29(中国科学院细胞库)，分别接种于含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的McCoy’s 5A(Gibco)培养基中，在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。待细胞密度长至90％左右，细胞消化离心接种至96孔板，24h后，弃去细胞原有的培养基，每孔加入含不同浓度(0、2、4、6、8、10、12、16、20μM)TEPC466的培养基100μL，继续培养24h。使用CCK-8试剂盒(Vazyme)评估TEPC466对细胞的毒性。如说明书附图7所示，在癌细胞中随着TEPC466浓度的升高，细胞的活力几乎没有受到影响，表明TEPC466对细胞低毒性，具有良好的生物相容性。
实施例7：TEPC466的细胞成像
鉴于TEPC466良好的光谱特性和细胞低毒性，我们接下来研究了TEPC466在细胞中检测PKM2蛋白的能力。因为在肿瘤细胞中PKM2高表达，选用肠癌细胞系HT29。实验分为两组，将肠癌细胞系HT29接种至共聚焦小皿内，待细胞贴壁后，按照制造商的说明，使用LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)，转染购自广州锐博公司设计的小干扰RNA(siRNA)。一组转染PKM2的小干扰RNA(siPKM2)将PKM2蛋白沉默，以获得PKM2低表达的细胞作为阴性对照组。另一组转染对照siRNA，作为PKM2表达的阳性对照组。两组细胞转染24h后，给予含20μM探针的培养基孵育细胞2h，弃去培养基，用PBS缓冲液洗净残留培养基，使用蔡司激光扫描共聚焦显微镜LSM700成像。如说明书附图8所示，TEPC466加入至阳性对照细胞后，在细胞内有强烈的蓝色荧光，而转染了siPKM2的阴性对照细胞中蓝色荧光非常微弱，这表明TEPC466可以检测细胞内PKM2蛋白的表达水平以及区分PKM2高表达的肿瘤细胞和PKM2低表达的正常细胞，用于癌症的早期判断。
实施例8：TEPC466对PKM2蛋白的靶向激动作用测定
TEPC466的设计是基于PKM2蛋白的特异性激动剂TEPP46。已知TEPP46可以促进PKM2的二聚体向四聚体构型的转变从而使得PKM2的丙酮酸激酶活性升高。我们使用丙酮酸激酶活性测定试剂盒(BioVision)中的测定缓冲液稀释实施例3中所制备的His-Tagged-PKM2蛋白至终浓度16μg/mL，随后分别与0，5，10，20，40μm TEPC466在37℃下准确反应30min，根据制造商的说明，通过比色法测定PKM2的丙酮酸激酶活性。如说明书附图9所示，PKM2的丙酮酸激酶活性随TEPC466浓度的升高而逐渐增强，当TEPC466浓度为40μM时，PKM2的丙酮酸激酶活性升高约1.5倍，且就有显著性差异，这表明TEPC466可以作为PKM2的靶向激动剂。

Claims (7)

1.一种用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，结构如式I所示，代号为TEPC466：
Figure FDA0002799721710000011
。
2.根据权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，具有聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)特性，当加入TEPC466时，二聚体的PKM2在生理条件下被诱导形成四聚体，分散的TEPC466积累并发出荧光。
3.根据权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，可定量和定性检测PKM2蛋白。
4.根据权利要求2所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，该探针与PKM2蛋白反应的最大激发波长为310nm，发射波长范围为330-500nm，且荧光发射强度与PKM2蛋白浓度相关。
5.根据权利要求2所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，当探针浓度为10μM时，定量检测PKM2蛋白的浓度线性范围为0.0625-4μg/mL，R2＝0.9997。
6.根据权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，可作为细胞中PKM2蛋白靶向激动剂。
7.权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，将EDC、HOBt、香豆素-3-羧酸的混合物在DMF中溶解，加入TEPP46搅拌，经脱水缩合反应后制得固体TEPC466。
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