CN113105560B - 一种多肽聚集体分子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽聚集体分子及其制备方法和应用。所述多肽聚集体分子包括丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分，所述丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分连接形成所述多肽聚集体分子。所述多肽聚集体分子能够在肿瘤细胞内被特异性水解，暴露丝氨酸与二聚体的PKM2作用，促使其转化为四聚体的PKM2，从而实现了抑制肿瘤，此外，通过组装实现了聚集诱导的发光效应，从而可以实时监测肿瘤的进展和迁移，同时具备长效滞留效果。

Description

一种多肽聚集体分子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多肽聚集体分子及其制备方法和应用。

背景技术

前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，是前列腺泡细胞异常生长的结果。前列腺癌有多种治疗方法，根据治疗手段的不同，目前治疗方法包括化疗、手术治疗、冷冻治疗、放射治疗、放射性粒子种植治疗等，对于有全身播撒倾向的癌症及已经转移的中晚期癌症，化疗是目前主要的治疗手段，然而，癌细胞对化疗药物产生耐药性常常最终导致化疗失败。

传统的有机材料，随着浓度的增加荧光强度会减弱，近年来，基于三苯胺类(TPA)的一系列聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission，AIE)有机荧光材料被设计合成，其在稀的有机溶液中荧光很弱甚至无荧光，而在含水的聚集态下发光增强，使其在生物成像和检测中具有明显的优势，已被应用于抗癌药物中，如CN112156083A公开了一种聚集诱导发光纳米颗粒，其利用自组装元件二苯丙氨酸肽(L-苯丙氨酰-苯丙氨酸)将具有肿瘤杀伤效果的药物以及肿瘤靶向性的亲水基团氨基葡萄糖，在水溶液中自组装成纳米颗粒，然后以此结构为纳米骨架，形成可以负载聚集诱导发光材料的纳米颗粒。

PKM2是一种由PKM2基因编码的蛋白，是糖酵解丙酮酸激酶同工酶。PKM2在不同的组织器官中表达，如肺、脂肪组织、视网膜和胰岛，以及在所有大量核酸合成的细胞中表达，如正常激增的细胞、胚胎干细胞，尤其是肿瘤细胞。PKM2主要以二聚体形式存在于肿瘤细胞核内，在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移中起着关键作用。鉴于PKM2在肿瘤细胞中的特异性表达，以及其在维持肿瘤能量与合成原料供应平衡中的关键作用，以PKM2为靶点进行干预就成为一种十分理想的肿瘤治疗策略。如Hitosugi等用苯丙氨酸取代PKM2的105位的酪氨酸，这导致PKM2不能被磷酸化从而固定于高活性的四聚体构象，导致合成原料缺乏进而发挥抑制肿瘤生长的作用(参见Hitosugi T,Kang S,Heiden M V,et al.TyrosinePhosphorylation Inhibits PKM2 to Promote the Warburg Effect andTumor Growth[J].Science Signaling,2009,2(97):ra73.)。

综上所述，以PKM2为靶点并利用聚集诱导发光分子开发一种抗肿瘤药物，可实时监测肿瘤状态，诊疗一体化，为进一步设计治疗前列腺癌的化疗药物提供新的理念。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种多肽聚集体分子及其制备方法和应用，所述多肽聚集体分子能够促使二聚体的PKM2转化成四聚体的PKM2，阻止二聚体PKM2进入细胞核，实现了抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，且能够进行自组装，可根据聚集诱导发光分子实时监测肿瘤状态，实现了诊疗一体化。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种多肽聚集体分子，所述多肽聚集体分子包括丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分，所述丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分连接形成所述多肽聚集体分子。

本发明的多肽聚集体分子中，酶特异性水解部分被特异性酶水解后，暴露丝氨酸，丝氨酸可诱导PKM2的四聚化，从而阻止二聚体PKM2进入细胞核，抑制二聚体PKM2发挥作用，抑制STAT3通路，减少可作为生物合成前体的糖酵解中间产物，从而实现了抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移(如图1所示)，组装驱动部分能够使多肽聚集体分子进行自组装形成纳米纤维，具备在肿瘤部位长效滞留效果，且聚集诱导发光部分具有聚集荧光效应，从而可实现实时监测。

优选地，所述酶特异性水解部分包括O-link乙酰氨基糖。

本发明中O-link乙酰氨基糖可被OGA特异性酶水解。

优选地，所述O-link乙酰氨基糖包括乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基甘露糖或乙酰氨基岩藻糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为乙酰氨基葡萄糖。

优选地，所述组装驱动部分包括具有组装驱动功能的功能肽。

优选地，所述功能肽包括2～5个氨基酸。

优选地，所述功能肽包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：KLVFF。

SEQ ID NO.2：FF。

SEQ ID NO.3：KYY。

优选地，所述聚集诱导发光部分包括聚集诱导发光分子。

优选地，所述聚集诱导发光分子包括三苯胺、4-溴三苯胺或4,4'-二甲基三苯胺中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述多肽聚集体分子的结构包括式I或式II所示的结构式，其中式I所示分子激发波长为456nm，发射波长为634nm，式II所示分子的激发波长为436nm，发射波长为592nm。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽聚集体分子的制备方法，所述方法包括：

将所述酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分进行连接，得到所述多肽聚集体分子。

优选地，所述方法包括：

制备含有酶特异性水解部分和组装驱动部分的多肽，将所述多肽与聚集诱导发光分子进行连接，得到所述多肽聚集体分子。

优选地，所述多肽的制备方法包括多肽固相合成法。

优选地，通过Click反应将所述多肽与聚集诱导发光分子进行连接。

作为优选的技术方案，所述多肽聚集体分子的制备方法包括：

利用多肽固相合成法合成含有酶特异性水解部分和组装驱动部分的多肽，并通过Click反应将所述多肽与聚集诱导发光分子进行连接，得到所述多肽聚集体分子。

第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的多肽聚集体分子。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的多肽聚集体分子或第三方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质细胞瘤或黑色素瘤中的任意一种或至少两种的组合。

与现有述相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的多肽聚集体分子能够在肿瘤细胞内被特异性水解，暴露丝氨酸与二聚体的PKM2作用，促使其转化为四聚体的PKM2，从而实现了抑制肿瘤，此外，通过组装实现了聚集诱导的发光效应，从而可以实时监测肿瘤的进展和迁移，同时具备长效滞留效果；

(2)本发明的多肽聚集体分子能够高效杀伤前列腺癌细胞，且具备特异性，能够在肿瘤部位富集，滞留时间长，此外，还具备抑制前列腺癌细胞迁移的能力。

附图说明

图1为本发明的多肽聚集体分子的设计原理图；

图2为试验例1中多肽聚集体分子的浊度实验的紫外吸收测定结果图；

图3A为试验例1中多肽聚集体分子酶切前的形貌电镜图；

图3B为试验例1中多肽聚集体分子酶切后的形貌电镜图；

图4为试验例2中多肽聚集体分子组装后在细胞水平的特异性成像图；

图5为试验例2中多肽聚集体分子在细胞水平的滞留能力实验所测荧光强度量化图；

图6为试验例2中多肽聚集体分子在动物水平各器官的荧光成像图，其中T为肿瘤部位，H为心，Li为肝，Sp为脾，Lu为肺，K为肾；

图7为试验例2中的实验组分子的滞留能力实验图；

图8为试验例3中验证实验组分子对肿瘤细胞的杀伤能力的CCK-8实验图；

图9为试验例4中实验组分子对肿瘤的作用时间和肿瘤体积的关系图；

图10为试验例4中实验组抑制肿瘤的迁移能力的量化图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种多肽聚集体分子，所述多肽聚集体分子的结构如式I所示。

所述多肽聚集体分子的制备方法包括以下步骤：

(1)多肽的合成

合成含有酶特异性水解部分和组装驱动部分的多肽，所述多肽的分子式为S(GlcNAc)-KLVFF，其中GlcNAc为乙酰氨基葡萄糖，S为丝氨酸，K为赖氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸；

实验仪器与材料：二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，树脂，二氯甲烷(DCM)，茚三酮反应试剂(茚三酮，维C，苯酚)，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷TIS，无水乙醚，三氟乙酸(TFA)，N-甲基吗啉(NMM)，甲醇，上述各种氨基酸，乙酰氨基葡萄糖丝氨酸，叠氮乙酸和多肽固相合成管；

溶液配制：脱保护液体积百分比为：六氢吡啶:DMF＝1:4；反应液体积百分比为：NMM:DMF＝1:24；裂解液体积百分比为：TFA92.5％、TIS 2.5％和EDT 2.5％；茚三酮测试液：茚三酮、维C和苯酚各一滴；

具体操作方法：称量树脂并投入到多肽固相合成管(以下简称反应器)中，加入10mL DMF溶胀120分钟，抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，置于摇床10min，抽掉脱保护液，用DMF和DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂(5mg)于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测阳性(深蓝色)后，准备接入下一个氨基酸(按目标序列)，进入氨基酸缩合反应。按照“KLVFF”顺序分别取相应氨基酸、HBTU(氨基酸:HBTU＝1:1)，用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应，1小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测，结果为阴性(未变色)证明缩合反应成功，抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂，对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc脱保护-氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到组装驱动部分；

称取适量乙酰氨基葡萄糖丝氨酸以及HBTU，加入反应液，倒入上述反应器中，反应完毕后，取脱-Dde保护基的脱保护剂(水合肼/DMF＝2/98)10mL，倒入反应器中，反应15min，然后使用DMF、DCM各洗涤树脂3次，茚三酮法检测，结果为阴性，取适量叠氮乙酸和HBTU以及反应液倒入反应器中，反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂3次，甲醇洗2次，继续抽干15～20min，从反应器中取出合成完的肽树脂，在室温下于裂解液(裂解液先冰浴20min)中裂解两小时，将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水乙醚(冰浴)洗3次，粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90％，所得到的纯肽使用质谱(MS，electrospray)进行鉴定，得到所述多肽；

(2)Click反应连接AIE分子

实验仪器与材料：抗坏血酸钠，五水硫酸铜，DMSO，AIE分子和烧瓶；

具体操作方法：取步骤(1)合成的多肽，抗坏血酸钠(0.4eq)，五水硫酸铜(0.4eq)，式I中所示AIE分子(2eq)溶解于5mL DMSO中，通入氮气保护，过夜反应，反应完毕，透析并冻干，得到所述聚集体分子。

实施例2

本实施例提供一种多肽聚集体分子，所述多肽聚集体分子的结构如式II所示。

所述多肽聚集体分子的制备方法包括以下步骤：

(1)多肽的合成

该步同实施例1步骤(1)；

(2)Click反应连接三苯胺类AIE分子

实验仪器与材料：抗坏血酸钠，五水硫酸铜，DMSO，AIE分子，烧瓶等；

具体操作方法：取步骤(1)合成的多肽，抗坏血酸钠(0.4eq)，五水硫酸铜(0.4eq)，式II中所示三苯胺类AIE分子(2eq)溶解于5mL DMSO中，通入氮气保护，过夜反应，反应完毕，透析并冻干，得到所述聚集体分子。

试验例1多肽聚集体分子的酶切反应验证

利用紫外分光光度计通过浊度反应对上述实施例1中合成的多肽聚集体分子(命名为TM-SA)的酶切反应的溶液态进行验证，由图2可知，溶液吸光度明显增加，证明多肽能够在与酶共孵育后迅速发生反应，由图3A和图3B可知，未加入OGA酶前的多肽聚集体分子成颗粒状，加入OGA酶后多肽聚集体分子聚集成纤维状，表明多肽可有效被酶水解并组装成纳米纤维。

试验例2在细胞水平及动物水平特异性成像

实验所选细胞为PKM2高表达的前列腺癌细胞系PC-3，以人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)为对照组，使用实施例1制备的多肽聚集体分子分别对实验组及对照组细胞进行处理，在共聚焦显微镜下对细胞进行观察发现实验组的荧光强度高于对照组(图4)，且滞留时间显著长于对照组(图5)，随后，用前列腺癌细胞PC-3进行小鼠移植瘤的建立，取1x10⁶个细胞注射到小鼠右腿皮下，2周后肿瘤成型(n＝3)，用实施例1制备的多肽聚集体分子进行鼠尾静脉注射，随后在4小时将小鼠处死，取肿瘤组织及其它组织进行离体成像，结果表明多肽聚集体分子在肿瘤细胞内的荧光强度明显强于其他组织(图6)，如图7所示，本发明多肽聚集体分子(TM-SA)的滞留能力强，综上所述，本发明的多肽聚集体分子能够在肿瘤细胞上长效滞留以及特异性成像，为其发挥生物学功能提供了有利条件。

试验例3多肽聚集体分子能够对前列腺癌细胞特异杀伤

为了进一步验证多肽聚集体分子对前列腺癌细胞PC-3的抑制作用，将实验组(TM-SA)与细胞共培养，并进行Cell Counting Kit-8(CCK-8)的细胞活性分析，共做4个副孔，结果如图8所示，本发明的多肽聚集体分子的半数致死浓度(IC₅₀)为45.4μM，对肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，表明本发明多肽聚集体分子能够对前列腺癌细胞特异性杀伤。

试验例4多肽聚集体分子组装后可显著抑制前列癌的转移

按照试验例所述方法构建小鼠肿瘤模型，分别使用PBS溶液(空白组)、实施例1制备的多肽聚集体分子(实验组)进行给药，观察肿瘤生长情况，由图9可知，实施例1制备的多肽聚集体分子能够使肿瘤生长速度明显减缓，且与其他组对比有统计学意义，此外，对实验组和空白组抑制肿瘤的转移能力进行检测，如图10所示，实验组小鼠的转移灶数量较低，说明实验组即本发明多肽聚集体分子对前列腺癌转移的抑制能力明显，表明本发明多肽聚集体分子能够高效抑制前列腺癌细胞的转移，提高对前列腺癌细胞的治疗效果。

综上所述，本发明提供的多肽聚集体分子能够被OGA酶特异性水解，促使二聚体PKM2变成四聚体，高效抑制肿瘤细胞，并驱动自组装成纤维，具有长效滞留效果，同时具备实时监测功能，可特异性杀伤前列腺癌细胞，并抑制其转移。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家纳米科学中心

<120> 一种多肽聚集体分子及其制备方法和应用

<130> 20210409

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Leu Val Phe Phe

1 5

<210> 2

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Phe Phe

1

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Tyr Tyr

1

Claims (9)

1.一种多肽聚集体分子，其特征在于，所述多肽聚集体分子包括丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分；

所述丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分连接形成所述多肽聚集体分子；

所述酶特异性水解部分为乙酰氨基葡萄糖；

所述组装驱动部分为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

所述聚集诱导发光部分为三苯胺或4,4'-二甲基三苯胺；

所述多肽聚集体分子的结构为式I或式II所示的结构式；

2.一种如权利要求1所述的多肽聚集体分子的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将所述丝氨酸、酶特异性水解部分、组装驱动部分和聚集诱导发光部分进行连接，得到所述多肽聚集体分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

制备含有丝氨酸、酶特异性水解部分和组装驱动部分的多肽，将所述多肽与聚集诱导发光分子进行连接，得到所述多肽聚集体分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多肽的制备方法包括多肽固相合成法。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过Click反应将所述多肽与聚集诱导发光分子进行连接。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用多肽固相合成法合成含有丝氨酸、酶特异性水解部分和组装驱动部分的多肽，并通过Click反应将所述多肽与聚集诱导发光分子进行连接，得到所述多肽聚集体分子。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的多肽聚集体分子。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

9.如权利要求1所述的多肽聚集体分子或权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；

所述肿瘤为前列腺癌。

Images