CN111718395B - 一种前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种前药激活化合物，其特征在于，所述前药激活化合物包括多肽片段，以及通过化学键连接在所述多肽片段上的四嗪基团和疏水基团；所述多肽片段的氨基酸中至少有一个磷酸化的酪氨酸。本发明提供的前药激活化合物具有靶向性和专一性，能够在肿瘤细胞内快速高效地累积并原位自组装形成纳米组装体，进而高效特异性地激活反式环辛烯改性的抗肿瘤前药；本发明的前药激活化合物及前药体系生物相容性好，无系统毒性。所述前药激活化合物的制备方法中采用固相合成法，操作简单，得到的产物化学纯度高，总产率高。

Description

一种前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学医药技术领域，具体涉及一种前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用。
背景技术
在肿瘤治疗中，小分子化疗药物在使用时常伴随着严重的药物副作用(AdverseDrug Reactions，ADR)，这是因为小分子药物缺乏对肿瘤细胞的选择识别性，往往对肿瘤周围正常组织、甚至其他器官造成毒副作用，极大地限制了给药剂量，从而可能导致化疗失败。前药(前体药物，pro-drug)是目前缓解化疗药物副作用的重要方法，其设计思路是通过化学修饰或物理包载的方法将母体药物转化为药物活性钝化的化合物；前药在进入体内指定区域后，被该区域的微环境差异(如过度表达的酶、氧化物或还原物等)或外源性刺激(如光、磁或超声等)所激活，原位释放出活性药物，发挥治疗作用。
CN 108395460A公开了一种乏氧激活阿霉素前药及其制备方法，通过在阿霉素3'位的氨基上修饰具有乏氧激活效应的偶氮键和自咬合结构的响应功能基团，合成了阿霉素前药，该药物能够有效实现乏氧环境下的选择性激活，并通过调节常氧和乏氧环境中阿霉素的亚细胞器分布实现抑制肿瘤细胞生长活性的调控，进而降低药物对正常细胞的毒副作用并提高对肿瘤治疗的靶向效率。CN 102940651A公开了一种利用肿瘤靶向性细菌激活前药的方法，该方法以肿瘤靶向性细菌作为一种天然的前药激活工具实现对前药的激活。所述肿瘤靶向性细菌能够组成型地表达内源性的前药激活酶基因，不经过任何基因改造或外源基因的过表达。Santra等报道了一种叶酸修饰的抗肿瘤前药，所述抗癌前药中靶向分子叶酸与抗肿瘤药物阿霉素以二硫键共价连接；由于肿瘤组织中谷胱甘肽过量表达，而且肿瘤细胞表面较正常细胞而言具有更多的维生素类受体，因此抗癌前药可以在肿瘤组织中富集；肿瘤组织中过量的谷胱甘肽与前药中的二硫键发生还原反应，使前药中的活性药物分子阿霉素释放(Santra Santimukul,et al.Journal of the American ChemicalSociety.2011,133(41),16680)。Moses Bio等利用光裂解反应设计并合成了一类诊断治疗型前药，所述前药由五部分组成：光敏剂、靶向叶酸官能团、单线态氧可断裂的氨基丙烯酸酯、亲水PEG链段和抗癌母药，在605nm的红外光照射下，前药中的光敏剂产生单线氧使氨基丙烯酸酯键断裂，从而释放出抗癌母药(Moses Bio,et al.Journal of MedicinalChemistry,2013,56(10),3936)。
然而在现有技术中，传统的肿瘤靶向主要包括依靠抗体蛋白的主动靶向肿瘤策略和依靠纳米载体的被动靶向递送策略，抗体蛋白的主动靶向虽然具有良好的靶向性，但依然面临抗体装载药物效率低、肿瘤抗原表达差异性、抗体内吞难度大等困难，导致药物靶向效率低；依靠纳米载体的被动靶向则面临着递送效率低的问题。而且目前开发的前药都是在内源性激活或外源性刺激的条件下实现母体药物的释放和激活，其中过度表达酶、氧化物、还原物等内源性激活条件同样存在于正常细胞中，导致前药可能在非病灶部位释放药物，从而减弱治疗效果、造成毒副作用；而光、磁场、超声等外源性刺激不仅操作繁复、费用昂贵，而且不可避免地对正常组织造成伤害。
因此，开发一种反应活性高、对病灶部位具有高度靶向性和专一性、反应底物及产生的副产物不会对机体造成损伤的新型前药体系，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种前药激活化合物，所述前药激活化合物包括多肽片段，以及通过化学键连接在所述多肽片段上的四嗪基团和疏水基团；所述多肽片段的氨基酸中至少有一个磷酸化的酪氨酸。
示例性的，构成所述多肽片段的氨基酸中含有1个磷酸化的酪氨酸、2个磷酸化的酪氨酸、3个磷酸化的酪氨酸、4个磷酸化的酪氨酸或更多个磷酸化的酪氨酸。
本发明提供的前药激活化合物的结构可以分为多肽片段、疏水基团和四嗪基团三个明确的功能单元。其中多肽片段中的磷酸化酪氨酸是磷酸酶响应单元，肿瘤细胞中存在过表达的磷酸酶能将多肽片段中磷酸化酪氨酸去磷酸化，而正常细胞中没有过表达的磷酸酶，因此前药激活化合物赖于多肽片段中磷酸化的酪氨酸实现对肿瘤细胞的靶向；前药激活化合物到达肿瘤细胞后，化合物中的疏水基团基于π-π相互作用发生聚集，进而在肿瘤细胞中原位自组装形成纳米组装体，实现了前药激活化合物以及其中四嗪基团在肿瘤细胞中的特异性富集；而反式环辛烯改性的抗癌小分子前药在四嗪基团存在时，会发生逆电子需求D-A反应(逆狄尔斯-阿尔德反应)，反式环辛烯基团内发生化学键的重排断裂，释放出前药中具有药物活性的母药，实现前药激活。
本发明所述前药激活化合物的设计是基于识别肿瘤区别于正常组织的特有信号实现靶向，在肿瘤细胞中过表达磷酸酶的存在下诱导前药激活化合物发生非共价作用的超分子组装，形成纳米组装体结构，进而在四嗪基团的催化下激活前药分子；本发明中前药激活化合物激活前药的机理是四嗪基团催化反式环辛烯基团的生物正交反应，具有简单、高效和专一性高的特点，因此，本发明提供的多肽四嗪类前药激活化合物生物相容性好、免疫原性低，毒副作用低。
优选地，所述多肽片段的氨基酸数目为3～6个，例如4个或5个；
优选地，所述氨基酸中至少有一个含有2个-NH2的氨基酸，例如至少1个赖氨酸或精氨酸；
优选地，所述氨基酸中至少有一个含有芳基的氨基酸，例如至少1个苯丙氨酸或色氨酸；
优选地，所述氨基酸选自赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述多肽片段的氨基酸为磷酸化的酪氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸。
本发明所述的多肽片段中至少含有三个氨基酸，其一是磷酸化的酪氨酸，其二是含有2个-NH2的氨基酸，其三是含有芳基的氨基酸，多肽片段中的氨基酸序列可根据实际情况进行调整。含有2个-NH2的氨基酸，以赖氨酸为例，手性碳上的-NH2参与了与其他氨基酸之间的缩合反应而形成肽键，侧链上的-NH2作为后续四嗪基团的连接单元；含有芳基的氨基酸，以苯丙氨酸为例，其中的芳香基与前药激活化合物中的疏水基团共同作为π-π作用单元，用于构建前药激活化合物在肿瘤细胞上的纳米组装体；此外，多肽片段中的氢键作用也是前药激活纳米组装体的组装驱动力。
优选地，通过四嗪衍生物与所述多肽片段形成酰胺键在多肽片段上引入四嗪基团；
优选地，所述四嗪衍生物中含有羧基；
优选地，所述四嗪衍生物为具有如式I或式II所示结构的化合物：
Figure BDA0002002746220000051
优选地，所述疏水基团为取代或未取代的芳香基团；
优选地，所述取代或未取代的芳香基团为取代或未取代的萘基、取代或未取代的菲基、取代或未取代的蒽基或取代或未取代的芘基；
优选地，通过芳香族化合物与多肽片段形成酰胺键而在多肽片段上引入疏水基团；
优选地，所述芳香族化合物为C9～C30芳香族化合物，例如C10、C11、C12、C14、C15、C16、C18、C20、C23、C25、C28或C30的芳香族化合物；
优选地，所述芳香族化合物为含有羧基的芳香族化合物；
优选地，所述芳香族化合物为2-萘乙酸、2-蒽-9-乙酸或1-芘乙酸；
优选地，所述前药激活化合物为具有如式III、式IV或式V所示结构化合物中的任意一种或至少两种的组合：
Figure BDA0002002746220000052
Figure BDA0002002746220000061
另一方面，本发明提供一种如上所述的前药激活化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用固相合成法，在载体树脂上，以末端氨基和侧链氨基均被保护的氨基酸为原料，依次缩合，反应得到多肽片段；
(2)将芳香族化合物连接到步骤(1)得到的多肽片段上，得到带有疏水基团的多肽片段；
(3)将步骤(2)得到的带有疏水基团的多肽片段上的载体树脂和侧链氨基保护基通过反应脱除；分离纯化，得到多肽产物；
(4)将步骤(3)得到的多肽产物与活化的四嗪衍生物进行反应，在多肽产物上引入四嗪基团，得到所述前药激活化合物。
优选地，步骤(1)所述末端氨基的保护基为Fmoc保护基；
优选地，步骤(1)所述侧链氨基的保护基为Boc保护基；
优选地，步骤(1)所述载体树脂为羧基树脂或2-氯-三苯甲基氯树脂；
优选地，步骤(1)所述依次缩合的方法包括以下步骤：
(a)将载体树脂进行溶胀；
(b)按照多肽片段的氨基酸顺序，将第一个氨基酸与载体树脂混合，使第一个氨基酸和载体树脂发生偶联反应并连接；脱去第一个氨基酸上的末端氨基保护基；
(c)将第二个氨基酸与第一个氨基酸进行偶联反应并连接；直至完成多肽片段中所有氨基酸的缩合；
(d)脱去最后一个氨基酸的末端氨基保护基，得到所述多肽片段；
优选地，步骤(a)所述溶胀使用的试剂为二氯甲烷；
优选地，所述偶联反应使用的偶联剂为N,N-二异丙基乙胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液；
优选地，所述偶联反应的时间为1.5～3小时，例如1.6小时、1.8小时、2小时、2.1小时、2.3小时、2.5小时、2.8小时或3小时；
优选地，所述偶联反应的温度为20～30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或30℃；
优选地，所述偶联反应完成后对反应产物进行清洗；
优选地，所述清洗使用的试剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二氯甲烷；
优选地，所述脱去末端氨基保护基所用的脱保护剂为哌啶和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液；
优选地，所述哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4；
优选地，所述脱去末端氨基保护基的持续时间为20～40min，例如20min、22min、25min、30min、32min、35min、36min、38min或40min；
优选地，所述脱去末端氨基保护基的温度为20～30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或30℃；
优选地，所述脱去末端氨基保护基完成后对反应产物进行清洗；
优选地，所述清洗使用的试剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二氯甲烷；
优选地，步骤(2)所述将芳香族化合物连接到步骤(1)得到的多肽片段上的方法为：将芳香族化合物的羧基端与多肽片段最后一个氨基酸进行偶联反应并连接；步骤(2)所述偶联反应使用的偶联剂、偶联反应的时间及温度与步骤(1)中的相同，得到产物的清洗过程与步骤(1)中氨基酸缩合后的清洗过程条件相同。
优选地，步骤(3)所述反应脱除的脱除剂为三氟乙酸；在三氟乙酸的作用下载体树脂和侧链氨基保护基均可脱除，得到连接疏水基团的多肽片段；
优选地，步骤(3)所述反应脱除的时间为1.5～3小时，例如1.6小时、1.8小时、2小时、2.1小时、2.3小时、2.5小时、2.8小时或3小时；
优选地，步骤(3)所述反应脱除的温度为20～30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或30℃；
优选地，步骤(3)所述分离纯化的方法为：向所述滤液中加入冰乙醚，过滤并清洗沉淀；
优选地，所述冰乙醚的加入方式为逐滴加入；
优选地，步骤(4)所述反应在有机碱存在下进行；
优选地，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺；
优选地，步骤(4)所述反应的时间为12～24小时，例如13小时、14小时、15小时、17小时、19小时、20小时、21小时或23小时；
优选地，步骤(4)所述反应的温度为20～30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或30℃；
优选地，步骤(4)所述活化的四嗪衍生物通过活化剂对四嗪衍生物进行活化得到；
优选地，所述活化剂为N-羟基丁二酰亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺；
优选地，所述步骤(1)～步骤(4)在保护性气体存在下进行；所述保护性气体优选为氮气。
另一方面，本发明提供一种如上所述前药激活化合物作为抗肿瘤前药激活剂的应用。
另一方面，本发明提供一种前药体系，所述前药体系包括如上所述的前药激活化合物和抗肿瘤前药分子。
优选地，所述抗肿瘤前药分子为反式环辛烯改性的母药分子；
优选地，所述母药分子选自紫杉醇、阿霉素、顺铂或喜树碱中的任意一种或至少两种的组合。
本发明所述反式环辛烯改性的母药分子的制备方法参考现有技术进行，例如参考Versteegen Ron M.,et al.Click to Release:Instantaneous DoxorubicinElimination upon Tetrazine Ligation[J].Angewandte Chemie,2013,52,14112。
另一方面，本发明提供一种如上所述的前药体系在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的前药激活化合物具有靶向性和专一性，能够在肿瘤细胞内快速高效地累积并原位自组装形成纳米组装体，进而高效特异性地激活反式环辛烯改性的抗肿瘤前药；本发明的前药激活化合物及前药体系生物相容性好，无系统毒性。所述前药激活化合物的制备方法中采用固相合成法，操作简单，得到的产物化学纯度高，总产率高。
附图说明
图1为本发明实施例4所述前药激活化合物在HeLa和HUVECs细胞中的累计性能测试图；
图2为本发明实施例5所述前药激活化合物对前药的激活性能统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例中制备一种结构如式III所示的前药激活化合物，
Figure BDA0002002746220000101
其中多肽片段为磷酸化的酪氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸缩合形成，疏水基团由2-萘乙酸和多肽片段中的氨基形成酰胺键得到，四嗪基团由2-[4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)]苯基乙酸和多肽片段中的氨基形成酰胺键得到。
具体制备方法包括以下步骤：
(1)在固相合成管中，将2-氯-三苯甲基氯树脂在二氯甲烷中溶胀30min；采用末端氨基由Fmoc保护的磷酸化的酪氨酸、苯丙氨酸和末端氨基和侧链氨基分别由Fmoc和Boc保护的赖氨酸为原料，按照赖氨酸-苯丙氨酸-磷酸化酪氨酸的氨基酸顺序，先将1.3g Fmoc和Boc保护的赖氨酸与992μL N,N-二异丙基乙胺溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，再与载体树脂混合，通氮气，在25℃下偶联反应2h并连接；过滤清洗后与甲醇、N,N-二异丙基乙胺与二氯甲烷体积比为15:5:80的混合溶液反应30min，过滤并用N,N-二甲基甲酰胺清洗；用哌啶溶液脱去赖氨酸上的Fmoc保护基；再与第二个氨基酸即Fmoc保护的苯丙氨酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺混合进行偶联反应，直到完成所有氨基酸的缩合，脱去最后一个氨基酸磷酸化酪氨酸的Fmoc保护基，得到多肽片段；
(2)将0.56g 2-萘乙酸、1.14g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和992μL N,N-二异丙基乙胺溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后与步骤(1)得到的多肽片段混合，通氮气，在25℃下偶联反应2h，使多肽片段与疏水基团连接；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入5mL三氟乙酸加入载体树脂，通氮气，在25℃下反应2h，脱除载体树脂和Boc保护基；过滤，向滤液中逐滴加入30mL冰乙醚，过滤，得到白色固体产物；
(4)将400mg步骤(3)得到的产物与160mg活化的四嗪衍生物溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入129μL N,N-二异丙基乙胺，通氮气，在25℃下反应24h，得到粗制的前药激活化合物；将粗制的前药激活化合物用半制备HPLC进行提纯得到精制产品，产率为86.7％。
分别用1H-NMR及电喷雾-质谱法(ESI-MS)对制得的前药激活化合物进行表征，结果如下：
1H-NMR表征结果为：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.40-8.38(d,2H),8.25-8.23(d,1H),8.21-8.19(d,1H),8.09(m,1H),7.94-7.92(d,1H),7.85-7.79(m,5H),7.72(s,1H),7.54-7.51(d,2H),7.47-7.38(m,2H),7.27-7.00(m,12H),4.52-4.41(m,2H),4.24-4.18(m,1H),3.66-3.55(q,2H),3.52(s,2H),3.05-2.71(m,9H),1.58-1.18(m,6H)。
ESI-MS表征结果为：C56H58N9O11P，1064.11(m/z)；[M-H+]-，1063.32(m/z)。
由以上核磁共振氢谱以及ESI-MS分析可知，成功制得结构如式III所示的前药激活化合物。
实施例2
本实施例中制备一种结构如式IV所示的前药激活化合物，
Figure BDA0002002746220000121
其中多肽片段为磷酸化的酪氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸缩合形成，疏水基团由2-萘乙酸和多肽片段中的氨基形成酰胺键得到，四嗪基团由2-[4-(6-乙醇基-1,2,4,5-四嗪-3-基)]苯基乙酸和多肽片段中的氨基形成酰胺键得到。
具体制备方法包括以下步骤：
(1)在固相合成管中，将2-氯-三苯甲基氯树脂在二氯甲烷中溶胀30min；采用末端氨基由Fmoc保护的磷酸化的酪氨酸、苯丙氨酸和末端氨基和侧链氨基分别由Fmoc和Boc保护的赖氨酸为原料，按照赖氨酸-磷酸化酪氨酸-苯丙氨酸的氨基酸顺序，先将1.3g Fmoc和Boc保护的赖氨酸与992μL N,N-二异丙基乙胺溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，再与载体树脂混合，通氮气，在25℃下偶联反应2h并连接；过滤清洗后与甲醇、N,N-二异丙基乙胺与二氯甲烷体积比为15:5:80的混合溶液反应30min，过滤并用N,N-二甲基甲酰胺清洗；用哌啶溶液脱去赖氨酸上的Fmoc保护基；再与第二个氨基酸即Fmoc保护的磷酸化酪氨酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺混合进行偶联反应，直到完成所有氨基酸的缩合，脱去最后一个氨基酸苯丙氨酸的Fmoc保护基，得到多肽片段；
(2)将0.56g 2-萘乙酸、1.14g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和992μL N,N-二异丙基乙胺溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后与步骤(1)得到的多肽片段混合，通氮气，在25℃下偶联反应2h，使多肽片段与疏水基团连接；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入5mL三氟乙酸加入载体树脂，通氮气，在25℃下反应2h，脱除载体树脂和Boc保护基；过滤，向滤液中逐滴加入30mL冰乙醚，过滤，得到白色固体产物；
(4)将400mg步骤(3)得到的产物与180mg活化的四嗪衍生物溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入129μL N,N-二异丙基乙胺，通氮气，在25℃下反应24h，得到粗制的前药激活化合物；将粗制的前药激活化合物用半制备HPLC进行提纯得到精制产品，产率为85.3％。
采用电喷雾-质谱法(ESI-MS)对制得的前药激活化合物进行表征，表征结果为：C56H58N9O11P，1064.11(m/z)；[M-H+]-，1063.35(m/z)。可知成功制得结构如式IV所示的前药激活化合物。
实施例3
本实施例中制备一种结构如式V所示的前药激活化合物，
Figure BDA0002002746220000141
其中多肽片段为磷酸化的酪氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸缩合形成，疏水基团由芘乙酸和多肽片段中的氨基形成酰胺键得到，四嗪基团由2-[4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)]苯基乙酸和多肽片段中的氨基形成酰胺键得到。
具体制备方法包括以下步骤：
(1)在固相合成管中，将2-氯-三苯甲基氯树脂在二氯甲烷中溶胀30min；采用末端氨基由Fmoc保护的苯丙氨酸、磷酸化的酪氨酸和末端氨基和侧链氨基分别由Fmoc和Boc保护的赖氨酸为原料，按照苯丙氨酸-磷酸化酪氨酸-赖氨酸的氨基酸顺序，先将2.5g Fmoc保护的苯丙氨酸与992μL N,N-二异丙基乙胺溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，再与载体树脂混合，通氮气，在25℃下偶联反应2h并连接；过滤清洗后与甲醇、N,N-二异丙基乙胺与二氯甲烷体积比为15:5:80的混合溶液反应30min，过滤并用N,N-二甲基甲酰胺清洗；用哌啶溶液脱去赖氨酸上的Fmoc保护基；再与第二个氨基酸即Fmoc保护的磷酸化酪氨酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺混合进行偶联反应，直到完成所有氨基酸的缩合，脱去最后一个氨基酸赖氨酸的Fmoc保护基，得到多肽片段；
(2)将1.2g芘乙酸、1.14g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和992μLN,N-二异丙基乙胺溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后与步骤(1)得到的多肽片段混合，通氮气，在25℃下偶联反应2h，使多肽片段与疏水基团连接；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入5mL三氟乙酸加入载体树脂，通氮气，在25℃下反应2h，脱除载体树脂和Boc保护基；过滤，向滤液中逐滴加入30mL冰乙醚，过滤，得到白色固体产物；
(4)将400mg步骤(3)得到的产物与160mg活化的四嗪衍生物溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入129μL N,N-二异丙基乙胺，通氮气，在25℃下反应24h，得到粗制的前药激活化合物；将粗制的前药激活化合物用半制备HPLC进行提纯得到精制产品，产率为89.3％。
采用电喷雾-质谱法(ESI-MS)对制得的前药激活化合物进行表征，结果为：C53H51N8O10P，990.35(m/z)；[M-H+]-，989.21(m/z)。分析可知，成功制得结构如式V所示的前药激活化合物。
实施例4
本实施例测试了实施例1制备的前药激活化合物在宫颈癌细胞HeLa和正常细胞HUVECs细胞中的累积性能，具体方法包括以下步骤：
(1)配制实施例1制备的前药激活化合物浓度为500μM的DMEM培养基；
(2)以HeLa和HUVECs为模型细胞，在接种有2×105个细胞的96孔板中，分别加入100μL步骤(1)配制的培养基，并在37℃、5％CO2的条件下孵育；
(3)分别在孵育1h、2h、4h、6h、12h和24h时，移除培养基，PBS清洗3遍，然后加入含有100μL 50μM TCO-CMR的DMEM培养基继续孵育24h；
(4)用酶标仪检测被释放的香豆素的荧光强度，根据香豆素荧光强度-浓度的标准曲线计算每个细胞内累积前药激活化合物的量，然后以步骤(3)中的培养时间为横坐标、细胞内累积的前药激活化合物的量为纵坐标作图，得到前药激活化合物在HeLa和HUVECs细胞中的累计性能测试图，如图1所示，从图中可以看出：前药激活化合物在HeLa细胞中的累积量显著地大于在HUVECs细胞中的累积量，表明本发明所述前药激活化合物对肿瘤细胞具有优异的靶向性。
采用本实施例提供的前药激活化合物在细胞中累积性能的测试方法分别对实施例2与实施例3制备的前药激活化合物进行测试，结果表明实施例2与实施例3制备的前药激活化合物均对肿瘤细胞具有优异的靶向性。
实施例5
本实施例测试实施例1制备的前药激活化合物用于激活反式环辛烯改性的紫杉醇前药(TCOdax-PTX)的激活性能，具体方法包括以下步骤：
(1)配制实施例1制备的前药激活化合物浓度为500μM的DMEM培养基；
(2)制备实验组：取HeLa细胞作为模型细胞，按每孔约5000个细胞的密度接种在96孔板中；预先加入100μL步骤(1)配制的培养基，并在37℃、5％CO2的条件下孵育6h，然后用PBS清洗，再加入200μL不同浓度的TCOdax-PTX，继续在37℃以及5％CO2的条件下孵育72h；
(3)制备2组对照组：对照组1为向DMEM培养基中加入TCOdax-PTX，对照组2为向DMEM培养基中加入紫杉醇；将对照组1和对照组2置于37℃、5％CO2的条件下孵育72h；
(4)用MTT法检测步骤(2)制备的实验组以及步骤(3)制备的2组对照组的细胞毒性，得到前药激活化合物对前药的激活性能统计图，如图2所示。
由图2可以看出：紫杉醇原药具有较大的细胞毒性，其半最大效应浓度(EC50)为0.0111μM；而反式环辛烯修饰的紫杉醇前药TCOdax-PTX的EC50为0.347μM，相比紫杉醇原药毒性降低31.2倍；而在实施例1制备的前药激活化合物存在的条件下，反式环辛烯修饰的紫杉醇前药TCOdax-PTX被有效激活，被激活的前药又恢复了药物对细胞的毒性(EC50为0.0111μM)。这表明该本发明提供的前药激活化合物能够有效激活反式环辛烯改性的紫杉醇前药。
采用本实施例提供的前药激活化合物用于激活反式环辛烯改性的紫杉醇前药(TCOdax-PTX)的激活性能测试方法，分别对实施例2与实施例3制备的前药激活化合物进行测试，结果表明实施例2与实施例3制备的前药激活化合物能够有效激活反式环辛烯改性的紫杉醇前药。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (38)

1.一种前药激活化合物，其特征在于，所述前药激活化合物包括多肽片段，以及通过化学键连接在所述多肽片段上的四嗪基团和疏水基团；所述多肽片段的氨基酸中至少有一个磷酸化的酪氨酸；
通过四嗪衍生物与所述多肽片段形成酰胺键在多肽片段上引入四嗪基团；
所述四嗪衍生物为如式I或式II所示结构的化合物：
Figure FDA0003466141600000011
通过芳香族化合物与多肽片段形成酰胺键而在多肽片段上引入疏水基团；
所述疏水基团为萘基或芘基；
所述多肽片段的氨基酸包括赖氨酸、苯丙氨酸和磷酸化的酪氨酸；
所述多肽片段的氨基酸数目为3～4个。
2.根据权利要求1所述的前药激活化合物，其特征在于，所述四嗪衍生物中含有羧基。
3.根据权利要求1所述的前药激活化合物，其特征在于，所述芳香族化合物为2-萘乙酸或1-芘乙酸。
4.根据权利要求1所述的前药激活化合物，其特征在于，所述前药激活化合物为如式III、式IV或式V所示结构化合物中的任意一种或至少两种的组合：
Figure FDA0003466141600000021
5.一种如权利要求1～4任一项所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用固相合成法，在载体树脂上，以末端氨基和侧链氨基均被保护的氨基酸为原料，依次缩合，反应得到多肽片段；
(2)将芳香族化合物连接到步骤(1)得到的多肽片段上，得到带有疏水基团的多肽片段；
(3)将步骤(2)得到的带有疏水基团的多肽片段上的载体树脂和侧链氨基保护基通过反应脱除；分离纯化，得到多肽产物；
(4)将步骤(3)得到的多肽产物与活化的四嗪衍生物进行反应，在多肽产物上引入四嗪基团，得到所述前药激活化合物。
6.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述末端氨基的保护基为Fmoc保护基。
7.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述侧链氨基的保护基为Boc保护基。
8.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述载体树脂为羧基树脂或2-氯-三苯甲基氯树脂。
9.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述依次缩合的方法包括以下步骤：
(a)将载体树脂进行溶胀；
(b)按照多肽片段的氨基酸顺序，将第一个氨基酸与载体树脂混合，使第一个氨基酸和载体树脂发生偶联反应并连接；脱去第一个氨基酸上的末端氨基保护基；
(c)将第二个氨基酸与第一个氨基酸进行偶联反应并连接；直至完成多肽片段中所有氨基酸的缩合；
(d)脱去最后一个氨基酸的末端氨基保护基，得到所述多肽片段。
10.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述溶胀使用的试剂为二氯甲烷。
11.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述偶联反应使用的偶联剂为N,N-二异丙基乙胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液。
12.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的时间为1.5～3小时。
13.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为20～30℃。
14.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述偶联反应完成后对反应产物进行清洗。
15.根据权利要求14所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述清洗使用的试剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二氯甲烷。
16.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述脱去末端氨基保护基所用的脱保护剂为哌啶和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液。
17.根据权利要求16所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4。
18.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述脱去末端氨基保护基的持续时间为20～40min。
19.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述脱去末端氨基保护基的温度为20～30℃。
20.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述脱去末端氨基保护基完成后对反应产物进行清洗。
21.根据权利要求20所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述清洗使用的试剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二氯甲烷。
22.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述将芳香族化合物连接到步骤(1)得到的多肽片段上的方法为：将芳香族化合物的羧基端与多肽片段最后一个氨基酸进行偶联反应并连接。
23.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应脱除的脱除剂为三氟乙酸。
24.根据权利要求9所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应脱除的时间为1.5～3小时。
25.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应脱除的温度为20～30℃。
26.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述分离纯化的方法为：过滤，向得到的滤液中加入冰乙醚，过滤并清洗沉淀。
27.根据权利要求26所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述冰乙醚的加入方式为逐滴加入。
28.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述反应在有机碱存在下进行。
29.根据权利要求28所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺。
30.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述反应的时间为12～24小时。
31.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述反应的温度为20～30℃。
32.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述活化的四嗪衍生物通过活化剂对四嗪衍生物进行活化得到。
33.根据权利要求32所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述活化剂为N-羟基丁二酰亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺。
34.根据权利要求5所述的前药激活化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)～步骤(4)在保护性气体存在下进行；所述保护性气体为氮气。
35.一种如权利要求1～4任一项所述前药激活化合物在制备反式环辛烯改性的抗肿瘤前药激活剂中的应用。
36.一种前药体系，其特征在于，所述前药体系包括如权利要求1～4任一项所述的前药激活化合物和抗肿瘤前药分子，所述抗肿瘤前药分子为反式环辛烯改性的母药分子。
37.根据权利要求36所述的前药体系，其特征在于，所述母药分子选自紫杉醇、阿霉素、顺铂或喜树碱中的任意一种或至少两种的组合。
38.一种如权利要求36或37所述的前药体系在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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