CN117679529B

CN117679529B - 核酸适配体-多价药物偶联物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN117679529B
Application number: CN202410127088.7A
Authority: CN
Inventors: 鲁军; 杨济瑞; 左艺; 曹秀君; 王川奇; 曹悦宁; 凌杰
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2024-01-30
Filing date: 2024-01-30
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2044-01-30
Also published as: CN117679529A

Abstract

本发明涉及一种核酸适配体‑多价药物偶联物及其制备方法与应用，其通过具有特定结构的连接子，实现单个核酸适配体载多个药物、多重载药的效果，通过肿瘤微环境响应型连接键减少药物对正常组织的毒性，同时可自组装形成均一的纳米颗粒，在提高小分子毒性药物的水溶性和生物相容性的同时，实现药物的主被动双靶向肿瘤细胞。

Description

核酸适配体-多价药物偶联物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药化工领域，具体涉及核酸适配体-多价药物偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

癌症严重威胁着人类的健康和生命，已成为死亡的主要原因。癌症治疗主要包括传统的手术治疗、放射治疗、药物治疗和近年来发展迅速的靶向治疗、免疫治疗等新型治疗方式。临床上应用的抗肿瘤药物种类繁多，但随着美国国家癌症研究所（NCI）植物筛选计划的展开和我国得天独厚的中医药背景，天然抗肿瘤药物已成为国内外研究的热点，先后共有13类天然小分子药物及其衍生物在不同国家获批上市，而且至今为临床上常用的化疗药物。天然抗肿瘤药物作为常用的药物形式，却由于其水溶性差，选择性差，生物利用度低等问题造成的严重毒副作用，如喜树碱、紫杉醇、水仙碱、鬼臼毒素等。

核酸适配体是一类具有特定三维构象的高水溶性RNA或单链DNA，其长度一般为20-80个碱基，可特异性结合目标蛋白、多肽等生物大分子，主要包括：DNA、RNA、修饰的DNA以及修饰的RNA。适配体较抗体具有水溶性好；结构稳定；筛选过程简单，周期短；相对分子质量小，具有快速的血浆清除率、强大的组织穿透力、免疫原性低、变性可逆等；易于合成修饰，实现多层面调控等优点。核酸适配体可与药物直接结合形成靶向药物传递体系，也可作为靶向基团修饰到药物载体表面，从而实现药物的靶向传递，为提高药物的临床疗效，降低毒副作用提供了一种可行的方法。

然而，现有技术中的核酸适配体-药物偶联物均为单价药物配体与受体结合的模式，而细胞表面受体蛋白总数是有限的，故目前的核酸适配体-药物偶联物效果仍然有限。

发明内容

针对以上技术现状，本发明的目的在于克服现有技术中所存在的适配体偶联物中载药量低，在体内肿瘤环境下释放量不足，进而造成血药浓度低导致的肿瘤抑制效果差的弊端，提供一种偶联多价药物的适配体偶联物。通过将小分子毒性药物与能够负载多分子药物的连接键连接，一方面将核酸适配体与多价药物偶联形成自组装聚合物前药，一方面达到多重载药的目的，例如载2分子、3分子、4分子甚至更多药物，从而实现小分子毒性药物抗肿瘤活性成倍的增加。另一方面，考虑到肿瘤微环境的特征主要包括整体缺氧、pH值低、高GSH、存在过表达的酶等，进一步在设计负载药物连接键时引入肿瘤微环境敏感基团，形成肿瘤微环境响应型连接键，以实现药物在肿瘤组织的智能释放。在上述构思基础上，确保偶联物在肿瘤部位释放原药，极大程度的降低药物毒性，并最大程度发挥高效低毒的抗肿瘤作用。为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

作为本发明的第一方面，本发明提供一种核酸适配体-多价药物偶联物，所述核酸适配体-多价药物偶联物具有如式（I）所示的结构：

A-R-B-C （I）

式（I）中，R为多价连接子，具有如式（II）或式（III）所示的结构：

（II）

（III）

其中，X为各自独立的N或C；

A为核酸适配体；

C为小分子毒性药物；

B为以下结构中的任意一种：-CO-(CH₂)n₁-S-S-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-S-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-S-S-S-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-(CH₂)n₃-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-(O-CH₂-CH₂-O)n₄-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-HN-NH-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-C₂H₂-CO-(CH₂)n₂-CO-。

其中n1、n2、n3、n4皆为整数，且1≤n1≤10，1≤n2≤10，1≤n3≤20，1≤n4≤20；优选2≤n1≤4，2≤n2≤4，2≤n3≤10，2≤n4≤10。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述R与一个或多个B通过酰胺键连接，当B为多个时，每个B相同或不同。所述B与C通过酯键相连接，当B为多个时，每个C相同或不同。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述式（II）或式（III）中，X所在的环为环己烷、苯、单氮杂苯、二氮杂苯、三氮杂苯中的一种；优选地，X所在的环为邻二氮杂苯、间二氮杂苯、对二氮杂苯、间三氮杂苯中的一种；更优选为哌啶、吡啶、嘧啶、哌嗪、吡嗪、哒嗪、1,3,5-间三氮杂苯中的一种。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述式（III）中三个含有X的六元环相同或不相同。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述R为如下结构中的任意一种：

、/>、、/>、、/>

。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述C为如下结构的中的一种或多种：

、/>

、/>、

；

其中，R₁-R₇分别独立地选自H、OH、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、酰基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基、取代的C₃-C₆环烷基、C₃-C₆杂环、C₁-C₆烷基巯基、C₁-C₆烷胺基或。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述C为如下结构中的一种或多种：

、/>、/>、、/>、/>、、/>、、/>、/>、、/>。

前述的核酸适配体-多价药物偶联物，所述A为如下种类的核酸适配体中的任意一种：

AS1411、Pegaptanib、Sgc8c、A10、DNAaptamer、RNAaptamer、CL4、Apt、E07，或上述核酸适配体的硫代磷酸酯或甲基酸酯，或上述核酸适配体中核糖上的2'与4'碳连结在一起形成的锁核酸。

前述适配体对应序列如下：

AS1411：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG

Pegaptanib：GCGAACCGAUGGAAUUUUUGGACGCUCGC

Sgc8c：ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA

A10：GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACGACUCGCCCGA

DNAaptamer：GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA-(25N)-TTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC

RNAaptamer：GGGGGCAUACUUGUGAGACUUUUAUGUCACCCCC

CL4：GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC

Apt：GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG

E07：GGACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGGAACCGUCC

作为优选，本发明中的化合物包含如下结构：

为AS1411、Pegaptanib、Sgc8c、A10、DNAaptamer、RNAaptamer、CL4、Apt、E07中的任一种，优选为AS1411。

作为本发明的第二方面，本发明提供所述核酸适配体-多价药物偶联物的制备方法。本发明所述核酸适配体-多价药物偶联物可以由本领域技术人员结合本发明记载的内容及本领域进行制备，本发明包括但不限于包含如下步骤（1）-（3）的制备方法：

（1）将式（I）中的小分子毒性药物C与B连接进行修饰；

（2）将经修饰的小分子毒性药物C与多重载药连接键R通过缩合剂连接，得到多价药物衍生物；

（3）将核酸适配体A溶解于水中，再将上述得到的多价药物衍生物与核酸适配体上的氨基进行反应，得到核酸适配体-多价药物偶联物。

优选地，上述方法进一步为如下步骤：

（1）将小分子毒性药物进行二硫键修饰；

（2）将经二硫键修饰的小分子毒性药物与多重载药的连接键通过缩合剂连接，得到多价药物衍生物；

（3）将核酸适配体溶解于水中，再将上述得到的多价药物衍生物用有机溶剂溶解，在缩合试剂作用下利用核酸适配体上的氨基进行反应得到核酸适配体-多价药物偶联物。

更优选地，所述（1）中的小分子毒性药物为具有前述核酸适配体-多价药物偶联物中C的结构，优选为喜树碱类似物或紫杉醇类似物。

更优选地，所述（2）中，以2，2'-二硫二吡啶为原料，先将2，2'-二硫二吡啶与3-巯基丙酸溶于有机溶剂（包括但不限于乙醇或甲醇），通过醋酸作用，使得巯基取代吡啶基团，重复两次，得到3，3'-二硫代二丙酸。再将小分子毒性药物（包括但不限于喜树碱或紫杉醇）溶于有机溶剂（包括但不限于二氯甲烷、DMF、DMSO等）通过缩合剂（包括但不限于EDCI/DIPEA、DCC/DIPEA、DIC/DIPEA等）与3，3'-二硫代二丙酸连接，得到二硫键修饰并带有羧基端的小分子毒性药物。具体结构如下：

、/>

更优选地，（1）为如下反应路线0：

更优选地，上述反应路线0进一步为反应路线1或反应路线2：

反应路线1：

反应路线2：

所述反应路线中的有机溶剂包括但不限于MeOH、EtOH、DMF、DMSO、DCM、THF、ACN、EA。

所述反应路线0、1、2中的化合物1、2的合成试剂用量包括但不限于0.1-10eq。

所述反应路线0、1、2中的反应温度为0-60 ℃，作为进一步优选方案，反应路线温度均为室温条件。

反应路线0、1、2中的反应结束时间包括但不限于2-48 h，例如2-36h、4-24h。作为进一步实施方案，反应路线0、1、2反应结束时间均以TLC和LC-MS检测为准（TLC和LC-MS检测反应至原料反应完全则证明反应结束）。

更优选地，步骤（2）中以3，5-二羟基苯甲酸甲酯为原料与N-Boc溴乙胺在有机溶剂中（包括但不限于DMF或DMSO）与碳酸钾反应，再通过碱性试剂（包括但不限于氢氧化锂或氢氧化钠）脱去甲酯，并与Fmoc-乙二胺盐酸盐通过缩合剂反应（包括但不限于HATU/DIPEA或PyBOP/DIPEA），并通过盐酸/甲醇或三氟乙酸脱去Boc基团，得到具有氨基端的载两分子药物的连接键，载四分子药物连接键步骤同上。具体结构如下：

载两分子药物连接键：

载四分子药物连接键：

进一步地，（2）可采用如下反应路线3、4：

反应路线3：

反应路线4：

所述缩合试剂包括但不限于HATU/DIPEA、HATU/Et₃N、PyBOP/DIPEA、PyBOP/Et₃N、EDCI/DMAP或EEDQ；

反应路线3、4中的有机溶剂包括但不限于DMF、DMSO、DCM、THF、甲醇、乙醇、乙腈、叔丁醇、水或者它们任意的混合物。

反应路线3、4中的合成试剂的用量包括但不限于0.1-10eq。

反应路线3、4中的反应温度为0-80 ℃，作为进一步实施方案，优选50-80 ℃，优选50℃-80℃。

反应路线3、4中的反应结束时间包括但不限于2-48 h，例如2-36h、4-24h。作为进一步实施方案，反应路线3、4反应结束时间均以TLC和LC-MS检测为准（TLC和LC-MS检测反应至原料反应完全则证明反应结束）。

对于步骤（3），包括如下步骤：

a.将步骤（1）所得的经二硫键修饰的喜树碱类似物或紫杉醇类似物在有机溶剂中，与实施例2所得的能多重载药的连接键通过缩合剂连接，并在其他试剂作用下脱去Fmoc保护基团，生成带有羧基端的多价药物；

b.将a所得多价药物溶于有机试剂，加入缩合剂，再将核酸适配体AS141溶于去离子水中，并加入有机相中进行反应、即得。

进一步地，（3）可采用如下反应路线5、6、7、8：

反应路线5：

/>

反应路线6：

反应路线7：

反应路线8：

反应路线5、6、7、8中喜树碱类似物和紫杉醇类似物的用量为10-200eq，作为进一步优选方案，优选用量为20eq或者50eq。

反应路线5、6、7、8中缩合剂的用量包括但不限于15-500eq，作为进一步优选方案，所述缩合剂的用量优选30eq。

反应路线5、6、7、8中反应温度包括但不限于10-60 ℃，作为进一步优选方案，所述温度优选37 ℃。

反应路线5、6、7、8中的反应结束时间包括但不限于2-48 h，例如2-36h、4-24h。作为进一步优选方案，反应路线5、6、7、8反应结束时间均以TLC和LC-MS检测为准（TLC和LC-MS检测反应至原料反应完全则证明反应结束，在与核酸适配体进行偶联时以HPLC显示核酸适配体反应完全为准）。

本发明制备方法中所采用的各种分析、检测、及纯化方法均可以由本领域技术人员根据本发明公开内容并结合本领域常识进行确定，其并不影响本发明的实施。

作为本发明的第三方面，本发明还提供前述任一项核酸适配体-多价药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述肿瘤为结肠癌、乳腺癌、肝癌中的任意一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的核酸适配体-多价药物偶联物中，核酸适配体-多价药物偶联物可自组装形成均一的纳米颗粒，提高小分子毒性药物的水溶性和生物相容性的同时，实现药物的主被动双靶向肿瘤细胞。

2.本发明提供的核酸适配体-多价药物偶联物中，实现单个核酸适配体载多个药物，达到多重载药的目的，大大提高药物的血药浓度，达到更好的肿瘤抑制效果。

3.本发明提供的核酸适配体-多价药物偶联物中，体外活性研究表明核酸适配体-多价药物偶联物抗肿瘤活性明显优于核酸适配体-单价药物偶联物，实现“1+1＞4”的抗肿瘤模式。

4.本发明提供的核酸适配体-多价药物偶联物采用肿瘤微环境响应型连接键，在正常组织中无法释放小分子毒性药物；而在肿瘤组织中连接键断裂，释放小分子原药。相较于单纯的小分子毒性药物，偶合物对正常组织的毒性大大降低。

附图说明

图1为实施例1中化合物1的MS图谱；

图2为实施例1中化合物2的MS图谱；

图3为实施例1中化合物3的MS图谱；

图4为实施例1中化合物4的MS图谱；

图5为实施例2中化合物5的MS图谱；

图6为实施例2中化合物6的MS图谱；

图7为实施例2中化合物7的MS图谱；

图8为实施例2中化合物8的MS图谱；

图9为实施例2中化合物8的¹H-NMR图谱；

图10为实施例2中化合物8的¹³C-NMR图谱；

图11为实施例2中化合物9的MS图谱；

图12为实施例2中化合物10的MS图谱；

图13为实施例2中化合物11的MS图谱；

图14为实施例2中化合物12的MS图谱；

图15为实施例2中化合物13的MS图谱；

图16为实施例2中化合物13的¹H-NMR图谱；

图17为实施例2中化合物13的¹³C-NMR图谱；

图18为实施例3中化合物14的MS图谱；

图19为实施例3中化合物15的MS图谱；

图20为实施例3中化合物15的¹H-NMR图谱；

图21为实施例3中化合物15的¹³C-NMR图谱；

图22为实施例3中化合物16的MS图谱；

图23为实施例3中化合物17的MS图谱；

图24为实施例3中化合物18的MS图谱；

图25为实施例3中化合物18的¹H-NMR图谱；

图26为实施例3中化合物18的¹³C-NMR图谱；

图27为实施例3中化合物19的MS图谱；

图28为实施例3中化合物20的MS图谱；

图29为实施例3中化合物21的MS图谱；

图30为实施例3中化合物22的MS图谱；

图31为实施例3中化合物23的MS图谱；

图32为实施例3中化合物24的MS图谱；

图33为实施例3中化合物25的MS图谱；

图34为实施例3中化合物26的MS图谱；

图35为AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-4的粒径表征图；

图36为AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-4的形貌图；

图37为核酸适配体-多价药物偶联物对结肠癌细胞系HCT116的抑制作用曲线图；

图38为核酸适配体-多价药物偶联物对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用曲线图；

图39为核酸适配体-多价药物偶联物对肝癌细胞HepG2的抑制作用曲线图；

图40为核酸适配体-多价药物偶联物对正常肝细胞系LO2的毒性曲线图；

图41为核酸适配体-多价药物偶联物对抗小鼠结肠癌异种植肿瘤图；

图42为核酸适配体-多价药物偶联物在荷瘤小鼠结肠癌模型不同组织中的分布情况；

图43为核酸适配体-多价药物偶联物的体内稳定性试验结果。

具体实施方式

以下通过实施例及说明书附图进一步解释本发明的具体内容。

实施例1 合成经修饰小分子毒性化合物及单分子药物偶联物

（1）按照反应路线1合成目标化合物3

反应路线1：

具体步骤如下：

化合物1的合成：

使用天平准确称量2，2'-二硫代吡啶（4.00 g，18.18 mmol）和三巯基丙酸（520.20μL，5.98 mmol），置于100.00 mL圆底烧瓶中，并加入乙醇（50.00 mL）溶解，然后量取冰醋酸（1.04 mL，18.18 mmol），缓慢滴加到反应体系中，体系逐渐由无色变至黄色，室温条件下搅拌2小时，通过薄层色谱法（TLC）和碘显色法协同监测，直至三巯基丙酸反应完全。减压浓缩除去乙醇，然后用乙酸乙酯（50.00 mL）稀释，有机层先用pH=8-9的碳酸氢钠水溶液（20.00mL）洗涤，除去体系中残留的醋酸，分取有机相，再用5%的稀盐酸水溶液（20.00 mL）和水（20.00 mL×3）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，减浓缩除去乙酸乙酯，得到粗产物，再使用硅胶柱层析法法（PE：EA=2：1）纯化，得到化合物1为白色固体（[M+H]⁺: 216.0）。

化合物2的合成：

使用天平准确称量化合物1（1.20 g，5.58 mmol）和三巯基丙酸（532.20 μL，6.00mmol），置于100.00 mL圆底烧瓶中，并加入乙醇（50.00 mL）溶解，然后量取醋酸（0.32 mL，5.58 mmol），并加入反应体系中，在室温下搅拌4小时，通过TLC和碘显色法监测反应，直到化合物1被完全消耗掉。减压浓缩，除去溶剂乙醇，再用乙酸乙酯（50.00 mL）稀释，有机层先用pH=8-9的碳酸氢钠水溶液（20.00 mL）洗涤，除去残留的醋酸，分取有机相，并用5%的稀盐酸水溶液（20.00 mL）洗涤，除去碳酸氢钠，调节pH至酸性，有机相用水（20.00 mL×3）萃取，并用无水硫酸钠干燥，减压蒸发，使用硅胶柱层析法法（PE：EA=1：2）纯化，得到化合物2为白色固体（[M+H]⁺: 211.0）。

化合物3的合成：

将化合物2（1.10 g ，5.24 mmol）置于250.00 mL的圆底烧瓶中，并加入100.00 mL二氯甲烷溶解，冰浴条件下，将DIC（0.98 mL，6.23 mmol）加入到反应瓶中，再称取DMAP（0.96 g，7.86 mmol），加入反应体系，5 min后撤去冰浴，升至室温，再加入喜树碱（1.39 g，3.93 mmol），通过TLC监测反应，直至喜树碱完全耗尽。反应体系用5%稀盐酸（20.00 mL）洗涤一次，并用水（20.00 mL×3）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得到粗产物，再用硅胶柱层析法（DCM：MeOH=20：1）进行纯化，得到化合物3为黄色固体（[M+H]⁺:541.1）。

（2）按照反应路线2合成目标化合物4

反应路线2：

具体步骤如下：

化合物4的合成：

将化合物2（0.55 g ，2.62 mmol）置于250.00 mL的圆底烧瓶中，并加入100.00 mL二氯甲烷溶解，冰浴条件下，将DIC（0.49 mL，3.12 mmol）加入到反应瓶中，再称取DMAP（0.48 g，3.93 mmol），加入反应体系，10 min后撤去冰浴，升至室温，再加入紫杉醇（1.68g，1.97 mmol），通过TLC监测反应，直至紫杉醇完全完全。反应体系用5%稀盐酸（20.00 mL）洗涤一次，并用水（20.00 mL×3）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得到粗产物，再用硅胶柱层析法（DCM：MeOH=25：1）进行纯化，得到化合物4为白色固体（[1/2M+H]⁺: 523.7）。

化合物1-4的MS图谱分别见说明书附图1-4。化合物26的MS图谱见说明书附图34。

实施例2多价连接子的合成

（1）按照反应路线3合成目标化合物6、8

反应路线3：

具体步骤如下：

化合物5的合成：

称取3，5-二羟基苯甲酸甲酯（1.50 g，8.92 mmol）并置于50.00 mL圆底烧瓶，加入DMF（20.00 mL）溶解，再加入N-Boc溴乙胺（5.99 g，26.76 mmol）和碳酸钾（6.77 g，49.06mmol），并将反应瓶置于油浴中，升温至60 ℃，通过TLC监测直到3，5-二羟基苯甲酸甲酯反应完全，过滤除去碳酸钾，加入乙酸乙酯（100.00 mL）稀释，将有机相用水（40.00 mL×5）和盐水（40.00 mL×5）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到粗产物。再用硅胶柱层析法（PE：EA=1：1）进行纯化，得到化合物5，为白色固体（[M+H]⁺: 455.2）。

化合物6的合成：

称取化合物5（2.00 g，4.41 mmol）置于100.00 mL圆底烧瓶，加入THF（20.00 mL）溶解样品，然后将氢氧化锂（0.32 g，13.23 mmol）溶解到20.00 mL水中，并加入到反应体系，体系逐渐变浑浊，最后将反应瓶置于油浴中，升温至50 ℃反应，通过TLC监测，直至化合物5反应完全，停止反应。用5%的稀盐酸调节反应体系至弱酸性，并减压浓缩除去THF，再加入乙酸乙酯（100.00 mL）萃取水相，分取有机相再用饱和食盐水（40.00 mL）萃取一次，并加入过量无水硫酸钠干燥除水，过滤，减压蒸发，除去溶剂，得到粗产物。再用硅胶柱层析法（PE：EA=1：1）快速纯化，得到化合物6，为白色固体（[M+H]⁺: 441.2）。

化合物7的合成：

室温条件下，称量化合物6（0.90 g，2.05 mmol）置于50.00 mL圆底烧瓶中，加入20.00 mL二氯甲烷溶解，再加入HATU（0.94 g，2.46 mmol）和DIPEA（534.60 μL，3.08mmol），将化合物6活化10 min，同时，称取Fmoc-乙二胺盐酸盐（1.30 g，4.09 mmol）置于5.00 mL离心管，加入4.00 mL二氯甲烷溶解，并加入0.30 mL的DIPEA，超声并涡旋样品，除去盐酸盐，再将其缓慢滴加到化合物6活化液中，通过TLC监测反应，至化合物6消耗完全，停止反应，有机相用水（20.00 mL×3）和饱和食盐水（20.00 mL）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗产物，再用硅胶柱层析法（PE：EA=2：1）纯化，得到化合物7，为白色固体（[M+H]⁺: 705.3）。

化合物8的合成：

将上述所得到的化合物7（1.20 g，1.70 mmol）置于50.00 mL圆底烧瓶中，加入10.00 mL二氯甲烷溶解，然后将反应瓶置于冰浴条件下，加入等体积的TFA（10.00 mL），加样结束后，撤去冰浴，升温至室温，通过TLC监测反应至化合物7反应完全（约10-30 min），低温真空浓缩除去溶剂与TFA，再将所得粗产物用二氯甲烷淋洗（50.00 mL×3），干燥即得，无需进一步纯化，得到能载两分子药物的连接键，即化合物8，为白色固体（[M+H]⁺: 505.2）。

（2）按反应路线4合成目标化合物11、13

反应路线4:

具体步骤如下：

化合物9的合成：

同样以3，5-二羟基苯甲酸甲酯为起始原料，合成能够搭载四分子喜树碱的连接键。称取上述步骤中所得到的化合物5（1.10 g，2.43 mmol）置于50.00 mL圆底烧瓶，加入14.00 mL二氯甲烷溶解，加入等体积（14.00 mL）TFA，室温搅拌反应，最后逐滴滴加0.50 mL去离子水。通过TLC监测反应，等化合物5反应完全，直接将反应体系真空浓缩至固体状，再将固体用二氯甲烷淋洗两次，干燥，得到白色固体，即化合物9，无需进一步纯化便可用于下一步反应（[M+H]⁺: 255.1）。

化合物10的合成：

称取化合物9（0.30 g，1.18 mmol）置于10.00 mL离心管中，加入6.00 mL二氯甲烷溶解，再加入DIPEA（761.10 μL，4.25 mmol），超声5 min以除去残留的三氟乙酸盐。同时，称取化合物6（1.30 g，2.95 mmol），置于50.00 mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷（30.00 mL）溶解，再加入HATU（1.35 g，3.54 mmol），室温搅拌5 min后，将溶解有化合物9的二氯甲烷溶液，逐滴滴加到反应瓶中。通过TLC监测反应至化合物9消耗完全，停止搅拌，有机相先用5%稀盐酸洗涤一次，再用水（20.00 mL×3）和饱和盐水（20.00 mL）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩得到粗产物，最后通过柱层析法（PE：EA=1：1）快速纯化，得到化合物10，为白色固体（[1/2 M+H]⁺: 550.3）。

化合物11的合成：

将化合物10（0.90 g，0.82 mmol）置于50.00 mL圆底烧瓶中，加入THF（10.00 mL）溶解，称取氢氧化锂（98.4 mg，4.10 mmol），先用等体积水（10.00 mL）溶解，再加入反应瓶。将反应瓶置于50 ℃油浴中，搅拌反应，通过TLC监测反应至化合物10反应完全，真空浓缩除去体系中的THF，再加入乙酸乙酯（20.00 mL），并用5%稀盐酸调节反应体系至弱酸性，分取有机相，并用水（20.00 mL）和饱和食盐水（20.00 mL）萃取，萃取结束后，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩得到粗产物，最后通过柱层析法（PE：EA=1：2）纯化，得到化合物11，为白色固体（[1/2 M+H]⁺: 543.3）。

化合物12的合成：

首先，称取Fmoc-乙二胺盐酸盐（0.47 g，0.48 mmol），置于10.00 mL离心管中，加入干燥二氯甲烷（6.00 mL）溶解，再加入DIPEA（129.90 μL，1.11 mmol），超声溶解，并涡旋5min，以除去盐酸盐。同时，取一个50.00 mL圆底烧瓶，加入化合物11（0.80 g，0.74 mmol）与HATU（0.34 g，0.89 mmol），用干燥二氯甲烷（20.00 mL）溶解，搅拌3 min后，将溶有Fmoc-乙二胺盐酸盐的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入反应瓶，室温搅拌过夜，体系中析出大量白色固体，过滤，收集固体，并用二氯甲烷淋洗（50.00 mL×3），干燥即得化合物12，为白色固体（[1/2 M+H]⁺: 675.3）。

化合物13的合成：

称取化合物12（0.70 g，0.52 mmol）置于50.00 mL圆底烧瓶中，加入甲醇（10.00mL）溶解，再加入等体积的2 mol/mL的盐酸-甲醇溶液，室温搅拌反应，通过TLC监测反应至化合物12反应完全，真空浓缩，除去溶剂，得到白色固体，将所得固体先用乙酸乙酯淋洗（50.00 mL），再用二氯甲烷淋洗（50.00 mL×3），干燥固体，无需进一步纯化，得到能载四分子药物的连接键，即化合物13，为白色固体（[M+H]⁺: 949.4）。

化合物5-8、9-13的MS图谱分别见说明书附图5-8、附图11-15；化合物8的¹H-NMR图谱、¹³C-NMR图谱分别见说明书附图9、10；化合物13的¹H-NMR图谱、¹³C-NMR图谱分别见说明书附图16、17。

实施例3 合成核酸适配体-多价药物偶联物

（1）按照反应路线5合成目标化合物16

反应路线5：

具体步骤如下：

化合物14的合成：

室温条件下，称取化合物3（0.64 g，1.12 mmol）置于25.00 mL圆底烧瓶中，并加入无水DMF（10.00 mL），超声溶解。同时，再称取上述所得化合物8（0.24 g，0，0.48 mmol），置于5.00 mL离心管中，加入3.00 mL无水DMF溶解，再准确量取DIPEA（292.00 μL，1.68mmol），并加入离心管，超声溶解5 min后再涡旋5 min以除去化合物8所含的三氟乙酸。与此同时，称取PyBOP（0.69 g，1.34 mmol）加入到圆底烧瓶中，再将化合物8的DMF溶液缓慢滴加到反应体系中，通过TLC监测反应至化合物8反应完全。停止反应，加入二氯甲烷（100.00mL）稀释体系，并用水（40.00 mL×5）和饱和盐水（40.00 mL×5）萃取有机相，再分取有机相，经无水硫酸钠干燥除水，过滤，真空浓缩除去溶剂，得到粗产物，然后用硅胶柱层析法（DCM：MeOH=30：1）纯化，得到化合物14，为黄色固体（[1/2 M+H]⁺: 775.2）。

化合物15的合成：

在干燥的50.00 mL圆底烧瓶中，加入化合物14（0.54 g，0.35 mmol），并用无水DMF（20.00 mL）溶解，再量取哌啶（84.00 μL，1.05 mmol）并逐滴滴加入反应体系，体系逐渐由淡黄色变为橙黄色，室温搅拌2小时，通过TLC监测反应至化合物14消耗完全后，称取丁二酸酐（175.00 mg，1.75 mmol）加入反应体系，搅拌半小时后（除去哌啶），加入DIPEA（182.00 μL，1.05 mmol），再将混合体系室温搅拌20小时，反应结束后，将反应体系用二氯甲烷（100.00 mL）稀释，再用5%稀盐酸洗涤，以除去残存的DIPEA，分取有机相，经水（40.00 mL×5）和饱和食盐水（40.00 mL×5）萃取后，加入无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩得到粗产物，然后用硅胶柱层析法法（DCM：MeOH=20：1）纯化，得到羧基修饰的二价喜树碱衍生物，即化合物15，为黄色固体（[1/2 M+H]⁺: 714.2）。

化合物16的合成：

取80.00 mg的AS1411核酸适配体（氨基修饰）置于5.00 mL离心管中，加入1.00 mL去离子水，并涡旋5.00 min，使其充分溶解。称量上述所得化合物15（136.90 mg，96.00 μmol），置于10.00 mL离心管中，并加入6.00 mL的DMF溶解样品，准确称量HATU（45.60 mg，120.00 μmol）和DIPEA（25.02 μL，144.00 μmol），加入到溶解有化合物15的离心管中，并涡旋5-10 min，使化合物15充分活化，体系颜色由无色透明逐渐变至亮黄色。活化结束后，将其分装于2.50 mL圆底EP管中（共计20管，每管300.00 μL活化液）。再将溶解有AS1411核酸适配体的水溶液缓慢滴加至活化液中（每管50 μL），加样结束后，将其放置于恒温混匀金属浴中（37 ℃、1200 rpm/min），孵育过夜，通过高效液相色谱法（HPLC）监测反应，直至AS1411反应完全，停止孵育，每管反应液均加入15.00 μL冰醋酸，调节pH至4-5。再将反应液通过制备液相（RP-HPLC）纯化，流动相：A相：TEAA盐溶液，B相：乙腈。最后将制备得到的产物冻干，得到化合物16，即AS1411-CPT-2（核酸适配体-二价喜树碱偶联物），为淡黄色固体（MS:9889.1）。

（2）按照反应路线6合成目标化合物19

反应路线6:

具体步骤如下：

化合物17的合成：

称取化合物13（0.40 g，0.42 mmol）置于10.00 mL离心管中，加入干燥的DMF（6.00mL）溶解，再加入DIPEA（633.60 μL，3.64 mmol），超声并涡旋5 min以除去残留的盐酸。同时，取一个50.00 mL圆底烧瓶，加入化合物3（1.37 g，2.52 mmol）与HATU（1.15 g，3.04mmol），同样用干燥的DMF（20.00 mL）溶解，室温搅拌5 min后，将溶有化合物13的DMF溶液逐滴滴加入反应体系，体系中颜色由淡黄色逐渐加深至深黄色，继续搅拌过夜，通过TLC监测反应至化合物13反应完全，停止搅拌，加入二氯甲烷（100.00 mL）稀释反应，然后用水（40.00 mL×5）和饱和食盐水（40.00 mL×5）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩得到粗产物，再通过硅胶柱层析法（DCM：MeOH=30：1）纯化，得到化合物17，为黄色固体（[1/4 M+H]⁺: 760.5）。

化合物18的合成：

取一个干燥的50.00 mL圆底烧瓶，加入化合物17（0.96 g，0.32 mmol），用干燥的DMF（20.00 mL）溶解，冰浴条件下，缓慢加入哌啶（155.84 μL，1.58 mmol），体系逐渐由浅黄色变至深黄色，撤去冰浴，室温搅拌，通过TLC监测反应至化合物17反应完全后，称量丁二酸酐（256.00 mg，2.56 mmol），加入反应体系，再加入DIPEA（400.00 μL，2.30 mmol），继续搅拌，约20小时后，停止反应，加入二氯甲烷（100.00 mL）稀释，有机相先用5%稀盐酸（40.00mL）洗涤，再经水（40.00 mL×5）和饱和食盐水（40.00 mL×5）萃取后，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，过滤，真空浓缩，然后通过硅胶柱层析法（DCM：MeOH=10：1）纯化，得到羧基修饰的四价喜树碱衍生物，即化合物18，为黄色固体（[1/3 M+H]⁺: 972.9）。

化合物19的合成：

首先，称取80.00 mg经氨基修饰的AS1411核酸适配体，置于5.00 mL离心管中，加入1.00 mL去离子水，并涡旋5 min，使其充分溶解。称量上述所得化合物18（688.00 mg，236.00 μmol），加入DMSO（6.00 mL）溶解，再称量HATU（91.20 mg，240.00 μmol）与DIPEA（50.04 μL，288.00 μmol），加入到溶解有化合物18的DMSO溶液中，涡旋10-30 min，充分活化，体系颜色由无色透明逐渐变至亮黄色。待化合物18活化结束后，将其分装于2.50 mL圆底EP管中（共计20管，每管300.00 μL活化液）。再将溶解有AS1411核酸适配体的水溶液缓慢滴加至装有化合物18活化液的EP管中（每管50 μL），加样结束后，将其放置于恒温混匀金属浴中（37 ℃、1200 rpm/min），孵育过夜，通过HPLC监测反应，直至AS1411反应完全，停止孵育，每管反应液均加入20.00 μL冰醋酸，调节pH至4-5，反应液再通过RP-HPLC纯化，收集制备的液体并冻干，得到化合物19，即AS1411-CPT-4（核酸适配体-四价喜树碱偶联物），为淡黄色固体（MS: 11030.4）。

（3）按照反应路线7合成目标化合物22

反应路线7:

具体步骤如下：

化合物20的合成：

室温条件下，称取化合物4（0.58 g，0.56 mmol）置于25.00 mL圆底烧瓶中，并加入无水DMF（10.00 mL），超声溶解。同时，再称取上述所得化合物8（0.12 g，0.24 mmol），置于5.00 mL离心管中，加入5.00 mL无水DMF溶解，再准确量取DIPEA（146.00 μL，0.84 mmol），并加入离心管，超声溶解5 min后再涡旋5 min以除去化合物8所含的三氟乙酸盐。与此同时，称取PyBOP（0.35 g，0.67 mmol）加入到圆底烧瓶中，再将化合物8的DMF溶液缓慢滴加到反应体系中，通过TLC监测反应至化合物8反应完全。停止反应，加入二氯甲烷（80.00 mL）稀释体系，并用水（40.00 mL×5）和饱和盐水（40.00 mL×5）萃取有机相，再分取有机相，经无水硫酸钠干燥除水，过滤，真空浓缩除去溶剂，得到粗产物，然后用硅胶柱层析法（DCM：MeOH=40：1）纯化，得到化合物20，为白色固体（[1/3 M+H]⁺: 854.3）。

化合物21的合成：

在干燥的50.00 mL圆底烧瓶中，加入化合物20（0.45 g，0.17 mmol），并用无水DMF（15.00 mL）溶解，再量取哌啶（42.00 μL，0.53 mmol）并逐滴滴加入反应体系，体系逐渐由淡黄色变为橙黄色，室温搅拌4小时，通过TLC监测反应至化合物20消耗完全后，称取丁二酸酐（87.00 mg，0.87 mmol）加入反应体系，搅拌半小时后（除去哌啶），加入DIPEA（91.00 μL，0.53 mmol），再将混合体系室温搅拌10小时，反应结束后，将反应体系用二氯甲烷（80.00mL）稀释，再用5%稀盐酸洗涤，以除去残存的DIPEA，分取有机相，经水（40.00 mL×5）和饱和食盐水（40.00 mL×5）萃取后，加入无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩得到粗产物，然后用硅胶柱层析法法（DCM：MeOH=25：1）纯化，得到羧基修饰的二价紫杉醇衍生物，即化合物21，为白色固体（[1/3 M+H]⁺: 813.6）。

化合物22的合成：

取40.00 mg的AS1411核酸适配体（氨基修饰）置于5.00 mL离心管中，加入0.50 mL去离子水，并涡旋5.00 min，使其充分溶解。称量上述所得化合物21（117.40 mg，48.00 μmol），置于5.00 mL离心管中，并加入3.00 mL的DMF溶解样品，准确称量HATU（22.80 mg，60.00 μmol）和DIPEA（12.52 μL，72.00 μmol），加入到溶解有化合物21的离心管中，并涡旋5-10 min，使化合物21充分活化，体系颜色由无色透明逐渐变至亮黄色。活化结束后，将其分装于2.50 mL圆底EP管中（共计10管，每管300.00 μL活化液）。再将溶解有AS1411核酸适配体的水溶液缓慢滴加至活化液中（每管50 μL），加样结束后，将其放置于恒温混匀金属浴中（37 ℃、1200 rpm/min），孵育过夜，通过高效液相色谱法（HPLC）监测反应，直至AS1411反应完全，停止孵育，每管反应液均加入15.00 μL冰醋酸，调节pH至4-5。再将反应液通过制备液相（RP-HPLC）纯化，最后将制备得到的产物冻干，得到化合物22，即AS1411-PTX-2（核酸适配体-二价紫杉醇偶联物），为白色固体（MS: 10899.2）。

（4）按照反应路线8合成目标化合物25

反应路线8:

/>

具体步骤如下：

化合物23的合成：

称取化合物13（0.20 g，0.21 mmol）置于5.00 mL离心管中，加入干燥的DMF（3.00mL）溶解，再加入DIPEA（316.80 μL，1.82 mmol），超声并涡旋5 min以除去残留的盐酸。同时，取一个50.00 mL圆底烧瓶，加入化合物4（1.32 g，1.26 mmol）与HATU（0.57 g，1.52mmol），同样用干燥的DMF（20.00 mL）溶解，室温搅拌5 min后，将溶有化合物13的DMF溶液逐滴滴加入反应体系，体系中颜色由淡黄色逐渐加深至深黄色，继续搅拌过夜，通过TLC监测反应至化合物13反应完全，停止搅拌，加入二氯甲烷（100.00 mL）稀释反应，然后用水（40.00 mL×5）和饱和食盐水（40.00 mL×5）萃取，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩得到粗产物，再通过硅胶柱层析法（DCM：MeOH=40：1）纯化，得到化合物23，为白色固体（[1/6 M+H]⁺: 844.3）。

化合物24的合成：

取一个干燥的50.00 mL圆底烧瓶，加入化合物23（0.81 g，0.16 mmol），用干燥的DMF（15.00 mL）溶解，冰浴条件下，缓慢加入哌啶（77.92 μL，0.79 mmol），体系逐渐由浅黄色变至深黄色，撤去冰浴，室温搅拌，通过TLC监测反应至化合物23反应完全后，称量丁二酸酐（128.00 mg，1.28 mmol），加入反应体系，再加入DIPEA（200.00 μL，1.15 mmol），继续搅拌，约15小时后，停止反应，加入二氯甲烷（100.00 mL）稀释，有机相先用5%稀盐酸（40.00mL）洗涤，再经水（40.00 mL×5）和饱和食盐水（40.00 mL×5）萃取后，分取有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，过滤，真空浓缩，然后通过硅胶柱层析法（DCM：MeOH=20：1）纯化，得到羧基修饰的四价紫杉醇衍生物，即化合物24，为白色固体（[1/5 M+H]⁺: 988.5）。

化合物25的合成：

取40.00 mg经氨基修饰的AS1411核酸适配体，置于5.00 mL离心管中，加入0.50mL去离子水，并涡旋10 min，使其充分溶解。称量上述所得化合物24（582.00 mg，118.00 μmol），加入DMSO（3.00 mL）溶解，再称量HATU（45.60 mg，120.00 μmol）与DIPEA（25.02 μL，144.00 μmol），加入到溶解有化合物24的DMSO溶液中，涡旋10-30 min，充分活化，体系颜色由无色透明逐渐变至亮黄色。待化合物24活化结束后，将其分装于2.50 mL圆底EP管中（共计10管，每管300.00 μL活化液）。再将溶解有AS1411核酸适配体的水溶液缓慢滴加至装有化合物23活化液的EP管中（每管50 μL），加样结束后，将其放置于恒温混匀金属浴中（37℃、1200 rpm/min），孵育过夜，通过HPLC监测反应，直至AS1411反应完全，停止孵育，每管反应液均加入20.00 μL冰醋酸，调节pH至4-5，反应液再通过RP-HPLC纯化，收集制备的液体并冻干，得到化合物25，即AS1411-PTX-4（核酸适配体-四价紫杉醇偶联物），为白色固体（MS:13399.6）。

(5) 按照反应路线9合成目标化合物26

反应路线9:

具体步骤如下：

化合物26的合成：

取40.00 mg的经氨基修饰的AS1411核酸适配体，置于5.00 mL离心管中，加入0.50mL去离子水，并涡旋5.00 min，使其充分溶解。称量前述化合物3（25.92 mg，48.00 μmol），置于10.00 mL离心管中，并加入3.00 mL的DMF溶解样品，准确称量HATU（22.80 mg，60.00 μmol）和DIPEA（12.52 μL，77.00 μmol），加入到溶解有化合物3的离心管中，并涡旋5-10min，使化合物3充分活化，体系颜色由无色透明逐渐变至亮黄色。活化结束后，将其分装于2.50 mL圆底EP管中（共计10管，每管300.00 μL活化液）。再将溶解有AS1411核酸适配体的水溶液缓慢滴加至活化液中（每管50 μL），加样结束后，将其放置于恒温混匀金属浴中（37℃、1200 rpm/min），孵育过夜，通过高效液相色谱法（HPLC）监测反应，直至AS1411反应完全，停止孵育，每管反应液均加入15.00 μL冰醋酸，调节pH至4-5。再将反应液通过制备液相（RP-HPLC）纯化，流动相：A相：TEAA盐溶液，B相：乙腈。最后将制备得到的产物冻干，得到化合物26，即AS1411-CPT-1（单分子核酸适配体-喜树碱偶联物），为淡黄色固体（MS:9001.1）。

化合物14、15、16-18、19-26的MS图谱分别见说明书附图18-19、22-24、27-34；化合物15的¹H-NMR图谱、¹³C-NMR图谱分别见说明书附图20、21；化合物18的¹H-NMR图谱、¹³C-NMR图谱分别见说明书附图25、26。

实施例4AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-4的粒径表征

将实施例3中制得的AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-4前药用超纯水配为浓度为1mg/mL的稀溶液，采用动态光散色法测定两种前药胶束的粒径分布以及电位，用透射电镜表征形貌。AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-4的粒径及形貌如图35-36所示。

其中AS1411-CPT-2聚合物胶束，粒径大约在176.67 nm 左右，PDI为0.22，Zeta电位为-6.7 mV；AS1411-CPT-4聚合物胶束，粒径大约在180.33 nm 左右，PDI为0.17，Zeta电位为-12.6 mV。两种前药胶束基本呈球形或者椭球形，且分布均匀。

实施例5核酸适配体-多价药物偶联物的体外活性研究

材料：AS1411-CPT-2（化合物16）和AS1411-CPT-4（化合物19）由实施例3制备提供，胰蛋白酶、噻唑蓝 (MTT) (Biofroxx公司，德国)；二甲基亚砜 (DMSO) (MPBiomedicals公司，法国)；胎牛血清 (FBS) (Newzerum公司，新西兰)；DMEM培养基、RPMI1640培养基、培养皿、96孔板 (康宁，美国)；结肠癌细胞HCT116、乳腺癌细胞MDA-MB-231和肝癌细胞HepG2均购自中国科学院上海细胞库并由本实验室保存。阳性对照药物：HCPT（10-羟基喜树碱）、AS1411-CPT-1（化合物26）。

实验过程：收集生长良好的肿瘤细胞，用含10 %胎牛血清的RPMI1640或DMEM培养基配制成1×10⁴/mL细胞悬液，将HCT116、MDA-MB-231和HepG2细胞以2.5×10³细胞/孔的密度铺在96孔板中，孵育24h后，除去原来培养基，加入含不同浓度药物的培养基继续培养48小时。药物作用结束后，除去原来培养基，加入新鲜培养基100μL，加入10μL MTT溶液，置于培养箱中孵育2后，加入150 mL DMSO，摇床孵育15min，于490 nm处，用酶标仪测定OD值，并计算细胞增殖抑制率。重复上述步骤三次，实验数据见图37-39。

结果：HCPT、AS1411-CPT-4、AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-1对结肠癌细胞HCT116的IC₅₀分别为0.89、0.96、4.36、和10.53μM，对于乳腺癌细胞MDA-MB-231的IC₅₀分别为0.80、0.78、3.73和10.22μM，对于肝癌细胞HepG2的IC₅₀分别为0.49、0.68、4.09和8.36μM。AS1411-CPT-4的活性较AS1411-CPT-1提升不止4倍，可达到10倍以上。表明多价药物的偶联使得可以起到协同作用，可进一步增强疗效。

实施例6 核酸适配体-多价药物偶联物的体外毒性研究

材料：AS1411-CPT-2（化合物16）和AS1411-CPT-4（化合物19）由实施例3制备提供，胰蛋白酶、噻唑蓝 (MTT) (Biofroxx公司，德国)；二甲基亚砜 (DMSO) (MPBiomedicals公司，法国)；胎牛血清 (FBS) (Newzerum公司，新西兰)；DMEM培养基、RPMI1640培养基、培养皿、96孔板 (康宁，美国)；正常肝细胞LO2购自中国科学院上海细胞库并由本实验室保存。阳性对照药物：HCPT（10-羟基喜树碱）、AS1411-CPT-1（化合物26）。

实验过程：收集生长良好的细胞，用含10 %胎牛血清的RPMI1640培养基配制成1×10⁴/mL细胞悬液，将LO2细胞以2.5×10³细胞/孔的密度铺在96孔板中，孵育24h后，除去原来培养基，加入含不同浓度药物的培养基继续培养48小时。药物作用结束后，除去原来培养基，加入新鲜培养基100 μL，加入10 μL MTT溶液，置于培养箱中孵育2后，加入150 mLDMSO，摇床孵育15min，于490 nm处，用酶标仪测定OD值，并计算细胞增殖抑制率。重复上述步骤三次，实验数据见图40。

结果：阳性药对照药HCPT，AS1411-CPT-4、AS1411-CPT-2和AS1411-CPT-1对正常肝细胞系LO2的IC₅₀分别为0.61、10.90、19.51和30.55μM，实验数据表明当小分子药物偶联核酸适配体AS1411后，其细胞毒性大大的降低了，其中AS1411对细胞均无明显抑制作用。这表明连接适配体后可以降低小分子毒性药物对正常细胞的毒性，这是由于正常肝细胞膜表面核仁素表达量较少，AS1411适配体与正常细胞不具靶向性，细胞对偶联物的摄入量较少，毒性作用小。

实施例7 核酸适配体-多价药物偶联物的体内活性研究

为了验证本申请中核酸适配体-多价药物偶联物的体内抗肿瘤作用，采用结肠癌小鼠模型进行体内抗肿瘤实验，对其肿瘤肿瘤、RTV值、肿瘤抑制率及T/C值进行测定，验证其抗肿瘤作用。

实验过程：在标准环境下饲养6-7周雌性裸鼠，将结肠癌细胞HCT116悬浮于无血清培养基中每只小鼠接种5 × 10⁶个肿瘤细胞。当肿瘤体积达到50-100 mm³时，小鼠随机分为4组，分别尾静脉注射HCPT、AS1411-CPT-4、AS1411-CPT-2、AS1411，每组12只。设PBS阴性对照组。每2天给药1次，连续给药8次，在末次给药后24小时结束实验。实验结束后将动物安乐死，剥离肿瘤，称瘤重，计算药物对肿瘤生长抑制率。用t检验法比较各组动物肿瘤重量、肿瘤体积、RTV等指标。实验数据汇总于表1，图41展示出不同注射药物得到的抗小鼠结肠癌异种植肿瘤。

表1为HCPT、AS1411-CPT-4、AS1411-CPT-2、AS1411对荷瘤小鼠结肠癌肿瘤模型生长抑制作用实验数据。

表1

在实验观察过程中，HCPT、AS1411-CPT-4、AS1411-CPT-2、AS1411各组在给药8次期间小鼠体重基本维持在动物毒副反应可以耐受的范围。由动物肿瘤重量、肿瘤抑制率及RTV值可知，HCPT、AS1411-CPT-4、AS1411-CPT-2、AS1411各给药组小鼠肿瘤生长速度和肿瘤抑制率与PBS组相比有所减缓。所有指标均显示出，AS1411-CPT-4组肿瘤抑制作用均优于相应CPT摩尔浓度的AS1411-CPT-2组。

实验结论：AS1411-CPT-4和AS1411-CPT-2对结肠癌模型裸鼠尾连续8次静脉注射给药，肿瘤生长受到明显抑制，且AS1411-CPT-4效果优于AS1411-CPT-2。

实施例8 核酸适配体-多价药物偶联物的体内分布研究

为了验证本申请核酸适配体-多价药物偶联物在体内的分布情况，采用结肠癌小鼠模型进行体内分布实验，采用HPLC技术对测定其各组织中偶联物的含量，研究其体内分布规律。

AS1411-CPT-4给药组剂量设为5 μM，给药体积为100 μL。HCPT给药组剂量设为5 μM，给药体积为100 μL。

实验过程：在标准环境下饲养6-7周雌性裸鼠将结肠癌细胞HCT116悬浮于无血清培养基中，每只小鼠接种3 × 10⁶个肿瘤细胞。当肿瘤体积达到50-100 mm³时，小鼠随机分为两组，分别尾静脉注射AS1411-CPT-4、HCPT，每组12只。给药8h后处死动物，取出心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织，用生理盐水冲洗干净，称重，-80 ℃短时冻存备用。取出各脏器组织，加入组织2倍量的生理盐水，匀浆后离心过滤，取90 μL滤液，滤液中加入标准品溶液10μL，过滤后采用HPLC测定给药不同时间后各组织中药物含量。上述药物在荷瘤小鼠结肠癌模型不同组织中的分布情况见图42。

从图42中的分布结果显示，AS1411-CPT-4在结肠癌肿瘤组织中分布较多，正常组织中分布较少，HCPT在正常肝、肾组织组织中分布较多。AS1411-CPT-4在小鼠正常组织中含量远低于HCPT，而在肿瘤组织中，AS1411-CPT-4实验组相对于HCPT实验组在肿瘤组织中的量占总注射量的百分比高，说明AS1411-CPT-4在体内有较好的结肠癌肿瘤组织靶向性。

实施例9 核酸适配体-多价药物偶联物的体内稳定性研究

通过对本申请核酸适配体-多价药物偶联物进行小鼠体内的稳定性实验，模拟药物在人体内的稳定性，以验证该偶联物在不同组织中的解离度和稳定性。

实验方法：随机挑选27只荷瘤小鼠，于尾椎静脉注射浓度为5 μM的AS1411-CPT-4生理盐水溶液100 μL。分别在0.5、1、2、4、8、12、16、24、32h时，各处死3只老鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，采用心脏穿刺取血，取心、肝、脾、肺、肾、实体瘤等组织，进行组织匀浆、提取，样品处理及预实验分别确定TP、AS1411及AS1411-CPT偶联物的保留时间后，HPLC分别检测每个时间点各组织中游离的CPT和AS1411-CPT的量，并计算出释放效率，监测并定量考察药物在组织内的稳定性。实验数据见表2，体内稳定性试验数据分析结果见图43。

表2为AS1411-CPT-4的体内稳定性试验数据。

表2

药物释放率	1/2 h	1 h	2 h	4 h	8 h	12 h	16 h	24 h	36 h
										肝	3 %	4 %	6 %	7 %	10 %	15 %	19 %	23 %	27 %
心	1 %	2 %	3 %	5 %	7 %	9 %	10 %	13 %	17 %
										脾	1 %	3 %	5 %	7 %	8 %	10 %	12 %	14 %	15 %
肺	2 %	3 %	5 %	8 %	9 %	12 %	13 %	15 %	17 %
										肾	8 %	9 %	10 %	11 %	13 %	15 %	17 %	20 %	22 %
血浆	1 %	3 %	6 %	8 %	9 %	11 %	13 %	16 %	19 %
										肿瘤	19 %	25 %	36 %	43 %	51 %	68 %	76 %	82 %	93 %

上述体内稳定性试验数据表明，本申请的核酸适配体-多价药物偶联物经过36小时后在血浆及心、脾，肺等正常组织中几乎不解离或仅少量解离，在肾和肝组织中解离稍多;而在肿瘤组织中，本申请的核酸适配体-多价药物偶联物大量解离，并且随着时间的累积，解离度不断增加。

以上结果证明了用于连接喜树碱和适配体的连接键在体内起到了明显的作用。使得偶联物在正常组织中不发生断裂，毒性较小；而在肿瘤组织中断裂，释放出喜树碱，发挥治疗作用。

Claims

1.一种核酸适配体-多价药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体-多价药物偶联物具有如式（I）所示的结构：

A-R-B-C （I）

式（I）中，R为多价连接子，为如下结构中的任意一种：

、/>；

A为核酸适配体；

C为如下结构中的任意一种：

、/>、/>、/>、/>、/>、/>，其中，R₃-R₄分别独立地选自H、OH、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、酰基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基、取代的C₃-C₆环烷基、C₃-C₆杂环、C₁-C₆烷基巯基、C₁-C₆烷胺基或/>；

B为以下结构中的任意一种：-CO-(CH₂)n₁-S-S-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-S-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-S-S-S-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-(CH₂)n₃-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-(O-CH₂-CH₂-O)n₄-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-HN-NH-(CH₂)n₂-CO-、-CO-(CH₂)n₁-C₂H₂-CO-(CH₂)n₂-CO-，其中1≤n1≤10，1≤n2≤10，1≤n3≤20，1≤n4≤20。

2.如权利要求1所述的核酸适配体-多价药物偶联物，其特征在于，2≤n1≤4，2≤n2≤4，2≤n3≤10，2≤n4≤10。

3.如权利要求1所述的核酸适配体-多价药物偶联物，其特征在于，所述R与一个或多个B通过酰胺键连接，当B为多个时，每个B相同或不同；和/或，所述B与C通过酯键相连接，当B为多个时，每个C相同或不同。

4.如权利要求3所述的核酸适配体-多价药物偶联物，其特征在于，所述C为如下结构中的一种或多种：

、/>、。

5.如权利要求1所述的核酸适配体-多价药物偶联物，其特征在于，所述A为如下种类的核酸适配体中的任意一种：

AS1411、Pegaptanib、Sgc8c、A10、CL4、E07，或上述核酸适配体的硫代磷酸酯。

6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的核酸适配体-多价药物偶联物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将式（I）中的C与B连接进行修饰；

（2）将经修饰的C与多重载药连接键R通过缩合剂连接，得到多价药物衍生物；

7.权利要求1-5任一项所述的核酸适配体-多价药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为结肠癌、乳腺癌、肝癌中的任意一种。