CN112569365A - 一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途。本发明所提供的核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与核酸适配体片段之间通过连接基团连接。本发明所提供的核酸适配体药物偶联物不仅具有核酸适配体所有的优点，丝裂霉素C是一种非特异性的抗癌药物，对细胞没有选择性，通过特定的连接分子将核酸适配体与丝裂霉素C结合，能够有效提高丝裂霉素C的靶向能力，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的效果。

Description

一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物领域，特别是涉及一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途。
背景技术
丝裂霉素(Mitomycin)为头状链霉菌的培养液中分离出的抗肿瘤抗生素，对多种实体瘤有效，能与DNA的双螺旋结构形成交联，破坏DNA的结构与功能，一直增殖期DNA的复制，对增殖期中的细胞均有杀伤作用，同时也可作用、于静止期的细胞，从而抑制肿瘤细胞，临床适用于消化道癌，如胃癌、肠癌、肝癌及胰癌等。
核酸适体(Aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，能够特异性结合靶标分子。与常用的靶向分子抗体相比，核酸适体筛选周期短，易于合成和修饰，制备成本低，稳定性更强，靶标范围广，毒性和免疫原性低，组织穿透性强，在肿瘤诊疗中具有更广阔的应用前景。自20世纪九十年代被发现就以后被广泛应用于生物传感，生物诊断，靶向治疗等方面。1990年Sullenger等人首次探索了适配体作为靶向治疗药物。除了用作抗肿瘤药物以外，核酸适体更可以用作靶向分子，连接一些具有优良抗肿瘤性能，但不具有靶向性的小分子抗肿瘤药物，赋予其靶向能力，能特异性识别肿瘤细胞表面高表达的靶标蛋白，将药物运送到肿瘤部位，从而实现药物精准释放，提高抗肿瘤药效，降低对正常组织的毒副作用。比如最近新兴的核酸适体-药物偶联物，类似于已开发比较成熟的抗体-药物偶联物，发挥子弹头的功能，把小分子抗肿瘤药物带到肿瘤部位，实现靶向治疗。虽然抗体已经有几十年的发展历史，但目前而言仅有四种抗体-药物偶联物被FDA批准上市，很大一部分原因在于抗体的分子量大，组织穿透性差，存在免疫原性，制备成本高等。而核酸适体刚好弥补这些缺陷，因此核酸适体-药物偶联将会给靶向药物的发展成熟带来新希望。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与核酸适配体片段之间通过连接基团连接，所述连接基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000021
其中，X选自O或不存在；
Y选自C1-3亚烷基、C1-3卤代亚烷基、芳基。
在本发明一些实施方式中，Y选自亚甲基、对亚苯基。
在本发明一些实施方式中，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000022
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ IDNO.1～3其中之一所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接。
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体药物偶联的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000023
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物选自化学结构式如下之一所示的化合物：
Figure BDA0002221601320000024
Figure BDA0002221601320000031
本发明另一方面提供上述的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
在本发明一些实施方式中，所述制备方法具体包括：将药物分子修饰连接分子，将修饰有连接分子的药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
本发明另一方面提供上述的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。
附图说明
图1显示为本发明实施例1制备获得的丝裂霉素C核酸适体偶联物质谱示意图。
图2a显示为本发明实施例2制备获得的丝裂霉素C核酸适体偶联物质谱示意图。
图2b显示为本发明实施例2制备获得的丝裂霉素C核酸适体偶联物质谱示意图。
图2c显示为本发明实施例2制备获得的丝裂霉素C核酸适体偶联物质谱示意图。
图2d显示为本发明实施例2制备获得的丝裂霉素C核酸适体偶联物质谱示意图。
图3显示为本发明实施例3制备获得的丝裂霉素C核酸适体偶联物质谱示意图。
图4显示为本发明实施例4中PL45细胞的细胞毒性实验示意图。
图5显示为本发明实施例4中HCT116细胞的细胞毒性实验示意图。
图6显示为本发明实施例4中A549细胞的细胞毒性实验示意图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量实践研究后意外地发现，将药物分子基团通过特定的连接基团与核酸适配体片段进行组合以获得核酸适配体药物偶联物，具有更好的药物活性，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与核酸适配体片段之间通过连接基团连接，所述连接基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000032
其中，X选自O或不存在；
Y选自C1-3亚烷基、C1-3卤代亚烷基、芳基。丝裂霉素C是一种非特异性的抗癌药物，对细胞没有选择性，而通过特定的连接片段将核酸适体与丝裂霉素C结合，可以很大程度上提高丝裂霉素C的靶向能力，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的效果。通过细胞毒性实验中可知，通过上述连接基团连接的核酸适配体药物偶联物，相对于未连接核酸适配体的丝裂霉素(Mitomycin)和通过其他连接片段连接的核酸适配体药物偶联物具有更强的肿瘤细胞杀伤能力。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物，可以包括药物分子基团，所述药物分子基团具体可以为丝裂霉素C分子所形成的丝裂霉素C基团。在本发明一优选实施方式中，所述药物分子，具体可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002221601320000041
所述药物分子可以包括环乙胺，从而可以通过环乙胺基团与连接分子反应，以形成药物分子基团。在本发明一优选实施方式中，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000042
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物中，可以包括核酸适配体片段，所述核酸适配体片段通常由合适的核酸片段形成，核酸适配体片段的选择决很大程度上决定了所述核酸适配体药物偶联物的靶向性，也很大程度上决定了核酸适配体药物偶联物整体上的稳定性。所述核酸适配体片段的多核苷酸序列可以包括如SEQ ID NO.1～3其中之一所示的序列：
XQ-2d序列：5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTC-3’(SEQ ID NO.1)；
Sgc8c序列：5’-AGATG GTAGGGTTACTATGAGC-3’(SEQ ID NO.2)；
AS1411序列：5’-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3’(SEQ ID NO.3)；
所述核酸适配体片段通常靶向于其所对应的蛋白，例如，AS1411可以与细胞核仁素特异性结合，从而实现靶向高表达细胞核仁素的肿瘤细胞；再例如，Sgc8c可以与靶标蛋白是肿瘤细胞表面高表达的PTK7蛋白；再例如，XQ-2d可以与靶细胞表面CD71蛋白特异性结合，提高诊疗试剂的靶向能力。所述核酸适配体片段通常可以由5’端被-SH修饰的核酸片段形成，从而可以在核酸适配体片段5’端与连接基团之间形成-S-S-键连接。对核酸片段5’端进行-SH修饰的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以使用C6氨基亚磷酰胺单体对核酸片段进行修饰，以获得5’端被-SH修饰的核酸片段。在本发明一优选实施方式中，可以使用DNA固相合成的方法将C6氨基亚磷酰胺单体修饰在5’端，所述C6氨基亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000051
核酸片段5’端糖环上的羟基与亚磷酰胺单体交联，反应方程式如下所示：
Figure BDA0002221601320000052
其中，五元杂环支链上的-CH2-连接的曲线部分表示核酸片段的剩余部分，实心圆表示固相支持物CPG。DNA磷酸骨架上进行了巯基修饰，制备获得的产物脱去保护基团，即可获得5’端被-SH修饰的核酸片段，进一步通过该-SH基团与连接基团连接，从而在核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接，-S-S-键所连接的核酸适配体片段所对应的结构式可以如下所示：
Figure BDA0002221601320000053
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物中，所述药物分子基团与核酸适配体片段之间通过连接基团连接。所述连接基团通常可以是由合适的连接分子与药物分子和核酸片段所形成的基团，例如，所述连接分子可以包括
Figure BDA0002221601320000061
从而可以与药物分子和核酸片段连接以形成连接基团。在本发明一优选实施方式中，所述连接分子具体可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002221601320000062
其中，X选自O或不存在；
Y选自C1-3亚烷基、C1-3卤代亚烷基、芳基。
本发明中，所述“亚烷基”通常指饱和脂肪族基团，它们可以是直链或支链。例如，C1-3烷基通常指包括1个、2个、3个碳原子的亚烷基基团，所述亚烷基基团具体可以是包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
本发明中，“卤代亚烷基”通常指卤代的饱和脂肪族基团，它们可以是直链或支链的、并且任选被被独立地选自氟、氯、溴或碘单取代或多取代。例如，C1-3卤代烷基通常指包括1个、2个、3个碳原子的卤代亚烷基基团，所述卤代烷基基团具体可以是包括但不限于卤代亚甲基、卤代亚乙基、卤代亚丙基等。
本发明中，“芳基”通常指具有至少一个芳环但没有杂原子的基团。所述芳基基团具体可以是包括但不限于亚苯基等，优选可以是包括但不限于对亚苯基等。
在本发明更优选的优选实施方式中，所述连接分子具体可以是化学结构式如下所示的化合物：
Figure BDA0002221601320000063
在本发明另一优选实施方式中，所述连接基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000064
其中，X选自O；
Y选自对亚苯基；
在本发明另一优选实施方式中，所述连接基团的结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000071
其中，X不存在；
Y选自亚甲基。
在本发明一优选实施例中，核酸适配体药物偶联物的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002221601320000072
其中，-S-S-所连接的曲线部分为核酸片段。
在本发明另一优选实施例中，核酸适配体药物偶联物的化学结构式如下之一所示：
Figure BDA0002221601320000073
其中，-S-S-所连接的曲线部分为核酸片段。
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。所述核酸片段可以是5’端修饰有-SH的核酸片段，对核酸片段进行-SH修饰的方法具体可以参照如上所给出的文献。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，所述制备方法具体可以包括：1)将含有二甲亚胺基团(aziridine)的药物分子修饰连接分子；2)将修饰有连接分子的药物分子与-SH修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有二甲亚胺基团(aziridine)的药物分子修饰连接分子，以提供修饰有连接分子的药物分子的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是：将含有环乙胺的药物分子和连接分子在催化剂存在的条件下反应，所使用的催化剂通常可以是有机碱，更具体可以是4-二甲基吡啶等。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是DMF等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是室温条件。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将修饰有连接分子的药物分子与-SH修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将修饰有连接分子的药物分子与-SH修饰的核酸片段充分混合。再例如，所述反应通常可以在合适的反应溶剂存在的条件下进行，具体可以是DMF等。再例如，反应通常可以在室温或加热的条件下进行，具体的反应温度可以是室温条件。
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有二甲亚胺基团(aziridine)的药物分子修饰连接分子，以提供修饰有连接分子的药物分子的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002221601320000081
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将修饰有连接分子的药物分子与-SH修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002221601320000082
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将含有二甲亚胺基团(aziridine)的药物分子修饰连接分子，以提供修饰有连接分子的药物分子的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002221601320000091
在本发明一优选实施方式中，所述核酸适配体药物偶联物的制备方法中，将修饰有连接分子的药物分子与-SH修饰的核酸片段反应，以提供所述的核酸适配体药物偶联物的反应方程式如下所示：
Figure BDA0002221601320000092
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。本发明所提供的核酸适配体药物偶联物对于靶标细胞(例如，可以是肿瘤细胞，具体可以是人肺癌细胞、人结肠癌细胞、人胰腺导管腺癌细胞等，更具体可以是A549细胞、HCT116细胞、PL45细胞等)具有良好的特异性和靶向性，核酸适配体药物在肿瘤部位更加富集，可以高效地靶向靶标。
本发明所提供的核酸适配体药物偶联物不仅具有核酸适配体所有的优点，丝裂霉素C是一种非特异性的抗癌药物，对细胞没有选择性，通过特定的连接分子将核酸适配体与丝裂霉素C结合，能够有效提高丝裂霉素C的靶向能力，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的效果。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1
丝裂霉素C苄基碳酸酰胺核酸适体的制备：
a.4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶基)苄基碳酸酯的制备：
往50mL三口圆底烧瓶中加入悬浮于10mL无水四氢呋喃的LiAlH4 74mg(1.95mmol),氮气保护并在冰水浴中加入溶于10mL无水四氢呋喃的100mg(0.65mmol)邻巯基苯甲酸，然后撤去冰水浴，室温搅拌反应6h，反应进程用TLC监测。当邻巯基苯甲酸完全转换为邻巯基苯甲醇后，缓慢加入冰水淬灭反应，加入2mM盐酸溶液调节溶液pH至2，然后用乙酸乙酯/饱和食盐水＝1:1体系萃取三次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，然后减压旋蒸除去乙酸乙酯。硅胶色谱柱分离纯化，得到55mg白色邻巯基苯甲醇固体，产率为60％。
往50mL三口圆底烧瓶中加入28mg(0.2mmol)邻巯基苯甲醇，加入5mL二氯甲烷，加入44mg(0.4mmol)2,2’-二巯基二吡啶，室温搅拌过夜，反应进程用TLC监测。反应完成后，减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离纯化，得到20mg产物4-(2-二巯基吡啶基)苯甲醇，黄白色油状液体，产率为41％。
往50mL三口圆底烧瓶中加入20mg(0.08mmol)4-(2-二巯基吡啶基)苯甲醇，氮气保护下加入无水二氯甲烷，加入对硝基苯基氯甲酸酯32mg(0.16mmol)，N,N'-二异丙基乙胺20.7mg(0.16mmol)，4-二甲氨基吡啶0.976mg(催化量)，室温下搅拌反应12h，反应进程用TLC监测。反应完成后，加入0.01M盐酸溶液中和过量碱，用二氯甲烷/饱和盐水萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离纯化得25.9mg 4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶基)苄基碳酸酯，为黄白色固体，产率为80％。
Figure BDA0002221601320000101
b.丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶)苄基碳酸酰胺的制备：
50mL三口圆底烧瓶中加入4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶基)苄基碳酸酯22.3mg(0.055mmol)，丝裂霉素C16.7mg(0.05mmol)，催化量的4-二甲氨基吡啶，再在氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺10mL，室温搅拌过夜，反应进程用TLC监测。反应完成后用二氯甲烷/饱和盐水萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离纯化得25.3mg丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶基)苄基碳酸酰胺，黑色固体，产率为83％。
Figure BDA0002221601320000111
c.丝裂霉素C核酸适体偶联物制备：
丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶基)苄基碳酸酰胺1mg溶于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，加入200μL 25μM巯基修饰的核酸适体溶液(核酸适体为XQ-2d，具体序列参照SEQ IDNO.1，购自上海生工生物工程股份有限公司)，37℃震荡24h。反应后反向制备柱纯化，所得到的目标产物用冷冻干燥方法得到产物，溶于超纯水后得130μL 25μM，XQ-2d序列的质谱结果如图1所示，HPLC纯度为46.72％，产率为65％。
Figure BDA0002221601320000112
实施例2
丝裂霉素C乙基碳酸酰胺核酸适体的制备：
a.4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶基)乙基碳酸酯的制备：
往50mL三口圆底烧瓶中加入88mg(0.4mmol)2,2’-二巯基吡啶，31.3mg(0.4mmol)2-巯基乙醇，加入10mL二氯甲烷。室温下搅拌2h，反应过程用TLC监测。减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱反应纯化，得20mg 2-(2-二巯基吡啶基)乙醇，黄白色油状液体，产率53％。
往50mL三口圆底烧瓶中加入18.7mg(0.1mmol)2-(2二巯基吡啶基)乙醇，加入10mL无水二氯甲烷，加入对硝基苯基氯甲酸酯40mg(0.2mmol)，N,N'-二异丙基乙胺25.9mg(0.2mmol)，4-二甲氨基吡啶1.22mg(催化量)，室温搅拌过夜，反应过程用TLC监测。反应完成后，加入0.01M的盐酸溶液中和过量碱，然后用二氯甲烷/饱和食盐水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后减压旋蒸出去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离得到19.35mg 4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酯，黄白色油状液体，产率55％。
Figure BDA0002221601320000121
b.丝裂霉素C-4-(2-吡啶二硫基)乙基碳酸酰胺的制备：
50mL三口圆底烧瓶中加入4-硝基苯基-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酯19.35mg(0.055mmol)，丝裂霉素C16.7mg(0.05mmol)，催化量的4-二甲氨基吡啶，再在氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺10mL，室温搅拌过夜，反应进程用TLC监测。反应完成后用二氯甲烷/饱和盐水萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去二氯甲烷，硅胶色谱柱分离纯化得22.0mg丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酰胺，黑色固体，产率为80％。
Figure BDA0002221601320000122
c.丝裂霉素C核酸适体偶联物制备：
丝裂霉素C-4-(2-二巯基吡啶)乙基碳酸酰胺1mg溶于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，加入200μL 30μM巯基修饰的核酸适体溶液(核酸适体分别为XQ-2d、Sgc8c、AS1411和对照序列，XQ-2d序列参照SEQ ID NO.1，Sgc8c序列参照SEQ ID NO.2，AS1411序列参照SEQ IDNO.3，对照序列参照SEQ ID NO.4，购自上海生工生物工程股份有限公司)，37℃震荡24h。反应后反向制备柱纯化，所得到的目标产物用冷冻干燥方法得到产物，溶于超纯水后得228μL25μM。
XQ-2d所对应的核酸适配体偶联物的质谱结果如图2a所示，HPLC纯度为94.53％，产率为93％。
Sgc8c所对应的核酸适配体偶联物的质谱结果如图2b所示，HPLC纯度为83.70％，产率为95％。
AS1411所对应的核酸适配体偶联物的质谱结果如图2c所示，HPLC纯度为61.97％，产率为90％。
对照序列所对应的核酸适配体偶联物的质谱结果如图2d所示，HPLC纯度为96.80％，产率为98％。
Figure BDA0002221601320000131
实施例3
丝裂霉素C羰基适配体偶联物的制备：
a.丝裂霉素C对硝基苯基甲酸酰胺的制备：
往50mL三口圆底烧瓶中加入82mg(0.25mmol)丝裂霉素C，98.7mg(0.5mmol)对硝基苯基氯甲酸酯，3mg催化量4-二甲氨基吡啶，100μL(0.5mmol)三乙胺，10mL无水四氢呋喃，室温下搅拌过夜，反应过程用TLC监测。反应结束后减压旋蒸除去三乙胺和四氢呋喃，硅胶色谱柱分离纯化，得到112.2mg丝裂霉素C对硝基苯基甲酸酰胺，为紫黑色固体，产率90％。
Figure BDA0002221601320000132
b.丝裂霉素C羰基适配体偶联物的制备：
2mg丝裂霉素C对硝基苯基甲酸酰胺溶于200μL DMF中，加入200μL，65μM氨基修饰的核酸适体水溶液(如XQ-2d序列：，加入1μL三乙胺，37℃震荡1h，反应后反向制备柱纯化，所得到的目标产物用冷冻干燥方法得到产物，溶于超纯水后得224μL 25μM，质谱结果如图3所示，HPLC纯度为80.30％，产率为43％。
Figure BDA0002221601320000133
实施例4
细胞毒性实验：
贴壁细胞(分别为A549细胞、PL45细胞、HCT116细胞)用DPBS清洗后加入200μL胰酶消化2-3min，吹打重悬到培养基，计数板计数后接种到96孔板，每个孔5000个细胞，培养24h后分别加入系列浓度梯度的含丝裂霉素C和丝裂霉素C适配体偶联物的新鲜培基，然后再培养72h。然后用CCK-8试剂盒检测细胞活力，PL45细胞、HCT116细胞、A549细胞的细胞活力检测结果分别如图4～6所示。其中，图4中，ApDC Linker1指实施例2合成的丝裂霉素C-核酸适体偶联物、ApDC Linker2指实施例1合成的丝裂霉素C-核酸适体偶联物、ApDC Linker3指实施例3合成的丝裂霉素C-核酸适体偶联物、MMC指丝裂霉素C、MMC-Linker1指实施例2中合成的丝裂霉素C-linker、MMC-Linker2指实施例1中合成的丝裂霉素C-linker，MMC-Linker3指实施例3中合成的丝裂霉素C-linker。图5中，HCT116Sgc8 ApDC是指实施例2的linker合成的核酸适体(Sgc8c)丝裂霉素C偶联物、MMC指丝裂霉素C、CpDC指对照序列丝裂霉素C偶联物，对照序列是
(5’-ATTGCACTTACTATATTGCACTTACTATATTGCACTTACTAT-3’，SEQ ID NO.4)，制备方法参照实施例2，仅使用的具体核酸适体序列不同。图6中，A549 AS1411 APDC是指实施例2的linker合成的核酸适体(AS1411)丝裂霉素C偶联物、MMC指丝裂霉素C、CpDC与实施例5相同。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种核酸适配体药物偶联物，包括药物分子基团和核酸适配体片段，所述药物分子基团选自丝裂霉素C基团，所述药物分子基团与核酸适配体片段之间通过连接基团连接，所述连接基团的结构式如下所示：
Figure FDA0002221601310000011
其中，X选自O或不存在；
Y选自C1-3亚烷基、C1-3卤代亚烷基、芳基。
2.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，Y选自亚甲基、对亚苯基。
3.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述药物分子基团的结构式如下所示：
Figure FDA0002221601310000012
4.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1～3其中之一所示的序列。
5.如权利要求4所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体片段5’端与连接基团之间通过-S-S-键连接。
6.如权利要求1所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体药物偶联的结构式如下所示：
Figure FDA0002221601310000013
7.如权利要求6所述的核酸适配体药物偶联物，其特征在于，所述核酸适配体药物偶联物选自化学结构式如下之一所示的化合物：
Figure FDA0002221601310000021
8.如权利要求1～7任一权利要求所述的核酸适配体药物偶联物的制备方法，包括：将药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将药物分子修饰连接分子，将修饰有连接分子的药物分子与核酸片段连接，以提供所述的核酸适配体药物偶联物。
10.如权利要求1～7任一权利要求所述的核酸适配体药物偶联物在制备药物中的用途。
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