CN103214541A

CN103214541A - 含有天然胆固醇和赖氨酸类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体、制备方法和应用

Info

Publication number: CN103214541A
Application number: CN2013101389953A
Authority: CN
Inventors: 曹阿民; 盛瑞隆; 陈剑; 徐宇虹; 王昭; 田晓婧
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明涉及脂质体基因转染生物试剂领域，特别涉及一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体、制备方法和其作为小分子干扰RNA(SiRNA)转染试剂的应用。本发明所提供的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质功能分子，合成方法简单且效率高，其与辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)复合形成的脂质体制备方法简便，易实现规模化制备。作为SiRNA基因转染试剂，本发明提供的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体与市售商品化基因转染试剂bPEI-25k相比具有明显较低的细胞毒性，且具有相对高效的SiRNA基因转染效果，可以作为新型类脂质基因载体功能试剂在SiRNA的转染中得到应用。

Description

含有天然胆固醇和赖氨酸类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及合成脂质体基因输送功能载体材料领域，特别涉及一种由天然胆固醇和赖氨酸合成的类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体的制备方法及其作为小分子干扰RNA(SiRNA)转染试剂的应用。

背景技术

目前，基因治疗(Gene Therapy)已经成为生物医学工程研究与应用领域的新兴研究热点，其核心是将具有一定治疗作用的基因片段通过基因输送途经导入人体靶细胞中进行表达，以纠正致病的基因缺陷，从而达到治疗疾病的目的。这些导入的治疗基因包括DNA、RNA等，其中基于小分子干扰RNA(SiRNA)技术的基因治疗方法近年来引起了人们的极大兴趣。与传统的DNA基因治疗相比，其方法优点在于：SiRNA无需穿越核膜屏障进入目标细胞核内进行整合表达，在细胞质中就能方便、快速、且特异性与信使RNA(mRNA)结合，进而抑制结合mRNA的翻译表达，起到基因调控和治疗的效果；另一方面，SiRNA可由人工合成制备得到，有利于其有效基因序列的筛选和优化，由于其起效快，在治疗过程中SiRNA给药的时间间隔也灵活可控。因此，通过SiRNA输送进行基因治疗的相关技术近年来得到了迅速的发展，而促使SiRNA基因高效输送的相关功能载体材料的研究成为生命科学和材料科学交叉领域最为活跃的研究方向之一。

据国内外已有的研究报道，病毒以外作为SiRNA基因输送的载体大多为合成阳离子有机功能分子、高分子，其实现基因负载与输送的原理为利用载体阳离子功能分子、高分子中质子化氨基官能团的正电荷(+)与SiRNA基因序列中磷酸基团所携带的负电荷(-)的静电相互作用，结合组装形成稳定的聚集体纳米复合物粒子(Polyplex)，保护所负载的SiRNA不易被细胞内外的核酸酶降解，同时可提高聚集复合体粒子在体内的稳定性，从而实现提高SiRNA基因转染的效率。然而，到目前为止，虽然国内外已经开发报道了多种阳离子功能分子如阳离子聚合物、阳离子脂质体等，并作为载体应用于体外或体内细胞/组织水平的SiRNA输送与转染研究，但仍然存在着一系列科学和技术问题，如大多数脂质阳离子功能分子在血液循环环境中不稳定，容易被网状内皮系统吞噬后被肝、脾等器官清除。同时，在脂质阳离子介导的SiRNA基因输送研究中发现，许多阳离子聚合物具有免疫原性，刺激、诱导细胞的免疫应急反应，从而导致毒副作用。以上这些因素限制了阳离子功能分子在SiRNA基因治疗中的进一步应用。因此，如何改善合成基因载体的生物相容性、减低毒性及增强SiRNA基因的输送与转染效果，具有重要的研究和实用价值。

目前，研究采用具有生物相容性的脂质化合物构建新型阳离子生物载体成为合成功能脂质分子研究开发应用的重要方向之一。胆固醇是一种具有重要生理活性的天然甾体化合物，其在动物体内多种脂质结构中(如低密度脂蛋白LDL)以自由分子或者化学键合形态广泛存在，具有较强的疏水性和良好的生物相容性。因此，充分利用胆固醇类天然产物的疏水性分子骨架结构，通过进一步化学偶联水溶性阳离子片段，可合成制备新型脂质阳离子有机功能分子，降低合成脂质阳离子的细胞毒性，其不仅有可能应用作为新型生物相容性基因载体，同时也是一类潜在的生物相容性药物输送辅助剂。近年来，国内外合成报道了多种由天然胆固醇衍生的阳离子脂质，如胆固醇胺盐(J.Med.Chem.2007,50,2432)、胆固醇取代胺类(Bioorg.Med.Chem.Lett.2009,19,2986)等，这些合成阳离子脂质作为药物和基因输送载体得到了广泛的研究(Mol.Pharm.2012,9,3579)。一些基于天然胆固醇的阳离子脂质表现出了良好的药物和基因负载、可控缓释以及基因输送与细胞内转染效果，提高了载体与药物或基因复合纳米粒子(NP)的细胞内摄入能力。在此基础上，人们又相继合成了由核苷酸或氯喹修饰的胆固醇衍生物阳离子脂质，发展更为有效可控的基因输送载体体系。在相关前期的工作中，申请者发现了系列基于二硫键的胆固醇脂质基因载体(Biomaterials2011,11,3507;中国专利申请号201010182428.4)，并发现二硫化学键的引入对降低合成脂质载体的细胞毒性具有重要作用。进一步还发现了系列基于天然生物相容性胆固醇的类脂质阳离子有机功能分子，作为基因转染试剂（中国专利申请号201110040189.3）并成功应用于质粒DNA的高效细胞转染。然而，上述作为基因输送载体的合成胆固醇类脂质大多集中应用于质粒DNA的细胞转染方面，用于SiRNA转染的比较少。因此，研究和开发生物相容性、高效和低细胞毒性的胆固醇类脂质阳离子有机功能分子，进一步拓展其作为小分子干扰SiRNA功能载体的应用，对于开发具有我国自主知识产权的生物功能载体材料具有重要意义，其也是本发明所致力解决的目标。

发明的内容

本发明的目的之一是提供一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子。

本发明的目的之二是提供上述一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成方法。

本发明的目的之三是含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子用于制备含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体及其它们的制备方法。

本发明的目的之四是提供一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质体作为SiRNA基因输送载体功能材料的用途。

根据本发明所提供的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子，其化学结构可由通式(I)表示：

上式(I)结构中，连接基团（Linker）选自：-(CH₂)₄-、-(CH₂)₅-，A-表示阴离子反离子部分，具体包括氯负离子、磷酸根负离子、甲磺酸根负离子、三氟乙酸根负离子(TFA^-)。

依据本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成方法，主要由以下两个步骤组成：

第一步：将烷基二醇溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯中，于0～50℃搅拌反应12～24h后蒸馏除去有机溶剂。然后用有机溶剂柱层析，分离纯化制备得到中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯。所述的烷基二醇是丁二醇、戊二醇。

第二步：将BOC保护的天然赖氨酸砌块化合物溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的步骤一制备所得的胆固醇单取代二醇中间体中，加入一定量的缩合剂后于0～50℃搅拌反应12～24h，蒸馏除去有机溶剂，进行柱层析。然后产品溶于过量酸中室温搅拌反应1～2h，加醚沉淀后过滤干燥得到含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子，所述的BOC是碳酸二叔丁酯。

本发明中所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成步骤（一）和（二）中，所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯，所述碱催化剂包括三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、吡啶、4-二甲氨基吡啶，所述柱层析所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈及其按照不同配比混合所得的溶剂体系。

本发明中所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成步骤（二）中，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑(CDI)。

本发明中所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成步骤（二）中，所述的过量酸包括盐酸、磷酸、甲磺酸、三氟乙酸。

本发明中所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成步骤（二）中，所述的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备步骤（一）中的反应温度优选但不限于0～50℃，特别优选30～50℃。所述合成制备步骤（二）中的反应温度优选但不限于0～50℃，特别优选10～30℃。

根据本发明所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体的合成制备方法，其主要操作流程为：

在25mL圆底烧瓶中称取1mmoL的上述合成得到的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子，然后加入摩尔比分别为(2：1；1：1；1：2)的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)与之混合，再将该混合脂质充分溶解于一定量的色谱级氯仿溶液中，随后在旋转蒸发仪中40℃下除去氯仿溶剂，待瓶底形成一层均匀的脂质薄膜后，加入一定量的去离子水，超声水化0.5h～1h后得到一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体。

根据本发明提供的上述一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体，可以进一步应用作为新型高效低毒的类脂质SiRNA基因转染试剂。与已有的相关报道相比(Mol.Pharmaceutics.2008，5，128)以及我们先前的工作（Biomaterials2011,11,3507;中国专利申请号201010182428.4，201110040189.3）相比，具有如下的优点：(1)本发明中所提供的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体其来源于资源丰富的天然产物胆固醇和天然赖氨酸，相关合成制备方法简单高效，易于实现低成本规模化制备。(2)本发明中所提供的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体，与已有商品化的枝化分子结构聚乙烯亚胺阳离子高分子基因转染试剂bPEI-25k相比具有明显较低的细胞毒性。同时，采用上述系列脂质体作为SiRNA基因载体，在人肺癌细胞株H1299中的基因转染效率评价结果表明其具有较高的SiRNA转染效率，可开发作为新型高效低毒的类脂质SiRNA基因转染试剂应用。

附图说明

图1、本发明实施例1-4中所述的合成类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys，Cho-4C-Lys及其脂质体Cho-5C-Lys-DOPE(摩尔比1:1)和Cho-4C-Lys-DOPE(摩尔比1:1)在人肺癌细胞H1299中的体外细胞毒性评价。

实验对照组采用市售基因转染试剂bPEI-25K，从图中结果可以发现依据该发明所制备的类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体在相同质量浓度下的细胞毒性远低于参照bPEI-25K。

图2、本发明实施例1-4中所述的合成类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys，及其脂质体Cho-5C-Lys-DOPE(摩尔比1:1)和Cho-4C-Lys-DOPE(摩尔比1:1)的荧光素酶法基因转染效率评价结果。

实验对照组采用市售基因转染试剂分子量25kDa的枝化分子结构聚乙烯亚胺bPEI-25K，从图中结果可发现依据该发明所制备的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys，Cho-4C-Lys及其脂质体Cho-5C-Lys-DOPE(摩尔比1:1)和Cho-4C-Lys/DOPE(摩尔比1:1)作为基因载体，在人子宫颈癌细胞株Hela中具有良好的基因转染效率。

图3以本发明所合成的类脂质阳离子有机功能分子Cho-4C-Lys及其脂质体Cho-4C-Lys+DOPE（摩尔比1：1）为基因载体和荧光素酶干扰SiRNA作为报告基因，在一定的N/P(载体/基因)摩尔比下，人肺癌细胞株H1299的SiRNA转染效率评价（对照载体组为市售转染试剂PEI-25k）。

附图中control表示在不加入任何基因载体的情况下，直接用荧光素酶干扰SiRNA转染人肺癌细胞株H1299的荧光素酶表达效率。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。

实施例1

脂质分子Cho-5C-Lys

第一步：将戊二醇(12.2g，0.1mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，上述溶液缓慢滴加到含有10ml三乙胺的溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯（4.5g，0.01mol）溶液中，于30℃搅拌反应12h后蒸馏除去有机溶剂。经过柱层析（洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚=1/2v/v）后制备得到胆固醇单取代戊二醇碳酸酯中间体。合成产率为80%。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.32(s，1H，C=CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J=6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]=531.5m/z

第二步：将BOC保护的天然赖氨酸（3.5g，0.01mol）溶于50ml干燥的三氯甲烷中，在1mL4-二甲氨基吡啶的催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的上一步所得胆固醇单取代戊二醇碳酸酯（5.3g，0.01mol）中，加入DCC缩合剂（4g，0.02mol）后于10℃搅拌反应24h。蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析（乙酸乙酯/石油醚=1/2v/v）后，所得粗产品溶于20ml三氟乙酸中室温搅拌反应2h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys。合成产率为72%。所述的BOC是碳酸二叔丁酯；所述的DCC是二环己基碳二亚胺。

¹H NMR(d-CD₃COCD₃，300MHz)：8.1(b，H，NH₃ ⁺)，7.8(b，H，NH₃ ⁺)，5.30(s，1H，C=CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J=6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]=646.5m/z

实施例2

脂质分子Cho-4C-Lys

第一步：将丁二醇(9.6g，0.1mmol)溶于50ml干燥二氧六环，将上述溶液缓慢滴加到含有20ml吡啶的溶于50ml干燥二氧六环的胆固醇对甲苯磺酸酯（5.4g， 0.01mol）溶液中，于40℃搅拌反应18h后蒸馏除去有机溶剂。经过柱层析（洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚=1/2v/v）后得到胆固醇单取代丁二醇碳酸酯中间体。合成产率71%。

¹H NMR(CDCl₃,300MHz)：5.32(s，1H，C=CH，胆固醇)，3.50(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OH)，3.37(t，2H，J=5.1Hz，CHOCH₂)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]=503.4m/z

第二步：将BOC保护的天然赖氨酸（3.5g，0.01mol）溶于50ml干燥的四氢呋喃中，在0.5g4-二甲氨基吡啶的催化下缓慢滴加到溶于20ml干燥四氢呋喃的上一步所得胆固醇单取代丁二醇碳酸酯（5.0g，0.01mol）中，加入DIC缩合剂（2.5g，0.02mol）后于20℃搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂。经过柱层析后（洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚=1/2v/v），粗产品溶于20ml盐酸（质量浓度37%）中室温搅拌反应1h后，加入甲基叔丁基醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-3。合成产率为63%。所述的DIC是二异丙基碳二亚胺。

¹H NMR(d-CD₃COCD₃，300MHz)：8.1(b，H，NH₃ ⁺)，7.8(b，H，NH₃ ⁺)，5.32(s，1H，C=CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，3.50(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OH)，3.37(t，2H，J=5.1Hz，CHOCH₂)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]=631.5m/z

实施例3

在250mL圆底烧瓶中称取1mmoL的上述合成得到的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys，然后加入摩尔比为1：1的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)与之混合。再将该混合脂质充分溶解于100mL色谱级氯仿溶液中，随后在旋转蒸发仪中40℃下除去氯仿溶剂，待瓶底形成一层均匀的脂质薄膜后，加入100mL去离子水，超声水化0.5h后得到含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体Cho-5C-Lys-DOPE。

脂质体Cho-5C-Lys-DOPE的粒径	脂质体Cho-5C-Lys-DOPE的表面电位
		108.6±12.3纳米	23.1±2.5毫伏

[0052] 实施例4

在250mL圆底烧瓶中称取1mmoL的上述合成得到的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子Cho-4C-Lys，然后加入摩尔比为1：1的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)与之混合。再将该混合脂质充分溶解于100mL色谱级氯仿溶液中，随后在旋转蒸发仪中40℃下除去氯仿溶剂，待瓶底形成一层均匀的脂质薄膜后，加入100mL去离子水，超声水化1h后得到含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体Cho-4C-Lys-DOPE。

脂质体Cho-4C-Lys-DOPE的粒径	脂质体Cho-4C-Lys-DOPE的表面电位
		97.4±12.1纳米	21.4±4.5毫伏

实施例5

含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体的细胞毒性评价

本发明实施例1-2中所述的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys和Cho-4C-Lys及其如实施例3和4中所述的脂质体Cho-5C-Lys-DOPE和Cho-4C-Lys-DOPE的细胞毒性评估采用MTT法，主要试验方法如下：将H1299细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入100μL含有10%FBS的DMEM培养基。然后，将该96孔板于37℃和5%CO₂浓度条件下孵育24小时后，加入不同浓度的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys和Cho-4C-Lys及其脂质体Cho-5C-Lys-DOPE和Cho-4C-Lys-DOPE继续孵育24小时，其后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)后继续孵育4小时。进一步每孔加入100mL二甲基亚砜（DMSO）溶解生成的甲臢化合物，用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm波长处的吸光度值。实验中以枝化bPEI-25K为参比样品评价根据本发明所提供的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys和Cho-4C-Lys及其脂质体Cho-5C-Lys-DOPE和Cho-4C-Lys-DOPE的细胞毒性。从说明书附图1中可看出阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys和Cho-4C-Lys及其脂质体Cho-5C-Lys-DOPE和Cho-4C-Lys-DOPE的细胞毒性大大低于市售参比试剂bPEI-25K。

实施例6

含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体作为SiRNA基因载体的转染性能评价

本发明实施例1-2中所述的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子Cho-5C-Lys和Cho-4C-Lys及其如实施例3和4中所述的脂质体Cho-5C-Lys-DOPE和Cho-4C-Lys-DOPE的SiRNA细胞转染效率评价采用荧光素酶报告基因分析试剂盒（Luciferase pDNA assay kit），主要试验方法如下：将稳定表达荧光素酶Luciferase的人肺癌细胞株H1299接种于24孔培养板中，每孔加入0.5mL含有10%FBS血清的1640培养基。将该24孔培养板于37℃和5%浓度CO₂条件下培养，待细胞长满底面积约80%后弃去培养基，然后每孔重新加入0.5mL不含血清的1640培养基，将脂质载体与沉默荧光素酶的SiRNA以不同N/P复合制成纳米颗粒。放置半小时后加入细胞中，继续培养48小时后测定luciferase表达移去每孔中的培养液并加入200μl荧光素酶分析试剂盒的细胞裂解液(Promega，USA)进行裂解。取10ul裂解液上清与10ul底物混匀，用Glomax20/20化学发光测定仪(Promega，USA)测定混合液的化学发光值。本实验中以枝化bPEI-25K为对比参照载体，评价根据本发明所制备的脂质阳离子作为SiRNA基因输送载体的细胞转染效率。说明书附图2和3中的测试结果表明，脂质体Cho-5C-Lys-DOPE和Cho-4C-Lys-DOPE的SiRNA基因转染效率高于市售参比试剂bPEI-25K。

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的权利要求范围为准。

Claims

1.一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子，其化学结构可由通式(I)表示：

上式结构中，连接基团Linker选自：-(CH₂)₄-或-(CH₂)₅ ^-，A^-表示阴离子反离子部分：氯负离子、磷酸根负离子、甲磺酸根负离子或三氟乙酸根负离子。

2.一种根据权利要求1中所述的含有天然胆固醇和氨基酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成方法，其特征是由以下两个步骤组成：

第一步：将烷基二醇溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯中，于0～50℃搅拌反应12～24h中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯；上述反应中，碱、烷基二醇和胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为0.05～0.1：4.0～6.0：1.0；

第二步：将BOC保护的天然赖氨酸砌块化合物溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代二醇中，加入一定量的缩合剂后于0～50℃搅拌反应12～24h，蒸馏除去有机溶剂，进行柱层析；然后产品溶于过量酸中室温搅拌反应1～2h，加醚沉淀后过滤干燥得到含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子；上述反应中，BOC保护的天然赖氨酸砌块化合物与胆固醇单取代二醇碳酸酯中间体的摩尔比为1.0：1.0～1.5；

所述的碱是三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、吡啶或4-二甲氨基吡啶；所述的烷基二醇是丁二醇或戊二醇；所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或羰基二咪唑;所述的过量酸为盐酸、磷酸、甲磺酸或三氟乙酸;所述的醚为乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚或甲基乙烯基醚；所述的BOC是碳酸二叔丁酯。

3.根据权利要求2中所述的一种含有天然胆固醇和氨基酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成方法，其特征是步骤（一）中，所述的产物经过蒸馏除去有机溶剂；然后用有机溶剂柱层析分离纯化。

4.根据权利要求2中所述的一种含有天然胆固醇和氨基酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成方法，其特征是步骤（一）和（二）中，所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯；所述柱层析所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈或它们的混合溶剂。

5.根据权利要求2中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸的类脂质阳离子有机功能分子的合成方法，其特征是步骤（一）中的反应温度为0～50℃；所述步骤（二）中的反应温度为0～50℃。

6.一种如权利要求1所述的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的应用，其特征是用于制备SiRNA转染试剂。

7.如权利要求6所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的应用，其特征是采用如权利要求1所述的含有天然胆固醇和赖氨酸的功能分子为制备原料，与二油酰磷脂酰乙醇胺混合制备脂质体制备含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体。

8.如权利要求7所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的应用，其特征是称取如权利要求1所述的含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子，然后加入摩尔比为1：1的二油酰磷脂酰乙醇胺与之混合,再将该混合脂质充分溶解于色谱级氯仿溶液中，二者的氯仿体积/混合脂质摩尔比为100～200：1；随后在旋转蒸发除去氯仿溶剂，形成一层均匀的脂质薄膜后，加入去离子水，去离子水和脂质薄膜的体积/摩尔比为100～200：1，超声水化0.5h～1h后得到一种含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体。

9.一种如权利要求7或8所述的一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质阳离子有机功能分子的应用，其特征是所述的含有天然胆固醇和赖氨酸的脂质体作为制备小分子干扰RNA基因输送载体的应用。