CN101870719B - 一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物、制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型结构的同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型有机功能分子、制备方法及其用途。本发明所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型有机功能分子具有低细胞毒性、高生物相容性，其分子结构为两亲性，能够在缓冲液中高效率地结合基因，并通过细胞内转染高效表达目标蛋白。本发明提供的新型有机功能分子中的二硫键在生物体内还原性环境中可还原破裂，有利于负载基因药物从聚集复合体中释放，同时脂溶性胆固醇骨架提供良好的生物相容性，并增强阳离子片段与基因的结合与负载能力。本发明所提供的新型有机功能分子制备方法简便，既可以作为低毒、高效的基因药物缓释载体生物材料应用，也可以作为一种高效、低毒阳离子功能表面活性剂，在水剂或乳剂化妆品及个人护理用品制备配方中应用。
Description
技术领域
本发明涉及″智能型″有机生物功能材料领域，特别涉及一种同时具有可生物还原性二硫化学键和甾体骨架化学结构的有机功能化合物、制备方法及其在制备环境响应性可控缓释药物与化妆品制备中功能表面活性剂的应用。
背景技术
20世纪90年代以来，生物材料(Biomaterials)已成为生命科学和材料科学等交叉学科领域中最为热门的研究课题之一。其中用于药物和治疗功能基因输送的载体生物材料可将负载的药物和外源治疗基因输送到生物体内的特定细胞、组织或器官发挥靶向治疗作用。目前，国内外正在研究的基因载体材料大多属于两亲性阳离子有机分子(脂质体、类脂质体)或者聚电解质高分子，其作用原理是利用功能阳离子分子中氨基基团所代的正电荷与DNA或者RNA中磷酸基团所带负电荷通过静电相互作用，使得载体与基因结合形成稳定的聚集复合体(complex)，保护聚集复合体中DNA或者RNA链在体内长时间血液循环中不易被核酸酶特异性降解，并可防止聚集复合体之间团聚形成更大尺寸的聚集体，实现治疗基因药物高效率输送与细胞内重组转染表达。因此，作为药物或基因转导的生物载体材料既要满足低毒性、无免疫原性、体内可降解吸收，还要能够和治疗外源基因DNA或者RNA有效地结合形成一定纳米尺度聚集复合体(通常在50-400纳米)，在血液循环中长期稳定存在，减少与血液中蛋白等成份的非特异性相互作用。通常情况下，为了使功能阳离子分子和基因之间有足够的结合能力，必须保证阳离子分子中的阳离子片段与疏水性片段的比例较高，提高其分子量和电荷密度。然而，现有的研究发现有机功能分子(脂质体、类脂质体)或者聚电解质高分子中阳离子片段分子量越大，导致电荷密度高，其作为药物或者基因输送载体材料应用时的细胞毒性大，难以满足临床转基因治疗的实际要求。因此，研发具有低分子量的阳离子片段，并能够和外源治疗基因高效复合稳定负载的新型生物载体是发展低细胞毒性、高效率基因治疗载体功能化合物的重要方向。
胆固醇类化合物在动物体内的细胞膜以及多种脂质中广泛存在，是一类具有重要生物功能的疏水性天然有机多环化合物，因此基于胆固醇类化合物的骨架结构，并通过进一步修饰水溶性阳离子片段后形成的类脂质体有机功能分子，将可能同时具有较低细胞毒性和两亲性，是一类潜在的新型生物相容性外源基因载体生物材料与功能表面活性剂。最近几年来，人们已经合成报道了一些由胆固醇衍生的两亲性阳离子有机功能分子，如胆固醇季胺盐(J.Med.Chem.2007，50，2432)、胆固醇取代胺类(Int.J.Pharm.2004，278，143)等，这些阳离子功能分子已经在构建药物和功能基因载体中得到初步应用。此外，一些基于胆固醇的阳离子功能分子已经表现出了良好的药物控释和基因转染效果，为了提高其细胞内吞能力，人们进一步又相继合成了核苷酸、氯喹修饰的胆固醇类阳离子有机功能分子。总体上，基于胆固醇结构的阳离子型有机功能分子的研究与应用尚处于初步阶段，值得进一步研究开发。另一方面，从作为药物或者治疗基因药物的载体实际应用考虑，现有报道的由胆固醇衍生的基因载体有机功能分子存在合成较为繁琐、载体在基因药物的输送过程中缺乏体内环境响应性等不足。二硫键是一种具有生物还原响应性的化学键，近年来已被广泛应用于设计、合成体内生物还原响应性的有机功能分子与嵌段高分子(J.Am.Chem.Soc，2009，131，4830)。因此，兼具脂溶性胆固醇骨架和功能阳离子片段以及生物还原响应性二硫化学键的新型有机功能化合物，将为研究开发新型体内生物响应性基因载体生物材料与生物相容性功能表面活性剂提供新的可能，这也是本发明所致力解决的目标。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型两亲有机功能化合物。
本发明的目的之二在于提供一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型两亲有机功能化合物的合成制备方法。
本发明的目的之三是提供一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型两亲有机功能化合物作为药物、基因载体生物材料以及生物相容性表面活性剂的用途。
本发明所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物，可由化学结构式(Ⅰ)表示：
上式中，CFG+表示水溶性阳离子功能砌块，其结构由阳离子氨基、阳离子天然氨基酸酯基或酰胺基、阳离子树枝状氨基酸酯基或酰胺基、阳离子多胺、天然季胺碱构成；Y表示分子连接结构片段，由1-30个碳原子长度的亚烷基链-(CH2)n-、亚烷氧基链-(OCH2CH2)n-构成，n选自1～30的自然数，进一步推荐n选自1～10的自然数，更进一步推荐n选自1～6的自然数；X1、X2、X3表示氧-O-、氮-NH-、硫-S-，它们可是相同原子，也可以是不同原子；A-表示阴离子部分，包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根离子、硝酸根离子、高氯酸根离子、甲酸根离子、磷酸根离子、焦磷酸根离子、柠檬酸根离子、酒石酸根离子、琥珀酸根离子或三氟乙酸根离子(TFA-)。
本发明中所述的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子有机功能化合物，其所述阳离子砌块(CFG)选自下列的结构：氨基阳离子-NH3 +、二甲氨基阳离子-NH(CH3)2 +、
赖氨酸酯基或酰胺基阳离子、精氨酸酯基或酰胺基阳离子、组氨酸酯基或酰胺基阳离子、1-5代树枝状赖氨酸酯基或酰胺基阳离子、1-5代树枝状精氨酸酯基或酰胺基阳离子、1-5代树枝状组氨酸酯基或酰胺基阳离子、二乙烯三胺阳离子、三乙烯四胺阳离子、四乙烯五胺阳离子、肉碱或甜菜碱。
本发明中所述的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物，其所述分子连接结构片段(Y)选自下列的结构：1，2-乙二烷基、1，3-丙二烷基，1，4-丁二烷基、1，5-戊二烷基、1，6-己二烷基、1，7-庚二烷基、1，8-辛二烷基、1，9-壬二烷基、1，10-癸二烷基、1，4-环己二烷基或-(OCH2CH2)n-，其中n为1-30，优选n为1-10，更进一步推荐n选自1～6的自然数。
本发明中所述的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物的合成方法步骤是：
第一步：将带有二硫键的双氨基、双羟基化合物溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下加入到溶于有机溶剂中的4-硝基氯甲酸苯酚酯，于0-60℃反应0.5-50h后减压蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析得到含有二硫化学键的中间体。其中，碱、有二硫键的双氨、双羟基化合物
和4-硝基氯甲酸苯酚酯的摩尔比为0.05～0.1∶1.0∶1.0～1.5；所述的x是氧原子O、亚氨基NH；所述的碱是三乙胺、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。其通式如下式所示：
第二步：将上述二硫中间体加入到溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯中，于0-45℃反应0.5-30h后蒸馏除去有机溶剂，用有机溶剂柱层析得到同时具有二硫化学键和胆固醇骨架的二硫中间体。所述的二硫中间体和胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1∶1.0～1.8。其通式如下式所示：
第三步：将上述具有胆固醇的二硫中间体加入到溶于有机溶剂的氨基Boc(叔丁氧羰基)保护的阳离子砌块化合物中，于50-120℃搅拌反应3-24h后蒸馏除去有机溶剂，进一步柱层析后，将产物溶于过量酸中室温搅拌反应10-30h后，加入醚沉淀。过滤干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型两亲有机功能化合物。所述的具有胆固醇的二硫中间体和氨基叔丁氧羰基保护的阳离子砌块CFG化合物摩尔比为1.0∶1.0～1.5。其通式如下式所示：
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成制备方法，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯。
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成制备方法，所述合成制备步骤一中使用的碱包括二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7(DBU)、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成制备方法，所述合成制备步骤一、二、三中柱层析纯化过程使用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、及其按照不同配比它们的混合溶剂体系。
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成制备方法，所述合成步骤三中使用的酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、高氯酸、甲酸、磷酸、焦磷酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或三氟乙酸。
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成制备方法，所述合成步骤三中使用的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇单丁醚、乙二醇二丁醚、丙二醇丁醚、丙三醇单甲醚、丙三醇二甲醚、丙三醇三甲醚、二苯醚、缩水甘油醚或脂肪醇聚氧乙烯醚。
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成制备方法，所述合成步骤一中的反应温度，优选但不仅限于0-60℃，特别优选30-60℃；所述合成步骤二中的反应温度，优选但不仅限于0-45℃，特别优选30-45℃；所述合成步骤三中的反应温度，优选但不限于50-120℃，特别优选80-100℃。
根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物作为药物释放材料的用途，与已有研究报道相比(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，9682；Gene Ther.2001，8，855；Mol.Pharmaceutics.2008，5，128)，本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型有机功能化合物具有这样的优点：
(1)根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的合成方法简单且效率高，原料来源与天然产物及其衍生物，合成方法易推广实现低成本规模化制备，可工业生产性好。
(2)根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物具有良好的纯度和水溶性，其结构中的二硫键可提供良好的体内生物还原性，由二硫断裂成双巯基，可用作药物载体尤其是作为基因载体的生物材料，实现化合物在体内细胞环境中的响应性″智能化″降解，从而释放负载的药物、治疗基因等。
(3)根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物与已经商品化的枝化结构聚乙烯亚胺阳离子高分子转染试剂PEI-25k相比，具有明显较低的细胞毒性，在体外对COS-7细胞株转染具有与PEI-25K相当的较高基因转染效率。
(4)根据本发明中所提供的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的水溶性良好，具有较强的乳化能力，并且化合物的生物相容性良好，二硫键具有生物活性，除用作基因载体生物材料外，还可作为有效活性成份用于水剂化妆品的配方，也可作为特种功能表面活性剂用于乳剂型化妆品的制造换言之，可以用于制备基因载体生物药物或化妆品。
化合物毒性测试方法
本发明实施例中一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物的生物相容性(细胞毒性)评估采用MTT法，主要方法如下：将cos-7细胞以每孔6×103个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入培养基100μL(培养基：含有10％FBS的DMEM)，该96孔板于37℃和5％的CO2条件下孵育24小时后，加入不同浓度的同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物继续孵育48小时。然后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液孵育4小时，其后每孔加入100μL DMSO溶解生成的甲臢化合物，最后用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm处的吸光度值。本实验中以枝化PEI-25K为对比参照，评价根据本发明所提供的化合物的毒性。
化合物作为基因载体的eGFP转染试验方法
本发明实施例中一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1基因载体转染绿色荧光蛋白(eGFP)的荧光显微镜成像，主要方法如下：将cos-7细胞以每孔6×103个细胞的密度接种于96孔板中，其中每孔加入培养基100μL(培养基：含有10％FBS的DMEM)，该96孔板于37℃和5％的CO2条件下孵育24小时后，加入不同N/P比条件下的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物与绿色荧光蛋白基因(eGFP)复合物孵育48小时后，用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和成像，评价基因转染的效率。
附图说明
图1.本发明实施例1一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1与质粒DNA复合物以及上述体系加入10mM浓度DTT后的琼脂糖凝胶电泳对比图。结果表明在10mM浓度生物还原化合物DTT存在下一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1与质粒DNA复合物能够生物环境响应性降解并释放质粒DNA。
图2.本发明实施例1一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1的生物相容性(细胞毒性)评估。对照组为市售基因转染试剂分子量25000的枝化聚乙烯亚胺PEI-25K，从图中曲线可看出，同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1的细胞毒性远小于同等质量浓度的PEI-25K。
图3.本发明实施例1中一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1作为基因载体转染绿色荧光蛋白(eGFP)的荧光显微镜成像，左图明场下的COS-7细胞右图波长405nm的荧光激发下的COS-7细胞，可以看出有明显的绿色荧光，证明同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-1具有良好的基因转染活性。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。
实施例1
(1)化合物CS-1
第一步：将双(2-羟乙基)-二硫化合物(14g，90mmol)溶于200ml干燥的四氢呋喃中，在20ml三乙胺催化下缓慢滴加溶于50ml干燥四氢呋喃中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(12g，60mmol)，于0℃冰浴中反应30h后减压蒸馏除去四氢呋喃，经过柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v))，制备得到单羟基二硫化合物中间体，其产率为35％，主要化学结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：[M+]＝319.1m/z
第二步：将上述制备所得单羟基二硫化合物中间体(3.2g，10mmol)溶解于30ml干燥二氯甲烷中，然后缓慢滴加到事先溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯溶液中，于40℃搅拌反应25h后，蒸馏除去二氯甲烷溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))，制备得到新的同时具有胆固醇骨架和二硫化学键的中间体，其产率为60％，主要化学结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，中文命名(胆固醇))。
ESI-MS：[M+]＝731.1m/z
第三步：将第二步制备得到的同时具有胆固醇骨架和二硫化学键的中间体(7.3g，10mmol)缓慢滴加到事先溶解于50ml干燥1，4-二氧六环的3-二甲氨基丙胺中，于100℃下搅拌反应8h，蒸馏除去有机溶剂。然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×50ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml 0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤。其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂。上述制备产物再次溶于20ml三氟乙酸，室温下搅拌反应3h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离，干燥制备得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物CS-1，结构如式(2)所示，其产率为70％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.20(s，6H，N(CH3)2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝695.3m/z
实施例2
(2)化合物CS-2
第一步：将双(2-羟乙基)-二硫化合物(28g，180mmol)溶于500ml干燥的无水乙腈中，在10g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下缓慢滴加事先溶解于50ml干燥三氯甲烷中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(25g，60mmol)，于室温反应15h后减压蒸馏除去三氯甲烷，经过过柱层析(洗脱剂：二氯甲烷∶石油醚＝1∶1(v/v))纯化，得到含有二硫化学键的中间体，其产率为43％，主要化学结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：[M+]＝319.1m/z
第二步：将上一步骤制备所得二硫中间体(7g，13mmol)溶解于30ml干燥二氯甲烷中，进一步将其缓慢滴加到事先溶解于150ml干燥乙酸乙酯的胆固醇氯甲酸酯溶液中，在室温搅拌反应18h后，蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化，制备同时具有胆固醇骨架与二硫化学键的新中间体，其化学结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝731.1m/z
第三步：将上一步骤制备所得的中间体(7.3g，10mmol)缓慢滴加到事先溶解于50ml二甲基亚砜的20ml乙二胺中，于80℃下搅拌反应12h，蒸馏除去有机溶剂后，将残余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×50ml的乙酸乙酯萃取合并有机相，进一步用200ml 0.1M氢氧化钠水溶液洗涤，再用100ml饱和食盐水洗涤。洗涤后产物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去残留有机溶剂，然后溶于20ml氢溴酸中，室温搅拌反应5h后加入100ml乙醚沉淀，过滤分离干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-2，其化学结构如式(3)所示，主要化学结构特征如下。
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NH3+CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝653.3m/z
实施例3
(3)化合物CS-3
第一步：将双(2-羟乙基)-二硫化合物(28g，180mmol)溶于500ml干燥的无水乙腈中，在10g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下，缓慢滴加事先溶于50ml干燥三氯甲烷中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(25g，60mmol)，于室温反应15h后，减压蒸馏除去三氯甲烷，经过柱层析(洗脱剂：二氯甲烷∶石油醚＝1∶1(v/v))分离纯化，制备得到含有二硫化学键的中间体，其产率为43％，主要化学结构特征为：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：[M+]＝319.1m/z
第二步：将上一步骤制备所得的二硫化合物中间体(7g，13mmol)溶解于30ml的干燥二氯甲烷，进一步将其缓慢滴加到事先溶于150ml干燥乙酸乙酯的胆固醇氯甲酸酯溶液中，于室温搅拌反应18h后，蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化，制备得到同时具有胆固醇骨架和二硫化学键的中间体，其主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝731.1m/z
第三步：将步骤二制备所得的中间体(7.3g，10mmol)缓慢滴加到事先溶于50ml二甲基亚砜的20mlBOC-L-精氨单酰乙二胺中，于80℃搅拌反应12h，蒸馏除去有机溶剂，然后将残余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×50ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相，用200ml 0.1M氢氧化钠溶液洗涤，再用100ml饱和食盐水洗涤，其后用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去残留有机溶剂。将产物溶于10ml硫酸中，室温下搅拌反应5h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物CS-3，其分子化学结构如式(4)所示，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.6(m，1H，NH3+CHCO)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NH3+CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝809.5m/z
实施例4
(4)化合物CS-4
第一步：将胱胺(14g，90mmol)盐酸盐悬浮于200ml干燥的四氢呋喃中，在30ml三乙胺催化下，缓慢滴加事先溶解于50ml干燥的四氢呋喃中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(12g，60mmol)，于0℃冰浴中反应26h后减压蒸馏除去四氢呋喃。经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v))分离纯化，制备得到具有二硫化学键结构的中间体，其产率为20％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：[M+]＝317.2m/z
第二步：将上述步骤一中所得中间体(3.2g，10mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，进一步缓慢滴加到事先溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应25h，然后蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：二氯甲烷∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化，制备得到同时具有胆固醇骨架和二硫化学键的中间体，其产率为65％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：729.1m/z
第三步：将上述步骤二中制备的中间体(7.4g，10mmol)缓慢滴加到溶于50ml干燥二甲基亚砜的20ml乙二胺中，于80℃搅拌反应12h，蒸馏除去有机溶剂后将残余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×50ml的乙酸乙酯萃取。合并萃取的有机相，先用200ml 0.1M氢氧化钠溶液洗涤，再用100ml饱和食盐水洗涤，然后在无水碳酸钾存在下干燥5小时后，蒸馏除去有机溶剂。将所得产物再溶于15ml高氯酸中，室温搅拌反应5h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离、干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物CS-4，其化学结构如式(5)所示，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NH3+CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝651.3m/z
实施例5
(5)化合物CS-5
第一步：将胱胺(14g，90mmol)盐酸盐悬浮于200ml干燥的四氢呋喃中，在30ml三乙胺催化下，缓慢滴加事先溶解于50ml干燥四氢呋喃中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(12g，60mmol)，于0℃冰浴中反应26h，然后减压蒸馏除去四氢呋喃，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v))分离纯化得到具有二硫键的中间体，其产率为20％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：319.1m/z
第二步：将上述步骤一中制备所得的中间体(3.2g，10mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，进一步缓慢滴加到事先溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应25h后，蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化制备得到同时具有二硫键和胆固醇胆固醇骨架的中间体，其产率为60％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：729.1m/z
第三步：将上述步骤二中制备所得的中间体(7.4g，10mmol)缓慢滴加到事先溶解于50ml二氯甲烷中的5g(15mmol)Boc-G2-树枝状赖氨酰-2-氨基乙醇中，于100℃搅拌反应20h，蒸馏除去有机溶剂后，将残余物倒入200ml蒸馏水中用3×50ml的乙酸乙酯萃取。然后合并有机相，顺序用300ml 0.1M氢氧化钠溶液洗涤、用200ml饱和食盐水洗涤，在无水碳酸钾存在下干燥5小时后，蒸馏除去有机溶剂。所得产物溶于10ml三氟乙酸，室温搅拌反应10h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离、干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-5，其结构式如式(6)所示，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NH3+CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝996.7m/z
实施例6
(6)化合物CS-6
第一步：将胱胺(14g，90mmol)盐酸盐悬浮于200ml干燥的四氢呋喃中，在30ml三乙胺催化下，缓慢滴加事先溶解于50ml干燥四氢呋喃中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(12g，60mmol)，于0℃冰浴中反应19h，然后减压蒸馏除去四氢呋喃，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v))分离纯化得到具有二硫键的中间体，其产率为20％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：319.1m/z
第二步：将上述步骤一中制备所得的中间体(3.2g，10mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，进一步缓慢滴加到事先溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应25h后，蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化制备得到同时具有二硫键和胆固醇胆固醇骨架的中间体，其产率为60％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：729.1m/z
第三步：将上述步骤二中制备所得的中间体(7.4g，10mmol)缓慢滴加到事先溶解于50ml二氯甲烷中的5g(15mmol)二乙撑氧基甜菜碱中，于100℃搅拌反应20h，蒸馏除去有机溶剂后，将残余物倒入200ml蒸馏水中用3×50ml的乙酸乙酯萃取。然后合并有机相，顺序用300ml 0.1M氢氧化钠溶液洗涤、用200ml饱和食盐水洗涤，在无水碳酸钾存在下干燥5小时后，蒸馏除去有机溶剂。所得产物溶于10ml三氟乙酸，室温搅拌反应10h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离、干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-6，其结构式如式(6)所示，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.54(t，6H，J＝5.1Hz，OCH2CH2O)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，3.3(S，9H，N+(CH3)3)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NH3+CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝796.7m/z
实施例7
(7)化合物CS-7
第一步：将胱胺(14g，90mmol)盐酸盐悬浮于200ml干燥的四氢呋喃中，在30ml三乙胺催化下，缓慢滴加事先溶解于50ml干燥四氢呋喃中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(12g，60mmol)，于0℃冰浴中反应26h，然后减压蒸馏除去四氢呋喃，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v))分离纯化得到具有二硫键的中间体，其产率为20％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：319.1m/z
第二步：将上述步骤一中制备所得的中间体(3.2g，10mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，进一步缓慢滴加到事先溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应25h后，蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化制备得到同时具有二硫键和胆固醇胆固醇骨架的中间体，其产率为60％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：729.1m/z
第三步：将上述步骤二中制备所得的中间体(7.4g，10mmol)缓慢滴加到事先溶解于50ml二氯甲烷中的6.6g(15mmol)1-乙撑氨基-Boc3-二乙烯三胺中，于100℃搅拌反应20h，蒸馏除去有机溶剂后，将残余物倒入200ml蒸馏水中用3×50ml的乙酸乙酯萃取。然后合并有机相，顺序用300ml 0.1M氢氧化钠溶液洗涤、用200ml饱和食盐水洗涤，在无水碳酸钾存在下干燥5小时后，蒸馏除去有机溶剂。所得产物溶于10ml三氟乙酸，室温搅拌反应10h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离、干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-5，其结构式如式(6)所示，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.9(m，12H，N+CH2CH2N+)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NH3 +CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝739.5m/z
实施例8
(8)化合物CS-8
第一步：将胱胺(14g，90mmol)盐酸盐悬浮于200ml干燥的四氢呋喃中，在30ml三乙胺催化下，缓慢滴加事先溶解于50ml干燥四氢呋喃中的4-硝基氯甲酸苯酚酯(12g，60mmol)，于0℃冰浴中反应26h，然后减压蒸馏除去四氢呋喃，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v))分离纯化得到具有二硫键的中间体，其产率为20％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：8.27(m，2H，ArH)，7.37(m，2H，ArH)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.91(t，2H，J＝6.6Hz，CH2OH)，3.03(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)，2.89(t，2H，J＝5.7Hz，CH2S)。
ESI-MS：319.1m/z
第二步：将上述步骤一中制备所得的中间体(3.2g，10mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，进一步缓慢滴加到事先溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应25h后，蒸馏除去有机溶剂，经过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v))分离纯化制备得到同时具有二硫键和胆固醇胆固醇骨架的中间体，其产率为60％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)8.27(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，7.37(m，2H，ArH，J＝9.3Hz)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.99(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：729.1m/z
第三步：将上述步骤二中制备所得的中间体(7.4g，10mmol)缓慢滴加到事先溶解于50ml二氯甲烷中的5g(15mmol)Boc-赖氨单酰-1，6-己二胺中，于100℃搅拌反应20h，蒸馏除去有机溶剂后，将残余物倒入200ml蒸馏水中用3×50ml的乙酸乙酯萃取。然后合并有机相，顺序用300ml 0.1M氢氧化钠溶液洗涤、用200ml饱和食盐水洗涤，在无水碳酸钾存在下干燥5小时后，蒸馏除去有机溶剂。所得产物溶于10ml三氟乙酸，室温搅拌反应10h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离、干燥得到一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的功能化合物CS-5，其结构式如式(6)所示，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.56(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，4.34(t，2H，J＝6.3Hz，CH2OCO)，3.09(t，2H，J＝6.3Hz，CH2S)，2.97(t，2H，J＝5.1Hz，CH2S)，2.30(t，2H，NHCH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝822.6m/z
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。
Claims (2)
1.一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型有机功能化合物，其具有以下化学结构：
上式中，CFG+选自氨基阳离子-NH3 +、二甲氨基阳离子-NH(CH3)2 +；Y表示分子连接结构片段，选自下列的一种-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-或-(CH2)10-；X1为亚氨基-NH-；X2、X3表示氧-O-；A-选自三氟乙酸根离子。
2.一种如权利要求1所述的一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的阳离子型有机功能化合物用于制备基因药物的载体。
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| Fuxing Tang, et al.Use of Dithiodiglycolic Acid as a Tether for Cationic Lipids Decreases the Cytotoxicity and Increases Transgene Expression of Plasmid DNA in Vitro.《Bioconjugate Chem.》.1999,第10卷(第5期),791-796. * |
| Molinda D. Kearns, et al.Structure-Transfection Activity Studies of Novel Cationic Cholesterol-Based Amphiphiles.《MOLECULAR PHARMACEUTICS》.2007,第5卷(第1期),128–139. * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20130925 Termination date: 20190521 |