CN102161688B - 一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体、制备方法及其用途。系采用点击化学偶联反应方法合成的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，方法简便、高效、易操作，并且偶联反应的起始原料，如疏水性胆固醇炔基化合物以及作为阳离子模块的叠氮功能化合物易于模块化设计和制备。同时，本发明获得的脂质体分子具有两亲性、低细胞毒性、良好生物相容性等优点，能够在缓冲液中高效结合基因形成稳定的复合体，并通过活细胞内转染，高效表达目标蛋白或释放出包裹的模型药物。不仅可以作为低毒、高效的基因和药物缓释载体生物材料应用，也可以作为一种高效、低毒阳离子型功能表面活性剂在日用化工、个人护理用品等工业领域应用。
Description
技术领域
本发明涉及面向有机生物功能材料的制备方法与生物医药应用领域，特别涉及到一种含有天然胆固醇化学结构片段的生物相容性合成脂质体、制备方法及其在制备药物缓释载体和功能表面活性剂的应用。
技术背景
近十几年来，用于药物和治疗功能基因输送的载体生物材料(Biomaterials)已成为生命科学和材料科学等交叉学科领域中最为热门的研究课题之一。其可将负载的药物和外源治疗基因输送到生物体内的特定细胞、组织或器官，发挥靶向治疗作用。目前，国内外正在研究的基因载体材料大多属于两亲阳离子有机分子(脂质体、类脂质体)或者聚电解质高分子，其作用原理是借助功能阳离子分子携带的正电荷与负电性的治疗基因(DNA、RNAi)通过静电相互作用，形成结构与形态稳定的复合体(complex)，保护复合体中DNA或RNAi链在体内长时间血液循环中不易被核酸酶特异性降解，同时防止复合体团聚形成更大尺寸的聚集体，实现治疗用基因药物高效率输送与细胞内重组转染表达。因此，作为药物或基因输送的生物载体既要满足自身的低毒性、无免疫原性、体内可降解吸收，还需要能够与治疗用外源基因DNA或RNAi有效地复合形成一定纳米尺度聚集体(通常在50-400nm)，具有血液长循环周期，减少器官的选择性滤出和与血液成份的非特异性相互作用。一般情况下，为了实现阳离子分子载体和基因间有较强的结合能力(BindingAffinity)，需要保证载体分子有较高的电荷密度。然而，现有的大量研究已经发现有机功能分子(脂质体、类脂质体)或者聚电解质高分子中阳离子片段分子量越大，在提高电荷密度的同时，其作为药物或基因输送载体应用时的细胞毒性显著增大，不能满足临床基因治疗的实际应用要求。因此，运用分子工程手段，研发具有低分子量的阳离子片段，并且能够和外源治疗基因高效复合负载的新型生物医用材料是发展低细胞毒性、高效率基因治疗生物载体的重要方向。
胆固醇类化合物是一类具有重要生物功能的天然甾族化合物，在动物体内多种脂质如低密度脂蛋白(LDL)中广泛存在，具有较强的疏水性和良好的生物相容性，因此基于天然产物胆固醇类化合物的骨架结构，通过进一步化学修饰水溶性阳离子片段后，形成两亲性类脂质体功能分子，将有可能同时具有较低细胞毒性和水溶性，是一类潜在的新型生物相容性基因载体材料与生物相容性表面活性剂。最近几年来，国内外已经报道了一些由胆固醇衍生的两亲性阳离子功能分子，如双子结构的胆固醇阳离子脂质体(J Med Chem 2008，51，2533-2540)、胆固醇取代胺类(Int.J.Pharm.2004，278，143)等，这些阳离子功能分子已经在构建药物和功能基因载体中得到初步研究。此外，一些基于胆固醇的阳离子功能分子已经表现出了良好的药物控释和基因转染效果。为了提高载体复合物的细胞内吞、摄入能力，人们又进一步相继合成了核苷酸、氯喹修饰的胆固醇类阳离子功能分子。中国专利申请201010182428.4报道了一种同时具有脂溶性胆固醇骨架和功能阳离子片段以及生物还原响应性二硫化学键的新型有机功能化合物，发现该种功能分子作为基因载体具有体内生物响应性和较高的基因转导效率，并为其作为生物相容性表面活性剂的应用提供了新的可能。然而，总体上国内外基于天然产物(如胆固醇、萜、胆酸类、生物碱、单糖与多糖类)的两亲阳离子有机分子与功能高分子的研究与应用开发的报道较少。另一方面，面向药物或者治疗基因药物的载体实际应用要求，现有已经报道的基于胆固醇结构的基因载体功能分子普遍存在合成步骤繁琐，产率较低、制备成本等现实问题。因此，基于上述考虑，有必要发展新型高效率、反应条件温和、易操容易、结构高度模块化的胆固醇类功能阳离子分子的制备方法，为大量低成本合成制备基于胆固醇类天然产物并且具有化学结构多样性的新型生物相容性阳离子功能分子提供可能，促进其作为生物载体功能材料和生物相容性表面活性剂的应用，这也是本发明所致力解决的目标。
发明的内容
本发明的要解决的问题之一在于提供提供一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体。
本发明要解决的问题之二在于提供一种含有胆固醇结构片段的合成脂质体的合成方法，运用点击化学合成方法(Click Chemistry)，高效偶联制备得到所述的一种含有胆固醇结构片段的合成脂质体。
本发明要解决的问题之三是提供一种上述含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的应用，可以作为药物或基因的载体材料以及生物相容性表面活性剂的用途。
依据本发明所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，其结构式(Ⅰ)可以表示如下：
上式中，CFG+表示水溶性阳离子功能砌块，如阳离子氨基、阳离子天然氨基酸酯基或酰胺基、阳离子树枝状氨基酸酯基或酰胺基、阳离子多胺、天然季胺碱等；Linker 1和2表示脂质体分子结构中链接片段；X，Y表示氧(-O-)、氮(-NH-)、硫(-S-)、碳酸酯(-OCO-)，它们可是相同原子，也可以是不同原子；A-表示阴离子反离子部分，包括氯负离子、溴负离子、碘负离子、硫酸根负离子、硝酸根负离子、高氯酸根负离子、甲酸根负离子、磷酸根负离子、焦磷酸根负离子、柠檬酸根负离子或三氟乙酸根负离子(TFA-)。
本发明中所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性脂质体分子中，所述的阳离子砌块(CFG)选自下列的结构：如氨基阳离子-NH3 +、二甲氨基阳离子-NH(CH3)2+、赖氨酸酯基或酰胺基阳离子、精氨酸酯基或酰胺基阳离子、组氨酸酯基或酰胺基阳离子、1-5代树枝状赖氨酸、精氨酸、组氨酸酯基或酰胺基阳离子、二乙烯三胺阳离子、三乙烯四胺阳离子或四乙烯五胺阳离子等。
所述结构式(I)中的Linker 1和2分别选自下列二取代烷基链或二取代烷氧基链的一种：1，2-乙二烷基、1，3-丙二烷基，1，4-丁二烷基、1，5-戊二烷基、1，6-己二烷基、1，7-庚二烷基、1，8-辛二烷基、1，9-壬二烷基、1，10-癸二烷基、一缩二乙二醇、二缩三乙二醇、三缩四乙二醇、四缩五乙二醇、单甲基一缩二乙二醇、单甲基二缩三乙二醇、单甲基三缩四乙二醇、单甲基四缩五乙二醇、它们可是相同片段，也可以是不同片段。
依据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，主要由以下三步骤组成：
第一步骤：将胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下加入到溶于有机溶剂中的末端炔基醇或胺中，在0-60℃下反应0.5-20h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后用醇沉淀得到具有末端炔基化学结构的胆固醇中间体，其化学结构式如式(Ⅱ)所示：
第二步骤：将末端溴代的氨基Boc保护的CFG化合物溶于有机溶剂中，加入叠氮化钠于0-80℃反应10-40h后，蒸馏除去有机溶剂，得到具有末端叠氮基团(-N3)的中间体，其化学结构如式(Ⅲ)所示：
第三步骤：将步骤一所得的具有端炔基的胆固醇中间体(Ⅱ)溶于有机溶剂中，然后加入步骤二制备所得的具有末端叠氮基团的中间体(Ⅲ)，继续加入一定量的铜催化剂后，于50-120℃搅拌反应0.5-3h后蒸馏除去有机溶剂，进一步快速柱层析，将产物溶于过量酸中室温搅拌反应1-3h后，然后加入醚沉淀。最终过滤干燥得到一种如结构式(I)所示的含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体。
依据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，步骤一、二、三中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、水、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤一中使用的碱包括二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7(DBU)、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤一中使用的末端炔基醇或胺包括丙炔醇、丁炔醇、戊炔醇、己炔醇、庚炔醇、辛炔醇、丙炔胺、丁炔胺、戊炔胺、己炔胺、庚炔胺、辛炔胺或十二炔基胺。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤二中使用的末端溴代的Boc-CFG或CFG化合物包括3-溴代-BOC-丙胺、4-溴代-BOC-丁胺、5-溴代-BOC-戊胺、6-溴代-BOC-己胺、m-溴代-BOC-赖氨酸，精氨酸，组氨酸酯或酰胺、m-溴代-BOC-G(1-5)-树枝状赖氨酸，精氨酸，组氨酸酯或酰胺、m-溴代烷氧基-BOC-二乙烯三胺、m-溴代烷氧基-BOC-三乙烯四胺阳离子、m-溴代烷氧基-BOC-四乙烯五胺阳离子，其中上述的m为1-10的自然数。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的方法中，所述合成步骤三中柱层析纯化过程使用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、及其按照不同配比它们的混合溶剂体系。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤三中使用的酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、高氯酸、甲酸、磷酸、焦磷酸、柠檬酸或三氟乙酸。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤三中使用的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇单丁醚、乙二醇二丁醚、丙二醇丁醚、丙三醇单甲醚、丙三醇二甲醚、丙三醇三甲醚、二苯醚、缩水甘油醚或脂肪醇聚氧乙烯醚。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤三中的铜催化剂为二价铜盐与有机还原剂复合体系，或者是一价铜盐与有机配体复合体系；二价铜盐包括氯化铜、溴化铜、硫酸铜、磷酸铜、甲酸铜、乙酸铜、氢氧化铜或柠檬酸铜；有机还原剂包括抗坏血酸、抗坏血酸钠、葡萄糖、草酸、乙烯醇、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊二醛或香草醛；一价铜盐包括氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜或氢氧化亚铜；有机配体包括乙二胺、丙二胺、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、N，N，N，N，N-五甲基二乙烯三胺、2，2′-联吡啶或聚乙烯亚胺。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，所述合成步骤一中的反应温度，优选但不仅限于0-60℃，特别优选30-60℃；所述合成步骤二中的反应温度，优选但不仅限于0-45℃，特别优选30-45℃；所述合成步骤三中的反应温度，优选但不限于50-120℃，特别优选60-100℃。
其中，Boc表示叔丁氧羰基，CFG表示阳离子功能砌块；Linker 1和2如前所述。
根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，与已有研究报道相比(Mol.Pharmaceutics.2008，5，128；)，本发明中所提供的一种含有胆固醇片段的生物相容性合成脂质体分子具有这样的优点：
(1)根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体可应用点击化学偶联法(Click Chemistry)制备得到，合成方法简单、效率高，分子结构主体片段来源于天然产物胆固醇，其余分子结构来源于可工业级大量制备的天然产物和有机合成原料，合成方法易推广实现低成本规模化制备，可工业生产性好。
(2)根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体具有良好的纯度和水溶性，可用作药物载体尤其是作为基因载体的生物功能材料，其在体内细胞环境中降解后可释放出负载的治疗药物或基因等。
(3)根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体与已经商品化的枝化结构聚乙烯亚胺阳离子高分子转染试剂bPEI-25k相比，具有明显优越的生物相容性。
(4)根据本发明中所提供的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，具有较强的乳化能力，并且生物相容性良好，可作为生物相容性特种功能表面活性剂，如作为表面活性剂用于化妆品以及个人护理用品的生产制造。
附图说明
图1.本发明实施例1、3中所述的合成脂质体(Click-1，Click-3)的荧光素酶转染效率评价结果。
图2.本发明实施例1、3中所述的合成脂质体分子(Click-1，Click-3)作为基因载体转染绿色荧光蛋白(eGFP)的荧光显微成像结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。
合成脂质体作为基因载体的荧光素酶转染效率评价方法
本发明实施例1、3中所述一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体(Click-1、Click-3)作为基因载体的转染效率评价，采用荧光素酶报告基因分析试剂盒(Luciferase pDNA assay kit)检测法，主要方法如下：将人肝癌细胞株SMMC-7721细胞以每孔5×103细胞的密度接种于24孔培养板中，其中每孔加入培养基500μL(培养基：含有10％FBS血清的DMEM)，该24孔板于37℃和5％的CO2条件下孵育24小时后弃去培养基，每孔重新加入500μL不含血清的DMEM培养基，随后再加入按照不同N/P设计摩尔比所需要质量的合成脂质体(Click-1或Click-3)，与中文命名(Luciferase pDNA)结合形成脂质复合物，并继续孵育24小时。然后，在每孔中加入荧光素酶分析试剂盒的细胞裂解液200μl(中文命名(Promega)，USA)进行裂解，移取50μL裂解液加入20μL荧光素酶分析试剂盒中所带底物混合，最后用Glomax 20/20化学发光测定仪(Promega，USA)测定混合液的化学发光值。本实验中以枝化bPEI-25K为对比参照载体，评价根据本发明所提供的脂质体的基因转染效率。
合成脂质体作为基因载体的绿色荧光蛋白转染效率评价实验方法
本发明实施例1、3中所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体(Click-1或者Click-3)作为基因载体转染效率，同时采用绿色荧光蛋白(eGFP)的质粒DNA为评价工具，通过GFP蛋白的荧光显微镜成像法进行基因转染效率评价，其主要方法如下：将人肝癌细胞株SMMC-7721细胞以每孔6×103个细胞的密度接种于12孔板中，其中每孔加入培养基500μL(培养基：含有10％FBS的DMEM)，该12孔板于37℃和5％的CO2条件下孵育24小时后，在不同N/P比条件下加入合成脂质体分子(Click-1或Click-3)，与绿色荧光蛋白质粒DNA复合后，孵育48小时，采用用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和显微成像。本实验中以枝化bPEI-25K为参比基因转染载体，评价根据本发明所提供的脂质体作为载体的基因转染效率。
实施例1
先将丙炔醇(60g，1mol)溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml三乙胺催化下缓慢滴加溶于50ml干燥四氢呋喃中的胆固醇氯甲酸酯(43.4g，1mol)，于0℃冰浴中反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇碳酸丙炔醇酯中间体，产率为88％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.90(s，2H，CH2OCO)，2.53(m，1H，-C≡CH)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝468.3m/z
将3-溴-BOC-丙胺(24g，0.1mol)溶解于30ml二氧六环中，然后缓慢滴加入事先溶于20ml乙醇的叠氮化钠(13g，0.2mol)溶液中，于40℃搅拌反应25h后，倒入1000ml水中，用3×500ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-BOC-丙胺中间体，产率为80％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：2.99(t，2H，NHCH2)，1.60(m，2H，CH2)，1.40(s，9H，CH3(Boc))，1.35(m，2H，-CH2N3)。
ESI-MS：[M+]＝200.1m/z
在上述两步骤所得中间体的基础上，继续将第二步制备得到的3-叠氮-BOC-丙胺中间体(2.4g，0.012mol)与第一步制备得到的胆固醇碳酸丙炔醇酯(4.5g，0.01mol)混合溶解于100ml干燥的1，4-二氧六环中，加入铜催化剂(氯化铜2.5g/抗坏血酸2.5g)于80℃下搅拌反应1h，蒸馏除去有机溶剂。然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×100ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤。其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂。上述制备产物再次溶于20ml三氟乙酸，室温下搅拌反应2h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-1，结构如式(IV)所示，产率为68％，其结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：7.26(s，lH，＝N-N＝CH-)，5.42(s，2H，-CH2OCO-)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，3.73(t，2H，＝N-N-CH2-)，3.33(t，2H，NH3 +CH2-)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝569.4m/z
实施例2
先将4-戊炔-1-醇(98g，1mol)溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml吡啶催化下缓慢滴加溶于50ml干燥甲苯中的胆固醇对甲苯磺酸酯(52.6g，1mol)，于80℃反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇戊炔醇醚中间体，产率为38％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：5.33(s，1H，C＝CH，胆固醇)，3.61(s，2H，CH2O)，2.53(m，1H，C≡CH)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝452.3m/z
将3-溴-BOC-丙胺(24g，0.1mol)溶解于30ml二甲基亚砜中，然后缓慢滴加事先溶于20ml蒸馏水的叠氮化钠(26g，0.4mol)溶液中，于室温搅拌反应48h后，倒入1000ml水中，用3×500ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-BOC-丙胺中间体，产率为72％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：2.99(t，2H，NHCH2)，1.60(m，2H，CH2)，1.40(s，9H，CH3(Boc))，1.35(m，2H，-CH2N3)。
ESI-MS：[M+]＝200.1m/z
在上述两步骤所得中间体的基础上，继续将第二步制备得到的3-叠氮-BOC-丙胺中间体(2.4g，0.012mol)与第一步制备得到的胆固醇戊炔醇醚中间体(4.5g，0.01mol)混合溶解于100ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入铜催化剂(硫酸铜2.5g/抗坏血酸5g)于50℃下搅拌反应2h，蒸馏除去有机溶剂。然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×200ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml 0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤。其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂。上述制备产物再次溶于15ml三氟乙酸，室温下搅拌反应3h后，加入50ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-2，结构如式V所示，产率为65％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：7.26(s，1H，＝N-N＝CH-)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，3.73(t，2H，CH2N＝N-)，3.38(t，2H，-CH2O-)，3.33(t，2H，NH3 +CH2-)，2.73(-N-C＝C-CH2)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝553.4m/z
实施例3
先将丙炔醇(60g，1mol)溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml三乙胺催化下缓慢滴加溶于50ml干燥四氢呋喃中的胆固醇氯甲酸酯(43.4g，1mol)，于0℃冰浴中反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇碳酸丙炔醇酯中间体，产率为88％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.90(s，2H，CH2OCO)，2.53(m，1H，C≡CH)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝468.3m/z
将3-溴-1-BOC-赖氨酰丙胺(4g，0.01mol)溶解于50ml N，N-二甲基甲酰胺中，然后缓慢滴加事先溶于10ml蒸馏水的叠氮化钠(2.6g，0.4mol)溶液中，于70℃搅拌反应24h后，倒入100ml水中，用3×50ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-1-BOC-赖氨酰丙胺中间体，产率为62％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：4.53(m，1H，-CHNHBoc)，3.20(t，2H，-CONHCH2-)，2.99(t，2H，BocNHCH2)，1.40(s，18H，CH3)，1.33(t，2H，CH2N3)，1.22-1.80(m，8H，CH2)。
ESI-MS：[M+]＝428.2m/z
在上述两步骤所得中间体的基础上，继续将第二步制备得到的3-叠氮-1-BOC-赖氨酰丙胺中间体(4.3g，0.01mol)与第一步制备得到的胆固醇碳酸丙炔醇酯中间体(4.7g，0.01mol)混合溶解于100ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入铜催化剂(溴化亚铜2g/二乙烯三胺3g)于80℃下搅拌反应2h，蒸馏除去有机溶剂。然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×200ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml 0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤。其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂。上述制备产物再次溶于20ml三氟乙酸，室温下搅拌反应2h后，加入50ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-3，结构如式(VI)所示，产率为55％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：7.26(s，1H，＝N-N＝CH-)，5.42(s，2H，-CH2OCO-)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.53(m，1H，-CHNHBoc)，3.73(t，2H，CH2N＝N-)，3.38(t，2H，NH3 +CH2-)，3.20(t，2H，-CONHCH2-)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝698.5m/z
实施例1和3中所述的合成脂质体(Click-1，Click-3)的荧光素酶转染效率评价结果列于附图1中。
该评价结果是以本发明实施例1、3中所述的合成脂质体Click-1，Click-3为基因载体，在一定的N/P摩尔比例下(N/P＝10，N/P＝20)，以荧光素酶基因作为报告基因，对人肝癌细胞株SMMC-7721转染效率评价。对照组为市售基因转染试剂分子量25，000的枝化聚乙烯亚胺bPEI-25K。从图中曲线可看出，含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体(Click-1，Click-3)作为基因载体，在人肝癌细胞株SMMC-7721中具有较好的基因转染性能。
实施例1、3中所述的合成脂质体分子(Click-1，Click-3)作为基因载体转染绿色荧光蛋白(eGFP)的荧光显微成像结果列于图2中。
该结果是以本发明实施例1、3中所述的合成脂质体分子Click-1，Click-3作为基因载体，在一定的N/P摩尔比例下，以绿色荧光蛋白(eGFP)质粒为报告基因，对人肝癌细胞株SMMC-7721转染后荧光显微镜成像(对照组为市售转染试剂bPEI-25k).(a).市售转染试剂bPEI-25k，N/P＝10；(b).Click-1，N/P＝10；(c).Click-3，N/P＝10。左图为明场下的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞，右图为波长405nm的荧光激发下的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞，可以观察到明显的绿色荧光蛋白激发后产生的荧光，证明该类含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体(Click-1，Click-3)作为载体具有良好的活细胞基因转染效率。
实施例4
先将4-戊炔-1-硫醇(10.3g，0.1mol)溶于50ml干燥的三氯甲烷中，在2.0g二甲氨基吡啶催化下缓慢滴加溶于50ml干燥四氢呋喃中的胆固醇对甲苯磺酸酯(7.8g，1.5mol)，于50℃反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇戊炔硫醇醚中间体，产率为34％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，2.44(t，2H，-CH2S-2.03(t，2H，≡C-CH2)，1.82(m，1H，C≡CH)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝468.4m/z
将3-溴-1-BOC-组氨酰丙胺(4g，0.01mol)溶解于50mlN，N-二甲基甲酰胺中，然后缓慢滴加事先溶于10ml蒸馏水的叠氮化钠(2.6g，0.4mol)溶液中，于70℃搅拌反应24h后，倒入100ml水中，用3×50ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-1-BOC-组氨酰丙胺中间体，产率为75％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：7.4(s，1H，组氨酸)，6.80(s，1H，组氨酸)，5.53(m，1H，-CHNHBoc)，3.20(t，2H，-CONHCH2-)，2.05(m，2H，-CH2-)，1.40(s，18H，CH3)，1.33(t，2H，CH2N3)。
ESI-MS：[M+]＝423.2m/z
在上述两步骤所得中间体的基础上，继续将第二步制备得到的3-叠氮-1-BOC-组氨酰丙胺中间体(4.3g，0.01mol)与第一步制备得到的胆固醇戊炔硫醇醚中间体(4.7g，0.01mol)混合溶解于100ml干燥的二甲基亚砜中，加入铜催化剂(碘化亚铜2g/N，N，N，N，N-二乙烯三胺4g)于70℃下搅拌反应2h，蒸馏除去有机溶剂。然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×200ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml 0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤。其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂。上述制备产物再次溶于20ml三氟乙酸，室温下搅拌反应2h后，加入50ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-4，其结构如式(Ⅶ)所示，产率为66％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：7.4(s，1H，组氨酸)，6.80(s，1H，组氨酸)，7.26(s，1H，＝N-N＝CH-)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，5.63(m，1H，-CHNHBoc)，3.73(t，2H，-CH2N＝N-)，3.20(t，2H，-CONHCH2-)，2.55(-N-C＝C-CH2)，2.44(t，2H，-CH2S-)，2.10-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝693.5m/z
实施例5
先将4-戊炔-1-醇(98g，1mol)溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml吡啶催化下缓慢滴加溶于50ml干燥甲苯中的胆固醇对甲苯磺酸酯(52.6g，1mol)，于80℃反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇戊炔醇醚中间体，产率为38％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：5.33(s，1H，C＝CH，胆固醇)，3.61(s，2H，CH2O)，2.53(m，1H，C≡CH)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝452.3m/z
将3-溴-1-BOC-G(2)-赖氨酰丙酯(8g，0.01mol)溶解于50ml二甲基亚砜中，然后缓慢滴加事先溶于10ml丙醇的叠氮化钠(2.6g，0.04mol)溶液中，于60℃搅拌反应18h后，倒入100ml水中，用3×100ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-1-BOC-G(2)-赖氨酰丙酯中间体，产率为42％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：4.53(m，3H，-CHNHBoc)，3.30(t，2H，-COOCH2-)，3.20(t，2H，-CONHCH2-)，2.96(t，4H，BocNHCH2)，1.22-1.80(m，20H，CH2)，1.33(t，2H，CH2N3)，1.40(s，36H，CH3)。
ESI-MS：[M+]＝802.5m/z
在上述两步骤所得中间体的基础上，继续将第二步制备得到的3-叠氮-1-BOC-G(2)赖氨酰丙酯中间体(8.1g，0.01mol)与第一步制备得到的胆固醇戊炔醇醚中间体(4.5g，0.01mol)混合溶解于100ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入铜催化剂(溴化亚铜2g/抗坏血酸钠3g)于60℃下搅拌反应1h，蒸馏除去有机溶剂。然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×100ml的二氯甲烷萃取，合并有机相后用100ml 0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤。其后洗涤物用无水碳酸钾干燥2小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂。上述制备产物再次溶于20ml盐酸/20ml四氢呋喃混合溶剂，室温下搅拌反应2h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-5，其结构如式(Ⅷ)所示，产率为58％，主要结构特征如下：
1H NMR(CDCl3，300MHz)：7.26(s，1H，＝N-N＝CH-)，5.42(s，2H，-CH2OCO-)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.53(m，3H，-CHNHBoc)，4.08(t，2H，-COOCH2)，3.73(t，2H，CH2N＝N-)，3.37(t，2H，-CH2O-)，3.20(t，2H，-CONHCH2-)，2.55(-N-C＝C-CH2)，2.40-0.95(m，65H，-CH2-，胆固醇)。
ESI-MS：[M+]＝698.5m/z
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。
Claims (9)
1.一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，其具有如下结构式：
2.一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，其具有如下结构式：
3.一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，其具有如下结构式：
4.一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体，其具有如下结构式：
5.一种如权利要求1所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，其特征是由下述步骤获得：
第一步骤：将1mol丙炔醇溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml三乙胺催化下缓慢滴加溶于50ml干燥四氢呋喃中的1mol胆固醇氯甲酸酯，于0℃冰浴中反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇碳酸丙炔醇酯中间体；
第二步骤：将0.1mol3-溴-BOC-丙胺溶解于30ml二氧六环中，然后缓慢滴加入事先溶于20ml乙醇的0.2mol叠氮化钠溶液中，于40℃搅拌反应25h后，倒入1000ml水中，用3×500ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-BOC-丙胺中间体；
第三步骤：将第二步制备得到的0.012mol3-叠氮-BOC-丙胺中间体与第一步制备得到的0.01mol胆固醇碳酸丙炔醇酯混合溶解于100ml干燥的1，4-二氧六环中，加入氯化铜2.5g/抗坏血酸2.5g的铜催化剂于80℃下搅拌反应1h，蒸馏除去有机溶剂；然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，用3×100ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤；其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂；上述制备产物再次溶于20ml三氟乙酸，室温下搅拌反应2h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-1。
6.一种如权利要求2所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，其特征是由下述步骤获得：
第一步骤：将1mol4-戊炔-1-醇溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml吡啶催化下缓慢滴加溶于50ml干燥甲苯中的1mol胆固醇对甲苯磺酸酯，于80℃反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇戊炔醇醚中间体；
第二步骤：将0.1mol3-溴-BOC-丙胺溶解于30ml二甲基亚砜中，然后缓慢滴加事先溶于20ml蒸馏水的0.4mol叠氮化钠溶液中，于室温搅拌反应48h后，倒入1000ml水中，用3×500ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-BOC-丙胺中间体；
第三步骤：将第二步制备得到的0.012mol3-叠氮-BOC-丙胺中间体与第一步制备得到的0.01mol胆固醇戊炔醇醚中间体混合溶解于100ml干燥的N，N-二甲基 甲酰胺中，加入硫酸铜2.5g/抗坏血酸5g的铜催化剂，于50℃下搅拌反应2h，蒸馏除去有机溶剂；然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，用3×200ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤；其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂；上述制备产物再次溶于15ml三氟乙酸，室温下搅拌反应3h后，加入50ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-2。
7.一种如权利要求3所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，其特征是由下述步骤获得：
第一步骤：先将1mol丙炔醇溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml三乙胺催化下缓慢滴加溶于50ml干燥四氢呋喃中的1mol胆固醇氯甲酸酯，于0℃冰浴中反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇碳酸丙炔醇酯中间体；
第二步骤：将0.01mol3-溴-1-BOC-赖氨酰丙胺溶解于50mlN，N-二甲基甲酰胺中，然后缓慢滴加事先溶于10ml蒸馏水的0.4mol叠氮化钠溶液中，于70℃搅拌反应24h后，倒入100ml水中，用3×50ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-1-BOC-赖氨酰丙胺中间体；
第三步骤：将第二步制备得到的0.01mol3-叠氮-1-BOC-赖氨酰丙胺中间体与第一步制备得到的0.01mol胆固醇碳酸丙炔醇酯中间体混合溶解于100ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入铜催化剂：溴化亚铜2g/二乙烯三胺3g，于80℃下搅拌反应2h，蒸馏除去有机溶剂；然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×200ml的乙酸乙酯萃取，合并有机相后用200ml0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤；其后洗涤物用无水碳酸钾干燥5小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂；上述制备产物再次溶于20ml三氟乙酸，室温下搅拌反应2h后，加入50ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-3。
8.一种如权利要求4所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体的合成方法，其特征是由下述步骤获得：
第一步骤：先将1mol4-戊炔-1-醇溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在20ml吡啶催化下缓慢滴加溶于50ml干燥甲苯中的1mol胆固醇对甲苯磺酸酯，于80℃反应24h后减压蒸馏除去溶剂，加入甲醇沉淀制备得到胆固醇戊炔醇醚中间体；
第二步骤：将0.01mol3-溴-1-BOC-G(2)-赖氨酰丙酯溶解于50ml二甲基亚砜中，然后缓慢滴加事先溶于10ml丙醇的0.04mol叠氮化钠溶液中，于60℃搅拌反应18h后，倒入100ml水中，用3×100ml二氯甲烷萃取，分出有机相后蒸馏除去溶剂，制备得到3-叠氮-1-BOC-G(2)-赖氨酰丙酯中间体；
第三步骤：继续将第二步制备得到的0.01mol3-叠氮-1-BOC-G(2)-赖氨酰丙酯中间体与第一步制备得到的0.01mol胆固醇戊炔醇醚中间体混合溶解于100ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入铜催化剂：溴化亚铜2g/抗坏血酸钠3g，于60℃下搅拌反应1h，蒸馏除去有机溶剂；然后将剩余物倒入200ml蒸馏水中，然后用3×100ml的二氯甲烷萃取，合并有机相后用100ml0.1M浓度的氢氧化钠溶液充分洗涤，继续用200ml饱和食盐水洗涤；其后洗涤物用无水碳酸钾干燥2小时后，蒸馏除去剩余有机溶剂；上述制备产物再次溶于20ml盐酸/20ml四氢呋喃混合溶剂，室温下搅拌反应2h后，加入100ml乙醚沉淀，过滤分离后干燥得到含有胆固醇结构片段的合成脂质体Click-5。
9.一种如权利要求1，2、3或4所述的一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体作为治疗基因和药物的载体材料的应用。
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