CN103893124B - 基于协同组装的基因治疗药物递送系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学与制剂领域。具体涉及一种基因治疗药物递送系统及其包含的两类点击反应模块分子的制备。本发明的药物脂质体，除了含有常规的药物、脂质、胆固醇外，还含有修饰剂和炔基化衍生物，修饰剂通过疏水相互作用插入到药物脂质体的脂质双分子层中,炔基化衍生物通过点击化学反应连接在药物脂质体的最外层，药物则通过与阳离子脂质之间的静电相互作用被包覆于药物脂质体的亲水内核中，本发明的递送系统具有一定的靶向性。

Description

基于协同组装的基因治疗药物递送系统

技术领域

本发明涉及化学与制剂领域。具体涉及一种基因治疗药物递送系统及其包含的两类点击反应模块分子的制备。

背景技术

随着人类基因组计划的实施，一大批与人类疾病相关的基因相继被发现，这使人们对疾病的分子遗传机制有了更深刻的了解和认识，使基因治疗药物成为生物技术药物发展的重要领域之一。基因治疗(gene therapy)是将外源正常基因导入患者的特定组织和细胞进行适当的表达，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗药物正在成为生物技术药物的重要组成部分，相比传统的蛋白质药物具有制备简便、特异性强、生物活性高等特点，除DNA外，近年来快速发展的siRNA、反义核酸、核酸适体(Aptamer)等新的基因治疗药物显示了广阔应用前景。

作为负电性核酸类生物大分子，基因药物亲水性强，在血浆中易被核酸酶降解，半衰期很短，很难穿透脂性细胞膜到达细胞质或细胞核作用靶点,生物利用度极低，极大地削弱了基因的治疗优势，特别是全身用药的实际效果不佳。解决基因成药性问题主要有三类方法：(1)物理方法：基因枪、电穿孔和微注射。(2)化学方法：对基因药物进行化学修饰；(3)药剂学方法：用载体系统包载、保护和递送基因。物理方法仅是一种给药方法，对改善基因成药性并没有作用，而且该方法对靶细胞的选择有一定的局限性，且耗时、效率低，目前只能应用于皮肤、肌肉等有限的几种组织。化学修饰的方法也不能从根本上解决成药性问题，往往只能对某一、二种性质进行变化，如经化学修饰的siRNA-027作为治疗老年性眼黄斑退行性病变的局部用药，最终因毒副作用大而终止在二期临床试验。因此，载体系统成为基因药物进入临床应用的不可或缺的桥梁。

目前用于基因药物传递的载体主要包括病毒性和非病毒性载体。病毒性载体虽然具有较高转染的效率，但其安全性差，具有免疫刺激性等严重问题极大的限制了在临床上的应用。非病毒载体因其低毒,低免疫反应,易于组装等优点而得到了广泛的关注和深入研究。非病毒载体一般为阳离子载体，其可以通过静电相互作用与负电性siRNA形成稳定的二元复合物，并通过胞吞作用将siRNA传递到细胞内。常见的用作阳离子载体材料有阳离子聚合物，如聚赖氨酸(PLL)，聚乙烯亚胺(PEI),壳聚糖及其衍生物等。此外，阳离子脂质如2，3-二油酰氧-N-[2(精胺酸基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸胺(DOSPA)等，市售阳离子脂质体试剂盒Lipofectamine2000常被用于体外siRNA递送的对照试剂。

虽然这些阳离子载体在体外研究中具有巨大的潜在价值，但却因其会引起免疫、炎症反应及自身毒性使其在临床上的应用受到了极大的限制。目前，降低阳离子载体毒性的策略主要是减小其表面的正电性，可对阳离子载体材料进行减少用量或降低分子量、化学结构修饰，但是通过这些方法降低正电性来降低毒性的代价就是载体复合率和复合物稳定性的下降。而且化学结构修饰载体的方法也常常结合功能基团的修饰，例如用聚乙二醇(PEG)或透明质酸(Hyaluronic acid,HA)修饰PEI，但具有长循环作用的PEG的空间位阻在降低了PEI的正电性及其与siRNA结合率的同时还阻碍了肿瘤细胞的内吞，而且PEG化载体在连续注射后，发生血浆快速清除效应(Accelerated blood clearance effect,ABC效应)。与化学修饰方法相比，应用适宜材料包覆脂质体复合物或聚合物复合物，使之具有正常生理环境能接受的电中性或负电性质，比前述直接降低材料正电性的方法更为普遍。这种基于物理相互作用以及包括有“复合”与“包覆”的组装过程称为“层-层组装”(Layer-by-Layer,LbL)技术。对于纳米复合物的表面包覆而言，这种依赖物理相互作用的方法存在严重的不足，如纳米复合物表面没有特定的结合位点，物理相互作用力复杂，在组装过程中特异性和识别能力差，纳米粒子的尺寸相对于分子来说较大，靠分子之间的弱相互作用很难进行稳定有效的组装等。除上述缺点外，在层层组装的具体实施中通常选用负电性聚合物通过静电作用包覆，静电作用力强于其它物理作用力如氢键、疏水键等，但是许多研究已经指出，在进行层层组装时负电性的聚阴离子很容易竞争结合复合物中的阳离子载体，将基因药物从二元复合物中置换出来，大大降低结合率或载药量。而且，这种依赖静电作用形成的包覆层稳定性仍然较差，在体内转运过程中易脱离或被血液中负电性组分如血浆蛋白等竞争而解组装，而且包覆量不易定量和控制，产品中存在的过量游离材料甚至可能干扰或影响递送系统的靶向功能。

因此，克服现有物理层层组装方法的弊端和解决阳离子载体材料的安全性问题是提高基因成药性、促进基因药物有效递送和早日进入临床应用的两个关键科学问题。

发明内容

本发明公开了一种药物脂质体，除了含有常规的药物、脂质、胆固醇外，还含有修饰剂和选自下列任一结构的炔基化衍生物：

其中修饰剂选自叠氮化磷脂、巯基化磷脂、叠氮化胆固醇、巯基化胆固醇中的一种或几种，脂质优选阳离子脂质，修饰剂通过疏水相互作用插入到药物脂质体的脂质双分子层中,炔基化衍生物通过点击化学反应连接在药物脂质体的最外层，药物则通过与阳离子脂质之间的静电相互作用被包覆于药物脂质体的亲水内核中。

如果将修饰剂作为模块分子A，炔基化衍生物作为模块分子B，阳离子脂质、胆固醇和模块分子A用于制备表面修饰有功能基团的阳离子脂质体，并与基因治疗药物形成二元复合物；模块分子B则通过与模块分子A发生化学反应而修饰到上述二元复合物的表面，形成稳定的三元纳米复合物，其结构如图1所示。

模块分子A和模块分子B作为点击反应的基元，可用于组装稳定的三元纳米复合物。模块分子A是将组成脂质体的固定组成分中的胆固醇或磷脂进行叠氮基或巯基衍生化；模块分子B的是将聚阴离子(或阴离子)如透明质酸、叶酸、PEG、Tat肽、六氢苯酐、柠康酸酐、二甲基马来酸酐和顺乌头酸酐等进行炔基化衍生。

优选的模块分子A结构式如下：

其中I是优选的叠氮化磷脂、II是优选的巯基化磷脂、Ⅲ是优选的叠氮化胆固醇、Ⅳ是优选的巯基化胆固醇。

本发明的模块分子可以分别用下列方法制备：

(1)模块分子A

a.将叠氮钠(NaN₃)与氯乙胺盐酸盐溶于水中，加热至60-80℃，反应12-24h。用氢氧化钠(或氢氧化钾)调pH至10-14，用乙酸乙酯(或乙醚，石油醚，二氯甲烷，氯仿)萃取，无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥有机层，浓缩后得到叠氮化乙胺。叠氮化乙胺与六氢苯酐(HHPA)溶于二氯甲烷(或氯仿，四氢呋喃，乙酸乙酯)，25℃-45℃反应1-5h，水洗，无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥有机层并浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到叠氮化六氢苯酸。合成反应式：

b.将巯基乙胺与丁二酸酐溶于氯仿(或二氯甲烷，四氢呋喃，乙酸乙酯)，加入三乙胺TEA(或4-二甲氨基吡啶(DMAP))，25℃-45℃反应1-5h，水洗，无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥有机层并浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到巯基化丁酸衍生物。合成反应式：

c.将磷脂(或胆固醇)与叠氮化六氢苯酸(或巯基化丁酸衍生物)溶于氯仿(或二氯甲烷，四氢呋喃)，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(或N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)),N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和三乙胺TEA(或DMAP),25℃-45℃反应10-20h，水洗，无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥有机层并浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到叠氮化(或巯基化)磷脂(或胆固醇)衍生物。

叠氮化磷脂的反应式：

叠氮化胆固醇的反应式：

巯基化磷脂的反应式：

巯基化胆固醇的反应式：

(2)模块分子B

将丙炔胺与透明质酸HA(或叶酸FA，羧基化聚乙二醇PEG-COOH，穿膜肽Tat)溶于水，加入EDC，NHS,25℃-45℃反应10-20h，加入氯化钠固体，使其浓度为5％-10％(w/v),加入2-5倍乙醇，抽滤，得到炔基化透明质酸；或加入二氯甲烷(氯仿，乙酸乙酯)萃取，得到炔基化叶酸，炔基化PEG和炔基化Tat肽。将丙炔胺与六氢苯酐HHPA(或柠康酸酐Cit，二甲基马来酸酐DMMA，顺乌头酸酐cis-AA)溶于氯仿(或二氯甲烷，四氢呋喃)，25℃-45℃反应10-20h，水洗，无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥有机层并浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到炔基化六氢苯酸(或炔基化柠康酸，炔基化二甲基马来酸，炔基化顺乌头酸)。

炔基化透明质酸的反应式：

炔基化叶酸的反应式：

炔基化PEG的反应式：

炔基化羧酸的反应式：

炔基化Tat肽的反应式：

本发明的模块分子A作为脂质体的修饰剂，可以与阳离子脂质共同制备表面修饰有叠氮基或巯基的阳离子脂质体，并与基因治疗药物形成二元复合物，炔基化衍生物则通过与叠氮或巯基化脂质之间的点击化学反应修饰到二元复合物的表面，从而提高载体系统的稳定性与靶向性。

本发明中的阳离子脂质优选2，3-二油酰氧-N-[2(精胺酸基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸胺(DOSPA)或2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵氯(DOTAP)等市售阳离子脂质。

本发明的药物脂质体，其中修饰剂与磷脂的重量比优选1:1-1:10。

药物优选基因治疗药物。基因治疗药物进一步优选质粒DNA、寡核苷酸或siRNA。

修饰剂与炔基化衍生物重量比优选1:1-1:20。

药物与空白脂质体的重量比优选1:5-1:20。

阳离子脂质体带正电，可以与基因治疗药物通过静电作用形成二元复合物，此二元复合物仍然带正电，具有一定的血液毒性。本发明基于点击化学反应的理论，设计了一种协同组装方式，即将物理组装与化学组装相结合的“层-层组装”新模式，见图2。“化学组装”是指“通过纳米复合物中预置的模块分子与包覆的模块分子进行的化学反应完成的组装过程”。化学组装具有共价键的专一性、稳定性和可计量性等特点。首先将基因药物通过静电作用与包含模块分子A的阳离子载体组装成二元纳米复合物，再加入模块分子B，通过基于点击化学反应的化学组装而形成三元纳米递药系统，实现稳定包覆并获得预期功能的药物递送系统。如采用透明质酸或叶酸与二元纳米复合物进行化学组装可以赋予载体系统肿瘤靶向功能，采用PEG与二元纳米复合物进行化学组装可以使载体系统具有长循环功能；采用负电性羧酸与二元纳米复合物进行化学组装可以使载体系统具有pH敏感功能；采用Tat肽二元纳米复合物进行化学组装可以使载体系统具有核趋向性。

本发明中模块分子A的加入对阳离子载体基因药物包覆能力没有影响，见实施例13。本发明中的脂质载体不仅可以用于siRNA的包载，还可以用于质粒DNA的包载，见实施例14。化学组装前后的纳米复合物可以通过红外图谱进行表征见图5。化学组装过程中，载体中的siRNA没有被置换和破坏，见实施例15，且本发明的三元递送系统可以保护siRNA不被核酸酶降解，见实施例17。阳离子载体与siRNA形成的二元复合物表面带正电，与透明质酸进行化学组装后，电荷可反转为负电；与负电性小分子羧酸(如炔基化六氢苯酸)进行化学组装后，电荷在中性环境中可以反转为负电，且在肿瘤弱酸性环境中变为正电，从而有利于被肿瘤细胞摄取，见实施例18。本发明的三元纳米递送系统具有很好的体外稳定性，见实施例19，从而确保siRNA能顺利到达肿瘤部位。本发明的三元纳米递送系统的细胞摄取是浓度和时间依赖的，见实施例20，并以巨胞饮摄取为主，见实施例21。本发明的三元递送系统在肿瘤细胞内可以有效地实现内涵体/溶酶体逃逸，从而将siRNA释放到胞质，见实施例22，导致基因沉默，见实施例23,并诱导肿瘤细胞的凋亡，见实施例24。本发明的三元递送系统具有核靶向作用，可以将编码绿色荧光蛋白的质粒DNA递送至细胞核，使肿瘤细胞表达出绿色荧光蛋白，见实施例25。

附图说明

图1是本发明的物理-化学协同组装的基因递送系统

图2是化学组装示意图

图3是模块分子A加入前后阳离子脂质体对siRNA的包载

图4是阳离子脂质体对质粒DNA的包载

图5是点击反应前后纳米复合物的红外图谱

图6是点击反应对siRNA的影响

图7是三元纳米递送系统对siRNA的保护作用

图8是肿瘤细胞对三元纳米系统的摄取

图9是三元纳米递送系统的体外稳定性

图10是三元纳米递送系统的细胞摄取动力学

图11是三元纳米递送系统的细胞摄取机制

图12是三元纳米递送系统的胞内转运

图13是cpusiRNA的基因沉默效果

图14是cpusiRNA的肿瘤细胞凋亡诱导作用

图15是质粒转染后绿色荧光蛋白的表达

具体实施方式

实施例1

叠氮化二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺的制备

将氯乙胺盐酸盐(5g，43.1mmol)和叠氮钠(8.4g，129mmol)溶于30mL水，80℃反应15h。反应结束后，加入氢氧化钾固体，调节反应液的pH值至12-14，乙醚萃取，浓缩有机层，得到淡黄色油状物(2.8g，75.6％)。将淡黄色油状物(2.8g，32mmol)与六氢苯酐(4.16g，27mmol)溶于50mL氯仿，25℃反应5h，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(叠氮化六氢苯酸，5.9g，90.9％)。将叠氮化六氢苯酸(0.38g，1.57mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.36g，3.14mmol)溶于20mL氯仿，冰浴中滴加20mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.6g，3.14mmol)，活化1h，加入二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(1g，1.57mmol)和三乙胺(0.16g，1.57mmol),25℃反应12h。水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(叠氮化二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，1.1g，76.9％)。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz,δppm):0.96(t,6H,CH₃),1.29(m,48H,CH₂),1.49，1.39(m，4H,CH₂),1.8,1.55(m,4H,CH₂),1.6(m，2H,CH₂-N＝N＝N),1.68(m,4H,COCH₂CH₂),2.25(m，4H,CH₂-O)，2.6(m，2H,CHCO),3.2(m，2H，CH₂NH)，3.57(m，2H,OCH₂CH₂)，4.29(m，2H,CH₂)，4.45，4.2(m，2H,CH₂)，4.39，4.14(m，2H,CH₂)，4.64(s，1H,CH-O).

实施例2

叠氮化1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺的制备

将氯乙胺盐酸盐(5g，43.1mmol)和叠氮钠(8.4g，129mmol)溶于30mL水，80℃反应15h。反应结束后，加入氢氧化钾固体，调节反应液的pH值至12-14，乙醚萃取，浓缩有机层，得到淡黄色油状物(2.8g，75.6％)。将淡黄色油状物(2.8g，32mmol)与六氢苯酐(4.16g，27mmol)溶于50mL氯仿，25℃反应5h，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(叠氮化六氢苯酸，5.9g，90.9％)。将叠氮化六氢苯酸(0.33g，1.39mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.32g，2.78mmol)溶于20mL氯仿，冰浴中滴加20mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g，2.78mmol)，活化1h，加入1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(1g，1.39mmol)和三乙胺(0.14g，1.39mmol),25℃反应12h。水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(叠氮化1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺，1.05g，80.4％)。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz,δppm):0.96(t,6H,CH₃),1.29(m,48H,CH₂),1.49，1.39(m，4H,CH₂),1.8,1.55(m,4H,CH₂),1.6(m，2H,CH₂-N＝N＝N),1.68(m,4H,COCH₂CH₂),2.25(m，4H,CH₂-O)，2.6(m，2H,CHCO),3.2(m，2H，CH₂NH)，3.57(m，2H,OCH₂CH₂)，4.29(m，2H,CH₂)，4.45，4.2(m，2H,CH₂)，4.39，4.14(m，2H,CH₂)，4.64(s，1H,CH-O),5.42(m,2H,CH＝CH).

实施例3

叠氮化胆固醇的制备

将氯乙胺盐酸盐(5g，43.1mmol)和叠氮钠(8.4g，129mmol)溶于30mL水，80℃反应15h。反应结束后，加入氢氧化钾固体，调节反应液的pH值至12-14，乙醚萃取，浓缩有机层，得到淡黄色油状物(2.8g，75.6％)。将淡黄色油状物(2.8g，32mmol)与六氢苯酐(4.16g，27mmol)溶于50mL氯仿，25℃反应5h，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(叠氮化六氢苯酸，5.9g，90.9％)。将叠氮化六氢苯酸(2.65g，11mmol)和二甲基吡啶胺(0.27g，2.2mmol)溶于30mL氯仿，冰浴中滴加30mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(4.2g，22mmol)，活化1h，加入胆固醇(2.13g，5.5mmol)25℃反应12h。水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(叠氮化胆固醇，2.5g，75.8％)。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz,δppm):1.01(t,6H,CH₃),1.06(t,3H,CH₃),1.16(t,3H,CH₃),1.24,1.49(m,2H,CH₂),1.25(m,4H,CH₂),1.26(t,3H,CH₃),1.27,1.52(m,2H,CH₂),1.28(m,2H,CH₂),1.29(m,2H,CH₂CH₃),1.38,1.13(m,2H,CH₂),1.4,1.65(m,2H,CH₂),1.4(s,1H,CH),1.47(s,1H,CHCH₃),1.49，1.39(m，4H,CH₂),1.57(m,4H,CH₂),1.6,1.35(m,4H,CH₂),1.8,1.55(m,4H,CH₂),1.6(m，2H,CH₂-N＝N＝N),2.08,2.33(m,2H,CH₂),3.2(m，2H，CH₂NH),5.31(s,1H,C＝CH).

实施例4

巯基化二油酰基磷脂酰乙醇胺的制备

将巯基乙胺盐酸盐(2g，18mmol)和丁二酸酐(1.8g，18mmol)溶于30mL氯仿，加入三乙胺(1.8g，18mmol)，35℃反应10h。反应结束后，水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(巯基化丁酸，3g，93.7％)。将巯基化丁酸(0.238g，1.34mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.31g,2.68mmol)溶于20mL氯仿，冰浴滴加10mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.5g，2.68mmol)活化1h，加入二油酰基磷脂酰乙醇胺(1g，1.34mmol)和三乙胺(0.14g，1.34mmol),25℃反应12h。水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(巯基化二油酰基磷脂酰乙醇胺，0.9g，72.6％)。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz,δppm):0.96(t,6H,CH₃),1.29(m,48H,CH₂),1.49，1.39(m，4H,CH₂),1.8,1.55(m,4H,CH₂),1.68(m,4H,COCH₂CH₂),2.25(m，4H,CH₂-O)，2.46(m,4H,CH₂CH₂),2.6(m，2H,CHCO)，2.82(m，2H,CH₂-SH),3.5(m，2H,CH₂CH₂-SH),3.57(m，2H,OCH₂CH₂)，4.29(m，2H,CH₂)，4.45，4.2(m，2H,CH₂)，4.39，4.14(m，2H,CH₂)，4.64(s，1H,CH-O),5.42(m,4H,CH＝CH).

实施例5

巯基化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的制备

将巯基乙胺盐酸盐(2g，18mmol)和丁二酸酐(1.8g，18mmol)溶于30mL氯仿，加入三乙胺(1.8g，18mmol)，35℃反应10h。反应结束后，水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(巯基化丁酸，3g，93.7％)。将巯基化丁酸(0.238g，1.34mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.31g,2.68mmol)溶于20mL氯仿，冰浴滴加10mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.5g，2.68mmol)活化1h，加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(1g，1.34mmol)和三乙胺(0.14g，1.34mmol),25℃反应12h。水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(巯基化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，1.1g，90.6％)。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz,δppm):0.96(t,6H,CH₃),1.29(m,56H,CH₂),1.49，1.39(m，4H,CH₂),1.8,1.55(m,4H,CH₂),1.68(m,4H,COCH₂CH₂),2.25(m，4H,CH₂-O)，2.46(m,4H,CH₂CH₂),2.6(m，2H,CHCO)，2.82(m，2H,CH₂-SH),3.5(m，2H,CH₂CH₂-SH),3.57(m，2H,OCH₂CH₂)，4.29(m，2H,CH₂)，4.45，4.2(m，2H,CH₂)，4.39，4.14(m，2H,CH₂)，4.64(s，1H,CH-O).

实施例6

巯基化胆固醇的制备

将巯基乙胺盐酸盐(2g，18mmol)和丁二酸酐(1.8g，18mmol)溶于30mL氯仿，加入三乙胺(1.8g，18mmol)，35℃反应10h。反应结束后，水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(巯基化丁酸，3g，93.7％)。将巯基化丁酸(0.92g，5.17mmol)和二甲基吡啶胺(0.13g，1.034mmol)溶于30mL氯仿，冰浴中滴加10mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.98g，10.3mmol)，活化1h，加入胆固醇(2g，5.17mmol)25℃反应12h。水洗(10mL×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(巯基化胆固醇，2.3g，81.6％)。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz,δppm):1.01(t,6H,CH₃),1.06(t,3H,CH₃),1.16(t,3H,CH₃),1.24,1.49(m,2H,CH₂),1.25(m,4H,CH₂),1.26(t,3H,CH₃),1.27,1.52(m,2H,CH₂),1.28(m,2H,CH₂),1.29(m,2H,CH₂CH₃),1.38,1.13(m,2H,CH₂),1.4,1.65(m,2H,CH₂),1.4(s,1H,CH),1.47(s,1H,CHCH₃),1.57(m,4H,CH₂),1.6,1.35(m,4H,CH₂),2.08,2.33(m,2H,CH₂),2.82(m，2H,CH₂-SH),3.5(m，2H,CH₂CH₂-SH),5.31(s,1H,C＝CH).

实施例7

炔基化透明质酸的制备

将透明质酸(1g，2.5mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(1.4g，12.5mmol)溶于250mL水中，冰浴中滴加50mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.4g，12.5mmol)，活化1h，加入炔丙胺(1.38g，25mmol)，25℃反应24h。加入NaCl(15g，0.256mol)，将反应液倒入900mL乙醇中，抽滤得到白色固体(0.9g，70.5％)。

¹H-NMR(300MHz,D₂O):δ2.7(s,1H,CH_(alkynye)),1.9(bs,3H,NHCOCH_3(HA)),3.8-3.2(m,12H,HA_{(hexane ring)}),4.5-4.3(m,1H,CHCH₂OH).

实施例8

炔基化PEG的制备

将羧基化mPEG2000(1g，0.5mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.58g，5mmol)溶于250mL水中，冰浴中滴加50mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.96g，5mmol)，活化1h，加入炔丙胺(0.275g，5mmol)，25℃反应24h。二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(0.9g，78.3％)。

¹H-NMR(300MHz,D₂O):δ2.3(s,1H,CH_(alkynye)),2.5(m,4H,CH₂CH₂CO),3.24(m,3H,CH₃),3.5-4.5(m,126H,CH_2(PEG)).

实施例9

炔基化叶酸的制备

将叶酸(1g，2.3mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.53g，4.6mmol)溶于250mL水中，冰浴中滴加50mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.88g，4.6mmol)，活化1h，加入炔丙胺(0.13g，2.3mmol)，25℃反应24h。二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(0.8g，72.7％)。

¹H-NMR(300MHz,D₂O):δ2.1(m,4H,CH₂CH₂CO),2.3(s,1H,CH_(alkynye)),3.94(m,2H,CH₂-C≡CH),4.46(m,1H,CHNH),6.61(m,2H,CH_(benzene)),7.73(m,2H,CH_(benzene)),8.57(m,1H,CH＝N-).

实施例10

炔基化Tat肽的制备

将Tat肽(1g，0.63mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.15g，1.26mmol)溶于250mL水中，冰浴中滴加50mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.24g，1.26mmol)，活化1h，加入炔丙胺(0.13g，2.3mmol)，25℃反应24h。二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体(0.75g，73.9％)。

¹H-NMR(300MHz,D₂O):δ1.55(m,16H,-CH₂CH₂NH₂),1.79(m,16H,-CH₂CHNH),2.07(m,2H,CH₂CH₂CONH₂),2.18(m,2H,CH₂CONH₂),2.3(s,1H,CH_(alkynye)),2.65(m,12H,CH₂NH-C＝NH),4.09(m,2H,NHCH₂),4.53(m,9H,CHNH),6.68(m,2H,CH_(benzene)),6.95(m,2H,CH_(benzene)).

实施例11

取市售阳离子脂质30mg，加或不加叠氮化胆固醇5mg，溶于5ml氯仿与1ml甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5ml水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8um，0.45um，0.22um滤膜，分别得到含和不含叠氮化胆固醇的阳离子脂质体，二者粒径电位测定结果(如表1所示)表明，叠氮化胆固醇的加入不会影响阳离子脂质体本身的大小和表面电性。

表1阳离子脂质体的性质

实施例12

取市售阳离子脂质30mg，加或不加巯基化胆固醇5mg，溶于5ml氯仿与1ml甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5ml水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8um，0.45um，0.22um滤膜，分别得到含和不含巯基化胆固醇的阳离子脂质体，二者粒径电位测定结果(如表2所示)表明，巯基化胆固醇的加入不会影响阳离子脂质体本身的大小和表面电性。

表2阳离子脂质体的性质

实施例13

将实施例11中的两种空白阳离子脂质体，按照不同的氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)与siRNA进行混合，涡旋10s，室温放置30min，即得二元纳米复合物，进行凝胶阻滞电泳实验，紫外灯下观察，结果显示，当N/P大于等于3时，阳离子脂质体可以将siRNA完全包覆，见图3。

实施例14

将实施例12中的两种空白阳离子脂质体，按照不同的氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)与编码绿色荧光蛋白的质粒DNA进行混合，涡旋10s，室温放置30min，即得二元纳米复合物，进行凝胶阻滞电泳实验，紫外灯下观察，结果显示，当N/P大于1时，阳离子脂质体可以将质粒完全包覆，见图4。

实施例15

采用炔基化的六氢苯酸与实施例13中得到的含叠氮化胆固醇的二元纳米复合物进行混合，并固定炔基化的六氢苯酸和叠氮化胆固醇之间质量比为5:1，加入5倍量的抗坏血酸钠和0.5倍的硫酸铜，和1倍的铜离子配体红菲绕啉二磺酸钠水合物，室温反应10h，透析，冻干，得到三元纳米递送系统。采用红外图谱对三元纳米递送系统进行表征，如图5,结果显示,点击反应后,叠氮化胆固醇中的2100处特征峰消失,说明点击反应的发生。二元纳米复合物和三元递送系统的粒径电位测定结果(如表3)表明，形成的三元纳米复合物具有电荷反转的特性，即在pH7.4的血液中，三元纳米复合物带负电，文献报道称负电性的纳米粒具有良好的血液相容性；而在pH6.5肿瘤微环境中，三元纳米复合物带正电，有利于被肿瘤细胞所摄取。琼脂糖凝胶电泳显示，化学组装的过程并未对siRNA造成破坏或置换(如图6所示)。

表3三元递送系统的性质

实施例16

采用炔基化的透明质酸与实施例14中得到的含巯基化胆固醇的二元纳米复合物进行混合，并固定炔基化的透明质酸和巯基化胆固醇之间比例为5:1，室温反应10h，透析，冻干，得到三元纳米递送系统，二元纳米复合物与三元纳米递送系统粒径电位测定结果(如表4)显示，三元递送系统带负电，说明炔基化透明质酸结合到二元纳米复合物的表面。

表4点击反应前后复合物的性质

实施例17

将实施例15中不同氮磷比(N/P＝1，2，3，4，5)的三元递送系统中加入3U的核酸酶，37℃孵育2h，琼脂糖凝胶电泳考察三元递送系统对siRNA的保护作用，并以裸siRNA进行对照，如图7所示。

实施例18

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402和宫颈癌细胞Hela以1×10⁵个/孔分别接种于24孔板和激光共聚焦小皿中，完全培养液37℃培养48h。将实施例15中的三元纳米系统分别在pH7.4，pH6.5条件下与肝癌细胞Bel-7402和宫颈癌细胞Hela进行孵育，3h后，通过激光共聚焦和流式细胞仪定性和定量观察pH值对两种肿瘤细胞摄取三元纳米系统的影响，如图8所示。

实施例19

采用前插入法制备罗丹明B标记的阳离子脂质体，并与FAM标记的siRNA以N/P＝4进行孵育30min，得到二元纳米复合物，再采用8倍的炔基化PEG与二元纳米复合物表面的叠氮基进行混合，加入5倍量的抗坏血酸钠和0.5倍的硫酸铜，和1倍的铜离子配体红菲绕啉二磺酸钠水合物，室温反应10h，透析，冻干，得到双标记的三元纳米递送系统。将0.3mL三元纳米递送系统(1mg/mL)分别加入3mL pH7.4，pH6.5和含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃孵育不同的时间(1,1.5,2,2.5,3h),计算罗丹明B与FAM-siRNA之间荧光能量共振转移效率的变化，评价三元纳米系统的体外稳定性，如图9所示。

实施例20

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402和宫颈癌细胞Hela以1×10⁵个/孔接种于24孔板中，完全培养液37℃培养48h。将实施例15中的三元纳米系统与肝癌细胞Bel-7402和宫颈癌细胞Hela进行孵育不同时间后(0.5,1,2,3,4h)，通过流式细胞仪观察三元纳米系统在肿瘤细胞中的摄取随时间的变化，如图10A所示；将实施例15中的三元纳米系统以不同的浓度(0.4,0.8,1.2,1.6,2.0ug/uL)与肝癌细胞Bel-7402和宫颈癌细胞Hela进行孵育，3h后，通过流式细胞仪观察三元纳米系统在肿瘤细胞中的摄取随浓度的变化，如图10B所示。

实施例21

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402和宫颈癌细胞Hela以1×10⁵个/孔接种于24孔板中，完全培养液37℃培养48h，移去培养液，用不含血清的培养液孵育15min，每孔分别加入以下抑制剂200μL：1)叠氮化钠(sodium azide,1mg/mL)，抑制细胞能量代谢；2)氯丙嗪(chlorpromazine,20μg/mL)、3)蔗糖(sucrose,154mg/mL)，能抑制网格蛋白介导的内吞途径(clathrin-mediated endocytosis)；4)制霉菌素(nystatin,10μg/mL),能抑制小窝蛋白介导的内吞(caveolin-mediated endocytosis)途径；5)阿米洛利(amiloride,133μg/mL)，能抑制巨胞饮。加入以上各种抑制剂后，37℃孵育1h后，分别加入200μL实施例15中的三元纳米递送系统。孵育2h后，采用流式细胞仪测定在不同摄取抑制剂存在条件下，肿瘤细胞对三元递送系统的摄取，如图11所示。

实施例22

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402以1×10⁵个/孔接种于激光共聚焦小皿中，完全培养液37℃培养12h，将实施例15中的包载有FAM-siRNA三元纳米系统与Bel-7402共同孵育不同的时间(3,6,9h)，弃去含制剂的培养基，加入1mL lysotracker red，孵育20min，弃去lysotracker red荧光染料溶液，激光共聚焦观察三元纳米系统在肿瘤细胞中的转运，如图12所示。

实施例23

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402以1×10⁵个/孔接种于六孔板中，完全培养液37℃培养12h，弃去培养基，在不同的pH值条件下，将实施例15中包载有cpusiRNA2(其序列如下：正义链：5'-GAAUUUGAGGAAACUGCGAtt-3'反义链：3'-ttCUUAAACUCCUUUGACGCU-5；cpusiRNA2对肝癌，肺癌，乳腺癌，胃癌等多种癌细胞生长均有显著的抑制作用，具有广谱抗肿瘤作用，尤其是抗肝癌活性十分显著。专利号200710020520的三元纳米递送系统，以200nM的浓度加入到细胞中，3h后，弃去含制剂的培养基，加入新鲜培养基，继续培养48h，弃去上清，采用胰酶将细胞消化，收集细胞，采用qPCR和Western blot检测cpusiRNA2的基因沉默效果，如图13。

实施例24

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402以1×10⁵个/孔接种于六孔板中，完全培养液37℃培养12h，弃去培养基，在不同的pH值条件下，将实施例15中的包载有cpusiRNA2的三元纳米递送系统，以200nM的浓度加入到细胞中，3h后，弃去含制剂的培养基，加入新鲜培养基，继续培养48h，弃去上清，采用胰酶将细胞消化，收集细胞，采用凋亡检测试剂盒AnnexinⅤ和PI检测cpusiRNA2诱导细胞凋亡的情况，如图14。

实施例25

取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402以1×10⁵个/孔接种于12孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，至细胞融合率达60％～70％。用无血清无双抗的培养基孵育细胞，每孔加入100μL实施例16中的三元纳米复合物，于培养箱中培养4h。更换有血清无双抗培养基，继续培养48h，于倒置荧光显微镜下观察细胞中的绿色荧光蛋白的表达(如图15)，结果显示，在Bel-7402和Hela细胞中均可以表达出绿色荧光蛋白。

Claims (3)

1.一种被修饰的药物脂质体，其中药物脂质体由药物、阳离子脂质、胆固醇组成，其特征是：被修饰的药物脂质体还含有修饰剂和选自下列任一结构的炔基化衍生物，其中修饰剂选自叠氮化磷脂、巯基化磷脂、叠氮化胆固醇、巯基化胆固醇中的一种或几种，修饰剂通过疏水相互作用插入到药物脂质体的脂质双分子层中,炔基化衍生物通过点击化学反应连接在药物脂质体的最外层，药物则通过与阳离子脂质之间的静电相互作用被包覆于药物脂质体的亲水内核中：

其中修饰剂与阳离子脂质的重量比为1:1-1:10；药物为基因治疗药物；修饰剂与炔基化衍生物重量比为1:1-1:20；其中基因治疗药物为质粒DNA或siRNA。

2.权利要求1的被修饰的药物脂质体，其中药物与空白脂质体的重量比为1:5-1:20。

3.权利要求1的被修饰的药物脂质体的制备方法，包括：磷脂、胆固醇和修饰剂通过薄膜分散法制备得到表面修饰有叠氮基或巯基功能团的阳离子脂质体，并与药物形成二元复合物；炔基化衍生物则通过与修饰剂发生点击化学反应修饰到上述二元复合物的表面，形成三元纳米复合物，即得。