CN105534908B - 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，它包括脂质体和核酸药物；所述的脂质体中各原料及其质量百分比为：具放疗增敏功能的脂质分子20~80%；胆固醇5~50%；聚乙二醇磷脂3~50%；DOPC脂质分子1~30%；所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1：（1~20）；本发明制备的脂质体克服了阳离子脂质体毒性高、血液稳定性差和转染效率低的缺点，有效地提高了核酸类药物的药效，同时由于该脂质体在缺氧环境下具有较强的内涵体逃逸能力，因此在转染基因药物方面具有显著优势。本发明的脂质体适于包裹各种核酸类药物，并且适用剂型范围广。
Description
技术领域
本发明涉及一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，属于药物制剂学领域。
背景技术
脂质体(liposomes)是一种由排列有序的脂质双分子层组成的单层或多层微囊。脂质体属于胶体系统，具有类似细胞的结构，与细胞膜亲和力强，可以增加被包封药物透过细胞膜的能力。脂质体生物相容性好，可实现药物体内靶向递送，具有延长药物作用时间、增加药物的体内外稳定性、降低药物毒性，增强药理作用等诸多优点。
目前关于脂质体的研究较多，并已取得许多进展。作为核酸类药物载体的脂质体，多数为阳离子脂质体，该脂质体的正电荷表面虽然利于携带核酸类药物，但是却不利于载体的体内循环，同时，阳离子浓度越高其毒副作用越大，限制了其体内使用的剂量，因此目前所研究的阳离子脂质体递送核酸药物仍不能满足临床需求。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体；该脂质体的亲水头部为可质子化的叔胺基团或磷酸基团，若为磷酸基团需通过辅助脂质分子引入叔胺基团，使其在正常生理pH（7.35~7.45）条件下呈电中性，利于体内长循环，而在肿瘤微酸的环境下，可发生质子化，利于脂质体进入肿瘤细胞；该脂质体的疏水末端连接有缺氧响应的硝基咪唑基团，其在缺氧的环境下疏水的硝基转变为亲水的氨基，破坏了脂质体的稳定性的同时加大了脂质体的电荷，利于脂质体从内涵中逃逸出来，提高核酸类药物的疗效；同时引入的硝基咪唑基团在缺氧条件下具有放疗增敏的作用，提高放射治疗抑制肿瘤生长的作用。
经过多次试验，为提高载药脂质体制备效率，本发明采用了以下的技术方案：
一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，它包括脂质体和核酸药物；所述的脂质体中各原料及其质量百分比为：具放疗增敏功能的脂质分子20~80%；胆固醇5~50%；聚乙二醇磷脂3~50%；DOPC脂质分子1~30%；
所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1：（1~20）；
所述的具放疗增敏功能的脂质分子，具有如下结构通式：
式（）；
其中：
n为10-26之间的任意数；n进一步优化为10-18之间任意数；
基团X为： ；
所述的基团X中：X1为，，亚甲基或不存在；
X2为亚甲基或1,2-亚乙基；
当X1为时，X3，X4和X5均为甲基；
当X1为时，X3和 X4为氢，甲基，乙基或异丁基；X5不存在；
基团R为：；
所述的基团R中：R1为氢或甲基，其甲基上还可连一卤素氯；
R2为亚甲基或1，2-亚乙基；
当R3为硝基时；R4为氢,甲基或无基团；
当R4为硝基时；R3为氢或甲基。
所述的具放疗增敏功能的脂质分子，其结构式为：
；
。
所述的聚乙二醇磷脂为DSPE-PEG1000，DSPE-PEG2000，DSPE-PEG3400，DSPE-PEG5000。
所述核酸药物为RNA，DNA，反义核酸，质粒，干扰核酸，适体，antagomir，miRNA，核酶及siRNA中的一种或两种以上的混合物。
所述核酸药物为具有肿瘤增殖抑制作用的siPLK1，具有放疗增敏作用的Dbait。
所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备方法，按如下方法制备：
按配比称量原料具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇磷脂和DOPC脂质分子，并溶解于有机溶剂中，通过乙醇注入法或油膜法，制成脂质体；
将脂质体边搅拌边加入到pH=2~5的柠檬酸缓冲溶液，脂质体在柠檬酸中的浓度为0.5~10 mg/mL，再向柠檬酸缓冲溶液中加入称量好的核酸药物，在37~70℃的温度下水浴加热，水浴加热2~10min，制得包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
所述的有机溶剂为分析纯乙醇。
所述的包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的粒径为纳米级或微米级。
所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体应用于治疗由基因异常表达引起的相关疾病药物中；所述疾病包括遗传病，例如血友病、囊性纤维病和家庭型高胆固醇血症；恶性肿瘤，例如脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、大肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、血癌和骨癌。
本发明的有益效果：
1、本发明的脂质体的亲水头部为可质子化的叔胺基团，该脂质体在正常生理pH（7.35~7.45）条件下呈电中性，利于体内长循环，而在肿瘤微酸的环境下，可发生质子化，利于脂质体进入肿瘤细胞；
2、本发明的脂质体的疏水末端连接有缺氧响应的硝基咪唑基团，其在缺氧的环境下疏水的硝基转变为亲水的氨基，破坏了脂质体的稳定性的同时加大了脂质体的电荷，利于脂质体从内涵中逃逸出来，提高核酸类药物的疗效；
3、本发明的脂质体由于硝基咪唑基团的引入，使其在缺氧条件下具有放疗增敏的作用，提高放射治疗抑制肿瘤生长的作用。
4、本发明包含的辅助脂PEG可以有效延长脂质体在体内的有效循环时间，从而延长药物作用时间；胆固醇具有膜稳定性，增强了脂质体的体内循环稳定性。
5、本发明质子化脂质体，稳定性高，适用剂型广泛，可以进一步加工，形成口服、黏膜、注射、皮肤给药制剂的原料，制成发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的具体制剂。
6、本发明采用乙醇滴入法，方法简便，操作简单，而且效率高，易于普及。
附图说明
图1为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的电镜形貌表征；
图2为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的粒径表征；
图3为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的表面电位表征；
图4为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的CCK8细胞毒性实验结果；
图6为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的q-PCR结果；
图7为本发明实施例1所制备包载核酸类药物siPLK1的脂质体的WB结果；
图8为本发明实施例9所制备包载核酸类药物Dbait的脂质体的琼脂糖凝胶电泳结果；
图9本发明实施例9所制备包载核酸类药物Dbait的脂质体的电镜形貌表征；
图10为本发明实施例9所制备包载酸类药物Dbait的脂质体的细胞集落实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备
所选用核酸药物siPLK1为特殊降解PLK1；
siPLK1序列为：AGATCACTCTCCTCAACTATT；（核酸药物文献来源：Inhibition ofPolo-like kinase 1 reduces beta-amyloid-induced neuronal cell death inAlzheimer’s disease. Bing Song, Korbin Davis, X. Shawn Liu, Hyoung-gon Lee,Mark Smith, and Xiaoqi Liu. AGING. 2011, 3: 846-851）。
所选用具放疗增敏功能的脂质分子为：
将具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇磷脂和DOPC脂质分子各组分，分别溶解于乙醇溶剂中，使其各组分浓度为20 µg/µL，摇匀，溶解过夜备用；抽取各组分脂质体，具放疗增敏功能的脂质分子（100 µL= 2000 µg），胆固醇（20 µL= 400 µg），聚乙二醇磷脂DSPE-PEG2000（18 µL=360 µg）和DOPC脂质分子（9 µL=180 µg）；充分混匀，并将混合液转移到一次性1 mL医用注射器中，将注射器中的混合液，在37℃条件下，缓慢（0.5~2滴/秒）滴入柠檬酸缓冲液中，边滴边用磁力搅拌器混匀，脂质体在柠檬酸中的浓度为3 mg/mL；之后取出一定量脂质体溶液，根据不同N/P加入核酸药物siPLK1（例如N/P为5时，22.5 µg脂质体加入1 µg siPLK1，依此类推），在60℃的温度下水浴加热，水浴加热5 min，制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
实施例2
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体形貌的表征
用透射电镜检测具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的形貌，将实施例1制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体沾到铜网上，用滤纸吸掉多余液体，晾干铜网上的液体后，用透射电镜进行拍摄。结果显示，合成的脂质体是具有明显的双分子层结构，粒径在100 nm左右，见图1。
实施例3
粒度仪下质子化脂质体的粒径
将实施例1制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体（3mg/mL）加入马尔文粒度检测仪专用比色皿中，打开检测程序进行粒径检测，检测结果显示，所合成的脂质体水力学直径130 nm左右，见图2。
实施例4
粒度仪下质子化脂质体的电位
将实施例1制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体加入马尔文粒度检测仪专用带电极比色皿中，打开检测程序进行粒径检测，所检测的脂质体浓度为3 mg/mL，并经过PBS透析，检测结果显示，所合成的脂质体电位呈电中性，见图3。
实施例5
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力的研究
具有强的基因复合能力是核酸类药物制剂成功的关键因素，本实施例采用凝胶渗透电泳实验考察本发明所述的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力。
称取0.8 g的琼脂糖溶于40 mL 1×TAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却，加入5 μL的核酸染料溴化乙锭于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自然凝固。将不同N/P的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体/siRNA复合物（例如N/P为5时，22.5 µg脂质体加入1µg siPLK1，依此类推）（实施例1所述）与2 μL的Loading Buffer的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为110 V进行电泳实验，常温下电泳10 min，实验结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，核酸类药物制剂在N/P为5时，已经可以完全负载siPLK1；见图4.
实施例6
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的细胞毒性
良好的生物相容性是核酸类药物制剂应用的前提，本实验采用正常神经胶质细胞模型，考察了不同脂质体浓度条件下的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的细胞毒性。将胶质细胞以1×104的密度接种于96孔板中，培养24 h。之后用含有不同脂质体浓度及含有10% FBS的培养基换液，培养24 h。每孔加入10 μL的CCK8于培养基中，在37 ℃条件下孵育4 h。采用酶联免疫检测仪在波长为450 nm条件下测定光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。实验结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，在脂质体浓度≤0.36 mg/mL情况下，细胞存活均大于95%，说明该脂质体制剂具有很好的生物相容性，见图5。
实施例7
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因转染效率
为了考察本发明核酸类药物制剂的基因转染效果，本实验以脑胶质瘤C6细胞为模型，考察以N/P为5包封siPLK1的制剂（实施例1所述）的基因转染效率。细胞培养到细胞密度达到60%~80%时，将核酸类药物制剂加入培养基中，在37 ℃条件下培养24 h，换上新鲜培养基继续培养24 h。结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物siPLK1的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体（即实验组脂质体），可以有效下调PLK1 mRNA的基因表达，见图6。
实施例8
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的下调蛋白能力检测
为了考察本发明核酸药物直接的蛋白下调作用，本实验以脑胶质瘤C6细胞为模型，考察以N/P为5包封siPLK1的制剂（实施例1所述）的蛋白下调效率。培养C6到密度为70~80%时，将该核酸类药物制剂加入到培养基中，37 ℃下培养24 h，之后更换新鲜培养基，继续培养24 h，提取蛋白，进行WB实验。本发明所述的具有缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂（即实验组脂质体），可以有效下调PLK1蛋白的表达；见图7。
实施例9
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备
所选用核酸药物为：Dbait，其序列，见图8；（核酸药物文献来源：Small-MoleculeDrugs Mimicking DNA Damage: A New Strategy for Sensitizing Tumors toRadiotherapy. Clinical Cancer Research. 2009, 15: 1308-1316）。
所选用具放疗增敏功能的脂质分子为：
将具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇磷脂和DOPC脂质分子各组分，分别溶解于乙醇溶剂中，使其各组分浓度为20 µg/µL，摇匀，溶解过夜备用；抽取各组分脂质体，具放疗增敏功能的脂质分子（100 µL=2000 µg），胆固醇（20 µL=400 µg），聚乙二醇磷脂DSPE-PEG2000（18 µL=360 µg）和DOPC脂质分子（9 µL=180 µg）；充分混匀，并将混合液转移到一次性1 mL医用注射器中，将注射器中的混合液，在37℃条件下，缓慢（0.5~2滴/秒）滴入柠檬酸缓冲液中，边滴边用磁力搅拌器混匀，脂质体在柠檬酸中的浓度为3 mg/mL；之后取出一定量脂质体溶液，根据不同N/P加入核酸药物Dbait（例如N/P为5时，22.5 µg脂质体加入1µg Dbait，依此类推），在60℃的温度下水浴加热，水浴加热5 min，制得包载核酸药物Dbait的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
的作用
放射治疗时放射线会破坏肿瘤细胞的DNA，DNA损伤将诱发细胞自我修复程序，募集DNA损伤修复因子，修复损伤的DNA序列。而Dbait也具有募集DNA损伤修复因子的作用，并且其募集作用比肿瘤自身损伤DNA的募集作用要强，因此在肿瘤细胞DNA修复过程中Dbait可以竞争修复因子，导致肿瘤细胞DNA修复能力下降，从而起到抑制肿瘤细胞修复引起肿瘤细胞凋亡的作用Dbait的基因序列。
实施例10
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力的研究
具有强的基因复合能力是核酸类药物制剂成功的关键因素，本实施例采用琼脂糖凝胶电泳实验考察本发明所述的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力。
称取0.8 g的琼脂糖溶于40 mL 1×TAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却，加入5 μL的核酸染料溴化乙锭于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自然凝固。将不同N/P的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体/Dbait复合物与2 μL的Loading Buffer的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为110 V进行电泳实验，常温下电泳10 min。实验结果表明，本发明实施例9制得的包载核酸药物Dbait的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体在N/P为5时已经可以完全包封Dbait，见图9。
实施例11
马尔文粒度仪检测制备脂质体的粒径
将实施例9制得的包载核酸药物Dbait的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体（脂质体浓度3 mg/mL）加入马尔文粒度检测仪专用比色皿中，打开检测程序进行粒径检测，检测结果显示，所合成的脂质体水力学直径130 nm左右。
实施例12
具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体负载Dbait放疗作用下对胶质瘤细胞的抑制作用
为了考察本发明实施例9制得的包载核酸药物Dbait的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体（即实验组脂质体）对胶质瘤细胞增殖的抑制作用，本实验以脑胶质瘤C6细胞为模型，进行细胞集落实验。C0为空白对照组，其他组别均进行加药并在加药后进行2 Gy剂量的放疗，结果显示脂质体包载Dbait并进行放疗的胶质瘤细胞增殖抑制效果最明显，见图10。
以上是两种药物治疗胶质瘤的研究
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用条件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (5)
1.一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，其特征在于：它包括脂质体和核酸药物；所述的脂质体中各原料及其质量百分比为：具放疗增敏功能的脂质分子20~80%；胆固醇5~50%；聚乙二醇磷脂3~50%；DOPC脂质分子1~30%；
所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1：（1~20）；
所述的具放疗增敏功能的脂质分子，其结构式为：
；
所述的聚乙二醇磷脂为DSPE-PEG2000；
所述核酸药物为具有肿瘤增殖抑制作用的siPLK1，或Dbait。
2.一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，其特征在于：它包括脂质体和核酸药物；所述的脂质体中各原料及其质量百分比为：具放疗增敏功能的脂质分子20~80%；胆固醇5~50%；聚乙二醇磷脂3~50%；DOPC脂质分子1~30%；
所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1：（1~20）；
所述的具放疗增敏功能的脂质分子，其结构式为：
；
所述的聚乙二醇磷脂为DSPE-PEG2000；
所述核酸药物为具有肿瘤增殖抑制作用的siPLK1，或Dbait。
3.一种如权利要求1或2所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备方法，其特征在于：按如下方法制备：
按配比称量原料具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇磷脂和DOPC脂质分子，并溶解于有机溶剂中，通过乙醇注入法或油膜法，制成脂质体；
将脂质体边搅拌边加入到pH=2~5的柠檬酸缓冲溶液，脂质体在柠檬酸中的浓度为0.5~10 mg/mL，再向柠檬酸缓冲溶液中加入称量好的核酸药物，在37~70℃的温度下水浴加热，水浴加热2~10min，制得包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
4.根据权利要求3所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为分析纯乙醇。
5.根据权利要求3所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备方法，其特征在于：所述的包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的粒径为纳米级或微米级。
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