CN109562057A - 聚乙二醇化脂质体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了聚乙二醇化脂质体，以及其制备和使用方法。所述聚乙二醇化脂质体至少包含胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG组分的平均分子量是约5000道尔顿或更小。所述聚乙二醇化脂质体是稳定且能够递送用于产生免疫反应的药剂，例如用于疫苗、治疗剂或诊断用途的药剂。还提供了与制备聚乙二醇化脂质体有关以及使用聚乙二醇化脂质体刺激免疫反应的组合物和方法。

Description

聚乙二醇化脂质体和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月16日提交的美国临时申请第62/337,328号的权益，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦政府资助的研究或研发的声明
本发明是在政府支持下、依据美国卫生和人类服务部(U.S.Department ofHealth and Human Service)预备和响应助理部长办公室(Office of the AssistantSecretary for Preparedness and Response，ASPR)内的生物医学高级研究和发展局(Biomedical Advanced Research and Development Authority，BARDA)所授予的合同号HHSO100201000039C，并且依据人类和卫生服务部所属国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health)内的过敏和传染病国家研究院所授予的授权号5R21AI109118和合同号HHSN272200800045C产生的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
已经针对生物分子(如药物和成像剂)研发出基于脂质体的递送系统。此类脂质体提供了优势，如循环持久性延长使得向免疫系统的呈递改善、使生物分子的释放可控，以及便于配制疏水性和亲水性生物分子的通用性。为了延长脂质体的循环半衰期，要求他们规避正常清除机制，包括与血清蛋白和吞噬细胞的相互作用。已经研发出改进脂质体规避免疫系统的多种方法，包括脂质体聚乙二醇化(含有聚乙二醇(PEG)的脂质体)。为了使脂质体规避巨噬细胞而设计的含有PEG和其它共聚物的脂质体在所属领域中已经称为“隐形脂质体”。除屏蔽特性之外，聚乙二醇化能够影响脂质体制剂的稳定性，这是通过在长时间储存时限制(然而不排除)脂质体融合来实现的。为了躲避此类融合，PEG光环应该为空间屏蔽脂质体表面提供足够厚的层。
PEG分子量在传统上已被认为是有效表面屏蔽的重要决定因素。经较低分子量PEG涂布的聚乙二醇化脂质体对屏蔽来说是无效的。举例来说，含有750道尔顿PEG的聚乙二醇化脂质体与非聚乙二醇化脂质体比较时，不存在差异(Mori等人，《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett)》，1991)。只有当PEG分子量增加到大于5000道尔顿时，才观察到血液循环延长和吞噬细胞吸收减少。
脂质体用于递送次单位蛋白质疫苗和佐剂也已被评估。脂质体是吸引人的疫苗递送媒剂，原因在于能够定制脂质体组成来实现所期望的脂质浓度、电荷、尺寸和分布或抗原和佐剂靶向。已经评估多种基于脂质体的系统，包括阴离子型、阳离子型和中性脂质体，然而并非所有脂质体都是同等产生的。多种阳离子脂质的脂质体配制物具有毒性。多种中性脂质体在活体外是不稳定的并且尺寸随时间生长或在制造之后立即崩溃。阴离子型脂质体的电荷局限性影响了其递送各种抗原且与细胞膜融合的能力。其它脂质体含有本身可能影响免疫系统的合成脂质或嵌段共聚物。基于胆固醇的脂质体配制物理想之处在于，胆固醇是人类细胞膜的天然组分，且当与其它共脂质(如DOTAP和DOPC)组合时，形成约100-200nm的稳定阳离子型纳米颗粒，其具有约0.3的所期望多分散指数。已经采用多种策略改进用作疫苗配制物的脂质体配制物，包括聚乙二醇化策略。迄今为止，尚未研发出克服已知脂质体的稳定性和毒性所带来的问题并且能够有效改进免疫反应的品质的明确配制物(评述于Carstens等人《Vaccine(Vaccine)》29，2011；Kaur等人，《可控释放杂志(Journal ofControlled Release)》，2012；Schwendener，《疫苗治疗学进展(Ther Adv Vaccines)》，2014；Nag和Awasthi，《制药学(Pharmaceutics)》，2013；Vartak和Sucheck，《疫苗》，2016；Fan等人，《可控释放杂志》，2015；Schmidt等人，《制药学》，2016)。
因此，需要研发出稳定、可制造、与基于脂质的抗原和佐剂相容且尺寸小、供疫苗、治疗学和诊断学用的聚乙二醇化脂质体。在疫苗领域中，特别需要将此类脂质体与能够增强免疫反应的佐剂联合提供，并且此类脂质体的研发可能会有益于例如流感、肠疾病(如阿米巴病)、肺结核、HIV、癌症和肝炎的疫苗接种。本文提供与此有关的组合物和方法。
本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和专利公开，皆以全文引用的方式并入本文中，如同每个个别参考文献被特别地且个别地指示以引用的方式并入一样。
发明内容
本发明提供聚乙二醇化脂质体、包含所述聚乙二醇化脂质体的配制物和组合物，以及制备和使用所述聚乙二醇化脂质体的方法。所述聚乙二醇化脂质体适用于疫苗、治疗学和诊断学。
所述聚乙二醇化脂质体至少包含胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG组分的平均分子量是约5000道尔顿或更小。所述聚乙二醇化脂质体是稳定且能够递送用于产生免疫反应的药剂。脂质体聚乙二醇化(其中聚乙二醇化脂质是约5000道尔顿或更小)实现了脂质体的稳定性且实现向免疫细胞的递送以便产生免疫反应。如本文所提供，存在于组合物中的聚乙二醇化脂质体尺寸在约1nm至约450nm范围内，且所述尺寸在不同温度下随时间保持稳定。聚乙二醇化脂质体是稳定的且显示极少聚集到无聚集，或减少的聚集，且在分装之前耐受终末灭菌步骤。本文提供的聚乙二醇化脂质体可以进一步包含TLR促效剂和/或药剂，例如用于疫苗、治疗或诊断用途的药剂。还提供了与制备和使用聚乙二醇化脂质体刺激免疫反应有关的组合物和方法。
在一个方面中，本文提供一种脂质体，其包含：(a)胆固醇；(b)非聚乙二醇化中性脂质；和(c)聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约5000道尔顿或更小。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量在约750道尔顿至约5000道尔顿范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约2000道尔顿或更小。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约750道尔顿。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含中性脂质。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含C14烷基链、C16烷基链或C18烷基链。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DSPE、DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DSPE。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DPPE。在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质包含C14烷基链、C16烷基链或C18烷基链。在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质是DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE。在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质是DPPC。在一些实施例中，脂质体是稳定的。在一些实施例中，脂质体在约2℃至约8℃的温度下稳定至少1个月。在一些实施例中，脂质体在约25℃的温度下稳定至少1个月。在一些实施例中，脂质体在约37℃的温度下稳定至少1个月。在一些实施例中，脂质体的多分散指数维持在约0.3或更小。在一些实施例中，脂质体的尺寸小于或为约450nm。在一些实施例中，脂质体的尺寸维持在小于或为约450nm。在一些实施例中，脂质体的尺寸在约50nm至约300nm范围内。在一些实施例中，脂质体的多分散指数小于或为约0.3。在一些实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质摩尔百分比(mol％)在约1mol％至约25mol％范围内。在一些实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％在约1mol％至约10mol％范围内。在一些实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约5mol％。在一些实施例中，脂质体中的胆固醇mol％在约1mol％至约50mol％范围内。在一些实施例中，脂质体中的胆固醇mol％是约50mol％。在一些实施例中，脂质体中的非聚乙二醇化脂质mol％在约45mol％至约98mol％范围内。在一些实施例中，脂质体中的非聚乙二醇化脂质mol％是约45mol％。在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约9.8:5.7:0.8。在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约18:5.5:3。在一些实施例中，脂质体进一步包含至少一种TLR促效剂。在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR2促效剂、TLR3促效剂、TLR4促效剂、TLR5促效剂、TLR6促效剂、TLR7促效剂、TLR8促效剂、TLR7/8促效剂或TLR9促效剂。在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR4、SLA、GLA、3D-MPL、R837或R848。在一些实施例中，TLR促效剂包含疏水性尾。在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR7/8促效剂。在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR7促效剂。在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR8促效剂。在一些实施例中，TLR7/8促效剂包含咪唑并喹啉或含有咪唑并喹啉的化合物。在一些实施例中，TLR7/8促效剂包含3M-052。在一些实施例中，TLR7/8促效剂包含R848。在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR4促效剂。在一些实施例中，TLR4促效剂包含3D-MPL。在一些实施例中，TLR4促效剂包含GLA。在一些实施例中，TLR4促效剂包含式(V)的合成GLA。在一些实施例中，TLR4促效剂包含式(VI)的合成GLA。
在一些实施例中，TLR4促效剂包含下式的合成GLA：
或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，脂质体包含TLR4促效剂和TLR7/8促效剂。在一些实施例中，脂质体包含GLA和3M-052。在一些实施例中，脂质体进一步包含至少一种药剂。在一些实施例中，所述药剂包含多肽、聚核苷酸、抗原、佐剂、诊断剂、治疗剂或生物体。在一些实施例中，所述药剂包含抗原。在一些实施例中，所述抗原是阿米巴病相关抗原。在一些实施例中，所述抗原包含LecA。在一些实施例中，所述抗原包含流感相关抗原。在一些实施例中，所述抗原包含H5N1。在一些实施例中，所述抗原包含肺结核相关抗原。在一些实施例中，所述抗原包含ID91。在一些实施例中，所述抗原包含ID93。在一些实施例中，所述抗原包含BCG的抗原。在一些实施例中，所述抗原包含肝炎病毒相关抗原。在一些实施例中，所述抗原包含B型肝炎抗原。在一些实施例中，所述抗原包含C型肝炎抗原。在一些实施例中，所述抗原包含HIV相关抗原。在一些实施例中，所述抗原包含癌症相关抗原。
在一个相关方面中，本文提供一种组合物，其包含本文所提供的任一种脂质体。在一些实施例中，所述组合物包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。在一些实施例中，所述组合物是疫苗。在一些实施例中，所述组合物是治疗剂。在一些实施例中，所述组合物是诊断剂。
在另一态样中，本文提供一种刺激受试者的免疫反应的方法，包含向受试者投与本文所述的任何脂质体，或包含本文所述脂质体的任何组合物，借此刺激受试者的免疫反应。在另一个方面，本文提供一种诱导受试者的Th1反应的方法，包含向受试者投与本文所述的任何脂质体，或包含本文所述脂质体的任何组合物，借此诱导受试者的Th1反应。在一些实施例中，免疫反应是非特异性免疫反应。在一些实施例中，免疫反应是抗原特异性免疫反应。在一些实施例中，免疫反应包含全身免疫反应。在一些实施例中，免疫反应包含粘膜免疫反应。在一些实施例中，粘膜免疫反应包含肠、粪便或阴道粘膜免疫反应。在一些实施例中，所述组合物用于治疗或预防癌症。在一些实施例中，所述组合物用作疫苗。在一些实施例中，所述组合物用于增强对抗致流感病毒的保护性免疫。在一些实施例中，所述组合物用于增强对抗致阿米巴病生物体的保护性免疫。在一些实施例中，所述组合物用于增强对抗溶组织内阿米巴的保护性免疫。在一些实施例中，所述组合物用于增强对抗流感的保护性免疫。在一些实施例中，所述组合物用于增强对抗阿米巴病的保护性免疫。在一些实施例中，所述组合物的投药途径是口服、体表、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、静脉内、皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。在一些实施例中，投药途径是鼻内。
在另一个方面中，本文提供一种刺激受试者的全身免疫反应和粘膜免疫反应的方法，包含向受试者鼻内投与本文所提供的任一种脂质体，或如本文所提供的包含所述脂质体的任一种组合物。在一些实施例中，所述方法包含投与包含TLR4促效剂和TLR7/8促效剂的脂质体。在一些实施例中，所述方法包含投与包含GLA和3M-052的脂质体。在一些实施例中，粘膜免疫反应包含肠、粪便或阴道粘膜免疫反应。在一些实施例中，粘膜免疫反应发生于鼻腔的远端。
在本文所述的任何方法中，脂质体或组合物可以联合视黄酸共佐剂投与。
在本文所述的任何方法中，脂质体或组合物是投与人。
在本文所述的任何方法中，脂质体或组合物是投与非人类哺乳动物。在一些实施例中，非人类哺乳动物是狗、奶牛或马。
在另一个方面中，本文提供一种制备本文所提供的任一种聚乙二醇化脂质体的方法，包含：(a)将非聚乙二醇化中性脂质、聚乙二醇化脂质和胆固醇混合于有机溶剂中；(b)蒸发有机溶剂，借此产生脂质膜；(c)使所述脂质膜在缓冲液中复水，和(d)对步骤(c)的复水产物进行超声波处理、微流体化或挤出。在一些实施例中，步骤(a)进一步包含混合TLR促效剂。在一些实施例中，有机溶剂是氯仿。在一些实施例中，对步骤(c)的复水产物进行声波处理，然后进行微流体化。在一些实施例中，所述方法进一步包含将药剂与聚乙二醇化脂质体混合。在一些实施例中，所述药剂包含抗原。
本发明的这些和其它方面在参考以下具体实施方式和附图后将变得显而易见。另外，本文中阐述了多个参考文献，其更详细地描述了本发明的某些方面，且因此以全文引用的方式并入。
附图说明
图1A-1D描绘了多种配制物的物理和稳定性特征。图1A描绘了随时间而变的粒径(在5℃下)。图1B描绘了随时间而变的多分散指数(在5℃下)。图1C描绘随时间而变的粒径(在37℃下)。图1D描绘随时间而变的多分散指数(在37℃下)。
图2展现了各种配制物的IgG1和IgG2a反应，如ELISA所测定。此图描绘了小鼠用LecA抗原与相应佐剂混合的各种配制物免疫接种之后，血浆IgG1与IgG2a效价的比较。
图3A-D描绘了LecA特异性细胞因子反应。
图4A-B描绘了激发前的粘膜IgA反应和粘附抑制潜力。使用混合型鼻内(第0周和第4周)和皮下(第2周)疗法，用GLA 3M-052脂质体佐剂化LecA将小鼠免疫。指定组的小鼠接受150mg全反式视黄酸(RA)的每周腹膜内注射。第三次免疫接种后的第三周收集粪便样品。对于图4A来说，将粪便上清液稀释120倍且利用ELISA测定激发前抗凝集素IgA效价；对于图4B来说，利用所述的粘附抑制分析，活体外测定粪便IgA抑制营养体粘附到哺乳动物细胞的潜力。
图5A-B描绘了疫苗介导的保护作用(使用肠阿米巴病小鼠模型)。GLA3M-052脂质体佐剂在盲肠激发试验中提供中等保护作用。使用异源疗法免疫的小鼠在最终免疫接种后第四周，盲肠内用溶组织内阿米巴激发。激发之后的一周使小鼠安乐死且利用ELISA分析盲肠内容物中的抗原负荷(图5A)且通过培养来分析盲肠内容物中的活阿米巴(图5B)作为无菌免疫的度量。激发总数中的感染小鼠数目在每个柱上方指出。将来自两个独立但相同试验的数据合并。
图6描绘针对指定配制物的血浆IgG反应。
图7描绘了针对指定配制物的粪便IgA反应。此图描绘了PEG长度的增加使粘膜IgA反应增强。
图8A-B描绘了递送途径对免疫接种的影响，其中单独IN(鼻内)疗法产生最高的IgG2a和IgA效价。脂质体+佐剂产生了稳定的粘膜和全身Th1免疫反应、肠道抗LecA IgA(图8B)。
图9A-B描绘了递送途径对免疫接种的影响。单独IN疗法产生的IFN-γ和IL-17效价等于或大于其它疗法。脂质体+佐剂产生了稳定的粘膜和全身Th1免疫反应，IFN-γ(图9A)和IL-17(图9B)。
图10A-B描绘了3M-052的代表性配制物在5℃下历时6个月的(a)粒径和(b)尺寸多分散指数。误差条表示单批配制物在每个时间点的三次独立粒度分析的标准差。这些批料中的3M-052含量未进行测量，但基于使用相同工艺所制造的后续批料，估计为0.04mg/ml。
图11A-H描绘了经3M-052免疫的小鼠在H5N1激发之后展示增强的存活力。动物用rHA蛋白质(A/VN/1203/04)与所指定的佐剂组合免疫接种一次。动物在免疫接种后的第二十一天，用106PFU的A/VN/1203/04(H5N1，分化体1)激发。每天监测动物的存活(图11A)和体重损失(图11B、11C)。激发后的第3天(图11D)和第7天(图11E)，使小鼠安乐死，且通过空斑分析来测定肺病毒效价。另外，激发后第7天，将整个肺称重，作为合并的度量(11F)，且对宏观病理学的外观评分(图11G)。利用曼特尔-考克斯(Mantel-Cox)对数秩检验(A)或利用单向ANOVA确定显著性(图11D-11G)(**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001)。图11H展现肺病毒效价。
图12A-D描绘了经3M-052配制佐剂免疫的小鼠的CD4T细胞反应。动物用rHA蛋白质(A/VN/1203/04)与所指定的佐剂组合免疫接种一次。免疫接种后第七天，分析安乐死小鼠的脾细胞在rHA刺激后的细胞因子刺激情况。确定IFNγ(I)、TNFα(T)和IL-2(2)的细胞因子分泌模式，以研究Th1 CD4+ T细胞反应的诱导。还测定多功能t细胞的相对百分比。利用单向ANOVA(*p<0.05，**p<0.005)确定各组之间的显著性。
图13A-H描绘了在单次免疫接种之后，保护白鼬以免同源H5N1激发。雄性艾鼬(Fitch ferrets)用H5N1裂解疫苗(H5N1，Sanofi Pasteur)与3M-052配制佐剂的组合免疫一次，且在106PFU的A/VN 1203免疫接种后的第21天激发。监测动物在长达14天期间的存活率(图A、E)、体重损失(图B、F)和临床分数(图C、G)。另外，收集洗鼻液，以评估病毒效价(图D、H)。3M-052-SE和3M-052-脂质体佐剂配制物在此模型中均展现有力的单次注射保护作用，其特征为病毒从洗鼻液清除更快速、减小的体重损失和临床分数，以及100％存活率。
图14A-F描绘了3M-052配制佐剂诱导病毒中和效价。雄性艾鼬用H5N1裂解疫苗(SP-H5，Sanofi Pasteur)与3M-052配制佐剂的组合免疫一次。免疫接种后第二十一天，从所有动物收集血液，且利用逆转录病毒假型中和分析来分析病毒中和抗体。将3M-052纳入佐剂配制物中引起中和效价增加(单向ANOVA)，所述中和效价对抗同源分化体1病毒(图A、D)以及分化体2病毒株(图B、E)和分化体2.2株(图C、F)。
图15A-B描绘了在单次免疫接种之后，保护白鼬以免异源H5N1激发。雄性艾鼬用H5N1裂解疫苗(H5N1，Sanofi Pasteur)与3M-052配制佐剂的组合免疫一次，且在106PFU的A/Whooper Swan/Mongolia/244/05免疫接种后第21天激发。收集洗鼻液以评估病毒效价。3M-052-SE佐剂诱导病毒更快速的清除，第5天的效价检测不到。3M-052-脂质体佐剂配制物展现的效价直到第3天，第5天清除。
具体实施方式
本申请尤其针对聚乙二醇化脂质体配制物、包含聚乙二醇化脂质体的组合物，以及制备和使用聚乙二醇化脂质体的方法。本发明人在配制不溶性铎样受体(TLR)促效剂的同时，研发出一种脂质体配制物，其在并入各种TLR配位体和/或抗原、同时维持稳定性方面具有惊人的通用性，并且其与抗原混合时有效地增强免疫反应。本发明人发现多种不同抗原当与这些脂质体混合时，使得抗原-脂质体配制物能够投与哺乳动物。脂质体配制物包含胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质，和聚乙二醇化脂质，其中聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约5000道尔顿或更小，优选约750至约5000道尔顿，或750至约2000道尔顿。聚乙二醇化脂质的用途是提供稳定性，并且实现了递送和免疫反应的产生/刺激/调节。在一些优选实施例中，非聚乙二醇化中性脂质是DPPC且聚乙二醇化脂质是聚乙二醇化DSPE或DPPE。在一些特别优选的实施例中，脂质体进一步包含铎样受体(TLR)促效剂和任选存在的抗原。
还提供了包含本文所述聚乙二醇化脂质体的组合物(如疫苗组合物、医药组合物)。所述组合物适用于产生/刺激/调节受试者的免疫反应。在一些实施例中，本文所述的组合物进一步包含一种或多种抗原和/或TLR促效剂。
本发明人还发现，当配制不溶性铎样受体3M-052的基于角鲨烯的水包油型乳液时，用卵磷脂酰胆碱或POPC替代DMPC制造的乳液使得处理之后的铎样受体回收率提高。另外，增添将铎样受体与卵磷脂酰胆碱或POPC合并于氯仿中的初始混合步骤进一步增加了铎样受体的回收率。本申请还尤其针对包含角鲨烯、不饱和磷脂酰胆碱和铎样受体(例如不溶性铎样受体)的基于角鲨烯的水包油型乳液，以及通过将铎样受体与不饱和磷脂酰胆碱混合于氯仿中来制备此类乳液的方法。
I.定义
除非另外指明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语具有其在所述领域中公认的含义。
在本说明书中，除非另外指明，否则术语“约”和“基本上由……组成”意指指定范围、值或结构的±20％。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
如本文所用，术语“包括”、“具有”和“包含”同义使用，所述术语和其变化形式希望按照非限制性解释。
除非上下文另外明确指明，否则如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括多个提及物。
如本文所用，术语“高分子”係指大分子，例如(但不限于)生物或合成来源的肽、蛋白质、寡核苷酸和聚核苷酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或分支的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已经天然地或通过介入而被修饰的氨基酸聚合物；所述介入例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化，或任何其它操纵或修饰，例如与标记组分结合。定义内还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及所述领域中已知的其它修饰的多肽。
术语“分离”是指分子已经脱离其天然环境。
“提纯”是指分子纯度已经增加，使得其存在的形式比其在其天然环境中存在的形式更纯和/或比初始在实验室条件下合成和/或扩增时更纯。纯度是相对术语且不一定意指绝对纯度。
如本文中可互换使用的“聚核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱，和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。聚核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在，那么可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。
如本文所用，“寡核苷酸”通常是指短的、通常是单链的、通常是合成的聚核苷酸，其长度通常(但不一定)小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“聚核苷酸”并非相互排斥。以上关于聚核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
“个体”或“受试者”是任何哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)人类、灵长类动物、农畜、竞技动物、宠物(如猫、狗、马)，和啮齿动物。
“烷基”是直链或分支链饱和烃。举例来说，烷基可以具有1到30个碳原子(即，(C1-C30)烷基)或1到20个碳原子(即，(C1-C20烷基)或1到10个碳原子(即，(C1-C10)烷基)或1到8个碳原子(即，(C1-C8)烷基)或1到6个碳原子(即，(C1-C6)烷基)或1到4个碳原子(即，(C1-C4)烷基)。此术语包括例如直链和分支链烃基，如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、第二丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)、新戊基((CH3)3CCH2-)，和正己基((CH3(CH2)5-)。
“卤基”或“卤素”是指氟、溴、氯和碘。
“羟基(hydroxy/hydroxyl)”是指基团-OH。
“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。
“羧基酯(Carboxyl ester/carboxy ester)”是指基团-C(O)O-烷基和被-C(O)O-取代的烷基，其中烷基和被取代的烷基如本文所定义。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用所属领域技能范围内的分子生物学、重组DNA、生物化学和化学传统技术。此类技术充分解释于文献中。参见例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)》第2版，Sambrook等人编，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)：(1989)；《DNA克隆(DNA Cloning)》第I和II卷(D.N.Glover版，1985)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；Mullis等人，美国专利第4,683,195号；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；B.Perbal，《分子克隆实践指南(APractical Guide To Molecular Cloning)》(1984)，论文《酶学方法(Methods InEnzymology)》(学术出版有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约)；和Ausubel等人，《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Maryland)(1989)。
如本文所用，“不溶于水”是指一种化合物，当所述化合物与水混合时，例如与水在室温(例如约25℃到50℃之间或约25℃与50℃之间)下混合时，不溶解或溶解的程度可以忽略。
II.聚乙二醇化脂质体
本公开提供了至少包含胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质的聚乙二醇化脂质体，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG组分平均分子量是约5000道尔顿或更小。本文所提供的聚乙二醇化脂质体可以进一步包含药剂，例如用于疫苗、治疗或诊断用途的药剂。本文所提供的聚乙二醇化脂质体可以进一步包含TLR促效剂，例如用于上述疫苗、治疗或诊断用途的TLR促效剂。聚乙二醇化脂质体中的每种个别组分的说明和聚乙二醇化脂质体的特征描述于下文中。
A.聚乙二醇化脂质
本文所提供的聚乙二醇化脂质体包含聚乙二醇化脂质(脂质连接至聚乙二醇(PEG))，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约5000道尔顿或更小。已认识到，将连接至PEG的此类脂质与中性非聚乙二醇化脂质和胆固醇组合使用向不含聚乙二醇化脂质的原本中性脂质体赋予稳定性。此类聚乙二醇化脂质的使用实现了聚乙二醇化脂质体结构的长期稳定性且实现了免疫反应的有效刺激。
聚乙二醇化脂质中的PEG特征
在本文所涵盖的实施例中，聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约5000道尔顿或更小。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约2000道尔顿或更小。在特定实施例中，PEG平均分子量在约750道尔顿至约5000道尔顿范围内。在特定实施例中，PEG平均分子量在约750道尔顿至约2000道尔顿范围内。在一些实施例中，PEG平均分子量在约750到1000；750到1500；750到2000；750到2500；750到3000；750到3500；750到4000；750到4500；或750到5000道尔顿范围内。在一些实施例中，PEG平均分子量在约4500到5000；4000到5000；3500到5000；3000到5000；2500到5000；2000到5000；1500到5000；1000到5000；或750到5000道尔顿范围内。在一些实施例中，PEG平均分子量在约500到1000；500到750；或750到1000道尔顿范围内。在一些实施例中，PEG平均分子量在约1500到2500；1500到2000；或2000到2500道尔顿范围内。在一些实施例中，PEG平均分子量在约4500到5500；4500到5000；或2000到5000道尔顿范围内。
在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG750。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG1000。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG1500。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG2000。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG2500。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG3000。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG3500。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG4000。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG4500。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质包含PEG5000。
聚乙二醇化脂质中的脂质特征
本文中预期聚乙二醇化脂质中的脂质组分可以包含能够与胆固醇和非聚乙二醇化中性脂质组分缔合而形成稳定脂质体结构的任何脂质(包括磷脂)。
表1提供能够连接至PEG以用于本发明的示例性脂质的非限制清单。
表1：示例性脂质
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是磷脂或季铵盐脂质。在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是磷脂，所述磷脂是磷脂酰胆碱或磷酸甘油酯。在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含以下部分中的任一种：
其中X-是碱金属相对离子且Y+是卤素相对离子。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含C10-20烷基链。在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含C12-18烷基链。在一些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含C14烷基链、C16烷基链或C18烷基链。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分是阴离子型。在某些实施例中，聚乙二醇化脂质中的脂质组分是阳离子型。在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分所带电荷总体上呈中性。在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是两性离子型。
在某些示例性实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DSPE、DPPE或DMPE。在一个示例性实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DSPE。在另一示例性实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DPPE。在另一示例性实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DMPE。
在本文所述的任一实施例中，所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分可以是DLPE。
在某些实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质摩尔百分比(mol％)在约1mol％至约25mol％范围内。在某些实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质摩尔百分比(mol％)是约1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％、15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％或甚至约25mol％。在一个示例性实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约5mol％。在另一示例性实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约10mol％。在另一个示例性实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约15mol％。在另一示例性实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约20mol％。在另一示例性实施例中，脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约25mol％。
示例性聚乙二醇化脂质
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DSPE-PEG750、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG1500、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2500、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG3500、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG4500或DSPE-PEG5000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DPPE-PEG750、DPPE-PEG1000、DPPE-PEG1500、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG2500、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG3500、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG4500或DPPE-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DMPE-PEG750、DMPE-PEG1000、DMPE-PEG1500、DMPE-PEG2000、DMPE-PEG2500、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG3500、DMPE-PEG4000、DMPE-PEG4500或DMPE-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DPPC-PEG750、DPPC-PEGl000、DPPC-PEG1500、DPPC-PEG2000、DPPC-PEG2500、DPPC-PEG3000、DPPC-PEGS500、DPPC-PEG4000、DPPC-PEG4500或DPPC-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DOPC-PEG750、DOPC-PEG1000、DOPC-PEG1500、DOPC-PEG2000、DOPC-PEG2500、DOPC-PEG3000、DOPC-PEG3500、DOPC-PEG4000、DOPC-PEG4500或DOPC-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DLPC-PEG750、DLPC-PEG1000、DLPC-PEG1500、DLPC-PEG2000、DLPC-PEG2500、DLPC-PEG3000、DLPC-PEG500、DLPC-PEG4000、DLPC-PEG4500或DLPC-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DMPC-PEG750、DMPC-PEG1000、DMPC-PEG1500、DMPC-PEG2000、DMPC-PEG2500、DMPC-PEG3000、DMPC-PEG3500、DMPC-PEG4000、DMPC-PEG4500或DMPC-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是POPC-PEG750、POPC-PEG1000、POPC-PEG1500、POPC-PEG2000、POPC-PEG2500、POPC-PEG3000、POPC-PEG3500、POPC-PEG4000、POPC-PEG4500或POPC-PEG5000。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体中的聚乙二醇化脂质是DSPC-PEG750、DSPC-PEG1000、DSPC-PEG1500、DSPC-PEG2000、DSPC-PEG2500、DSPC-PEG3000、DSPC-PEG3500、DSPC-PEG4000、DSPC-PEG4500或DSPC-PEG5000。
B.非聚乙二醇化中性脂质
本文所提供的聚乙二醇化脂质体还包含非聚乙二醇化中性脂质(中性脂质不连接至聚乙二醇(PEG))。本文中预期脂质体中的非聚乙二醇化中性脂质组分包含带有总体中性电荷或是两性离子型的任何中性脂质(包括中性磷脂)，其能够与聚乙二醇化脂质组分缔合而形成稳定的脂质体结构。
如本文所提供，非聚乙二醇化中性脂质的电荷总体上呈中性。在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质是两性离子型。在一些变化形式中，聚乙二醇化脂质体中的中性非聚乙二醇化脂质组分能够使聚乙二醇化脂质体的电荷总体上呈中性。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的非聚乙二醇化中性脂质组分包含C10-20烷基链。在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质组分包含C12-18烷基链。在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质包含C14烷基链、C16烷基链或C18烷基链。
在一些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质是DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE。
在某些实施例中，脂质体中的非聚乙二醇化中性脂质摩尔百分比(mol％)在约45mol％至约98mol％范围内。在某些实施例中，脂质体中的非聚乙二醇化中性脂质摩尔百分比(mol％)是约45mol％、50mol％、55mol％、60mol％、65mol％、70mol％、75mol％、80mol％、85mol％、90mol％、95mol％或甚至约98mol％。在一个示例性实施例中，脂质体中的非聚乙二醇化中性脂质mol％是约45mol％。
在一个示例性实施例中，非聚乙二醇化中性脂质相对于聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是9.8:0.8。在一个示例性实施例中，非聚乙二醇化中性脂质相对于聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是18:3。
在一个示例性实施例中，非聚乙二醇化中性脂质DPPC相对于聚乙二醇化脂质DPPE-PEG2000的脂质摩尔比是9.8:0.8。在一个示例性实施例中，非聚乙二醇化中性脂质DPPC相对于聚乙二醇化脂质DPPE-PEG750的脂质摩尔比是9.8:0.8。在一个示例性实施例中，非聚乙二醇化中性脂质DPPC相对于聚乙二醇化脂质DPPE-PEG750的脂质摩尔比是18:3。
C.胆固醇
本文所提供的聚乙二醇化脂质体包含胆固醇(包括含胆固醇化合物)。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％在以下范围内：约1mol％至约50mol％、约5mol％至约50mol％、约10mol％至约50mol％、约20mol％至约50mol％、约25mol％至约50mol％、约5mol％至约10mol％、约5mol％至约20mol％、约5mol％至约25mol％、约10mol％至约20mol％、约10mol％至约25mol％、约20mol％至约30mol％、约20mol％至约40mol％，或甚至约1mol％至约10mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约50mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约45mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约40mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约35mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约30mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约25mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约20mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约15mol％。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约10mol％。聚乙二醇化脂质体中的胆固醇mol％是约5mol％。
在某些实施例中，胆固醇相对于非聚乙二醇化中性脂质相对于聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约5.7:9.8:0.8。在某些实施例中，胆固醇相对于非聚乙二醇化中性脂质相对于聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约5.5:18:3。
在某些实施例中，胆固醇相对于非聚乙二醇化中性脂质DPPC相对于聚乙二醇化脂质DPPE-PEG2000的脂质摩尔比是约5.7:9.8:0.8。在某些实施例中，胆固醇相对于非聚乙二醇化中性脂质DPPC相对于聚乙二醇化脂质DPPE-PEG750的脂质摩尔比是约5.7:9.8:0.8。在某些实施例中，胆固醇相对于非聚乙二醇化中性脂质DPPC相对于聚乙二醇化脂质DPPE-PEG750的脂质摩尔比是约5.5:18:3。
D.TLR促效剂
如本文所述，本文所述的聚乙二醇化脂质体可以包含一种或多种铎样受体促效剂(TLR促效剂)。铎样受体(TLR)包括先天免疫系统的细胞表面跨膜受体，其赋予宿主细胞早期识别多种保守微生物分子结构(如可以存在于大量感染性病原体中或上)的能力。诱导TLR介导信号转导以强化先天免疫系统引发免疫反应可以利用与细胞表面TLR接合的TLR促效剂实现。举例来说，脂多糖(LPS)可以是通过TLR2或TLR4的TLR促效剂(Tsan等人，《白细胞生物学杂志(J.Leuk.Biol.)》76:514；Tsan等人，2004，《美国生理学-细胞生理学杂志(Am.J.Physiol.Cell Phsiol.)》286:C739；Lin等人，2005《休克(Shock)》24:206)；聚(肌苷-胞苷)(polyI:C)可以是通过TLR3的TLR促效剂(Salem等人，2006《疫苗(Vaccine)》24:5119)；CpG序列(含有未甲基化胞嘧啶-鸟苷或“CpG”二核苷酸基序的寡脱氧核苷酸，例如CpG 7909，Cooper等人，2005 AIDS 19:1473；CpG 10101，Bayes等人，《实验和临床药理学方法和发现(Methods Find Exp Clin Pharmacol)》27:193；Vollmer等人，《关于生物学疗法的专家意见(Expert Opinion on Biological Therapy)》5:673；Vollmer等人，2004《抗微生物剂与化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)》48:2314；Deng等人，2004《免疫学杂志(J.Immunol.)》173:5148)可以是通过TLR9的TLR促效剂(Andaloussi等人，2006《Glia》54:526；Chen等人，2006《免疫学杂志》177:2373)；肽葡聚糖可以是TLR2和/或TLR6促效剂(Soboil等人，2006《生殖生物学(Biol.Reprod.)》75:131；Nakao等人，2005《免疫学杂志》174:1566)；3M003(4-胺基-2-(乙氧基甲基)-α,α-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇水合物(分子量318Da，得自3M制药公司(St.Paul,MN)，其也是相关化合物3M001和3M002的来源；Gorden等人，2005《免疫学杂志》174:1259)可以是TLR7促效剂(Johansen 2005《临床和实验过敏(Clin.Exp.Allerg.)》35:1591)和/或TLR8促效剂(Johansen 2005)；鞭毛蛋白可以是TLR5促效剂(Feuillet等人，2006《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》103:12487)，且C型肝炎抗原可以通过TLR7和/或TLR9充当TLR促效剂(Lee等人，2006《美国国家科学院院刊》103:1828；Horsmans等人，2005《肝病学(Hepatol.)》42:724)。其它TLR促效剂已知(例如Schirmbeck等人，2003《免疫学杂志》171:5198)且可以根据本文所述的某些实施例使用。
在各种实施例中，TLR促效剂可以是TLR2促效剂、TLR3促效剂、TLR4促效剂、TLR5促效剂、TLR6促效剂、TLR7促效剂、TLR8促效剂、TLR7/8促效剂、TLR9促效剂、其组合。
TLR7/8促效剂
本文提供了可以用于本文所述组合物中的TLR7/8促效剂。如本文所用，“TLR7/8促效剂”是指一种促效剂，其通过其与TLR7、TLR8或两者的相互作用来影响其生物活性。此类生物活性包括(但不限于)诱导TLR7和/或TLR8介导信号转导，以通过先天免疫系统强化免疫反应。在一些实施例中，TLR是咪唑并喹啉、含咪唑并喹啉化合物，或咪唑并喹啉胺衍生物(参见例如美国专利第4,689,338号(Gerster))，但是还知道其它化合物类别(参见例如美国专利第5,446,153号(Lindstrom等人)；美国专利第6,194,425号(Gerster等人)；和美国专利第6,110,929号(Gerster等人)；和国际公开案第W02005/079195号(Hays等人))。
在某些实施例中，本文所述组合物中所用的TLR7/8促效剂包含咪唑并喹啉衍生物，如Shi等人(《ACS药物化学快报(ACS Med.Chem.Lett.)》，2012，3(6)，第501-504页)，其内容以全文引入的方式并入本文中。
在一些实施例中，TLR7/8包含咪唑并喹啉或含咪唑并喹啉化合物。在一些实施例中，咪唑并喹啉是咪喹莫特(imiquimod)(称为IMQ或R 837)，一种免疫反应调节剂。在一些实施例中，咪唑并喹啉是雷西莫特(resiquimod)(R848)，一种充当免疫反应调节剂的药物(Tornai MA，Miller RL，Lipson KE，Kieper WC，Zarraga IE，Vasiiakos JP(2007年10月)，“作为疫苗佐剂的雷西莫特和其它免疫反应调节剂(Resiquimod and other immuneresponse modifiers as vaccine adjuvants)”，《疫苗专家评论(Expert Review ofVaccines)》6(5):835-47.)。在某些实施例中，TLR 7/8促效剂是CL075。
举例来说，在某些实施例中，TLR7/8促效剂是具有以下式(I)结构的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中：
R11选自由氢和C1-6烷基组成的群组，其中所述C1-6烷基任选地被一个或多个选自由卤基、羟基和C1-6烷氧基组成的群组的基团取代；
R12选自由氢和羧基酯组成的群组；且
R13选自由氢和C1-6烷基组成的群组，其中所述C1-6烷基任选地被一个或多个选自由卤基、羟基和C1-6烷氧基组成的群组的基团取代。
在式(I)的一些实施例中，R11是氢。在一些实施例中，R11是C1-6烷基。在一些实施例中，R11是甲基、乙基、正丙基或正丁基。在一些实施例中，R11是正丁基。在一些实施例中，R11是C1-6烷基，其是被取代的C1-6烷氧基。在一些实施例中，R11是-CH2-O-CH2-CH3。
在式(I)的一些实施例中，R12是氢。在一些实施例中，R12是羧基酯。在一些实施例中，R12是-C(O)O-C1-4烷基。在一些实施例中，R12是-C(O)O-CH3。
在式(I)的一些实施例中，R13是C1-6烷基。在一些实施例中，Rl3是C2-4烷基。在一些实施例中，R13是-CH2-CH(CH3)2。
在一些实施例中，R13是被卤基、羟基或C1-6烷氧基取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R13是被羟基取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R13是被羟基取代的C2-4烷基。在一些实施例中，R13是-CH2-C(CH3)2OH。
在某些实施例中，TLR7/8促效剂是具有以下式(II)结构的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中：
R11选自由氢和C1-6烷基组成的群组，其中所述C1-6烷基任选地被一个或多个选自由卤基、羟基和C1-6烷氧基组成的群组的基团取代；
R12选自由氢和羧基酯组成的群组，且
Rl3a选自由氢和羟基组成的群组。
在式(II)的一些实施例中，R11是氢。在一些实施例中，R11是C1-6烷基。在一些实施例中，R11是甲基、乙基、正丙基或正丁基。在一些实施例中，R11是正丁基。在一些实施例中，R11是C1-6烷基，其是被取代的C1-6烷氧基。在一些实施例中，R11是-CH2-O-CH2-CH3。
在式(II)的一些实施例中，R12是氢。在一些实施例中，R12是羧基酯。在一些实施例中，R12是-C(O)O-C1-4烷基。在一些实施例中，R12是-C(O)O-CH3。
在式(II)的一些实施例中，R13a是羟基。在一些实施例中，R13a是氢。
在某些实施例中，TLR7/8促效剂是具有以下式(III)结构的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中：
R11选自由氢和C1-6烷基组成的群组，其中所述C1-6烷基任选地被一个或多个选自由卤基、羟基和C1-6烷氧基组成的群组的基团取代；
R12选自由氢和羧基酯组成的群组；且
R13b是C1-6烷基，其任选地被一个或多个选自由以下组成的群组的基团取代：卤基、羟基、C1-6烷氧基和酰基胺基。
在式(III)的一些实施例中，R11是氢。在一些实施例中，R11是C1-6烷基。在一些实施例中，R11是甲基、乙基、正丙基或正丁基。在一些实施例中，R11是正丁基。在一些实施例中，R11是C1-6烷基，其是被取代的C1-6烷氧基。在一些实施例中，R11是-CH2-O-CH2-CH3。
在式(III)的一些实施例中，R12是氢。在一些实施例中，R12是羧基酯。在一些实施例中，R12是-C(O)O-C1-4烷基。在一些实施例中，R12是-C(O)O-CH3。
在式(III)的一些实施例中，R13b是C2-4烷基，其被酰基胺基取代。在一些实施例中，R13b是-(CH2)4-酰基胺基。在一些实施例中，R13b是-(CH2)4-NH-C(O)-C1-25烷基。在一些实施例中，R13b是-(CH2)4-NH-C(O)-C15-25烷基。在一些实施例中，R13b是-(CH2)4-NH-C(O)-C15-20烷基。在一些实施例中，R13b是-(CH2)4-NH-C(O)-C17烷基。
在某些实施例中，TLR7/8促效剂是具有以下式(IV)结构的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中：
R10选自由氢和C1-6烷基组成的群组；且
R11b是C1-6烷基，其任选地被一个或多个选自由以下组成的群组的基团取代：卤基、羟基、C1-6烷氧基和酰基胺基。
在式(IV)的一些实施例中，R10是氢。在一些实施例中，R10是C1-6烷基。在一些实施例中，R10是甲基、乙基、正丙基或正丁基。在一些实施例中，R10是正丁基。
在式(IV)的一些实施例中，R11b是C2-4烷基，其被酰基胺基取代。在一些实施例中，R11b是-(CH2)4-酰基胺基。在一些实施例中，R11b是-(CH2)4-NH-C(O)-C1-25烷基。在一些实施例中，R11b是-(CH2)4-NH-C(O)-C15-25烷基。在一些实施例中，R11b是-(CH2)4-NH-C(O)-C15-20烷基。在一些实施例中，R11b是-(CH2)4-NH-C(O)-C17烷基。
在某些实施例中，TLR7/8促效剂是具有任一以下结构的化合物或其医药学上可接受的盐：
在某些实施例中，TLR7/8促效剂是具有以下结构的化合物或其医药学上可接受的盐：
在某些示例性实施例中，本文组合物中所用的TLR7/8促效剂包含N-(4-{[4-胺基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]氧基}丁基)十八烷酰胺)，如美国专利第9,242,980号中所述的3M-052。
TLR4促效剂
本文提供了可以用于本文所述组合物中的TLR4促效剂。在某些实施例中，本文组合物中所用的TLR4促效剂包含葡糖吡喃糖基脂质佐剂(GLA)，如美国专利公开第US2007/021017号、第US2009/045033号、第US2010/037466号和第US2010/0310602号中所述的那些佐剂，所述专利的内容以全文引入的方式并入本文中。
举例来说，在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下式(V)结构的合成GLA佐剂：
或其医药学上可接受的盐，其中：
L1、L2、L3、L4、L5和L6是相同或不同的且独立地是-O-、-NH-或-(CH2)-；
L7、L8、L9和L10是相同或不同的且独立地为不存在的或为-C(＝O)-；
Y1是酸官能基；
Y2和Y3是相同或不同的且独立地是-OH、-SH或酸官能基；
Y4是-OH或-SH；
R1、R3、R5和R6是相同或不同的，且独立地是C8-13烷基；且
R2和R4是相同或不同且独立地是C6-11烷基。
在合成GLA结构的一些实施例中，R1、R3、R5和R6是C10烷基；且R2和R4是C8烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C9烷基。
举例来说，在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下式(VI)结构的合成GLA佐剂：
在一个特定实施例中，R1、R3、R3和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C12-C20烷基。
在另一特定实施例中，GLA具有上述式，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基，且R2和R4是C13烷基。
在另一特定实施例中，GLA具有上述式，其中R1、R3、R5和R6是C10烷基；且R2和R4是C8烷基。
在另一特定实施例中，GLA具有上述式，其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C9烷基。
在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下式(VII)结构的合成GLA佐剂：
在上述GLA结构的某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基，且R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C9烷基。
在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下式(VIII)结构的合成GLA佐剂：
在上述GLA结构的某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基，且R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C9烷基。
在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下式(IX)结构的合成GLA佐剂：
在上述GLA结构的某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基，且R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C9烷基。
在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下结构的合成GLA佐剂：
在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下结构的合成GLA佐剂：
在某些实施例中，TLR4促效剂是具有以下结构的合成GLA佐剂：
在另一个实施例中，将减毒的脂质A衍生物(ALD)并入本文所述的组合物中。ALD是脂质A样分子，其已被改变或构建，以便分子呈现脂质A更小或不同的不利影响。这些不利影响包括致热原性、局部施瓦茨曼反应性(Shwarzman reactivity)和毒性，如鸡胚50％致死性剂量分析(CELD50)中所评估。根据本发明使用的ALD包括单磷酰脂质A(MPL)和3-脱酰基化单磷酰脂质A(3D-MPL)。MPL和3D-MPL是已知的且本文中无需详细描述。参见例如美国专利第4,436,727号，其公开了单磷酰脂质A和其制造。美国专利第4,912,094号和复审凭证B1美国专利第4,912,094号涵盖了3-脱酰基化单磷酰脂质A和其制造方法。另外，参见例如GB2220211和WO 92/116556。3 De-O-酰基化单磷酰脂质A已从GB 2220211(Ribi)获知。在化学上，其是3 De-O-酰基化单磷酰脂质A与4,5或6酰基化链的混合物且由Ribi ImmunochemMontana制造。国际专利申请第WO 92/116556号中公开了某种形式的3De-O-酰基化单磷酰脂质A。这些专利中的每一个关于MPL和3D-MPL的公开内容皆以引入的方式并入本文中。
在上述TLR4促效剂化合物中，总体电荷可以根据分子中的官能基确定。举例来说，磷酸酯基可以带负电或呈中性，这视磷酸酯基的电离状态而定。
示例性TLR促效剂实施例
在一些实施例中，TLR促效剂与聚乙二醇化脂质体的脂质双层缔合。
在一些实施例中，TLR促效剂被包封于聚乙二醇化脂质中。
在一些实施例中，TLR促效剂是使非聚乙二醇化脂质体结构分裂的促效剂。
在一些实施例中，TLR促效剂包含疏水性尾。在一些实施例中，TLR促效剂的疏水性尾与聚乙二醇化脂质体的脂质双层缔合。
在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR4、SLA、GLA、MPL、3D-MPL、R848、R837或其组合。
在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR4促效剂。
在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR 7/8促效剂。
在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR7促效剂。
在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR8促效剂。
在一些实施例中，TLR促效剂包含咪唑并喹啉。
在一些实施例中，TLR促效剂包含3M-052。
在一些实施例中，TLR促效剂包含TLR4促效剂与TLR7/8促效剂的组合。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含3M-052和GLA。
E.药剂
本文所提供的聚乙二醇化脂质体可以进一步包含一种或多种药剂，其中所述药剂可以是多肽、聚核苷酸、抗原、佐剂、诊断剂、治疗剂、生物体、基因组或病毒。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含两种或更多种药剂。
在一些实施例中，所述药剂与聚乙二醇化脂质体缔合。在一些实施例中，所述药剂通过配体交换和/或通过静电(基于电荷)相互作用而与聚乙二醇化缔合。
在某些实施例中，所述药剂可以是聚乙二醇化脂质体的约0.01到1重量％。
多肽
在一些实施例中，所述药剂是多肽。在一些实施例中，所述多肽是全长蛋白质或其片段。在一些实施例中，所述多肽是肽。在一些实施例中，所述多肽是融合蛋白。在一些特定实施例中，所述融合蛋白在投与个体后能够诱发免疫反应。在一些实施例中，所述多肽是如下文进一步描述的抗原。
抗原
在一个实施例中，所述药剂包含抗原。
在一些实施例中，所述多肽抗原涉及或来源于过敏、癌症或感染性疾病。
在一些实施例中，本文所述的组合物适用于疫苗接种目的，且作为疫苗配制物(疫苗组合物)提供。
抗原可以是期望诱发或增强受试者的免疫反应性所针对的任何目标抗原决定基、分子(包括生物分子)、分子复合物(包括含有生物分子的分子复合物)、亚细胞组装体、细胞或组织。术语抗原常常指所关注的多肽抗原。然而，如本文所用，抗原还可以指编码所关注多肽抗原的重组构筑体(例如表现构筑体)。在某些实施例中，抗原可以是或可以来源于以下或可以与以下具有免疫交叉反应性：与感染、癌症、自体免疫疾病、过敏、哮喘或任何其它病状相关的感染性病原体和/或抗原决定基、生物分子、细胞或组织，其中刺激抗原特异性免疫反应为所期望的或有益的。
某些实施例涵盖的抗原来源于至少一种感染性病原体，如细菌、病毒或真菌，包括放线菌，如结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌或另一种分枝杆菌、细菌如沙门氏菌属(Salmonella)、奈瑟菌属(Neisseria)、疏螺旋体属(Borrelia)、衣原体属(Chlamydia)或博特氏杆菌属(Bordetella)成员；病毒，如单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、细胞巨大病毒、水痘带状疱疹(Varicella Zoster)病毒、肝炎病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、呼吸道合胞体病毒、人类乳头瘤病毒(HPV)和细胞巨大病毒；HIV，如HIV-1或HIV-2；真菌，如曲霉属(Aspergillus)、芽生菌属(Blastomyces)、球霉菌属(Coccidioides)和肺囊虫(Pneumocysti)，或酵母，包括念珠菌种，如白色念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)、热带念珠菌(C.tropicalis)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)；寄生虫，如原虫，例如疟原虫种，包括恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，或另一种寄生虫，如以下中的一种或多种：棘阿米巴(Acanthamoeba)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、血管圆线虫(Angiostrongylus)、曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansonii)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本裂体吸虫(Schistosoma japonicum)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、钩虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、不相称内阿米巴(Entamoeba dispar)、哈门氏内阿米巴(Entamoeba hartmanni)、波列基内阿米巴(Entamoeba polecki)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、梨形鞭毛虫(Giardia)和利什曼原虫(Leishmania)。在特定实施例中，抗原可以来自或与涉及肺结核、流感、阿米巴病、HIV、肝炎或利什曼体病的抗原有关。
在一些实施例中，所述抗原是阿米巴病相关抗原。在一些实施例中，所述抗原是致阿米巴病抗原。在一些实施例中，所述抗原来自致阿米巴病生物体。在一些实施例中，所述抗原来自溶组织内阿米巴。在一个实施例中，所述抗原包含LecA。在一个实施例中，抗原是LecA。
在一些实施例中，所述抗原是流感相关抗原。在一些实施例中，所述抗原是致流感抗原。在一些实施例中，所述抗原来自致流感病毒。在一个实施例中，所述抗原包含H5N1。在一个实施例中，所述抗原包含H5N1。
举例来说，在某些实施例中，抗原来源于疏螺旋体属，所述抗原可以包括核酸、病原体源抗原或抗原制剂、重组产生的蛋白质或肽，和嵌合融合蛋白。一种此类抗原是OspA。OspA可以是通过其在宿主细胞中生物合成而得的完整成熟蛋白质的脂质化形式(Lipo-OspA)，或可以替代地是非脂质化衍生物。此类非脂质化衍生物包括非脂质化NSl-OspA融合蛋白，其具有流感病毒的非结构蛋白质(NS1)的前81个N末端氨基酸和完整的OspA蛋白质，和另一种，MDP-OspA是携带3个额外N末端氨基酸的OspA的非脂质化形式。
在某些实施例中，所述抗原来源于病毒，如来自HIV-1(如tat、nef、gp120或gp160)、人类疱疹病毒(如gD或其衍生物或即刻早期蛋白，如来自HSV1或HSV2的ICP27)、细胞巨大病毒((尤其人类)(如gB或其衍生物)、轮状病毒(包括活减毒病毒)、埃-巴二氏病毒(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(如gpI、II和IE63)，或来自肝炎病毒，如B型肝炎病毒(例如B型肝炎表面抗原或其衍生物)、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒和E型肝炎病毒，或来自其它病毒病原体，如副粘病毒:呼吸道合胞体病毒(如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类乳突状瘤病毒(例如HPV6、11、16、18等)、黄病毒(例如黄热病病毒、登革热病毒、扁虱传播的脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒(完整的活病毒或不活化病毒、裂解流感病毒，生长于卵或MDCK细胞中，或完整流感病毒颗粒(如Gluck，《疫苗》，1992，10，915-920所述)，或其提纯或重组蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白，或其组合)。
在某些其它实施例中，所述抗原来源于一种或多种细菌病原体，如奈瑟氏菌属(Neisseria spp)，包括淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)(例如荚膜多糖和其结合物、转铁蛋白-结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；酿脓链球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变形链球菌:杜克雷嗜血杆菌(S.mulans:H.ducreyi)；莫拉菌属(Moraxella spp)，包括卡他莫拉菌(M catarrhalis)，也称为卡他布拉汉菌(Branhamellacatarrhalis)(例如高和低分子量粘附素和侵袭素)；博德特氏菌属(Bordetella spp)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状血球凝集素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，包括肺结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、85B或85C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuherculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团菌属(Legionella spp)，包括嗜肺性军团杆菌(L.pneumophila)；埃希氏菌属(Escherichia spp)，包括肠毒性大肠杆菌(例如拓殖因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒素或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素或其衍生物)；弧菌属(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺氏菌属(Shigella spp)，包括索内志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、痢疾富勒氏菌(S.flexnerii)；耶尔森氏菌属(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、伪结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲杆菌属(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌；沙门氏菌属(Salmonella spp)，包括伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；李斯特菌属(Listeria spp.)，包括产单核细胞李斯特菌(P.aeruginosa)；螺旋杆菌属(Staphylococcus spp.)，包括幽门螺旋杆菌(S.aureus)(例如尿素酶、催化酶、空泡毒素)；假单胞菌属(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌属(Enterococcus spp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；梭菌属(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤风毒素和其衍生物)、肉毒芽孢梭菌(C.botulinum)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B和其衍生物)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)；棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋体属(Borrelia spp.)，包括伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安德森疏螺旋体(B.andersonii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫母斯氏疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希体属(Ehrlichia spp.)，包括马埃里希体(E.equi)和人类粒细胞埃立克体病媒介；立克次体属(Rickettsia spp)，包括李克特立克次体(R.rickettsir)；衣原体属(Chlamydia spp.)，包括沙眼衣原体(C.trachomatis)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体属(Leptospira spp)，包括钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体属(Treponema spp.)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如罕见的外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T denticola)、猪痢疾密螺旋体(T hyodysenteriae)；或其它细菌病原体。
在某些其它实施例中，所述抗原来源于一种或多种寄生虫(参见例如John,D.T.和etri,W.A.，《马尔科尔与沃格医学寄生虫学(Markell and Voge's MedicalParasitology)》第9版，2006，WB Saunders，Philadelphia；Bowman,D.D.,《佐治亚兽医寄生虫学(Georgia'Parasitology for Veterinarians)》第8版，2002，WB Saunders，Philadelphia)，如疟原虫属(Plasmodium spp.)，包括恶性疟原虫(P.falciparum)；弓虫属(Toxoplasma spp.)，包括刚地弓形虫(T gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；内阿米巴属，包括溶组织内阿米巴；巴倍虫属(Babesia spp.)，包括田鼠巴倍虫(B.microti)；锥虫属(Trypanosoma spp.)，包括克鲁兹锥虫(T.cruzi)；梨形鞭毛虫属，包括拉姆达梨形鞭毛虫(G.lambda)；利什曼原虫属(Leshmania spp.)，包括主要利什曼原虫(L.major)；肺囊虫属，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫属(Trichomonas spp.)，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)，或来自能够感染哺乳动物的蠕虫，如：(i)线虫感染(包括(但不限于)蠕形住肠线虫(Enterobius vermicularis)、似蚓蛔线虫(Ascaris lumbricoides)、毛首鞭形线虫(Trichuris trichuria)、美洲板口线虫(Necator americanus)、十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、麦地那龙线虫(Dracanculusmedinensis)、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)；(ii)吸虫感染(包括(但不限于)曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及裂体吸虫(Schistosoma haematobium)、日本裂体吸虫(Schistosoma japonicmu)、湄公河裂体吸虫(Schistosoma mekongi)、华支睾吸虫(Opisthorchis sinensis)、并殖吸虫属(Paragonimus sp)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、大拟片吸虫(Fasciola magna)、大片吸虫(Fasciola gigantica)；和(iii)绦虫感染(包括(但不限于)牛带绦虫(Taeniasaginata)和有钩绦虫(Taenia solium))。在某些实施例中，所述抗原来源于裂体吸虫属、曼森氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫和/或日本裂体吸虫，或来源于酵母，如念珠菌属，包括白色念珠菌；隐球酵母属，包括新生隐球菌(C.neoformans)。
其它特异性抗原来源于结核分枝杆菌，例如Th Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。结核分枝杆菌蛋白质还包括融合蛋白和其变异体，其中结核分枝杆菌的至少两种、三种或四种或更多种多肽融合成较大蛋白质。某些融合物包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erdl4DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99151748)。可以使用的其它抗原包括抗原、抗原组合，以及US 2010/0129391和WO 2008/124647中所述的融合蛋白。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID93。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID91。
其它特异性抗原来源于衣原体属，且包括例如高分子量蛋白质(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)和推定膜蛋白(Pmps)。其它衣原体属抗原可以选自WO 99128475中所述的群组。某些抗原可以来源于链球菌属，包括肺炎链球菌(例如荚膜多糖和其结合物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白质抗原肺炎链球菌溶血素(《生物化学与生物物理文献学报(Biochem Biophys Acta)》，1989，67，1007；Rubins等人，《微生物发病机制(Microbial Pathogenesis)》，和其突变型解毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它细菌疫苗包含来源于嗜血杆菌属(包括B型流感嗜血杆菌(例如PRP和其结合物)、不可分型的流感嗜血杆菌(例如OMP26))的抗原、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白质D和脂蛋白D，以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(美国专利第5,843,464号)或多拷贝变异体或其融合蛋白。
其它特异性抗原来源于B型肝炎。B型肝炎表面抗原衍生物在所属领域中是众所周知的且尤其包括欧洲专利申请EP-A414 374、EP-A-0304 578和EP 198474中所述的那些PreS1、Pars2S抗原抗原。在一个方面中，抗原是HIV-1 gp120，尤其当表达于CHO细胞中时。在另一个实施例中，所述抗原是gD2t。
在其它实施例中，所述抗原来源于人类乳头瘤病毒(HPV)，其被认为引起生殖器疣(HPV 6或HPV 11等)，和HPV病毒，其引起子宫颈癌(HPV16、HPV18等)。特定抗原包括L1颗粒或衣壳体，和包含一种或多种抗原的融合蛋白，所述抗原选自HPV6和HPV11蛋白质E6、E7、L1和L2。融合蛋白的某些形式包括WO 96/26277中所公开的L2E7，和GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中所公开的蛋白质D(1/3)-E7。其它可能抗原包括HPV 16或18抗原。举例来说，L1或L2抗原单体，或L1或L2抗原一起作为病毒样颗粒(VLP)呈递，或单独的L1蛋白质单独以VLP或荚膜聚体结构呈递。此类抗原、病毒样颗粒和荚膜聚体本身是已知的。参见例如WO94/00152、W094/20137、WO94/05792和WO93/02184。
在其它实施例中，所述抗原是融合蛋白。融合蛋白可以单独或作为融合蛋白(如E7、E2或F5)包括在内；特定实施例包括包含L1E7融合蛋白的VLP(WO 96/11272)。特定的HPV16抗原包含早期蛋白质E6或F7与蛋白质D载剂的融合，以由HPV16形成蛋白质D-E6或E7融合物；或E6或E7与L2的组合(WO 96/26277)。或者，HPV 16或18早期蛋白质E6和E7可以作为单分子呈递，例如蛋白质D-E6/E7融合物。组合物可以任选地含有E6和E7蛋白质前端HPV18中的任一种或两种，例如呈蛋白质D-E6或蛋白质D-E7融合蛋白或蛋白质D E6/E7融合蛋白形式。组合物可以另外包含来自其它HPV株的抗原，例如来自株系HPV31或33的抗原。
抗原还可以来源于引起疟疾的寄生虫。举例来说，来自恶性疟原虫(Plasmodiafalciparum)的抗原包括RTS,S和TRAP。RTS是一种杂交蛋白质，其包含恶性疟原虫的环子孢子(CS)蛋白质的基本上所有C末端部分，所述C末端部分通过B型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸连接到B型肝炎病毒的表面(S)抗原。其整个结构公开于作为WO 93/10152公开的国际专利申请第PCT/EP92/02591号中，所述专利要求英国专利申请第9124390.7号的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，且当其与来自HBV的S抗原共表达时，其产生混合颗粒，称为RTS,S。
TRAP抗原描述于作为WO 90/01496公开的国际专利申请第PCT/GB89/00895号。本发明的一个实施例是疟疾疫苗，其中抗原制剂包含RTS,S与TRAP抗原的组合。可能成为多阶段疟疾疫苗组分的候选物的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27125、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和其疟原虫属类似物。
在一个实施例中，所述抗原来源于癌细胞，也可以适用于癌症的免疫治疗性疗法。举例来说，所述抗原可以是肿瘤排斥抗原，如前列腺、乳房、结肠直肠、肺、胰脏、肾或黑色素瘤癌症的排斥抗原。示例性癌症或癌细胞源抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4或其它MAGE抗原(如WO99/40188中所公开的那些抗原)、FRAME、BAGE、Lage(也称为NY Eos 1)、SAGE和HAGE(WO99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996《免疫学新见解(Current Opinions inImmunology)》8，第628-636页；Van den Eynde等人，《国际临床和实验室研究杂志(International Journal of Clinical&Laboratory Research)》(1997和1998)；Correale等人(1997)，《国家癌症研究所杂志(Journal of the National Cancer Institute)》89，第293页。癌症抗原的这些非限制性实例表达于多种多样的肿瘤类型中，如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。参见例如美国专利第6,544,518号。
其它肿瘤特异性抗原包括(但不限于)肿瘤特异性或肿瘤相关的神经节苷脂，如GM2和GM3或其与载体蛋白的结合物；或自我肽激素，如全长促性腺素激素释放激素(GnRH，WO95/20600)，一种短10个氨基酸的长肽，其适用于治疗多种癌症。在另一个实施例中，使用前列腺抗原，如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(例如《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》95(4)1735-1740 1998)、PSMA或在一个实施例中，称为前列腺酶(Prostase)的抗原。(例如Nelson等人，《美国国家科学院院刊》(1999)96:3114-3119；Ferguson等人，《美国国家科学院院刊》1999.96，3114-3119；WO 98/12302；美国专利第5,955,306号；WO 98/20117；美国专利第5,840,871号和第5,786,148号；WO 00/04149。其它前列腺特异性抗原从WO 98/137418和WO/004149已知。另一种是STEAP(PNAS 9614523 145287-12 1999)。
适用于本发明背景下的其它肿瘤相关抗原包括：Plu-1(《生物化学杂志(JBiol.Chem)》274(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HASH-2、Cripto(Salomon等人，《生物分析(Bioessays)》199，21:61-70；美国专利第5,654,140号)和隐停(Criptin)(美国专利第5,981,215号)。另外，与癌症治疗疫苗特别相关的抗原还包含酪氨酸酶和存活素。
在其它实施例中，本发明组合物中所用的药剂包括与呼吸道疾病(如细菌感染(例如肺炎球菌)所引起或加剧的那些疾病)相关的抗原，其用于预防和治疗如慢性阻塞性肺病(COPD)病状。COPD在生理学上定义为慢性支气管炎和/或肺气肿患者存在不可逆或部分可逆的呼吸道阻塞(《美国呼吸和重症护理医学杂志(Am J Respir Crit Care Med.)》1995年11月；152(5Pt 2):S77-121)。COPD恶化通常由细菌(例如肺炎球菌)感染引起(《临床微生物学评论(Clin Microbiol Rev.)》2001年4月，14(2):336-63)。
聚核苷酸
在一些实施例中，所述药剂是聚核苷酸。聚核苷酸包括(但不限于)DNA、RNA、适体和寡核苷酸。在一些实施例中，聚核苷酸是DNA。在一些实施例中，所述聚核苷酸是RNA。在一些实施例中，DNA或RNA是单链或双链的。在一些实施例中，所述聚核苷酸是非编码RNA。在一些实施例中，所述聚核苷酸是编码RNA。在一些实施例中，所述RNA选自由以下组成的群组：复制子RNA、mRNA、tRNA、siRNA、shRNA和微RNA。
在一些实施例中，所述聚核苷酸编码多肽。在一些实施例中，所述聚核苷酸编码作为抗原的多肽或包含抗原的多肽。在一些实施例中，由聚核苷酸编码的多肽是融合蛋白。在一些实施例中，由聚核苷酸编码的多肽是LecA。在一些实施例中，由聚核苷酸编码的多肽是H5N1。在一些实施例中，由聚核苷酸编码的多肽是ID93。
在一些实施例中，所述聚核苷酸是复制子。在一些实施例中，所述复制子是能够在其自身控制下复制的质体、粘质体、穿梭载体、噬菌体或病毒。在一些实施例中，所述复制子是RNA或DNA。在一些实施例中，所述复制子是单链或双链的。在一些实施例中，所述复制子来源于RNA病毒。
佐剂
在一些实施例中，本文所提供的聚乙二醇化脂质体进一步包含佐剂或可以与共佐剂共投与。在一些实施例中，佐剂选自由以下组成的群组：视黄酸(RA)、AS-2、单磷酰脂质A、3-de-O-酰基化单磷酰脂质A、IFA、QS21、CWS、TOM、AGP、含有CpG的寡核苷酸，铎样受体(TLR)促效剂、Leif皂素、皂素模拟物、生物学和合成脂质A、咪喹莫特、伽迪莫特、雷西莫特、聚I:C、鞭毛蛋白(flagellin)、GLA、SLA、刺激素(Stingin)和其组合。
生物体
在一些实施例中，本文所提供的聚乙二醇化脂质体包含生物体。举例来说，溶组织内阿米巴、致流感病毒，或引起肺结核(TB)的细菌结核分枝杆菌。当前，活细菌疫苗接种是用于诱导保护性免疫对抗肺结核的最有效方法。用于此目的的最常见分枝杆菌是卡介菌(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)，牛分枝杆菌的一种无毒株系。因此，在一些实施例中，所述组合物包含聚乙二醇化脂质体和分枝杆菌。
在一些实施例中，所述药剂是病毒或病毒基因组。因此，在这些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含病毒或病毒基因组。
F.示例性聚乙二醇化脂质体
在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质在本发明聚乙二醇化脂质体中的脂质摩尔比是约9.8:5.7:0.8。
在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质在本发明聚乙二醇化脂质体中的脂质摩尔比是约18:5.5:3。
在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质DPPC:胆固醇:聚乙二醇化脂质DPPE-PEG750在本发明聚乙二醇化脂质体中的脂质摩尔比是约9.8:5.7:0.8。
在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质DPPC:胆固醇:聚乙二醇化脂质DPPE-PEG2000在本发明聚乙二醇化脂质体中的脂质摩尔比是约9.8:5.7:0.8。
在某些实施例中，非聚乙二醇化中性脂质DPPC:胆固醇:聚乙二醇化脂质DPPE-PEG750在本发明聚乙二醇化脂质体中的脂质摩尔比是约18:5.5:3。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体包含LecA抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含LecA抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，所述聚乙二醇化脂质体包含H5N1抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含H5N1抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含ID93抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含ID93抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含ID91抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含ID91抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含3M-052、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含3M-052、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG 750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含3M-052和GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含3M-052和GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含LecA抗原、3M-052和GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含LecA抗原、3M-052和GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含H5N1抗原、3M-052和GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含H5N1抗原、3M-052和GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含肺结核相关抗原、HIV相关抗原、癌症相关抗原、阿米巴病相关抗原、流感相关抗原或肝炎相关抗原、TLR促效剂、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含肺结核相关抗原、HIV相关抗原、癌症相关抗原、阿米巴病相关抗原、流感相关抗原或肝炎相关抗原、TLR促效剂、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含肺结核相关抗原、HIV相关抗原、癌症相关抗原、阿米巴病相关抗原、流感相关抗原或肝炎相关抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含肺结核相关抗原、HIV相关抗原、癌症相关抗原、阿米巴病相关抗原、流感相关抗原或肝炎相关抗原、GLA、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含肺结核相关抗原、HIV相关抗原、癌症相关抗原、阿米巴病相关抗原、流感相关抗原或肝炎相关抗原、3M-052、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG2000。
在某些实施例中，聚乙二醇化脂质体包含肺结核相关抗原、HIV相关抗原、癌症相关抗原、阿米巴病相关抗原、流感相关抗原或肝炎相关抗原、3M-052、胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质，其中PEG组分是PEG750。
III.聚乙二醇化脂质体的物理化学特征
A.尺寸
如本文所提供，聚乙二醇化脂质体尺寸在约1nm到450nm范围内，且可以被认为是聚乙二醇化纳米脂质体。此类纳米脂质体容易制造且能无菌过滤。另外，包含药剂(例如抗原和/或佐剂)的此类纳米脂质体的活体内递送典型地不显示或减少储存效应的发生。另外，包含药剂(例如抗原和/或佐剂)的此类纳米脂质体的活体内递送实现了向引流淋巴结的递送，并且实现了向抗原呈递细胞的呈递且实现了有效的基于Th1的免疫反应的产生。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体的尺寸可以通过所属领域中已知的技术评估，包括(但不限于)x射线和激光衍射、动态光散射(DLS)、CryoEM或Malvern Zetasize。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸是指Z平均直径。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约50nm到75nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约50nm到100nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约50nm到150nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约50nm到200nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约50nm到300nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约20nm到100nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约20nm到50nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约10nm到200nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约10nm到100nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸在约10nm到50nm范围内。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸是约1nm，是约5nm，是约10nm，是约15nm，是约20nm，是约25nm，是约30nm，是约35nm，是约40nm，是约45nm，是约50nm，是约55nm，是约60nm，是约65nm，是约70nm，是约75nm，是约80nm，是约85nm，是约90nm，是约95nm，是约100nm，是约105nm，是约110nm，是约115nm，是约120nm，是约125nm，是约130nm，是约135nm，是约140nm，是约145nm，是约150nm，是约155nm，是约160nm，是约165nm，是约170nm，是约175nm，是约180nm，是约185nm，是约190nm，是约195nm，或是约200nm。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体尺寸不大于约1nm、不大于约5nm、不大于约10nm、不大于约15nm、不大于约20nm、不大于约25nm、不大于约30nm、不大于约35nm、不大于约40nm、不大于约45nm、不大于约50nm、不大于约55nm、不大于约60nm、不大于约65nm、不大于约70nm、不大于约75nm、不大于约80nm、不大于约85nm、不大于约90nm、不大于约95nm、不大于约100nm、不大于约105nm、不大于约110nm、不大于约115nm、不大于约120nm、不大于约125nm、不大于约130nm、不大于约135nm、不大于约140nm、不大于约145nm、不大于约150nm、不大于约155nm、不大于约160nm、不大于约165nm、不大于约170nm、不大于约175nm、不大于约180nm、不大于约185nm、不大于约190nm、不大于约195nm或不大于约199nm。
如本文所提供，在优选实施例中，聚乙二醇化脂质体能够通过至少0.45微米过滤器过滤。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体能够通过小于0.45微米的过滤器过滤。在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体能够通过0.20或0.22微米过滤器过滤。
B.稳定性
本文所提供的聚乙二醇化脂质体是稳定的，从而实现易用性、可制造性、可运输性和储存。本发明人已经发现，使脂质体聚乙二醇化有助于脂质体稳定性。聚乙二醇化脂质体的物理化学特征，包括(但不限于)其尺寸，在各种温度下且在各种条件下随时间维持。
在一些实施例中，相较于缺乏聚乙二醇化脂质的脂质体，聚乙二醇化脂质体展现减少的聚集或无聚集。在一些实施例中，包含聚乙二醇化脂质体的聚乙二醇化脂质体或组合物不聚集，显示极少的聚集到不聚集，显示减少的聚集，或相较于其初始尺寸，不展现平均尺寸随时间的总体增加。
聚乙二醇化脂质体的稳定性可以通过所属领域的技术人员熟悉的技术测量。在一些实施例中，以肉眼观察稳定性。目视检查可以包括对微粒、絮状体或聚集体的检查。在一些实施例中，所述稳定性是根据聚乙二醇化脂质体的尺寸确定，且任选地按照尺寸随时间或在各种温度下或在某些条件下的变化表示。在一些实施例中，所述稳定性是通过评估聚乙二醇化脂质体在组合物中的聚集％来确定。在一些实施例中，所述稳定性是根据聚乙二醇化脂质体通过特定尺寸的过滤器(例如通过0.20、0.22或0.45微米过滤器)的能力评估。在一些实施例中，稳定性是根据pH确定。在一些实施例中，稳定性是通过测量多分散指数(PdI)来确定，例如利用动态光散射(DLS)技术来确定。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体的Z平均直径在所分析的时间段期间增加小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于12％、小于10％、小于7％、小于5％、小于3％、小于1％。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在0-8℃下是稳定的。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃下稳定至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年、至少2年或至少5年。在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约2℃至约8℃的温度下稳定至少1个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约4℃至约8℃的温度下稳定至少1个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约4℃至约8℃的温度下稳定至少6个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约4℃至约8℃的温度下稳定至少1年。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在8-20℃下是稳定的。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在8-20℃下稳定至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年、至少2年或至少5年。在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约8℃至约20℃的温度下稳定至少1个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约8℃至约20℃的温度下稳定至少1个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约8℃至约20℃的温度下稳定至少6个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约8℃至约20℃的温度下稳定至少1年。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在20-30℃下是稳定的。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在25℃下稳定至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年、至少2年或至少5年。在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约25℃的温度下稳定至少1个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约25℃的温度下稳定至少6个月。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约25℃的温度下稳定至少1年。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在30-40℃下是稳定的。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃下稳定至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年、至少2年或至少5年。在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在约37℃的温度下稳定至少1个月。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在40-62℃下是稳定的。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在40-62℃下稳定至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月。
在一个示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在4-8℃下稳定至少一年。在另一示例性实施例中，聚乙二醇化脂质体在25℃下稳定至少一年。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在1-5次冷冻解冻之后是稳定的。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体在1次、2次、3次、4次或5次冷冻解冻之后是稳定的。
在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体的多分散指数维持在约0.3或更小。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体的多分散指数维持在约0.25或更小。在一些实施例中，聚乙二醇化脂质体的多分散指数维持在约0.2或更小。
IV.制备聚乙二醇化脂质体的方法
如本文所提供，制备聚乙二醇化脂质体的方法包含(a)将非聚乙二醇化中性脂质、聚乙二醇化脂质和胆固醇混合于有机溶剂中；(b)蒸发有机溶剂，借此产生脂质膜；(c)使脂质膜在缓冲液中复水；和(d)向步骤(c)的复水产物施加高能输入源(例如声波处理、微流体化、挤出)。在一些实施例中，高能源包含微流体化。在一些实施例中，高能源包含声波处理。在一些实施例中，高能源包含挤出。在一些实施例中，有机溶剂是氯仿或氯仿/甲醇/水混合物。在一些实施例中，步骤(a)进一步包含将TLR促效剂与其它组分混合。
在一个示例性实施例中，将DPPC、胆固醇和DPPE-PEG750与各种量的3M-052合并于有机溶剂(氯仿或氯仿/甲醇/水混合物)中。然后蒸发有机溶剂。所得脂质膜在缓冲液中复水且声波处理，直至配制物半透明，看不到大颗粒。较大批量(100mL)的聚乙二醇化脂质体可以如上制造，但声波处理时间较短，随后进行高剪切均质化。
在一些实施例中，所得聚乙二醇化脂质体与药剂(例如抗原)混合。
V.包含聚乙二醇化脂质体的组合物
本文提供了包含本文所述聚乙二醇化脂质体的配制物、组合物和医药组合物。
在一些实施例中，包含聚乙二醇化脂质体的组合物进一步包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
本文所述的组合物可以投与受试者用于任何疫苗接种、治疗或诊断目的。
医药组合物通常包含本文所述的组合物且可以进一步包含如本文所提供的一种或多种组分与医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合，所述组分选自抗原、其它促效剂或重组表达构建体。
在本文所提供的实施例中，医药组合物能够通过0.45微米过滤器过滤。在一些实施例中，医药组合物能够通过0.20微米过滤器过滤。在一些实施例中，医药组合物能够通过0.22微米过滤器过滤。
在一个实施例中，本发明涉及包含聚乙二醇化脂质体的医药组合物，所述聚乙二醇化脂质体包含TLR7/8促效剂或TLR4促效剂。此类组合物可以用于“单一疗法”，其中如本文所述的TLR7/8促效剂或TLR 4促效剂配制成组合物且所述组合物基本上缺乏其它抗原，且投与受试者以便刺激免疫反应(例如非特异性免疫反应或抗原特异性免疫反应)，以用于诊断、治疗或预防疾病或其它病状(如生物体感染)的目的。
在其它实施例中，医药组合物是一种疫苗组合物，其包含本文所述的组合物和抗原并且可以进一步包含如本文所提供的一种或多种组分与医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合。说明性载剂在所用剂量和浓度下，对于接受者来说通常是无毒的。
在本文所提供的治疗实施例中，投与约1μg/kg至约1mg/kg治疗医药组合物的剂量。对于所属领域的技术人员显而易见的是，投药次数和频率与受试者的反应相关。
在本文所提供的基于疫苗的实施例中，每次投药投与约1ug至25ug药剂(例如佐剂或抗原)。对于所属领域的技术人员显而易见的是，投药次数和频率与受试者的反应相关。
用于治疗用途的“医药学上可接受的载剂”在医药领域中已众所周知，且描述于例如《雷明登氏药学全书(Remingtons Pharmaceutical Sciences)》，马克出版公司(MackPublishing Co.)(A.R.Gennaro编，1985)。举例来说，可以使用生理pH下的无菌生理盐水和磷酸盐缓冲盐水。医药组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。举例来说，苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以作为防腐剂添加，同上，1449。另外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂，同上。
“医药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，其衍生自此类化合物与有机或无机酸(酸加成盐)或有机或无机碱(碱加成盐)的组合。本发明的组合物可以游离碱或盐形式使用，两种形式均被视为属于本发明的范围内。
医药组合物可以呈允许组合物投与患者的任何形式。举例来说，组合物可以呈固体、液体或气体(气溶胶)形式。典型的投药途径包括(不限于)口服、局部、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、静脉内、皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。如本文所用，术语肠胃外包括离子导入(例如U.S.7,033,598；7,018,345；6,970,739)、超声波电渗(例如U.S.4,780,212；4,767,402；4,948,587；5,618,275；5,656,016；5,722,397；6,322,532；6,018,678)、热(例如U.S.5,885,211；6,685,699)、被动透皮(例如U.S.3,598,122；3,598,123；4,286,592；4,314,557；4,379,454；4,568,343；5,464,387；英国专利说明书第2232892号；U.S.6,871,477；6,974,588；6,676,961)、微针(例如U.S.6,908,453；5,457,041；5,591,139；6,033,928)投药以及皮下注射、静脉内、肌肉内、脑干内、海绵窦内、鞘内、子宫内、尿道内注射或输注技术。在一个特定实施例中，如本文所述的组合物(包括疫苗和医药组合物)是通过选自离子导入、微气穴、超声波电渗或微针的技术皮内投与。
医药组合物能够配制成允许其中所含的活性成分在组合物投与受试者后生物可利用。投与受试者的组合物采取一个或多个剂量单位形式，其中例如，片剂可以是单个剂量单元，且含有气溶胶形式的一种或多种本发明化合物的容器可以容纳多个剂量单位。
对于口服来说，可以存在赋形剂和/或粘合剂。实例是蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、海藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。可以存在着色剂和/或调味剂。可以采用包衣壳。
所述组合物可以呈液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以口服或通过注射递送。当希望口服时，组合物可以含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味强化剂中的一种或多种。在希望通过注射投与的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等张剂中的一种或多种。
如本文所用，液体医药组合物，不论采用溶液、悬浮液形式，还是其它类似形式，可以包括以下载剂或赋形剂中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等张氯化钠、不挥发性油(如角鲨烯、角鲨烷、矿物油、二缩甘露醇单油酸酯、胆固醇，和/或可以充当溶剂或悬浮介质的合成单酸或二酸甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张力调节剂，如氯化钠或右旋糖。
在另一个实施例中，本发明的组合物是按照能够气溶胶化的方式配制。
还可以期望医药组合物中包括其它组分，如递送媒剂，包括(但不限于)铝盐、油包水型乳液、可生物降解的油性媒剂、水包油型乳液、可生物降解的微胶囊和脂质体。用于此类媒剂中的其它免疫刺激物质(共佐剂)的实例也描述如上且可以包括N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酸-D-异谷氨酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素和IL-12。
虽然本发明的医药组合物中可以采用所属领域的技术人员已知的任何适合载剂，但是载剂类型将根据投药方式和是否期望持续释放而定。对于非经肠投药(如皮下注射)来说，载剂可以包含水、盐水、乙醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服来说，可以采用上述载剂或固体载剂中的任一种，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁中的任一种。还可以使用可生物降解的微球体(例如丙交酯乙交酯共聚物(polylactic galactide))作为本发明医药组合物用的载剂。适合的可生物降解微球体公开于例如美国专利第4,897,268号和第5,075,109号中。就此而言，优选的是微球体大于约25微米。
医药组合物还可以含有稀释剂，如缓冲剂；抗氧化剂，如抗坏血酸、多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物，包括葡萄糖、蔗糖或糊精；螯合剂，如EDTA、谷胱甘肽，以及其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是适当的示例性稀释剂。举例来说，产物可以使用适当赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂来配制成冻干物。
医药组合物可以预期用于局部投药，在这种情况下，载剂可以适合地包含溶液、乳液、软膏或凝胶基质。举例来说，基质可以包含以下中的一种或多种：石蜡脂、羊毛蜡、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(如水和醇)以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于医药组合物中局部投与。如果预期用于透皮投药，那么组合物可以包括透皮贴片或离子导入疗法(iontophoresis)装置。局部配制物可以含有浓度为约0.1至约10％w/v(重量/单位体积)的抗原(例如GLA抗原疫苗组合物)或GLA(例如免疫佐剂组合物；GLA获自Avanti PolarLipids,Inc.,Alabaster,AL；例如产品编号699800)。
组合物可以预期按照例如栓剂的形式用于直肠投药，所述栓剂能够在直肠中熔融且释放药物。直肠投药用的组合物可以含有油性基质作为适合的无刺激性赋形剂。此类基质包括(但不限于)羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。在本发明方法中，医药组合物/佐剂可以通过使用嵌入物、珠粒、定时释放配制物、贴片或快速释放配制物来投与。
VI.聚乙二醇化脂质体使用方法
本文提供了一种刺激受试者发生免疫反应的方法，包含投与本文所提供的任一种聚乙二醇化脂质体或包含所述聚乙二醇化脂质体的组合物。聚乙二醇化脂质体和组合物应用于疫苗接种、治疗学和诊断学。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物是用于癌症的治疗或预防。
在一些实施例中，包含本文所提供的聚乙二醇化脂质体的医药组合物是疫苗组合物且用作疫苗。在一些实施例中，本文所述的组合物是用于刺激受试者的免疫反应(包括非特异性反应和抗原特异性反应)。在一些实施例中，免疫反应包含全身免疫反应。在一些实施例中，免疫反应包含粘膜免疫反应。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于增强保护性免疫对抗致流感病毒。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于增强保护性免疫对抗致阿米巴病生物体。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于增强保护性免疫对抗溶组织内阿米巴。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于增强保护性免疫对抗流感。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于增强保护性免疫对抗阿米巴病。
在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于刺激受试者的全身免疫反应(其特征为IgG免疫反应)和粘膜免疫反应(其特征为IgA免疫反应)，包含鼻内投与本文所提供的任一种聚乙二醇化脂质体组合物。在一个实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于刺激受试者的全身免疫反应和粘膜免疫反应，包含鼻内投与包含TLR4促效剂和TLR7/8促效剂的聚乙二醇化脂质体。在相关实施例中，聚乙二醇化脂质体组合物用于刺激受试者的全身免疫反应和粘膜免疫反应，包含鼻内投与包含GLA和3M-052的聚乙二醇化脂质体。本发明人已惊人地发现，鼻内投与包含聚乙二醇化脂质体的组合物能够产生局部粘膜反应(鼻腔)，产生全身免疫反应，且产生远端粘膜反应(例如粪便、肠和/或阴道粘膜反应)。
在本文所提供的实施例中，受试者是哺乳动物(例如包括农畜(奶牛、猪、山羊、马等动物)、宠物(猫、狗等)和啮齿动物(大鼠、小鼠等)或人类)。在一个实施例中，受试者是人类。在另一个实施例中，受试者是非人类哺乳动物。在另一个实施例中，非人类哺乳动物是狗、奶牛或马。
VII.试剂盒和制品
在某些实施例中，还涵盖试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的聚乙二醇化脂质体和组合物，其可以用一个或多个容器提供。在一个实施例中，组合物中的所有组分共同存在于单一容器中，但本发明实施例不希望受此限制并且还涵盖两个或更多个容器，其中例如免疫佐剂组合物与抗原组分分开且不接触。作为非限制性理论，相信在一些情况下，聚乙二醇化脂质体组合物可以有益地只作为免疫佐剂组合物投与，同时在其它情况下，此投药可以有益地在时间上和/或空间上与抗原投与分开(例如在不同解剖部位)，同时在另外其它情况下，投与受试者有益地由如本文所述且含有抗原和佐剂组合物且任选地亦含有本文所述其它组分的疫苗组合物实现。
在一些实施例中，试剂盒中的一个小瓶包含含有聚乙二醇化脂质体的组合物，且试剂盒中的第二个小瓶含有药剂。在一些实施例中，试剂盒包含含有任选药剂的第三个小瓶。
本发明的试剂盒可以进一步包含如本文所述的使用说明书或关于将瓶内所装物质混合的说明书。在一些实施例中，小瓶中的物质是干燥的或被冻干。在一些实施例中，小瓶中的物质是液体。
根据此类试剂盒实施例的容器可以是任何适合的容器、器皿、小瓶、安瓿、管、杯子、盒子、瓶子、烧瓶、缸、培养皿、单孔或多孔器械的孔、储集器、储槽等，或本文所公开组合物可以放置、储存和/或运输且可以进入其中以移出内容物的其它装置。典型地，此类容器可以由与预定用途相容的物料制成且能够容易实现所含内容物的回收。此类容器的非限制性实例包括玻璃和/或塑料密封或可再密封的管和安瓿，包括具有橡胶隔膜或与使用针和针筒抽出内容物相容的其它密封构件的那些容器。此类容器可以例如由玻璃或化学上相容的塑料或树脂制成，其可以用如下材料制成或涂布：允许从容器有效回收物质和/或保护物质以防例如降解条件(如紫外光或温度极值)或防止引入非所需污染物(包括微生物污染物)的材料。容器优选无菌或能灭菌的，并且由与任何载剂、赋形剂、溶剂、媒剂等(如可以用于悬浮或溶解本文所述的疫苗组合物和/或免疫佐剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等)相容的材料制成。
VIII.示例性实施例
在第一实施例中，本发明尤其涉及一种脂质体，其包含胆固醇；非聚乙二醇化中性脂质；和聚乙二醇化脂质，其中聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约5000道尔顿或更小。
本发明在第二实施例中还提供以下中的任一种：第1实施例的脂质体，其中聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量在约750道尔顿至约5000道尔顿范围内；第一实施例的脂质体，其中聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约2000道尔顿或更小；或第一实施例的脂质体，其中聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约750道尔顿。
本发明在第三实施例中提供第1或第2实施例的脂质体中的任一种，其中聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含中性脂质；其中聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含C14烷基链、C16烷基链或C18烷基链；其中聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DSPE、DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE；其中聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DSPE；或其中聚乙二醇化脂质中的脂质组分是DPPE。
本发明在第四实施例中提供第1、第2或第3实施例的脂质体中的任一种，其中非聚乙二醇化中性脂质包含C14烷基链、C16烷基链或C18烷基链；其中非聚乙二醇化中性脂质是DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE；或其中非聚乙二醇化中性脂质是DPPC。
本发明在第五实施例中提供第1、第2、第3或第4实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体是稳定的；其中脂质体在约2℃至约8℃的温度下稳定至少1个月；其中脂质体在约25℃的温度下稳定至少1个月；或其中脂质体在约37℃的温度下稳定至少1个月。
本发明在第六实施例中提供第1、第2、第3、第4或第5实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体的多分散指数维持在约0.3或更小。
本发明在第七实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5或第6实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体尺寸小于或为约450nm；其中脂质体尺寸维持在小于或约450nm；或其中脂质体尺寸在约50nm至约300nm范围内。
本发明在第八实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体中的聚乙二醇化脂质摩尔百分比(mol％)在约1mol％至约25mol％范围内；其中脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％在约1mol％至约10mol％范围内；或其中脂质体中的聚乙二醇化脂质mol％是约5mol％。
本发明在第九实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体中的胆固醇mol％在约1mol％至约50mol％范围内；或其中脂质体中的胆固醇mol％是约50mol％。
本发明在第十实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8或第9实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体中的非聚乙二醇化脂质mol％在约45mol％至约98mol％范围内或其中脂质体中的非聚乙二醇化脂质mol％是约45mol％。
本发明在第十一实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8、第9或第10实施例的脂质体中的任一种，其中非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约9.8:5.7:0.8或其中非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约18:5.5:3。
本发明在第十二实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10或第11实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体进一步包含至少一种TLR促效剂；其中脂质体包含TLR2促效剂、TLR3促效剂、TLR4促效剂、TLR5促效剂、TLR6促效剂、TLR7促效剂、TLR8促效剂、TLR7/8促效剂或TLR9促效剂；其中脂质体包含TLR4、SLA、GLA、3D-MPL、R837或R848；其中脂质体包含具有疏水性尾的TLR促效剂；其中脂质体包含TLR7/8促效剂；其中脂质体包含TLR7促效剂，其中脂质体包含TLR8促效剂；其中脂质体包含含有咪唑并喹啉的TLR7/8促效剂或含有咪唑并喹啉的化合物；其中脂质体包含3M-052；其中脂质体包含R848；其中脂质体包含TLR4促效剂；其中脂质体包含3D-MPL；其中脂质体包含GLA；其中脂质体包含如本文所提供的式(V)的合成GLA或其医药学上可接受的盐和式(V)的相应实施例或其医药学上可接受的盐中的任一种；其中脂质体包含如本文所提供的式(VI)的合成GLA或其医药学上可接受的盐和式(VI)的相应实施例或其医药学上可接受的盐中的任一种；或其中脂质体包含下式的合成GLA：
或其医药学上可接受的盐；其中脂质体包含TLR4促效剂和TLR7/8促效剂；其中脂质体包含本文所述的TLR4或TLR7/8促效剂中的任一种；或其中脂质体包含GLA和3M-052。
本发明在第十三实施例中提供第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12实施例的脂质体中的任一种，其中脂质体包含至少一种药剂；其中脂质体包含的至少一种药剂包含多肽、聚核苷酸、抗原、佐剂、诊断剂、治疗剂或生物体；其中脂质体包含的至少一种药剂包含抗原；其中脂质体包含的至少一种药剂包含抗原且其中抗原包含阿米巴病相关抗原、LecA、流感相关抗原、H5N1、肺结核相关抗原、ID91、ID93、BCG抗原、肝炎病毒相关抗原、B型肝炎抗原、C型肝炎抗原、HIV相关抗原或癌症相关抗原。
本发明在第十四实施例中提供包含第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13实施例的脂质体中的任一种的组合物或包含第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13实施例的脂质体中的任一种和医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合物。组合物可以是例如疫苗、治疗剂或诊断剂。
本发明在第十五实施例中提供一种刺激受试者发生免疫反应的方法，包含向受试者投与第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13或第14实施例中任一例的脂质体或组合物，借此刺激受试者发生免疫反应。免疫反应可以是例如非特异性免疫反应；抗原特异性免疫反应；全身免疫反应；粘膜免疫反应；或肠、粪便或阴道粘膜免疫反应。所述组合物可以用于例如治疗或预防癌症；用作疫苗；增强保护性免疫对抗致流感病毒；增强保护性免疫对抗致阿米巴病生物体；增强保护性免疫对抗溶组织内阿米巴；增强保护性免疫对抗流感；或增强保护性免疫对抗阿米巴病。组合物的投与途径可以是口服、局部、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、静脉内、皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。脂质体或组合物可以联合视黄酸共佐剂投与。受试者可以是例如人类或非人类哺乳动物。
本发明在第十六实施例中提供一种诱导受试者发生Th1反应的方法，包含向受试者投与第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13或第14实施例中任一例的脂质体或组合物，借此诱导受试者发生Th1反应。免疫反应可以是例如非特异性免疫反应、抗原特异性免疫反应、全身免疫反应、粘膜免疫反应，或肠、粪便或阴道粘膜免疫反应。所述组合物可以用于例如治疗或预防癌症；用作疫苗；增强保护性免疫对抗致流感病毒；增强保护性免疫对抗致阿米巴病生物体；增强保护性免疫对抗溶组织内阿米巴；增强保护性免疫对抗流感；或增强保护性免疫对抗阿米巴病。组合物的投与途径可以是口服、局部、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、静脉内、皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。脂质体或组合物可以联合视黄酸共佐剂投与。受试者可以是例如人类或非人类哺乳动物。
本发明在第十七实施例中提供一种刺激受试者发生全身免疫反应和粘膜免疫反应的方法，包含向受试者鼻内投与第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13或第14实施例中任一例的脂质体或组合物。粘膜免疫反应可以包含例如肠、粪便或阴道粘膜免疫反应。粘膜免疫反应可以发生于例如鼻腔的远端。脂质体或组合物可以联合视黄酸共佐剂投与。受试者可以是例如人类或非人类哺乳动物。
本发明在第十八实施例中提供一种制备本文所述的任一种聚乙二醇化脂质体的方法，包含：a)将非聚乙二醇化中性脂质、聚乙二醇化脂质和胆固醇混合于有机溶剂中；b)蒸发有机溶剂，借此产生脂质膜；c)使脂质膜在缓冲液中复水；以及对步骤c)的复水产物进行超声波处理、微流体化或挤出。步骤a)可进一步包含混合TLR促效剂的步骤。有机溶剂可以是例如氯仿。步骤(c)的复水产物可以例如进行声波处理，然后微流体化。所述方法可进一步包含将药剂与聚乙二醇化脂质体混合。药剂可以是本文所述的任一种药剂。
本发明在第十九实施例中提供基于角鲨烯的水包油型乳液，其包含TLR促效剂、角鲨烯和不饱和磷脂酰胆碱。在此类实施例中，相较于饱和磷脂(DMPC)，使用不饱和磷脂酰胆碱制成的乳液使得TLR促效剂的回收率提高，即，最终配制物中的TLR促效剂浓度较高(当以TLR促效剂的相同初始浓度开始时)。
本发明在第二十实施例中提供基于角鲨烯的水包油型乳液，其包含TLR促效剂、角鲨烯和不饱和磷脂酰胆碱，其中角鲨烯的浓度在约30至约40mg/ml之间且不饱和磷脂酰胆碱的浓度是约5至约10mg/ml。
本发明在第二十一实施例中提供为了使用TLR促效剂(典型地，不溶于水(在水中的溶解性可以忽略)中的TLR促效剂)配制而优化的基于角鲨烯的水包油型乳液，其包含TLR促效剂、角鲨烯和不饱和磷脂酰胆碱(例如卵磷脂酰胆碱)，其中角鲨烯的浓度是约34mg/ml且不饱和磷脂酰胆碱的浓度是约7-8mg/ml或约7.6mg/ml。
本发明在第二十二实施例中提供第19、第20或第21实施例的乳液中的任一种，进一步任选地包含共乳化剂、张力剂和缓冲剂。在本文所述的任一实施例中，共乳化剂可以是例如非离子型线性三嵌段共聚物，如泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。在本文所述的任一实施例中，张力剂可以是例如多元醇，如甘露糖醇或甘油。在本文所述的任一实施例中，缓冲剂可以是例如磷酸盐缓冲剂，例如磷酸铵缓冲剂。共乳化剂当存在于乳液时，优选以0.1至约2mg/ml、更优选约0.5mg/ml、最优选约0.36mg/ml的浓度存在于乳液中。张力剂当存在于乳液中时，是以引起组合物具有约250-350mOsm/kg、优选270-315mOsm/kg的渗透压度的量存在。
本发明在第二十三实施例中提供第19、第20、第21或第22实施例的乳液中的任一种，其中TLR促效剂(a)是合成的，(b)不溶于水中，(c)是咪唑并喹啉或含有咪唑并喹啉的化合物，(d)具有疏水性尾，(e)是3M-052，或其任何组合。乳液可进一步包含至少一种药剂；其中所述至少一种药剂可以是多肽、聚核苷酸、抗原、佐剂、诊断剂、治疗剂或生物体。示例性药剂包括例如阿米巴病相关抗原、LecA、流感相关抗原、H5N1、肺结核相关抗原、ID91、ID93、BCG抗原、肝炎病毒相关抗原、B型肝炎抗原、C型肝炎抗原、HIV相关抗原，或癌症相关抗原。
本发明在第二十四实施例中提供一种制备第19、第20、第21、第22和第23实施例的乳液的方法，包含将TLR促效剂与不饱和磷脂酰胆碱合并于有机溶剂中。能够溶解TLR促效剂和不饱和磷脂酰胆碱的任何有机溶剂适合使用，包括例如乙醇、DMF和氯仿。所述方法可进一步包含如下步骤：(a)通过任何适合的方法(包括蒸发)来去除氯仿，以产生脂质膜；(b)将角鲨烯添加到干燥的脂质膜中；和(c)混合所得混合物，例如通过声波处理(例如在60C水浴中)或微流体化或简单搅拌。
本发明在第二十五实施例中提供医药组合物，其包含第19、第20、第21、第22和第23实施例的乳液中的任一种；和医药学上可接受的载剂。
本发明在第二十六实施例中提供一种刺激受试者发生免疫反应的方法，包含向受试者投与第19、第20、第21、第22和第23实施例的乳液中的任一种或第25实施例的医药组合物。免疫反应可以是例如Th1免疫反应、非特异性免疫反应、抗原特异性免疫反应、全身免疫反应、粘膜免疫反应，或肠、粪便或阴道粘膜免疫反应。所述乳液或组合物可以用于例如治疗或预防癌症；用作疫苗；增强保护性免疫对抗致流感病毒；增强保护性免疫对抗致阿米巴病生物体；增强保护性免疫对抗溶组织内阿米巴；增强保护性免疫对抗流感；或增强保护性免疫对抗阿米巴病。组合物的投与途径可以是口服、局部、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、静脉内、皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。脂质体或组合物可以联合视黄酸共佐剂投与。受试者可以是例如人类或非人类哺乳动物。
以下实例是为了说明，而非为了限制而提供。
实例
实例1：含TLR配体的脂质体用于阿米巴病疫苗的配制物和测试
材料和方法
使用佐剂、LecA抗原的配制物
所有佐剂都在传染病研究所(IDRI，西雅图，华盛顿州)制备且作为2倍或5倍浓缩的配制物提供，其在即将注射之前与抗原混合。
LecA抗原由TECHLAB(Blacksburg,VA)制造，正如所述(Barroso L，Abhyankar M，Noor Z，Read K，Pedersen K，White R等人，重组LecA作为阿米巴结肠炎疫苗候选物的表达、提纯和评估(Expression,purification,and evaluation of recombinant LecA as acandidate for an amebic colitis vaccine)，《疫苗(Vaccine)》2014；32(10):1218-)。吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750](DSPE-PEG750)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)获自CordenPharma(Liestal，瑞士)或Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)。3M-052按惯例由3M DrugDelivery Systems(St.Paul,MN)提供。胆固醇和缓冲剂盐购自J.T.Baker(San Francisco,CA)。实例中使用的GLA具有式(VI)结构，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C13烷基。
聚乙二醇化脂质体配制物是通过将DPPC、胆固醇、DSPE-PEG750或DPPE-PEG2000和3M-052和/或GLA合并于氯仿中来制造。脂质摩尔比是9.8:5.7:0.8(DPPC:胆固醇:聚乙二醇化脂质)。然后使用旋转式蒸发器将配制物中的有机溶剂蒸发至少12个小时。脂质薄膜在25mM磷酸铵缓冲液(约pH 5.7)中复水且在Crest Powersonic CP230D(Trenton,NJ)水浴中、在约60℃下声波处理长达30分钟。然后利用再循环冷水机组，使配制物在10℃下、在10,000-30,000psi下微流体化5-6遍。使脂质体通过0.8/0.2μm双膜聚醚砜过滤器过滤且在5℃、环境温度、37℃或60℃下储存。微流体化的一个替代方案是声波处理。
水包角鲨烯型乳液基本上如(Fox等人，《疫苗》2013，31:5848)所述，通过在30,000psi下进行微流体化(M110P，微流体公司(Microfluidics Corp))来制备。明矾吸附的配制物如此前所述(Fox等人，《药学杂志(J Pharm Sci)》2012，101:4357和Fox等人)，通过将基于聚乙二醇化脂质的GLA悬浮液中的水性脂质组分或CpG 1826水溶液与(Brenntag Biosector)混合来制备。
物理化学稳定性测量
在水中按1:100稀释之后，通过动态光散射来测量乳液和脂质体粒度。混合之后立即且在混合之后第4和24小时(其中混合物在5℃和环境温度下储存)，通过监测粒度、视觉外观和抗原初级结构来评估抗原-佐剂混合物的短期(≤24小时)物理化学相容性。抗原首先在盐水中稀释到0.1mg/ml，且随后与脂质体佐剂配制物按照1:1体积混合。除了准备一个比色管而非三个之外，如上文所述测量粒度。通过将50μL样品与50μL 4倍浓缩样品缓冲液和100μL20％SDS混合来执行SDS-PAGE。样品在90℃下加热5分钟且在-20℃下储存，随后将其在90℃再加热1分钟且装载到聚丙烯酰胺凝胶上，使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液在180V下运作65分钟，随后用库马斯蓝(Coomassie blue)染色。
使用HPLC方法，通过320nm UV吸光度检测来测定3M-052浓度且通过带电气溶胶检测来测定GLA浓度。HPLC方法此前已描述(Misquith A,Fung M,Dowling QM,Guderian JA,Vedvick TS,Fox CB.TLR4促效剂活性的试管内评估：配方作用(In vitro evaluation ofTLR4 agonist activity:formulation effects)，《胶体和表面B：生物界面(Colloids andSurfaces B:Biointerfaces)》2014；113:312-9)。如果测量值在目标浓度的+/-20％内，那么佐剂浓度视为在规格内。使用Malvern Instruments(Worcestershire，UK)ZetasizerNano-S或Nano-ZS评估脂质体粒度和尺寸多分散性。在1.5ml聚苯乙烯抛弃式比色管中，将配制物在超纯(18.2MΩ)水中按100倍稀释。每种配制物准备三个独立比色管。然后每个比色管进行所有尺寸测量三次。偶尔会有尘粒引起明显的测量偏差；在此类情况下，从集合中舍弃所怀疑比色管的测量结果。按照指示，定期监测TLR配体浓度、粒度和视觉外观。
免疫接种
四到六周龄CBA/J雄性小鼠购自Jackson Labs。非标记LecA抗原是在TechLabInc.(Blacksburg,VA)提纯且每只小鼠每次免疫接种使用5ug抗原。所有小鼠研究严格地按照IACUC规定进行。颈区域皮下免疫接种时，将LecA与相应佐剂(表1)混合且用注射用的盐水使体积达到100ul。鼻内免疫接种是在麻醉下进行且每个鼻孔使用典型10ul抗原-佐剂混合物。对于所有疗程来说，连续的免疫接种之间维持两周间隔时间。在涉及所有反式视黄酸(RA)每周一次剂量的实验中，每只小鼠腹膜内接受150ug溶解于50ul最终体积DMSO中的所有反式视黄酸(Sigma)。RA储备液在-80℃下避光储存。所有佐剂在4℃下储存且配制物是在即将免疫接种之前无菌制备。
免疫原性测量
使用每孔涂有0.5ug凝集素的96孔盘，通过ELISA测量抗体效价。血浆样品加以适当稀释且使用1:10,000稀释的辣根过氧化酶结合山羊抗小鼠IgG1和IgG2a检测抗体(Southern Biotechnology)测量抗原特异性IgG亚型。如所述(Guo X,Barroso L,BeckerSM,Lyerly DM,Vedvick TS,Reed SG等人，重组疫苗对肠阿米巴病的预防作用可通过T细胞转移且被γ干扰素介导(Protection against intestinal amebiasis by a recombinantvaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon)，《感染与免疫(Infect Immun.)》2009年9月；77(9):3909-18)，制备粪便上清液。简单地说，将刚收集的粪便样品再悬浮(每mg粪便5ul稀释剂)于含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的PBS中且剧烈混合5分钟。通过3000rpm和12,000rpm的两次连续旋转来去除不溶性物质且上清液在-20℃下储存。将适当稀释的粪便上清液用于ELISA且将1:5000稀释的辣根过氧化酶结合山羊抗小鼠IgA用作二次抗体。利用标准曲线确定抗体单位。
为了测量细胞外的细胞因子，用50μg/ml LecA再刺激脾细胞72小时且通过使用Luminex珠粒的多重悬浮阵列系统(BioRad)分析上清液(Guo X,Barroso L,Becker SM,Lyerly DM,Vedvick TS,Reed SG等人，重组疫苗对肠阿米巴病的预防作用可通过T细胞转移且被γ干扰素介导(Protection against intestinal amebiasis by a recombinantvaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon)，《感染与免疫(Infect Immun.)》2009年9月；77(9):3909-18)。样品根据制造商说明书在未稀释的情况下试验，且按照皮克/每毫升上清液度量。
培养条件和激发实验
将连续通过小鼠盲肠的HM1:IMSS(ATCC)最初所衍生的营养体用于激发实验。使营养体在胰蛋白酶-酵母萃-铁(TYI-S-33)培养基中维持，所述培养基补充有2％Diamond维生素、13％热灭活牛血清(Gemini Labs)和100U/ml青霉素加100ug/ml链霉素(Invitrogen)(Diamond LS,Harlow DR,Cunnick CC，用于纯性培育溶组织内阿米巴和其它内阿米巴属的新培养基(A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica andother Entamoeba)，《皇家热带医学与卫生学会会报(Trans R Soc Trop Med Hyg)》1978；72(4):431-2)。免疫组和对照组小鼠在剖腹手术之后，在用含有二百万营养体的150ul培养基进行最后增强免疫之后的第四周，盲肠内激发(Houpt E,Barroso L,Lockhart L,WrightR,Cramer C,Lyerly D等人，溶组织内阿米巴Gal/GalNac凝集素疫苗接种对肠阿米巴病的预防(Prevention of intestinal amebiasis by vaccination with the Entamoebahistolytica Gal/GalNac lectin)，《疫苗》2004年1月26日；22(5-6):611-7)。小鼠激发之后的一周安乐死。用1ml PBS冲洗盲肠，将300ul盲肠冲洗液在TYI-S-33培养液中培养长达五天且使用200ul进行抗原负荷ELISA。疫苗功效是如下计算：100×(1-(已接种疫苗的小鼠感染％)/(假处理组小鼠感染％)(Guo X,Barroso L,Becker SM,Lyerly DM,Vedvick TS,Reed SG等人，重组疫苗对肠阿米巴病的预防作用可通过T细胞转移且被γ干扰素介导，《感染与免疫》2009年9月；77(9):3909-18；Soong CJ,Kain KC,Abd-Alla M,Jackson TF,Ravdin JI，溶组织内阿米巴半乳糖可抑制凝集素的重组富半胱氨酸部分作为次单位疫苗在沙鼠阿米巴肝脓肿模型中富有成效(A recombinant cysteine-rich section of theEntamoeba histolytica galactose-inhibitable lectin is efficacious as asubunit vaccine in the gerbil model of amebic liver abscess)，《传染病杂志(JInfect Dis.)》1995年3月；171(3):645-51)。
粪便抗原检测
使用E.his II ELISA试剂盒(TechLab Inc.,Blacksburg,VA)检测盲肠内容物中的粪便抗原。450nm光学密度比阴性对照组高≥0.05视为阳性。使用提纯的LecA产生标准曲线。
粘附分析
使中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在α-MEM培养基中生长且使溶组织内阿米巴营养体生长，如上文所述。溶组织内阿米巴营养体与得自对照组或免疫组的粪便上清液的十倍稀释液一起在冰上预培育1小时。然后按照1:20比率将营养体和CHO细胞混合且在圆底聚苯乙烯管中、在冰上继续培育90分钟。即将进行显微镜计数之前，将所述管短暂涡旋且细胞用血球计计数。粘附性是按照具有至少3个黏附CHO细胞的营养体的数目度量并且按照丛簇形成％报告。每个样品按照三重复试验且对最少100个阿米巴计数(Barroso L,Abhyankar M,NoorZ,Read K,Pedersen K,White R等人，重组LecA作为阿米巴结肠炎疫苗候选物的表达、提纯和评估(Expression,purification,and evaluation of recombinant LecA as acandidate for an amebic colitis vaccine)，《疫苗》2014年2月26；32(10):1218-24；Ravdin JI,Guerrant RL，粘附性在溶组织内阿米巴的致细胞病变机制中的作用(Role ofadherence in cytopathogenic mechanisms of Entamoeba histolytica)，对哺乳动物组织培养细胞和人类红细胞的研究(Study with mammalian tissue culture cells andhuman erythrocytes)，《临床研究杂志(J Clin Invest)》1981年11月；68(5):1305-13)。
统计分析
所有分析都使用Graph Pad Prism软件进行。使用费舍尔精确检验(Fisher'sexact test)，分析激发试验所引起的感染小鼠和未感染小鼠的比例。利用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)，分析抗原负荷、抗体效价和粘附性抑制差异。
结果
物理化学稳定性-
通过动态光散射(粒度和尺寸多分散性)、视觉外观和HPLC(GLA和3M-052浓度)监测脂质体稳定性。粒度和尺寸多分散性值在5℃、在12个月期间显示的变化极小或无变化，但是含有DSPE-PEG2000的脂质体的多分散性值显著地高于含有DSPE-PEG750的脂质体的多分散性值(图1A)。脂质体的视觉外观始终是半透明的和均匀的且不随时间而变。在37℃下储存时，含有DSPE-PEG2000的脂质体的粒度和尺寸多分散性随时间的变化大于含有DSPE-PEG750的脂质体(图1C-1D)。在5℃储存的样品中，GLA和3M-052浓度在12个月期间不变。在37℃下，GLA损耗速率大于3M-052，其中6个月之后的GLA损耗>40％，而3M-052尚未发生可检测到的损失。
为了评估佐剂与LecA抗原在混合之后的短期(≤24小时)相容性，将储备抗原在盐水中稀释且然后按照1:1体积比与佐剂混合，以模拟计划的混合程序供下述活体内免疫接种研究用。在与抗原之前及之后，配制物具有半透明的均匀外观。总的来说，与抗原混合之后的24小时期间(不论在5℃下储存，还是在环境温度下储存)，粒度的变化极小(<15％)或无变化，但是含有DSPE-PEG2000的脂质体显示的尺寸增加倾向稍微大于含有较短PEG长度的脂质体(DSPE-PEG750)。总的来说，GLA、3M-052或两种促效剂共同存在似乎不影响粒度相容性结果。同样，尽管含有DSPE-PEG2000的脂质体的多分散性高于含有DSPE-PEG750的脂质体，但是尺寸多分散性值变化极小。抗原-佐剂混合物的SDS-PAGE分析指出，不论脂质体组成，抗原初始结构在24小时期间的任何时间点或储存条件下都不变，在预期MW附近出现均一的单条色带。总之，这些数据表明抗原-佐剂混合物在5℃或环境温度下展现至少达到24小时的可接受短期相容性。
脂质体配制物的免疫原性的评估和选择
通过使用溶组织内阿米巴重组粘附素LecA作为免疫原，筛选可以产生平衡的免疫反应的佐剂。如表2中所示制备含有合成TLR促效剂的佐剂且评估其产生抗原特异性体液反应的能力。
表2：含有TLR促效剂的佐剂
这些佐剂中的每一种包含医药学上可接受的组分且适用于临床研究。根据组成和处理方法，乳液和脂质体配制物展现65-130nm的平均粒度，而含有明矾的配制物含有微米颗粒。九种配制物是通过将佐剂与提纯的非标记LecA蛋白质混合来制备且小鼠以皮下途径免疫。每组五只小鼠每隔2周用与相应佐剂混合的LecA抗原皮下免疫三次。最后免疫接种之后一周收集血浆样品，稀释256,000倍且通过ELISA分析IgG1和IgG2a产生。相较于除EM014(GLA-CpG-SE)和3M-052乳液之外的所有其它组，GLA 3M-052-脂质体佐剂化LecA所诱发的*IgG2a量具有统计显著性。血浆IgG亚类的效价通过ELISA测定(图2)。图2表明，含有GLA(TLR-4促效剂)和3M-052(TLR-7/8促效剂)的脂质体配制物(指定为GLA-3M-052-LS)展示平衡的IgG反应，且选用于进一步研究。
接下来，探究GLA-3M-052-LS诱发抗原特异性细胞因子产生的能力，所述抗原特异性细胞因子产生指示细胞介导的免疫反应。脾细胞在试管内用LecA再刺激且分析培养物上清液。GLA 3M-052脂质体佐剂化LecA/含有LecA的GLA 3M-052脂质体诱发强IFN-γ和IL-17反应，这是小鼠模型中的保护标记物(图3A-3D)。具体地说，小鼠在第三次免疫接种之后一周安乐死且脾细胞用LecA再刺激72小时。培养上清液中的细胞外IFN-γ、IL-17、IL-2和IL-4产生是利用Luminex检测且用pg/ml表示。*＝p<0.05；**＝p<0.001。
另外，仅来自GLA 3M-052脂质体佐剂化LecA组的PBMC展示中等、但统计显著的细胞内IFN-γ染色。
还测试全反式视黄酸(RA)作为共佐剂的相容性。相应群组中的小鼠接受RA每周一次注射。RA辅助疗法进一步提高了IFN-γ和IL-17含量(还见图3A-3D)。(佐剂+LecA)和(佐剂+LecA+RA)组产生了等效的IL-2反应；然而，RA辅助疗法引起稍微较高的IL-4反应。
由于基于脂质体的疫苗也适用于粘膜免疫接种，因此后续实验使用粘膜/肠胃外混合型免疫接种疗法测试其产生抗原特异性肠道IgA反应的能力。
粘膜IgA反应和其粘附性抑制潜力
小鼠通过鼻内免疫接种预致敏，随后进行皮下和鼻内增强免疫。RA辅助组中的小鼠接受RA每周一次注射。如图4A所示，佐剂化LecA产生了具有抗原特异性的稳定粘膜IgA反应。RA纳入有助于提高IgA效价。溶组织内阿米巴营养体粘附到靶细胞是感染发作的初始和关键步骤。
为了评估粘膜IgA是否具有保护性质，试管内测试其阻断寄生虫粘附到CHO细胞的能力。营养体与免疫小鼠的粪便上清液一起预培育使其粘附潜力显著减小(图4B)。得自(佐剂+LecA)或(佐剂+LecA+RA)疗法的粪便悬浮液展示类似的粘附抑制潜力。因此，佐剂化LecA诱发了高效价肠道IgA反应，所述IgA反应在试管内具有保护性。
含有协同TLR促效剂的纳米脂质体配制物具有预防肠寄生虫激发的潜力
使用小鼠肠阿米巴病模型，测试GLA 3M-052脂质体佐剂预防溶组织内阿米巴激发的潜力。对照组和实验免疫组小鼠用溶组织内阿米巴毒性株系盲肠内激发且激发之后一周收集盲肠，以评估抗原负荷(图5A)以及活寄生虫的存在(图5B)。相较于对照小鼠，佐剂化LecA使抗原负荷显著减小且此减小在使用RA作为共佐剂的情况下甚至更明显。所述佐剂联合当前疗法展示中等的34％功效。然而，RA纳入疗法使功效大幅度提高到69.2％(表3)。用于计算疫苗功效的公式是：
功效＝100×(1-(已接种疫苗的小鼠感染％)/(假处理组小鼠感染％)
佐剂+LecA组的功效＝100×(1-46/69.2)＝100×(1-0.66)＝34％
表3：疫苗功效
群组 感染率 功效(％)
单独佐剂(对照) 69.2
佐剂+LecA 46 34
佐剂+RA(对照) 46.8
佐剂+RA+LecA 21.3 69.2
这些数据证明，含有合成协同TLR促效剂混合物的纳米脂质体配制物具有产生抗原特异性保护反应的潜力且其与微量营养素辅助免疫接种相容。
PEG长度的影响
图6-7表明，观察到PEG2000配制物情况下的反应高于PEG750。图6表明GLA-3M-052PEG2000+LecA组的IgG2a和IgG1效价平衡；这个组的效价还高于GLA-3M-052 PEG750+LecA组。在图7中，探究PEG长度对粪便粘膜IgA反应的影响。图7表明GLA-3M-052 PEG2000+LecA组的粪便IgA反应大于GLA-3M-052 PEG750+LecA组。因此，脂质体中的PEG长度增加使得粘膜IgA反应增强。
递送途径的影响
探究免疫接种的递送途径是否影响免疫反应。图8A-B描绘了递送途径对免疫接种的影响，其中单独IN(鼻内)疗法产生最高的IgG2a和IgA效价。脂质体+佐剂产生了稳定的粘膜和全身Th1免疫反应：肠道抗LecA IgA(16B)。
图9A-9B进一步描绘了递送途径。单独鼻内疗法产生的IFN-γ和IL-17等效于或大于其它疗法。单独粘膜疗法LecA+脂质体+佐剂产生了稳定的粘膜和全身Th1免疫反应：IFN-γ(9A-B，表4)。未预料到鼻内递送会产生IgA(全身反应)反应。这表明，在含有LecA的脂质体中配制的GLA和3M-052的粘膜递送产生了全身免疫。这些结果表明，组合物的非粘膜投与产生了稳定的全身免疫反应，如IgG2a/IgG1比率所证明。惊人的是，组合物鼻内投与局部粘膜表面不仅在鼻通道中产生了粘膜反应，而且产生了远端肠(粪便)粘膜反应。
表4：单独鼻内疗法LecA+脂质体+佐剂产生了稳定的粘膜和全身Th1免疫反应
疗法 IgG2a/IgG1比率
IN+IN+IN 2.22
SC+SC+SC 0.53
IN+SC+IN 1.49
SC+IN+SC 0.46
结果讨论
这项研究的重要成果是鉴别出了能够诱发全身以及粘膜免疫反应的含有合成TLR促效剂的纳米脂质体佐剂。含有TLR4(GLA)和TLR7/8(3M-052)促效剂的基于脂质体的佐剂系统产生了平衡的体液反应和强细胞因子反应。GLA是一种合成TLR4配体，其在多个1期和2期临床试验所用的基于脂质的平台中配制。3M-052是一种合成TLR7/8配体，其处于先进的临床前研发中(Fox等人，《现代疫苗中的免疫增强剂(Immunopotentiators in ModernVaccines)》，第2版，正待出版；Smirnov等人，《疫苗》2011，29:5434；Zhao等人，《癌症免疫疗法杂志(J Immunother Cancer)》2014，2:12；Singh等人，《免疫学杂志(J Immunol)》2014，193:4722)。GLA和3M-052的脂质体配制物适用于粘膜/肠胃外混合型免疫接种疗法并且也诱发强粘膜IgA反应。溶组织内阿米巴激发的免疫小鼠展示了抗原负荷大幅度减小。GLA3M-052纳米脂质体配制物与使用所有反式视黄酸作为共佐剂相容且此类疗法进一步提高了保护功效和粘膜IgA含量。
实例2：3M-052佐剂的流感疫苗配制物和测试
材料和方法
材料配制和制造
3M-052由3M公司内部合成。R848由3M供应或购自Axxora Life Sciences Inc.(加州圣地亚哥)。合成的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-双十六酰基-sn-甘油-3-磷酸基-(1'-外消旋-甘油)(DPPG)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750](DPPE-PEG750)和卵磷脂酰胆碱(PC)购自Avanti Polar Lipids Inc(Alabaster,AL)或LipoidLLC(Newark,NJ)。角鲨烯获自Sigma(St.Louis,MO)。胆固醇、磷酸二氢铵和磷酸氢铵购自J.T.Baker(San Francisco,CA)。泊洛沙姆188和甘油购自Spectrum Chemical(Gardena,CA)。磷酸盐缓冲盐水1×(PBS)pH 7.2购自Invitrogen(Grand Island,NY)。
通过将DPPC、胆固醇和DPPE-PEG750与各种量的3M-052合并于有机溶剂(氯仿或氯仿/甲醇/水混合物)中来制造小批量(≤20mL)的聚乙二醇化脂质体配制物。然后使用Genevac EZ-2蒸发有机溶剂。使脂质膜在PBS(pH 7.2)或25mM磷酸铵缓冲液(pH 5.7)中复水且在Crest powersonic CP230D(Trenton,NJ)超声波水浴中、在约60℃下声波处理约2-3小时或直至配制物半透明且看不到大颗粒为止。中性脂质体(DOPC、胆固醇)、阴离子型脂质体(DPPC、胆固醇、DPPG)和阳离子型脂质体(DPPC、胆固醇、DPTAP)使用相同程序。脂质体组分重量比如下：聚乙二醇化(18:5.5:3，DPPC:chol:DPPE-PEG750)、中性(20:5，DOPC:chol)、阴离子型(18:5:2，DPPC:chol:DPPG)、阳离子型(18:5:2，DPPC:chol:DPTAP)。如上制造较大批量(100mL)的聚乙二醇化脂质体，但声波处理时间较短，随后进行高剪切均质化(微流化器M110P)，在30,000psi下连续通过12次。
除了脂质体初始用75mM硫酸铵溶液水合之外，如上文所述通过制造浓缩的聚乙二醇化脂质体组合物来制备含有R848的脂质体。在60℃声波处理约1小时之后，使用PD-10柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))使脂质体的外部缓冲液相对于0.9％盐水交换。将其外部缓冲液中现含有盐水且其内部现含有硫酸铵的脂质体与含有R848的盐水溶液混合且在60℃下培育1小时。最后，使脂质体通过另一个PD-10柱以去除未囊封的R848。
水包油型稳定乳液(SE)是通过将3M-052与DMPC或卵PC一起溶解于氯仿中来制造。然后使用旋转式蒸发器去除氯仿。然后将角鲨烯添加至干燥的脂质膜中且将玻璃容器在60℃超声波水浴中放置约1小时。这种混合物称为油相。或者，通过将3M-052直接分散于角鲨烯和DMPC(无卵PC或氯仿)中来制备油相。然后将水相添加到油相中，以获得最终浓度25mM的磷酸铵缓冲液、0.037％(w/w)泊洛沙姆188和1.8％(v/v)甘油(等张剂)、4％v/v角鲨烯、7.6mg/ml DMPC或卵PC，和各种量的3M-052。一些乳液还含有0.02％v/vα-生育酚。粗乳液是通过将混合物在60℃水浴中超声波处理另外10-15分钟来产生。最终乳液是通过处理粗乳液、在30,000psi下连续约12次通过高剪切均质器(微流化器M110P)来制备。
使用R848，通过如上文所述制造浓缩乳液且与干燥粉末R848混合或与R848于磷酸铵缓冲液中的溶液混合来制备乳液。在下述活体内实验之前，使乳液和脂质体通过0.2μm膜过滤。
配制物表征
通过首先将每种配制物在比色管中、在98％乙醇/2％HCl溶液中稀释20倍来估算3M-052和R848的浓度。在日立U-3900H光谱仪(日本东京)上分析样品在约322nm下的吸光度。使用Malvern Instruments(Worcestershire,UK)Zetasizer Nano-S、Nano-ZS或Nano-APS评估粒度。配制物在1.5ml聚苯乙烯抛弃式比色管中、在超纯水中稀释100倍。每种配制物准备三个独立比色管。然后每个比色管进行所有尺寸测量三次。使用Malvern ZetasizerNano-ZS测量ξ电位。每次配制时，将50μl与950μl超纯水在抛弃式毛细管单元(MalvernInstruments,DTS1070)中合并。从所制备的每个样品收集九次测量值(每种配制物一个样品)。
病毒储备液和疫苗
此研究中使用的疫苗抗原都衍生自A/越南/1203/04(VN1203)流感病毒。鼠类免疫原性和激发研究中使用的重组HA蛋白(rHA)获自蛋白质科学公司(Protein SciencesCorp)。在白鼬免疫接种和激发研究中，从Sanofi Pasteur获得临床级VN1203裂解疫苗。
通过用所指定的H5N1储备液接种10日龄含胚鸡蛋来产生供鼠类和白鼬激发研究用的病毒储备液。过滤澄清的尿囊液，且在-80℃下储存直至使用。通过使用标准分析且如所述对MDCK细胞(ATCC#CCL-34)进行溶菌斑分析来测定病毒效价。
白鼬全血刺激分析
收集从雄性艾鼬收集到的全血且与TLR促效剂化合物(包括咪喹莫特(TLR7))、TLR7/8促效剂CL057(Invivogen)和合成TLR4促效剂GLA一起培育。培育之后，使用RNA全血提取试剂盒(Qiagen)从被刺激的对照物和盐水对照物中收集RNA。TLR7、TLR8、IL-1β和IL-8的RNA含量是通过实时PCR测定。表现量变化相对于盐水刺激的血液样品以RNA含量的变化倍数图示。
鼠类激发研究
在鼠类激发研究中，6-8周龄雌性C57B1/6小鼠组用重组H5N1 HA蛋白(VN1203株系，蛋白质科学公司)与所指定佐剂的组合免疫。所有免疫接种都是通过肌肉内途径(均匀地接种于两腿之间)，总体积为100μL裂解疫苗。免疫接种之后二十一天，小鼠用1×106PFU的A/VN/1203/05(H5N1分化体1)激发。激发后第一天开始，监测所有动物的体重损失且观察重度感染的征兆。使发现第0天体重损失>25％的动物安乐死。
白鼬激发研究
所有免疫接种和激发研究都使用雄性艾鼬(佛罗里达鼬(Mustela putorisfero)，Triple F农场，Sayre PA)。艾鼬的免疫接种是通过将250μL注射到四头肌肌肉中来进行。所有动物接受0.5μg来源于国家大流行病储备库的A/越南/1203/04 H5N1裂解疫苗(Sanofi Pasteur)。免疫接种后21天，收集血清样品以测定抗体效价。
通过将1×105-5×105PFU病毒按照50μL体积(25μL/鼻孔)滴注至肺中来起始激发。感染之后，观察动物且每天称重以监测病毒诱导的发病率。使失去激发前体重的25％的任何动物安乐死。
溶菌斑分析
通过对马丁-达比犬肾脏(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞进行溶菌斑分析来获得病毒效价。简单地说，分析开始之前的24小时，将细胞于杜贝科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中按照1×106个细胞/孔接种于6孔培养皿中，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素。分析开始时，用DMEM将汇合的MDCK单层洗涤三次以去除FBS。将连续稀释的洗鼻液样品按照100μL体积添加到单层中且在37℃下培育60分钟。培育之后，单层用2mL含有0.8％琼脂糖(SeaKem)的1×L-15培养基(Lonza)覆盖。培育48-72小时之后，利用结晶紫(BD)染色来量化溶菌斑。
血球凝集抑制(HAI)分析
根据WHO方案执行血球凝集素抑制分析(52)。福马林灭活的H5N1抗原获自国家生物学标准和管制所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)。所有细胞都使用洗涤过的1％马红血球(RBC)(Lampire)分析。
微量中和分析
使用假型化慢病毒颗粒测定中和抗体效价。简单地说，假型颗粒通过用表达H5N1和HA的质体和3种以下慢病毒封装质体共转染293T细胞来产生：pDR8.74(55)、pRSV-Rev和HR'-CMV-Luc，所述慢病毒封装质体封装于病毒颗粒中且在CMV立即早期启动子的控制下编码荧光素酶转基因。病毒储备液在杜贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)中按照5×103个MDCK细胞/孔接种之前的24小时，在黑色平底96孔盘(Corning)中滴定。病毒滴定之前，细胞用200μL DMEM洗涤3次以去除DMEM，且用连续稀释的病毒储备液覆盖。培育72小时以允许转基因表达之后，使用BrightGlo荧光素酶(Promega)，根据制造商说明书测定已转导细胞中的荧光素酶含量。
为了进行中和分析，将连续稀释的免疫接种后血清与含有1×104个相对荧光素酶单位(RLU)的稀释病毒储备液按照1:1比率混合。将病毒血清混合物在37℃下培育1小时，且如上添加到含有洗涤过的MDCK细胞的培养盘中。根据对所有已转导细胞中的荧光素酶表达水平的评估来确定中和效价。IC90抗体效价定义为观察到荧光素酶含量相对于载体转导的对照细胞减少10倍时的最高血清稀释度。
HA阵列
含有流感HA蛋白的HA阵列此前已有描述(56)。此研究中使用的阵列是第二代，并且含有来自多种流感病毒株的278 HA蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司(Sinobiological))。为了进行疫苗接种后免疫分析，阵列首先用PBS+1％胎牛血清+0.1％Tween-20阻断，用蛋白质阵列洗涤缓冲液(ArrayIt)洗涤三次，且与300μL的1:100稀释的免疫接种后小鼠血清一起在振荡下培育1小时。初步培育之后，阵列用洗涤缓冲液洗涤5次，并且与针对IgG2c(Jackson Immunoresearch，零件#：115-495-208)和IgG1(LifeTechnologies，零件#：A21123)的荧光团结合二次抗体按照1:2000稀释度培育。在室温下培育30分钟之后，阵列用冲洗缓冲液(Arrayit)冲洗，且使用Molecular Dynamics 400B阵列扫描仪分析。使用Tableau数据分析软件进行采集后分析。
ELISA
免疫接种后的第七天和第二十一天，确定IgG、IgG1和IgG2c的HA特异性终点效价。高结合聚苯乙烯384孔盘在室温下用含有重组VN1203 HA(蛋白质科学公司(ProteinSciences Corp.))(2μg/ml)的0.1M碳酸氢盐涂布缓冲液涂布2.5小时。培养盘在室温下用0.05％PBS-Tween 20+1％BSA阻断培育两小时之前和之后，用0.1％PBS-Tween 20洗涤三次。使用Nanonscreen NSX-1536将小鼠血清在0.05％PBS-Tween20+0.1％BSA中连续稀释且在4℃下培育隔夜且洗涤五次。培养盘与抗小鼠IgGT、IgG1或IgG2c-HRP(SouthernBiotechnologies)一起在振荡器上培育1小时。洗涤五次之后，使培养盘在使用SureBlue四甲基联苯胺底物的Nanoscreen机器人(Kirkegaard&Perry Laboratories)上显影。使用Multipette Sagian机器人，使用1N H2SO4中止酶反应。使用Synergy ELISA读盘器(Biotek)和Gen5软件，在450-570nm下读盘。
细胞内细胞因子染色
为了量化疫苗特异性T细胞反应，疫苗接种之后，从每组五只小鼠中分离出脾细胞。使用红血球溶解缓冲液(eBioscience)溶解红血球且再悬浮于cRPMI1640(10％FBS、1％青霉素/链霉素；0.1％2-巯基乙醇)中。将细胞按照107个细胞/孔接种于96孔盘中且在37℃下用培养基或rHA抗原(10μg/mL)刺激2小时。添加1:50GolgiPlug(BD Biosciences)且将细胞在37℃下培育另外8小时。洗涤细胞且在室温下、在黑暗中、在抗CD16/32(克隆系93)存在下、用针对CD4(克隆系RM4-5)、CD8(克隆系53-6.7)、CD44(克隆系IM7)和B220(RA3-6B2)的存在于1％BSA-PBS中的荧光染料标记抗体(1:100)(BioLegend和eBioscience)表面染色15分钟。固定细胞且在室温下、在黑暗中用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)渗透30分钟。细胞用Perm/Wash(BD Biosciences)洗涤且用检测如下细胞内细胞因子的荧光染料标记抗体染色：IFN-γ(克隆系XMG-1.2)、IL-2(JES6-5H4)、TNF(MP6-XT22)、IL-5(克隆系：TRFK5)和IL-10(克隆系：JES5-16E3)(BioLegend和eBioscience)。染色在室温下、在黑暗中进行15分钟。洗涤细胞，再悬浮于1％BSA-PBS中且使用30-40μm PP/PE 96过滤盘(Pall Corp)过滤。在四个激光LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上收集多达106个事件。利用FlowJo(Treestar)分析数据。
结果
利用薄膜技术、随后通过声波处理来制造经阴离子型、阳离子型或聚乙二醇化磷脂修饰的基于DPPC的脂质体，和基于DOPC的中性脂质体。脂质体使用1mg/ml高浓度的3M-052制造，以便强调与各种脂质体组成不相容的任何倾向。每种脂质体两次独立批量之后，聚乙二醇化脂质体和DOPC脂质体在声波处理之后展现半透明的外观和最小的粒度和多分散性(表5)。
表5：脂质体的配制物特性和3M-052的乳液配制物
*脂质体和乳液经制造以分别含有1mg/ml 3M-052或0.04mg/ml 3M-052
选择聚乙二醇化脂质体用于进一步的稳定性和活体内评估。聚乙二醇化脂质体带负电(表6)，最可能的原因是DPPE-PEG750存在阴离子型磷酸酯基。
表6：含有3M-052的代表性脂质体和乳液配制物的ξ电位
配制物 估算的3M-052浓度(mg/ml)* ζ电位(mV)
聚乙二醇化脂质体 - -37.1±4.8
聚乙二醇化脂质体 0.04 -27.1±1.1
水包油型乳液 - -4.2±0.6
水包油型乳液 0.04 -8.6±1.0
*这些批料中的3M-052含量未进行测量，但基于使用相同工艺所制造的后续批料，估计为0.04mg/ml。
所述脂质体在5℃下展现极小的粒度变化或粒度不变(图10A-10B)。一般来说，在制造期间，3M-052的损耗不明显。
通过微流体化制造3M-052的基于角鲨烯的水包油型乳液(SE)配制物，从而产生<100nm尺寸的液滴和低多分散性和长期粒度稳定性(图10A-10B)。乳液ζ电位值略微呈负值(表6)。惊人的是，使用卵PC代替DPMC制造的乳液使得在处理之后的3M-052回收率提高。此外，相较于在氯仿不存在下对角鲨烯/卵PC中的干燥粉末进行声波处理，增添将3M-052与卵PC合并于氯仿中的初始混合步骤进一步提高了3M-052的回收率。因此，乳液组成和处理程序的变化对3M-052并入最终配制物中具有显著的影响。参见下表7
表7-乳液制造之后的3M-052回收率
3M-052与H5N1 HA组合配制物在单次免疫接种之后保护小鼠以免致死性H5N1激发
展现3M-052佐剂配制物的稳定性(图10A和B)之后，探究这种TLR促效剂增强HA特异性疫苗反应的能力。将配制于聚乙二醇化脂质体中或配制于角鲨烯水包油型乳液(SE)中的3M-052与重组流感HA H5N1蛋白(A/越南/1203/04株系[VN1203]，蛋白质科学公司，Meridien CT)混合并且通过肌肉内途径使用，以使C57BL/6小鼠组(每组N＝20)免疫。单次免疫接种之后的第二十一天，所有小鼠鼻内用1000LD50的VN1203激发。追踪十只动物14天以确定病毒诱导发病率(根据体重损失来测量)以及死亡率。在脂质体佐剂配制物中，3M-052防止病毒诱导发病率；接受rH5+3M-052-脂质体的动物100％存活，相比之下，接收rH5或rH5与单独脂质体组合的动物50％存活(图11A)。用rH5+3M-052-脂质体免疫的小鼠未展示体重损失，而接受有或无脂质体的rH5的动物在激发之后出现体重损失(图11B)。接受基于乳液的配制物的动物在3M-052存在和不存在下展示一致的存活率(图11A)，与乳液作为流感佐剂的已知功效一致。然而，相较于接受rH5+SE的动物，接受乳液与TLR 7/8促效剂组合的动物在急性感染期间展示减小的体重损失(图11C)。
除监测动物存活率之外，使每组5只动物在激发后第4和7天安乐死，以测量/观测流感诱导肺发生的病理学和测定肺病毒效价。激发后第4天，经rH5+3M-052佐剂配制物免疫的动物使肺病毒效价相对于非免疫对照显著减小。经rH5+3M-052-脂质体免疫的动物在此时间点的病毒效价检测不到(图11D)。第7天，接受基于3M-052的佐剂配制物的动物相对于单独的rH5具有最小的病毒效价。对于脂质体与基于SE的配制物来说，3M-052的添加相对于不含TLR的相同配制物引起效价显著降低(图11E)。除病毒效价降低之外，经rH5+3M-052佐剂配制物免疫的动物展示显著更低的肺重量(图11F)和降低的肺病理学分数(图11G)。综合而言，这些结果表明3M-052甚至能够保护小鼠以防致死性禽流感激发的临床后遗症。图11H展示了肺病毒效价。
3M-052佐剂配制物诱导小鼠发生Th1 CD4 T细胞反应
为了研究含3M-052佐剂配制物的保护相关性，检查rH5与佐剂组合免疫接种之后所诱导的CD4 T细胞反应。单次免疫接种之后，检查CD4+ T细胞的细胞因子产生情况。3M-052佐剂配制物免疫的动物中可以展现含量较低、但可检测的Th1细胞因子阳性细胞(IFNγ/TNFα/IL-2)含量(图12A-C)。可以在展示具有动物保护作用的所有佐剂配制物中观察到典型的Th1 CD+ T细胞。根据此前研究，这些数据表明3M-052能够在低含量抗原疫苗接种之后诱导小鼠发生偏向Th1的细胞反应。
3M-052佐剂配制物诱导针对H5N1 HA的拓宽的亚型抗体交叉反应
所配制的3M-052佐剂免疫接种之后，观察到Th1 CD4 T细胞(IFNγ+TNFa+IL-2+)的诱导(图12)。使用第二代高密度HA蛋白质阵列，探究3M-052拓宽分化体1rH5抗原所诱导的抗体反应的能力。此研究中使用的HA阵列含有278种个别HA蛋白，包括来自HA亚型1-16的至少一种代表性蛋白质。探究IgG1与IgG2c抗体结合至来自不同亚型的HA蛋白的能力。佐剂的添加使得增强免疫接种之后所诱导的抗体量增加。SE和脂质体佐剂展示对H5亚型蛋白的结合增加，并且以IgG1反应占主导。3M-052添加到配制物中引起抗体反应显著变宽，从而结合至多种多样的HA亚型，以及诱导交叉反应性IgG2c抗体。(数据未示出)
检查阵列上的H5株系明确表明，用3M-052配制物免疫接种之后发生交叉分化体结合反应。3M-052-脂质体与3M-052-SE免疫的动物均展示结合到来自多种H5N1病毒分化体的蛋白质的IgG2c抗体含量增加。相比之下，IgG1含量不依赖于3M-052的存在。为了检验得自HA阵列的发现，使用VN1203 HA作为包被抗原，通过ELISA测定免疫接种后的小鼠血清的抗体终点效价。通过血清ELISA所观察的结果反映了对HA阵列所观察的那些结果。(数据未示出)
TLR 7/8促效剂增加艾鼬全血中的受体和细胞因子mRNA
为了证实咪唑并喹啉能够刺激艾鼬中的同源TLR受体，进行全血刺激分析。从雄性艾鼬收集全血且用咪唑并喹啉或合成TLR4促效剂葡糖吡喃糖基脂质A(GLA)刺激。利用实时PCR检查促效剂分子刺激细胞因子与TLR受体mRNA的能力。100μM R848(在其它物种中，已知的TLR7/8促效剂，3M)和100μM CL075(在其它物种中，已知的TLR8促效剂，Invivogen)刺激全血引起IL-1B、IL-8、TLR7和TLR8 mRNA显著增加。此结果证明咪唑并喹啉能够刺激艾鼬受体，并且表明艾鼬具有可能在此流感疾病模型中起作用的活性TLR7和TLR8。
所配制的3M-052佐剂(与H5N1抗原组合)在单次免疫接种之后增强保护作用以防艾鼬中的H5N1激发
鉴于小鼠中出现有希望的结果，且验证咪唑并喹啉能够刺激艾鼬TLR，因此检查含有3M-052的佐剂在单次免疫接种之后保护艾鼬以防致死性H5N1激发的能力。在这些研究中，将存在和不存在3M-052的中性脂质体和SE佐剂与衍生自VN1203(SP-H5)的H5N1裂解病毒疫苗(Sanofi)组合。选择这种抗原的原因是其当前包括于美国国家大流行病储备库中，并且在此前研究中已得到临床测试。简单地说，按照使用单独H5N1抗原的剂量范围研究(数据未示出)，将各组4-6只艾鼬用0.5μg SP-H5与所指定佐剂的混合物、通过肌肉内途径免疫(图13)。免疫接种后二十一天，艾鼬用106PFU的A/VN/1203/04鼻内激发，并且追踪14天期间的体重损失、临床分数和存活率。另外，激发后第一天开始，隔日收集洗鼻液。在一项研究中，相较于SP-H5+SE免疫的动物，3M-052/SE完全保护动物以免激发(图13A)。3M-052/SE相较于单独的SE还使病毒诱导的发病率降低；经SP-H5+3M-052/SE免疫的动物在激发之后未出现体重损失(图13B)，且在整个感染期间具有仅最低的临床分数(图13C)。在第二实验中，在脂质体佐剂配制物免疫接种动物之后，观察到类似结果。3M-052-脂质体保护100％动物以免激发(图13E)。类似于基于SE的配制物，经SP-H5+3M-052脂质体免疫的动物无体重损失(图13F)，并且临床分数可以忽略(图13G)。或许最重要的是，肺病毒效价的检查表明，在SE与脂质体配制物中，3M-052能够减少洗鼻液的病毒排出；经3M-052/SE(图13D)或3M-052/脂质体(图13H)免疫的动物相较于其它佐剂或对照动物，在激发后3天很快展示显著的降低。在两种情况下，在接受3M-052佐剂的所有动物中，病毒在第5天被清除到含量检测不到。
3M-052佐剂配制物诱导艾鼬发生杂交分化体中和抗体反应
基于小鼠中所观察的广泛HA特异性抗体反应和我们在艾鼬中所观察到的针对同源病毒的稳固保护作用，直接检查中和抗体效价，所述中和抗体效价是在使用H5N1 HA假型化慢病毒载体的不同佐剂配制物免疫接种之后所诱导的。简单来说，将连续稀释的血清样品与表面上含有H5N1 HA和NA蛋白质的慢病毒颗粒一起培育。使血清-病毒混合物在汇合的MDCK细胞单层上培育。培育以允许封装于病毒中的荧光素酶转基因表现之后，通过定量荧光素酶基因表达来测定血清样品的中和潜力。与这些研究中所观察到的增加的存活率一致，在单次注射之后的第21天，3M-052/SE和3M-052/脂质体佐剂使血清的IC90中和效价提高(图14A、D)。另外，观察到两种配制物均使针对分化体2病毒的中和效价显著提高；使针对A/Indo/5/05[分化体2.1]和A/大天鹅/蒙古/244/05[分化体2.2]的IC90效价提高(图14B-F)。这个发现符合所配制3M-052诱导针对漂移的流感病毒株的广泛功能中和抗体效价的能力。
3M-052-SE诱导杂交分化体保护反应
鉴于免疫接种VN1203抗原之后观察到针对A/大天鹅/蒙古/244/05的中和效价，因此探究VN1203抗原疫苗接种之后，所配制3M-052减少病毒在肺中复制的能力。如同此前研究，艾鼬用SP-H5与所配制3M-052的组合免疫一次，且21天后，用5×105PFU的病毒激发。接受3M-052/脂质体的动物展示病毒排出随时间适度减少；接受3M-052/脂质体的动物在激发后第5天检测不到病毒，而接受单独脂质体或抗原的其他动物此时能检测到病毒(图15B)。相比之下，接受3M-052-SE的动物快速清除病毒，激发后第3天起检测不到溶菌斑，而接受SP-H5+SE的那些动物展示的病毒效价直到第5天都能检测到(图15A)。
结果讨论
本文所呈现的结果表明，当小鼠和艾鼬用所配制的TLR7/8促效剂3M-052免疫时，这些动物在大剂量(1000 LD50)H5N1病毒激发之后受到保护。将3M-052并入任一种配制物中，且这些配制物稳定的时间延长。当与低剂量(100ng)的基于HA的重组抗原组合时，观察到3M-052的新颖聚乙二醇化脂质体配制物增加存活率且降低肺病毒效价。另外，测试角鲨烯水包油型乳液中并入3M-052和DMPC或卵PC的配制物，且这种配制物与rHA组合时，展示提高的存活率和降低的肺效价。在3M-052免疫动物中观察到Th1 CD4+ T细胞的诱导。与Th1CD4+ T细胞诱导一致，在3M-052免疫动物中观察到IgG2c抗体增加。含3M-052佐剂配制物诱导针对同源和异源病毒株的防护作用的能力以及所配制的3M-052佐剂的稳定性延长表明，这些配制物适用于储备。另外，展现了这些佐剂与国家储备库中当前所包括的大流行前疫苗抗原的相容性，并且表明组合疫苗能够保护艾鼬以防株系匹配的分离株和漂移分离株。
实例3：聚乙二醇化脂质体通用性
为了测试聚乙二醇化脂质体配制物的通用性，将额外脂质添加到胆固醇、非聚乙二醇化中性脂质和聚乙二醇化脂质的基质配制物中。一种或多种额外中性脂质和一种或多种额外阳离子脂质的添加对所得脂质体配制物的稳定性或功效未产生不利影响(资料未示出)。

Claims (39)

1.一种脂质体，其包含：
(a)胆固醇；
(b)非聚乙二醇化中性脂质；和
(c)聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约5000道尔顿或更小。
2.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量在约750道尔顿至约5000道尔顿范围内。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的脂质体，其中所述聚乙二醇化脂质中的PEG平均分子量是约2000道尔顿或更小。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的脂质体，其中所述聚乙二醇化脂质中的脂质组分包含中性脂质。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的脂质体，其中所述聚乙二醇化脂质中的所述脂质组分是DSPE、DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE。
6.根据权利要求1到4中任一项所述的脂质体，其中所述聚乙二醇化脂质中的所述脂质组分是DSPE或DPPE。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的脂质体，其中所述非聚乙二醇化中性脂质是DPPC、DOPC、DLPC、DMPC、DSPC、POPC、DPPE或DMPE。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的脂质体，其中所述非聚乙二醇化中性脂质是DPPC。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体在约2℃至约8℃的温度下稳定至少1个月。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体的多分散指数维持在约0.3或更小。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体的尺寸小于或为约450nm。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的所述聚乙二醇化脂质摩尔百分比(mol％)在约1mol％至约25mol％范围内，所述脂质体中的胆固醇mol％在约1mol％至约50mol％范围内，且所述脂质体中的非聚乙二醇化脂质mol％在约45mol％至约98mol％范围内。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的脂质体，其中所述非聚乙二醇化中性脂质:胆固醇:聚乙二醇化脂质的脂质摩尔比是约9.8:5.7:0.8或约18:5.5:3。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体进一步包含至少一种TLR促效剂。
15.根据权利要求14所述的脂质体，其中所述TLR促效剂包含疏水性尾。
16.根据权利要求14所述的脂质体，其中所述至少一种TLR促效剂是3M-052或GLA。
17.根据权利要求14所述的脂质体，其中所述TLR促效剂包含下式的合成GLA：
或其医药学上可接受的盐，；或式(VI)的合成GLA：
或其医药学上可接受的盐，其中：
R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C12-C20烷基，优选地，R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C13烷基。
18.根据权利要求14所述的脂质体，其中所述脂质体包含TLR4促效剂和TLR7/8促效剂。
19.根据权利要求18所述的脂质体，其中所述脂质体包含GLA和3M-052。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体进一步包含抗原。
21.根据权利要求20所述的脂质体，其中所述抗原包含H5N1。
22.根据权利要求20所述的脂质体，其中所述抗原包含LecA。
23.一种组合物，其包含根据权利要求1到21中任一项所述的脂质体和医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。
25.一种组合物，其包含根据权利要求22所述的脂质体和医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
26.一种刺激受试者的免疫反应的方法，其包含向所述受试者投与根据权利要求1到21中任一项所述的脂质体或根据权利要求23到24中任一项所述的组合物，借此刺激所述受试者的免疫反应。
27.一种刺激受试者的免疫反应的方法，其包含向所述受试者投与根据权利要求22所述的脂质体或根据权利要求25所述的组合物，借此刺激所述受试者的免疫反应。
28.一种诱导受试者的Th1反应的方法，其包含向所述受试者投与根据权利要求1到21中任一项所述的脂质体或根据权利要求23到24中任一项所述的组合物，借此诱导所述受试者的Th1反应。
29.根据权利要求26或28所述的方法，其中所述免疫反应是非特异性免疫反应。
30.根据权利要求26或28所述的方法，其中所述免疫反应是抗原特异性免疫反应。
31.根据权利要求26或28所述的方法，其中所述脂质体或组合物用于增强保护性免疫对抗致流感病毒。
32.一种诱导受试者的Th1反应的方法，其包含向所述受试者投与根据权利要求22中任一项所述的脂质体或根据权利要求25所述的组合物，借此诱导所述受试者的Th1反应。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物或脂质体用于增强保护性免疫对抗致阿米巴病生物体。
34.根据权利要求27、32或33中任一项所述的方法，其中投药途径是鼻内。
35.一种刺激受试者的全身免疫反应和粘膜免疫反应的方法，其包含向所述受试者鼻内投与根据权利要求22所述的脂质体或根据权利要求25所述的组合物。
36.一种制备根据权利要求1到21中任一项所述的聚乙二醇化脂质体或根据权利要求23到24中任一项所述的组合物的方法，其包含：
(a)将所述非聚乙二醇化中性脂质、所述聚乙二醇化脂质和所述胆固醇混合于有机溶剂中；
(b)蒸发所述有机溶剂，借此产生脂质膜；
(c)使所述脂质膜在缓冲液中复水；和
(d)对步骤(c)的复水产物进行超声波处理、微流体化或挤出。
37.一种水包油型乳液，其包含TLR促效剂、角鲨烯和不饱和磷脂酰胆碱。
38.一种制备根据权利要求37所述的水包油型乳液的方法，其包含将所述TLR促效剂与所述不饱和磷脂酰胆碱合并于有机溶剂中。
39.根据权利要求37所述的乳液或根据权利要求38所述的方法，其中所述TLR促效剂是3M-052。
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