BR112018073676B1 - Lipossomas peguilados e métodos de uso - Google Patents

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Susan S. Lin
Darrick Carter
Neal Van Hoeven
Mayuresh M. Abhyankar
William A. Petri Jr
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Abstract

trata-se de lipossomas peguilados, e métodos de fabricação e uso dos mesmos. os lipossomas peguilados compreendem pelo menos um colesterol, um lipídeo neutro não peguilado e um lipídeo peguilado, em que o peso molecular médio do componente peg no lipídeo peguilado é de cerca de 5.000 daltons ou menos. os lipossomas peguilados são estáveis e têm a capacidade de entregar um agente para a geração de uma resposta imune, por exemplo, um agente para uso diagnóstico, terapêutico ou vacina. também são fornecidas composições e métodos relacionados à fabricação dos lipossomas peguilados e ao uso dos lipossomas pegilados para estimular uma resposta imunológica.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/337.328, depositado em 16 de maio de 2016, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO RELACIONADA À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO DO GOVERNO FEDERAL
[0002] Esta invenção foi realizada com o apoio do governo sob o contrato n° HHSO100201000039C concedido pela Autoridade de Pesquisa e Desenvolvimento em Biomédica Avançada (BARDA) dentro do Gabinete do Subsecretário de Preparação e Resposta (ASPR) no Departamento de Saúde e Senhores Humanos dos EUA e sob a Concessão n° 5R21AI1091I8 e Contrato n° HHSN272200800045C concedido pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, dentro dos Institutos Nacionais de Saúde no Departamento de Serviços Humanos e de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Sistemas de entrega à base de lipossomas têm sido desenvolvidos para biomoléculas, como fármacos e agentes de imageamento. Tais lipossomas oferecem vantagens como uma persistência circulatória prolongada conduzindo a uma apresentação melhorada do sistema imunológico, liberação controlada da biomolécula e a versatilidade para permitir a formulação de biomoléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. Para prolongar a semivida circulatória dos lipossomas, é necessário que sejam protegidos dos mecanismos normais de depuração, incluindo interações com proteínas e fagócitos séricos. Foram desenvolvidas inúmeras abordagens para melhorar a proteção de lipossomas do sistema imunológico, incluindo a PEGuilação de lipossomas (lipossomas contendo um polietilenoglicol (PEG)). Lipossomas contendo PEG e outros opolímeros concebidos para proteger o lipossoma contra macrófagos foram denominados na técnica como “lipossomas furtivos”. Além das propriedades de proteção, a PEGuilação pode influenciar a estabilidade da preparação de lipossomas restringindo, embora não excluindo, a fusão de lipossomas após armazenamento prolongado. Para escapar de tais fusões, a coroa PEG deve fornecer uma camada suficientemente espessa para proteger a superfície lipossômica.
[0004] O peso molecular do PEG tem sido tradicionalmente considerado como um importante determinante da proteção eficaz de superfície. Os lipossomas PEGuilados revestidos com PEGs de 1 peso molecular inferior foram ineficazes na blindagem. Por exemplo, quando os lipossomas PEGuilados com 750 Daltons de PEG foram comparados com lipossomas não PEGuilados, não houve diferença (Mori et al., FEBS Lett, 1991). A circulação sanguínea prolongada e a absorção fagocítica reduzida só foram observadas apenas quando o peso molecular do PEG foi aumentado para mais de 5.000 Daltons.
[0005] Os lipossomas também foram avaliados quanto à entrega de vacinas e adjuvantes de proteínas subunitárias. Os lipossomas são veículos de entrega de vacina atrativos devido à capacidade de adaptar a composição do lipossoma para atingir a concentração lipídica desejada, carga, tamanho e distribuição ou direcionamento do antígeno e adjuvante. Inúmeros sistemas à base de lipossomas foram avaliados incluindo lipossomas aniônicos, catiônicos e neutros, mas nem todos os lipossomas são criados iguais. Muitas formulações de lipossomas lipídicos catiônicos são tóxicas. Muitos lipossomas neutros são instáveis ex vivo e crescem ao longo do tempo ou desintegram-se imediatamente após a fabricação. Os lipossomas aniônicos têm limitações de carga que afetam a sua capacidade para distribuir vários antígenos e se fundem a membranas celulares. Outros lipossomas contêm lipídeos sintéticos ou copolímeros em bloco que podem exercer efeitos sobre o próprio sistema imunológico. As formulações lipossômicas à base de colesterol são ideais devido ao fato de que o colesterol é um componente natural das membranas celulares humanas e, quando combinado com outros colípideos, como DOTAP e DOPC, forma nanopartículas catiônicas estáveis de aproximadamente 100 a 200 nm com índices desejáveis de polidispersão de cerca de 0,3. Várias estratégias têm sido empregadas para aprimorar as formulações lipossômicas para uso como formulações de vacinas, incluindo estratégias de PEGilação. Até o presente momento, não foi desenvolvida nenhuma formulação clara que supere os problemas associados à estabilidade e toxicidades dos lipossomas conhecidos, e possa aprimorar eficazmente a qualidade da resposta imunológica (revisto em Carstens et al. Vaccine 29, 2011; Kaur et al. Journal of Controlled Release, 2012; Schwendener, Ther Adv Vaccines, 2014; Nag e Awasthi, Pharmaceutics, 2013; Vartak e Sucheck, Vaccines, 2016; Fan et al., Journal of Controlled Release, 2015; Schmidt et al., Pharmaceutics, 2016).
[0006] Dessa forma, existe uma necessidade de desenvolver lipossomas PEGuilados que sejam estáveis, fabricáveis, compatíveis com antígenos e adjuvantes à base de lipídeos, e pequenos em tamanho, para vacinas, terapêuticas e diagnósticos. No domínio das vacinas, existe uma necessidade especial de fornecer tais lipossomas em conjunto com adjuvantes que podem aumentar uma resposta imunológica e vacinações para influenza, doenças entéricas (como amebíase), tuberculose, HIV, câncer e hepatite, por exemplo, poderia se beneficiar do desenvolvimento de tais lipossomas. São aqui fornecidas composições e métodos relacionados às mesmas.
[0007] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de patente e publicações de patentes são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade, como se cada referência individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A presente invenção fornece lipossomas PEGuilados, formulações e composições que compreendem os lipossomas PEGuilados, e métodos para produzir e usar os lipossomas PEGuilados. Os lipossomas PEGuilados são úteis para vacinas, terapêuticas e diagnósticos.
[0009] Os lipossomas PEGuilados compreendem pelo menos um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o peso molecular médio do componente PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos. Os lipossomas PEGuilados são estáveis e têm a capacidade de entregar um agente para a geração de uma resposta imune. A PEGilação dos lipossomas, em que lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos, permite a estabilidade do lipossoma e permite a entrega para células imunes, para a geração de uma resposta imune. Como fornecido no presente documento, o tamanho dos lipossomas PEGuilados presentes na composição varia de cerca de cerca de 450 nm e o tamanho permanece estável a temperaturas variáveis e ao longo do tempo. Os lipossomas PEGuilados são estáveis e apresentam pouca ou nenhuma agregação, ou agregação reduzida, e são passíveis de uma etapa de esterilização final antes do envasamento. Os lipossomas PEGuilados aqui fornecidos podem ainda compreender um agonista de TLR e/ou um agente, por exemplo, um agente para uso em vacina, terapêuticos ou diagnóstico. Também são fornecidas composições e métodos relacionados à fabricação e ao uso dos lipossomas PEGuilados para estimular uma resposta imunológica.
[0010] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um lipossoma que compreende: (a) um colesterol; (b) um lipídeo neutro não PEGuilado; e (c) um lipídeo PEGuilado, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado varia entre cerca de 750 Daltons e cerca de 5.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 2.000 Daltons ou menos. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 750 Daltons. Em algumas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende um lipídeo neutro. Em algumas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende uma cadeia de C14 alquila, uma cadeia de C16 alquila ou uma cadeia de C18 alquila. Em algumas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DSPE, DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE. Em algumas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DSPE. Em algumas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DPPE. Em algumas modalidades, o lipídeo neutro não PEGuilado compreende uma cadeia de C14 alquila, uma cadeia de C16 alquila ou uma cadeia de C18 alquila. Em algumas modalidades, o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE. Em algumas modalidades, o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC. Em algumas modalidades, o lipossoma é estável. Em algumas modalidades, o lipossoma é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 25 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 37 °C. Em algumas modalidades, o índice de polidispersidade do lipossoma é mantido em cerca de 0,3 ou menos. Em algumas modalidades, o tamanho do lipossoma é menor que ou cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho do lipossoma é mantido em menos que ou cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho do lipossoma se encontra na faixa de cerca de 50 nm a cerca de 300nm. Em algumas modalidades, o índice de polidispersidade do lipossoma é menor que ou cerca de 0,3. Em algumas modalidades, o percentual molar (% molar) do lipídeo PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 25% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 10% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 5% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 50% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma é de cerca de 50% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar de lipídeo não PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 45% molar a cerca de 98% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do lipídeo não PEGuilado no lipossoma é de cerca de 45% molar. Em algumas modalidades, a razão molar lipídica do lipídeo neutro não PEGuilado:colesterol:lipídeo PEGuilado é de cerca de 9,8:5,7:0,8. Em algumas modalidades, a razão molar lipídica do lipídeo neutro não PEGuilado:colesterol:lipídeo PEGuilado é de cerca de 18:5,5:3. Em algumas modalidades, o lipossoma compreende adicionalmente pelo menos um agonista de TLR. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR2, um agonista de TLR3, um agonista de TLR4, um agonista de TLR5, um agonista de TLR6, um agonista de TLR7, um agonista de TLR8, um agonista de TLR7/8 ou um agonista de TLR9. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende TLR4, SLA, GLA, 3D-MPL, R837 ou R848. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende uma cauda hidrofóbica. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR7/8. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR7. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR8. Em algumas modalidades, o agonista de TLR7/8 compreende uma imidazoquinolina ou um composto contendo imidazoquinolina. Em algumas modalidades, o agonista de TLR7/8 compreende 3M-052. Em algumas modalidades, o agonista de TLR7/8 compreende R848. Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR4. Em algumas modalidades, o agonista de TLR4 compreende 3D- MPL. Em algumas modalidades, o agonista de TLR4 compreende GLA. Em algumas modalidades, o agonista de TLR4 compreende um GLA sintético de Fórmula (V). Em algumas modalidades, o agonista de TLR4 compreende um GLA sintético de Fórmula (VI).
[0011] Em algumas modalidades, o agonista de TLR4 compreende um GLA sintético de Fórmula:
[0012] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o lipossoma compreende um agonista de TLR4 e um agonista de TLR7/8. Em algumas modalidades, o lipossoma compreende GLA e 3M-052. Em algumas modalidades, o lipossoma compreende adicionalmente pelo menos um agente. Em algumas modalidades, o agente compreende um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente de diagnóstico, um agente terapêutico ou um organismo. Em algumas modalidades, o agente compreende um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno relacionado à amebíase. Em algumas modalidades, o antígeno compreende LecA. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno relacionado à gripe. Em algumas modalidades, o antígeno compreende H5N1. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno relacionado à tuberculose. Em algumas modalidades, o antígeno compreende ID91. Em algumas modalidades, o antígeno compreende ID93. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno de BCG. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno relacionado ao vírus da hepatite. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno de Hepatite B. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno de Hepatite C. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno relacionado ao HIV. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno relacionado ao câncer.
[0013] Em um aspecto relacionado, é fornecida no presente documento uma composição que compreende qualquer um dos lipossomas fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, a composição compreende um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição é uma vacina. Em algumas modalidades, a composição é um agente terapêutico. Em algumas modalidades, a composição é um diagnóstico.
[0014] Em um outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de estimulação de uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo qualquer um dos lipossomas descritos no presente documento, ou qualquer uma das composições que compreendem os lipossomas descritos no presente documento, estimulando, assim, uma resposta imune no indivíduo. Em um outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de indução de uma resposta de Thl em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo qualquer um dos lipossomas descritos no presente documento, ou qualquer uma das composições que compreendem os lipossomas descritos no presente documento, em que a resposta de Thl é induzida no indivíduo. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta imune não específica. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta imune específica de antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune compreende uma resposta imune sistêmica. Em algumas modalidades, a resposta imune compreende uma resposta imune de mucosa. Em algumas modalidades, a resposta imune de mucosa compreende uma resposta imune de mucosa intestinal, fecal ou vaginal. Em algumas modalidades, a composição é usada para o tratamento ou prevenção de câncer. Em algumas modalidades, a composição é usada como uma vacina. Em algumas modalidades, a composição é usada para melhorar imunidade protetora contra um vírus causador da gripe. Em algumas modalidades, a composição é usada para melhorar a imunidade protetora contra um organismo causador de amebíase. Em algumas modalidades, a composição é usada para melhorar a imunidade protetora contra Entamoeba histolytica. Em algumas modalidades, a composição é usada para melhorar a imunidade protetora contra influenza. Em algumas modalidades, a composição é usada para melhorar imunidade protetora contra amebíase. Em algumas modalidades, a via de administração da composição é oral, tópica, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal, intravenosa, intradérmica, transdérmica, intranasal, intramucosal ou subcutânea. Em algumas modalidades, a via de administração é intranasal.
[0015] Em um outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de estimulação de uma resposta imune sistêmica e uma resposta imune de mucosa em um indivíduo que compreende administrar via intranasal qualquer um dos lipossomas fornecidos no presente documento, ou qualquer uma das composições que compreendem os lipossomas, conforme fornecido no presente documento, ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um lipossoma que compreende um agonista de TLR4 e um agonista de TLR7/8. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um lipossoma que compreende GLA e 3M-052. Em algumas modalidades, a resposta imune de mucosa compreende uma resposta imune de mucosa intestinal, fecal ou vaginal. Em algumas modalidades, a resposta imune de mucosa é distal em relação à cavidade nasal.
[0016] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o lipossoma ou composição pode ser administrada com um coadjuvante de ácido retinoico.
[0017] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o lipossoma ou composição é administrada a um ser humano.
[0018] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o lipossoma ou composição é administrada para um mamífero não humano. Em algumas modalidades, o mamífero não humano é um cachorro, vaca ou cavalo.
[0019] Em um outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de fabricação de qualquer um dos lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento, que compreende: (a) misturar o lipídeo neutro não PEGuilado, o lipídeo PEGuilado e o colesterol em um solvente orgânico; (b) evaporar o solvente orgânico, gerando assim um filme lipídico; (c) reidratar o filme lipídico em um tampão, e (d) sonicar, microfluidizar ou extrudar o produto reidratado da etapa (c). Em algumas modalidades, a etapa (a) compreende adicionalmente misturar um agonista de TLR. Em algumas modalidades, o solvente orgânico é clorofórmio. Em algumas modalidades, o produto reidratado da etapa (c) é sonicado e, então, microfluidizado. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente misturar por adição um agente ao lipossoma PEGuilado. Em algumas modalidades, o agente compreende um antígeno.
[0020] Esses e outros aspectos da presente invenção se tornarão evidentes com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos. Além disso, várias referências são aqui apresentadas que descrevem em mais detalhes certos aspectos desta invenção e são, portanto, incorporadas por referência em sua totalidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0021] As Figuras 1A a 1D apresentam características físicas e de estabilidade de várias formulações. A Figura 1A apresenta o diâmetro de partícula, ao longo do tempo, a 5°C. A Figura IB apresenta o índice de polidispersidade, ao longo do tempo, a 5°C. A Figura 1C apresenta o diâmetro de partícula, ao longo do tempo, a 37°C. A Figura 1D apresenta o índice de polidispersidade, ao longo do tempo, a 37°C.
[0022] A Figura 2 mostra a resposta de IgG1 e IgG2a de várias formulações, conforme determinado por ELISA. A Figura apresenta a comparação entre titulações de IgG1 e IgG2a de plasma após a imunização de camundongos com várias formulações do antígeno de LecA misturado com o adjuvante correspondente.
[0023] As Figuras 3A a D apresentam resposta de citoquina específica de LecA.
[0024] As Figuras 4A a B apresentam resposta de IgA de mucosa pré-desafio e potencial inibidor de aderência. Os camundongos foram imunizados com LecA com adjuvante de Lipossoma GLA 3M-052 com o uso de um regime intranasal (semanas 0 e 4) e subcutâneo (semana 2). Os camundongos nos grupos indicados receberam uma injeção intraperitoneal semanal de 150 mg de ácido all-trans retinoico (RA). Amostras de fezes foram coletadas três semanas após a terceira imunização. Para a Figura 4A, os sobrenadantes fecais foram diluídos 120 vezes e a titulação de IgA anti-Lectina pré-desafio foi determinada por ELISA; para a Figura 4B, o potencial de IgA fecal para inibir a aderência de trofozoítos a células de mamífero foi determinado in vitro com o uso do ensaio de inibição de aderência como descrito.
[0025] As Figuras 5A a B representam proteção mediada por vacina com o uso de modelo de rato de amebíase intestinal. O adjuvante de lipossoma GLA 3M-052 rendeu uma proteção moderada em um teste de desafio cecal. Os camundongos imunizados com o uso de um regime heterólogo foram desafiados intracecalmente com E. histolytica quatro semanas após a imunização final. Os camundongos foram eutanasiados uma semana após o desafio e os conteúdos cecais analisados para (Figura 5A) carga de antígeno com o uso de ELISA e (Figura 5B) ameba viva por cultura como uma medida de imunidade estéril. Número de camundongos infectados do total de desafiados são indicados acima de cada coluna. Dados de dois estudos independentes, mas idênticos, foram agrupados.
[0026] A Figura 6 apresenta a resposta de IgG de plasma às formulações indicadas.
[0027] A Figura 7 apresenta a resposta de IgA fecal às formulações indicadas. A Figura apresenta que um aumento no comprimento de PEG melhora a resposta de IgA de mucosa.
[0028] As Figuras 8A e B apresentam os efeitos da rota de entrega sobre a imunização com titulações de IgG2a e IgA mais elevadas que resultam do regime apenas IN (intranasal). Lipossoma + adjuvante produziram uma resposta imune da mucosa e sistêmica Till , IgA anti-LecA de intestino (Figura 8B).
[0029] As Figuras 9A e B apresentam a rota de entrega/efeitos sobre a imunização, regime apenas IN gerou titulações de IFN-y e IL-17 equivalentes ou maiores em comparação com outros regimes. Lipossoma+ adjuvante produziram uma resposta imune de Thl de mucosa e sistêmica robusta, IFN-y (Figura 9A) e IL 17 (Figura 9B).
[0030] As Figuras 10A e B apresentam (a) Diâmetro da partícula e (b) índice de polidispersidade de tamanho de formulações representativas de 3M-052 a 5 °C por 6 meses. As barras de erro representam o desvio padrão de três ensaios de tamanho de partícula separados de um único lote de formulação em cada ponto no tempo. O teor de 3M-052 não foi medido para esses lotes, mas foi estimado em 0,04 mg/ml com base nos lotes subsequentes fabricados usando o mesmo processo.
[0031] As Figuras 11A a H apresentam que camundongos imunizados com 3M-052 mostram sobrevivência melhorada após desafio de H5N1. Os animais foram imunizados uma vez com proteína rHA (AAN/1203/04) em combinação com adjuvantes como indicado. Vinte e um dia após a imunização, os animais foram desafiados com 106 PFU de A/VN/1203/04 (H5N1, Clado 1). Os animais foram monitorados diariamente para sobrevivência (Figura 11A) e perda de peso (Figuras 11B, 11C). 3 dias (Figura 11D) e 7 dias (Figura 11E) após o desafio, os camundongos foram eutanizados, e titulações de vírus de pulmão determinadas por ensaio de placa. Além disso, os pulmões intactos foram pesados no dia 7 após o desafio como uma medida de consolidação (11F), e foram classificados para o aparecimento de patologia macroscópica (Figura 11G). A significância foi determinada pelo teste MantelCox Log-Rank (A) ou por ANOVA Unidirecional (Figuras 11D a 11G) (**p<0,005, ***p<0,0005, ****p<0,0001). A Figura 11H mostra a titulação de vírus de pulmão.
[0032] As Figuras 12A a D apresentam respostas de célula T de CD4 em camundongos imunizados com Adjuvantes 3M-052 formulados. Os animais foram imunizados uma vez com proteína rHA (A/VN/1203/04) em combinação com adjuvantes como indicado. Sete dias após a imunização, os esplenócitos de camundongos eutanizados (n = 5/grupo) foram analisados quanto à estimulação de citoquinas após estimulação com rHA. Padrões de secreção de citoquinas para IFNy (I), TNFa (T) e IL-2 (2) foram determinados para investigar a indução de uma resposta de células T CD4+. Também foi determinada a porcentagem relativa de células t polifuncionais. A significância entre os grupos foi determinada por ANOVA unidirecional (* p <0,05, ** p <0,005).
[0033] As Figuras 13A a H apresentam proteção de furões contra desafio homólogo de H5N1 após uma única imunização. Furões Fitch machos foram imunizados uma vez com uma vacina H5N1 dividida (H5N1, Sanofi Pasteur) em combinação com adjuvantes 3M-052 formulados e desafiados 21 dias após imunização com 106 PFU de A/VN/1203. Os animais foram monitorados por até 14 dias para sobrevivência (Figuras A, E), perda de peso (Figuras B, F) e escores clínicos (Figuras C, G). Além disso, lavagens nasais foram coletadas para avaliar a titulação de vírus (Figuras D,H). Ambas as formulações de adjuvante lipossômico 3M-052-SE e 3M-052 mostram proteção de dose única potente nesse modelo, caracterizada por depuração viral mais rápida de lavagens nasais, perda de peso e escores clínicos reduzidos e 100% de sobrevivência.
[0034] As Figuras 14A a F apresentam a indução da titulação de neutralização do vírus por adjuvantes 3M-052 formulados. Furões machos Fitch foram imunizados uma vez com uma vacina H5N1 dividida (SP- H5, Sanofi Pasteur) em combinação com adjuvantes 3M-052 formulados. Vinte e um dias após a imunização, recolheu-se sangue de todos os animais e testou- se quanto a anticorpos neutralizadores de vírus com o uso de um ensaio de neutralização de pseudotipo de retrovírus. A inclusão de 3M-052 em formulações adjuvantes resultou em aumentos significativos (ANOVA de uma via) na titulação de neutralização contra ambos os vírus do clado 1 homólogo (Figuras A, D) bem como da cepa de vírus do clado 2 (Figuras B, E) e uma cepa do clado 2.2 (Figuras C, F) As Figuras 15A e apresentam a proteção de ferrões contra desafio de H5N1 heterólogo após uma única imunização. Furões Fitch machos foram imunizados uma vez com uma vacina H5N1 dividida (H5N1, Sanofi Pasteur) em combinação com adjuvantes 3M-052 formulados e desafiados 21 dias após imunização com 106 PFU de A/Whooper Sw7an/Mongolia/244/05. As lavagens nasais foram coletadas para avaliar a titulação de vírus. Os adjuvantes 3M-052-SE induziram uma depuração mais rápida do vírus, com titulações indetectáveis no dia 5, as formulações de adjuvante lipossômico 3M-052 mostraram a titulação até ao dia 3, com depuração no dia 5.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0035] O presente pedido se refere, entre outros, a formulações de lipossoma PEGuilado, composições que compreendem os lipossomas PEGuilados, e métodos de fabricação e uso dos lipossomas PEGuilados. Os inventores, ao formularem um agonista de receptor do tipo tolllike (TLR) insolúvel, desenvolveram uma formulação de lipossoma que é surpreendentemente versátil na incorporação de vários ligantes de TLR e/ou antígenos, mantendo a estabilidade e que é eficaz no aumento da resposta imunológica quando misturada com antígeno. Os inventores constataram que uma variedade de antígenos diferentes quando misturados com esses lipossomas resultaram em formulações antígeno-lipossoma com a capacidade de administração a um mamífero. As formulações de lipossoma compreendem um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos, de preferência de cerca de 750 a cerca de 5.000 Daltons, ou de 750 a cerca de 2.000 Daltons. O uso dos lipídeos PEGuilados fornece estabilidade e permite a entrega e geração/estimulação/modificação de uma resposta imune. Em algumas modalidades preferenciais, o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC e o lipídeo PEGuilado é DSPE ou DPPE PEGuilado. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, os lipossomas compreendem adicionalmente um agonista de receptor do tipo toll (TLR) e, opcionalmente, um antígeno.
[0036] Também são fornecidas composições (como composições de vacina, composições farmacêuticas) que compreendem os lipossomas PEGuilados descritos no presente documento. As composições são úteis para gerar/estimular/modificar uma resposta imune em um indivíduo. Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento compreende adicionalmente um ou mais antígenos e/ou agonistas de TLR.
[0037] Os inventores também constataram, quando formulavam emulsões óleo-em-água à base de esqualeno do receptor insolúvel do tipo toll 3M-052, as emulsões fabricadas com fosfatidilcolina de ovo ou POPC em vez de DMPC resultaram em recuperação mais elevada do receptor do tipo toll após processamento. Além disso, a adição de uma etapa de mistura inicial de combinação do receptor do tipo toll com fosfatidilcolina de ovo ou POPC em clorofórmio aumentou ainda mais a recuperação do receptor do tipo toll. O presente pedido também se refere, entre outros, a emulsões óleo-em-água à base de esqualeno que compreendem esqualeno, fosfatidilcolina insaturada e um receptor do tipo toll (por exemplo, um receptor do tipo toll insolúvel) e métodos de fabricação de tais emulsões por meio da mistura do receptor do tipo toll com fosfatidilcolina insaturada em clorofórmio.
I. DEFINIÇÕES
[0038] Os seguintes termos têm os seguintes significados, salvo indicação em contrário. Quaisquer termos indefinidos têm seus significados reconhecidos na técnica.
[0039] Na presente descrição, os termos "cerca de" e "que consiste essencialmente em" significam ± 20% da faixa, valor ou estrutura indicados, salvo indicação em contrário.
[0040] O uso da alternativa (por exemplo, "ou") deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas.
[0041] Como usado no presente documento, os termos "incluir", "ter" e "compreender" são usados como sinônimos, cujos termos e variantes se destinam a ser interpretados como não limitativos.
[0042] Como usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um,” “uma,” e “o/a” incluem referências no plural, exceto se o contexto indicar em contrário.
[0043] O termo "macromolécula", como usado no presente documento, se refere a moléculas grandes exemplificadas, sem limitação, por peptídeos, proteínas, oligonucleotídeos e polinucleotídeos de origem biológica ou sintética.
[0044] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados intercambiavelmente no presente documento para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de marcação. Também incluídos na definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica,
[0045] O termo "isolado" significa que a molécula foi removida do seu ambiente natural.
[0046] “Purificado” significa que a molécula foi aumentada em pureza, de modo que exista em uma forma que é mais pura do que existe em seu ambiente natural e/ou quando inicialmente sintetizada e/ou amplificada sob condições de laboratório. Pureza é um termo relativo e não significa necessariamente pureza absoluta.
[0047] Um “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico,” como usado aqui de forma intercambiável, se refere a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por polimerase de DNA ou RNA, ou por uma reação de síntese. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou depois da montagem do polímero,
[0048] "Oligonucleotídeo", como usado no presente documento, se refere geralmente a polinucleotídeos curtos, geralmente de cadeia simples, geralmente sintéticos, que são geralmente, mas não necessariamente, inferiores a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleótidos é igual e totalmente aplicável a oligonucleotídeos.
[0049] Um "indivíduo" ou um "sujeito" é qualquer mamífero. Mamíferos incluem, sem limitação, seres humanos, primatas, animais de fazenda, animais de esporte, animais de estimação (como gatos, cães, cavalos) e roedores,
[0050] "Alquila" é um hidrocarboneto saturado linear ou ramificado. Por exemplo, um grupo alquila pode ter 1 a 30 átomos de carbono (isto é, (C1-C30)alquila) ou 1 a 20 átomos de carbono (isto é, (C1-C20 alquila) ou 1 a 10 átomos de carbono (isto é, (C1-C10)alquila) ou 1 a 8 átomos de carbono (isto é, (C1-C8)alquila) ou 1 a 6 átomos de carbono (isto é, (C1-C6 alquila) ou 1 a 4 átomos de carbono (isto é, (C1-C4)alquila). Por exemplo, um grupo alquila pode ter 1 a 30 átomos de carbono (isto é, (CH3-), etila (CH3CH2-). n-propila (CH3CH2CH2-), isopropila ((CH3)2CH-), n-butila (CH3CH2CH2CH2-), isobutila ((CH3)2CHCH2-), sec-butila ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butila KOI3)3C-), n-pentila (CH3CH2CH2CH2CH2-), neopentila ((CH3)3CCH2-) e n-hexila (CH3((CH2)5).
[0051] "Halo" ou "halogênio" se refere um flúor, cloro, bromo e iodo.
[0052] "Hidróxi" ou "hidroxila" se refere ao grupo -OH.
[0053] "Alcóxi" se refere ao grupo -O-alquila, em que alquila é como definido no presente documento. Alcóxi inclui, a título de exemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, t-butóxi, sec-butóxi, n-pentóxi e similares.
[0054] "Carboxil éster" ou "carboxiéster" se refere aos grupos -C(O)O-alquila e -C(O)O-alquila substituída, em que alquila e alquila substituída são como definido no presente documento.
[0055] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, DNA recombinante, bioquímica e química , que estão dentro da perícia na técnica. Tais técnicas são completamente aplicadas na literatura. Consulte, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., Sambrook et al, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I e II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984), Mullis et ah, Pat. N° US: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hanies & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984), o tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc,, N.Y.); e em Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
[0056] Como usado no presente documento, "insolúvel em água" se refere a um composto que não se dissolve ou dissolve a um nível insignificante quando o composto é misturado com água, por exemplo, quando misturado com água à temperatura ambiente, por exemplo, entre ou entre cerca de 25 °C e 50 °C.
II. LIPOSSOMAS PEGUILADOS
[0057] A presente revelação fornece lipossomas PEGuilados que compreendem pelo menos um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o peso molecular médio do componente PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos. Os lipossomas PEGuilados aqui fornecidos podem ainda compreender um agente, por exemplo, um agente para uso em vacina, terapêuticos ou diagnóstico. Os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento podem compreender adicionalmente um agonista de TLR, por exemplo, para os usos de vacina, terapêutico ou diagnóstico mencionados acima. A descrição de cada componente individual dos lipossomas PEGuilados e características dos lipossomas PEGuilados são descritos abaixo.
A. LIPÍDEOS PEGUILADOS
[0058] Os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento compreendem lipídeos PEGuilados (lipídeos ligados a um polietileno glicol(PEG)), em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos. Reconheceu-se que o uso desses lipídeos ligados ao PEG em combinação com um lipídeo não PEGuilado neutro e um colesterol conferem estabilidade a um lipossoma neutro que não contém lipídeos PEGuilados. O uso de tais lipídeos PEGuilados permite a estabilidade a longo prazo da estrutura do lipossoma PEGuilado e permite a estimulação efetiva de uma resposta imune.
CARACTERÍSTICA DO PEG NO LIPÍDEO PEGUILADO
[0059] Nas modalidades contempladas no presente documento, o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 2.000 Daltons ou menos. Em modalidades particulares, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons. Em modalidades particulares, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 2.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 750 a 1.000; 750 a 1.500; 750 a 2.000; 750 a 2.500; 750 a 3.000; 750 a 3.500; 750 a 4.000; 750 a 4.500; ou 750 a 5.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 4.500 a 5.000; 4.000 a 5.000; 3.500 a 5.000; 3.000 a 5.000; 2.500 a 5.000; 2.000 a 5.000; 1.500 a 5.000; 1.000 a 5.000; ou 750 a 5.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 500 a 1.000; 500 a 750; ou 750 a 1.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 1.500 a 2.500; 1.500 a 2.000; ou 2.000 a 2.500 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG se encontra na faixa de cerca de 4.500 a 5.500; 4.500 a 5.000; ou 2.000 a 5.000 Daltons.
[0060] Em uma modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG750. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG1000. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG1500. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG2000. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG2500. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG3000. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEG3500. Em uma outra modalidade exemplificadora , o lipídeo PEGuilado compreende PEG4000. Em uma outra modalidade exemplificadora, lipídeo PEGuilado compreende PEG4500. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipídeo PEGuilado compreende PEGS000.
CARACTERÍSTICAS DO LIPÍDEO NO LIPÍDEO PEGUILADO
[0061] Contempla-se no presente documento que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado pode compreender qualquer lipídeo (que inclui fosfolipídeos) que possa se associar ao colesterol e aos componentes lipídicos neutros não PEGuilados para formar uma estrutura de lipossoma estável.
[0062] A Tabela 1 fornece uma lista não limitativa de lípideos exemplificadores que podem ser ligados ao PEG para uso na invenção.TABELA 1: LIPÍDEOS EXEMPLIFICADORES
[0063] Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é um fosfolipídeo ou um lipídeo de sal de amônio quaternário. Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é um fosfolipídeo que é uma fosfatidilcolina ou um fosfoglicerídeo. Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende qualquer uma das partes a seguir:
[0064] em que X- é um contra-íon de metal alcalino eY+ é um contra-íon de haleto.
[0065] Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende uma cadeia de C10-20 alquila. Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende uma cadeia de C12-18 alquila. Em algumas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende uma cadeia de C14 alquila, uma cadeia de C16 alquila ou uma cadeia de C18 alquila.
[0066] Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é aniônico. Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é catiônico. Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é globalmente carregado de forma neutra. Em certas modalidades, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é um zwitteríon.
[0067] Em certas modalidades exemplificadoras, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DSPE, DPPE ou DMPE. Em uma modalidade exemplificadora, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DSPE. Em uma outra modalidade exemplificadora, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DPPE. Em uma outra modalidade exemplificadora, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DMPE,
[0068] Em qualquer uma das modalidades descritas no presente documento, o componente lipídico do lipídeo PEGuilado pode ser DUPE.
[0069] Em certas modalidades, o percentual molar (% molar) do lipídeo PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 25% molar. Em certas modalidades, o percentual molar (% molar) do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 1% molar, 2% molar, 3% molar, 4% molar, 5% molar, 6% molar, 7% molar, 8% molar, 9% molar, 10% molar, 11% molar, 12% molar, 13% molar, 14% molar, 15% molar, 16% molar, 17% molar, 18% molar, 19% molar, 20% molar, 21% molar, 22% molar, 23% molar, 24% molar ou mesmo cerca de 25% molar. Em uma modalidade exemplificadora, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 5% molar. Em uma outra modalidade exemplificadora, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 10% molar. Em uma outra modalidade exemplificadora, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 15% molar. Em uma outra modalidade exemplificadora, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 20% molar. Em uma outra modalidade exemplificadora, o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 25% molar.
LIPÍDEOS PEGUILADOS EXEMPLIFICADORES
[0070] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DSPE- PEG750, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG1500, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2500, DSPE- PEG3000, DSPE-PEG3500, DSPE- PEG4000, DSPE-PEG4500 ou DSPE-PEG5000.
[0071] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DPPE- PEG750, DPPE -PEG1000, DPPE -PEG1500, DPPE -PEG2OO0, DPPE-PEG2500, DPPE- PEG3000, DPPE-PEG3500, DPPE- PEG4000, DPPE-PEG4500 ou DPPE-PEG5000,
[0072] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DMPE- PEG750, DMPE -PEG 1000, DMPE - PEGI500, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG2500, DMPE- PEG3000, DMPE- PEG35QQ, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG4500 ou DMPE-PEG5000.
[0073] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DPPC- PEG750, DPPC-PEG1000, DPPC-PEG1500, DPPC-PEG2000, DPPC-PEG2500, DPPC- PEG3000, DPPC -PEG3500, DPPC- PEG4000, DPPC-PEG4500 ou DPPC-PEG5000.
[0074] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DOPC- PEG750, DOPC-PEG1000, DOPC-PEG1500, DOPC-PEG2000, DOPC-PEG2500, DOPC- PEG3000, DOPC -PEG3500, DOPC-PEG4000, DOPC-PEG4500 ou DOPC-PEG5000,
[0075] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DLPC- PEG750, DLPC-PEG1000, DLPC-PEG1500, DLPC-PEG2000, DLPC-PEG2500, DLPC- PEG3000, DLPC -PEG3500, DLPC- PEG4000, DLPC-PEG4500 ou DLPC-PEG5000.
[0076] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DMPC- PEG750, DMPC-PEG1000, DMPC- PEG1500, DMPC-PEG2000, DMPC-PEG2500, DMPC- PEG3000, DMPC - PEG3500, DMPC-PEG4000, DMPC-PEG4500 ou DMPC-PEG5000.
[0077] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é POPC- PEG750, POPC-PEG1000, POPC-PEG1500, POPC-PEG2000, POPC-PEG2500, POPC- PEG3000, POPC -PEG3500, POPC-PEG4000, POPC-PEG4500 ou POPC-PEG5000.
[0078] Em certas modalidades, o lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado é DSPC PEG750, DSPC-PEG1000, DSPC-PEG1500, DSPC-PEG2000, DSPC-PEG2500, DSPC- PEG3000, DSPC -PEG3500, DSPC- PEG4000, DSPC-PEG4500 ou DSPC-PEG5000.
B. LIPÍDEOS NÃO PEGUILADOS
[0079] OS lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento compreendem também lipídeos neutros não PEGuilados (lipídeos neutros não ligados a um polietileno glicol (PEG)). Contempla-se aqui que o componente lipídico neutro não PEGuilado do lipossoma compreende qualquer lípideo neutro (que inclui fosfolipídeos neutros) que transporte uma carga neutra global, ou é zwitteriônico, que pode se associar ao componente lipídico PEGuilado para formar uma estrutura de lipossoma estável.
[0080] Conforme fornecido no presente documento, o lipídeo neutro não PEGuilado é globalmente carregado de forma neutra. Em certas modalidades, o lipídeo neutro não PEGuilado é um zwitteríon. Um componente lipídico não PEGuilado neutro do lipossoma PEGuilado, em algumas variações, pode fazer com que o lipossoma PEGuilado seja globalmente carregado de forma neutra.
[0081] Em certas modalidades, o componente lipídico neutro não PEGuilado do lipossoma PEGuilado compreende uma cadeia de C1020 alquila. Em certas modalidades, o componente lipídico neutro não PEGuilado compreende uma cadeia C12-18 alquila. Em algumas modalidades, o componente lipídico neutro não PEGuilado compreende uma cadeia C14 alquila, uma cadeia a C16 alquila ou uma cadeia C18 alquila.
[0082] Em algumas modalidades, o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE.
[0083] Em certas modalidades, o percentual molar (% molar) do lipídeo neutro não PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 45% molar a cerca de 98% molar. Em certas modalidades, o percentual molar (% molar) do lipídeo neutro não PEGuilado no lipossoma é de cerca de 45% molar, 50% molar, 55% molar, 60% molar, 65% molar, 70% molar, 75% molar, 80% molar, 85% molar, 90% molar, 95l% molar ou mesmo cerca de 98% molar. Em uma modalidade exemplificadora, o percentual molar do lipídeo neutro não PEGuilado no lipossoma é de cerca de 45% molar.
[0084] Em uma modalidade exemplificadora, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado e o lipídeo PEGuilado é 9,8: 0,8. Em uma modalidade exemplificadora, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado e o lipídeo PEGuilado é 18: 3.
[0085] Em uma modalidade exemplificadora, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado DPPC e o lipídeo PEGuilado DPPE-PEG2000 é 9,8: 0,8. Em uma modalidade exemplificadora, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado DPPC e o lipídeo PEGuilado DPPE- PEG750 é 9,8: 0,8. Em uma modalidade exemplificadora, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado DPPC e o lipídeo PEGuilado DPPE- PEG750 é 18: 3.
C. COLESTEROL
[0086] Os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento compreendem um colesterol (que inclui compostos contendo colesterol).
[0087] Em algumas modalidades, o percentual molar de colesterol no lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 50% molar, de cerca de 5% molar a cerca de 50% molar, de cerca de 10% molar a cerca de 50% molar, de cerca de 20% molar a cerca de 50% molar, de cerca de 25% molar a cerca de 50% molar, de cerca de 5% molar a cerca de 10% molar, de cerca de 5% molar a cerca de 20% molar, de cerca de 5% molar a cerca de 25% molar, de cerca de 10% molar a cerca de 20% molar, de cerca de 10% molar a cerca de 25% molar, de cerca de 20% molar a cerca de 30% molar, de cerca de 20% molar a cerca de 40% molar, ou mesmo de cerca de 1% molar a cerca de 10% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 50% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 45% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 40% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 35% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 30% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 25% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 20% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 15% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 10% molar. Em algumas modalidades, o percentual molar do colesterol no lipossoma PEGuilado é de cerca de 5% molar.
[0088] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o colesterol e lipídeo neutro não PEGuilado e o lipídeo PEGuilado é de cerca de 5,7:9,8:0,8. Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o colesterol e lipídeo neutro não PEGuilado e o lipídeo PEGuilado é de cerca de 5,5:18:3.
[0089] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o colesterol e lipídeo neutro não PEGuilado DPPC e o lipídeo PEGuilado DPPE-PEG2000 é de cerca de 5,7:9,8:0,8. Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o colesterol e lipídeo neutro não PEGuilado DPPC e o lipídeo PEGuilado DPPE-PEG750 é de cerca de 5,7:9,8:0,8. Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o colesterol e lipídeo neutro não PEGuilado DPPC e o lipídeo PEGuilado DPPE- PEG750 é de cerca de 5,5:18:3.
D. AGONISTAS DE TLR
[0090] Conforme descrito no presente documento, os lipossomas PEGuilados descritos no presente documento podem compreender um ou mais agonistas de receptor do tipo toll (agonistas de TLR). Receptores do tipo toll (TLR) incluem receptores transmembranares da superfície celular do sistema imune inato que conferem capacidade de reconhecimento de fase inicial a células hospedeiras para uma variedade de estruturas moleculares microbianas conservadas, como podem estar presentes em ou num grande número de patógenos infecciosos. A indução de transdução de sinal mediada por TLR para potencializar o início de respostas imunológicas através do sistema imunológico inato pode ser efetuada por agonistas de TLR, que envolvem TLR de superfície celular. Por exemplo, o lipopolissacarídeo (LPS) pode ser um agonista de TLR através de TLR2 ou TLR4 (Tsan et ah, 2004 J. Leuk. Biol. 76:514, Tsan et ah, 2004 Am. J. Physiol. CellPhsiol. 286:C739; Lin et ah, 2005 Shock 24:206); poli(inosina-citidina) (polihC) pode ser um agonista de TLR a TLR3 (Salem et ah, 2006 Vaccine 24:5119); sequências de CpG (oligodesoxinucleotídeos contendo citosina- guanosina não metilada ou motivos de dinucleotídeo de “CpG”, por exemplo, CpG 7909, Cooper et ah, 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et ah Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et ah Expert Opinion on Biological Therapy 5:673, Vollmer et ah, 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng et ah, 2004.7. Immunol. 173:5148) podem ser agonistas de TLR a TLR9 (Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et ah, 2006,/, Immunol. \T1:2373), peptidoglicanos podem ser agonistas de TLR2 e/ou TLR6 (Soboll et ah, 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et ah, 2005 7 Immunol. 174:1566); 3M003 (hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)-α,α- dimetil-6,7,8,9- tetraidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-l-etanol. Mol. Wt. 318 Da junto à 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, que também é uma fonte de compostos relacionados 3M001 e 3M002; Gorden et ah, 2005 J. Immunol. 174:1259) pode ser um agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) e/ou um agonista de TLR8 (Johansen 2005); flagelina pode ser um agonista de TLR5 (Feuillet et ah, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487), e antígenos de hepatite C podem atuar como agonistas de TLR a TLR7 e/ou TLR9 (Lee et ah, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et ah, 2005 Hepatol. 42:724). Outros agonistas de TLR são conhecidos (por exemplo, Schirmbeck et al, 2003 7 Immunol. 171:5198) e podem ser usados de acordo com algumas daquelas modalidades atualmente descritas.
[0091] Em várias modalidades, o agonista de TLR pode ser um agonista de TLR2, um agonista de TLR3, um agonista de TLR4, u agonista de TLR5, um agonista de TLR6, um agonista de TLR7, um agonista de TLR8, um agonista de TLR7/8, um agonista de TLR9, combinações dos mesmos.
AGONISTAS DE TLR 7/8
[0092] São fornecidos no presente documento os agonistas de TLR7/8 que podem ser usados nas composições aqui descritas. Como usado no presente documento, um “agonista de TLR7/8” se refere a um agonista que afeta suas atividades biológicas através de sua interação com TLR7, TLR8, ou ambos. Tais atividades biológicas incluem, sem limitação, a indução de transdução de sinal mediada por TLR7 e/ou TLR8 para potenciar as respostas imunes através do sistema imune inato. Em algumas modalidades, a TLR é uma imidazoquinolina, um composto contendo imidazoquinolina ou um derivado de imidazoquinolina amina (consulte, por exemplo, Pat. n° US 4.689.338 (Gerster)), mas outras classes de composto também são conhecidas (consulte, por exemplo, Pat. n° US 5.446.153 (Lindstrom et al.); U.S, Pat. US 6.194.425 (Gerster et ah); e Pat. n° US 6.110.929 (Gerster et ah); e Publicação Internacional n° WO2005/079195 (Hays et al.)),
[0093] Em certas modalidades, um agonista de TLR7/8 usado nas composições descritas no presente documento compreende um derivado de imidazoquinolina, como aqueles descritos em Shi et al. (ACSMed. Chem. Lett., 2012, 3(6), páginas 501 a 504), cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[0094] Em algumas modalidades, o TLR7/8 compreende uma imidazoquinolina ou um composto contendo imidazoquinolina. Em algumas modalidades, a imidazoquinolina é imiquimod (chamada de IMQ ou R837), um modificador de resposta imune. Em algumas modalidades, a imidazoquinolina é resiquimod (R848), um fármaco que atua como um modificador de resposta imune (Tomai MA, Miller RL, Lipson KE, Kieper WC, Zarraga IE, Vasilakos IP (outubro de 2007). "Resiquimod and other immune response modifiers as vaccine adjuvants". Expert Review of Vaccines 6 (5): 835 a 847.) Em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é CL075.
[0095] Por exemplo, em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é um composto da seguinte estrutura de Fórmula (I):
[0096] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
[0097] R11 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila, em que a C1-6 alquila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila e C16 alcóxi;
[0098] R12 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e carboxil éster; e
[0099] R13 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila, em que a C1-6 alquila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila e C16 alcóxi.
[0100] Em algumas modalidades de Fórmula (I), R11 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R11 é C1-6 alquila. Em algumas modalidades, R11 é metila, etila, n-propila ou n-butila. Em algumas modalidades, R11 é n-butila. Em algumas modalidades, Rn é C1-6 alquila, que é C1-6alcóxi substituído. Em algumas modalidades, R11 é -CH2-O-CH2-CH3.
[0101] Em algumas modalidades de Fórmula (I), R12 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R12 é carboxil éster. Em algumas modalidades, R52 é -C(O)O-C1-4 alquila. Em algumas modalidades, R12 é - C(O)O-CH3.
[0102] Em algumas modalidades de Fórmula (I), R13 é C1-6 alquila. Em algumas modalidades, R13 é C2-4 alquila. Em algumas modalidades, R13 é -CH2-CH(CH3)2.
[0103] Em algumas modalidades, R13 é C1-6a alquila que é substituída por halo, hidroxila ou C1-6 alcóxi. Em algumas modalidades, R13 é C1-6 alquila, que é substituída por hidroxila. Em algumas modalidades, R13 é C1-6 alquila, que é substituída por hidroxila. Em algumas modalidades, R13 é - CH2-C(CH3)2OH.
[0104] Em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é um composto da seguinte estrutura de Fórmula (II):
[0105] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
[0106] R11 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila, em que a C1-6 alquila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila e C16 alcóxi;
[0107] R12 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e carboxil éster, e
[0108] R13a é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e hidroxila.
[0109] Em algumas modalidades de Fórmula (II), R11 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R11 é C1-6 alquila. Em algumas modalidades, R55 é metila, etila, n-propila ou n-butila. Em algumas modalidades, R11 é n-butila. Em algumas modalidades, R11 é C1-6 alquila, que é C1-6 alcóxi substituído. Em algumas modalidades, R11 é -CH2-O-CH2-CH3.
[0110] Em algumas modalidades de Fórmula (II), R12 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R12 é carboxil éster. Em algumas modalidades, R12 é -C(O)O-C1-4 alquila. Em algumas modalidades, R12é -C(O)O- CH3.
[0111] Em algumas modalidades de Fórmula (II), R13a é hidroxila. Em algumas modalidades, R13a é hidrogênio.
[0112] Em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é um composto da seguinte estrutura de Fórmula (III):
[0113] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
[0114] R11 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila, em que a C1-6 alquila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila e C16 alcóxi;
[0115] R12 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e carboxil éster; e
[0116] R13b é C1-6 alquila opcionalmente substituída por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila, C1-6 alcóxi e acilamino.
[0117] Em algumas modalidades de Fórmula (III), R11 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R11 é C1-6 alquila. Em algumas modalidades, R11 é metila, etila, n-propila ou n-butila. Em algumas modalidades, R11 é n-butila. Em algumas modalidades, R11 é alquila, que é C1-6 alcóxi substituído. Em algumas modalidades, R11 é -CH2-O-CH2-CH3.
[0118] Em algumas modalidades de Fórmula (III), R12 é hidrogênio. Em algumas modalidades, é carboxil éster. Em algumas modalidades, R12 é -C(O)O-C1-4 alquila. Em algumas modalidades, R12é -C(O)O- CH3.
[0119] Em algumas modalidades de Fórmula (III), R13b e C2-4alquila, que é substituída por acilamino. Em algumas modalidades, R13b é --(CH2)4-acilamino. Em algumas modalidades, R13b é -(CH2)4-NH-C(O)-C1-25 alquila. Em algumas modalidades, R13b é -(CH2)4-NH-C(O)-C15-25 alquila. Em algumas modalidades, R13b é -(CH2)4-NH-C(O)-C15-20 alquila. Em algumas modalidades, R13bé -(CH2)4-NH-C(O)-C17 alquila.
[0120] Em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é um composto da seguinte estrutura de Fórmula (IV):
[0121] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
[0122] R10 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila; e
[0123] R.11b é C1-6 alquila opcionalmente substituída por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila, C1-6 alcóxi e acilamino. Em algumas modalidades de Fórmula (IV), R10 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R10 é C1-6 alquila. Em algumas modalidades, R10 é metila, etila, n-propila ou n-butila. Em algumas modalidades, R10 é n-butila.
[0124] Em algumas modalidades de Fórmula (IV), R11b é C2-4 alquila, que é substituída por acilamino. Em algumas modalidades, R11b é -(CH2)4-acilamino. Em algumas modalidades, R11b é -(CH2)4-NH-C(O)-C1- 25 alquila. Em algumas modalidades, R11b é -(CH2)4-NH-C(O)-C15-25 alquila. Em algumas modalidades, R11b é -(CH2)4-NH-C(O)-C15-20 alquila. Em algumas modalidades, R11bé -(CH2)4-NH-C(O)-C17 alquila.
[0125] Em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é um composto de qualquer uma das seguintes estruturas ou sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas:
[0126] Em certas modalidades, o agonista de TLR7/8 é um composto da seguinte estrutura
[0127] Em certas modalidades exemplificadoras, um agonista de TLR7/8 usado nas composições no presente documento compreende uma N-(4-{[4-amino-2-butil-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-1- il]oxi}butil)octadecanamida), 3M-052 conforme descrito na Patente n° US 9.242.980.
AGONISTAS DE TLR4
[0128] São fornecidos no presente documento os agonistas de TLR4 que podem ser usados nas composições aqui descritas. Em certas modalidades, um agonista de TLR4 usado nas composições no presente documento compreende a um adjuvante de glucopiranosil lipídeo (GLA), como aqueles descritos nas Publicações de Patente n° US2007/021017, US2009/045033, US2010/037466 e US 2010/0310602, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
[0129] Por exemplo, em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (V):
[0130] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
[0131] L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são iguais ou diferentes e independentemente -O-, -NH- ou - (CH2)-;
[0132] L7, L8, L9, e L10 são iguais ou diferentes e independentemente ausentes ou -C(=O)-;
[0133] Y1 é um grupo funcional ácido;
[0134] Y2 e Y3 são iguais ou diferentes e independentemente -OH, -SH, ou um grupo funcional ácido;
[0135] Y4 é -OH ou -SH,
[0136] R1, R3, R5 e R6 são iguais ou diferentes e independentemente C8-13 alquila; e R2 e R4 são iguais ou diferentes e independentemente C6-11 alquila.
[0137] Em algumas modalidades da estrutura de GLA sintético, R1, R3, R5 e R6 são C10 alquila; e R2 e R4 são C8 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.
[0138] Por exemplo, em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (VI):
[0139] Em uma modalidade específica, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C12-C20 alquila.
[0140] Em uma outra modalidade específica, o GLA tem a fórmula apresentada acima, em que R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila e R2 e R4 são C13 alquila.
[0141] Em uma outra modalidade específica, o GLA tem a fórmula apresentada acima em que R1, R5 e R6 são C10 alquila; e R2 e R4 são C8 alquila.
[0142] Em uma outra modalidade específica, o GLA tem a fórmula apresentada acima em que R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R’ são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.
[0143] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (VII):
[0144] Em certas modalidades da estrutura de GLA acima, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R2 e R4 são C9 alquila.
[0145] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (VIII):
[0146] Em certas modalidades da estrutura de GLA acima, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila e R2 e R4 são C9 alquila,
[0147] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (IX):
[0148] Em certas modalidades da estrutura de GLA acima, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila e R2 e R4 são C9 alquila.
[0149] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura:
[0150] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura:
[0151] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura:
[0152] Em uma outra modalidade, um derivado de lipídeo A atenuado (ALD) é incorporado às composições descritas no presente documento. ALDs são moléculas do tipo lipídeo A que foram alteradas ou construídas de modo que a molécula exiba menos efeitos adversos ou efeitos adversos diferentes do lipídeo A. Esses efeitos adversos incluem pirogenicidade, reatividade Shwarzman local e toxicidade conforme avaliado no ensaio de dose 50% letal de embrião de galinha (CELD50). ALDs úteis de acordo com a presente revelação incluem lipídeo A de monofosforila (MPL) e lipídeo A de monofosforila 3-desacetilada (3D-MPL). MPL e 3D-MPL são conhecidos e não precisam ser descritos em detalhes no presente documento. Consulte, por exemplo, a Patente n° U.S. 4.436.727 que revela o lipídeo A de monoforforila e sua fabricação. A Patente n° US 4.912.094 e certificado de re-examinação BI Pat. n° US 4.912.094 incorpora lipídeo A de monoforforila 3-desacetilada e um método para sua fabricação. Além disso, consulte, por exemplo, os documentos GB 2220211 e WO 92/116556. O lipídeo A de monofosforila 3-De-O-acilada é conhecido junto ao documento GB 2220211 (Ribi). Quimicamente é uma mistura de lipídeo A de monofosforil 3-De-O-acilada com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é fabricado por Ribi Immunochem Montana, uma certa forma de lipídeo A de monofosforil 3-De- O-acilada é revelada no Pedido Internacional de Patente n° WO 92/116556. As revelações de cada uma dessas patentes em relação a MPL e 3D-MPL são aqui incorporadas a título de referência.
[0153] Nos compostos de agonista de TLR4 acima, a carga geral pode ser determinada de acordo com os grupos funcionais na molécula. Por exemplo, um grupo fosfato pode ser negativamente carregado ou neutro, dependendo do estado de ionização do grupo fosfato.
MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS DE AGONISTA DE TLR
[0154] Em algumas modalidades, o agonista de TLR se associa à bicamada lipídica do lipossoma PEGuilado.
[0155] Em algumas modalidades, o agonista de TLR é envelopado no lipossoma PEGuilado,
[0156] Em algumas modalidades, o agonista de TLR é um que quebraria a estrutura de um lipossoma não PEGuilado.
[0157] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende uma cauda hidrofóbica. Em algumas modalidades, a cauda hidrofóbica do agonista de TLR se associa à bicamada lipídica do lipossoma PEGuilado.
[0158] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende TLR4, SLA, GLA, MPL, 3D-MPL, R848, R837 ou combinações dos mesmos.
[0159] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR4.
[0160] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR.7/8.
[0161] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR7.
[0162] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende um agonista de TLR8.
[0163] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende uma imidazoquinolina.
[0164] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende 3M-052.
[0165] Em algumas modalidades, o agonista de TLR compreende uma combinação de um agonista de TLR4 e um agonista de TLR7/8. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende 3M-052 e GLA.
E. AGENTES
[0166] Os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento podem compreender adicionalmente um ou mais agentes, em que o agente pode ser um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente de diagnóstico, um agente terapêutico, um organismo, um genoma ou um vírus. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende dois ou mais agentes.
[0167] Em algumas modalidades, o agente está associado ao lipossoma PEGuilado. Em algumas modalidades, o agente está associado ao PEGuilado por troca de ligante e/ou por uma interação eletrostática (à base de carga).
[0168] Em certas modalidades, o agente pode ser entre cerca de 0,01 a 1% em peso do lipossoma PEGuilado.
POLIPEPTÍDEOS
[0169] Em algumas modalidades, o agente é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína de comprimento inteiro ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um peptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína de fusão. Em algumas modalidades particulares, a proteína de fusão tem a capacidade de elicitar uma resposta imune mediante a administração a um indivíduo.
[0170] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um antígeno, conforme adicionalmente descrito abaixo.
ANTÍGENO
[0171] Em uma modalidade, o agente compreende um antígeno.
[0172] Em algumas modalidades, o antígeno de polipeptídeo está envolvido em, ou é derivado de, uma alergia, câncer ou infecção infecciosa.
[0173] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento são úteis para propósitos de vacinação, e são fornecidas como formulações de vacina (composições de vacina).
[0174] Um antígeno pode ser qualquer epítopo-alvo, molécula (incluindo uma biomolécula), complexo molecular (incluindo complexos moleculares que contêm biomoléculas), montagem subcelular, célula ou tecido contra os quais é desejada a elicitação ou realce de imunorreatividade em um indivíduo. Frequentemente, o termo antígeno fará referência a um antígeno de polipeptídeo de interesse. Entretanto, antígeno, como usado no presente documento, também pode ser referir a um construto recombinante que codifica um antígeno de polipeptídeo de interesse (por exemplo, um construto de expressão). Em certas modalidades, o antígeno pode ser, ou pode ser derivado de, ou pode ser imunologicamente reativo de forma cruzada com, um patógeno infeccioso e/ou um epítopo, biomolécula, célula ou tecido que está associado à infecção, câncer, doença autoimune, alergia, asma, ou qualquer outra condição em que a estimulação de uma resposta imune específica de antígeno seria desejável ou benéfica.
[0175] Certas modalidades contemplam um antígeno que é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso como uma bactéria, um vírus ou um fungo, incluindo uma Actinobacterium como M. tuberculosis ou M. leprae ou uma outra mycobacterium, uma bactéria como um membro do gênero Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia ou Bordetella, um vírus como um vírus herpes simplex, um vírus da imunodeficiência humana (HIV), um vírus da imunodeficiência felina (FIV), citomegalovírus, Vírus da Varicella Zoster, vírus da hepatite, Vírus Epstein Barr (EBV), vírus sincicial respiratório, papilomavírus humano (HPV) e um citomegalovírus; HIV como HIV-1 ou HIV-2; um fungo como Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides e Pneumocysti ou uma levedura, incluindo espécie de Candida como C. albicans, C. glahrata, C. krnsei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. parapsilosis', um parasita como um protozoário, por exemplo, uma espécie de Plasmodium incluindo P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale', ou um outro parasita como um ou mais de Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii. Schistosoma haematohhim., Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria hancrofti, Giardia, e Leiskmania. Em modalidades específicas, o antígeno pode ser de, ou relacionado a antígenos envolvidos na tuberculose, gripoe, amebíase, HIV, hepatite ou Leishmaniose.
[0176] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno relacionado à amebíase. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno ocasionador de amebíase. Em algumas modalidades, o antígeno é de um organismo causador de amebíase. Em algumas modalidades, o antígeno é de Entamoeba histolytica. Em uma modalidade, o antígeno compreende LecA. Em uma modalidade, o antígeno é LecA.
[0177] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno relacionado à gripe. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno ocasionador de gripe. Em algumas modalidades, o antígeno é de um vírus causador de gripe. Em uma modalidade, o antígeno compreende H5N1. Em uma modalidade, o antígeno compreende H5N1.
[0178] Por exemplo, em certas modalidades, os antígenos são derivados de Borrelia sp., os antígenos podem incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno ou preparações antigênicas, proteína ou peptídeos recombinantemente produzidos, e proteínas de fusão quiméricas. Tal antígeno é OspA. O OspA pode ser um proteína madura completa em uma forma lipidada em virtude de sua biossíntese em uma célula hospedeira (Lipo- OspA) ou pode alternativamente ser um derivado não lipidado. Tais derivados não lipidados incluem a proteína de fusão NS1-OspA não lipidada que tem os primeiros 81 aminoácidos N-terminais da proteína não estrutural (NS1) do vírus da gripe, e a proteína OspA completa, e uma outra, MDP-OspA, é uma forma não lipidada de OspA contendo 3 aminoácidos N-terminais adicionais.
[0179] Em certas modalidades, o antígeno é derivado de um vírus como de HIV-1, (como tat, nef, gp120 ou gp160), vírus da herpes humana, como gD ou derivados do mesmo ou proteína Early Imediata, como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ((esp. Humana)(como gB ou derivados dos mesmos), Rotavírus (incluindo vírus vivos atenuados), vírus Epstein Barr (como gp350 ou derivados dos mesmos), vírus Varicela Zoster (como gpl, II e IE63), ou de um vírus da hepatite como o vírus da hepatite B (por exemplo, antígeno superficial da Hepatite B ou um derivado do mesmo), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E, ou de outros agentes patogênicos virais, como os paramixovírus: Vírus Sincicial Respiratório (como proteínas F e G ou derivados das mesmas), vírus parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, papilomavírus humano (por exemplo, HPV6, 11, 16, 18, etc.), flavivírus (por exemplo, Vírus da Febre Amarela, Vírus da Dengue, encefalite transmitida por carrapatos, vírus da encefalite japonesa) ou vírus da gripe (vírus inteiros vivas ou inativados, vírus da gripe dividido, cultivado em óvulos ou células MDCK, ou virossomas de gripe inteiro (conforme descrito por Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 a 920) ou proteínas purificadas ou recombinantes das mesmas, como proteínas HA, NP, NA ou M, ou combinações das mesmas).
[0180] Em certas outras modalidades, o antígeno é derivado de um ou mais patógenos bacterianos como Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. meningitidis (por exemplo, polissacarídeos capsulares e conjugados dos mesmos, proteína de ligação à transferrina, proteína de ligação à lactoferrina, PilC, adesinas); S, pyogenes (por exemplo, proteínas M ou fragmentos das mesmas, protease C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi', Moraxella spp, incluindo M. catarrhalis, também conhecido como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de peso molecular alto e baixo); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo, pertactina, toxina da coqueluxe ou derivados da mesma, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fimbriae), B. parapertussis e B. hronchiseptica', Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis (por exemplo, ESAT6, Antígeno 85 A, -B ou -C), M. bovis,M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis'. Legionella spp, incluindo L. pneumophila', Escherichia spp, incluindo enterotóxico, E. coli (por exemplo, fatores de colonização, toxina termolábil ou derivados da mesma, toxina termoestável ou derivados da mesmas), entero- hemorrágico E. coli, enteropatogênico E. coli (por exemplo, toxina do tipo toxina shiga ou derivados da mesma); Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo, toxina da cólera ou derivados da mesma); Shigella spp, incluindo V. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii', Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo, uma proteína Yop), F. pestis, F pseudotuberculosis', Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo, toxinas, adesinas e invasinas) e C. coir, Salmonella spp, incluindo A typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S.enteritidis', Listeria spp., incluindo L. monocytogenes, Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo, urease, catalase, toxina vacuolizante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa;, Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp., incluindo E. faecaiis, E.faecium, Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo, toxina do tétano e derivados da mesma), C. botulinum (por exemplo, toxina botulínica e derivados da mesma), C. difficile (por exemplo, toxinas A ou B de Clostrídio e derivados da mesma); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulínica e derivados da mesma); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina da difteria e derivados da mesma); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsir, Ehrlichia spp., incluindo A. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica Humana; Rickettsia spp, incluindo R. rickettsir, Chlamydia spp. incluindo C. trachomatis (por exemplo, MOMP, proteína de ligação à heparina), C. pneumoniae (por exemplo, MOMP, proteína de ligação à heparina), C. psittacr, Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as raras proteínas de membrana externa), T. denticola, T hyodysenteriae;, ou outros patógenos bacterianos.
[0181] Em certas outras modalidades, o antígeno é derivado de um ou mais parasitas (consulte, por exemplo, John, D.T. e Petri, W.A., Marked and Voge’s Medical Parasitology-9f Ed, 2006, WB Saunders, Filadélfia, EUA; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8a Ed., 2002, WB Saunders, Filadélfia, EUA) como Plasmodium spp., incluindo, P.falciparum;, Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo, SAG2, SAGS, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp., incluindo T. cruzi, Guardia spp., incluindo G. lambda, Leshmania spp., incluindo L.major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinir, Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis; ou de um helminto capaz de infectar um mamífero, como: (i) infecções de nematódeo (incluindo, sem limitação, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis, andStrongyioides stercoralisj, (ii) infecções de trematódeo (incluindo, sem limitação, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum., Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fascio hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica; e (iii) infecções de cestódeo (incluindo, sem limitação, Taenia saginata e Taenia solium). Em certas modalidades, o antígeno é derivado de Schisostoma spp., Schistosoma mansomi, Schistosoma haematobium e/ou Schistosoma japonicum, ou derivado de levedura como Candida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.
[0182] Outros antígenos específicos são derivados de M. tuberculosis, por exemplo, Th RaI2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCCl (documento WO 99/51748). As proteínas para M. tuberculosis incluem também proteínas de fusão e variantes das mesmas, em que pelo menos dois, três ou quatro ou mais polipeptídeos de M. tuberculosis são fundidos formando uma proteína maior. Certas fusões incluem Ral2-TbH9- Ra35, Erd 14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd 14DPV-MTI-MSI,-mICC2. Erdl.4- DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, Tbl19-DPV-MTI (documento WO 99151748). Outros antígenos que podem ser usados incluem antígenos, combinação de antígenos e proteínas de fusão descritos nos documentos US 2010/0129391 e WO 2008/124647. Em uma modalidade exemplificadora, a proteína de fusão é 1D93. Em uma modalidade exemplificadora, a proteína de fusão é 1D91,
[0183] Outros antígenos específicos são derivados de Chlamydia, e incluem, por exemplo, a Proteína com Alto Peso Molecular (HWMP) (documento WO 99/17741), ORF3 (documento EP 366 412) e proteínas membrânicas putativas (Pmps). Outros antígenos de Chlamydia podem ser selecionadas do grupo descrito no documento WO 99128475. Certos antígenos podem ser derivados de Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae (por exemplo, polissacarídeos capsulares e conjugados dos mesmos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteína de ligação à colina) e o antígeno de proteína Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et a!., Microbial Pathogenesis, 25, 337 a 342), e derivados desintoxicados mutantes dos mesmos (documentos WO 90/06951; WO 99/03884). Outras vacinas bacterianas compreendem antígenos derivados de Haemophilus spp., incluindo o tipo H. influenzae B (por exemplo, PRP e conjugados das mesmas), II não tipificável, influenzae, por exemplo, OMP26, adeninas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D e lipoproteína D, e fimbrina e peptídeos derivados de fimbrina (Pat. n° US 5.843.464) ou múltiplas variantes de múltiplas cópias ou proteínas de fusão das mesmas.
[0184] Outros antígenos específicos são derivados de Hepatite B. Derivados de antígeno superficial de Hepatite B são bem conhecidos na técnica e incluem, entre outros, aqueles antígenos PreS1, Pars2 S apresentados nos pedidos de patente n° EP-A414 374; EP-A-0304 578 e EP 198474. Em um aspecto, o antígeno é gp120 de HIV-1, especialmente quando expresso em células de CHO. Em uma modalidade adicional, o antígeno é gD2t.
[0185] Em outras modalidades, o antígeno é derivado do Papilomavírus Humano (HPV) considerado responsável por verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros), e os vírus HPV responsáveis por câncer cervical (HPV16, HPV18 e outros). Antígenos particulares incluem partículas L1 ou capsômeros e proteínas de fusão que compreendem um ou mais antígenos selecionados das proteínas E6, E7, L1 e L2 de HPV 6 e HPV 11. Certas formas de proteína de fusão incluem L2E7 conforme revelado no documento WO 96/26277, e proteína D(1/3)-E7 revelada 10no documento GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285). Possíveis antígenos adicionais incluem antígenos de 16 ou 18 HPV. Por exemplo, monômeros de antígeno L1 ou L2, antígenos de L1 ou L2 apresentados juntos como uma partícula do tipo viral (VLP) ou a proteína sozinha de L1 apresentada sozinha em uma VLP ou estrutura capsômero. Tais antígenos, partículas do tipo virais e capsômeros são per se conhecidas. Consulte, por exemplo, os documentos WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 e WO93/02184.
[0186] Em outras modalidades, o antígeno é uma proteína de fusão. As proteínas de fusão podem ser incluídas sozinhas ou como proteínas de fusão como E7, E2 ou F5, por exemplo; modalidades particulares incluem uma VLP que compreende proteínas de fusão L1E7 (documento WO 96/11272). Antígenos particulares de HPV 16 compreendem as proteínas precoces E6 ou F7 em fusão com um carreador de proteína D para formar fusões de proteína D-E6 ou E7 de HPV 16, ou combinações das mesmas; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (documento WO 96/26277). Alternativamente, as proteínas precoces E6 e E7 de HPV 16 ou 18 podem ser apresentadas em uma única molécula, por exemplo, uma fusão de Proteína D-E6/E7. As composições podem opcionalmente conter uma ou ambas as proteínas E6 e E7 frente ao HPV 18, por exemplo, sob a forma de uma proteína de fusão Proteína D-E6 ou Proteína D-E7 ou proteína de fusão Proteína D E6/E7. As composições podem compreender adicionalmente antígenos de outras cepas de HPV, por exemplo, das cepas HPV 31 ou 33.
[0187] Os antígenos também podem ser derivados de parasitas que causam a Malária. Por exemplo, antígenos de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. RTS é uma proteína híbrida que compreende substancialmente toda a porção C-terminal da proteína circunsporozoíta (CS) de P. falciparum ligada através de quatro aminoácidos da porção preS2 do antígeno de superfície da Hepatite B ao antígeno de superfície (S) do vírus da hepatite B. Sua estrutura completa é revelada no Pedido de Patente Internacional n° PCT/EP92/02591, publicado como WO 93/10152 reivindicando prioridade do pedido de patente n° UK 9124390.7. Quando expresso em levedura, o RTS é produzido como uma partícula lipoproteica e, quando é coexpresso com o antígeno S do VHB, produz uma partícula misturada conhecida como RTS,S.
[0188] Os antígenos TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional n° PCT/GB89/00895 publicado como WO 90/01496. Uma modalidade da presente invenção é uma vacina contra a Malária em que a preparação antigênica compreende uma combinação dos antígenos RTS,S e TRAP. Outros antígenos de plasmodia que provavelmente são candidatos a componentes de uma vacina contra múltiplos estágios da Malária são MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PffiMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PffiXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparun e seus análogos em Plasmodium spp.
[0189] Em uma modalidade, o antígeno é derivado de uma célula de câncer, como pode ser útil para o tratamento imunoterápico de cânceres. Por exemplo, o antígeno pode ser um antígeno de rejeição de tumor como aqueles de câncer de próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Antígenos derivados de célula de câncer ou câncer exemplificadores incluem MAGE 1, 3 e MAGE 4 ou outros antígenos de MAGE como aqueles revelados no documento WO99/40188, FRAME, BAGE, Lage (também conhecido como NY Eos 1) SAGE e HAGE (WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, páginas 628 a 636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical &. Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, página 293. Esses exemplos não limitativos de antígenos do câncer são expressos em uma ampla gama de tipos de tumores, como melanoma, carcinoma do pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga. Consulte, por exemplo, Patente n° US 6.544.518.
[0190] Outros antígenos específicos de tumor incluem, mas não se restringem, gangliosídeos específicos de tumor ou associados a tumor como GM2, e GM3 ou conjugados dos mesmos a proteínas carreadoras; ou hormônio de auto-peptídeo como hormônio de liberação de hormônio Gonadotrofina (GnRH, documento WO 95/20600), um peptídeo com comprimento de 10 aminoácidos, útil no tratamento de muitos cânceres. Em uma outra modalidade, são usados antígenos de próstata, como antígeno específico de Próstata (PSA), PAP, PSCA (por exemplo, Proc. Nat. Acad. Set. USA 95(4) 1.735 a 1.740 1998), PSMA ou, em uma modalidade, um antígeno conhecido como Prostase. (por exemplo, Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3.114 a 3.119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3.114 a 3.119, documento WO 98/12302; Patente, n° US 5.955.306; WO 98/20117; Patentes n° US 5.840.871 e 5.786.148; WO 00/04149. Outros antígenos específicos de próstata são conhecidos junto ao documento WO 98/137418 e WO/004149. Um outro é STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).
[0191] Outros antígenos associados a tumor úteis no contexto da presente invenção incluem: Plu -1 (JBiol. Chem 274 (22) 15.633 a 15.645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21:61 a 70, Pat. n° US 5.654.140) e Criptin (Pat. n° 5.981.215). Adicionalmente, antígenos particularmente relevantes para vacinas na terapia de câncer também compreendem tirosinase e survivina.
[0192] Em outras modalidades, os agentes usados nas composições da invenção incluem antígenos associados a doenças respiratórias, como aquelas causadas ou exacerbadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumococo), para a profilaxia e terapia de condições como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A DPOC é definida fisiologicamente pela presença de obstrução irreversível ou parcialmente reversível das vias aéreas em pacientes com bronquite crônica e/ou enfisema (Am J Respir Crit Care Med. Nov de 1995; 152(5 Pt 2):S77-121). As exacerbações da DPOC são frequentemente causadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumococos) (Clin Microbiol Rev. 2001 abril;14(2):336 a 63).
POLINUCLEOTÍDEOS
[0193] Em algumas modalidades o agente é um polinucleotídeo. Um polinucleotídeo inclui, sem limitação, DNA, um RNA, um aptâmero e um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é DNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é RNA. Em algumas modalidades, o DNA ou RNA é de filamento único ou de filamento duplo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA não codificante. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA codificante. Em algumas modalidades, o RNA é selecionado do grupo que consiste em RNA de réplicon, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA, e microRNA.
[0194] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que é um antígeno ou compreende um antígeno. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é LecA. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é H5N1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é ID93.
[0195] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um réplicon. Em algumas modalidades, o réplicon é um plasmídeo, cosmídeo, bacrnídeo, fago ou vírus, que tem a capacidade de replicação em grande parte sob seu próprio controle. Em algumas modalidades, o réplicon é RNA ou DNA. Em algumas modalidades, o réplicon é de filamento único ou duplo. Em algumas modalidades, o réplicon é derivado de um vírus de RNA.
ADJUVANTES
[0196] Em algumas modalidades, os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento compreendem adicionalmente um adjuvante ou podem ser coadministrados com um coadjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado do grupo que consiste em um ácido retinoico (RA), AS-2, lipídeo A de monoforforila, lipídeo A de monoforforila 3-de- O-acilado, IRA, QS21, CWS, TOM, AGPs, oligonucleotídeo contendo CpG, agonistas do receptor do tipo Toll (TLR), Leif, saponinas, miméticos de saponina, lipídeo A biológico e sintético, imiquiraod, gardiquimod, resiquimod, poliLC, flagelina, GLA, SLA, Estingina e combinações dos mesmos.
ORGANISMOS
[0197] Em algumas modalidades, os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento compreendem um organismo. Por exemplo, o Entamoeba histolytica, um vírus causador da gripe, ou a bactéria Mycobacterium tuberculosis que causa tuberculose (TB). Atualmente, a vacinação com bactérias vivas é o método mais eficiente para induzir imunidade protetora contra a tuberculose. A micobactéria mais comum empregada para essa finalidade é o Bacillus Calmette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Dessa forma, em algumas modalidades, a composição compreende um lipossoma PEGuilado e uma micobactéria.
[0198] Em algumas modalidades, o agente é um vírus ou um genoma viral. Dessa forma, nessa modalidades, os lipossomas PEGuilados compreendem um vírus ou genoma viral.
F. LIPOSSOMAS PEGUILADOS EXEMPLIFICADORES
[0199] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado:colesterol:lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado da invenção é de cerca de 9,8:5,7:0,8.
[0200] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado:colesterol:lipídeo PEGuilado no lipossoma PEGuilado da invenção é de cerca de 18:5,5:3.
[0201] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado DPPC:colesterol:lipídeo PEGuilado DPPE- PEG750 no lipossoma PEGuilado da invenção é de cerca de 9,8:5,7:0,8.
[0202] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado DPPC:colesterol:lipídeo PEGuilado DPPE- PEG2000 no lipossoma PEGuilado da invenção é de cerca de 9,8:5,7:0,8.
[0203] Em certas modalidades, a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado DPPC:colesterol: lipídeo PEGuilado DPPE- PEG750 no lipossoma PEGuilado da invenção é de cerca de 18:5,5:3.
[0204] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0205] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0206] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno de LecA, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0207] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno de LecA, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0208] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno H5N1, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0209] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno H5N1, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0210] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno ID93, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0211] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno ID93, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0212] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno ID9I, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0213] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno ID91, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0214] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende 3M-052, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0215] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende 3M-052, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0216] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um 3M-052 e GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0217] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um 3M-052 e GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0218] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno de LecA, 3M-052 e GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0219] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno de LecA, 3M-052 e GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0220] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno H5N1, 3M-052 e GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0221] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno H5NI, 3M-052 e GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0222] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno relacionado à tuberculose, um antígeno relacionado ao HIV, um antígeno relacionado ao câncer, um antígeno relacionado à amebíase, um antígeno relacionado à gripe, ou um antígeno relacionado à hepatite, um agonista de TLR, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2000.
[0223] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno relacionado à tuberculose, um antígeno relacionado ao HIV, um antígeno relacionado ao câncer, um antígeno relacionado à amebíase, um antígeno relacionado à gripe, ou um antígeno relacionado à hepatite, um agonista de TLR, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0224] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno relacionado à tuberculose, um antígeno relacionado ao HIV, um antígeno relacionado ao câncer, um antígeno relacionado à amebíase, um antígeno relacionado à gripe ou um antígeno relacionado à hepatite, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG2QQ0.
[0225] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno relacionado à tuberculose, um antígeno relacionado ao HIV, um antígeno relacionado ao câncer, um antígeno relacionado à amebíase, um antígeno relacionado à gripe ou um antígeno relacionado à hepatite, GLA, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
[0226] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno relacionado à tuberculose, um antígeno relacionado ao HIV, um antígeno relacionado ao câncer, um antígeno relacionado à amebíase, um antígeno relacionado à gripe ou um antígeno relacionado à hepatite, 3M-052, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG200Q.
[0227] Em certas modalidades, o lipossoma PEGuilado compreende um antígeno relacionado à tuberculose, um antígeno relacionado ao HIV, um antígeno relacionado ao câncer, um antígeno relacionado à amebíase, um antígeno relacionado à gripe ou um antígeno relacionado à hepatite, 3M-052, um colesterol, um lipídeo neutro não PEGuilado e um lipídeo PEGuilado, em que o componente de PEG é PEG750.
III. CARACTERÍSTICAS FISIOQUÍMICAS DOS LIPOSSOMAS PEGUILADOS A. TAMANHO
[0228] Conforme fornecido no presente documento, o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 1 nm a 450 nm, e pode ser considerado um nanolipossoma PEGuilado. Tais nanolipossomas são passíveis de fabricação e são esterilizáveis por filtro. Ademais, in vivo, a entrega de tais nanolipossomas que compreendem um agente (por exemplo, um antígeno e/ou um adjuvante) tipicamente não exibe ou reduz a ocorrência de um efeito de depósito. Ademais, a entrega in vivo de tais nanolipossomas que compreendem um agente (por exemplo, um antígeno e/ou um adjuvante) permite a entrega par drenar nódulos linfáticos, e permite a apresentação para células apresentadoras de antígeno e permite a geração de uma respostas imunológicas eficazes à base de Thl.
[0229] Em algumas modalidades, o tamanho do lipossoma PEGuilado pode ser avaliado por técnicas conhecidas na técnica , incluindo, sem limitação, raios X e difração de laser, dispersão dinâmica de luz (DLS), CryoEM, ou Malvern Zetasize. Em algumas modalidades, o tamanho do lipossoma PEGuilado se refere ao diâmetro médio Z.
[0230] Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 50 nm a 75 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 50 nm a 100 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 50 nm a 150 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 50 nm a 200 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 50 nm a 300 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 20 nm a 100 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 20 nm a 50 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 10 nm a 200 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 10 nm a 100 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 10 nm a 50 nm. Em algumas modalidades o tamanho do lipossoma PEGuilado é de cerca de 1 nm, é de cerca de 5 nm, é de cerca de 10 nm, é de cerca de 15 nm, é de cerca de 20 nm, é de cerca de 25 nm, é de cerca de 30 nm, é de cerca de 35 nm, é de cerca de 40 nm, é de cerca de 45 nm, é de cerca de 50 nm, é de cerca de 55 nm, é de cerca de 60 nm, é de cerca de 65 nm, é de cerca de 70 nm, é de cerca de 75 nm, é de cerca de 80 nm, é de cerca de 85 nm, é de cerca de 90 nm, é de cerca de 95 nm, é de cerca de 100 nm, é de cerca de 105 nm, é de cerca de 110 nm, é de cerca de 115 nm, é de cerca de 120 nm, é de cerca de 125 nm, é de cerca de 130 nm, é de cerca de 135 nm, é de cerca de 140 nm, é de cerca de 145 nm, é de cerca de 150 nm, é de cerca de 155 nm, é de cerca de 160 nm, é de cerca de 165 nm, é de cerca de 170 nm, é de cerca de 175 nm, é de cerca de 180 nm, é de cerca de 185 nm, é de cerca de 190 nm, é de cerca de 195 nm ou é de cerca de 200 nm. Em algumas modalidades, o tamanho do lipossoma PEGuilado não é maior que cerca de 1 nm, não maior que cerca de 5 nm, não maior que cerca de 10 nm, não maior que cerca de 15 nm, não maior que cerca de 20 nm, não maior que cerca de 25 nm, não maior que cerca de 30 nm, não maior que cerca de 35 nm, não maior que cerca de 40 nm, não maior que cerca de 45 nm, não maior que cerca de 50 nm, não maior que cerca de 55 nm, não maior que cerca de 60 nm, não maior que cerca de 65 nm, não maior que cerca de 70 nm, não maior que cerca de 75 nm, não maior que cerca de 80 nm, não maior que cerca de 85 nm, não maior que cerca de 90 nm, não maior que cerca de 95 nm, não maior que cerca de 100 nm, não maior que cerca de 105 nm, não maior que cerca de 110 nm, não maior que cerca de 115 nm, não maior que cerca de 120 nm, não maior que cerca de 125 nm, não maior que cerca de 130 nm, não maior que cerca de 135 nm, não maior que cerca de 140 nm, não maior que cerca de 145 nm, não maior que cerca de 150 nm, não maior que cerca de 155 nm, não maior que cerca de 160 nm, não maior que cerca de 165 nm, não maior que cerca de 170 nm, não maior que cerca de 175 nm, não maior que cerca de 180 nm, não maior que cerca de 185 nm, não maior que cerca de 190 nm, não maior que cerca de 195 nm ou não maior que cerca de 199 nm.
[0231] Conforme fornecido no presente documento, em modalidades preferenciais, o lipossoma PEGuilado tem a capacidade de ser filtrado através de um filtro de 0,45 mícron. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado tem a capacidade de ser filtrado através de um filtro menor que 0,45 mícron. Em uma modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado tem a capacidade de ser filtro através de um filtro de 0,20 ou 0,22 mícron.
B. ESTABILIDADE
[0232] Os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento são estáveis, permitindo ouso fácil, a fabricabilidade, a transportabilidade e o armazenamento. Os inventores constataram que a PEGuilação de um lipossoma contribui para a estabilidade do lipossoma. As característica fisioquímicas do lipossoma PEGuilado, incluindo, sem limitação, seu tamanho, são mantidas ao longo do tempo, a várias temperaturas, e sob várias condições.
[0233] Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado exibe agregação reduzida, ou nenhuma agregação, quando comparado ao lipossoma na ausência de um lipídeo PEGuilado. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado ou composição compreendida de lipossomas PEGuilados não agrega, exibe pouca ou nenhuma agregação, exibe agregação reduzida ou não demonstra um aumento geral no tamanho médio ao longo do seu tamanho inicial.
[0234] A estabilidade do lipossoma PEGuilado pode ser medida por técnicas familiares aos versados na técnica. Em algumas modalidades, a estabilidade é observada visualmente. Inspeção visual pode incluir inspeção de partículas, floculação ou agregados. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada pelo tamanho do lipossoma PEGuilado e, opcionalmente, expressa como mudança no tamanho ao longo do tempo, ou a várias temperaturas, ou sob certas condições. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada avaliando a agregação percentual de lipossomas PEGuilados na composição. Em algumas modalidades, a estabilidade é avaliada pela capacidade de o lipossoma PEGuilado atravessar um filtro de um tamanho particular, por exemplo, através de um filtro de 0,20, 0,22 ou 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada pelo pH. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada pela medição do índice de polidispersidade (Pdl), por exemplo, com o uso de técnica de dispersão dinâmica de luz (DLS).
[0235] Em algumas modalidades, o diâmetro médio Z do lipossoma PEGuilado aumenta menos que 50%, menos que 40%, menos que 30%, menos que 25%, menos que 20%o, menos que 15%, menos que 12%, menos que 10%, menos que 7%, menos que 5%, menos que 3%, menos que 1% ao longo do período de tempo analisado.
[0236] Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 0 a 8 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 0 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C ou 8 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 35 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos. Em uma modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 8 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 8 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 ano a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 8 °C.
[0237] Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 8 a 20 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 8 a 20 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 35 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos. Em uma modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 8 °C a cerca de 20 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 8 °C a cerca de 20 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 8 °C a cerca de 20 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 ano a uma temperatura de cerca de 8 °C a cerca de 20 °C.
[0238] Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 20 a 30 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 25 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 35 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos. Em uma modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 25 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25 °C. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 ano a uma temperatura de cerca de 25 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 30 a 40 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 30 °C , 31 °C , 32 °C , 33 °C , 34 °C 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C ou 40 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 35 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos. Em uma modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 37 °C.
[0239] Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 40 a 62 °C. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável a 40 a 62 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 35 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês,
[0240] Em uma modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável a 4 a 8° C por pelo menos um ano. Em uma outra modalidade exemplificadora, o lipossoma PEGuilado é estável a 25 °C por pelo menos um ano.
[0241] Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável após 1 a 5 ciclos de congelamento e descongelamento. Em algumas modalidades, o lipossoma PEGuilado é estável após 1, após 2, após 3, após 4 ou após 5 ciclos de congelamento e descongelamento.
[0242] Em algumas modalidades, o índice de polidispersidade do lipossoma PEGuilado é mantido em cerca de 0,3 ou menos. Em algumas modalidades, o índice de polidispersidade do lipossoma PEGuilado é mantido em cerca de 0,25 ou menos. Em algumas modalidades, o índice de polidispersidade do lipossoma PEGuilado é mantido em cerca de 0,2 ou menos.
IV. MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE LIPOSSOMAS PEGUILADOS
[0243] Conforme fornecido no presente documento, um método de fabricação de um lipossoma PEGuilado compreende (a) misturar o lipídeo neutro não PEGuilado, o lipídeo PEGuilado e o colesterol em um solvente orgânico; (b) evaporar o solvente orgânico, gerando, assim, um filme lipídico; (c) reidratar o filme lipídico em um tampão; e (d) aplicar uma fonte de entrada de alta energia (por exemplo, sonicação, microfluidização, extrusão) ao produto reidratado da etapa (c). Em algumas modalidades, a fonte de alta energia compreende microfluidização. Em algumas modalidades, a fonte de alta energia compreende sonicação. Em algumas modalidades, a fonte de alta energia compreende extrusão. Em algumas modalidades, o solvente orgânico é clorofórmio ou uma mistura de clorofórmio/metanol/água. Em algumas modalidades, a etapa (a) compreende adicionalmente misturar um agonista de TLR com outros componentes.
[0244] Em uma modalidade exemplificadora, DPPC, colesterol, e DPPE-PEG750 são combinados com várias quantidades de 3M-052 em solvente orgânico (clorofórmio ou mistura de clorofórmio/metanol/água). O solvente orgânico é, então, evaporado. O filme lipídico resultante é reidratado em um tampão e sonicado até que a formulação fique translúcida com nenhuma partícula visível. Grandes lotes (100 ml) de lipossomas PEGuilados podem ser fabricados conforme acima, mas com tempo de sonicação mais curto seguido de homogeneização de alto cisalhamento.
[0245] Em alguma modalidade, o lipossoma de PEGuilação resultante é misturado com um agente (por exemplo, um antígeno).
V. COMPOSIÇÕES QUE COMPREENDEM LIPOSSOMAS PEGUILADOS
[0246] São fornecidas no presente documento formulações, composições e composições farmacêuticas que compreendem os lipossomas PEGuilados descritos no presente documento.
[0247] Em algumas modalidades, a composição que compreende lipossoma PEGuilado compreende adicionalmente um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[0248] As composições descritas no presente documento podem ser administradas a um indivíduo para qualquer propósito de vacinação, terapêutico ou diagnóstico.
[0249] Composições farmacêuticas geralmente compreendem composições descritas no presente documento e podem compreender adicionalmente um ou mais componentes conforme fornecido no presente documento que são selecionados dentre um antígeno, 48 agonistas adicionais, ou um construto de expressão recombinante, em combinação com um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[0250] Nas modalidades fornecidas no presente documento, a composição farmacêutica tem a capacidade de ser filtrada através de um filtro de 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem a capacidade de ser filtrada através de um filtro de 0,20 mícron. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem a capacidade de ser filtrada através de um filtro de 0,22 mícron.
[0251] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um lipossoma PEGuilado que compreende um agonista de TLR7/8 ou um agonista de TLR4. Tal composição pode ser usada para “monoterapia” em que o agonista de TLR7/8 ou o agonista TLR 4, conforme descrito no presente documento, é formulada em uma composição e a composição é substancialmente desprovida de outros antígenos, e é administrada a um indivíduo a fim de estimular uma resposta imune, por exemplo, uma resposta imune não específica ou uma resposta imune específica de antígeno, para o propósito de diagnóstico, tratamento ou prevenção de uma doença ou outra condição, como uma infecção por um organismo,
[0252] Em outras modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina que compreende ambas as composições descritas no presente documento e um antígeno e podem compreender adicionalmente um ou mais componentes, conforme fornecido no presente documento, em combinação com um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores ilustrativos são usualmente não tóxicos a recipiendários nas dosagens e concentrações empregadas.
[0253] Nas modalidades terapêuticas fornecidas no presente documento, uma dosagem de cerca de 1 μg/kg a cerca de 1 mg/kg de uma composição farmacêutica terapêutica é administrada, será evidente para os versados na técnica que o número e a frequência de administração serão dependentes da resposta do indivíduo.
[0254] Nas modalidades à base de vacina aqui fornecidas, cerca de 1 ug a 25 ug do agente (por exemplo, adjuvante ou antígeno) será administrada por administração, será evidente para os especialistas na técnica que o número e frequência de administração dependerão da resposta do indivíduo.
[0255] “Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R, Gennaro edit. 1985). Por exemplo, uma solução salina estéril e uma solução salina tamponada com fosfato a pH fisiológico podem ser usadas. Conservantes, estabilizantes, corantes e, ainda, agentes flavorizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Por exemplo, benzoato de sódio, ácido ascórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico podem ser adicionados como conservantes, id. em 1449. Além disso, podem ser usados antioxidantes e agente de suspensão. Id.
[0256] “Sal farmaceuticamente aceitável” se refere a sais dos compostos da presente invenção derivados da combinação de tais compostos e um ácido orgânico ou inorgânico (sais de adição ácidos) ou uma base orgânica ou inorgânica (sais de adição básicos). As composições da presente invenção podem ser usadas ou nas formas de sal ou base livres, em que ambas as formas são consideradas dentro do escopo da presente invenção.
[0257] As composições farmacêuticas podem estar em qualquer forma que permite que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar sob a forma de um sólido, líquido ou gás (aerossol). Vias típicas de administração incluem, sem limitação, oral, tópica, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal, intravenosa, intradérmica, transdérmica, intranasal, intramucosal ou subcutânea. O termo parenteral como usado no presente documento inclui administração iontoforética (por exemplo, documentos U.S. 7.033.598; 7.018.345; 6.970.739), sonoforética (por exemplo, U.S. 4.780.212; 4.767.402; 4.948.587; 5.618.275; 5.656.016, 5.722.397; 6.322.532; 6.018.678), térmica (por exemplo, U.S. 5.885.211; 6.685.699), transdérmica passiva (por exemplo, U.S. 3.598.122; 3.598.123; 4.286.592; 4.314.557; 4.379.454; 4.568.343; 5.464.387; Pedido de Patente N° UK 2232892; U.S. 6.871.477; 6.974.588; 6.676,961), microagulha (por exemplo, U.S. 6.908.453; 5.457.041; 5.591.139; 6.033.928) e também injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intrastemais, intracavernosas, intratecais, intrameatais, intrauretrais ou técnicas de infusão. Em uma modalidade particular, uma composição conforme descrito no presente documento (incluindo composições farmacêuticas e de vacina) é administrada de forma intradérmica por meio de uma técnica selecionada de iontoforese, microcavitação, sonoforese ou microagulhas.
[0258] A composição farmacêutica pode ser formulada de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos na mesma sejam biodisponíveis através da administração da composição a um indivíduo. As composições que serão administradas a um indivíduo tomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que, por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um ou mais compostos da invenção em forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem.
[0259] Para administração oral, um excipiente e/ou aglutinante pode estar presente. Exemplos são sacarose, caulina, glicerina, dextrinas de amido, alginato de sódio, carboximetilcelulose e etilcelulose. Corantes e/ou agentes aromatizantes podem estar presentes. Uma carcaça de revestimento pode ser empregada.
[0260] A composição pode estar sob a forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para entrega por injeção, como dois exemplos. Quando pretendido para administração oral, as composições podem conter um ou mais dentre um agente adoçante, conservantes, corante/colorante e intensificador de sabor. Em uma composição destinada a ser administrada por injeção, pode ser incluído um ou mais dentre um tensoativo, conservante, agente molhante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotônico.
[0261] Uma composição farmacêutica líquida como usado no presente documento, sob a forma de uma solução, suspensão ou outra forma similar, pode incluir um ou mais dos seguintes carreadores ou excipientes: diluentes estéreis, como água para injeção, solução salina, solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos como esqualeno, esqualano, óleo mineral, monooleato manitânico, colesterol e/ou mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabeno; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose.
[0262] Em uma outra modalidade, a composição da invenção é formulada de maneira que possa ser aerossolizada.
[0263] Pode também ser desejável incluir outros componentes em uma composição farmacêutica, como veículos de entrega incluindo, sem limitação, sais de alumínio, emulsões de água em óleo, veículos de óleo biodegradáveis, emulsões de óleo em água, microcápsulas biodegradáveis e lipossomas. . Exemplos de substâncias imunoestimulantes adicionais (coadjuvantes) para uso em tais veículos são também descritos acima e podem incluir N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), glucano, IL-12, GM-CSF, interferon gama e IL-12.
[0264] Embora possa ser usado qualquer carreador adequado conhecido pelos versados na técnica nas composições farmacêuticas desta invenção, o tipo de carreador variará dependendo do modo de administração e se é desejada uma liberação prolongada. Para administração parenteral, como injeção subcutânea, o carreador pode compreender água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode ser usado qualquer um dos carreadores acima ou um carreador sólido, como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glucose, sacarose e carbonato de magnésio. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactida poliláctica) podem também ser usadas como carreadores para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas são reveladas, por exemplo, nas Patentes n° U.S. 4.897.268 e 5.075.109. Nesse sentido, é preferencial que a microesfera seja maior que aproximadamente 25 mícrons.
[0265] As composições farmacêuticas podem conter, também, diluentes, como tampões, antioxidantes, como ácido ascórbico, polipeptídeos, proteínas, aminoácidos, carboidratos incluindo glicose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes, como EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumisilina sérica não específica são diluentes apropriados exemplificadores. Por exemplo, um produto pode ser formulado como um liofilizado com o uso de soluções de excipiente apropriadas (por exemplo, sacarose) como diluentes.
[0266] A composição farmacêutica pode ser destinada para administração tópica, caso no qual o carreador pode adequadamente compreender uma solução, emulsão, pomada ou base de gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos dispostos a seguir: petrolato, lanolina, polietileno glicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes como água e álcool, e emulsionantes e estabilizantes. Agentes espessantes podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se pretendido para administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou um dispositivo de iontoforese. As formulações tópicas podem conter uma concentração do antígeno (por exemplo, composição de vacina de GLA-antígeno) ou GLA (por exemplo, composição de adjuvante imunológico; GLA. está disponível junto à Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL: por exemplo, número de produto 699800) de cerca de 0,1 a cerca de 10% em p/v (peso por volume de unidade).
[0267] A composição pode ser destinada a administração retal, sob a forma de, por exemplo, de um supositório que pode derreter no reto e liberar o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno glicol. Nos métodos da invenção, as composições farmacêuticas/adjuvantes podem ser administradas através do uso de inserto (ou insertos), microesfera (ou microesferas, formulação (ou formulações) de liberação termporizada, elemento inserível (ou emplastros) ou formulação (ou formulações) de liberação rápida.
VI. MÉTODOS DE USO DE LIPOSSOMAS PEGUILADOS
[0268] É fornecido no presente documento um método de estimular uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar qualquer um dos lipossomas PEGuilados ou composições que compreendem os lipossomas PEGuilados fornecidos no presente documento. Os lipossomas PEGuilados e composições encontram usos para vacinação, terapêuticos e diagnósticos.
[0269] Em uma modalidade, é usado uma composição de lipossoma PEGuilado para o tratamento ou prevenção de câncer.
[0270] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende um lipossoma PEGuilado fornecido no presente documento é uma composição de vacina e é usada como uma vacina. Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento são usadas para estimular uma resposta imune no indivíduo (incluindo uma resposta não específica e uma resposta específica de antígeno). Em algumas modalidades, a resposta imune compreende uma resposta imune sistêmica. Em algumas modalidades, a resposta imune compreende uma resposta imune de mucosa.
[0271] Em uma modalidade, uma composição de lipossoma PEGuilado é usada para melhorar a imunidade protetora contra um vírus causador da gripe.
[0272] Em uma modalidade, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para melhorar a imunidade protetora contra um organismo causador de amebíase,
[0273] Em uma modalidade, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para melhorar a imunidade protetora contra Entamoeba histolytica.
[0274] Em uma modalidade, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para melhorar a imunidade protetora contra influenza.
[0275] Em uma modalidade, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para melhorar a imunidade protetora contra amebíase.
[0276] Em uma modalidade, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para estimular tanto uma resposta imune sistêmica (caracterizada por uma resposta imune de IgG) como uma resposta imune de mucosa (caracterizada por uma resposta imune de IgA) em um indivíduo, que compreende administrar via intranasal qualquer uma das composições de lipossoma PEGuilado fornecidas no presente documento. Em uma modalidade, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para estimular tanto uma resposta imune sistêmica como uma resposta imune de mucosa em um indivíduo, que compreende administrar via intranasal um lipossoma PEGuilado que compreende um agonista de TLR4 e um agonista de TLR7/8. Em uma modalidade relacionada, a composição de lipossoma PEGuilado é usada para estimular tanto uma resposta imune sistêmica como uma resposta imune de mucosa em um indivíduo, que compreende administrar via intranasal um lipossoma PEGuilado que compreende um GLA e um 3M-052. Surpreendentemente, os inventores constataram que a administração intranasal de uma composição que compreende um lipossoma PEGuilado pode gerar uma resposta de mucosa local (na cavidade nasal), gerar uma resposta imune sistêmica e gerar uma resposta de mucosa distal (por exemplo, fecal, intestinal e/ou resposta de mucosa vaginal).
[0277] Nas modalidades fornecidas no presente documento, o indivíduo é um mamífero (por exemplo, um animal incluindo animais de fazenda (vacas, porcos, cabras, cavalos, etc.), animais de estimação (gatos, cães, etc.), e roedores (ratos, camundongos, etc.) ou um ser humano). Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano. Em uma outra modalidade, o indivíduo é um mamífero não humano. Em uma outra modalidade, o mamífero não humano é um cão, vaca ou cavalo.
[0278] Também são contemplados em certas modalidades kits que compreendem os lipossomas PEGuilados e composições descritos no presente documento, que podem ser fornecidos em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, todos os componentes das composições estão presentes juntos em um único recipiente, mas a invenção não se destina a ser tão limitada e também contemplar dois ou mais recipientes nos quais, por exemplo, uma composição adjuvante imunológica é separada de, e não está em contato com, o componente antígeno. Por meio de teoria não limitativa, acredita- se que, em alguns casos, a administração apenas da composição de lipossomas PEGuilados como uma composição adjuvante imunológica pode ser realizada beneficamente, enquanto em outros casos tal administração pode ser beneficamente separada temporal e/ou espacialmente (por exemplo, em um sítio anatômico diferente) da administração do antígeno, enquanto em outros casos a administração ao indivíduo é conduzida beneficamente de uma composição de vacina como descrita no presente documento e contendo tanto antígeno como composição adjuvante, e opcionalmente também outros componentes descritos no presente documento.
[0279] Em algumas modalidades, um frasco do kit compreende uma composição que compreende lipossomas PEGuilados, e um segundo frasco do kit contém um agente. Em algumas modalidades, o kit compreende um terceiro frasco contendo um agente opcional.
[0280] Os kits da invenção podem compreender adicionalmente instruções para uso como descrito no presente documento ou instruções para misturar os materiais contidos nos frascos. Em algumas modalidades, o material no frasco é seco ou liofilizado. Em algumas modalidades, o material no frasco é líquido.
[0281] Um recipiente de acordo com tais modalidades do kit pode ser qualquer recipiente, vaso, frasco pequeno, ampola, tubo, taça, caixa, garrafa, frasco, jarra, prato, poço de um aparelho de poço simples ou de múltiplos poços, reservatório, tanque ou similares, ou outro dispositivo no qual as composições reveladas no presente documento podem ser colocadas, armazenadas e/ou transportadas, e acessadas para remover o conteúdo. Tipicamente, tal recipiente pode ser fabricado de um material que seja compatível com o uso pretendido e a partir do qual a recuperação do conteúdo contido pode ser prontamente obtida. Exemplos não limitativos de tais recipientes incluem tubos e ampolas vedadas ou revedáveis de vidro e/ou plástico, incluindo aquelas que têm um septo de borracha ou outro meio de vedação que seja compatível com a retirada do conteúdo com o uso de uma agulha e seringa. Tais recipientes podem, por exemplo, feitos de vidro ou de um plástico ou resina quimicamente compatível, que pode ser feito de, ou pode ser revestido com, um material que permita a recuperação eficiente do material do recipiente e/ou proteja o material, por exemplo, condições degradantes, como luz ultravioleta ou temperaturas extremas, ou a partir da introdução de contaminantes indesejáveis, incluindo contaminantes microbianos. Os recipientes são preferencialmente estéreis ou esterilizáveis, e fabricados de materiais que serão compatíveis com qualquer transportador, excipiente, solvente, veículo ou semelhante, como podem ser usados para suspender ou dissolver as composições de vacina aqui descritas e/ou composições de adjuvantes imunológicos e/ou antígenos e/ou construções de expressão recombinante, etc. Modalidades Exemplificadoras
[0282] Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere a, entre outros, um lipossoma que compreende um colesterol; um lipídeo neutro não PEGuilado; e um lipídeo PEGuilado, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 5.000 Daltons ou menos.
[0283] A presente invenção também fornece em uma segunda modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a modalidade, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado se encontra na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons; lipossomas da primeira modalidade, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 2.000 Daltons ou menos; ou lipossomas da primeira modalidade, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de cerca de 750 Daltons.
[0284] A presente invenção fornece em uma terceira modalidade qualquer um dentre os lipossomas da 1a ou 2a modalidade, em que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende um lipídeo neutro; em que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende uma cadeia de C14 alquila, a cadeia de C16 alquila ou uma cadeia de C18 alquila; em que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DSPE, DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE; em que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DSPE; ou em que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DPPE.
[0285] A presente invenção fornece em uma quarta modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a ou 3a modalidades, em que o lipídeo neutro não PEGuilado compreende uma cadeia de C14 alquila, uma cadeia de C16 alquila ou uma cadeia de C18 alquila; em que o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE, ou em que o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC.
[0286] A presente invenção fornece em uma quinta modalidade, qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a 3a ou 4a modalidades, em que o lipossoma é estável; em que o lipossoma é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C; em que o lipossoma é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 25 °C; ou em que o lipossoma é estável por pelo menos 1 mês a uma temperatura de cerca de 37 °C.
[0287] A presente invenção fornece em uma sexta modalidade, qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a 3a, 4a ou 5a modalidades, em que o índice de polidispersidade do lipossoma é mantido em cerca de 0,3 ou menos.
[0288] A presente invenção fornece em uma sétima modalidade, qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a 3a, 4a 5a ou 6a modalidades, em que o tamanho do lipossoma é menor que ou cerca de 450 nm; em que o tamanho do lipossoma é mantido em menos que ou cerca de 450 nm; ou em que o tamanho do lipossoma se encontra na faixa de cerca de 50 nm a cerca de 300 nm.
[0289] A presente invenção fornece em uma oitava modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a 3a, 4a 5a, 6a ou 7a modalidades, em que o percentual molar (% molar) do lipídeo PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 25% molar; em que o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 10% molar; ou em que o percentual molar do lipídeo PEGuilado no lipossoma é de cerca de 5% molar.
[0290] A presente invenção fornece em uma nona modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a 3a 4a 5a 6a, 7a ou 8a modalidades, em que o percentual molar de colesterol no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 1% molar a cerca de 50% molar; ou em que o percentual molar do colesterol no lipossoma é de cerca de 50% molar.
[0291] A presente invenção fornece em uma décima modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a , 2a 3a, 4a 5a, 6a, 7a, 8a ou 9a modalidades, em que o percentual molar de lipídeo não PEGuilado no lipossoma se encontra na faixa de cerca de 45% molar a cerca de 98% molar ou em que o percentual molar de lipídeo não PEGuilado no lipossoma é de cerca de 45% molar.
[0292] A presente invenção fornece em uma décima- primeira modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a 3a, 4a 5a, 6a, 7a, 8a 9a ou 10a modalidades, em que a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado:colesterol:lipídeo PEGuilado é de cerca de 9,8:5,7:0,8 ou em que a razão molar lipídica entre o lipídeo neutro não PEGuilado:colesterol:lipídeo PEGuilado é de cerca de 18:5,5:3.
[0293] A presente invenção fornece em uma décima- segunda modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a , 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a ou 11a modalidades, em que o lipossoma compreende adicionalmente pelo menos um agonista de TLR; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR2, um agonista de TLR3, um agonista de TLR4, um agonista de TLR5, um agonista de TLR6, um agonista de TLR7, um agonista de TLR8, um agonista de TLR7/8 ou um agonista de TLR9; em que o lipossoma compreende um TLR4, SLA, GLA, 3D- MPL, R837 ou R848; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR com uma cauda hidrofóbica; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR7/8; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR7, em que o lipossoma compreende um agonista de TLR8; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR7/8 que compreende uma imidazoquinolina ou um composto contendo imidazoquinolina; em que o lipossoma compreende 3M052; em que o lipossoma compreende R848; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR4; em que o lipossoma compreende 3D-MPL; em que o lipossoma compreende GLA; em que o lipossoma compreende um GLA sintético de Fórmula (V) conforme fornecido no presente documento ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e qualquer uma das modalidades correspondentes de Fórmula (V) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que o lipossoma compreende um GLA sintético de Fórmula (VI) conforme fornecido no presente documento ou um sal farmaceuticamente aceitável e qualquer uma das modalidades correspondentes de Fórmula (VI) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ou em que o lipossoma compreende um GLA sintético de Fórmula:
[0294] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que o lipossoma compreende um agonista de TLR4 e um agonista de TLR7/8; em que o lipossoma compreende qualquer um dos agonistas de TLR4 ou TLR7/8 descritos no presente documento; ou em que o lipossoma compreende GLA e 3M-052.
[0295] A presente invenção fornece em uma décima- terceira modalidade qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a ou 12a modalidades, em que o lipossoma compreende pelo menos um agente; em que o lipossoma compreende pelo menos um agente que compreende um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente de diagnóstico, um agente terapêutico ou um organismo; em que o lipossoma compreende pelo menos um agente que compreende um antígeno; em que o lipossoma compreende pelo menos um agente que compreende um antígeno e em que o antígeno compreende um antígeno relacionado à amebíase, LecA, um antígeno relacionado à gripe, H5N1, um antígeno relacionado à tuberculose, ID91, ID93, um antígeno de BCG, um antígeno relacionado ao vírus da hepatite, um antígeno de Hepatite B, um antígeno de Hepatite C, um antígeno relacionado ao HIV ou um antígeno relacionado ao câncer.
[0296] A presente invenção fornece em uma décima- quarta modalidade uma composição que compreende qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a ou 13a modalidades ou uma composição que compreende qualquer um dos lipossomas da 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a ou 13a modalidades e um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser, por exemplo, uma vacina, um terapêutico ou um diagnóstico.
[0297] A presente invenção fornece em uma décima- quinta modalidade um método de estimulação de uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o lipossoma ou composição de qualquer uma da 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a 13a ou 14a modalidades, estimulando, assim, uma resposta imune no indivíduo. A resposta imune pode ser, por exemplo, uma resposta imune não específica; uma resposta imune específica de antígeno; uma resposta imune sistêmica; uma resposta imune de mucosa; ou uma resposta imune de mucosa intestinal, fecal ou vaginal. As composições podem ser usadas, por exemplo, para o tratamento ou prevenção de câncer; como uma vacina; para melhorar a imunidade protetora contra um vírus causador de gripe; para melhorar a imunidade protetora contra um organismo causador de amebíase; para melhorar a imunidade protetora contra Entamoeba histolytica, para melhorar a imunidade protetora contra gripe; ou para melhorar a imunidade protetora contra amebíase. A via de administração da composição pode ser oral, topical, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal, intravenosa, intradérmica, transdérmica, intranasal, intramucosal ou subcutânea. O lipossoma ou composição pode ser administrado com um coadjuvante de ácido retinoico. O indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero não humano ou ser humano.
[0298] A presente invenção fornece em uma décima- sexta modalidade, um método de indução de uma resposta de Thl em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o lipossoma ou composição de qualquer uma da 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a 13a ou 14a modalidades, em que uma resposta de Th1 é induzida no indivíduo. A resposta imune pode ser, por exemplo, uma resposta imune não específica; uma resposta imune específica de antígeno; uma resposta imune sistêmica; uma resposta imune de mucosa; ou uma resposta imune de mucosa intestinal, fecal ou vaginal. As composições podem ser usadas, por exemplo, para o tratamento ou prevenção de câncer; como uma vacina; para melhorar a imunidade protetora contra um vírus causador de gripe; para melhorar a imunidade protetora contra um organismo causador de amebíase; para melhorar a imunidade protetora contra Entamoeba histolytica, para melhorar a imunidade protetora contra gripe; ou para melhorar a imunidade protetora contra amebíase. A via de administração da composição pode ser oral, topical, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal, intravenosa, intradérmica, transdérmica, intranasal, intramucosal ou subcutânea. O lipossoma ou composição pode ser administrado com um coadjuvante de ácido retinoico. O indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero não humano ou ser humano.
[0299] A presente invenção fornece em uma décima- sétima modalidade um método de estimulação de uma resposta imune sistêmica e uma resposta imune de mucosa em um indivíduo, que compreende administrar via intranasal o lipossoma ou composição de qualquer uma da 1a, 2a, 3a, 4a 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a 13a ou 14 modalidades ao indivíduo. A resposta imune de mucosa pode compreender, por exemplo, uma resposta imune de mucosa, intestinal, fecal ou vaginal. A resposta imune de mucosa pode ser, por exemplo, distal em relação à cavidade nasal. O lipossoma ou composição pode ser administrado com um coadjuvante de ácido retinoico. O indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero não humano ou ser humano.
[0300] A presente invenção fornece em uma décima- oitava modalidade um método de fabricação de qualquer um dos lipossomas PEGuilados descritos no presente documento, que compreende: a) misturar o lipídeo neutro não PEGuilado, o lipídeo PEGuilado e o colesterol em um solvente orgânico; b) evaporar o solvente orgânico, gerando, assim, um filme lipídico; c) reidratar o filme lipídico em um tampão; e sonicar, microfluidizar ou extrudar o produto reidratado da etapa c). A etapa a) pode compreender adicionalmente a etapa de mistura de um agonista de TLR. O solvente orgânico pode ser, por exemplo, clorofórmio. O produto reidratado da etapa (c) pode ser, por exemplo, sonicado e, então, microfluidizado. O método pode compreender adicionalmente misturar por adição um agente ao lipossoma PEGuilado. O agente pode ser qualquer um dos agentes descritos no presente documento.
[0301] A presente invenção fornece em uma décima- nona modalidade uma emulsão óleo em água à base de esqualeno que compreende um agonista de TLR, esqualeno e fosfatidilcolina insaturada. Em tais modalidades, as emulsões fabricadas com a fosfatidilcolina insaturada em comparação com um fosfolipídeo saturado, por exemplo, DMPC, resultaram em maior recuperação de agonista de TLR, isto é, maior concentração de agonista de TLR na formulação final quando começando com a mesma concentração inicial de agonista de TLR.
[0302] A presente invenção fornece em uma vigésima modalidade uma emulsão óleo em água à base de esqualeno que compreende um agonista de TLR, esqualeno, e fosfatidilcolina insaturada, em que o esqualeno está a uma concentração entre cerca de 30 a cerca de 40 mg/ml e a fosfatidilcolina insaturada está a uma concentração de cerca de 5 a cerca de 10 mg/ml.
[0303] A presente invenção fornece em uma vigésima-primeira modalidade uma emulsão óleo em água à base de esqualeno otimizada para formulação com um agonista de TLR, tipicamente um agonista de TLR que é insolúvel em água (solubilidade insignificante na água) que compreende o agonista de TLR, esqualeno, e fosfatidilcolina insaturada (por exemplo, fosfatidilcolina de ovo) em que o esqualeno está a uma concentração entre cerca de 34 mg/ml e a fosfatidilcolina insaturada está a uma concentração de cerca de a -8 mg/ml ou cerca de 7,6 mg/ml.
[0304] A presente invenção fornece em uma vigésima-segunda modalidade qualquer uma das emulsões da 19a, 20a ou 21a modalidade que compreende adicionalmente um agente coemulsionante, um agente de tonicidade e um agente de tamponamento. Em qualquer uma das modalidades descritas no presente documento, o agente coemulsionante pode ser, por exemplo, um copolímero em tribloco linear não iônico como um poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 188). Em qualquer uma das modalidades descritas no presente documento, o agente de tonicidade pode ser, por exemplo, um poliol como manitol ou glicerol. Em qualquer uma das modalidades descritas no presente documento, o agente de tamponamento pode ser, por exemplo, um agente de tamponamento de fosfato como, por exemplo, um tampão de fosfato de amônio. O agente coemulsionante, quando presente na emulsão está, de preferência, presente na emulsão a uma concentração de 0,1 a cerca de 2 mg/ml, com mais preferência em cerca de 0,5 mg/ml, com a máxima preferência em cerca de 0,36 mg/ml. O agente de tonicidade, quando presente na emulsão está presente em uma quantidade suficiente para fazer com que a composição tenha uma osmolaridade de cerca de 250 a 350 mOsm/kg, de preferência, 270 a 315 mOsm/kg.
[0305] A presente invenção fornece em uma vigésima-terceira modalidade qualquer uma das emulsões da 19a, 20a, 21a ou 22a modalidade, em que o agonista de TLR (a) é sintético (b) é insolúvel em água (c) é uma imidazoquinolina ou composto contendo imidazoquinolina (d) tem uma cauda hidrofóbica (e) é 3M-052 ou quaisquer combinações dos mesmos. As emulsões podem compreender adicionalmente pelo menos um agente; em que o pelo menos um agente pode ser um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente de diagnóstico, um agente terapêutico ou um organismo. Agentes exemplificadores incluem, por exemplo, um antígeno relacionado à amebíase, LecA, um antígeno relacionado à gripe, H5N1, um antígeno relacionado à tuberculose, ID91, ID93, um antígeno de BCG, um antígeno relacionado ao vírus da hepatite, um antígeno de Hepatite B, um antígeno de Hepatite C, um antígeno relacionado ao HIV ou um antígeno relacionado ao câncer.
[0306] A presente invenção fornece em uma vigésima-quarta modalidade um método de fabricação das emulsões da 19a, 20a, 21a , 22a e 23a modalidades que compreende combinar o agonista de TLR com a fosfatidilcolina insaturada em um solvente orgânico. Qualquer solvente orgânico que tem a capacidade de solubilizar tanto o agonista de TLR como a fosfatidilcolina insaturada é adequado para uso incluindo, por exemplo, etanol, DMF e clorofórmio. O método pode compreender adicionalmente a etapa de (a) remover o clorofórmio através de qualquer método adequado incluindo evaporação para gerar um filme lipídico (b) adicionar o esqualeno ao filme lipídico seco e (c) e misturar a mistura resultante, por exemplo, por sonicação (por exemplo, em um banho a 60 °C) ou microfluidização ou agitação simples.
[0307] A presente invenção fornece em uma vigésima-quinta modalidade composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma das emulsões da 19a, 20a, 21a, 22a e 23a modalidades, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0308] A presente invenção fornece em uma vigésima-sexta modalidade um método de estimulação de uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar qualquer uma das emulsões da 19a, 20a, 21a, 22a e 23a modalidades ou composições farmacêuticas da 25a modalidade a um indivíduo. A resposta imune pode ser, por exemplo, uma resposta imune de Thl; uma resposta imune não específica, uma resposta imune específica de antígeno, uma resposta imune sistêmica, uma resposta imune de mucosa ou uma resposta imune de mucosa intestinal, fecal ou vaginal. As emulsões ou composições podem ser usadas, por exemplo, para o tratamento ou prevenção de câncer; como uma vacina; para melhorar a imunidade protetora contra um vírus causador de gripe; para melhorar a imunidade protetora contra um organismo causador de amebíase; para melhorar a imunidade protetora contra Entamoeba histolytica, para melhorar a imunidade protetora contra gripe; ou para melhorar a imunidade protetora contra amebíase. A via de administração da composição pode ser oral, topical, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal, intravenosa, intradérmica, transdérmica, intranasal, intramucosal ou subcutânea. O lipossoma ou composição pode ser administrado com um coadjuvante de ácido retinoico. O indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero não humano ou ser humano.
[0309] Os Exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: FORMULAÇÃO E TESTE DE LIPOSSOMAS CONTENDO LIGANTE DE TLR PARA VACINAS DE AMEBÍASE MATERIAL E MÉTODOS FORMULAÇÕES COM ADJUVANTES, ANTÍGENO LECA
[0310] Todos os adjuvantes foram preparados no Instituto de Pesquisa de Doenças Infecciosas (IDRI, Seattle, WA, EUA) e fornecidos como formulações concentradas 2X ou 5X para misturar com o antígeno imediatamente antes da injeção.
[0311] O antígeno de LecA foi fabricado por TECHLAB (Blacksburg, VA) conforme descrito (Barroso L, Abhyankar M, Noor Z, Read K, Pedersen K, White R, et al. Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine. Vaccine. 2014,32(10): 1218-). Adjuvante lipídico glucopiranosila (GLA), 1,2-dipalmitoil-sn- glicero-3- fosfocolina (DPPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietileno glicol) -750] (DSPE-PEG750) e 1,2-diestearil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG2000) foram obtidos junto à Corden Pharma (Liestal, Suíça) ou Avanti Polar Lipids (Alabastro, AL). 3M-052 foi fornecido como corteseia de 3M Drug Delivery Systems (St. Paul, MN). Colesterol e sais de tampão foram adquiridos junto à J.T. Baker (São Francisco, CA, EUA). GLA usados nos exemplos tem a estrutura de Fórmula (VI) em que R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C13 alquila,
[0312] As formulações de lipossoma PEGuilado foram fabricadas pela combinação de DPPC, colesterol, DSPE-PEG750 ou DPPE- PEG2000, e 3M-052 e/ou GLA em clorofórmio. A razão molar lipídica era 9,8:5,7:0,8 (DPPC:colesterol:lipídeo PEGuilado). O solvente orgânico das formulações foi, então, evaporado por pelo menos 12 h com o uso de um evaporador giratório. O filme fino lipídico foi reidratado em tampão de fosfato de amônio 25 mM (pH ~5,7) e sonicado em um banho de água Crest Powersonic CP230D (Trenton, NJ) a ~60 °C por até 30 min. A formulação foi, então, microfluidizada a 10.000 a 206,8 MPa (30.000 psi) por 5 a 6 passagens com um resfriador de água em recirculação ajustado a 10 °C. Os lipossomas foram filtrados através de um filtro de poliéter sulfona de membrana dupla de 0,8/0,2 um e armazenados a 5 °C, temperatura ambiente, 37 °C, ou 60 °C. Uma alternativa à microfluidização é a sonicação.
[0313] As emulsões de esqualeno em água foram preparadas por microfluidização (M110P, Microfluidics Corp) a 206,8 MPa (30.000 psi) essencialmente como descrito (Fox et al. Vaccine 2013, 31:5848). Foram preparadas formulações de adsorção de alúmen misturando um componente lipídico aquoso da suspensão à base de lipídeo PEGuilado de GLA ou uma solução aquosa de CpG 1826 a Alhydrogel® (Brenntag Biosector) como anteriormente descrito (Fox et al. J Pharm Sci 2012, 101:4357 e Fox et al.)
MEDIÇÕES DE ESTABILIDADE FÍSICO-QUÍMICA
[0314] Os tamanhos das partículas de emulsão e lipossoma foram medidos por dispersão de luz dinâmica após diluição de 1:100 em água. A compatibilidade físico-química a curto prazo (<24 h) da mistura antígeno-adjuvante foi avaliada através do monitoramento do tamanho de partícula, aparência visual e estrutura primária do antígeno imediatamente após a mistura e 4 e 24 h após a mistura, com misturas armazenadas a 5 °C e temperatura ambiente. O antígeno foi primeiro diluído em solução salina para 0,1 mg/ml e subsequentemente misturado em volume de 1:1 com a formulação adjuvante lipossômica. O tamanho de partícula foi medido como descrito acima, exceto que uma cubeta foi preparada em vez de três. A SDS-PAGE foi conduzida misturando 50 μl de amostra com 50 μl de tampão de amostra redutor 4x e 100 μl de SDS a 20%. A amostra foi aquecida a 90 °C durante 5 min e armazenada a -20 °C e, depois, foram reaquecidas durante 1 min a 90 °C e carregadas em um gel de poliacrilamida com tampão corrente Tris-glicina durante 65 min a 180 V, seguido de coloração com azul de Coomassie.
[0315] Com o uso de um método de HPLC, determinou-se a concentração de 3M-052 por detecção de absorvância de UV a 320 nm e determinou-se a concentração de GLA por detecção de aerossol carregada. O método de HPLC foi descrito anteriormente (Misquith A, Fung M, Dowling QM, Guderian JA, Vedvick TS, Fox CB. In vitro evaluation of TLR4 agonist activity: formulation effects. Coll Surf B: Biointerfaces. 2014;! 13:312 a 319). As concentrações de adjuvante foram consideradas dentro da especificação se os valores medidos estiverem dentro de +/'- 20% da concentração-alvo. O tamanho de partícula dos lipossomas e a polidispersão do tamanho foram avaliados com o uso de Nano-S ou ZS Zetasizer da Malvern Instruments (Worcestershire, Reino Unido). A formulação foi diluída 100 vezes em água ultrapura (18,2 MQ) em uma cubeta descartável de poliestireno de 1,5 ml. Para cada formulação, foram preparadas três cubetas separadas. Todas as medições de tamanho foram feitas três vezes para cada cubeta. Em raras ocasiões, partículas de poeira resultam em desvios de medição óbvios; nesses casos, a medição da cubeta suspeita é descartada do conjunto. A concentração de ligando de TLR, tamanho de partícula e aparência visual foram monitorados regularmente como indicado.
IMUNIZAÇÕES
[0316] Camundongos machos CBA/J com quatro a seis semanas de vida foram adquiridos junto a Jackson Labs. O antígeno Lee A não marcado foi purificado na TechLab Inc. (Blacksburg, VA, EUA) e o 5 ug de antígeno foi usado por imunização por camundongo. Todos os estudos com camundongos foram realizados estritamente de acordo com os regulamentos da IACUC. Para a imunização subcutânea na região do pescoço, o LecA foi misturado com o respectivo adjuvante (Tabela 1) e o volume foi levado até 100 ul com solução salina para injeção. As imunizações intranasais foram realizadas sob anestesia e, tipicamente, foi usada uma mistura antígeno-adjuvante por narina. Um intervalo de duas semanas foi mantido entre as imunizações sucessivas para todos os regimes. Para experiências envolvendo a dose semanal de todo o ácido trans-retinoico (RA), cada camundongo recebeu 150 μg de ácido trans-retinóico (Sigma) dissolvido em um volume final de 50 μl de DMSO intraperitonealmente. O estoque de RA foi armazenado a -80 °C e protegido da luz. Todos os adjuvantes foram armazenados a 4 °C e as formulações preparadas assepticamente imediatamente antes da imunização.
MEDIÇÃO DE IMUNOGENICIDADE
[0317] As titulações de anticorpos foram medidas por ELISA com o uso de placas de 96 cavidades revestidas com 0,5 ug de lectina por cavidade. As amostras de plasma foram diluídas apropriadamente e os subtipos de IgG específicos para o antígeno foram medidos com o uso de anticorpos de detecção IgG1 e IgG2a anti-camundongo de cabra conjugados com peroxidase de rábano diluídos a 1:10.000 (Southern Biotechnology). Os sobrenadantes de fazes foram preparados conforme descrito (Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al). A proteção contra amebíase intestinal por uma vacina recombinante é transferível por células T e mediada por interferon gama. Infect Immun. set de 2009;77(9):3.909 a 3.918). Em resumo, amostras de fezes recém-coletadas foram ressuspensas (5 ul de diluente por mg de fezes) em PBS contendo o coquetel inibidor de protease (Roche) e vigorosamente misturadas por 5 minutos. O material insolúvel foi removido através de duas voltas consecutivas a 3.000 rpm e 12.000 rpm e o sobrenadante foi armazenado a -20 °C. Foram utilizados sobrenadantes de fezes apropriadamente diluídos para ELISA e foi usado IgA anti-camundongo de cabra conjugada com peroxidase de rábano a uma diluição de 1:5.000 como anticorpo secundário. As unidades de anticorpo foram determinadas usando curvas padrão.
[0318] Para a medição de citocinas extracelulares, os esplenócitos foram re-estimulados com 50 μg/ml de LecA por 72 h e os sobrenadantes analisados por um sistema de arranjo de suspensões multiplex usando microesferas Luminex (BioRad) (Guo X, Barroso L. Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al. A proteção contra amebíase intestinal por uma vacina recombinante é transferível por células T e mediada por interferon gama. Infect Immun. set de 2009;77(9):3.909 a 3.918). As amostras foram processadas não diluídas de acordo com as instruções do fabricante e medidas em picogramas por mililitro de sobrenadante.
CONDIÇÕES DE CULTURA E EXPERIMENTOS DE DESAFIO
[0319] Trofozoítos originalmente derivados de HM1: IMSS (ATCC) passados sequencialmente através de camundongos ceca foram usados para os experimentos de desafio. Os trofozoítos foram mantidos em meio tripsina-extrato de levedura-ferro (TYI-S-33) suplementado com vitaminas Diamante 2%, soro bovino inativado pelo calor 13% (Gemini Labs) e 100 U/ml de penicilina mais 100 μg/ml de estreptomicina (Invitrogen) (Diamante LS, Harlow DR, Cunnick CC). A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1978;72(4):431 a 432). Os camundongos dos grupos imunizados e controle foram desafiados intracecalmente quatro semanas após o reforço final com dois milhões de trofozoítos em um meio de 150 ul após a laparotomia (Houpt E, Barroso L, Lockhart L, Wright R, Cramer C, Lyerly D, et al. Prevention of intestinal amebiasis by vaccination with the Entamoeba histolytica Gal/GalNac lectin. Vaccine. janeiro de 2004 26;22(5 a 6);611 a 617). Os camundongos foram sacrificados uma semana após o desafio. Ceco foram enxaguados com 1 ml de PBS, 300 ul de enxágue de ceco foram cultivados em caldo TYI-S-33 por até 5 dias e 200 ul utilizados para ELISA de carga de antígeno. A eficácia da vacina foi calculada como 100x (1-(% de camundongos vacinados com infecção)/(% de camundongos sham com infecção) (Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al. A proteção contra amebíase intestinal por uma vacina recombinante é transferível por células T e mediada por interferon gama. Infect Imraun, setembro de 2009; 77(9):3.909 a 3.918; Soong CJ, Kain KC, Abd-Alla M, Jackson TF, Ravdin JI. A recombinant cysteine-rich section of the Entamoeba histolytica galactose-inhibitable lectin is efficacious as a subunit vaccine in the gerbil model of amebic liver abscess. J Infect Dis. março de 1995;171(3):645 a 651).
DETECÇÃO DE ANTÍGENO FECAL
[0320] O antígeno fecal no conteúdo cecal foi detectado usando do kit ELISA E. his II (TechLab Inc., Blacksburg, VA, EUA). Uma densidade óptica a 450 nm> 0,05 acima do controle negativo foi considerada positiva. Uma curva padrão foi gerada usando Lee A purificado.
ENSAIO DE ADERÊNCIA
[0321] Células de ovário de hamster chinês (CHO) foram cultivadas em um meio α-MEM e trofozóitos de E. histolytica foram cultivados conforme descrito acima. Trofozóitos de E.histofytica foram pré- incubados com uma diluição de dez vezes de sobrenadantes fecais de grupos de controlo ou imunizados em gelo durante 1 h. Trofozoítos e células CHO foram, então, misturados em uma razão de 1:20 e a incubação continuou por 90 min em gelo em tubos de poliestireno de fundo redondo. Imediatamente antes da contagem microscópica, os tubos foram brevemente agitados em vórtice e as células contadas em um hemocitômetro. A aderência foi medida como o número de trofozoítos tendo pelo menos 3 células CHO aderentes e relatado como percentual de formação de rosetas. Cada amostra foi processada em triplicata e um mínimo de 100 amebas foi contado (Barroso L, Abhyankar M, Noor Z, Read K, Pedersen K, White R, et al. Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine. Vaccine. favereiro de 201426:32(10): 1.218 a 24; Ravdin JI, Guerrant RL. Role of adherence in cytopathogenic mechanisms of Entamoeba histolytica. Study with mammalian tissue culture cells and human erythrocytes. J Clin Invest. novembro de 1981;68(5): 1.305 a 13).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
[0322] Todas as análises foram realizadas usando o software Graph Pad Prism. As razões de camundongos infectados e não infectados de testes de desafio foram analisadas com o uso do teste exato de Fisher. As cargas de antígenos, os títulos de anticorpos e as diferenças de inibição da aderência foram analisados pelo teste de Mann-Whitney.
RESULTADOS ESTABILIDADE FISIOQUÍMICA
[0323] A estabilidade de lipossoma foi monitorada por dispersão dinâmica de luz (tamanho de partícula e polidispersividade de tamanho), aparência visual e HPLC (concentração de GLA e 3M-052). Os valores de polidispersão do tamanho e tamanho da partícula apresentaram pouca ou nenhuma alteração ao longo de 12 meses a 5 °C, embora os valores de polidispersão para lipossomas contendo DSPE-PEG2000 fossem significativamente mais elevados do que os valores de polidispersão para lipossomas contendo DSPE-PEG750. (Figura 1A). A aparência visual dos lipossomas foi consistentemente translúcida e homogênea e não se alterou ao longo do tempo. Quando armazenados a 37 °C, os lipossomas contendo DSPE- PEG2000 apresentaram maior alteração no tamanho de partícula e polidispersividade de tamanho ao longo do tempo em comparação com os lipossomas contendo DSPE- PEG750 (Figuras 1C e 1D). As concentrações de GLA e 3M-052 não mudaram ao longo de 12 meses nas amostras armazenadas a 5 °C. A 37 °C, a taxa de perda de GLA foi maior que a de 3M-052, com >40% de perda de GLA após 6 meses, enquanto nenhuma perda detectável ocorreu com 3M-052.
[0324] Para avaliar a compatibilidade de curto prazo (<24 h) do adjuvante e do antígeno LecA após a mistura, o antígeno estoque foi diluído em solução salina e, então, misturado a uma razão de 1:1 com adjuvante para mimetizar o procedimento de mistura planejado para os estudos de imunização in vivo descritos abaixo. As formulações apresentavam uma aparência homogênea e translúcida antes e depois da mistura com o antígeno. No geral, houve pouca (<15%) ou nenhuma alteração no tamanho das partículas ao longo de 24 h após a mistura com o antígeno armazenada a 5 °C ou temperatura ambiente, embora lipossomas contendo DSPE-PEG2000 tenham mostrado uma tendência ligeiramente maior para aumentar em tamanho em comparação com o lipossomas contendo o comprimento de PEG mais curto (DSPE-PEG750). No geral, a presença de GLA, 3M-052 ou ambos os agonistas juntos não pareceu afetar os resultados de compatibilidade de tamanho de partícula. Do mesmo modo, os valores de polidispersividade de tamanho mudaram pouco, embora a polidispersão fosse maior para os lipossomas contendo DSPE-PEG2000 em comparação com os lipossomas contendo DSPE- PEG750. A análise de SDS-PAGE das misturas antígeno-adjuvantes não indicou mudança na estrutura primária do antígeno em qualquer momento ou estado de armazenamento ao longo de 24 h, independentemente da composição dos lipossomas, com uma mão simples uniforme próximo ao PM esperado. Em conjunto, esses dados indicam que a mistura antígeno-adjuvante demonstrou compatibilidade aceitável a curto prazo durante pelo menos 24 horas a 5 °C ou à temperatura ambiente. AVALIAÇÃO DE IMUNOGENICIDADE E SELEÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DE LIPOSSOMA Com o uso de um LecA de adesina recombinante de E. histolytica como um imunógeno, adjuvantes que poderiam gerar uma resposta imune equilibrada foram varridos. Os adjuvantes contendo agonistas de TLR sintéticos foram preparados como mostrado na Tabela 2 e a sua capacidade para gerar uma resposta humoral específica de antígeno foi avaliada.TABELA 2: ADJUVANTES CONTENDO AGONISTAS DE TLR
[0325] Cada um desses adjuvantes é constituído por componentes farmaceuticamente aceitáveis e seria adequado para estudos clínicos. As formulações de emulsão e lipossoma demonstraram um tamanho médio de partícula de 65 a 130 nm dependendo da composição e método de processamento, enquanto as formulações contendo Alum continham micropartículas. Nove formulações foram preparadas misturando os adjuvantes com proteína LecA não marcada purificada e os camundongos foram imunizados subcutaneamente. Cinco camundongos por grupo foram imunizados três vezes por via subcutânea em um intervalo de 2 semanas com o antígeno LecA misturado com o adjuvante correspondente. Amostras de plasma coletadas uma semana após a imunização final foram diluídas 256.000 vezes e analisadas para produção de IgG1 e IgG2a por ELISA. * O nível de IgG2a elicitado por LecA adjuvantado com LLA 3M-052-lipossoma foi estatisticamente significativo em comparação com todos os outros grupos exceto EMO 14 (GLA-CpG-SE) e emulsão de 3M-052. Titulações de subclasses de IgG de plasma foram determinadas por ELISA (Figura 2). A Figura 2 mostra que a formulação de lipossomas contendo uma mistura de GLA (um agonista de TLR-4) e 3M-052 (um agonista de TLR-7/8) (designada como GLA-3M-052-LS) mostrou uma resposta equilibrada de IgG e foi selecionada para estudos posteriores.
[0326] Em seguida, foi investigada a capacidade de a GLA-3M-052-LS induzir uma produção de citocina específica para o antígeno, indicativa de uma resposta imune mediada por células. Esplenócitos foram re- estimulados com LecA in vitro e os sobrenadantes de cultura foram analisados. Os lipossomas GLA 3M-052 adjuvantados contendo LecA desencadearam respostas fortes de IFN-y e IL-17, que são marcadores de proteção no modelo de camundongo (Figuras 3A a 3D). Especificamente, os camundongos foram eutanasiados uma semana após a terceira imunização e os esplenócitos re- estimulados com LecA por 72 h. A produção de IFN-YY, IL-17, IL-2 e IL-4 extracelular foi detectada no sobrenadante da cultura por Luminex e expressa em pg/ml. * - p< 0,05, ** == p 0,001.
[0327] Adicionalmente, PBMCs apenas do grupo LecA adjuvantado com lipossomas GLA 3M-052 mostraram uma coloração intracelular moderada, mas estatisticamente significativa de IFN-y.
[0328] A compatibilidade do ácido all-trans retinoico (RA) como coadjuvante foi também testada. Camundongos nos respectivos grupos receberam uma injeção semanal de RA. O regime assistido por RA aumentou ainda mais os níveis de IFN-y e IL-17 (também Figuras 3A a 3D). Ambos os grupos (adjuvante + LecA) e (adjuvante + LecA + RA) geraram uma resposta equivalente de IL-2, enquanto que o regime assistido por RA resultou em uma resposta ligeiramente maior de IL-4.
[0329] Uma vez que uma vacina à base de lipossomas também é adequada para a imunização da mucosa, foi usado um regime de imunização parentérica/de mucosa misto para os experimentos subsequentes para testar a sua capacidade de gerar uma resposta IgA intestinal específica do antígeno.
RESPOSTA DE IGA MUCOSAL E SEU POTENCIAL INIBIDOR DE ADERÊNCIA
[0330] Os camundongos foram preparados com uma imunização intranasal, seguida de um reforço subcutâneo e intranasal. Camundongos nos grupos assistidos com RA receberam uma injeção semanal de RA. Conforme mostrado na Figura 4A, LecA adjuvantado gerou uma resposta robusta de IgA de mucosa que era específica de antígeno. Inclusão de RA ajudou a aumentar a titulação de IgA. A aderência de trofozoítos de E. histolytica às células-alvo é uma etapa inicial e crucial no início da infecção.
[0331] Para avaliar se a IgA da mucosa era de natureza protetora, foi testada a sua capacidade para bloquear a aderência de parasitas às células CHO in vitro. A pré-incubação de trofozoítos com sobrenadantes fecais dos camundongos imunizados reduziu significativamente o seu potencial de aderência (Figura 4B). As suspensões de fezes dos regimes (adjuvante + LecA) ou (adjuvante + LecA + RA) mostraram um potencial inibitório de aderência comparável. Assim, o LecA adjuvantado desencadeou uma resposta IgE intestinal de alto título que era protetora in vitro.
FORMULAÇÃO DE NANOLIPOSSOMAS CONTENDO AGONISTAS DE TLR SINÉRGICOS TEM O POTENCIAL DE PROTEGER CONTRA O DESAFIO PARASITÁRIO INTESTINAL
[0332] Foi testado o potencial do adjuvante de lipossoma GLA 3M-052 para proteger contra o desafio de E. histolytica com o uso do modelo de camundongo de amebíase intestinal. Camundongos dos grupos controle e experimental foram imunizados intracecalmente com uma cepa virulenta de E. histolytica e ceca colhida uma semana após o desafio de avaliar a carga de antígenos (Figura 5A) bem como a presença de parasitas vivos (Figura 5B). A LecA adjuvada reduziu significativamente a carga de antígeno em comparação com os camundongos de controle e essa redução foi ainda mais pronunciada com o uso de RA como coadjuvante. O adjuvante com o regime atual mostrou moderada eficácia de 34%. Contudo, a inclusão de RA no regime melhorou substancialmente a eficácia para 69,2% (Tabela 3). A fórmula usada para calcular a eficácia da vacina foi:Eficácia = 100 x (1-(% de camundongos vacinados com infecção)/(% de camundongos sham com infecção) Eficácia para grupos adjuvante+ LecA 100 x (1-46/69,2) = 100 x (1-0,66) = 34% TABELA 3: EFICÁCIA DE VACINA
[0333] Estes dados sustentam que uma formulação de nanolipossoma contendo a mistura de agonistas de TLR sintéticos sinérgicos tem o potencial de gerar uma resposta protetora específica de antígeno e é compatível com a imunização assistida com micronutrientes.
EFEITOS DE COMPRIMENTO DE PEG
[0334] As Figuras 6 e 7 mostram que respostas mais elevadas foram observadas com formulações PEG2000 em comparação com PEG750. A Figura 6 mostra titulações equilibradas de IgG2a e IgG1 para o grupo GLA-3M-052 PEG2000 + LecA; houve também titulações mais elevadas para esse grupo em comparação com o grupo GLA-3M-052 PEG750 + LecA. Na Figura 7, foram investigados os efeitos do comprimento de PEG em uma resposta de IgA de mucosa fecal. A Figura 7 mostra que a resposta de IgA fecal para o grupo GLA-3M-052 PEG2000 + LecA foi maior do que para o grupo GLA- 3M-052 PEG750 + LecA. Dessa forma, um aumento no comprimento de PEG no lipossoma melhorou a resposta de IgA de mucosa.
EFEITOS DE ROTA DE ENTREGA
[0335] Foi investigado se a rota de entrega para a imunização tem efeitos sobre as respostas imunes. As Figuras 8A e B apresentam os efeitos da rota de entrega sobre a imunização com titulações de IgG2a e IgA mais elevadas que resultam do regime apenas IN (intranasal). Lipossoma + adjuvante produziram uma resposta imune da mucosa e sistêmica Till , IgA anti-LecA de intestino (16B).
[0336] As Figuras 9A e 9B apresentam adicionalmente vias de entrega. Um regime intranasal apenas gerou IFN-y equivalente e maior, e IL-17 em comparação com outros regimes. O regime apenas de mucosa de LecA + lipossoma + adjuvante produziu uma resposta imune robusta da mucosa e sistêmica Thl, IFN-y (9A e B, Tabela 4). Não se esperava que a administração intranasal gerasse uma resposta IgA (resposta sistêmica). Isto mostra que a entrega de mucosa de GLA e 3M-052 formulada no lipossoma com LecA gerou imunidade sistêmica. Esses resultados demonstram que uma administração não mucosal da composição produz uma resposta imune sistêmica robusta, como evidenciado pelas razões IgG2a/TgG1. Surpreendentemente, a administração da composição intranasalmente na superfícies da mucosa gera localmente não apenas uma resposta da mucosa nas passagens nasais, mas também a resposta da mucosa intestinal distal (fecal).TABELA 4: O REGIME APENAS INTRANASAL DE LECA + LIPOSSOMA + ADJUVANTE PRODUZIU UMA RESPOSTA IMUNE DE TH1 DE MUCOSA E SISTÊMICA ROBUSTA
DISCUSSÃO DE DETALHES
[0337] Um importante resultado desse estudo foi a identificação de um adjuvante do nanolipossoma contendo agonistas sintéticos de TLR com a capacidade de induzir uma resposta imune sistêmica e mucosa. O sistema adjuvante à base de lipossoma contendo os agonistas TLR4 (GLA) e TLR7/8 (3M-052) gerou uma resposta equilibrada humoral e uma forte resposta de citocina. GLA é um ligante TLR4 sintético que é formulado em plataformas lipídicas empregadas em vários testes clínicos de Fase 1 e 2. 3M-052 é um ligante TLR7/8 sintético em desenvolvimento pré-clínico avançado (Fox et al. Immunopotentiators in Modem Vaccines, 2a ed, na imprensa; Smirnov et al. Vaccine 2011, 29:5434; Zhao et al. J Imm another Cancer 2014, 2:12; Singh et al. J Immunol 2014, 193:4722). Uma formulação lipossômica de GLA e 3M-052 foi adequada para um regime de imunização parenteral/de mucosa misto e induziu também uma forte resposta da IgA da mucosa. Camundongos imunizados desafiados com E. histolytica mostraram uma redução substancial na carga de antígeno. A formulação de nanolipossoma GLA 3M-052 era compatível com o uso de todo o ácido all-trans retinoico como coadjuvante e tal regime aumentou ainda mais a eficácia de proteção e os níveis de IgA da mucosa.
EXEMPLO 2: FORMULAÇÃO E TESTE DE ADJUVANTES 3M-052 PARA VACINAS DA GRIPE MATERIAIS E MÉTODOS FORMULAÇÃO DE MATERIAIS E FABRICAÇÃO
[0338] 3M-052 foi sintetizado em casa pela 3M Company. R848 foi fornecidos pela 3M ou adquirido junto à Axxora Life Sciences Inc. (São Diego, CA, EUA). 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina sintético (DPPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2 dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC) , 1,2-diexadecanoil-sn-glicero-3-fosfo- (1'-rac-glicerol) (DPPG), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-dipalmitoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-750] (DPPE PEG750), e fosfatidilcolina de ovo (PC) foram adquiridos junto à Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, EUA) ou Lipoid LLC (Newark, NJ, EUA). O esqualeno foi obtido junto à Sigma (St. Louis, MO). Colesterol, fosfato de amônio monobásico e fosfato de amônio dibásico foram adquiridos junto à J.T. Baker (São Francisco, CA, EUA). O poloxâmero 188 e o glicerol foram adquiridos junto à Spectrum Chemical (Gardena, CA, EUA). Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) a pH 7,2 foi adquirida à Invitrogen (Grand Island, NY, EUA).
[0339] Pequenos lotes (<20 ml) de formulações de lipossomas PEGuilados foram produzidos pela combinação de DPPC, colesterol e DPPE-PEG750 com várias quantidades de 3M-052 em solvente orgânico (mistura de clorofórmio ou clorofórmio/metanol /água). O solvente orgânico foi, então, evaporado com o uso de um Genevac EZ-2. O filme lipídico foi reidratado em PBS (pH 7,2) ou tampão de fosfato de amônio 25 mM (pH 5,7) e sonicado em um banho de água de sonicação powersonic CP230D da Crest (Trenton, NJ, EUA) a ~60 °C por ~2 a 3 h ou até que a formulação ficasse translúcida com nenhuma partícula grande visível. O mesmo procedimento foi seguido para lipossomas neutros (DOPC, colesterol), lipossomas aniônicos (DPPC, colesterol, DPPG) e lipossomas catiônicos (DPPC, colesterol, DPTAP). As razões de peso dos componentes lipossômicos foram as seguintes: PEGuilado (18:5,5:3, DPPC:col:DPPE-PEG750), neutro (20:5, DOPC:col), aniônico (18:5:2, DPPC:col:DPPG), catiônico (18:5:2, DPPC:col:DPTAP). Lotes maiores (100 ml) de lipossomas PEGuilados foram fabricados como acima, mas com menor tempo de sonicação seguido por homogeneização de alto cisalhamento (Microfluidizer M110P) durante 12 passagens contínuas a 206,8 MPa (30.000 psi).
[0340] Os lipossomas contendo R848 foram preparados por meio da fabricação de uma composição de lipossomas PEGuilados concentrados como descrito acima, exceto que os lipossomas foram inicialmente hidratados com solução de sulfato de amônio 75 mM. Após sonicação a 60 °C ~ 1 h, foi usada uma coluna PD-10 (GE Healthcare) para trocar o tampão externo dos lipossomas por solução salina a 0,9%. Os lipossomas agora contendo solução salina no seu tampão externo e sulfato de amônio no seu interior, foram misturados com uma solução salina contendo R848 e incubados durante 1 h a 60 ° C. Finalmente, os lipossomas foram passados através de outra coluna PD-10 para remover o R848 não encapsulado.
[0341] As emulsões estáveis em óleo-em-água (SE) foram fabricadas dissolvendo 3M-052 em clorofórmio com DMPC ou PC de ovo. O clorofórmio foi, então, removido com o uso de um evaporador giratório. O esqualeno foi, então, adicionado ao filme lipídico seco e o recipiente de vidro foi colocado em um banho de água com sonicação a 60 °C durante ~ 1 h. Essa mistura é referida como a fase oleosa. Alternativamente, a fase oleosa foi preparada por dispersão de 3M-052 diretamente em esqualeno e DMPC (sem clorofórmio ou PC de ovo). Uma fase aquosa foi, então, adicionada à fase oleosa para obter concentrações finais de 25 mM de tampão de fosfato de amônio, 0,037% (em p/p) de poloxâmero 188 e 1,8% (em v/ v) de glicerol (agente isotônico), 4% em v/ v de esqualeno, 7,6 mg/ml de DMPC ou PC de ovo, e várias quantidades de 3M-052. Algumas emulsões também continham 0,02% em v/v de α-tocoferol. A emulsão bruta foi criada por sonicação da mistura no banho de água a 60 °C durante mais 10 a 15 minutos. A emulsão final foi preparada processando a emulsão bruta através de um homogeneizador de alto cisalhamento (Microfluidizador M110P) para ~ 12 passagens contínuas a 206,8 MPa (30.000 psi).
[0342] As emulsões foram preparadas com R848 fabricando uma emulsão concentrada como descrito acima e misturando com R848 em pó seco ou com uma solução de R848 em tampão de fosfato de amônio. Emulsões e lipossomas foram filtrados através de uma membrana de 0,2 μm antes dos experimentos in vivo descritos abaixo.
CARACTERIZAÇÃO DE FORMULAÇÃO
[0343] As concentrações de 3M-052 e R848 foram estimadas diluindo primeiro cada formulação 20 vezes em uma solução de etanol a 98% /HC1 a 2% em uma cubeta. As amostras foram analisadas em um espectrofotômetro Hitachi U-3900H (Tóquio, Japão) para absorbância a -322 nm. O tamanho de partícula foi avaliado usando um Zetasizer Nano-S, -ZS ou - APS da Malvern Instruments (Worcestershire, Reino Unido). As formulações foram diluídas 100 vezes em água ultrapura em uma cubeta descartável de poliestireno de 1,5 ml. Para cada formulação, foram preparadas três cubetas separadas. Todas as medições de tamanho foram feitas três vezes para cada cubeta. Os potenciais zeta foram medidos usando Nano-ZS Zetasizer da Malvern. Para cada formulação, 50 μl foram combinados com 950 μl de água ultrapura em uma célula capilar descartável (Malvern Instruments, DTS1070). Nove medições foram coletadas de cada amostra preparada (uma amostra por formulação).
VACINAS E ESTOQUES DE VÍRUS
[0344] Antigênios de vacina usados neste estudo foram todos derivados do vírus da gripe A/Vietnã/1203/04 (VN1203). A proteína de HA recombinante (rHA) usada em estudos de imunogenicidade e desafio de murinos foi obtida junto à Protein Sciences Corp. Para estudos de imunização e desafio de furões, foi obtida uma vacina de grau clínico VNI203 junto à Sanofi Pasteur. Os estoques de vírus para estudos de desafio de murino e furão foram gerados por inoculação de ovos de galinha embrionados com 10 dias de vida com estoques de H5N1 como indicado. O fluido alantoico clarificado foi filtrado e armazenado a -80 °C até utilização. As titulações de vírus foram determinadas pelo ensaio de placa em células MDCK (ATCC n° CCL-34) com o uso de ensaios padrão e como descrito.
ENSAIO DE ESTIMULAÇÃO DO SANGUE TOTAL DE FURÃO
[0345] O sangue total coletado de furões machos Fitch foi coletado e incubado com compostos agonistas de TLR incluindo Imiquimod (TLR7), o agonista de TLR7/8 CL057 (Invivogen) e o agonista de TLR4 sintético GLA. Após a incubação, o RNA foi coletado de ambos os controles, estimulado e salino, usando um kit de extração de sangue total de RNA (Qiagen). Níveis de RNA parafor TLR7, TLR8, IL-1 P e IL-8 foram determinados por PCR em tempo real. As alterações no nível de expressão foram representadas graficamente como alteração de dobra nos níveis de RNA em relação às amostras de sangue estimuladas com solução salina.
ESTUDOS DE DESAFIO DE MURINO
[0346] Para estudos de desafio de murino, grupos de camundongos fêmeas C57B1/6 com 6 a 8 semanas foram imunizados com proteína HA de H5N1 recombinante (cepa VN1203, Protein Sciences Corp.) combinada com adjuvante conforme indicado. Todas as imunizações foram realizadas por via intramuscular em um volume total de 100 μl dividido igualmente entre as duas pernas. Vinte e um dia após a imunização, os camundongos foram desafiados com 1 x 106 PFU de A/VN/1203/05 (H5N1, Clado 1). Começando um dia após o desafio, todos os animais foram monitorados para perda de peso e observados para sinais de infecção grave. Animais que perderam >25% do peso do dia 0 foram eutanizados.
ESTUDOS DE DESAFIO DE FURÃO
[0347] Furões machos Fitch (Mustelaputorisfero, Triple F Farms, Sayre PA) foram usados para todos os estudos de imunização e desafio. A imunização dos furões foi realizada por injeção de 250 μl no músculo quadríceps. Todos os animais receberam 0,5 pg de uma vacina A/Vietnã/1203/04 H5N1 dividida (Sanofi Pasteur) proveniente do estoque nacional de pandemia. As amostras de soro para determinar os títulos de anticorpos foram recolhidas 21 dias após a imunização.
[0348] Desafio foi iniciado por instilação de 1 x 10’ - 5 x 105 PFU de vírus no pulmão em um volume de 50 μl (25 μl/nare). Após a infeção, os animais foram observados e pesados diariamente para monitorar a morbidade induzida pelo vírus. Qualquer animal perdendo 25% do peso pré- desafio foi eutanizado.
ENSAIO DE PLACA
[0349] As titulações de vírus foram obtidas por ensaio de placa em células de rim canino Madin-Darby (MDCK). Resumidamente, as células foram semeadas 24 horas antes do início do ensaio de placas de 6 cavidades a 1 x 106 células/cavidade em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina/estreptomicina. No início do ensaio, as monocamadas de MDCK confluentes foram lavadas três vezes com DMEM para remover o FBS. Amostras de lavagem nasal diluídas em série foram adicionadas a monocamadas em um volume de 100 e incubadas a 37 °C durante 60 minutos. Após a incubação, as monocamadas foram cobertas com 2 ml de Agarose a 0,8% (SeaKem) em meio 1 x L-15 (Lonza). Após 48 a 72 horas de incubação, as placas foram quantificadas após coloração com violeta cristalino (BD).
ENSAIO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO (HAI)
[0350] Os ensaios de inibição da hemaglutinina foram conduzidos de acordo com o protocolo da OMS. (52) Os antígenos de H5N1 inativados com formalina foram obtidos junto ao Instituto Nacional de Padrões e Controle Biológico (NIBSC). Todas as células foram ensaiadas com o uso de eritrócitos (RBC) de cavalo a 1% lavados (Lampire).
ENSAIO DE MICRONEUTRALIZAÇÃO
[0351] As titulações de anticorpos neutralizantes foram determinadas com o uso de partículas de lentivírus pseudotipadas. Resumidamente, partículas de pseudotipo são geradas por cotransfecção de células 293T com plasmídeos que expressam H5N1 e HA, e 3 plasmídeos de empacotamento de lentivírus; pDR8.74 (55), pRSV-Rev e HR'-CMV-Luc, que é empacotado nas partículas virais e codifica um transgene de luciferase sob o controle do promotor imediatamente precoce de CMV. Os estoques de vírus foram titulados em placas de 96 cavidades de fundo plano preto (Coming) semeadas 24 horas antes com 5 x 103 células MDCK/cavidade em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal de bovino (FBS). Antes da titulação do vírus, as células foram lavadas 3 vezes com 200 de DMEM para remover o DMEM e cobertas com estoques de vírus diluídos em série. Após 72 horas de incubação para permitir a expressão do transgene, os níveis de luciferase nas células transduzidas foram determinados com o uso de luciferase BrightGlo (Promega), de acordo com as instruções do fabricante.
[0352] Para análise de neutralização, o soro após imunização diluído em série foi misturado em uma razão de 1:1 com estoques de vírus diluídos contendo 1 x 104 unidades de luciferase relativas (RLU). As misturas de soro de vírus foram incubadas a 37 °C durante 1 hora e adicionadas a placas contendo células MDCK lavadas como acima. As titulações de neutralização foram determinadas após avaliação do nível de expressão da luciferase em todos os tecidos transduzidos. A titulação de anticorpo IC90 definido como a maior diluição de soro observada para reduzir os níveis de luciferase em 10 vezes em relação a células de controle transduzidas com vetor.
ARRANJOS DE HA
[0353] Foram descritos anteriormente Arranjos de HA contendo proteínas de HA da gripe (56). Os arranjos usados neste estudo são de segunda geração e contêm 278 proteínas de HA de uma variedade de cepas de gripe (Sinobiológica). Para análise imunológica pós-vacinação, os arranjos foram inicialmente bloqueados com PBS + Soro Fetal Bovino a 1% + Tween-20 a 0,1%, lavados três vezes com Tampão de Lavagem de Arranjo de Proteína (Arraylt) e incubados com 300 μl de diluição de 1:100 de soro do rato pós- imunização durante 1 hora com agitação. Após a incubação primária, os arranjos foram lavados 5 vezes com tampão de lavagem e incubados com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para IgG2c (Jackson Immunoresearch, n° Part: 115-495-208) e IgG1 (Life Technologies, n° Part: A21123) a uma diluição de 1:2.000. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, os arranjos foram enxaguados com Tampão de Lavagem (Arrayit) e analisados com o uso de um varredor de arranjo Molecular Dynamics 400B. A análise pós- aquisição foi feita com o uso do software de análise de dados Tableau.
ELISA
[0354] As titulações finais específicas de HA para IgG, IgG1 e IgG2c foram determinadas sete dias e vinte e um dias após a imunização. Placas de 384 cavidades de poliestireno de ligação elevada foram revestidas com HA recombinante de VN1203 (Protein Sciences Corp.) (2/ml) em tampão de revestimento de bicarbonato 0,1 M durante 2,5 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS-Tween 20 a 0,1% antes e depois de uma incubação de bloqueio de duas horas com PBS-Tween 20 a 0,05% + BSA a 1% à temperatura ambiente. Os soros de camundongo foram diluídos em série em PBS-Tween 20 a 0,05% + BSA a 0,1% com o uso de Nanonscreen NSX-1536 e incubados durante a noite a 4 °C e lavados cinco vezes. As placas foram incubadas durante 1 hora no agitador com IgGT, IgG1 ou IgG2c-HRP anti- camundongo (Southern Biotechnologies). Após cinco lavagens, foram desenvolvidas placas no robô Nanoscreen com o uso do substrato de tetrametilbenzidina SureBlue (Kirkegaard & Perry Laboratories). A reação enzimática foi parada com H2SO4 1 N com o uso do robô Multipette Sagian. As placas foram lidas a 450 a 570 nm com o uso do leitor de placas Synergy ELISA (Biotek) e o software Gen5.
MANCHAMENTO DE CITOCINA INTRACELULAR
[0355] A fim de quantificar as respostas das células T específicas da vacina, os esplenócitos foram isolados de cinco camundongos por grupo após a vacinação. Os eritrócitos foram lisados com o uso de tampão de lise de eritrócitos (eBioscience) e ressuspensos em cRPMI 1640 (FBS a 10%, penicilina/estreptomicina a 1%; 2-mercaptoetanol a 0,1%). As células foram plaqueadas a 10 células/cavidade em placas de 96 cavidades e foram estimuladas durante 2 horas com meio ou antígeno rHA (10 μg/ml) a 37 °C. Foi adicionado 1:50 de GolgiPlug (BD Biosciences) e as células foram incubadas durante mais 8 horas a 37 °C. As células foram lavadas e coradas à superfície com anticorpos marcados com fluorocromo a 1:100 em BSA-PBS a 1% para CD4 (clone RM4-5), CD8 (clone 53-6. 7), CD44 (clone IM7) e B220 (RA3- 6B2) (BioLegend e eBioscience) na presença de anti-CD16/32 (clone 93) por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. As células foram fixadas e permeabilizadas com Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas com Perm/Wash (BD Biosciences) e manchadas com anticorpos marcados com fluorocromo para detectar citocinas intracelulares da seguinte forma: IFN-y (clone XMG-1.2), IL-2 (JES6-5H4), TNF (MP6- XT22), IL-5 (clone: TRFK5) e IL-10 (clone: JES5-16E3) (BioLegend e eBioscience). O manchamento foi executado por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas, ressuspensas em BSA-PBS a 1% e filtradas com o uso de uma placa de filtro PP/PE 96 de 30 a 40 ppm (Pall Corp). Até 106 eventos foram coletados em um citômeto de fluxo LSR Fortessa de quatro lasers (BD Biosciences). Os dados foram analisados com FlowJo (Treestar).
RESULTADOS
[0356] Os lipossomas baseados em DPPC modificados com fosfolipídeos aniônicos, catiônicos ou PEGuilados e um lipossoma neutro à base de DOPC foram fabricados pela técnica de filme fino seguida por sonicação. Os lipossomas foram fabricados a uma concentração elevada de 3M-052 de 1 mg/ml de modo a destacar qualquer tendência para incompatibilidade com as várias composições de lipossomas. Após dois lotes separados para cada lipossoma, o lipossoma PEGuilado e o lipossoma de DOPC demonstraram uma aparência translúcida e o menor tamanho de partícula e polidispersão após a sonicação (Tabela 5).TABELA 5: PROPRIEDADES DE FORMULAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE LIPOSSOMA E EMULSÃO DE 3M-052* Lipossomas e emulsões foram fabricados para conter 1 mg/ml de 3M-052 ou 0,04 mg/ml de 3M-052, respectivamente
[0357] O lipossoma PEGuilado foi selecionado para avaliação in vivo e estabilidade adicional. Os lipossomas PEGuilados foram carregados negativamente (Tabela 6), mais provavelmente devido ao grupo fosfato aniônico de DPPE-PEG750.TABELA 6: POTENCIAIS ZETA DE FORMULAÇÕES REPRESENTATIVAS DE LIPOSSOMA E EMULSÃO CONTENDO 3M-052 O teor de 3M-052 não foi medido para esses lotes, mas foi estimado em 0,04 mg/ml com base nos lotes subsequentes fabricados usando o mesmo processo.
[0358] Os lipossomas demonstraram pouca ou nenhuma alteração no tamanho das partículas durante pelo menos 6 meses a 5 °C (Figuras 10A e 10B). Em geral, nenhuma perda de 3M-052 durante a fabricação foi evidente.
[0359] As formulações de emulsão óleo-em-água à base de esqualeno (SE) de 3M-052 foram fabricadas por microfluidização, gerando gotículas de tamanho <100 nm com baixa polidispersidade e estabilidade de tamanho de partícula a longo prazo (Figuras 10A a 10B). Os valores do potencial zeta da emulsão foram ligeiramente negativos (Tabela 6). Surpreendentemente, as emulsões fabricadas com PC de ovo em vez de DPMC resultaram em maior recuperação de 3M-052 após o processamento. Além disso, adicionando uma etapa de mistura inicial de combinação de 3M-052 com PC de ovo em clorofórmio aumentou ainda mais a recuperação de 3M-052 em comparação com sonicação do pó seco em esqualeno/PC de ovo sem clorofórmio. Assim, alterações na composição da emulsão e no processo de processamento tiveram efeitos significativos na incorporação do 3M-052 na formulação final. Consulte a Tabela 7 abaixo TABELA 7 - RECUPERAÇÃO DE 3M-052 APÓS FABRICAÇÃO DE EMULSÃO
3M-052 FORMULADO COMBINADO COM HA DE H5N1 PROTEGE CAMUNDONGOS DO DESAFIO LETAL DE H5N1 APÓS UMA ÚNICA IMUNIZAÇÃO
[0360] Após a demonstração da estabilidade das formulações adjuvantes de 3M-052 (Figuras 10A e B), a capacidade desse agonista de TLR foi investigada para melhorar respostas de vacina específicas de HA. 3M-052 formulado em lipossomas PEGuilados ou em uma emulsão de óleo-em-água de esqualeno (SE) foi misturado com uma proteína de HA de gripe H5N1 recombinante (cepa A/Vietnã/1203/04 [VN1203], Protein Sciences Corp., Meridien CT ) e usado para imunizar grupos de camundongos C57B1/6 (N = 20/grupo) por via intramuscular. Vinte e um dias após uma única imunização, todos os camundongos foram desafiados intranasalmente com 1000 LD50 de VN1203. Dez animais foram acompanhados por 14 dias para determinar a morbidade induzida por vírus, medida pela perda de peso, assim como a mortalidade. Em uma formulação adjuvante lipossômica, 3M-052 preveniu a morbilidade induzida pelo vírus; 100% dos animais que receberam rH5 + 3M- 052-lipossoma sobreviveram em comparação com 50% dos animais que receberam rH5 ou rH5 combinado com lipossomas apenas (Figura 11 A). Os camundongos imunizados com rH5 + 3M-052-lipossomas não apresentaram perda de peso, enquanto que os animais que receberam rH5 com ou sem lipossomas perderam peso durante 11 dias após o desafio. (Figura 11B). Animais que receberam formulações à base de emulsão mostraram sobrevivência consistente tanto com quanto sem 3M-052 (Figura 11A), consistente com a eficácia conhecida das emulsões como adjuvantes da gripe. No entanto, os animais que receberam emulsões combinadas com os agonistas de TLR 7/8 mostraram perda de peso reduzida durante o período de infecção aguda em comparação com os animais que receberam rH5 + SE. (Figura 11C).
[0361] Além dos animais monitorizados quanto à sobrevivência, 5 animais/grupos foram eutanizados aos 4 e 7 dias após o desafio para medir/observar a patologia induzida pela gripe no pulmão e para determinar as titulações virais no pulmão. Aos 4 dias após o desafio, os animais imunizados com formulações adjuvantes de rH5 + 3M-052 tinham titulações de vírus de pulmão significativamente reduzidas em relação aos controles não imunizados. Os animais imunizados com rH5 + 3M-052-lipossomas não tinham titulação de vírus detectável nesse ponto no tempo (Figura 11D). No dia 7, os animais que receberam formulações adjuvantes à base de 3M-052 tinham titulações de vírus mínimas em relação a rH5 sozinho. Para lipossomas e formulações à base de SE, a adição de 3M-052 resultou em titulação significativamente reduzida em relação à mesma formulação sem TLR (Figura 11E). Além da redução das titulações de vírus, os animais imunizados com formulações adjuvantes rH5 + 3M-052 mostraram um peso pulmonar significativamente menor (Figura 1 IF) e escores reduzidos de patologia de pulmão (Figura 11G). Tomados em conjunto, esses resultados demonstram a capacidade de 3M-052 proteger os camundongos mesmo contra sequelas clínicas do desafio da gripe aviária letal. A Figura 11H mostra a titulação de vírus de pulmão.
FORMULAÇÕES DE ADJUVANTE 3M-G52 INDUZEM UMA RESPOSTA DE CÉLULA T DE THL EM CAMUNDONGOS
[0362] Para investigar os correlatos de proteção para as formulações de adjuvante contendo 3M-052, foram examinadas as respostas de células T CD4 induzidas após imunização com rH5 em combinação com adjuvantes. Após uma única imunização, a produção de citocinas a partir de células T CD4 + foi examinada. Níveis baixos, mas detectáveis, de células positivas para citocinas Thl (IFNy/TNFa/IL-2) poderiam ser demonstrados em animais imunizados com formulações adjuvantes 3M-052 (Figuras 12A a 12C). Células T CD+ canônicas puderam ser observadas em todas as formulações adjuvantes que se mostraram protetivas em animais. Consistente com o trabalho anterior, esses dados demonstram a capacidade de 3M-052 induzir uma resposta celular na direção de Thl em camundongos após a vacinação com baixos níveis de antígeno. FORMULAÇÕES ADJUVANTES 3M-052 INDUZEM UMA RESPOSTA DE ANTICORPO DE SUBTIPO TRANSVERSAL AMPLIADO PARA HA DE H5N1 Uma indução de células T CD4 de Thl (IFNy TNFa+IL-2+) após a imunização com adjuvantes 3M-052 formulados foi observada (Figura 12). Com o uso de um arranjo de proteína de HA de alta densidade de segunda geração, foi investigada a capacidade de 3M-052 para ampliar a resposta de anticorpo induzida por um antígeno rH5 do Clado 1. O arranjo de HA usado nesse estudo contém 278 proteínas individuais de HA, incluindo pelo menos um representante dos subtipos de HA 1 a 16. A capacidade de os anticorpos IgG1 e IgG2c se ligarem a proteínas de HA de diferentes subtipos foi investigada. A adição de adjuvantes aumentou o nível de anticorpo induzido após uma imunização de reforço. Os adjuvantes de SE e lipossoma mostraram uma ligação aumentada das proteínas do subtipo H5 e foram predominados pelas respostas de IgG1. A adição de 3M-052 a qualquer formulação resultou na ampliação significativa da resposta de anticorpo, com ligação a uma ampla faixa de subtipos de HA, bem como a indução de anticorpos IgG2c de reação cruzada. (Dados não mostrados)
[0363] O exame das cepas H5 no arranjo demonstrou claramente uma resposta de ligação cruzada após imunização com formulações 3M-052. Ambos os animais imunizados com 3M-052-Lipossoma e 3M-052-SE mostraram níveis aumentados de anticorpo IgG2c que se ligam a proteínas de múltiplos clados do vírus H5N1. Em contrapartida, os níveis de IgG1 não eram dependentes da presença de 3M-052. De modo a verificar os resultados dos arranjos de HA, determinou-se a titulação final do anticorpo no soro de camundongo pós-imunização por ELISA, com o uso de VN1203 HA como antígeno de revestimento. Os resultados observados por ELISA sérico espelharam aqueles observados no arranjo de HA. (Dados não mostrados)
AGONISTAS DE TLR 7/8 MELHORAM MRNA DE CITOCINA E RECEPTOR EM SANGUE TOTAL DE FURÃO
[0364] A fim de confirmar que as imidazoquinolinas têm a capacidade de estimular os receptores de TLR cognatos em furões, foi executado um ensaio de estimulação do sangue total. Sangue total de furões Fitch machos foi coletado e estimulado com imidazoquinolinas ou com o agonista de TLR4 sintético Lipídeo A de Glucopiranosila (GLA). A capacidade de as moléculas agonistas estimular tanto as citocinas como o mRNA de receptor de TLR foi examinada com o uso de PCR em tempo real. Estimulação do sangue total com 100 μM de R848 (em outras espécies um agonista de TLR7/8 conhecido, 3M) e 100 μM de CL075 (em outras espécies um agonista de TLR8 conhecido, Invivogen) resultou em aumentos significativos em mRNA de IL-1B, IL-8, TLR7 e TLR8. Esse resultado demonstra a capacidade de as imidazoquinolinas estimular os receptores de furão, e sugere que os furões têm ambos os TLR7 e TLR8 ativos que podem desempenhar um papel nesse modelo de doença da gripe.
ADJUVANTES 3KE052 FORMULADOS MELHORAM (COMBINADOS COM ANTÍGENOS H5N1) A PROTEÇÃO CONTRA O DESAFIO DO H5N1 EM FURÕES APÓS UMA ÚNICA IMUNIZAÇÃO
[0365] Dados resultados promissores em camundongos, e a verificação de que as imidazoquinolinas podem estimular TLR de furão, examinou-se a capacidade de adjuvantes contendo 3M-052 para proteger furões que constituem o desafio letal de H5N1 após uma única imunização. Para esses estudos, os adjuvantes de lipossoma neutro e SE com e sem 3M-052 foram combinados com uma vacina de vírus dividido H5N1 (Sanofi) derivada de VN1203 (SP-H5). Esse antígeno foi escolhido porque está atualmente incluído no estoque nacional de pandemia para os Estados Unidos e foi testado clinicamente em estudos anteriores. Resumidamente, seguindo um estudo de variação de dose apenas com o antígeno H5N1 (dados não mostrados), grupos de 4 a 6 furões foram imunizados via intramuscular com 0,5 μg de SP-H5 misturado com adjuvantes como indicado (Figura 13). Vinte e um dias após a imunização, os furões foram desafiados por via intranasal com 106PFU de A/VN/1203/04, e acompanhados por 14 dias para perda de peso, escores clínicos e sobrevida. Além disso, lavagens nasais foram coletadas em dias alternados, começando um dia após o desafio. Em um estudo, 3M-052/SE protegeu completamente os animais do desafio, comparado com animais imunizados com SP-H5 + SE (Figura 13A). 3M-052/SE também reduziu a morbidade induzida por vírus em comparação com SE sozinho; os animais imunizados com SP-H5 + 3M-052/SE não perderam peso após o desafio (Figura 13B), e apresentaram escores clínicos mínimos ao longo da infecção (Figura 13C). Resultados similares foram observados em um segundo experimento após a imunização de animais com formulações adjuvantes lipossômicas. 3M-052- Lipossomas protegeram 100% dos animais contra o desafio (Figura 13E). Semelhante às formulações a base de SE, os animais imunizados com lipossomas SP-H5 + 3M-052 não perderam peso (Figura 13F), e apresentaram escores clínicos insignificantes (Figura 13G). Talvez o mais importante, o exame de titulações de vírus de pulmão mostra que, tanto nas formulações SE quanto em lipossomas, 3M-052 tem a capacidade de reduzir a liberação de vírus nas lavagens nasais; animais imunizados com 3M-052/SE (Figura 13D) ou 3M- 052/Lipossomas (Figura 13H), mostraram reduções significativas logo 3 dias após o desafio em comparação com outros adjuvantes ou animais de controle. Em ambos os casos, o vírus foi eliminado para níveis indetectáveis no dia 5 em todos os animais que receberam adjuvantes 3M-052.
AS FORMULAÇÕES ADJUVANTES 3M-Q52 INDUZEM UMA RESPOSTA DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE CLADO CRUZADO EM FURÕES
[0366] Com base na ampla resposta de anticorpos específicos de HA observada em camundongos e na proteção robusta observada contra vírus homólogos em furões, as titulações de anticorpos neutralizantes induziram, após a imunização com diferentes formulações de adjuvantes com o uso de um lentivírus pseudotipado de HA H5N1, o vetor que empacotada um transgene de Luciferase foi diretamente examinado . Resumidamente, amostras de soro diluídas em série foram incubadas com partículas lentivirais contendo proteínas de HA e NA de H5N1 sobre a sua superfície. As misturas de vírus-soro foram incubadas em monocamadas confluentes de células MDCK. Após a incubação para permitir a expressão do transgene da luciferase empacotado no vírus, a neutralização potencial das amostras de soro foi determinada por quantificação da expressão do gene da luciferase. Consistente com o aumento da sobrevida observado nesses estudos, os adjuvantes 3M-052/SE e 3M-052-Lipossomas aumentaram as titulações de neutralização IC90 no soro 21 dias após uma única injeção. (Figuras 14A, D).Adicionalmente, ambas as formulações aumentaram significativamente as titulações de neutralização para vírus Clado 2, foram observadas titulações de IC90 aumentadas para A/ Indo/5/05 [Clado 2.1] e A/Whooper swan/Mongólia/244/05 [Clado 2.2] (Figuras 14B a F). Essa descoberta é consistente com a capacidade de 3M-052 formulado para induzir amplas titulações de anticorpos neutralizantes funcionais a cepas de gripe derivadas.
3M-052-SE INDUZ UMA RESPOSTA PROTETORA DE CLADO CRUZADO
[0367] Dados as titulações neutralizantes que foram observadas em A/Whooper swan/Mongólia/244/05 após a imunização com antígenos VN1203, investigou-se a capacidade de a formulação 3M-052 reduzir a replicação do vírus no pulmão após a vacinação com o antígeno VN1203. Tal como nos estudos anteriores, os furões foram imunizados uma vez com SP-H5 combinado com o 3M-052 formulado e desafiados 21 dias 5 x 105 PFU de vírus. Os animais que receberam 3M-052/lipossomas apresentaram uma diminuição modesta na libertação de vírus ao longo do tempo; os animais que receberam 3M-052/Lipossomas não tinham vírus detectáveis 5 dias após o desafio, enquanto outros animais que receberam lipossomas ou antígeno só tinham vírus detectáveis essa vez . (Figura 15B). Em contrapartida, os animais que receberam 3M-052-SE eliminaram rapidamente o vírus, sem placas detectáveis a partir de 3 dias após o desafio, enquanto aqueles que receberam SP-H5 + SE mostraram titulações de vírus detectáveis até ao dia 5. (Figura 15A).
DISCUSSÃO DE DETALHES
[0368] Os resultados apresentados aqui demonstram proteção em camundongos e furões após o desafio de alta dose (1000 LD50) com vírus H5N1 quando os animais são imunizados com o agonista TLR7/8 3M-052 formulado. O 3M-052 é incorporado em qualquer formulação e essas formulações são estáveis por longos períodos. Observou-se que uma nova formulação de lipossomas PEGuilados de 3M-052 aumenta a sobrevivência e diminui a titulação de vírus de pulmão quando combinada com uma dose baixa (100 ng) de um antígeno recombinante à base de HA. Adicionalmente, foi testada uma formulação que incorpora 3M-052 e DMPC ou PC de ovo em uma emulsão de óleo-em-água de esqualeno, e mostrou maior sobrevivência e titulação de pulmão reduzida com essa formulação em combinação com rHA. Observou-se a indução de células T CD4 + Thl em animais imunizados com 3M-052. Consistente com uma indução de células T CD4 + Th, foi observado um aumento de anticorpos IgG2c em animais imunizados com 3M-052. A capacidade de formulações adjuvantes contendo 3M-052 induzir a proteção contra cepas de vírus homólogas e heterólogas, bem como a estabilidade prolongada de adjuvantes 3M-052 formulados indica que essas formulações são adequadas para estocagem. Além disso, a compatibilidade desses adjuvantes com os antígenos da vacina pré-pandêmica atualmente incluídos no estoque nacional é demonstrada, e mostra que uma vacina combinada tem a capacidade de proteger furões contra ambos os isolados de linhagem e emparelhados.
EXEMPLO 3: VERSATILIDADE DE LIPOSSOMA PEGUILADO
[0369] Para testar a versatilidade da formulação lipossômica PEGuilada, foram adicionados lipídeos adicionais à formulação básica de colesterol, lipídeo neutro não PEGuilado e lipídeo PEGuilado. A adição de um ou mais lipídeos neutros adicionais e um ou mais lipídeos catiônicos adicionais não afetou negativamente a estabilidade ou a eficácia da formulação lipossômica resultante (dados não mostrados).

Claims (15)

1. Lipossoma caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um antígeno (b) um colesterol; (c) um lipídeo neutro não PEGuilado, (d) um lipídeo PEGuilado, em que o peso molecular médio do PEG no lipídeo PEGuilado é de 2.000 Daltons, em que a razão molar lipídica do lipídio neutro não PEGuilado : colesterol : lipídio PEGuilado é 9,8 : 5,7 : 0,8 ou 18 : 5,5 : 3; e (e) agonistas que compreendem GLA e 3M-052, em que há pelo menos duas vezes mais GLA do que 3M-052 em peso e em que o GLA compreende um GLA sintético de fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um GLA sintético de fórmula (VI): ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1, R3, R5 e R6 são alquila C11-C20; e R2 e R4 são alquila C12-C20
2. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende um lipídeo neutro.
3. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado é DSPE, DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE.
4. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o componente lipídico do lipídeo PEGuilado compreende uma cadeia alquila C14, uma cadeia alquila C16 ou uma cadeia alquila C18.
5. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o lipídeo neutro não PEGuilado é DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE ou DMPE.
6. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o lipídio neutro não PEGuilado compreende uma cadeia alquila C14, uma cadeia alquila C16 ou uma cadeia alquila C18.
7. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o lipossoma é estável por 1 mês a uma temperatura de 2 °C a 8 °C; e/ou b) o índice de polidispersidade do lipossoma é mantido em 0,3 ou menos; e/ou c) o tamanho do lipossoma é menor que ou igual a 450 nm.
8. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o percentual molar (% molar) do lipídeo PEGuilado no lipossoma é 1% molar a 25% molar, o percentual molar de colesterol no lipossoma é 1% molar a 50% molar e o percentual molar de lipídeo neutro não PEGuilado no lipossoma é 45% molar a 98% molar.
9. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a % molar do lipídio PEGuilado no lipossoma é 5% molar, a % molar de colesterol no lipossoma é 50 % molar e a % molar de lipídio neutro não PEGuilado no lipossoma é 45 % molar.
10. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que R1, R3, R5 e R6 são alquila C11; e R2 e R4 são alquila C13.
11. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que há 2,5 vezes mais GLA do que 3M-052 em peso.
12. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o antígeno compreende H5N1 ou LecA.
13. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antioxidante.
14. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o antioxidante compreende ácido ascórbico, bissulfito de sódio ou α-tocoferol.
15. Método de fabricação de um lipossoma PEGuilado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) misturar o antígeno, o lipídeo neutro não PEGuilado, o lipídeo PEGuilado, os agonistas que compreendem GLA e 3M-052 e o colesterol em um solvente orgânico, (b) evaporar o solvente orgânico, gerando, assim, um filme lipídico; (c) reidratar o filme lipídico em um tampão; e da etapa (c). (d) sonicar, microfluidizar ou extrudar o produto reidratado da etapa (c).
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