CZ298347B6 - Fúzní protein z rodiny MAGE, kódová sekvence nukleové kyseliny, vektor, hostitelská bunka, vakcina a použití fúzního proteinu pro výrobu vakciny - Google Patents

Abstract

Podstatu rešení tvorí fúzní protein z rodiny MAGE, sestávající z antigenu MAGE a fúzního partnera, pricemž fúzním partnerem je protein D nebo jeho derivát, NS1 protein influenzy nebo jeho fragment, nebo C-lytA ze Streptococcus pneumoniae nebo jeho fragment. Popsána je rovnež príslušná nukleová kyselina, vektor a hostitelská bunka. Rešení se týká také použití popsaného fúzního proteinu pro výrobu vakciny.

Description

Fúzní protein z rodiny MÁGE, kódová sekvence nukleové kyseliny, vektor, hostitelská buňka, vakcina a použití fúzního proteinu pro výrobu vakcíny

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká proteinových derivátů obsahujících antigeny asociované s nádory, které mohou být použitelné při protinádorove vakcinaci. Přesněji, deriváty podle předkládaného vynálezu zahrnují fúzní proteiny obsahující antigen kódovaný rodinou MÁGE genů (například MAGE-3, MAGE-1) navázaný a imunologický fúzní partner, který dodává epitopy pro T pomocné lymfocyty , jako je například lipidovaná forma proteinu D z Haemophilus iníluenzae B; chemicky modifikované MÁGE proteiny, ve kterých jsou disulfidové můstky redukovány a vzniklé thioly jsou blokovány a geneticky modifikované MÁGE proteiny opatřené afinitní koncovou a/nebo geneticky modifikované tak, aby bylo zabráněno tvorbě d i sulfidových můstků. Také jsou popsány způsoby pro přečištění MÁGE proteinů a pro přípravu vakcin pro léčbu různých zhoubných nádorů, včetně například melanomu, karcinomu prsu. plic. MSCLC, spinocelulárních karcinomů hlavy a krku, karcinomu tlustého střeva a karcinomu jícnu.

Dosavadní stav techniky

Antigeny kódované rodinou MÁGE genů jsou exprimovány především na mclanomových buňkách (včetně buněk maligního melanomu) a na buňkách některých jiných nádorů včetně NSCLC (nemalobuněčného karcinomu plic), spinocclulámího karcinomu hlavy a krku, urotcliálního karcinomu močového měchýře a karcinomu jícnu, ale nejsou detekovatelné na normálních tkáních s výjimkou varlat a placenty (Gaugler, 1949; Weynants, 1949, Patard, 1995). MAGE-3 je exprimován v 69% melanomu (Gaugler, 1994) a může být také detekován ve 44% případů NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48% případů spinocelulárního karcinomu hlavy a krku, 34% případů uroteliálního karcinomu močového měchýře, 57 % případů karcinomu jícnu, 32 % případu karcinomu tlustého střeva a 24 % případů karcinomu prsu (Van Pel, 1995; lnoue. 1995; Fujie, 1997; Nishimura, 1997). Nádory' exprimující MÁGE proteiny jsou známé jako nádory asociované s MÁGE.

Inumogenicita lidských mclanomových buněk byla elegantně prokázána v pokusech využívajících smíšených kultur mclanomových buněk a autologních lymfocytů. Tyto kultury často vytvářejí specifické cytotoxické T-lymfocyty (CTL) schopné lyžovat výlučně autologní melanomové buňky, ale ne autologní fibroblasty ani autologní lymfocyty transformované EBV (Kmitli, 1984; Anichiní, 1987). Nyní bylo identifikován několik antigenu rozpoznávaných na autologních melanomových buňkách těmito CTL klony, včetně antigenu MÁGE rodiny.

První antigen, který mol být definován pomocí rozpoznávání specifickými CTL na autologní melanomových buňkách, je označen MZ2-E (Van den Eynde, 1989) a je kódován genem MAGE-1 (van der Bruggne. 1991). CTL namířené proti M72-E rozpoznávají a lyžují MZ2-E pozitivní autologní melanomové buňky, stejně jako buňky od jiných pacient, pokud mají tyto buňky HLA.A1 alelu.

MAGE-1 gen náleží do rodiny 12 blízce příbuzných gen, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MÁGE-4. MAGE-5, MAGE-6, MÁGE-7, MAGE-8. MAGE-9, MÁGE 10, MAGE-11, MÁGE-12. umístěných na chromosomu X a majících 64 až 85% vzájemnou homologii v kódujících sekvencích (De Plaen, 1994), Tyto jsou někdy označovány jako MAGE-A1. MÁGE A2, MAGE-A3, MAGE-A4. MAGE-A5, MAGE-Áó. MAGE-A7. MAGE-A8. MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11. MAGE-A12 (MÁGE A rodina). Dvě další skupiny proteinů také náleží do MÁGE rodiny, ačkoliv jsou příbuzné o něco méně. Tyto patří do MÁGE B a MÁGE C rodiny. MÁGE B rodina zahrnuje MÁGE B1 (též známý jako MÁGE Xpl a DAM10). MÁGE B2 (též známý jako MÁGE Xp2 a DAM6), MÁGE B3 a MÁGE B4 - MÁGE C rodina

- 1 CZ 298347 B6 v současnosti zahrnuje MÁGE Cl a MÁGE C2. Obecně může být MÁGE protein definován jako protein obsahující specifickou jadernou sekvenci umístěnou v oblasti C-konce proteinu (například pro MÁGE Al protein o 309 aminokyselinách odpovídá specifická jaderná sekvence aminokyselinách 195-279).

s

Společná specifická jaderná sekvence může být zapsána následujícím způsobem, kde x představuje jakoukoliv aminokyselinu, zbytky uvedené malými písmeny jsou konzervované (konzervativní varianty jsou možné) a zbytky uvedené velký mi písmeny jsou zcela konzervované.

ίο Specifická jaderná sekvence:

LíxvL (2x)I(3x)g(2x) apEExiWexl (2x)m(3-4x)Gxe (3-4x)Gxc (3-4x)gxp (2x)l lt (3x) VqexYLxYxqVPxsxP (2x) yeFLWGprA (2x)Et(3x) kv

Konzervativní substituce jsou dobře známé a obyčejně jsou zadávány jako chybové skórovací matrice v počítačových programech pro seřazování sekvencí. Mezi tyto programy patří PAM250 (Dayhoft M.O. et al, (1978) „A model of evolutionary changes in proteins, v ..Atlas of Protein sequence and structure“. 5(3) M.O. Dayhoft (ed.) 345-352), National Biomedical Rcsearch Foundation, Washington, a Blosum 62 (Steven Hcnikoft and Jorja G. Henikoft (1992), „Amino 20 acid substitution matrices from protein blocks“), Proč, Nati. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

Obecně, substituce v následujících skupinách jsou konzervativní substituce, ale substituce mezi skupinami jsou považovány za nekonzervativní substituce. Těmito skupinami jsou:

(i) aspertat/asparagin/glutamat/glutamin:

(ii) serin/threonin:

(iii) lysin/arginin:

(iv) fenylalanin/tyrosin/lryptofan;

.to (v) leucin/isoleucin/valin/methionin;

(vi) glycin/alanin.

Obecně a v kontextu předkládaného vynálezu bude MÁGE, protein přibližně z 50% identický v tomto jaderném regionu s aminokyselinami 195-279 MÁGE Al.

Na MAGE-3 proteinu bylo identifikováno několik C ΓΕ epitopů. Jeden Lakový epitop, MAGE-

3.AI, je nepeptidová sekvence umístěná mezi aminokyselinami 168 a 176 MAGE-3 proteinu, která tvoří cpitop specifický pro CTL. pokud je prezentována společně s MHC molekulou třídy I HLA.AE Nově byly identifikována další CTL epitopy na peptidové sekvenci MAGE-3 proteinu 40 podle své schopnosti vyvolat CTL odpověď vc smíšené kultuře melanomových buněk a autologních lymfocytu. Tyto dva epitopy mají specifické vazebné motivy pro HLA.A2. (Val der Bruggen, 1994) a HLA.B44 (Herman. 1996) alely, v příslušném pořadí.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří fúzní protein z rodiny MÁGE sestávající z antigenů MÁGE a fúzního partnera, přičemž fúzním partnerem je protein D nebo jeho derivát, NS1 protein iníluenzy nebo jeho fragment, nebo C-lytA ze Streptococcus pneumoniae nebo jeho fragment.

V jednom provedení předkládaného vynálezu je derivátem fúzní protein obsahující aniigen z MÁGE proteinové rodiny navázaný na heterologní fúzní partner. Proteiny mohou být chemicky . 7 .

konjugované, ale výhodněji jsou exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny umožňující vyšší úroveň produkce v expresním systému ve srovnání snon-fúzními proteiny. Fúzní partner může napomáhat dodáváním epitopů pro T-pornoené lymfocyty (imunologický fúzní partner), výhodné epitopy pro T-pomocnc lymfocyty rozpoznávané člověkem, nebo může napomáhat 5 v expresi proteinu (zesilovač exprese) ve vyšším množství ve srovnání s přirozeným rekombinantním proteinem. Výhodně jc fúzní partner jak imunologickým fúzním partnerem, tak zesilovačem exprese.

Ve výhodném provedení vynálezu je imunologický fúzní partner odvozen od proteinu D, povrio citového proteinu gram negativní bakterie Haemophilus influenzae B (WO 91/18926). Výhodně obsahuje derivát proteinu D přibližně první 1/3 proteinu, přesněji přibližně prvních 100-1 10 N— koncových aminokyselin. Výhodně jc derivát proteinu D lipidovaný. Výhodně je prvních 109 zbytků fúzního partnera tvořeného lipoproteinem D obsaženo na N -konci pro dodání potenciálního vakcinačního antigenů s dalšími exogenními epitopy pro T-lymfocyty a tento fúzní partner 15 zvyšuje expresi v E. coli (takže působí jako zesilovač exprese). Lipidový konec zajišťuje optimální prezentaci antigenů buňkám prezentujícím antigen.

Mezi další fúzní partnery patří nestrukturální protein z chřipkového viru. NSI (hcinagglutinin). Obvykle je použito 81 N-tcrminální aminokyselin, ačkoliv mohou být použity jiné fragmenty. 20 pokud obsahují epitopy pro T-lymfocyty.

V jiném provedení je imunologickým fúzním partnerem protein známý jako LV I A. Výhodně je použita C-koncová část molekuly. LYTA je odvozen od Streptococcus pneuinoniae, který' syntetizuje N-acetyl-L-alanin amidasu, amidasu LYTA (kódovanou lytA genem (Gene, 43 (1986) str.

2 65-2 72), což je autolysin. který' specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanovcm skeletu. C-koncová doména LYTA proteinu je odpovědná za afinitu k cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako jc DEAE. lato vlastnost byla využita pro vývoj E. coli C-LYTA expresních plazmidů použitelných pro expresi fúzních proteinů. Přečištění hybridních proteinů obsahujících C-LYTA fragment na amino-konci bylo popsáno (Biotcchnology, 10. (1986), str. 795-798). 3u Výhodná provedení vynálezu využívaní repetitivní část Lyta molekuly na C-konci začínající zbytkem 178. Zejména výhodná provedení obsahují zbytky 188-305.

Imunologické fúzní partnery uvedené výše jsou také výhodné vtom, že napomáhají expresi. Konkrétně, takové fúzní proteiny jsou exprimovány s vyšším výtěžkem než přirozené rekombi35 nantní MÁGE proteiny.

Vynálezci demonstrovali, že při klinickém použití jsou takové konstrukty schopné léčit melanom.

V jednom případě byl pacient s melanomem ve stadiu IV zbaven metastas po dvou dávkách lipo D 1/3 MÁGE 3 His proteinu bez adjuvans.

V Jednom provedení předkládaný vynález proto obsahuje fúzní proteiny obsahující antigen asociovaný s nádory s MÁGE rodiny navázaný na imunologický fúzní partner. Výhodně je imunologický fúzní partner protein D nebo Jeho fragment, nejlépe lipoprotein D. MÁGE proteiny jsou výhodně MÁGE Al nebo MÁGE A3. Složka lipoprotcinu D je výhodně tvořena první 1/3 lipo- proteinu D.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou přednostně exprimovány v E. coli. Ve výhodném provedení jsou proteiny exprimovány s afinitní koncovkou, jako je například histidinová koncovka složená z 5 až 9, výhodně ze 6 histidinových zbytků. Tyto koncovky jsou výhodné v lom. že 5o napomáhají při přečištění.

Přeskládaný vynález také poskytuje nukleové kyseliny kódující proteiny podle předkládaného vynálezu. Taková sekvence mohou být inzertovány do vhodného expresního vektoru a použity v DNA/RNA vakcinaci, nebo mohou být exprimovány ve vhodném hostiteli. Mikrobiální vektory

- j CZ 298347 B6 cxprimující nukleové kyseliny mohou byt použity jako vakciny. Mezi takové vektory patří například pox virus, adeno virus, alfa virus, li ster i a a monarfág.

DNA sekvence kódující proteiny podle předkládaného vynálezu muže být syntetizována za použití standardních technik syntézy DNA, jako je enzymatická ligace popsána v D.M. Roberts et al. v Biochemistry 1985. 24: 5090-5098. chemická syntéza, enzymatická polymerizace in vitro nebo PCR technologie využívající například termostabilní polymerasu, nebo pomocí kombinace těchto technik.

Enzymatická polymerizace DNA muže být provedena in vitro za použili DNA polymeras jako je DNA polymerasa 1 (Klenovv fragment) ve vhodném pufru obsahujícím nukleosid-trifosfaty dATP, dCTP. dGTP a dTTP podle potřeb při teplotě 10 až 37 °C. obyčejně v objemu 50 μΐ nebo menší. Enzymatická ligace DNA fragmentů může být provedena za použití DNA lipasy, jako je T4 DNA ligasa. ve vhodném pufru. jako je 0,05 M Tris (pil 7,4). 0,01 M MgCE, 0,01 M dithiothreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP a OJ mg/ml hovězí sérový albumin, při teplotě od 4 °C do teploty okolí, obyčejně v objemu 50 ml nebo menším. Chemická syntéza DNA polymeru nebo fragmentu může být provedena běžnou fosfotriesterovou. fosfitovou nebo fosforoamiditovou metodou, za použití techniky syntézy na pevné fázi, jak je popsána v „Chem i ca 1 and Enzymatic Synthesis ofo Gene Fragments - A Laboratory Manual (cd. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), nebo v jiných vědeckých publikacích, jako jc například M.J. Gait. H.W. D. Matthcs. M. Singlu B.S, Sproat a R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982. 10: 6243; B.S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Lctters, 1983, 24: 5771; M.D. Matteucci a M.H. Caruthers. Tetrahedron Eettcrs, 1980. 21: 719; M.D. Matteuci a M.H. Caruthers. Journal of the Američan Chemical Society, 1981, 103: S.P. Adams et al.. Journal of the Američan Chemical Society, 1983, 105; 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McManus a H. Kocster, Nucleic Acids Research 1984. 12: 4539: a H.W. D. Matthes et al. EMBO Journal. 1984, 3:801.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být proveden za použití jakékoliv rekombinantní techniky, jako jsou například techniky popsané v Maniatis ct al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Přesněji, způsob může obsahovat kroky:

(i) přípravu replikovatelného nebo intcgrovatelného expresního vektoru, který je schopen cxprimovat v hostitelské buňce DNA polymer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo jeho imunogenní derivát;

(ii) transformaci hostitelské buňky uvedeným vektorem;

(iii) kultivaci uvedené transformované hostitelské buňky za podmínek umožňujících expresi uvedeného DNA polymeru pro produkci uvedeného proteinu; a (iv) získání uvedeného proteinu.

Termín ..transformování, jak je zde použit, označuje vložení cizorodé DNA do hostitelské buňky. l oto může být provedeno pomocí transformace, transfekce nebo infekce vhodného plazmidu nebo virového vektoru za použití běžných technik popsaných například v Genetics Engencering, ed. S.M. Kingsman a A.J. Kingsman: Blackwell Scienptific Publications, Oxford. England, 1988. Termíny ..transformovaná“ nebo „transformanl jsou zde použity na výslednou hostitelskou buňku obsahující a exprimujicí vybraný cizorodý gen.

Expresní vektory' jsou nove a tvoří také část předkládaného vynálezu.

Replíkovátelné expresní vektory mohou být připraveny způsobeni podle předkládaného vynálezu, štěpením vektoru kompatibilního s hostitelskou buňkou za zisku lineárního DNA segmentu mají

-4 CZ 298347 B6 čího intaktní replikou a kombinováním uvedeného lineárního segmentu sjednou nebo více molekulami DNA, které spolu s uvedeným lineárním segmentem kódují požadovaný produkt, jako je například DNA polymer kódující protein podle předkládaného vynálezu nebo derivát, za vhodných ligačních podmínek.

Tak může být DNA polymer vytvořen před nebo během konstrukce vektoru.

Volba vektoru bude provedena podle hostitelské buňky, která může být prokaryotická nebo eukaryotická, ale výhodně se jedná o E. coli nebo CHO buňky. Mezi vhodné vektory patří plazmidy. 10 bakteriofágy. kosmidy a rekombinantní viry.

Příprava replikovatelných expresních vektorů může být provedena běžnými způsoby za použití vhodných enzymů pro restrikci polymerizaci a ligaci DNA, podle způsobů popsaných například v Maniatis ct al., výše.

Rekombinantní hostitelská buňka je připravena vc způsobu podle předkládaného vynálezu transformováním hostitelské buňky replikovalelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu za transformačních podmínek. Výhodnými transformačními podmínkami jsou běžné podmínky a jsou popsány například v Maniatis et al., výše, nebo v „DNA Cloning“. svazek 11, D.M. 20 Glover ed. IRE Prcss Ltd.. 1985.

Volba transformačních podmínek závisí na hostitelské buňce. Bakteriální buňka, jako je E. coli. může být ošetřena roztokem CaCI? (Cohcn et al. proč. Nati, Acad. Sci. 1973, 69:21 10) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCh. octanu draselného a glycerolu. a potom kyselinou 325 [N-morfblino]-propansultonovou, RbCl a glycerolcm. Savčí buňky v kultuře mohou být transformovány vápníkovým vy srážením vektorové DNA do buněk. Vynález také zahrnuje hostitelské buňky transformovaná replikovalelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu.

Kultivace transformovaných hostitelských buněk za podmínek umožňujících expresi DNA 3o polymeru je provedena běžným způsobem, jak je popsáno například v Maniatis et al.. a v DNA

Cloning, výše. Výhodně jsou buňkám dodávány živiny a kultivace probíhá při teplotách nižších než 50 °C.

Výsledný materiál muže být získán za použití běžných metod vybraných podle hostitelských 35 buněk a podle lokalizace cxprimováného materiálu (intracelulární nebo secernovany do kultivačního média nebo do buněčné periplazmv). Když je hostitelská buňky bakteriální, jako jen například E. coli, tak může být například provedena fyzikální, chemická nebo enzymatická lýza buňky a proteinový produkt může být izolován z výsledného lyzátu. Když je hostitelskou buňkou savčí buňka, tak může být produkt obvykle izolován z živného média nebo z bezbuněčných extraktů. 40 Mezi běžné techniky pro izolaci proteinů patří selektivní srážení, adsorpční chromatografie a afinitní chromatografie včetně afin i tni kolony s monoklonální protilátkou.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou poskytnuty buď jako rozpouštěný materiál v kapalné formě, nebo v lyofilizované formě.

Obecně se předpokládá, že každá dávka pro člověka bude obsahovat 1 až 1000 Lig proteinu.výhodně 30 až 300 gg.

Předkládaný vynálezu také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující protein podle přudklá50 daného vynálezu ve farmaceuticky přijatelných přísadách. Výhodný vakcínačni prostředek obsahuje alespoň lipoprotein D - MAGE-3. Taková vakcina může volitelně obsahovat jeden nebo více jiných antigenú asociovaných s nádory, například jiné antigeny náležící do MÁGE nebo GAGE rodiny. Mezi vhodné další antigeny asociované s nádory patří MAGE-I, GAGE-1 nebo tyrosinasa.

- 5 CZ 298347 B6

Příprava vakcin je obecně popsána v Vaccine Design („Tlie subunit and adjuvant approach (ed. Powell M.F. and Ncwman, M.J.) (1995) Plenům Press New York). Obalení do liposomů je popsáno ve Fullerton, patent US 4 235 877.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně obsaženy ve vakcinačních prostředcích podle předkládaného vynálezu společně s adjuvans. Mezi vhodná adjuvans patří soli hliníku, jako jc hydroxid hlinitý ve formě gelu (kamenec) nebo fosforečnan hlinitý, ale patří mezi ně také soli vápníku, železa nebo zinku nebo nerozpustné suspenze acylovaného ty rosí nu nebo acylované cukry, kationtově nebo aniontově derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny. Mezi další známá adjuvans patří oligonukleotidy obsahující CpG. Oligonukleotidy sc vyznačují tím. žc CpG dinukleotid jc nemethylovaný. Takové oligonukleotidy jsou dobře známé a jsou popsány například ve WO 96/02555:

V prostředních podle předkládaného vynálezu je výhodné, aby adjuvans přednostně vyvolávalo imunitní odpověď Thl typu. Mezi vhodné adjuvantní systémy patří, například, kombinace monofosforyl lipidu A. výhodně 3 de-O-acylovancho monofosforyllipidu A (3D-MPL) se solí hliníku. CpG oligonukleotidy také přednostně vyvolávají Th I odpověď.

Zesílený systém obsahuje kombinaci monofosforyl-lipidu A a saponinovcho derivátu, přesněji kombinaci QS2I a 3D-MPL, jak jc popsána ve WO 94/00153. nebo méně reaktogenní prostředek, ve kterém je QS21 utlumen cholesterolem, jako je popsáno ve WO 96/33739.

Zejména účinný adjuvantní prostředek obsahuje QS21 3D-MPI. a tokoferol v olejové nebo vodní emulzi, jak je popsáno ve WO 95/17210, který jc také přednostně použitým prostředkem.

V jednom provedení předkládaný vynález poskytuje vakcinační prostředek obsahující protein podle předkládaného vynálezu, nejlépe lipoprotein D (nebo jeho derivát) - MAGE-3 s adjuvans. který je monofosforyl lipid A nebo jeho derivát.

Výhodně obsahuje vakcína dále saponin. nejlépe QS2I.

Výhodný prostředek dále obsahuje emulzi olej vc vodě a tokoferol. Předkládaný vynález také obsahuje způsob přípravy vakcinačního prostředku obsahující smísení proteinu podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky přijatelnou přísadou, jako je 3D-MPL.

V jednom aspektu vynález obsahuje způsob pro přečištění rckombinantně připraveného MÁGEproteinu. Tento způsob obsahuje solubilizaci proteinu, například v silném chaotropním činidle (jako je například močovina, guanidiniumhydrochlorid) nebo v obojetném detergenčním činidle, jako je například Empigen BB - n dodecy I-N.N-diinethylglycin), redukci i π tra- a intermokkulovýcli d i sulfidových můstků proteinu, blokování vzniklých thiolů pro prevenci oxidačního obnovení vazeb a zpracování proteinu v jednom nebo ve více chrotnatografických stupních.

Výhodně je blokovacím činidlem alky lační činidlo. Mezi taková blokovací činidla patří, například, alfa halogenkyseliny nebo alfa halogenamidy, například kyselina jodoctová a jodacetamid, které způsobují karboxymethylaci nebo karboxyamidaci (karbamidorncthylaci) proteinu. Další blokovací činidla, která mohou být použita, jsou popsána v literatuře (viz například l be Proteins, svazek H, cd. H. Neurath, R.L. Hill, a C.L. Bocdcr, Academie Press, 1976, a Chemical Reagents for Protein Modificaton, svazek, ed,. R.L. Lunblad a C.M. Noyes, CRC Press, 1985). Mezi typické příklady takových dalších blokovacích činidel patří N-ethylmaleimid, cliloraceiylfosfat, O-methylisomočovina a akrylonitril. Použití blokovacích činidel je výhodné, protože brání agregaci vzniklého materiálu a zajišťuje stabilitu při dalším přečištění.

V provedení vynálezu jsou blokovací činidla vybrána tak, aby indukovala vznik stabilního kovalentního a irevcrsibilního derivátu (například jc použito alfa-halogenkyselinv nebo alfa-halogcn

-6CZ 298347 Β6 amidu). Nicméně, mohou byt použita i jiná blokovací činidla, která mohou byt po přečištění odstraněna za uvolnění ncderivatizovaného proteinu.

MÁGE proteiny mající derivatizované volné thiolové zbytky jsou nové a tvoří aspekt předkládaného vynálezu. Výhodným provedením vynálezu jsou karboxyamidované nebo karboxymethylovanc deriváty.

Ve výhodném provedení jsou proteiny podle předkládaného vynálezu opatřeny afínitní koncovkou, jak oje CLYTA nebo polyhistidinová sekvence. V takových případech jc protein po stupni blokování výhodně zpracován afínitní chromatografií. Pro proteiny s polyhistidinovou koncovkou může být použita afínitní chromatografie s imobilizováným iontem kovu (IMAC). lontem kovu může být jakýkoliv vhodný iont jako je například zinek, nikl, železo, hořčík nebo měd', ale výhodně je použit zinek nebo nikl. Výhodně obsahuje IMAC pufr obojetné detergenčni činidlo, jako je Empigen BB (dále pouze Empigen). protože snižuje koncentrace endotoxinu v konečném materiálu.

Pokud je připraven protein s Clyta částí, tak může být přečištěn za použití své afinity k cholinu nebo k analogům cholinu, jak oje DEAE. V jednom provedení vynálezu jsou proteiny připraveny s polyhistidinovou koncovkou a Clyta částí. Tyto proteiny mohou být přečištěny za použití jednoduchého dvoustupňového protokolu afínitní chromatografie.

Vynález bude dále popsán v následujících příkladech.

Příklady proveden i vy nálezu

Příklad 1: Příprava rekombínantního kmene E. coli exprimujíciho fúzní protein lipoprotein DMAGE-3- His (LPD 1/3- MAGE-3-his nebo LpD MAGE-3-His)

1. Expresní systém E. coli

Pro produkci lipoproteinu D byla DNA kódující protein D klonována do expresního vektoru pMG 814. 1 ento plazmid využívá signály z DNA lambda fágu pro řízení transkripce a translace insertovaných cizorodých genů. Vektor obsahuje lambda PE protokol PE. operátoru OL a dvě využitelná místa (NutL a NutR) pro odstranění efektů transkripční polarity při použiti N proteinu (Gross et al.. 1985, Mol. and Cell Biol. 5: 1015). Vektory obsahující Pí. promotor jsou vloženy do El coli lysogenního hostitele pro stabilizaci plazmidové DNA. Lysogenní hostitelské kmeny obsahují replikou-dcficientní lambda fágovou DNA integrovanou do genomu (Shatzman ct al.. 1983; v Experimetal Man i pu lat ion o f Gene Express ion. Inouya (ed.) str. 1-14, Academie Press, NY). DNA lambda fágu řídi syntézu cl represorového proteinu, který se váže a OL represor vektoru a bráni vazbě RNA polymerasy na PE promotor a tak transkripci insertovancho genu, cl gen expresního kmene AR58 obsahuje teplotně sensitivni mutaci, takže transkripce řízená PL může být regulována teplotním posunem, to znamená, že zvýšení kultivační teploty i n akt i v uje represor a je zahájena syntéza cizorodého proteinu. Expresní systém umožňuje kontrolovanou syntézu cizorodých proteinů, zejména těch, které mohou být toxické pro buňky (Shimataka and Rosenberg. 1981, Nátuře 292: 128).

2. E. coli. kmen AR58:

Lysogenní kmen E. coli AR58 použitý pro produkci LPD MAGE-3-His proteinu je derivát standardního NIH E. coli KI2 kmene N99 (E-su-galK.2. lacZ-, thr-). Obsahuje defektní lysogenní lambda fág (galE::TN10, 1 Kil- 0857 DH1). Kil fenotyp brání ukončení makromolekulo vé syntézy hostitele. 0857 mutace způsobuje teplotní sensitivitu cl represoru. DH1 mutace odstraňuje pravý operon lambda fágu a bio. uvr3 a ChlA lokusy hostitele. Kmen AR58 byl

-7C7. 298347 B6 připraven transdukcí N99 P lambda fágem předem kultivovaným na SA 500 derivátu (galE;:TN10, 1 Kil cI857 D1H). Vložení defektního lysogenu do N99 buněk bylo selektováno tetraeyklinem, protože TN10 transposon kódující resistenci ne tctracyklin je umístěn v sousedství galE genu. N99 a SA500 jsou K12 kmeny E. coli získané od Dr. Martin Rosenberg's laboratoře 5 v National Institute of Health.

3. Konstrukce vektoru navrženého pro expresi rekombinantního proteinu LPD-MAGE-3His:

Cílem bylo exprimovat MÁGE 3 jako fúzní protein za použití N-koncové třetiny lipidovaného io proteinu D jako fúzního partner navázaného na N-konec MAGE-3 a sekvence několika histidinových zbytků (His koncovky) umístěné na jeho C-konci.

Protein D je lipoprotein (42 kDa vazebný protein pro imunoglobulin D umístěný na povrchu gram negativní bakterie Haemophilus influenzae). Protein je syntetizován jako prekurzor 15 s 18 aminokyselinovou signální sekvencí, která obsahuje konvenční sekvenci pro bakteriální lipoprotein (WO 91/18926).

Po odstranění signální sekvence lipoproteinu bohem sekrece se stává Cys (v pozici 19 molekuly prckurzoru) amino-koncovým zbytkem a současně je modifikován kovalentním navázáním jak 20 esterovou vazbou vázaných, tak amidovou vazbou vázaných mastných kyselin.

Mastné kyseliny navázané na amino-koncový cysteinový zbytek potom působí jako membránové ukotvení.

Plazmid exprimující fúzní protein byl navržen tak, aby exprimoval prckurzorový protein obsahující 18 aminokyselinovou signální sekvenci a prvních 109 zbytků zpracovaného proteinu D, dvě nepříbuzne aminokyseliny (Met a Asp), aminokyselinové zbytky 2 až 314 MAGE-3 a dva Gly zbytky působící jako pantový region pro navázání dalších sedmi His zbytků.

Takto připravený rekombinantní kmen produkoval lipidovaný fúzní protein s His koncovkou o 432 aminokyselinách (viz obr, 1), s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 1 a kódující sekvencí SEQ ID NO: 2.

4. Klonovatí strategie pro přípravu LPD-MAGE 3 -His fúzního proteinu (vektor pRIT 14477).

Byly použity cDNA plazmid (od Dr. fhierry Boon z Ludwig Institute) obsahující kódující sekvenci pro MAGE-3 gen (Gaugler, B. ct al.. 1994) a vektor pRU 14586, obsahující n-koncovou část Lípo D 1/3 kódující sekvence (připravený podle obr. 2), Klonovaeí strategie obsahovala následující kroky:

w (a) PCR ampliftkaci sekvencí přítomných v plazmidové cDNA pro MAGE-3 za použití kódujícího oligonuklcolidu: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct. a protismyslného oligonukleotidu 5' gcg tet aga tta atg gig atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tet caa: tato amplifikace vedla k následujícím modifikacím na N-konci: změnu prvních pěti kodonů na kodo- nv používané v E. coli; nahrazení Pro kodonů v pozici i Asp kodonem. vložení Ncol místa na 5' konci a adici 2 Gly kodonů a 7 His kodonů následovaných Xbal místem na C-konci:

(b) klonování výše uvedeného ampl ifi kovaného fragmentu do TA klonovacího vektoru (Invitrogen) a přípravu pracovního vektoru pRIT 14647:

(c) vystřižení Ncol-Xbal fragmentu z plazmidů pRU 14647 a klonování do vektoru pRIT 14586:

(d) transformaci hostitelského kmene AR58:

(e) selekci a charakterizaci transformantů E. coli obsahujících plazmid pRIT 1447 exprimujících LPD-MAGE-3-His fúzní protein.

Příklad 2: Příprava EPD1/3 MAGE-3-His antigenu

1. Kultivace a indukce bakteriálního kmene - exprese EPD1/3 MAGE-3-His

Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT 14477 byly kultivovány ve 2 litrových nádobách io obsahujících 400 ml EYI2 média doplněného kvasinkovým extraktem (6.4 g/1) a kanamycinsulfatem (50 mg/1). Po inkubaci za třepání při 30 °C po dobu 8 ± I hodiny se z každé nádoby odebral malý vzorek pro mikroskopické vyšetření. Obsah dvou nádob se potom smísil za vzniku inokula pro 20 litrovou fermentační nádobu.

i? Inokuíum (přibližně 800 ml) bylo přidáno do předem sterilizované 20 litrové (celkový objem) fermentační nádoby obsahující 7 litru média doplněného 50 mg/1 kanamycin-sulfatem. pH bylo upraveno a udržováno na 6.8 pravidelným přidáváním NH₄OH (25% obj./obj.) a teplota byla upravena a udržována na 30 °C. Provzdušňování bylo prováděno rychlostí 12 1/min a tlak rozpouštěného kyslíku byl udržován na 50% saturaci pomocí zpětnovazebně kontroly rychlostí 20 třepání. Přetlak ve fermentačním tlaku byl udržován na 500 g/cnr (0,5 baru).

Kultivace za přísunu živin byla provedena za kontrovaného přidávání uhlíkového živného roztoku. Živný roztok byl přidáván počáteční rychlostí 0,04 ml/min a rychlost sc exponenciálně zvyšovala během prvních 42 hodin pro dosažení rychlosti růstu 0,1 li¹.

Po 42 hodinách byla teplota ve fermentačním tanku rychle zvýšena na 39 °C a rychlost podávání živného roztoku byla udržována na 0,005 ml/g DCW/min. během indukční láze po dobu dalších 22 až 23 hodin, během kterých dosáhla intracelulární exprese LPD1/3-MAGE-3 His maximální úrovně.

Alikvoty (15 ml) media byly odebírány v pravidelných intervalech během růstové/indukční fáze a na konci fermentace, aby bylo možno sledovat kinetiku růstu bakterií a intracelulární exprese produktu a dále pro získání vzorků pro identifikaci mikrobů/lesty nečistoty.

Na konci fermentace byla optická hustota kultury mezí 80 a 120 (což odpovídá koncentraci buněk mezi 48 a 72 g DC'W/1) a celkový objem kapaliny byl přibližně 12 litrů. Kultury byly rychle ochlazeny na teplotu 6 až 10°C a buňky ECK32 byly separovány z kultivačního média odstředěním při 5000 x g při 4 °C během 30 minut. Koncentrované buňky ECK32 byly rychle uskladněny v plastových vacích a ihned zmrazený při -80 °C.

4(1

2, Extrakce proteinu

Zmrazené koncentrované buňky ECK32 se nechaly roztát při 4 °C a potom byly resuspendovány v pufru pro rozrušení buněk v konečně optické hustotě 60 (která odpovídá koncentraci buněk 45 přibližně 36 g DCW/I).

Buňky byly rozrušeny dvěma průchody přes vysokotlaký homogenizační přístroj (1000 barů). Suspenze rozrušených buněk byla odstředěna (1000 x g při 4 °C. 30 minut) a peletová frakce byla promyta dvakrát Triton ΧΙ00 (1% hmot./obj.) + EDTA 1 mM) a potom fosfátem pilířovaným 50 salinickým roztokem (PBS) + Tween 20 (0,1% obj./obj.) a nakonec PBS. Před každým stadiem promývání byla suspenze odstředěna při 10000 x g po dobu 30 minut při 4 °C, supernatant byl odstraněn a peleta byla použita v dalším promývání.

9CZ 298347 B6

Příklad 3: Charakterizace fúzního proteinu lípo D- MÁGE 3

I. Přečištění:

S

LPD-MAGE-3-His byl přečištěn z buněčného homogenátu za použití následující sekvence kroků:

(a) solubilizacc pro myté pe letové frakce z procesu destrukce buněk;

(b) chemická redukce intra- a inter-proteinových disulíldovýeh můstků, po které následovalo blokováni thiolových skupin pro zabránění oxidativnímu obnovení vazeb;

(c) mi kro filtrace reakční směsi pro odstranění částic a snížení obsahu endotoxinů;

(d) zachycení a primární přečištěni LPD-MAGE-3 His pomocí využití afin i tni interakce mezi polyhistidinovou koncovkou a chelatační sepharosou obsahující zinek;

(e) odstranění kontaminujících proteinů aniontovou ionioměničovou chromatografií.

Přečištěný LPD-MAGE-3-His byl zpracován v několika dalších krocích;

(f) výměna pufru/odstranění močoviny pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti za použití Superdex 75;

(g) filtrací během procesu;

(h) výměnou pufru/odsolením pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti za použití Sephadex G25.

Každý z těchto kroků bude nvní popsán podrobněji.

1.1) Solubilizacc pelety buněčného homogenátu

Peleta z posledního promylí (jak je popsáno výše) byla resolubilizována přes noc v 800 ml roztoku guanidinhydrochloridu (6M) a fosforečnanu sodného (OJ M. pil 7,0) při 4 °C.

1.2) Redukce a karboxymethylacc

Solubilizovaný materiál (světle žlutá, kalná suspenze) se probublala argonem pro odstranění jakéhokoliv zbývajícího kyslíku a přidal se zásobní roztok 2-mcrkapioethanolu (14 M) na konečnou koncentraci 4,3 M (která odpovídá 0,44 ml 2-merkaptoethanolu na ml roztoku).

Vzniklý roztok se rozdělil a přenesl se do dvou skleněných zkumavek, které sc zahřály na 95 °C 45 ve vodní lázni. Po 15 minutách při 95 °C se zkumavky odstranily z vodní lázně a nechaly se vychladnout a potom se jejich obsah slil do fólií pokry té kádinky (5 I), která sc umístila na led a za důkladného míchání se přidal jodacetamid v pevném stavu v množství nutném pro dosažení konečné koncentrace 6 M (která odpovídá 1J 1 g jodacetamidu na ml roztoku). Směs se ponechala na ledu ve tmě po dobu 1 hodiny pro zajištění úplné solubilizacc jodacetamidu a potom 50 byla neutralizována (za stálého důkladného třepání a kontinuálního sledování pH) přidáním přibližně 1 litru hydroxidu sodného (5 M) za dosažení konečného pil 7,5 až 7.8.

Získaná směs se ponechala na ledu ve tmě po dobu dalších 30 minut a polom se pH opčt upravilo na pl I 7.5 až 7.8.

- 10CZ 298347 B6

1.3) M i kro filtrace

Směs se mikrofiltrovala na Amicon Proflux M12 jednotce s tangenciálním průtokem vybavené Miníkos náplní z dutého vlákna (rcf. č. M22M-600-0.1 N; plocha 5600 cm², 0.2 pm). Filtrát byl 5 použit v následném chromalografickém přečištění.

1.4) Chelatační chromatografie za použití kovu (Zn²‘) (1MAC)

Chelatační chromatografie za použití kovu byla provedena za použití Chelating Sepharose FF io (Pharmacia Biotechnology kat. č. 17-0575-01) naplněné do BPG 100/500 kolony (Pharmacia

Biotechnology kat. č. 18—1 103 01). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 79 cm ; délka náplně 19 cm: objem 1500 ml. Prázdná kolona byla ošetřena hydroxidem sodným (0,5 M) a potom byla promyta přečištěnou vodou.

Nosič (aplikovaný ve 20% obj./obj. ethanolu) byl pro myt přečištěnou vodou (8 litrů) na Buchnerově nálevce (vc vakuu) a byl naplněn zinkem pomocí průchodu alespoň 15 I roztoku ZnCl· (0.1 M). Nadbytek zinku byl odstraněn promýváním nosiče 10 1 přečištěné vody, dokud pH kapaliny na výstupu nedosáhlo pl I roztoku ZnCl· (pH 5.0). Nosič byl potom uveden do rovnováhy 4 1 roztoku obsahujícího guanidin hydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M. pl 1 7,0),

Filtrát z mikrofiltrace obsahující 1 .PD-MAGE-3-HIS byl smísen s nosičem (vazba ve vsádce) před naplněním BPG kolony roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0.1 M, pH 7.0).

Další stadia chelatační chromatografie za použití kovu byla provedena za průtoku eluens 60 ml/min. Kolona byla promývána nejprve roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0.1 M, pH 7,0), potom roztokem obsahujícím močovinu (6M) a fosforečnan sodný (0,1M, pH 7,0), dokud nedosáhl eluens kolony nulové absorbance při OD_2ř!(i nm (základní hodnota).

.10

Sem i-přečištěná LPD -MAGE-3-His proteinová frakce byla eluována 2 objemy kolony roztoku obsahujícího močovinu (6M), fosforečnan sodný (0.1M. pH 7.0) a imidazol (0.5M). Vodivost této frakce byla přibližně 16 mS/cm.

1.5) Anioiitová iontomčničová chromatografie

Před provedením aniontové iontoméničové chromatografie sc vodivost semi-přečištčné LPDMAGE-3-His proteinové frakce snížila na přibližně 4 mS/cm pomocí uaředění roztokem obsahujícím močovinu (6M) a Tris-HCI (20 mM, pil 8,0).

Aniontová iontomčničová chromatografie byla provedena za použití Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology. kat. č. 17-0510 01) naplněné v BPG 200/500 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-11). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 314 cm ; délka náplně 9 cm; objem náplně 3900 ml.

Kolona byla naplněna (20 % obj./obj. ethanolem) a byla promyta 9 I přečištěné vody při průtoku eluens 70 ml/min. Naplněná kolona byla ošetřena 3 litry hydroxidu sodného (0,5 M), byla promyta 30 litry přečištěné vody a potom byla uvedena do rovnováhy 6 litry roztoku obsahujícího močovinu (6M) a Tris-HCI (20 mM, pH 8,0). Ředěný, senii—přečištěný EPD-MAGE-3-His byl 50 vnesen do kolony a potom byl promýván 9 litry roztoku obsahujícího močovinu (6M), Tris-HCI (20 mM, pH 8.0). EDTA (1 mM) a Tween (0.1%), dokud absorbance (280 nm) eluens neklesla na nulu.

Další promytí bylo provedeno za použití roztoku obsahujícího močovinu (6M) a Tris-HCI 55 (20 mM. pH 8.0)'

Přečištěný LPD-MAGE 3-1 lis byl cluován z kolony roztokem obsahujícím močovinu (6M), Tris-HCI (20 mM, pl I 8,0) a NaCÍ(0,25M).

1.6) Chromatografie s vylučováním podle velikosti

Odstranění močoviny z přečištěného LPD-MAGE-3-His a výměna pufru byly provedeny za použiti chromatografie s vylučováním podle velikosti. Tato byla provedena za použití Supcrdex 75 (Pharmacia Biotechnology. kat. č. 17 1044-01) naplněně v XK 50/100 koloně (Pharmacia 10 Biotechnology kat. č. 18-8753-01). Rozměry náplně byly: průměr 5 cm; plocha na příčném řezu 19,6 cm²; objem 1800 ml.

Kolona byla naplněna ethanolem (20%) a byla promyta 5 litry přečištěné vody při průtoku 20 ml/min. Kolona byla ošetřena 2 litry hydroxidu sodného (0,5 M), byla promyta 5 litry přečiš15 těné vody a polom byla uvedena do rovnováhy 5 litry fosfátem pufrovancho salinického roztoku obsahujícího Tween 80 (0.1% obj./obj.).

Přečištěná LPD-MAGE-3-1 lis frakce (maximum 500 ml/jedno odsolování) byla vnesena do kolony při průtoku eluens 20 ml/min. Odsolený přečištěný LPD MAGE-3-IIis byl eluován 20 z kolony 3 litry PBS obsahujícího Tween 80 (0.1% obj./obj.).

Frakce obsahující LPD-MAGE -3—His eluovala při volném objemu kolony.

1.7) Filtrace během procesu

LPD-MAGE-3 His z chromatografie s vylučováním podle velikosti se filtruje přes 0.22 gm membránu v digestoři s laminárním prouděním (třída 10 000). Filtrovaný materiál se zmrazí při -80 °C a uskladní se do kroku odsolení.

1.8) Odsolovací chromatografie

Protože osmolalita konečného materiálu by měla být nižší než 400 mOsM, jc nutný pro snížení koncentrací solí další výměna pufru. Tato výměna pufru se provede odsolovací chromatografií za použití Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology, kal. č. 17 -0033-02) naplněné v BPG 100/950 35 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18 1103-03). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm;

plocha na příčném řezu 78,6 cm^-’; délka náplně 85 cm^?; objem 6500 ml.

Sephadex G25 se hydratovala 7 litry přečištěné vody a nechala sc bobtnat přes noc při 4 °C. Gel byl potom naplněn do kolony s čistou vodou při průtoku eluens 100 ml/min.

Kolona byla ošetřena 6 litry hydroxidu sodného (0,5 M) a polom byla uvedena do rovnováhy 10 litry roztoku obsahujícího fosforečnan sodný (10 mM, pH 6,8). NaCl (20 mM) a Tween 80 (0,1% obj./obj).

Přečištěná LPD-MAGF-3-His frakce (maximum 1500 ml/jedno odsolování) byla vnesena do kolony při průtoku eluens 100 ml/min. Odsolený přečištěný LPD-MAGE 3-1 lis byl cínován při volném objemu kolony, byl sterilně filtrován přes 0,22 μιη membránu a byl uskladněn při -80 °C. Výsledný proteinový materiál se nechal roztát při 4 °C před rozdělením do zkumavek a lyofilizací s laktosou (3,2%).

51)

2. Analýza SDS-polyakrylamidových gelů barvených Coomasie modří

Přečištěný LPD-MAGE-3- His antigen byl analyzován SDS-PAGE na 12,5% akrylamidovem gelu za redukčních podmínek.

- 12 CZ 298347 B6

Pro barvení Coomasie modří byl obsah proteinu 50 pg a pro barveni dusičnanem stříbrným byl obsah proteinu 5 pg. Byla analyzována klinická šarže 96K19 a pilotní šarže 96,122. Byl vizualizován jeden hlavní proužek odpovídající molekulové hmotnosti 60 kDa. Také byly pozorovány dva vedlejší proužky odpovídající přibližně 45 kDa a 35 kDa.

3. Analýza westernovým přenosem

Peptidy získané při SDS-PAGE analýze LPD-MAGF-3-1 lis proteinu byly identifikovány westernovým přenosem za použití myších monoklonálních protilátek. Tyto protilátky byly io připraveny v myších za použití přečištěného přípravku MAGE-3-His proteinu (tento protein neobsahuje LPD část l.PD-MAGE-3-His).

Podle vhodnosti pro analýzu westernovým přenosem byly vybrány dva přípravky monoklonálních protilátek (MAb 22 a MAb 54) a byly použity testv identifikace. Obr. 4 ukazuje charakter 15 proužku získaných pro šarže 96K.19 a 96J22 po barvení Mab 32 a 54. 600 ng proteinu bylo izolováno na 12.5% SDS-PAGE, tento materiál byl přenesen na nylonovou membránu, reagoval sMAb32a54(60 pg/ml) a tyto byly detekovány pomocí anti-myších protilátek navázaných na peroxidasu.

60 kDa a 30 kDa peptid detekovaný SDS- PAGE byl detekován oběma mAb.

Příklad 4

1. Příprava vakciny za použití LPD-MAGE-3-His proteinu

Vakcina použití v těchto pokusech byla připravena z rekombinantní DNA kódující lipoprotein D l/3-MAGE-3-his. exprimované v E. eoli kmene AR58, a obsahovala nebo neobsahovala adjuvans. Jako adjuvans prostředek obsahoval směs 3-de-O-acylováného ntonofosforyllipidu a (3D30 MPL) a QS21 v emulzi olej ve vodě. Adjuvantní systém SBAS2 byl popsán dříve ve WO 95/17210.

3D-MPL je imunostimulační činidlo odvozené od Iipopolysacharidu (EPS) grain-negativní bakterie Salmonella minnesota. MPL byl deacylován a postrádá fosfátovou skupinu na skupině 35 lipidu A. Toto chemické zpracování dramaticky snižuje toxicitu za zachování i munosti mu lučních vlastností (Ríbi, 1986). Ribi hiinuinochemistry vyrábí a dodává MPL do SB-Biologicals. Pokusy provedené ve Smith Kline Beccham Biologicals ukázaly, že 3D-MPL v kombinaci sráznými vehikuly významně zvyšuje jak protilátkovou imunitu, tak Tlil typ imunitní reakce.

4o QS21 je přirozená saponinová molekula extrahovaná z kůry jihoamerického stromu Quillaja saponaria Molina. Technika přečištěni vyvinutá pro separaci jednotlivých saponinu ze surových extraktu z kůry umožňuje izolaci saponinu QS21, který je triterpen ováným glykosidem vykazujícím silnou adjuvantní aktivitu a nízkou toxicitu ve srovnání s původním materiálem. Bylo prokázáno, že QS21 aktivuje CTL restrihované MHC třídy 1 k několika podjednotkovým Ag, stejně jako bylo prokázáno, že stimuluje Ag specifickou proliferaci lymfocytů (Kensil. 1992). Aquila (formálně Cambridge Biotech Corporation) vyrábí a dodává QS2I do SB Biologicals.

Pokusy provedené ve SmithKline Beecham Biologicals prokázaly jasný synergní efekt kombinace MPL a QS21 v indukci jak protilátkové imunity, tak Th 1 typu imunitní reakce.

Emulze olej/voda je složena z organické fáze tvořené 2 oleji (tokoferolem a skvalenem) a vodné fáze tvořené PBS obsahující Tween 80 jako emulgační činidlo. Emulze obsahuje 5 % skvalenu, 5 % lokofcrolu, 0,4% Tween 80 a má průměrnou velikost částic 180 nm a je známá jako SB62 (viz W(3 95/17210).

- 13CZ 298347 B6

Pokusy provedené ve SmithKline Beechani Biologicals prokázaly, že přidání této emulze olcj/voda k 3D-MP/QS21 (SBAS2) dále zvyšuje imunostimulační vlastnosti 3D-MPL/QS2I pro různé podjednotkové an ti geny.

2. Příprava emulze SB62 (2-násobný koncentrát)

Tween 80 se rozpustil ve fosfátem pufrovaném šalinickém roztoku (PBS) za zisku 2% roztoku v PBS. Pro získání 100 ml 2—krát koncentrované emulze se 5g DL alfa tokofcrolu a 5 ml skvalenu důkladně promísí. Přidá se 90 ml roztoku PBS/Tween a směs se důkladně promísí. Vzniklá emulze se potom protlačí stříkačkou a nakonec se mikrofluidizuje za použití M110S mikrofluidizačního přístroje. Výsledné olejové kapičky mají velikost přibližné 180 nm.

3. Příprava lipoprot. Dl/3-MAGF-3-His QS21/3D MP1. emulze olej ve vodě (SBAS2)

Adjuvans je připraveno jako kombinace MPL a QS2L v emulzi olej ve vodě. Tento prostředek je aplikován do fíol o objemu 0.7 ml. ve kterých je smísen s lyofilizovaným antigenem (ťiolly obsahující od 30 do 300 pg antigenu).

Složení ředidla obsahujícího adjuvans pro lyofilizovanou vakcinu jc následující:

složka	Množství (na dávku)
Adjuvans
Emulse S362	250 pl
- skvalen	i 0' t 7 mg
- DL α-tokoferol	11,9 mg
- Tween 80	4,8 mg
Monofosforyl lipid A	10C pg
QS21	100 pg
Konzervační činidlo
Thiomersal
	25 pg
Puf r
	q. s . 0,5 ml
Voda pro injekce
- hydrogenfosforečnan sodný	57 5 pg
- dihydrogenfosforečnan sodný	100 pg
- chlorid draselný	100 pg
- chlorid sodný	4,0 mg

Konečný vakcinační prostředek je získán po rekonstituci lyofilizovaného LPD MAGE-3-His přípravku pomocí adjuvans nebo PBS samotným.

Kontroly obsahující adjuvans bez antigenu byly připraveny nahrazením proteinu PBS.

- 14CZ 298347 B6

4. Vakcinační antigen: fúzní protein lipoprolcin Dl/3 MÁGE 3—His

Lipoprotein D je lipoprotein přítomný na povrchu gram-negativní bakterie Haemophilus influenzae.

Použití prvních 109 zbytku zpracovaného proteinu D jako fúzního partnera poskytuje vakcinačnímu antigenu epitopy pro T-lymfocyty. Kromě LPD skupiny obsahuje protein dvě nepříbuzné aminokyseliny (Met a Asp), aminokyselinové zbytky 2 až 314 MAGE-3 a dva Gly zbytky působící jako pantový region pro navázání dalších sedmi His zbytků.

Příklad 5

1. Iinunogcnieita LPD MAGE-3-His u myší a opic

Pro testování antigenicity a imunogenícity lidského MAGE-3 proteinu byla připravena vakcina inj i ková na 2 různým kmenům myší (C57BL/6 a Balb/C). které se liší svým genetickým základem a MHC alelami. Pro oba kmeny myší byly teoreticky stanoveny peptidového motivy Ml 1C-třídy a MHC třídy II pro MÁGE část LPD-MAGE-3-His fúzního proteinu.

(a) Imunizační protokol myším každého kmene bylo injekčně podáno 2—krát ve 2-týdenních intervalech do nohy 5 pg LPD-MAGE-3-Ilis připraveného nebo nepřipraveného v SBAS2 v koncentraci rovné 1/10 koncentrace použité u člověka.

(b) Proliferační test

Lymfocyty byly připraveny rozdrcením sleziny nebo popliteálitích lymfatických uzlin od myší, týdny po poslední injekci. 2 x 10' buněk bylo umístěno trojmo jamek 96 jamkové plotny a buňky byly restimulovány in vitro po dobu 72 hodin různými koncentracemi (1-0,1 pg/ml) His-MAGE-3, který byl použit samotný nebo potažený na latexové mikrokorálky.

Zvýšená MAGE-3 specifická lymfoproliferativní aktivita byla pozorována jak u buněk sleziny (viz obr. 5 a 7), tak u buněk lymfatických uzlin (viz obr. 6 a 8) jak od C57BL/6 myší, tak od Balb/C myší, kterým byl injekčně podán LPD-MAGE-3-IIis protein, ve srovnání s lymfoproliferativní odpovědí myší, kterým byl podán přípravek SBAS2 samotný nebo PBS.

Kromě toho, významně vyšší proliferativní odpověď byla získána pro lymfocyty od myší imunizovaných LPD-MAGE-3-1 lis v adjuvantním SBAS2 (viz obr. 6 a 8).

(c) Závěr

LPD-MAGE-3-His je imunogenní u myší a tato imunogenicita může být zvýšena použitím SBAS2 jako adjuvans.

2. Proti látková odpověď (a) Imunizační protokol:

Balb/C nebo C57BL/6 myši byly imunizovány 2 injekcemi do nohy ve 2-týdenních intervalech za použití bud PBS, nebo SBAS2, nebo 5 pg LPD MÁGE 3 His. nebo 5 pg LPD-MAGE-3His + SBAS2. Tři zvířata byla použita v kontrolní skupině a pět zvířat bylo použito v testovací skupině.

-15CZ 298347 B6 (b) Nepřímá ELISA

Dva týdny po druhé injekci byla zvířatům odebrána séra a byla analyzována v nepřímém ELISA testu. 2 gg/ml přečištěného His MÁGE 3 byly použity jako potahový antigen. Po saturaci po 5 dobu 1 hodiny při 37 °C v PBS i 1% fetální telecím séru byla séra sériově ředěna (od 1/1000) v saturačním pufru a byla inkubována přes noc při 4 °C nebo po dobu 90 minut při 37 °C. Po promytí PBS/Tween 20,01 % byla biotinylovaná kozí protilátka proti celkovému myšímu IgG (1/1000) nebo kozí protilátky proti myšímu IgGl. lgG2a, lgG2b (1/5000) použity jako sekundární protilátky. Po 90 minutové inkubaci při 37 °C byl přidán streptavidin navázaný na 10 peroxidasu a TMB (tetra-mcthyl-benzidin-peroxid) byl použit jako substrát. Po 10 minutách byla reakce blokována přidáním 0.5 M H₂SOj a byla stanovena OD, (c) Výsledky

Obr. 9 srovnává různé skupiny myší (n ~ 5/skupinu). relativní průměrný střední titr séra, který je průměrným ředěním nutný pro dosažení středního bodu křivky.

Tyto výsledky ukazují, žc u obou testovaných kmenů myší je přítomná slabá Ab odpověd' po injekcích LPD MAGE-3-His samotného, ale že vyšší koncentrace protilátek proti MAGE-3 je 20 přítomná v případě, žc LPD-MAGE-3-His jc injíkován společně s SBAS2. Pouze 2 injekce

LPD-MAGE-3-Hís 1 SBAS2 ve 2-týdenních intervalech, jsou dostatečné pro dosažení pozorovaně vysoké proti látkové odpovědi.

Lepší proti látková odpověď pozorovaná u Balc/c myší ve srovnání s odpovědí pozorovanou 25 u C57BL/6 myší může být vysvětlena rozdíly v haplotypu nebo v genetickém základu mezi těmito dvěma kmeny, i když proti látkový titr dosažený u C67BL/6 myší jc také vyšší po injekcích LPD-MAGE-3 His + SBAS2 než po injekcích LPD-MAGE-3 His samotného.

Anti-MAGE-3 odpovědi vc specifických podtřídách Ig po vakcinaci v různých skupinách myší 30 jsou uvedeny na obr, 10 a 11, které uvádějí srovnání průměrných středních ředění séra.

Ani IgA, ani IgM nebyly detekovány v žádném vzorku séra, ani u myší vakcinovaných LPDMAGE-3-His 4- SBAsY

Naopak, celkové koncentrace IgG byly o něco vyšší v séru myší vakcinovaných LPD-MAGE-3His samotným a významně vyšší v séru myší vakcinovaných LPD-MAGE-3-His v SBAS2.

Analýza koncentrací různých podtříd IgG ukázala, že u myší byla indukována smíšená protilátková odpověď, protože koncentrace všech testovaných podtříd IgG (IgG 1, IgG2a. lgG2b) byly 40 vyšší u myší vakcinovaných antigencm s adjuvans než u myší vakcinovaných an ti genem samotným nebo adjuvans samotným.

Nicméně se zdá, že charakter této smíšené protilátkové odpovědi po vakcinaci LipoD· MAGE-3 za přítomnosti SBAS2 závisí na myším kmenu, protože v séru myší Balsb/C převládal IgGl 45 a v séru myší C57BL/6 převládal IgG2b.

3. Imunogenicita lipoprotein D 1/3 MAGE-3 * SBAS2 adjuvans n opic makak

Byly vybrány tři skupiny opic makak (Macaca Mulatta). RTS.S a gpl20 byly použity jako pozi50 tivní kontroly.

Skupiny

Skupina 1 levá noha: RTS,S/SBAS2 pravá noha: GP120/SBAS2

- 16 CZ 298347 Β6

Skupina 2 levá noha: RTS.S/SB26T pravá noha: GP120/SB26T

Skupina 3 pravá noha: LipoDl/3 MÁGE 3 His/SBAS2

Zvířatům byla podána vakcína v den 0 a dosycovací dávka v den 28 a 84 den a byla jim odebírána krev pro stanovení jejich proti látkové odpovědi na MAGE-3 a protein D. Vakcíny byly podávány intramuskulárnč jako bolusové injekce (0,5 ml) do zadní části pravé nohy.

Malé vzorky krve byly odebírány každých 14 dní. Neheparizované vzorky krve objemu 3 ml byly odebírány z véna fcmoralis. krev sc nechala srážet po dobu nejméně I hodiny a odstředila se při teplotě okolí během 10 minut při 2500 rpm.

Sérum sc odebralo, zmrazilo sc při -20 °C a odeslalo se pro srovnání koncentrace protilátek pomocí specifické ELISA.

96-jainkovc mikroplotny (Maxisorb Nunc) se potáhly přes noc při 4 °C bud' 5 pg His MAGE-3, nebo Proteinem D. Po 1 hodině saturace při 37 °C s PBS NCS 1% sc přidalo sériové ředění králičího séra na dobu 15. hodiny při 37 °C (počáteční ředění 1/10) a po 3 promytích v PBS Tween se přidalo anti—králičí biolynylovanc sérum (1/5000, Amersham. ref. RPN 1004. šarže 88). Plotny se promyly a na dobu 30 minut při 37 °C se přidala peroxidasa navázaná na streptavidin (1/50000). Po promytí se na dobu 7 minut přidalo 50 μΙ Ί'ΜΒ (BioRad) a reakce se ukončila 0,5 M ILSO4. OD sc měřila při 450 nm. Střední ředění byla vypočítána za použití SoftmaxPro.

Protilátková odpověď

Malé vzorky krve byly odebírány každých 14 dnů pro stanovení kinetiky proti látkové odpovědi na MAGE-3 pomocí ELISA. Výsledky ukazují, žc po 1 injekci LPD MAGE-3 His + SBAS2 byl titr celkových Ig specifických pro MAGE3 nízký a jasné zvýšení bylo pozorováno u 3 z. 5 zvířat po druhé a třetí injekci LipoDl/3 MÁGE 3 + adjuvans u stejných opic. Zvířata vykazující špatnou odpověď zůstávala negativní i po 3 injekcích. 28 dnů po II nebo po 111 dávce sc litry protilátek navrátily na základní hodnoty. Mezi těmito protilátkami převládaly podtřídy IgG a nikoliv IgM. Přesmyk na IgG ukazuje na spuštění odpovědi T-lynifocytú. Specifická odpověď pro protein D, ačkoliv byla slabá, měla paralelní průběh s proti látkovou odpovědí k MAGE-3.

Příklad 6

1. LPD MÁGE 1 His

Analogickým způsobem byl připraven LPD-MAGE-l-His. Aminokyselinová sekvence a DNA sekvence jsou uvedeny na SEQ ID NO: 3 a 4. Získaný protein byl přečištěn stejně jako LPDMAGE-3-His protein. Stručně, buněčná kultura byla hotnogenizována a zpracována 4M guanidin HCI a 0,5 M β-merkaptoethanolem za přítomnosti 0,5% Em p i gen detergeneního činidla. Materiál byl filtrován a filtrát byl zpracován 0.6 M jodacetamidem. Karboxyamidovaná frakce byla zpracována IMAC (zinková chclatační scpharosa FE) chromatografií. Kolona byla nejprve uvedena do rovnováhy a promyta roztokem obsahujícím 4M guanidin HCI a fosforečnan sodný (20 mM, pH 7,5) a 0,5% Empigen, potom byla kolona promyta roztokem obsahujícím 4M močovinu ve fosforečnanu sodném (20 mM, pH 7,5) za přítomnosti 0,5% Empigen. Protein byl cínován ve stejném pufru, ale se stoupající koncentrací imidazolu (20 mM. 400 mM a 500 mM).

Eluat byl ředěn 4M močovinou. Q-sepharosová kolona byla uvedena do rovnováhy a byla promyta 4M močovinou ve 20 M fosfátovém pufru (pH 7,5) za přítomnosti 0.5% Empigen.

- 17CZ 298347 B6

Druhý výplach byl proveden ve stejném pufru. ale bez detergenčního činidla. Protein byl cluován ve stejném pufru, ale se stoupající koncentrací imidazolu (150mM. 400 mM, 1M). Eluát byl potom ultra-filtrován.

Příklad 7: Konstrukce expresního plazmidu pRITl4426 a transformace hostitelského kmene

AR58 pro produkci N$l MAGE-3-His

Složení proteinu

Sloužení fůzního proteinu NS-l-MAGE 3—His, kteří je exprimován v E. eoli, jc uvedeno na obr. 12.

Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5.

Kódující sekvence (SEQ ID NO: 6) odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu λρΕ promotoru v E-coli expresním plazmidu.

Klonovací strategie pro výrobu NSl-MAGE-3-llis fůzního proteinu

Výchozím materiálem byl cDNA plazmid získaný od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute obsahující kódující sekvenci pro MAGE-3 gen a vektor pMG81 obsahující kódující region pro 81 aminokyselinový NSI (nestrukturální protein) z Influenza.

Klonovací strategie obsahovala následující kroky:

(a) PCR amplifikaci sekvencí přítomných v plazmidové cDNA pro MAGE-3 za použiti kódujícího oligonukleotídu: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, a protismyslného oligonukleotidu 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc cte tet caa; tato amplifikace vedla k následujícím modifikacím na N—konci: změnu prvních pěti kodonů na kodony používané v E. coli; nahrazení Pro kodonu v pozici 1 Asp kodonem, vložení Ncol místa na 5' konci a adici 2 Gly kodonů a 7 His kodonů následovaných Xbal místem na C-konci;

(b) klonování výše uvedeného amplifikovaného fragmentu do TA klonovacího vektoru (Invitrogen) a přípravu pracovního vektoru pRITl4647;

(c) vystřižení Ncol-Xbal fragmentu z plazmidu pRIT 14647 a klonování do vektoru pRIT PMG8I;

(d) transformaci hostitelského kmene AR58;

(e) selekci a charakterizaci trans formantu E, coli obsahujících plazmid pRIT 14426 exprim Lijících NS1 - MAGE-3-His fúzní protein.

Charakterizace rekombinantního NSI-MÁGE- 3 His (pRIT 14426)

Bakterie byly kultivovány na IB média doplněném 50 pg/nil kanamycinem při 30 °C. Poté, co kultura dosáhla OD - 0,3 (při 620 nm), byla provedena teplotní indukce zvýšením teploty na 42 °C.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintcgrací) trojím stlačením na French lisu. Po odstředění (60 minut. I00000 ,x g) byly supernatanty pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v genech barvených Coomasic Bl, kde fúzní protein představuje přibližně I % celkových proteinů F. coli.

- 18CZ 298347 B6

Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 44,9 kD. Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití anti-NSI monoklonální protilátky.

Příklad 8: Přečištění NS1 MAGE-3-His (E. coli) pro imunizaci králíků/myší

Schéma přečištěni

Následující prečišťovací schéma bylo použito pro přečištění antigenů.

Lýza buněk i odstředění

Solubilizace antigenů i odstředění

Ni' + NTA agarosa koncentrování

Preparativní elektroforesa i

Srážení TCA a solubilizace v PBS (a) Lýza buněk

Bakteriální buňky byly lyžovány ve 203 ml 50 mM PO₄ pufru (pH 7,0) za použití homogenizačního přístroje (Rannie) a lvzát byl odstředěn na JA20 odstředivce při 15 000 rpm po dobu 30 minut. Supernatant byl odstraněn.

(b) Solubilizace antigenů

1/3 pelety byla resolubilizována O/N při 4°C ev 34 ml 100 mM PO₄ - 6m GuHCL pH 1. Po odstředění na JA20 odstředivce při 15 000 rpm po dobu 30 minut byla peleta odstraněna a supernatant byl dále přečištěn 1MAC.

(c) Afinitní chromatografie: Ni²' 1-NTA agarosa (Qiagen)

Objem kolony: 15 ml (16 mm x 7,5 cm)

Plnicí pufr: 0,1 Μ PO₄ - 6M GuHCL pi l 7

Vzorkový pufr: idem

Promývací pufr: 0,1 Μ PO₄ - 6M GuHCL pH 7

0.1 Μ PO₄ - 6M močovina, pí I 7

Elucc: imidazolový gradient (0 > 250 nM) v 0,1 M PO₄ pufru, pH 7, doplněném 6M močovinou.

Průtok: 2 ml/min

- 19CZ 298347 B6

a. Koncentrování

Antigen-pozitivní frakce IMAC eluatu (160 ml) byly odebrány a koncentrovány na 5 ml v Amicon míchací kývete na Filtron membráně (typ Omega s limitem 10 000). Čistota v tomto stadiu byla přibližné 70 % podle SDS PAGE.

b. preparativní clcktroforesa (Prep Cell Bio Rad)

2.4 koncentrovaného vzorku byla zahřívána při teplotě varu v 0.8 ml redukčního vzorkového pufru a tento materiál byl vnesen na 10% akrvlamidový gel. Antigen byl cluován v Tris—Glycinovém pufru. pFI 8.3. doplněném 4% SDS a NS1-MAGE 3 His-požitivní frakce byly odebrány.

c. TCA srážení

Antigen byl srážen TCA a po odstředění na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 20 minut byl supernatant odstraněn. Peleta byla resolubilizována v PBS pufru, pil 7.4.

Protein je solubilní v PBS a po zmrazení/rozmrazení nevykazuje známky jakékoliv degradace při skladování po dobu 3 hodin při 37 ^UC a má zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 50 000 Daltonů. jak je určeno SDS (12,5% PAGE).

Příklad 9: Příprava kmene E. coli cxprimujícího fúzní protein CLYTA-MAGE-l-His koncovka

1. Konstrukce expresního plazmidu pRIT 14426 a transformace hostitelského kmene AR58 pro produkci NS1-MAGE-3 His

Složení proteinu

Složeni fúzního proteinu Clyta-MAGE-I His. který je exprimován v E, coli. je uvedeno na obr. 15.

Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 7.

Kódující sekvence (SEQ ID NO: 8) odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu λρΕ promotoru v E-coli expresním plazmidu.

Klonování:

Výchozím materiálem byl vektor PCllZ.l, který obsahuje 117 C-koncových kodonú LytA kódujícího regionu ze Streptococcus pneumoniae a vektoru pRITl4518, do kterého jsme předtím klonovali MAGE-l genovou cDNA z plazmidu získaného od Dr. Thicrry Boon z l.udwig Institute.

Klonovací strategie pro expresi CLYTA-Magc-I his proteinu (viz schéma na obr. 16) obsahovala následující kroky:

2. Příprava modulu CLYTA-Mage-l-His kódující sekvence (a) Prvním krokem byla PCR amplifikace, která přidávala ke CLYTA sekvenci Ndcl-Afllll restrikční místa na obou stranách. PCR amplifikace byla provedena za použití plazmidu PCTZ1 jako templátu a kódujícího oligonukleotidového primem 5' GCC AGA C AT GTC CAA ITC TGG CCT GTC? TGC CAG. l ato amplifikace vedla k zisku 378 nukleotidu dlouhé CLYTA sekvence.

-20CZ 298347 B6 (b) Druhým krokem bylo navázání CLYTA sekvence na MAGE-l-His sekvenci za získání| kódující sekvence pro fúzní protein. Tento krok obsahoval excisi Ndel-AflIII Clyta fragmentuj a jeho inserci do vektoru pRITl4518, který byl předen nahrazen Ndel a Ncol (Ncol a AflIIIi kompatibilními) restrikčními enzymy a tento postup vedl k zisku plazmidu pRIT 14613.1 (c) Transformace hostitelského kmene AR5 8.

(d) Selekce a charakterizace transformantů E. coli (KAN resistentních) obsahujících plazmid, pRIT14613 (vizobr. 16).4

1. Charakterizace rekombinantního proteinu CLYTA-MAGE-l-Hís (pRIT 14613)

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 μg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 0,3 (při 620 nm), byla provedena teplotní indukce zvýšením teploty na 38 °C.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací) jedním stlačením. Po odstředění byly supematanty pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúzní protein představuje přibližně 1 % celkových proteinů E. coli. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 49 kD. Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití anti-Mage-1-monoklonální protilátky.

Obnovení expresní jednotky složené z dlouhého ZpL promotoru (použitelného pro indukci kyseliny nalidixovou) a CLYTA-Mage-l-his kódující sekvence pRIT 14614.

EcoRI-NCOl restrikční fragment obsahující dlouhý pL promotor a část CLYTA sekvence byl připraven z plazmidu pRIT DVA6 a byl insertován mezi ECORI-NCO1 místa plazmidu pRIT14613.

Byl získán rekombinantní plazmid pRlT14614.

Rekombinantní plazmid pR!T14614 (viz obr. 17) kódující fúzní protein CLYTA-Mage-l-His byl použit pro transformaci E, coli AR120. Byl selektován a charakterizován Kan resistentní kmen.

Charakterizace rekombinantního proteinu

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 mg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 400 (při 620 nm), byla přidána kyselina nalidixová v konečné koncentraci 60 mg/ml.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací jedním nárazem). Po odstřední byly supematant pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúzní protein představuje přibližně 1 % celkových proteinů E. coli, Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití králičích anti-Mage-1 polyklonálních protilátek. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 49 kD.

-21 CZ 298347 B6

Příklad 10: CLYTA-Mage-3-His

A. Rekombinantní antigen způsobující rejekci národu: fúzní protein CLYTA-Mage-3-His, kde je fúzním partnerem C-lyt A, který způsobuje expresi solubilního proteinu, působí jako afinitní koncovka a je epitopem pro T-pomocné lymfocyty.

Příprava kmene E. coli exprimujícího fúzní protein CLYŤA-Mage-3-His

Konstrukce expresního plazmidu pRIT14646 a transformace hostitelského kmene AR120:

Složení proteinu

Složení fúzního proteinu Clyta-MAGE-3-His, který je exprimován v E. coli, je uvedeno na obr. 18.

Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 9 a kódující sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 10.

Kódující sekvence odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu ApL promotoru v E-coli expresním plazmidu.

Klonování:

Výchozí materiál byl vektor PCUZ1, který obsahuje 17 C- koncových kodonů LytA kódujícího regionu za Streptococcus pneumoniae (Gene 43, (1986), str. 265-272) a vektor pRIT 14426, do kterého jsme předtím klonovali MAGE-3 genovou cDNA z plazmidu získaného od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute.

Klonovací strategie pro expresi CLYTA-MAGE-3-His proteinu (viz schéma na obr. 19) obsahovala následující kroky:

1. Příprava modulu CLYTA-MAGE-3-His kódující sekvence

1.1 Prvním krokem byla PCR amplifikace, která přidávala ke CLYTA sekvenci AflII a AflIII restrikční místa na obou stranách. PCR amplifikace byla provedena za použití plazmidu PCUZ1 jako templátu kódujícího oligonukleotidového primerů 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat .atg_aaa.ggg_gga-att_gta.cat.tca-gac;-a-protismyslného-oligonuk-leotidového-pr-imeru-5-ccc-aca-tgtcca gac tgc tgg'cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Tato amplifikace vedla k získu 472 nukleotidů dlouhé CLYTA sekvence. Tento amplifikovaný fragment byl klonován do TA klonovacího vektoru (Introgen) za vzniku pracovního vektoru pRIT 14661,

1.2 Dlouhým krokem bylo navázáno CLYTA sekvence na MAGE-3-His sekvenci za získání kódující sekvence pro fúzní protein. Tento krok obsahoval excizi AflII—AflIII Clyta fragmentu a jeho inserci do vektoru pRIT 14426, který byl předem natráven AflIII a Ncol (Ncol a AflII kompatibilními) restrikčními enzymy a tento postup vedl k zisku plazmidu pRIT 14662.

2. Obnovení exprese jednotky složené z dlouhého λ pL promotoru (použitelného pro indukci kyselinou nalidixovou) a CLYTA-Mage-3-His kódující sekvence

Blgll-Xbal restrikční fragment obsahující dlouhý pL promotor a CLYTA-MAGE-3-His kódující sekvenci byl připraven z plazmidu pRIT14662 a byl insertován mezi BglII—Xbal místa plazmidu TCM67 (derivát pBR322 obsahující gen pro resistenci na ampicilin a dlouhý λ pL promotor, popsaný v mezinárodní přihlášce PCT/EP 92/01827). Byl získán plazmid pRIT14607.

-22CZ 298347 B6

Rekombinantní plazmid pRIT146607 kódující fúzní protein CLYTA-MAGE-3-His byl použit pro transformaci E. coli AR 120 (Mott et al.. 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. 82:88). Byl selektován a charakterizován kmen resistentní na ampiciIin.

3. Příprava plazmidu pRIT 14646

Nakonec byl připraven plazmid podobný pRIT 14607. ale obsahující resistenci na kanamycin (pR!TI4646).

io Charakterizace rekombinantního proteinu

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 mg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 400 (při 620 nm). byla přidána kyselina nalídixová v konečné koncentraci 60 mg/ml.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací jedním nárazem). Po odstředění byly supernatanty pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bluc, kde fúzní protein představuje přibližně 1 % celkových proteinů E. coli. Fúzní protein byl identifikován westernoví vou analýzou za použití králičích anti-Magc-3 póly klonál nich protilátek. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 58 kD.

Příklad 11: Přečištění rekombinantního proteinu CLYTA-Mage-3-His

Rekombinantní bakterie ARI20 (pRl 14646) byly kultivovány ve 201itrovém fernientačním tanku za doplňování živin při 30 °C. Exprese rekombinantního proteinu byla indukována přidáním kyseliny nalidixovc v konečné koncentraci 60 mg/ml. Buňky byly sklízeny na konci fermcntace a byly lyžovány při 60 oD/600 pomocí dvou průchodů French lisem (20 000 psi). Lyžované 30 buňky byly poletovány během 20 minut při 15 000 g při 4 °C. Supernatant obsahující rekombinantní protein byl vnesen do iontoměničové DEAE Sepharose CL6B pryskyřice (Pharmacia) předem uvedené do rovnováhy v pufru A (0.3 M NaCl. 20 mM Iris 1ICI, pH 7,6). Po promytí kolony pufrem A byl fúzní protein eluován 2% cholinem v pufru A. Byly odebrány frakce pozitivní na antigen, jak byly stanoveny westernovým přenosem za použití anti-Mage 3 protilátky. 35 Antigen cluovaný z DEAE byl přenesen do 0.5% Empigen BB (obojetné detergenční činidlo) a do 0.5 M NaCl před tím, než byl vnesen do afinitní chromatografickc kolony využívající iont kovu, která byla předem uvedena do rovnováhy v pufru B (0.5% Empigen RB, 0,5 M NaCl, 50 mM fosfátový pufru, pH 7.6).

IMAC kolona byla promývána pufrem B do té doby, než dosáhla absorbance při 280 nm základní hodnoty. Druhé promytí pufrem B bez Empigen BB (pufr C) pro eliminaci detergenčního činidla byl proveden před clucí antigenu imidazolovým gradientem 0 až 250 mM imidazolu v pufru C.

0,090 až 0,250 M imidazolové frakce byly shromážděny a byly koncentrovány na 10 kDa Filtrom 45 omega membráně před dialýzou proti PBS pufru.

Závěr.

Prokázali jsme, že fúzní protein LPD-MAGE-3-His je imunogenní u myší a že tato imunoge50 nic i ta (prol iterativní odpověď a proti látková odpověď) může být dále zvýšena použitím adjuvans popsaného výše. Přečištění může být zlepšeno derivatizací thiolů, které tvoří disulfklové můstky.

Také jsme prokázali, že lepší proti látková odpověď je spouštěna vakcinaci LPD-MAGE-3 His za přítomnosti adjuvans. Převládající izotop nacházený v seru C57BL/6 je !gG2b, což naznačuje, 5? že byla vyvolána imunitní odpověd' Th 1 typu.

C7. 298347 B6

U člověka byl popsán případě pacienta léčeného LPD-MAGE-3-His v prostředku bez adjuvans, který' byl vyléčen z maligního melanomu.

? Odkazy:

Anichini A., Fossati G., Parmiani G. Immunol. Today. 8: 385 (1987).

Dc Plaen E., A rděn K„ Traversari C., et al. Immunogenetics, 40: 360 (1994).

Gaugler B.. Van den Eynde B.. van der Bruggen P„ et al., J. Exp. Med. 1979: 921 (1994).

Herman J.. van der Bruggen P., Immanuel F.. et al, Immunogenetics, 43:377 (1996).

- lnouc H., Moři M.. Li J., et al, lni. .1. Cancer. 63. 523 (1995).

Kensil C.R., Soltysik S., Patel U„ ct al„ in: Channock R.M.. Ginsburg 11.S., Brown F„ et al.. (eds). Vacci nes 92.

(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), 36-40: (1992).

Knuth A.. Dan o ws k i B., Octtgcn H.F.. et al. Proč. Nati. Acud. Sci. USA, 81:3511 (1984).

Patard J J_, Brasseur F„ Gil-Diez S.. et al. lni. J. Cancer, 64: 60 (1995).

- Ribi E„ ct al. in: Levine L.. Bonventre P.F., Morcllo J., ct al. (eds). Američan Society for Microbiology, Washington DC. Microbiology 1986, 9—13: (1986).

Van den Eynde B., Hainaut P.. Hérin M. et al.. Ni. ./. ('ancer, 44: 634 (1989).

- Van der Bruggen P„ Traversari C.. Chomez P., ct al., Science. 254: 1643 (1991).

Van der Bruggen P.. Bastin J.. Gajewski T„ et al. Eur. J. Immunol.. 24: 3038 (1994).

Van Pel A., van der Bruggen P., Coulic P.G.. et al„ Immunol. Rev.. 145: 229 (1995).

Wcynants P.. Léthé B., Brasseur F., et al.. lni. J. ('ancer, 5(y. 826 (1994).

N i sli imura S, Fuj i ta M. Terata N, I ani T. Kodani a M, ltoh K, Ni hon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997. Apr. 20 (20): 95-101.

- Fuijie T et al, Ann Oneol 1997 Apr, 8 (4): 369-72.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: SmitKline Bccchani Biologicals (ii) Název vynálezu: Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MÁGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kódující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúzních proteinu a prostředků pro vakcinaci (i i i) počet sekvencí: 10

-24CZ 298347 Β6 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: SmithKline Beecham (B) Ulice: 2 New I lorizons Court, Great West Road. B (C) Město: Middx (D) Země (E) Stát: UK (F) ZIP: IW8 9EP (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM kompatibilní (C) Operační systém: DOS (D) Software: FastSF.Q pro Windows verze 2.0 (vi) Data současné přihlášky:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Dala předchozí přihlášky:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(viii) Zástupce/Agent informace (A) Jméno: Dalton. Marcus J (B) Registrační číslo:

(C) Reference/č. rejstříku: B45126 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 0181 9756348 (B) Telefax: 0181 9756177 (C) Telex;

(2) Informace pro SEQ ID NO: I:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 452 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Mez 1

Asp

Pro

Lys

Thr 5

Leu

Ala

Leu

Ser Leu 10

Lee

Ala

Ala

C-ly

Val 15

Leu

Ala

Gly

Cys

Ser

Ser

His

Ser

Ser

Asn Met

AJ_a

Asn

Thr

Gin

Met

Lys

20

25

30

Ser

Asp

Lys

Ile

* 1 w

I le

Ala

Has

Arg Gly

Ala

Ser

Gly

Tyr

Leu

Pro

35

• Z' 1 U

45

Glu

His

Thr

Leu

Glu

Ser

Lvs

R * . n_d

Leu Ala

Phe

Gin

Gin

Ala

Asp

50

55

60

Tyr

Leu

Glu

Gin

Asp

Leu

Ala

Met

Thr Lys

Asd

Gly

Arg

Leu

Val

Val

65

70

75'

90

*le

His

Asp

His

Pne

Leu

Asp

Gly

Leu Thr

As?

Val

Ala

Lys

Lvs

Phe

35

90

95

9ro

His

Arg

His

Arg

Lys

Asp

Gly

Are Tvr

Tyr

Val

Ile

Asp

Phe

Thr

100

105

110

Leu

Lys

Glu

Ile

Gin

Ser

Leu

Glu

Met Thr

Glu

Asn

Phe

Glu

Thr

Mez

115

120

125

Asp

Leu

Glu

Gin

Arg

Ser

Gin

Hus

Cys Lys

Pro

Glu

Glu

Glv

Leu

Glu

130

135

140

Ala

Arg

G _ y

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

Val Oly

Ala

0

Ala

Pro

Au. a

Thr

145

150

155

160

Glu

Glu

Gin

'»i U

Ala

-Ala

Ser

Seg

C 6Σ Ξ 2 Γ

Thr

Lea

Val

Glu

Val

Thr

165

570

175

Leu

Gly

Glu

Val

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser Pro

Asp

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

180

185

190

r> i _ sjl. u

Gly

Ala

Ser

S Λ

Leu

Pro

Τ’---

Tu, - Mez

Asn

i zr

Pro

Leu

Trp

Ser

195

200

205

Gin

S 5 Γ

Tyr

Glu

A.sp

Ser

Ser

Asn

Gin Glu

Glu

G-u

Gly

Pro

Ser

Thr

210

215

220

Phe

Pro

Asp

Leu

Glu

Ser

Glu

Phe

- _ - , _ a

Ala

Leu

Ser

Arg

Lys

Val

225

230

235

240

Ala

Glu

Leu

Val

His

Phe

Leu

Leu

Leu Lys

Tyr

Arg

Ala

Arg

Glu

Pro

24 5

250

25ó

Val

5 r

Lys

Ala

Glu

Met

Leu

Gly

Ser Val

Val

Gly

Asn

Trp

Gin

Tyr

260

265

270

Phe

Phe

Prc

Val

Ile

Phe

Ser

Lvs

Ala Ser

Ser

Ser

Leu

Gin

Leu

Val

275

280

285

Phe

Glv

Tle

Glu

Leu

Met

Glu

Val

Asp Pro

Ile

Gly

His

Leu

Tyr

Ile

290

295

300

Phe

Ala

Th’·

Cys

Leu

Glv

Leu

Ser

Tyr Asp

Glv

Leu

Leu

Gly

Asp

Asn

205

31Ó

315

320

Gin

” 1 e

Mez

Pro

Lvs

Ala

Gly

Leu

Leu Ile

λ- 15

Vax

Leu

Ala

Ile

Ile

325

230

335

Ala

Arg

Glu

Glv

As?

Cys

Ala

□ ^2

Glu Glu

Lys

llé

Trp

C-lu

Glu

Leu

34 0

345

350

Ser

Val

Leu

Glu

Val

Phe

Glu

Gly

Arg Glu

As?

Ser

Ile

Leu

Gly

Asp

2 = 5

360

3 65

Pro

Lvs

Lys

Leu

Thr

Gin

Hus

Phe Val

Gin

Glu

A.sn

Tyr

Leu

Glu

370

275

38C

Tyr

Arg

Gin

Val

Pro

Gly

5er

Asp

Pro .Ua

Cys

Tyr

Glu

Phe

Leu

Tro

385

390

395

4 00

Gly

Pro

Arg

Ala

Leu

Val

Glu

Ser Tyr

Val

lys

Val

Leu

His

His

405

410

415

M 2 *

Val

Lys

Ile

Ser

Gly

Gly

Prc

His Zle

Ser

Tyr

Pro

Pro

Leu

Has

420

425

430

G1‘1

Trp

val

Leu

Arg

Glu

Gly

Glu

Glu Thr

Ser

Gly

Gly

His

His

His

435

440

4 4 5

Hls His His

450

-26CZ 298347 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence ? (Λ) Délka: 1353 páru bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ίο (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO; 2:

A T GGATCC ΑΆ	AAACTTTAGC	CCTTTCTTTA		GCGTACTAGC	AGGTTGTAGC	60
	CAAATATGGC	GAATACCOAA	ATG ΑΛΑT CAG	.ACAAAATCAT	TATTGCTTAC	-22
'-^TGG-Gt- a A	GCGG7TATTT	ACCAGAGCAT		77A-AGCACT	. cvjTTTGCA	1S 0
C AAC AG G C T G	ATTATTTAG.A	GCAAGATTTA	GCAATGACTA	.-οα;.·ϊ, GGTCG	W -Π r> f--TI rft - - i AÍJ 4 * -	240
__	T ..χρ «« «Τ' .“xW A - A - AJ-lVrt	TGGCTTGACT	GA- j	.AAAAATTCCG	LrU - G-A.	300
CGTAAAGA.TG	GCCGTTACTA	TGTCATCGAC	TR.T. -	a-.gaaattca	AA-GT T T.AGAA	3=0
h - —. - 'JAt, i-iV7.rt.-rt	ACTTTGAAAC	CATGGATCTG	GAAC Λ. GGG?	G7CAGCAC7G	-.x-vjCC á CA.-.	423
G.AAGGCCTTG	aGGCCCGAvtj	AGAG ví v. L, a 7 G	GGCC7GGTGG		TCCTGCT.ACT	430
GA.GGAG^Aj^	AGG^.TG*-'w i C	CTCCTCTTCT	ACTC7AG7TG	AAGTCACCCT	viGGvsGAGGTG	540
	Αν; ,	TCCTGCCCAG	A'j 4	GAGCCTCCAG	.« « M ·*. ««Τ' -^ 4 A.A.i.LňL .	600
AC C A.T G AACT	ACCCTCTGTG	GAGCCAATCC	TATGAGGAC7	CCAGGAACCA	hv.-.Akjf.G Gnví	660
GGGCCAAGCA	CCTTCCOTGA	CCTGGAGTCC	GAGT7 C0,-AG	- Akř a. A C 7 C AG	7--.GGrtA.GGTG	T20
L\.CkJ.Art·	— * * * * 1 w -	GCTCCTCAAG	TATCGAGCGA	VJV1AGCCGG7	CxACAAAGGCA.	780
GAAATGCTGG	kjejAO -J1GC k	CGGAAATTGG	CAGTATTTOT	TTCCTGTGAT	C 77GAGGAAA	840
GCTTCTAGTT	CCTTGCAGCT	GGTCTTTC-GC	ATCGAGCTOA	TGGAAGTGGA	'w<-CCA7Cv;sj,„	9C0
CACTTGTACA	TCTTTGCCAC	*Ά· f L	CTCTOOTAOO	.-. i Glí'»x,7GC7	^«GTGACAAT	960
CAGATCATGC	L rtfrú cjN. Λ v xj	CCTCCTGATA	η ΐΊζΐ η·ηΛΐ^*ι	ATAATCGC	Artj A-G j-.u ss u _	2020
— «, ΛΗ, « ϋΛς * w 4	C T G * vG GAu AA	AATCTGG^AG	GAl>v. x GAGT _	- aiTTAGAGuT	j i TTGAGijGG	iOSO
\ j xa .—*AG AC A	GTATC íTvG^j	GvA.cvCnAG	. JA ί „-.		C G TGCAGG AA	1140
- - rr. T, — A xrtxx w a	AcjTACCG^uá	GGTCGGCvivzC	AGTGA7CT73	_· 1	ATTCCTGTC-G	0200
* ^V-rtAliOV:	CTCTCG7TGA	AACCAGCTAT	GTGAAAGT00	**|**r· n r r—f Λ >1 -Ψ1	GGTxA.AAGA.TG	2260
AG T GGAG GA.C	CTCACATTTC	CTACCCACCG	CTGC.-.TGAGT	* fj /—	AGA.GGGGGA..	2320
GAGG^CGGTC	ATCACCATCA	CCATCACCAT	TAA			1353

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka; 1341 páru bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA ή

-27CZ 298347 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 466 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina io (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

-28CZ 298347 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO. 4;

Met Asp 1

ΡΓΟ

LVS

„ ΐ-Γ

Leu

Ala Leu Ser Lee Z0

; Leu Ala Ala Gly Val 15

Leu

Ala

Gly

Cys

Ser

Ser

Els

Ser

Ser

Asn

. Mez

. Ala

i Asr

. Thr

Gin

. Met

Lys

20

25

30

Ser

Asp

Lys

r « £A

Zle

Ile

Ala

Eis

Arg

: Gly

' Ala

i Ser Gly

Tyr

Leu

Pro

35

40

45

Glu

His

Thr

Leu

Glu

Ser

Lys

.Ala

Leu

, Ala

. Phe

: Ala

. Gin

Gin

. Ala

Asp

50

55

60

Tyr

Leu

Glu

G^n

Asp

Leu

A, a

Met

Thr

’ Lvs

Asp Glv

' Arg

Leu

Val

Val

65

70

75

30

Ile

His

Asp

His

Phe

Leu

Asp

Gly

Leu

. Thr

Asp

1 Val

. Ala

Lys

Lvs

Phe

8 5

90

95

Pro

His

Arg

Eis

Arg

Lys

Asp

Gly

Arg

Tyr

Tyr

Val

Zle

As 0

Phe

Thr

100

105

110

Leu

Lys

Glu

Ile

Gin

Ser

Leu

Glu

Met

T. -

Glu

Asn

Phe

Glu

Thr

Met

115

120

125

Gly

Ser

Leu

Glu

Gin

Arg

Ser

Leu

His

Cys

Lys

Pro

Glu

Glu

Ala

Leu

130

135

140

Glu

Ala

Gin

Gin

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

Val

Cvs

Val

Gin

Ala

Ala

Thr

145

150

155

160

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Gly

Thr

Leu

Glu

Glu

Val

Pro

Thr

165

170

175

Ala

Gly

Ser

Thr

Asp

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

Gin.

Gly

Ala

Ser

Ala-

Phe

180

185

190

Pro

Thr

Thr

Ile

Asn

Phe

Thr

Arg

Gin

Arg

Gin

Pro

Ser

Glu

Gly

Ser

195

200

205

Ser

Ser

Arg

Glu

Glu

Glu

Glv

Pro

Ser

Thr

Ser

Cvs

Ile

Leu

Glu

Ser

210

215

220

Leu

Phe

Arg

Ala

Val

Ile

Thr

Lys

Lys

Val

Ala

.Asp

Leu

Val

Gly

Phe

225

230

223

240

Leu

Leu

Leu

Lys

Tvr

Arg

Ala

Are

C-lu

Pro

Val

Thr

Lys

Ala

Glu

Met

245

250

255

Leu

Glu

Ser

Val

Zle

Lys

Asn

Tyr

Lys

S

Cys

Phe

Pro

Glu

Ile

Phe

260

265

270

Gly

Lys

Ala

Ser

Glu

Ser

Leu

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Zle

Asp

Val

Lys

275

230

285

Glu

Ala

Asp

Pro

Thr

Gly

His

Ser

T V ”

Val

Leu

Val

Thr

Cys

Leu

Gly

290

29 =

300

Leu

Ser

Tyr

Asp

Gl?

Leu

Leu

Gly

Asp

Asn

Gin

Zle

Met

Pro

Lys

Thr

305

310

315

320

Gly

Phe

Leu

Ile

Zle

val

Leu

Val

Mez

Zle

Ala

Met

Glu

Gly

Glv

His

325

33C

335

Ala

Pro

Glu

Gxu

Glu

11*

Tro

C-lu

Glu

Lau

Ser

Val

Glu

Val

Tyr

340

34 =

350

Asp

Gly

Arg

Glu

Eis

2 927

Ala

Tyr

Gly

C-lu

Pro

Arg

Lvs

Leu

Leu

Thr

35 5

360

365

.i

As o

Leu

Val

Gin

Glu

Lys

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Arg

Gin

Val

Pro

Asp

370

375

320

Ser

Asp

Pro

Ala

Arg

T?r

Glu

Phe

Leu

Trp

G1 v

□ -0

Arg

Ala

Leu

Ala

385

390

395

4 00

Glu

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Leu

Glu

Tvr

Val

1 1

Lvs

Val

Ser

Ala

405

410

415

Arg

Val

Arg

Phe

Phe

Phe

Pro

Ser

Leu

Arg

Glu

Ala

Ala

Leu

Arg

C-lu

420

42:

43G

Glu

1 . .

Glu

Gly

Val

Gly

Gly

His

Eis

Eis

Has

His

HiS

: Hi£

435 440 445

-29CZ 298347 B6

2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 404 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence. SEQ ID NO: 5:

Met

Asp

Pro

Asn

Thr z ->

val

Ser

Ser

Phe

Gin 13

Val

A.sp

Cys

Phe

Leu 15

Trp

Has

Val

Arg

Lvs

Arg

Val

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly

Asp

Ala

Pro

Phe

2Ó

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Arg

Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

GLv

Arg

Gly

Ser

35

40

45

TI- ~

Leu

Gly

Leu

Asp

Zle

Glu

TU -

Ala

TU -

Arg

.Ala

Gly

Lys

Gin

Zle

50

55

60

Val

Glu

Arg

Zle

Leu

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Met

Thr

65

7C

75

90

Met

Asp

Leu

Glu

Gin

Arg

Ser

Sir.

Hl Ξ

Cys

Lys

Pro

Glu

Glu

Gly

Leu

35

90

95

C-lu

Ala

Arg

Gly

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

Val

Gly

Ala

Gin

Ala

Pro

Ala

100

135

110

Thr

Glu

Glu

Gin

Glu

Ala

Ala

Ser

Ser

Ser

Ser

TU-

Leu

Val

Glu

Val

115

120

125

Thr

Leu

Gly

Glu

Val

Pro

Ala

.Ala

Glu

Ser

Pra

Aso

Pro

Pro

Gin

Ser

130

125

140

Pro

Gin

Giy

Ala

Ser

Ser

Leu

?rc

Thr

Thr

Ma-

Asn

Tyr

Pro

Leu

Tro

145

150

155

160

Ser

Glr.

Ser

7yr

Glu

Asp

Ser

C i r-

Asn

Gin

Glu

Glu

Glu

Gly

Pro

Ser

165

170

175

Thr

Phe

Pro

AS O

Leu

Glu

Ser

Giu

Phe

Gin

Ala

Ala

Leu

Ser

Arg

Lys

13 0

19 5

190

vaL

Ala

Glu

Leu

Val

His

Phe

Leu

Leu

Leu

Lys

Tyr

Arg

Ala

Arg

Glu

195

200

205

?ro

val

TJ*

Lys

Ala

Glu

Met

Leu

_ _

Ser

Val

Val

Gly

Asn

Trp

Gin

210

215

220

Tvr

Phe

Phe

Pru

Val

Zle

Phe

Ser

Lys

Ala

Ser

Ser

Ser

Leu

Gin

Leu

225

230

235

240

Val

Phe

Gly

Zle

Glu

Leu

Met

Glu

Val

As o

Pro

Zle

Gly

His

Leu

Tyr

245

250

255

Ile

Phe

Ala

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Tyr

.Asp

Gly

Leu

Leu

Gly

Asp

260

263

270

Asn

Gin

Zle

Met

Pra

Lys

Ala

,-1,, —

Leu

Leu

z 1 ?

Zle

Val

Leu

Ala

Ile

275

230

295

Zle

Ala

Arg

Glu

Gly

Asp

Cvs

Ala

Pro

Glu

Glu

Lvs

Zle

Trp

Glu

Glu

290

295

300

Leu

Ser

Val

Leu

Glu

Val

Phe

o 1 u

G-y

Arg

G-u

Asp

Ser

Zle

Leu

Glv

305

310

315

320

Asp

Pro

Lys

Lys

Leu

Leu

71

Gin

His

Phe

Val

Gin

Glu

Asn

Tyr

Leu

325

330

335

Glu

Tyr

Arg

Gin

Val

Pro

Gly

Ser

Asp

- fc Srf

Ala

Cys

Tyr

Glu

Phe

Leu

340

345

350

Trp

Gly

Pro

Arg

Ala

Leu

Val

Glu

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Leu

His

355

360

365

His

Met

val

Lys

Ile

Ser

Gly

Gly

Pro

His

Zle

Ser

Tyr

Pro

Pro

Leu

370

375

390

His

Glu

Trp

Val

Leu

Arg

G x u

Gly

Glu

Glu

Gly

Gly

HiS

His

His

His

3Θ5 350 yy₅

Has His His

-30CZ 298347 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1212 páru bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

ur. l	L x.	rvtúc i k i s-AU	r'··’”!. - »*· U --IL3M. . u _ _	ί.^ΛΛ—ρρ,---- - - ~ X * X	C’j l CCGCAj-^-,	6G
z— z— T Í i ,’J	ACCAAGAACT	AGGTGATGCC	C~ VTC^TTG	a.tcGuGTtcg	C CG AG AT CaG	120
aaatccctaa	GAGGAAGGGG	GAGCACTCTT	G G T C 7 GGA. CA	TCGAGACAGC	CACACGTGCT	eso
cGAAA.GCAGA.	TAGTGGAGCG	GAT T CTG AAA	’λ-λΟΑΑΤ w w -	.AT G AijGCA.C T	TAAAATGAC C	240
ATGGACCTGG	AAC AsiCsrT AG	TCA.íjCACTGC	AA>j c G T G,“_-.	A-AGGCCTTGA	GGCCCGAGGA	300
GAGGCCCTGG	GCCTGGTGCG	TGCGCAGGCT	L Λχ. . 'J	AG v Aw« A	r-r— mmr <*/-- X UXlU- ÍC-	3 60
	CTCTAGTTGA GTCCTCAGGG	l ^Z»AX ρ-'Ζ·»/' AGCCTCCAG^	GcjXJ-.‘jkj _ W	— - ^1». Gv — wA	GTCA.CCAC-AT	420
C , - _ ^,.-λοΑ	C TC C C CAC T A	CCATGAACTA	CGGTCTCTGG	480
AGCCAATCCT	ATGAGGACTC	CAGCAACGAA	U ,-“i U f. <2 u.-.v v	uGCCAAGC.AC	Λ—'Τ' 'r z·'z —'PX* · /' L 1 - ·—v-x. , urV	540
ČTGC-AG TCCG	“1 — <· n Γ- -X' _	AGCACTCAGT	1 r“H -h r* Λ r.-JUGVAUxJ .	CCGAATTGG?	’C-1TT7''C'^	c00
CTCCTC.AAGT	* /-'-'«η JI 1 XírtkJ X»	GGA.uCl. íjGTC	A———*. *j .t v.	1 Λ *i <r A* «* W Ζ» — z-i .-LTU-l i \jC .	GAGTGTCGCC	cóO
^GA-^-ATTGGC	agtatttctt	TCCTGTGATC	TTCAG CAA--.1-·	i—pmz-j— ^Qzr.mr	CTTGGAGCTG	720
GTCTTTGGCA	TCGAGCTGAT	GG AAG i v7<j/i.C	- wL3l;x,C	ACTTGTACAT	CTTTGCGAGG	780
TGCGTGGGCC	tctcctacga	TGC^— i ^<.Τνϊ	GoT-.-iCAs,.,	•-.g.AT C AT GCC	CAAGGCAGC-C	840
CTCCTGATAA	TCGTCCTGG C	CATAATCGCA	AGAGAGGGCG	ACTGTGCCCC	T U rt-^r V AG AAA	=00
ATCTGGGAGG	AGCTGAGTGT	GTTAGAGGTG	tttgagggga	GxjGAAGAC.AG	TATCTTGGGG	960
GATCCCAAGA	AGCTGCTCAC	CCAACATTTC	GTGCAGGAAA	’ f’’* z-p-·*.-1'— . ---Τ-'ρ, V, . Plun	GTACCGGCavj	1020
GTCCCCGGCA	GTGATCCTGC	η τ. ·π/~ Ί ή.;·ς » ..-.. ur.-	TTC-TGTGGij	G TCCAAGGGC	cgtcgttga-a	1090
ACCAGGTATG	'TGAAAGTCCT	GCACCATATG	«. AAAG ATC ?.	GTGGAGGACC	TGACATTTCC	1140
TACCCACCCC	T G C AT 'jAG T G	L-GTTTTGAGr.	G A u sj jxjxj j	.“.ucjCGGTCA	TCACGATCAC	1200
CATCACCATT	AA					1212

(2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 445 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Met

Lys

Gly

Gly

Zle

Val

His

Ser

Asp

Glv

Ser

Tyr

Pro

Lys

ASD

Lys

1

5

ioJ

15*

Phe

Glu

Lys

Zle

Asn

Gly

Thr

Trp

T

ff·.

ph, a

Asp

Ser

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Met

Leu

Ala

Asp

Arg

Arg

Lys

Eis

'L,

Asp

Gly

Asn

Trp

Tyr

Trp

35

4 ó

45

Phe

Asp

Asn

Ser

Gly

Glu

Met

Ala

Thr

Gly

-í> „r. i. , y

Lvs

Lys

Ile

Ala

Asp

50

55

6Ó

Lys

Trp

Tyr

Tyr

Phe

As a

Glu

Glu

Gly

Ala

Met

Lys

Thr

Gly

Trp

val

65

70

75

30

Lys

Tyr

Lys

Asp

Thr

Trp

Tyr

Tyr

Leu

ASC

Ala

Lys

Glu

Gly

Ala

Met

85

$0'

95

Val·

Ser

Asn

Ala

Phe

Ile

Gin

Ser

Ala

Asp

Gly

Thr

Gly

Tro

Tyr

Tyr

100

105

110

Leu

Lys

Pro

Asp

Glv

mj, _

Leu

Ala

Asp

Arg

Pro

Glu

Leu

A.SO

Met

Gly

115

120

125

Ser

ceu

Glu

Gin

Arg

Ser

Leu

Hus

C/5

Lys

Pro

Glu

Glu

Ala

Leu

Glu

130

135

140

Ala

Gin

Gin

Glu

Ala

Leu

Gí.y

Leu

r r _ 1 • O. i.

Cys

Val

Gin

Ala

Ala

Thr

Ser

14 5

150

155

160

Ser

Ser

Ser

Pro

Leu

Val

Leu

Gly

Tb.r

Leu

Glu

Val

Pro

Thr

Ala

16c

170

175

Gly

Ser

7* *

Aso

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

Gl.n

Gly

n i _ Λ-LQ

Ser

Ala

Phe

Prc

13 0

18 5

190

Thr

mt-l 7

7 ' a

Asr,

Phe

Thr

Arg

Gin

Arg

Gin

Prc

Sec

Glu

Gly

Ser

Ser

195

200

205

Ser

Ar^

Glu

Glu

Glu

Gly

Pro

Ser

Thr

Ser

Cys

λ

Leu

Glu

Ser

Leu

210

215

220

?he

Arg

Ala

Val

Ile

Thr

Lys

Lys

Val

P.2.«

Ase

Leu

Val

Gly

Phe

Leu

225

230

235

240

Leu

Leu

Lys

Tyr

Arg

Ala

.Arg

Glu

Pro

Val

Thr

Lys

Ala

Gx u

Met

Leu

245

250

255

Glu

Ser

Val

Zle

Lys

Asn

Tyr

Lys

His

Cys

Phe

Pro

Glu

Zle

Phe

Gly

260

265

270

Lys

Ala

Ser

Glu

Ser

Leu

Gin

Leu

Val

phe

Gly

Zle

Aso

Val

Lys

Glu

275

280

235

Ala

Asp

Pro

TU,

Gly

Hus

Ser

Tyr

v a i

Leu

Val

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

290

295

300

Ser

Tyr

Asp

Gly

Leu

Leu

Gly

Asp

Asn

Gin

Zle

Mn £

Pro

Lys

Thr

Gly

305

310

315

320

Phe

Leu

Zle

Zle

Val

Leu

Val

Met

ile

Ada

Met

G-U

Gly

Gly

His

ALď

325

330

335

Pro

u —L·

Glu

Gx u

Zle

Trp

Glu

Glu

Leu

Ser

Val

Met

Glu

Val

Tyr

Asp

340

345

350

Gly

Arg

Glu

Hus

Ser

Ala

Tyr

Glv

Glu

Prc

Arg

Lys

Leu

Leu

Thr

Gin

355

360

365

Asp

Leu

Val

Gin

Glu

Lys

Tvr

Leu

Glu

T vr

Are

Gin

Val

Pro

Asp

Ser

370

375

380

A_sp

Pro

Ala

Arg

Tyr

Glu

Phe

Leu

Trp

Gly

Pro

Arg

Ala

Leu

Ala

Glu

365

390

295

400

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Leu

Glu

Tyr

Val

Zle

Lys

Val

Ser

Ala

Arg

405

410

415

Val

Arg

Phe

Phe

Pro

Ser

Leu

Aru

Glu

Au a

Ala

Leu

Arg

Glu

Glu

420

425

4 30

Glu

Glu

Civ

Val

Gly

Gly

Eis

His

Hus

Hus

His

His

His

435

440

445

CZ 298J47 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1338 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

ATGAAAGGC-G	GAATTGTACA TTCAGACGGC	TCTTATCCAA	λλ v: A C AAG T T	TGAGAAAATC	60
A-ATGGCACTT	GGTACTACTT TGACAGTTCA	G vjCT ATAT G C	7TGCAGACCG	CTGGAGGAAG	120
CACACAGACG	GCAACTGGTA CTGGTTCGAC	AACTCAGGCG	AAATGGCTAC	AGU*,, x G^jAA^j	180
AAAATCGCTG	ATAAGTGGTA CTATTTCAAC	AAia AAG GTG	CCATGAAGAC	riGGCTGxjGTC	240
AAG TACAAG w	ACACTTGGTA CTACTTAGAC	GCTAAAGAAG	GCGCCATGGT	ATCAAATGCC	300
TTTATCCAGT	CAGCGGACG.J AACAGGCTGvj	TACTACCTCA	AACCAGACGG	AACACTGGCA	360
GACAGGCCAG	AATTGGACAT GGGCTCTCTG	Z * W z- Λ (,	GTCTGCACTG	CAAGCCTGAG	420
GAAGCCCTTG	AGGCCCAACA AGAGGCCCTG	GGCCTGGTGT	; 'jTGCAGGC	TGCCACCTCC	480
TCCTCCTCTC	CTCxkjij.CC. G<aG*—ACCC, G	G.híjxjaGGTGC	ν νΛΌ i x oxj	GTCAACAGAT	540
CCTCCCCAGA	GTCCTCAGGG AGCCTCCGCC	TTTCCCAC 7 A	CCATCAACTT	CACTCGACAG	600
AG vj AAC C C A	GTGAGG^TTC CAGGAGCCGT	GAA.GAGGAGG	GGCCAAGCAC	CTCTTGTATC	660
X Gvar-iG 1 x- -T	TGTTCCGAGC AGTAATCACT	AAGAAGG7GG	CTGATTTGGT	TGGTTTTCTG	720
CTCCTCAAAT	ATGGAGCCAG GGA.aCCAG	ACAAAGGCAG	AAAT GCT GGA	GAGTGTCATC	780
AAAAATTACA	AGCACTGTTT TCCTGAGATC	rp m 1 — y- f T> » » r~ X k	CCTCTGAGTC	CTTGCAGCTG	340
uTCTTTGG^A	TTGACGTGAA GGAí-.^c.AGAc-	C -T C A^ C- G s; C'«	ACTCCTATGT	CCTTGTCACC	500
TGCCTAGGTC	TCTCCTATGA TGGCCTGCTG	GGT GA.7 AAT c	AGATCATGCC	l. AAG-z-iCf^G^j C	960
TTC CT G AT AA	TTGTCC“GGT CATGATTGCA	atggagggcg	GCCATGCTCC	i GAGxjAkJkaA-A	1020
AT“TGGGAGG	A.GCTGAGTGT G.ATGGAGGTG	*Γ Tr* nr«- r LilΝ-·ί	oGGAG CACAG	TGCCTATGGG	108 0
GAGCCCAGGA	agctggtcac ccaagatttg	G T GCAtjijAAA.	— v-rAzAy—P	GTACCGGCAG	1140
G x vai— C jijAC.--	GTGATCCCGC ACGCTATGAG	ttcctgtggg	GTCv,nAG<;G'-	CCTCGCTGAA	1200
ACCAGCTATG	« A -> /τη rfi^rrir-. X ví.tAAkr X - X ί 1.1X U 1	λ í kj AAGu 7 CA	GTux,AAGAGT	TCGCTTTTTC	1260
TTCCCATCCC	TGCGTGAAGC A\ív*TTGAG?*.	G AG—AG <j A.-, u	AGGGAGTCGG	CGGTCATCAC	1320
CATCACCATC	ACCATTAA				1338

(2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 454 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

- a? CZ 298347 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Μλ *2	Lys Gly Gly „le	Val	His Ser	Asp	Glv Ser Tvr Pro 10	L/5	Asp Lys
Phe	Glu Lys Ile ,Asr.	Gly	Thr	Trp	* VT	Tyr Phe Asp Ser	Ser	Gly	Tyr
	v _J				25		30
Met	i_eu Aí-3. .-.$3 Arg	T	c	Lvs	•íis	Thr Asp Gly Asn	Tm	Tyr	Trp
	u o			40		45
?!re	Asc A_sn Ger Glv	<r — LL	Mez	Λ-L U	Tn -	Glv Tm Lvs Lvs	Ile	Ala	Asp
	50’		55			50
Lys	Trp Tyr Tyr Phe	Asn	Glu	Glu	Gly	Ala Mez Lys Thr	Gly	Trp	Val
0 -		70				7 5			30
_ ·, Ξ	Tyr Lys Asp Thr	2rp	Tyr	Tyr	Leu	.Aso Ala Lvs Glu	Gly	Ala	Mez
	65					90		95
Val	Ser Asn Ala. Phe	Σ Σθ	Gin	Ser	Ala	Asp Gly Thr Gly	Trp	Tyr	Tyr
	100				• *1 *		110
Leu	Lys Pro Aso Glv	Thr	Leu	Ala	Asp	Arg Pro Glu Leu	A. a	Ser	Met
	115			120		125
Leu	Aso Mez Aso Leu	Glu	Gin	Arg	Ser	Gin His Cvs Lvs	Pro	Glu	Glu
	L3Ó		135			140
Gly	Leu Glu Ala Arg	Gly	Glu	Ala	Leu	Gly Leu Val Gly	Ala	Gin	Ala
145		150				155			160
Pro	Ala Thr Glu Glu	Gin	Glu	Ala	Ala	Ser Ser Ser Ser	Thr	Leu	Val
	155					70		175
Glu	Val Thr Leu Glv	Glu	V a a.	Pro	Ala	Ala Glu Ser Pro	Asp	Pro	Pro
	180				195		190
Gin	Ser Pro Gin Glv	Ala	Ser	Ser	Leu	Pro Thr Thr Met	Asn	Tyr	Pro
	195			200		205
Leu	Tm Ser Gin Ser	Tyr	Glu	Asp	Ser	Ser Asn Gin Glu	Glu	Glu	Gly
	210		215			220
Pro	Ser Thr Phe Pro	Asp	Leu	Glu	Ser	Glu rhe Gin Ala	Ala	Leu	Ser
225		230				235			240
Arg	Lvs Val Ala Glu	Leu	Val	His	Phe	Leu Leu Leu Lvs	Tyr	Arg	Ala
	245					250		255
Arg	Glu Pro val Thr	Lys	.Ala	Glu	Mez	Leu Gly Ser 'Val	Val	Gly	Asn
	260				265		270
Trp	Glr. Tvr Phe Phe	Pro	Val	Ile	Phe	Ser Lys Ala Ser	Ser	Ser	Leu
	275			280		2S5
Glr.	Leu Val Phe Gly	Ile	Glu	Leu	Met	Glu Val Asp Pro	Ile	Gly	Hus
	290		295			300
Leu	Tyr Ile Phe Ala	Thr	Cys	Leu	Gly	Leu Ser Tyr Aso	Gly	Leu	Leu
305		320				315			320
Gly	Ano Asn Glr. Ile	Met	Pro	Lys	Ala	Glv Leu Leu Ile	a	Val	Leu
	325					330		233
Ala	Ile Ile Ala Are	G _ u	Gly	Asp	Cvs	Ala Pru Glu Glu	Lvs	I_e	Tm
	340				345		350
Glu	Glu Leu Ser Val	Leu	ú	Val	Phe	ulu G_v Are Glu	Asp	Ser	Ile
	35 5			3 Ó0		365
Leu	Glv Aso Pro Lvs	Lys	Leu	Leu	Thr	G-.n Sos Phe Val	Glr.	u	Asn
	370		Ϊ *			390
Tvr	Leu Glu Tyr Arg	Gin	Val	Pro	Gly	Ser Asp Pro Ala	Cys	T’/r	Glu
385		390				295			400
Pr.e	Leu Tm Gly Pro	Ar 7	Ala	Leu	Val	Glu Thr Ser Tyr	Val	Lys	Val
	405					4 _0		415
Leu	His Hus Mez Val	Lys	Ile	Ser	Gly	Gly Pro Pis Ile	Ser	Tyr	Pro
	420				425		430
Pro	Leu His u_u Trp	Val	Leu	Arg	Olu	G - y Clu Gm G_ y	Cly	His	His
	435			4 40		445

Eis His His His His

450

- 34 CZ ZM8347 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1362 páru bází (B) Typ: nuklcová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

A 7 G AzíAG G	GAATTGTACA	TTCAGACGGC	TCTTATCCAA	AAG AC AAG TT	TC-AGAAAATC	60
.*v-., ubu-r.L· - *		TGACAG7TCA	G*ju . .“.TATGC	T. jG.AjAGCG	CTGGAGGAAG	120
i_ ACACAGz-v- G	GCAACTGGTA	CTGGTTCGAC	AACT C AG G i_ G	hAAT 1 j <j i_ T AC	AGGCTGGAAG	180
AAAAT C G CTG	ATAAGTGGTA	CTATTTCAAC	GAAGAAGGTG	CCATGAAGAC	AGGu i uGG í.	240
AAG T ACAAGu	ACACTTGGTA	C. i Au i	Γ ~rn Ί Ί Λ , . Λ JU X	GCGCCATGGT	ATCAAATGGC	30C
; - -Λ. ^„AGT	C AG C G AC tz	AACAGGCTGG	TACTACCTCA	-•v^C »,AGAu	AAC AC T GG CA.	3 60
GACAGGCCAG	AATTGGCCAG	GATGCTGGAC	A x . <, ; uu	.AACAGCGTAG	TCAGCACTGC	450
	AAGGCCTTGA	α αχ- L ΙτΛααΛ	. jo	bCCTGuTGGG	TGCGCAGGCT	43G
CC7GCTACTC-	AGGAGCAGGA	GGuTG<,^- - -	TCCTCTTCTA	CTC7AGTTGA	AGTCACGCTG	540
GGGGAGGTxjC	C X	GTCACCAGAG	CCTCCCCAGA	uT^CT AGju	AGCCTCCAGC	600
CTCCCCACTA	CC.ATGAACTA	CGCTCTCTGG	,ιυ(.υΛΛ i Cu .	ATGAGGACTC	CAGCAACCAA	660
G AA G AG AG xj	GGGCAAGCAC	CTTCCCTGAC	CTGGř.GTCTG	.“u TTC GAavj c	AGCACTCAGT	720
AG vrAAG G T G G	i . ijui -	TCATTTTCTG	CTCCTCAAGT	ATCGAGCCAG	GGAGCCGGCC	780
ACAAAGGCAG	AAAT GCTGxjG	C-ACTGTCGTC	GGAAATTGGC	AGTACTTCTT	TCCTGTGATC	840
CT CAGCAAAG	CTTCCGATTC	< » i u	/-» O j-w v clc ; - <. ujvjc-	TCGAGCTGAT	*. J* * «1 i	900
..SrUA·. 'wk3tí'-C	AC GT GT ACAT	CTTTGCCACC	TaV-C *	TCTZCTACGA	fFI í—í—Γ-r r-Ti-rt f-· í-1*p <— - 1 VjXx, 1 x_7	960
is ur T G rCAl T u	AGATCATGCC	C*-AG AC Au u u	TTCGCGATAA	1 UÍSxC^T-J^JU	CATAATCGC.A	3020
AAAG AG‘j^ c j	ACTGTGCCCC	TGAGGAGAAA	ATCTGGcAGG	AjCTGAGTGT	gttagaggtg	1080
tttgagggga	u G G AAG AC.AG	TATCT7CGGG	GATCCCAAC-A	AJv x 1 -wrtU	a n ** *» λ L γ>1 l - v.	1140
GTGCAGGAAA	AC T .AC ~ 7 GGA.	GTACCGGCAG	C . UU'^·	_ Gr·. - CCTGC	?, fTrr-— r* - » rt 1	L20C
TTCCTGTGGG	GTCCAAGGGu	uCTuATTGA-	ACCAGCTATG	TGAAAGTCCT	GCACCATATG	12 60
GTAAAGATCA	ρττ, r. n . ,. tT-r	ηι >—i i i-ι η ΑΊφφ^Γ* • *. * 4 . s-—	TACGCACTCC	TGCATGAGTG	GGCTTTGAC-A	1320
	-jLjT CA	T CAC CATCAu	-I — , <·-. - __-- i	.---i		1362

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (17)

1. huzní protein z rodiny MÁGE sestávající z antigenu MÁGE a fůzního partnera, vyznačující se tím. žc fúzním partnerem je protein D nebo jeho derivát, NS1 protein infkienzy nebo jeho fragment, nebo C-lytA ze Strcptococcus pneumoniac nebo jeho fragment.

2. Fúzní protein podle nároku 1, vyznačující se tím. že obsahuje derivatizované volné thioly, které jsou karboxyamidovanc nebo karboxymethylovanc.

3. Fúzní protein podle nároku I, v y z n a č u j í c í sc tím, že dále obsahuje afinitní tag.

4. Fúzní protein podle některého z nároků 1 až 3, v y z n a č u j í c í se tím. žc protein D nebo jeho fragment je lipidovaný.

5. Fúzní protein podle některého z nároků 1 až 4, v y z n a č u j t c í se t í m , že se protein MÁGE volí ze skupiny MÁGE Al, MÁGE A2, MÁGE A3, MÁGE A4. MÁGE A5. MÁGE A6. MÁGE A7, MÁGE A8, MÁGE A9, MÁGE A10, MÁGE Al I, MÁGE Λ12. MÁGE Bl. MÁGE B2, MÁGE B3, MÁGE B4, MÁGE Cl a MÁGE C2.

-35CZ 298347 B6

6. Fúzní protein podle některého z nároků 1 až 5. vyznačující se tím. že antigen

MÁGE a fúzní partner jsou chemicky konjugovány.

5

7. Fúzní protein podle některého z nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že antigen

MÁGE a fúzní partner jsou exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny.

8. Sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein podle nároku 7.

io

9. Vektor, obsahující nuklcovou kyselinu podle nároku 8.

10. Hostitelská buňka, transformovaná nukleovou kyselinou podle nároku 8 nebo vektorem podle nároku 9.

15

11. V akci na. vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein podle některého z nároků laž.7.

12. Vakcina podle nároku 11. vyznačující se tím. že dále obsahuje adjuvans a/nebo imunostimulační cytokin nebo chemokin.

13. Vakcina podle nároku 11 nebo 12. vy znač uj ící se tím. že protein je připraven \e vehíkulu. jím je emulze typu olej ve vodě.

14. Vakcina podle nároku 12 nebo 13. vyznačující se tím. že adjuvans obsahuje 25 3D MLP. QS21 nebo CpG oligonukleotid.

15. Vakcina podle některého z nároku 11 až 14, vyznačující se tím. že dále obsahuje jeden nebo více dalších antigenů.

30

16. Vakcina podle některého z nároků II až 14 pro použití v lékařství.

17. Použití fúzního proteinu podle některého z nároků 1 až 7 nebo nukleové kyseliny podle nároku 8 pro výrobu vakcíny pro imunotherapeutickou léčbu nemocných trpících melanomem, karcinomem prsu, močového měchýře, plic. NSCLC. karcinomem hlavy nebo spinocelulániím 35 karcinomem, karcinomem tlustého střeva nebo jícnu nebo jiným nádorem, asociovaným s MÁGE.