ES2367998T3 - Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, usados para la preparación de proteínas de fusión y de composiciones para vacunación. - Google Patents
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Abstract
Uso de un derivado de antígeno asociado a tumores de la familia MAGE que comprende residuos de tioles derivados para la fabricación de una vacuna para tratar de forma inmunoterapéutica a un paciente que padece un tumor asociado a MAGE, en el que el tumor asociado a MAGE se selecciona de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago.
Description
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La presente divulgación se refiere al uso de un derivado antígeno asociado a tumores de la familia MAGE que comprende residuos de tioles derivatizados para la fabricación de una vacuna para tratar de forma inmunoterapéutica a un paciente que padece un tumor asociado a MAGE, en el que el tumor asociado a MAGE se selecciona de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago. La presente descripción se refiere a derivados de proteínas, que comprenden un antígeno asociado a tumores, que resultan útiles en terapia de vacuna contra el cáncer. En particular los derivados de la divulgación incluyen proteínas de fusión que comprenden un antígeno codificado por la familia de genes MAGE (por ejemplo MAGE-3, MAGE-1), unido a una pareja de fusión inmunológica que proporciona epítopes de auxiliares T, tales como, por ejemplo, la forma lipidada de la proteína D de Haemophilus influenzae B; proteínas MAGE químicamente modificadas en las que los puentes disulfuro del antígeno están reducidos y los tioles resultantes están bloqueados y las proteínas MAGE genéticamente modificadas se proporcionan con una marca de afinidad y/o genéticamente modificadas para prevenir la formación de puentes disulfuro. También se describen procedimientos para purificar proteínas MAGE y para formular vacunas para tratar una gama de cánceres, que incluye, pero no se limita a, melanoma, mama, vejiga, pulmón, NSCLC, carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago.
Los antígenos codificados por la familia de genes MAGE se expresan predominantemente sobre células de melanoma (incluyendo melanoma maligno) y algunos otros cánceres incluyendo NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células transitorias de vejiga y carcinoma de esófago, pero no son detectables sobre tejidos normales excepto en los testículos y placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 se expresa en el 69 % de los melanomas (Gaugler, 1994), y también se puede detectar en el 44 % de NSCLC (Yoshimatsu 1988), en el 48 % de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, en el 34 % de carcinoma de células transitorias de vejiga, en el 57 % de carcinoma de esófago, en el 32 % de cánceres de colon y en el 24 % de cánceres de mama (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Los cánceres que expresan proteínas MAGE se conocen como tumores asociados a Mage.
La inmunogenicidad de células de melanoma humano se ha demostrado de manera elegante en experimentos que usan cultivos mixtos de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos cultivos a menudo generan linfocitos T citotóxicos específicos (CTL) capaces de lisar exclusivamente las células de melanoma autólogas pero ni fibroblastos autólogos ni los linfocitos B autólogos transformados por EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Varios de los antígenos reconocidos sobre células autólogas de melanoma por estos clones de CTL están ahora identificados, incluyendo los de la familia MAGE.
El primer antígeno que se podría definir a través de su reconocimiento por CTL específicos sobre células de melanoma autólogas se denomina MZ2-E (Van den Eynde, 1989) y está codificado por el gen MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). Los CTL dirigidos contra MZ2-E reconocen y lisan células de melanoma positivas MZ2-E de autólogos así como de otros pacientes con tal que estas células tengan el alelo HLA.A1.
El gen MAGE-1 pertenece a una familia de 12 genes estrechamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados en el cromosoma X y que comparten entre sí del 64 al 85 % de homología en su secuencia codificadora (De Plaen, 1994). Estos son algunas veces conocidos como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12 (la familia MAGE A). Otros dos grupos de proteínastambién son parte de la familia MAGE aunque relacionados de manera más distante. Éstos son el grupo MAGE B y MAGE C. La familia MAGE B incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1, y DAM 10), MAGE B2 (también conocido como MAGE Xp2, y DAM 6), MAGE B3 y MAGE B4 -la familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2. En términos generales, una proteína MAGE se puede definir por contener una firma de secuencia central localizada hacia el extremo C terminal de la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1 una proteína de 309 aminoácidos, la firma central corresponde a 195 -279 aminoácidos).
El patrón de consenso de la firma del núcleo se describe así como sigue en la que x representa cualquier aminoácido, los residuos del caso inferior se conservan (variantes conservadoras permitidas) y los residuos del caso superior se conservan perfectamente.
Firma de la secuencia central
Las sustituciones conservadoras son bien conocidas y generalmente se exponen como las matrices de puntuación por defecto en programas de ordenador de alineación de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft
M. O. y col., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, en “Atlas of Protein sequence and estructure” 5
(3) M. O. Dayhoft (ed.), 345 -352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acids sustitution matricies from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915 -10919.
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En términos generales, la sustitución dentro de los siguientes grupos son sustituciones conservadoras, pero las sustituciones entre los grupos se consideran no conservadas. Los grupos son:
i) Aspartato / asparagina / glutamato / glutamina
ii) Serina / treonina
iii) lisina / arginina
iv) fenilalanina / tirosina /triptófano
v) Leucina / isoleucina / valina / metionina
vi) Glicina / alanina
En general y en el contexto de esta divulgación, una proteína MAGE será aproximadamente un 50 % idéntica en esta región central con 195 a 279 aminoácidos de MAGE A1.
Varios epítopes de CTL se han identificado sobre la proteína MAGE -3. Tal epítope, MAGE-3.A1, es una secuencia nonapeptídica localizada entre los 168 y 176 aminoácidos de la proteína MAGE-3 que constituye un epítope específico para las CTL cuando se presentan en asociación con la molécula de la clase I de MHC HLA.A1. Recientemente se han identificado dos epítopes de CTL adicionales sobre la secuencia de péptidos de la proteína MAGE-3 por su capacidad de montar la respuesta CTL en un cultivo mixto de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos dos epítopes tienen motivos de unión específica para los alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) y HLA.B44 (Herman, 1996) respectivamente.
El documento WO9504542 da a conocer el aislamiento y la producción del gen MAGE – 1 completo y la identificación y análisis de péptidos de MAGE inmunogénicos. Se sugiere la fusión con el péptido de auxiliares T, opcionalmente a través de un espaciador.
La presente divulgación proporciona derivados de la proteína MAGE. Los derivados de este tipo son adecuados para uso en las formulaciones de vacunas terapéuticas que son adecuadas para el tratamiento de diversos de tipos de tumores.
En una realización de la presente divulgación, el derivado es una proteína de fusión que comprende un antígeno de la familia de proteínas MAGE unido a una pareja heteróloga. Las proteínas se pueden conjugar químicamente, pero se expresan preferentemente como proteínas de fusión recombinantes que permiten la producción de niveles incrementados en un sistema de expresión en comparación con proteínas no fusionadas. De este modo la pareja de fusión puede asistir en la proporción de los epítopes auxiliares T (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes de los auxiliares T reconocidos por seres humanos, o asistir en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Preferentemente la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de expresión.
En una forma preferida de la divulgación, la pareja de fusión inmunológica se deriva de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa, Haemophilus influenza B (documento WO91/18926). Preferentemente, el derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer 1/3 de la proteína, en particular, aproximadamente los 100-110 primeros aminoácidos N terminales. Preferiblemente, el derivado de la proteína D está lipidado. Preferentemente los 109 primeros residuos de la pareja de fusión de la lipoproteína D se incluye en el extremo N para proporcionar el antígeno candidato de vacuna con epítopes de células T exógenos adicionales e incrementar el nivel de expresión en E. coli (actuando así como un potenciador de expresión). La cola lipídica asegura la presentación óptima del antígeno a las células presentadoras de antígeno.
Otras parejas de fusión incluyen la proteína no estructural de virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Normalmente se usan los 81 aminoácidos N terminales, aunque se pueden usar diferentes fragmentos con tal que incluyan epítopes de auxiliares T.
En otra realización la pareja de fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA. Preferiblemente se usa la porción terminal C de la molécula. LYTA se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-Lalanina amidasa, amidasa LYTA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265 -272} una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura central de peptidoglicano. El dominio C -terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o algunos análogos de colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de las proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795 -798}. Como se usa en esta memoria descriptiva una realización preferida usa la porción repetida de la molécula Lyta encontrada en el extremo C terminal que comienza en el residuo 178. Una forma particularmente preferida incorpora los residuos 188 -305.
Las parejas de fusión inmunológicas indicadas anteriormente también son ventajosas para ayudar en la expresión. En particular, tales fusiones se expresan con rendimientos mayores que las proteínas MAGE recombinantes nativas.
Los presentes inventores han demostrado que tales construcciones en un escenario clínico son capaces de tratar melanomas. En un caso, se eliminó la metástasis de un paciente con melanoma de fase IV después de dos dosis de proteína lipo D 1/3 MAGE 3 His no adyuvantada.
Por consiguiente, la presente divulgación en la realización proporciona proteínas de fusión que comprenden un antígeno asociado a tumores derivado de la familia MAGE unidos a una pareja de fusión inmunológica. Preferentemente, la pareja de fusión inmunológica es proteína D o un fragmento de la misma, más preferentemente lipoproteína D. Las proteínas MAGE son preferentemente MAGE A1 o MAGE A3. La parte de lipoproteína D comprende preferentemente el primer 1/3 de la lipoproteína D.
Las proteínas de la presente divulgación se expresan preferentemente en E. coli. En una realización preferida las proteínas se expresan con una marca de afinidad, tal como por ejemplo, una cola histidina que comprende entre 5 y9 y preferentemente seis residuos histidina. Éstos son ventajosos ayudando a la purificación.
La presente divulgación también proporciona un ácido nucleico que codifica las proteínas de la presente divulgación. Tales secuencias se pueden insertar en un vector de expresión adecuado y usar para vacunación de ADN / ARN o expresar en un huésped adecuado. Los vectores microbianos que expresan el ácido nucleico se pueden usar como vacunas. Tales vectores incluyen por ejemplo, poxvirus, adenovirus, alfavirus, listeria y monarfago.
Una secuencia de ADN que codifica las proteínas de la presente divulgación se pueden sintetizar usando técnicas de síntesis de ADN convencionales, tales como mediante ligamiento enzimático como describen D. M. Roberts y col, en Biochemistry 1985, 24, 5090 -5098, mediante síntesis química, mediante polimerización enzimática in vitro, o mediante tecnología PCR que usa por ejemplo una polimerasa estable al calor, o mediante una combinación de estas técnicas.
La polimerización enzimática de ADN se puede llevar a cabo in vitro usando una ADN polimerasa tal como ADN polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón apropiado que contiene los trifosfatos de nucleósidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP como se requiere a una temperatura de 10 º a 37 ºC, generalmente en un volumen de 50 l o menos. El ligamiento enzimático de los fragmentos de ADN se puede llevar cabo usando una ADN ligasa tal como ADN ligasa de T4 en un tampón apropiado tal como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl2 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina, a una temperatura de 4 ºC a ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml o menos. La síntesis química del polímero o fragmentos de ADN se puede llevar a cabo mediante química convencional de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita, usando técnicas de fase sólida tal como las descritas en ‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments -A Laboratory Manual’ (ed. H. G. Gassen y A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones científicas, por ejemplo M. J. Gait, H. W. D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat, y R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat, y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci y M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci y M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H. W. D. Mattes y col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
El procedimiento de la divulgación se puede realizar mediante técnicas recombinantes convencionales tal como describen Maniatis y col., Molecular Cloning -A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 -1989.
En particular, el procedimiento puede comprender las etapas de:
i) preparar un vector de expresión replicable o de integración capaz, en una célula huésped, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o un derivado inmunogénico de la misma;
ii) transformar una célula huésped con dicho vector;
iii) cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones que permiten la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y
iv) recuperar dicha proteína.
El término ‘transformación’ se usa en esta memoria descriptiva para referirse a la introducción de ADN extraño en una célula huésped. Esto se puede lograr por ejemplo mediante transformación, transfección o infección con un plásmido apropiado o vector viral que usa, por ejemplo, técnicas convencionales como se describe en Genetic Engineering: Eds. S. M. Kingsman y A. J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. El término ‘transformado’ o ‘transformante’ se aplicará de aquí en adelante a la célula huésped resultante que contiene y expresa el gen extraño de interés.
Los vectores de expresión son novedosos y también forman parte de la divulgación.
Los vectores de expresión replicables se pueden preparar de acuerdo con la divulgación, mediante escisión de un vector compatible con la célula huésped para proporcionar un segmento de ADN lineal que tiene un replicón intacto, y combinando dicho segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal codifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la divulgación, o derivado de la misma, en condiciones ligantes.
De este modo, el polímero de ADN se puede preformar o formar durante la construcción del vector, según se desee.
La elección del vector lo determinará en parte la célula huésped, que puede ser procariótica o eucariótica pero son preferiblemente E. coli o células CHO. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes.
La preparación del vector de expresión replicable se puede llevar a cabo de manera convencional con enzimas apropiadas para restricción, polimerización y ligamiento del ADN, mediante procedimientos descritos en por ejemplo, Maniatis y col., citado anteriormente.
La célula huésped recombinante se prepara, de acuerdo con la divulgación, transformando una célula huésped con un vector de expresión replicable de la divulgación en condiciones de transformación. Las condiciones adecuadas de transformación son convencionales y se describen, por ejemplo, en Maniatis et al., citado anteriormente, o “DNA Cloning” Vol. II, D. M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.
La elección de las condiciones de transformación la determina la célula huésped. De esta manera, un huésped bacteriano tal como E. coli se puede tratar con una solución de CaCl2 (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) o con una solución que comprende una mezcla de RbC1, MnCl2, acetato de potasio y glicerol, y después con ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbC1 y glicerol. Las células de mamífero en cultivo se pueden transformar mediante coprecipitación con calcio del ADN del vector en las células. La divulgación también se extiende a una célula huésped transformada con un vector de expresión replicable de la divulgación.
El cultivo de la célula huésped transformada en condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN se lleva a cabo de manera convencional, como se describe, por ejemplo, en Maniatis y col. y en “DNA Cloning” citado anteriormente. De esta manera, preferiblemente la célula se suministra con nutriente y se cultiva a una temperatura por debajo de 50 ºC.
El producto se recupera mediante procedimientos convencionales de acuerdo con la célula huésped y de acuerdo con la localización del producto de expresión (intracelular o secretado en el medio de cultivo o en el periplasma de la célula). De este modo, cuando la célula huésped es bacteriana, tal como E. coli, se puede, por ejemplo, lisar física, química o enzimáticamente y el producto proteico se aísla del lisado resultante. Cuando la célula huésped es un mamífero, el producto generalmente se puede aislar del medio nutriente o de los extractos libres de células. Las técnicas de aislamiento de proteínas convencionales incluyen precipitación selectiva, cromatografía de adsorción, y cromatografía de afinidad que incluye una columna de afinidad de anticuerpos monoclonales.
Las proteínas de la presente divulgación se proporcionan o bien solubles en una forma líquida o en una forma liofilizada.
En general se espera que cada dosis humana comprenderá 1 a 1000 g de proteína, y preferentemente 30 -300 g.
La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente divulgación en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Una composición de vacuna preferida comprende al menos lipoproteína D -MAGE-3. Tal vacuna puede contener opcionalmente uno o más de otros antígenos asociados a tumores. Por ejemplo otros miembros que pertenecen a las familias MAGE y GAGE. Otros antígenos asociados a tumores adecuados incluyen MAGE -1 y GAGE -1 o proteínas de tirosinasa.
La preparación de vacunas generalmente se describe en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds. Powell M. F. & Newman M. J.). (1995) Plenum Press Nueva York). La encapsulación dentro de liposomas la describe Fullerton, patente de Estados Unidos nº 4.235.877.
Las proteínas de la presente divulgación se adyuvantan preferentemente en la formulación de vacuna de la divulgación. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre)
o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos o polifosfacenos derivados catiónicamente o aniónicámente. Otros adyuvantes conocidos incluyen oligonucleótidos que contienen CpG. Los oligonucleótidos se caracterizan porque el dinucleótido CpG está sin metilar. Tales oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/02555.
En la formulación de las divulgaciones se prefiere que la composición de adyuvantes induzca una respuesta inmune preferentemente del tipo TH1. Los sistemas de adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente 3-des-O-acilado monofosforil lípido A (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Los oligonucleótidos CpG también inducen preferentemente una respuesta TH1.
Un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739.
Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida.
Por consiguiente, en una realización de la presente divulgación se proporciona una vacuna que comprende una proteína de la presente divulgación, más preferentemente una lipoproteína D (o derivado de la misma) -MAGE-3 adyuvantada con un monofosforil lípido A o derivado del mismo.
Preferentemente, la vacuna adicionalmente comprende una saponina, más preferentemente QS21.
Preferentemente, la formulación adicional comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La presente divulgación también proporciona un procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende mezcla de una proteína de la presente divulgación junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL.
En un aspecto de la divulgación se proporciona un procedimiento para purificar una proteína MAGE producida de manera recombinante. El procedimiento comprende la solubilización de la proteína, por ejemplo en un agente caotrópico fuerte (tal como por ejemplo, urea, clorhidrato de guanidinio), o en un detergente de ion bipolar, por ejemplo, (Empigen BB -n-dodecil-N,N-dimetilglicina), que reduce los enlaces intra e intermoleculares disulfuro de la proteína, bloqueando los tioles resultantes para evitar el reacoplamiento oxidante, y someter la proteína a una o más etapas cromatográficas.
Preferiblemente, el agente bloqueante es un agente alquilante. Tales agentes bloqueantes incluyen pero no se limitan a haloácidos alfa o haloamidas alfa. Por ejemplo ácido yodoacético y yodoacetamida que da como resultado la carboximetilación o carboxiamidación (carbamidometilación) de la proteína. Otros agentes bloqueantes se pueden usar y se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, The Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill y C -L Boeder, Academic Press 1976, o Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad y CM Noyes, CRC Press 1985). Los ejemplos típicos de tales otros agentes bloqueantes incluyen N-etilmaleimida, fosfato de cloroacetilo, O-metilisourea y acrilonitrilo. El uso del agente bloqueante es ventajoso ya que previene la agregación del producto, y asegura la estabilidad de la purificación cadena abajo.
En una realización de la divulgación, los agentes bloqueantes se seleccionan para que induzcan un derivado covalente e irreversible estable (por ejemplo haloácidos alfa o haloamidas alfa). Sin embargo, se pueden seleccionar otros agentes bloqueantes de manera que después de la purificación el agente bloqueante se pueda retirar para liberar la proteína no derivada.
Las proteínas MAGE que tienen residuos tiol libres derivados son nuevas y forman un aspecto de la divulgación. En particular, los derivados carboxiamidados o carboximetilados son una realización preferida de la divulgación.
En una realización preferida de la divulgación las proteínas de la presente divulgación se proporciona con una marca de afinidad, tal como CLYTA o una cola de polihistidina. En tales casos, la proteína después de la etapa de bloqueo se somete preferiblemente a cromatografía de afinidad. Para las proteínas con una cola de polihistidina, se puede realizar cromatografía de afinidad por ion metálico inmovilizado (IMAC). El ion metálico, puede ser cualquier ion metálico por ejemplo, cinc, níquel, hierro, magnesio o cobre, pero es preferentemente cinc o níquel. Preferentemente, el tampón IMAC contiene un detergente de ion bipolar tal como Empigen BB (de aquí en adelante en esta memoria descriptiva Empigen) ya que esto da como resultado niveles inferiores de endotoxina en el producto final.
Si la proteína se produce con una parte Clyta, la proteína se puede purificar explotando su afinidad para colina o análogos de colina tal como DEAE. En una realización de la divulgación las proteínas se proporcionan con una colade polihistidina y una parte Clyta. Éstas se pueden purificar en un programa sencillo de purificación cromatográfico de afinidad de dos etapas.
La divulgación se describirá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos:
Ejemplo I:
Preparación de la cepa de E. coli recombinante que expresa la proteína de fusión lipoproteína D-MAGE-3-His (LPD 1/3-MAGE-3-His o LpD MAGE-3-His)
Para la producción de Lipoproteína D, el ADN que codifica la proteína D se ha clonado en el vector de expresión pMG 81. Este plásmido usa señales del ADN del fago lambda para dirigir la transcripción y traducción de genes extraños insertados. El vector contiene el promotor de PL lambda PL, operador OL y dos sitios de uso (NutL y NutR) para liberar los efectos de polaridad transcripcional cuando se proporciona la proteína N (Gross et al., 1985 Mol. & Cell. Biol. 5:1015). Los vectores que contienen el promotor PL, se introducen en un huésped lisogénico de E. coli para estabilizar el ADN de plásmido. Las cepas huésped lisogénicas contienen ADN de fago lambda defectuoso de replicación integrado en el genoma (Shatzman y col., 1983; en Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) p. 1 -14. Academic Press N. Y.) El ADN del fago lambda dirige la síntesis de la proteína represora cI que se une al represor OL del vector y previene la unión de ARN polimerasa al promotor PL y por lo tanto la transcripción del gen insertado. El gen cI de la cepa de expresión AR58 contiene una mutación sensible a temperatura de manera que la transcripción dirigida por PL se puede regular por deslazamiento de temperatura, es decir, un incremento en la temperatura de cultivo inactiva el represor y se inicia la síntesis de la proteína extraña. Este sistema de expresión permite la síntesis controlada de proteínas extrañas especialmente de aquellas que pueden ser tóxicas a la célula (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292: 128).
La cepa de E. coli lisogénica AR58 usada para la producción de la proteína LPD-MAGE-3-His es un derivado de la cepa de K12 de E. coli de NIH N99 patrón (F-su-galK2, LacZ-thr-). Contiene un fago lambda lisogénico defectuoso (galE::TN10, 1 Kil-cI857 DH1). El fenotipo Kil previene el corte de la síntesis macromolecular del huésped. La mutación cI857 confiere una lesión sensible a la temperatura al represor cI. La supresión DH1 retira el operón derecho del fago lambda y los loci bio, uvr3, y chlA de huéspedes. La cepa AR58 se generó mediante transducción de N99 con una disolución madre de fago lambda P desarrollada previamente sobre un derivado SA500 (galE::TN10, 1 Kil-c-I857 DH1). La introducción del lisogen defectuoso en N99 se seleccionó con tetraciclina en virtud de la presencia de un transposón TN10 que codifica resistencia a tetraciclina en el gen adyacente galE. N99 y SA500 son cepas de E. coli K12 derivadas del laboratorio del Dr. Martin Rosenberg en el Instituto Nacional de Salud.
La base fundamental era expresar MAGE 3 como una proteína de fusión que usa el tercio N-terminal de la proteína D lipidada como una pareja de fusión conectada en el extremo N de MAGE-3 y una secuencia de varios residuos de histidina (cola His) colocada en el extremo C.
La proteína D es una lipoproteína (una proteína de unión a la inmunoglobulina D de 42 kDa expuesta sobre la superficie de la bacteria Gram -negativa Haemophilus influenzae). La proteína se sintetiza como un precursor con una secuencia señal de residuo de 18 aminoácidos, que contiene una secuencia de consenso para la lipoproteína bacteriana (documento WO 91/18926).
Cuando la secuencia señal de una lipoproteína se procesa durante la secreción, la Cys (en la posición 19 en la molécula precursora) llega a ser el residuo amino terminal y se modifica de manera simultánea mediante unión covalente de ácidos grasos tanto unidos por éster como unidos por amida.
Los ácidos grasos unidos al residuo cisteína amino terminal funcionan entonces como un anclaje de membrana.
El plásmido que expresa la proteína de fusión se diseñó para expresar una proteína precursora que contiene la secuencia señal de 18 aminoácidos y los primeros 109 residuos de la proteína D procesada, dos aminoácidos no relacionados (Met y Asp), residuos de aminoácidos 2 a 314 de MAGE-3, dos residuos Gly que funcionan como una región bisagra para exponer los siete residuos His posteriores.
La cepa recombinante produce de esta manera la proteína de fusión con cola His lipidada procesada de 432 residuos de aminoácidos (véase la figura 1), con la secuencia de aminoácidos descrita en ID N.º 1 y la secuencia codificadora se describe en ID Nº 2.
Se usaron un plásmido de ADNc (del Dr Thierry Boon del Instituto Ludwig) que contiene la secuencia codificadora para el gen MAGE-3 (Gaugler B y col., 1994), y el vector PRIT 14586, que contiene la porción N-terminal de la secuencia codificadora de Lipo-D-1/3 (preparada como se esquematiza en la figura 2). La estrategia de clonación incluía las siguientes etapas (figura 3).
a) -Amplificación de PCR de las secuencias presentadas en el plásmido MAGE 3 del ADNc usando el oligonucleótido de sentido: 5’ gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, y el oligonucleótido de sentido opuesto: 5’ gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa); esta amplificación conduce a las modificaciones siguientes en el extremo N: cambio de los cinco primeros codones al uso del codón de E. coli, reemplazo del codón Pro mediante un codón de Asp en la posición 1, instalación de un sitio NcoI en la extremidad 5’ y finalmente la adición de dos codones 2 Gly y el codón de 7 His seguido de un sitio XbaI en el extremo C.
b) -Clonación en el vector de clonación de TA de invitrogen del fragmento amplificado anteriormente y preparación del vector intermedio pRIT14647.
c) -Escisión del fragmento NcoI XbaI del plásmido pRIT14647 y clonación en el vector pRIT14586.
d) -Transformación de la cepa huésped AR58.
e) Selección y caracterización de los transformantes de la cepa de E. coli que contienen el plásmido pRIT 14477, que expresa la proteína de fusión LPD-MAGE-3-His.
Ejemplo II:
Preparación del antígeno LPD1/3 -MAGE -3 His
1. Crecimiento e inducción de la cepa bacteriana -Expresión de LPD1/3 -MAGE-3 -His:
Células de AR58 transformadas con plásmido pRIT14477 se cultivaron en matraces de 2 litros, conteniendo cada uno 400 ml de medio LY12 suplementado con extracto de levadura (6,4 g/l) y sulfato de kanamicina (50 mg/l). Después de la incubación sobre una mesa en agitación a 30 ºC durante 8 + / -1 h, se retiró una pequeña muestra de cada matraz para examen microscópico. El contenido de los dos matraces se reunió proporcionando el inóculo para el fermentador de 20 litros.
El inóculo (aproximadamente 800 ml) se añadió a un fermentador preesterilizado de 20 litros (volumen total) que contenía 7 litros de medio, suplementado con 50 mg/l de sulfato de kanamicina. El pH se ajustó y se mantuvo a 6,8 mediante la adición periódica de NH4OH (25 % v/v), y la temperatura se ajustó y se mantuvo a 30 ºC. La velocidad de aireación se ajustó y se mantuvo a 12 litros de aire/minuto y la tensión de oxígeno disuelto se mantuvo al 50 % de saturación mediante control por retroalimentación de la velocidad de agitación. La sobrepresión en el fermentador se mantuvo a 500 g/cm2 (0,5 bares (50 kPa)).
El cultivo por lotes se llevó a cabo mediante la adición controlada de una solución nutriente de carbono. La solución nutriente se añadió a una velocidad inicial de 0,04 ml/min, y se incrementó de manera exponencial durante las primeras 42 horas para mantener una velocidad de crecimiento de 0,1 h-1 .
Después de 42 horas, la temperatura en el fermentador se incrementó rápidamente hasta 39 ºC, y la velocidad de alimentación se mantuvo constante a 0,005 ml/g DCW/min durante la fase de inducción durante 22 -23 horas adicionales, tiempo durante el que la expresión intracelular de LPD-MAGE-3-His alcanzó un máximo nivel.
Se tomaron alícuotas (15 ml) de caldo a intervalos regulares a lo largo de las fases de crecimiento / inducción y al final de la fermentación para seguir la cinética de crecimiento microbiano y expresión del producto intracelular y además, proporcionando muestras para ensayos de identificación / pureza microbiana.
Al final de la fermentación, la densidad óptica del cultivo estaba entre 80 y 120 (correspondiente a una concentración de células de entre 48 y 72 g de DCW/L) y el volumen de líquido total era aproximadamente 12 litros. El cultivo se enfrió rápidamente hasta entre 6 y 10 ºC, y las células de ECK32 se separaron del caldo de cultivo mediante centrifugación a 5000 x g a 4 ºC durante 30 minutos. Las células concentradas de ECK32 se almacenaron rápidamente en bolsas de plástico y se congelaron inmediatamente a -80 ºC.
2. Extracción de la proteína:
Las células concentradas congeladas de ECK32 se descongelaron hasta 4 ºC antes de que se volvieran a suspender en tampón de rompimiento de células hasta una densidad óptica final de 60 (que corresponde a una concentración de células de aproximadamente 36 g de DCW/L).
Las células se rompieron mediante dos pases mediante un homogeneizador de alta presión (1000 bares (100000 kPa)). La suspensión de células rotas se centrifugó (x 10000 g a 4 ºC durante 30 minutos) y la fracción sedimentada se lavó dos veces con Triton x 100 (1 % p/v) + EDTA (1 mM), seguido de un lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + Tween 20 (0,1 % v/v) y finalmente un lavado con PBS. Entre cada fase de lavado, la suspensión se centrifugó a x 10000 g durante 30 minutos a 4 ºC, el sobrenadante se desechó y se retuvo la fracción sedimentada.
Ejemplo III:
Caracterización de la proteína de fusión Lipo D -MAGE 3:
LPD-MAGE-3-His se purificó del homogeneizado celular usando una secuencia de etapas descritas más adelante:
a) Solubilización de la fracción sedimentada lavada del rompimiento celular,
b) Reducción química de los enlaces disulfuro intra-e inter -proteína seguido de bloqueo de los grupos tiol para
prevenir el reacoplamiento oxidante,
c) Microfiltración de la mezcla de reacción para la retirada de partículas y reducción de endotoxinas,
d) Captura y purificación primaria de LPD-MAGE-3-His mediante explotación de la interacción de afinidad entre
la cola de polihistidina y Sepharose quelante cargada con cinc,
e) Retirada de las proteínas contaminantes mediante cromatografía de intercambio aniónico. La LPD-MAGE 3-His purificada se sometió a varias fases de refinamiento:
f) Intercambio de tampón / retirada de urea mediante cromatografía de exclusión de tamaño usando Superdex
75,
g) Filtración en-proceso,
h) Intercambio de tampón / desalación mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando Sephadex G25.
Cada una de estas etapas se describe con más detalle más adelante:
1.1) -Solubilización del sedimento de homogeneizado de células.
La fracción sedimentada de la fase de lavado final (como se ha descrito anteriormente) se volvió a solubilizar
durante toda una noche en 800 ml de una solución de clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) a 4 ºC.
1.2) -Reducción y carboximetilación El material solubilizado (una suspensión de color amarillo claro, turbio) se purgó con argón para depurar cualquier oxígeno restante, y se añadió una solución madre de 2-mercaptoetanol (14 M) para proporcionar una concentración final de 4,3 M (que corresponde a 0,44 ml de 2-mercaptoetanol por ml de solución).
La solución resultante se dividió y se transfirió en dos matraces de vidrio que se calentaron ambos hasta 95 ºC en un baño de agua. Después de 15 minutos a 95 ºC, se retiraron los matraces del baño de agua y se dejó enfriar, después el contenido se reunió en un recipiente cubierto con una hoja delgada (5 l), se colocó en hielo, y se añadió yodoacetamida sólida con mezcla vigorosa proporcionando una concentración final de 6 M (que corresponde a 1,11 g de yodo acetamida por ml de solución). La mezcla se mantuvo en hielo en la oscuridad durante 1 hora para asegurar la completa solubilización de la yodo acetamida, antes de neutralizarse (manteniendo agitación vigorosa y control continuado de pH) mediante la adición de aproximadamente 1 l de hidróxido sódico (5 M) proporcionando un pH final de 7,5 -7,8.
La mezcla resultante se mantuvo en hielo en la oscuridad durante 30 minutos adicionales, después de lo cual el pH se volvió a ajustar hasta pH de 7,5 -7,8.
1.3) -Microfiltración La mezcla se microfiltró en una unidad de flujo tangencial Amicon Proflux M12 equipada con un cartucho de fibra hueca Minikros (ref. Nº M22M-600-01N; 5600 cm 2 de área, 0,2 m). El permeado se retuvo para posterior purificación cromatográfica.
La cromatografía por metales quelados se realizó con Sepharose quelante FF (Pharmacia Biotechnology Nº de catálogo 17-0575-01) envasado en una columna BPG 100/500 (Pharmacia Biotechnology Nº de catálogo 18-110301). Las dimensiones del lecho envasado eran: diámetro 10 cm; área de la sección transversal 79 cm 2; altura del lecho 19 cm; volumen de envase 1500 ml. La columna vacía se sanitizó con hidróxido de sodio (0,5 M), después se lavó con agua purificada.
El soporte (distribuido en etanol al 20 % v/v) se lavó con agua purificada (8 litros) sobre un embudo Buchner (a vacío) y se cargó con cinc pasando al menos 15 litros de una solución de ZnCl2 (0,1 M). El exceso de cinc se retiró lavando el soporte con 10 litros de agua purificada, hasta que el pH del líquido de salida alcanzó el pH de la solución de ZnCl2 (pH 5,0). Después el soporte se equilibró con 4 litros de una solución que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0).
El permeado de la microfiltración, que contenía LPD-MAGE-3 His, se mezcló con el soporte (unión de lote), antes de cargar y envasar la columna de BPG con la solución que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0).
Las fases siguientes de cromatografía por metal quelado se llevaron a cabo a un caudal de eluyente de 60 ml/min. La columna se lavó, primero con la solución que contenía clorohidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0), después con la solución que contenía urea (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0), hasta que el eluyente de la columna alcanzó absorbancia cero a DO 280 nm (línea base).
La fracción de proteína semipura de LPD-MAGE-3-His se eluyó con 2 volúmenes de columna de una solución que contenía urea (6 M), fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) e imidazol (0,5 M). La conductancia de esta fracción era aproximadamente 16 mS/cm.
Antes de continuar con la cromatografía de intercambio aniónico, la conductancia de la fracción de proteína semipura de LPD-MAGE-3-His se redujo hasta aproximadamente 4 mS/cm mediante dilución con una solución que contiene urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).
La cromatografía de intercambio aniónico se realizó usando Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, nº de catálogo 17-0510-01) envasada en una columna BPG 200/500 (Pharmacia Biotechnology, nº de catálogo 18-110311). Las dimensiones del lecho envasado eran: diámetro 10 cm; área de la sección transversal 314 cm2; altura del lecho 9 cm; volumen de envase 2.900 ml.
La columna se envasó (con etanol al 20 % v/v) y se lavó con 9 litros de agua purificada a un caudal de eluyente de 70 ml/min. La columna envasada se sanitizó con 3 litros de hidróxido de sodio (0,5 M), se lavó con 30 litros de agua purificada, después se equilibró con 6 litros de una solución que contenía urea (6 M) y Tris -HCl (20 mM, pH 8,0). La LPD-MAGE-3-His diluida, semipurificada se cargó en la columna y después se lavó con 9 litros de una solución que contenía urea (6 M), Tris -HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) y Tween (0,1 %), hasta que la absorbancia (280 nm) del eluyente caía hasta cero.
Se realizó una etapa de lavado adicional con 6 litros de una solución que contenía urea (6 M) y Tris -HCl (20 mM, pH 8,0).
La LPD-MAGE-3-His purificada se eluyó de la columna con una solución que contenía urea (6 M), Tris -HCl (20 mM, pH 8,0) y NaCl (0,25 M).
La retirada de urea de la LPD-MAGE-3-His purificada y el intercambio de tampón se lograron ambos mediante cromatografía por exclusión de tamaño. Esto se realizó usando Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo 17-1044-01) envasada en una columna XK 50/100 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo 18-8753-01) Las dimensiones del lecho envasado eran: diámetro 5 cm; área de la sección transversal 19,6 cm2; altura del lecho 90 cm; volumen envasado 1.800 ml.
La columna se envasó en etanol (20 %) y se lavó con 5 litros de agua purificada a un caudal de eluyente de 20 ml/min. La columna se sanitizó con 2 litros de hidróxido sódico (0,5 M), se lavó con 5 litros de agua purificada, después se equilibró con 5 litros de solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 80 (0,1 % v/v).
La fracción de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo 500 ml / desarrollo de desalado) se cargó en una columna a un caudal de eluyente de 20 ml/min. La LPD-MAGE-3-His purificada desalada se eluyó de la columna con 3 litros de PBS que contenía Tween 80 (0,1 % v/v).
La fracción que contenía LPD-MAGE-3-His se eluyó hasta el volumen de vaciado de la columna.
La LPD-MAGE-3-His a granel de la cromatografía de exclusión por tamaño se filtró a través de una membrana de 0,22 m en una campana de flujo laminar (clase 10.000). El volumen filtrado se congeló hasta -80 ºC y se almacenó hasta la etapa de desalación.
1.8) -Cromatografía de desalación Ya que la osmolalidad del volumen final debe ser menor que 400 mOsM, se requería una etapa de intercambio de tampón adicional para reducir la concentración de sal. Esto se realizó mediante una etapa de cromatografía de desalación usando Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo 17-0033-02) envasada en una columna BPG 100/950 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo 18-1103-03). Las dimensiones del lecho envasado eran: diámetro 10 cm; área de la sección transversal 78,6 cm2; altura del lecho 85 cm; volumen envasado 6.500 ml.
El Sephadex G25 se hidrató con 7 litros de agua purificada y se dejó hinchar durante toda una noche a 4 ºC. El gel se envasó después en la columna con agua pura a una caudal de eluyente de 100 ml/min.
La columna se sanitizó con 6 litros de hidróxido sódico (0,5 M), después se equilibró con 10 litros de una solución que contenía fosfato sódico (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) y Tween 80 (0,1 % v/v).
La fracción de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo 1500 ml/desarrollo de desalación) se cargó en la columna a un caudal de eluyente de 100 ml/min. La fracción de LPD-MAGE-3-His purificada desalada eluida hasta el volumen de vaciado de la columna, se filtró de manera estéril a través de una membrana de 0,22 m y se almacenó a -80 ºC.
La proteína a granel final se descongeló hasta +4 ºC antes de que se tomaran alícuotas en viales y se secaron por congelación en un excipiente de lactosa (3,2 %).
El antígeno de LPD-MAGE-3-His purificado se analizó mediante SDS -PAGE sobre un gel de poliacrilamida al 12,5 % en condiciones reductoras.
La carga de proteína era 50 g para la tinción de azul Coomassie y 5 g para la tinción por nitrato de plata. Se analizaron el lote clínico 96K19 y el lote piloto 96J22. Se visualizó una banda principal correspondiente a un peso molecular de 60kDa. También se observaron dos bandas adicionales menores de aproximadamente 45 kDa y 35 kDa.
Los péptidos revelados mediante análisis de SDS -PAGE de la proteína LPD-MAGE-3-His se identificaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales de ratón. Estos anticuerpos se desarrollaron en la casa usando una preparación purificada de la proteína MAGE-3-His (esta proteína no contiene la parte LPD de la LPDMAGE-3-His).
Se han seleccionado dos preparaciones de anticuerpos monoclonales (Mab 22 y Mab 54) en base a la conveniencia para análisis por transferencia de Western y se usaron en el ensayo de identidad para la liberación del lote. La figura 4 muestra los patrones de banda obtenidos para los lotes 96K19 y 96J22 después de la tinción con Mabs 32 y 54. Se resolvieron seiscientos (600) ng de la proteína sobre un SDS -PAGE al 12,5 %, se transfirieron a una membrana de nylon, se hicieron reaccionar con Mabs 32 y 54 (60 g/ml) y se revelaron con anticuerpos anti -ratón acoplados a peroxidasa.
Los péptidos de 60 kDa y 30 kDa detectados mediante SDS -PAGE se revelaron mediante ambos Mabs.
Ejemplo IV:
1. Preparación de vacunas usando proteína LPD-MAGE-3-His:
La vacuna usada en estos experimentos se produce a partir de un ADN recombinante, que codifica una lipoproteína D 1/3-MAGE-3-His, expresada en E. coli a partir de la cepa AR58, o bien adyuvantada o no. Como un adyuvante, la formulación comprende una mezcla de 3 des-O-acilado monofosforil lípido A (3D-MPL) y QS21 en una emulsión aceite / agua. El sistema adyuvante SBAS2 se ha descrito previamente en el documento WO 95/17210.
3D-MPL: es un inmunoestimulante derivado del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria Gram negativa Salmonella minnesota. MPL se ha desacilado y carece de un grupo fosfato del resto del lípido A. El tratamiento químico reduce notablemente la toxicidad mientras que preserva las propiedades inmunoestimulantes (Ribi, 1986). La inmunoquímica Ribi produce y suministra MPL a SB-Biologicals.
Los experimentos realizados en Smith Kline Beecham Biologicals han mostrado que 3D-MPL combinada con diversos vehículos potencia fuertemente tanto el tipo humoral como el tipo TH1 de la inmunidad celular.
QS21: es una molécula de saponina natural extraída de la corteza del árbol de Sur América Quillaja saponaria Molina. Una técnica de purificación desarrollada para separar las saponinas individuales a partir de los extractos brutos de la corteza, permitió el aislamiento de la saponina particular. QS21, que es un glicósido de triterpeno que demuestra actividad adyuvante más fuerte y menor toxicidad cuando se compara con el componente precursor. QS21 se ha mostrado que activa las CTL restringida de clase I MHC a varias subunidades Ags, así como que estimula la proliferación linfocítica específica de Ag (Kensil, 1992). Aquila (formalmente Cambridge Biotech Corporation) produce y suministra QS21 a SB-Biologicals.
Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de las combinaciones de MPL y QS21 en la inducción de respuestas inmunes celulares tanto humorales como de tipo TH1.
La emulsión de aceite / agua se compone de una fase orgánica hecha de 2 aceites (un tocoferol y un escualeno), y una fase acuosa de PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía el 5 % de escualeno, el 5 % de tocoferol, el 0,4 % de Tween 80 y tenía un tamaño medio de partícula de 180 nm y se conoce como SB62 (véase el documento WO 95/17210).
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Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han probado que la adjunción de esta emulsión ac / ag a 3D-MPL/QS21 (SBAS2) incrementa adicionalmente las propiedades inmunoestimulantes de esta última contra diversas subunidades de antígenos.
2. Preparación de la emulsión SB62 (2 veces concentradas):
Se disuelve Tween 80 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) proporcionando una solución al 2 % en la PBS. Para proporcionar 100 ml de la emulsión concentrada dos veces 5 g de DL alfa tocoferol y 5 ml de escualeno se agitaron en un aparato vortex para mezclar completamente. Se añaden 90 ml de solución PBS/Tween y se mezcla concienzudamente. La emulsión resultante se pasa después a través de una jeringa y finalmente se microfluidifica usando una máquina de microfluidificación M110S. Las gotas de aceite resultante tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.
El adyuvante se formula en forma de una combinación de MPL y QS21, en una emulsión aceite / agua. Esta preparación se distribuye en viales de 0,7 ml a mezclar con el antígeno liofilizado (viales que contienen entre 30 y 300 g de antígeno).
La composición del diluyente de adyuvante para la vacuna liofilizada es como sigue:
- Ingredientes:
- Cantidad (por dosis):
- Adyuvantes
- Emulsión SB62:
- 250 l
- -Escualeno
- 10,7 mg
- -DL α-tocoferol
- 11,9 mg
- -Tween 80
- 4,8 mg
- Monofosforil lípido A
- 100 g
- QS21 Conservante
- 100 g
- Tiomersal Tampón
- 25 g
- Agua para inyección
- c. s. ajust 0,5 ml
- -Fosfato sódico dibásico
- 575 g
- -Fosfato potásico monobásico
- 100 g
- -Cloruro potásico
- 100 g
- -Cloruro sódico
- 4,0 mg
La vacuna final se obtiene después de reconstitución de la preparación de LPD-MAGE-3-His liofilizada con el adyuvante o con PBS solo.
Los controles de adyuvantes sin antígeno se prepararon reemplazando la proteína por PBS.
La lipoproteína D es una lipoproteína expuesta sobre la superficie de la bacteria Gram -negativa Haemophilus influenzae.
La inclusión de los primeros 109 residuos de la proteína D procesada como pareja de fusión se incorpora para proporcionar el antígeno de vacuna con epítopes de células T. Además del resto LPD, la proteína contiene dos aminoácidos no relacionados (Met y Asp), restos de aminoácidos 2 a 314 de Mage-3, dos residuos Gly que funcionan como región bisagra para exponer los siete residuos His posteriores.
Ejemplo V:
1. Inmunogenicidad de LPD-MAGE-3-His en ratones y monos:
Con el fin de ensayar la antigenicidad e inmunogenicidad de la proteína MAGE-3 humana, la vacuna candidata se inyectó en 2 cepas diferentes de ratones (C57BL/6 y Balb/C), variando en sus antecedentes genéticos y alelos MHC. Para ambas cepas de ratones, los motivos de péptido MHC clase -I y MHC clase -II se predijeron teóricamente para la parte MAGE de la proteína de fusión LPD-MAGE-3-His.
a) -Protocolo de inmunización:
5 ratones de cada raza se inyectaron dos veces a intervalos de dos semanas en la almohadilla de la pata con 5 g
de LPD-MAGE-3-His, formulada o no en SBAS2 a 1/10 de la concentración usada en las situaciones humanas.
b) -Ensayo de proliferación:
Los linfocitos se prepararon aplastando el bazo o los ganglios linfáticos poplíteos de los ratones, 2 semanas después de la última inyección. Se colocaron 2 x 105 células por triplicado en placas de 96 pocillos y las células se volvieron a estimular in vitro durante 72 horas con diferentes concentraciones (1 -0,1 g/ml) de His-Mage 3 como tal o revestidas en microperlas de látex.
Se observó un incremento de la actividad linfoproliferativa específica de MAGE-3 tanto con células de bazo (figuras 5 y 7) como con células de ganglios linfáticos (véanse las figuras 6 y 8) a partir de ratones o bien C57BL/6 o Balb/C inyectados con la proteína LPD-MAGE-3-His, cuando se compara con la respuesta linfoproliferativa de ratones que recibían la formulación SBAS-2 sola o PBS.
Además, una respuesta proliferativa mayor se obtuvo con linfocitos de ratones inmunizados con LPD-MAGE-3-His en el adyuvante SBAS2 (véanse las figuras 6 y 8).
c) -Conclusión:
LPD-MAGE-3-His es inmunogénica en ratones, y esta inmunogenicidad se puede incrementar mediante el uso de la formulación de adyuvante SBAS2.
2. Respuesta de anticuerpos:
a) -Protocolo de inmunización:
Ratones C57BL/6 o Balb/C se inmunizaron mediante 2 inyecciones dentro de la almohadilla de la pata a intervalos de dos semanas con o bien PBS, o SBAS2, o 5 g de LPD-MAGE-3-His, o 5 g de LPD-MAGE-3-His + SBAS2.
Se usaron tres y cinco animales en los grupos de control y en los grupos ensayados respectivamente.
b) -ELISA indirecto:
Dos semanas después de la segunda inyección, se tomaron sueros individuales y se sometieron a un ELISA indirecto.
2 g/ml de His MAGE 3 purificada se usó como antígeno revestido. Después de la saturación durante 1 hora a 37 ºC, en PBS + suero de ternera recién nacida al 1 %, los sueros se diluyeron en serie (partiendo a 1/1000) en el tampón de saturación y se incubaron durante toda una noche a 4 ºC, o 90 minutos a 37 ºC. Después de lavar en PBS/Tween 20,0,1 %, se usaron antisueros de IgG total anti ratón de cabra biotinilado (1/1000) o IgG1, IgG2a, IgG2b de anti -ratón de cabra (1/5000) como anticuerpos secundarios. Después de 90 minutos la incubación a 37 ºC. Se añadió estreptavidina acoplada a peroxidasa, y se usó TMB (peróxido de tetra-metil-bencidina) como sustrato. Después de 10 minutos, la reacción se bloqueó mediante la adición de H2SO4 0,5 M, y se determinó la D.
O.
c) -Resultados:
La figura 9 compara entre los diferentes grupos de ratones (N = 5/grupo), la titulación media del punto medio relativo de los sueros, que consiste en la dilución media necesaria para alcanzar el punto medio de las curvas.
Estos resultados muestran que en ambas cepas de ratones ensayadas, se observó una respuesta débil de Ab después de 2 inyecciones de LPD-MAGE-3-His sola, pero se generaron concentraciones mayores de Ab anti-MAGE 3 cuando se inyecta LPD-MAGE-3-His en presencia de SBAS2. De esta manera, solamente dos inyecciones de LPD-MAGE-3-His + SBAS2, a intervalos de 2 semanas, son suficientes para generar la respuesta alta de Ab observada.
La mejor respuesta de Ab observada en los ratones Balb/c cuando se compara con la respuesta obtenida en los ratones C57BL/6 se puede explicar mediante diferencias en haplotipos o en antecedentes entre estas 2 razas, incluso aunque la valoración de Ab en ratones C57BL/6 es también mayor después de inyecciones de LPD-MAGE3-His + SBAS2 que después de inyecciones con LPD-MAGE-3-His sola.
Las respuestas de anti-MAGE-3 específica de las subclases de Ig después de vacunaciones en los diferentes grupos de ratones se puede observar en las figuras 10 y 11, que proporcionan una comparación de la dilución media del punto medio del suero.
Ni IgA, ni IgM se detectaron en ninguna de las muestras de suero incluso de los ratones vacunados con LPD-MAGE3-His en el adyuvante SBAS2.
Por el contrario, el nivel de IgG total era ligeramente mayor en los sueros de ratones vacunados con LPD-MAGE-3His sola, y aumentaba significativamente en el suero d animales inyectados con LPD-MAGE-3-His en SBAS2.
El análisis de las concentraciones diferentes de subclases IgG muestran que se indujo respuesta de Ab mixta en los ratones, ya que los niveles de todas las subclases de IgG ensayadas (IgG1, IgG2a, IgG2b) eran mayores en ratones vacunados con Ag adyuvantada que en ratones inyectados con la Ag o el adyuvante solo.
La naturaleza de esta respuesta de Ab mixta con LipoD-MAGE-3 en presencia de SBAS2 parece sin embargo depender de la cepa de ratón, ya que IgG1 e IgG2b se encontraron predominantemente en el suero de ratones
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45
50
55 Balb/c y C57BL/6 respectivamente.
Se seleccionaron tres grupos de cinco animales Rhesus (Macaca mulatta). RTS,S y gp 120 se usaron como control
- positivo.
- Grupos:
- Grupo 1
- pata derecha: RTS,S/SBAS2
- pata izquierda: GP120/SBAS2
Grupo 2 pata derecha: RTS,S/SB26T
pata izquierda: GP120/SB26T
Grupo 3 pata derecha: LipoD 1/3 Mage 3 His/SBAS2
Los animales recibieron vacuna el día 0 y se reinmunizaron los días 28, y 84 y se extrajo sangre para determinar su respuesta de anticuerpo para tanto MAGE 3 como el componente de la proteína D. Las vacunas se administraron por vía intramuscular como una inyección de bolo (0,5 ml) en la parte posterior de la pata derecha.
Se tomaron pequeñas muestras de sangre cada 14 días. Se recogieron muestras de sangre no heparinizada de 3 ml de la vena femoral, se dejaron coagular durante al menos 1 hora y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 10 minutos a 2500 rpm.
Se retiró suero, se congeló a -20 ºC y se envió para determinación de los niveles de anticuerpo mediante Elisa específico.
Se revistieron placas de 96 pocillos (maxisorb Nunc) o bien con 5 g de His Mage 3 o Proteína D durante toda una noche a 4 ºC. Después de 1 hora de saturación a 37 ºC con PBS NCS 1 %, se añadieron diluciones en serie del suero de conejo durante 1 h 30 min. a 37 ºC (partiendo de 1/10), después de 3 lavados en PBS Tween, se añadió suero biotinilado anti conejo (Amerham ref RPN 1004 lote 88) (1/5000). Las placas de lavaron y se añadió estreptavidina acoplada a peroxidasa (1/5000) durante 30 minutos a 37 ºC. Después de lavar, se añadieron 50 l de TMB (BioRad) durante 7 minutos y se detuvo la reacción con H2SO4 0,2 M, se midió la DO a 450 nm. Las diluciones de punto medio se calcularon mediante SoftmaxPro.
Se tomaron muestras pequeñas de sangre cada 14 días para seguir la cinética de la respuesta de anticuerpos a Mage 3 mediante ELISA. Los resultados indican que después de una inyección de LPD1/3 Mage 3 His + SBAS2, la valoración de Ig total específica de Mage 3 era baja, se observó un estímulo claro en 3 de los 5 animales después de una segunda y tercera inyección de LipoD1/3 Mage 3 + adyuvante en los mismos monos. Los respondedores pobres permanecían negativos después de 3 inyecciones. 28 días después de II o después de III, las valoraciones de anticuerpos han retornado a los niveles basales. La subclase de estos anticuerpos se determinó como IgG predominantemente y no IgM. El cambio a IgG sugiere que se ha desencadenado una respuesta de auxiliar T. La respuesta de anticuerpo específica de la proteína D, aunque más débil, es exactamente paralela a la respuesta de anticuerpo Mage 3.
Ejemplo VI:
Se preparó LPD -MAGE 1 His de una manera análoga. Las secuencias de aminoácidos y ADN se muestran en las SECUENCIAS ID números 3 y 4. La proteína resultante se purificó de una manera análoga a la proteína LPDMAGE-3-His. En resumen, el cultivo celular se homogeneizó y se trató con guanidina HCl 4 M y beta mercaptoetanol 0,5 M en presencia de detergente Empigen al 0,5 %. El producto se filtró y se trató el permeado con yodo acetamida 0,6 M. Las fracciones carboxiamidadas se sometieron a cromatografía IMAC (quelato de cinc -sepharose FF). Primero la columna se equilibró y se lavó con una solución que contenía guanidina 4 M, HCl y fosfato sódico (20 mM, pH 7,5) y Empigen al 0,5 %, después la columna se lavó con una solución que contenía urea 4 M en fosfato sódico (20 mM, pH 7,5) 0,5 % de tampón Empigen. La proteína se eluyó en el mismo tampón, pero con concentración creciente de Imidazol (20 mM, 400 mM y 500 mM).
El eluato se diluyó con urea 4 M. La columna de Q-sepharose se equilibró y se lavó con urea 4 M en tampón fosfato 20 mM (pH 7,5) en presencia de Empigen al 0,5 %. Se realizó un segundo lavado en el mismo tampón, pero desprovisto de detergente. La proteína se eluyó en el mismo tampón pero con Imidazol creciente (150 mM, 400 mM, 1 M). El eluato se ultra filtró.
Construcción del plásmido de expresión pRIT14426 y transformación de la cepa huésped AR58 para producir NS1 -MAGE -3 His:
13
El diseño de la proteína de fusión NS1, -MAGE-3-His a expresar en E. coli se describe en la figura 12.
La estructura primaria de la proteína resultante tiene la secuencia expuesta en ID Nº 5.
La secuencia codificadora (ID Nº 6) correspondiente al diseño de proteína anterior se colocó bajo el control del
promotor λpL en un plásmido de expresión de E. coli.
El material de partida era un plásmido de ADNc recibido del Dr Tierry Boon del Instituto Ludwig, que contiene la secuencia codificadora para el gen MAGE-3 y el vector PMG81, que contiene los 81 aa de la región codificadora de NS1 (proteína no estructural) de Influenza.
La estrategia de clonación esquematizada en la figura 13 incluía las siguientes etapas:
a) amplificación de PCR de las secuencias presentadas en el plásmido MAGE-3 del ADNc usando el oligonucleótido de sentido: 5’ gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, y el oligonucleótido de sentido opuesto: 5’ gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa.
Esta amplificación conduce a las siguientes modificaciones en el extremo N: cambiando los cinco primeros codones al uso del codón de E. coli, reemplazo del codón Pro por un codón Asp en la posición 1, la instalación de un sitio NcoI en el extremo 5’ y finalmente la adición de los 2 codones Gly y el codón 7 His seguido de un sitio XbaI en el extremo C.
b) Clonación en el vector de clonación TA de invitrogen del fragmento amplificado anterior y preparación del vector intermedio pRIT14647
c) Escisión del fragmento NcoI XbaI del plásmido pRIT14647 y clonación en el vector pRIT PMG81
d) transformación de la cepa huésped AR58
e) selección y caracterización de los transformantes de la cepa de E. coli que contienen el plásmido pRIT14426 (véase la figura 14) que expresa la proteína de fusión NS1-MAGE-3-His
Se cultivaron bacterias sobre el medio LB suplementado con 50 g/ml de kanamicina a 30 ºC. Cuando el cultivo había alcanzado la DO = 0,3 (a 620 nm), la inducción por calor se logró elevando la temperatura hasta 42 ºC.
Después de 4 horas de inducción, se recogieron las células, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron (mediante disgregación) presionando tres veces en la prensa francesa. Después de centrifugación (60 minutos a 100.000 g), el sobrenadante sedimentado y el extracto total se analizaron mediante SDS -PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos con Coomassie B1 donde las proteínas de fusión representaban aproximadamente el 1 % de las proteínas totales de E. coli. La proteína recombinante aparecía en una sola banda con un peso molecular aparente de 44,9 K. La proteína de fusión se identificó mediante análisis de transferencia de Western usando anti -NS1 monoclonal.
La purificación de NS1-MAGE 3-His (E. coli) para inmunización de conejo / ratón.
Esquema de purificación:
Se usó el siguiente esquema de purificación para purificar el antígeno:
Lisis de células + centrifugación
↓
Solubilización de antígeno + centrifugación
↓
Ni2 + -NTA agarosa
↓
Concentración
↓
Célula prep.
↓
Precipitación de TCA y solubilización en PBS
a. Lisis
Se lisaron células bacterianas (23 g) en 203 ml de un tampón de PO4 pH 7 50 mM mediante Rannie (homogeneizador) y el lisado se centrifugó en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 30 minutos.
Se desechó el sobrenadante.
b. Solubilización de antígeno
1/3 del sedimento se volvió a solubilizar en O/N a 4 ºC en 34 ml de PO4 100 mM GuHCl 6 M pH 7. Después de la centrifugación en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 30 minutos, el sedimento se desechó y el sobrenadante se purificó adicionalmente mediante IMAC.
c. Cromatografía de afinidad: Ni2 + -NTA agarosa (Qiagen) Volumen de columna: 15 ml (16 mm x 7,5 cm) Tampón de envasado: PO4 0,1 M -GuHCl 6 M pH 7 Tampón de muestra: idem Tampón de lavado: PO4 0,1 M -GuHCl 6 M pH 7
PO40,1 M-urea 6 MpH 7 Elución: gradiente de imidazol (0 → 250 mM) en tampón PO4 0,1 M pH 7 suplementado con urea 6 M. Caudal: 2 ml/min
a. Concentración:
Fracciones positivas de antígeno del eluato IMAC (160 ml) se reunieron y se concentraron hasta 5 ml en una celda agitada por Amicon sobre una membrana Filtron (tipo Omega corte 10.000). La pureza a esta fase es aproximadamente del 70 % como se estima por SDS-PAGE.
b. Electroforesis preparativa (prep. Cell Biorad)
2,4 ml de la muestra concentrada se sometió a ebullición en 0,8 ml de tampón de muestra reductora y se cargó en un gel de acrilamida al 10 %. El antígeno se eluyó en un tampón Tris -glicina pH 8,3 suplementado con SDS al 4 % y se reunieron fracciones positivas de Ns1 -MAGE 3 His.
a. Precipitación de TCA:
El antígeno se precipitó por TCA y después de la centrifugación en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 20 minutos, el sobrenadante se desechó. El sedimento se volvió a solubilizar en tampón PBS pH 7,4.
La proteína es soluble en PBS después de que la congelación / descongelación no muestra ninguna degradación cuando se almacena durante 3 horas a 37 ºC y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 50.000 Daltons como se determina por SDS (12,5 % de PAGE).
Ejemplo IX:
Preparación de la cepa de E. coli que expresa una proteína de fusión CLYTA -MAGE -1 -cola His
El diseño de la proteína de fusión Clyta-Mage-1-His a expresar en E. coli se describe en la figura 15.
La estructura primaria de la proteína resultante tiene la secuencia expuesta en la secuencia ID Nº 7.
La secuencia codificadora (véase la SECUENCIA ID Nº 8) correspondiente al diseño de proteína anterior de colocó
bajo el control del promotor λ pL en un plásmido de expresión de E. coli.
Clonación:
El material de partida era el vector PCUZ1 que contiene los 117 codones C terminales de la región codificadora de LytA de Streptococcus pneumoniae y el vector pRIT14518, en el que previamente se había subclonado el ADNc del gen MAGE-1 de un plásmido recibido del Dr Thierry Boon del instituto Ludwig.
La estrategia de clonación para la expresión de la proteína CLYTA-Mage-1-His (véase el esquema de la figura 16) incluía las siguientes etapas:
2. Preparación del módulo de la secuencia codificadora CLYTA-Mage-1-His:
a) La primera etapa era una amplificación de PCR, destinada a flanquear las secuencias de CLYTA con los sitios de restricción NdeI-AfIII. La amplificación de PCR se realizó usando el plásmido PCUZ1 como molde y como cebadores el oligonucleótido de sentido: 5’ tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, y el oligonucleótido de sentido opuesto: 5’ GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Esto conduce a la amplificación de una secuencia de CLYTA de 378 nucleótidos.
b) La segunda etapa era la unión de las secuencias de CLYTA a las secuencias MAGE-1-His, para generar la secuencia codificadora para la proteína de fusión. Esta etapa incluía la escisión de un fragmento NdeI-AfIIII Clyta e inserción en el vector pRIT14518 abierto previamente mediante las enzimas de restricción NdeI y NcoI (NcoI y AfIIII compatible) y dio lugar al plásmido pRIT14613.
c) Transformación de la cepa huésped AR58
d) Selección y caracterización del transformante de E. coli (resistente a KAN) que contiene el plásmido pRIT14613. (Véase la figura 16).
Las bacterias se cultivaron en un medio LB suplementado con 50 g/ml de kanamicina a 30 ºC. Cuando el cultivo había alcanzado una DO = 0,3 (a 620 nm), la inducción por calor se logró elevando la temperatura a 38 ºC.
Después de 4 horas de inducción, las células se recogieron, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron (mediante disgregación) por un disparo. Después de la centrifugación, el sobrenadante sedimentado y extracto total se analizaron mediante SDS -PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos por Coomassie B1, cuando la proteína de fusión representaba aproximadamente el 1 % de las proteínas totales de E. coli. La proteína recombinante aparecía en una sola banda con un peso molecular aparente de aproximadamente 49 kD. La proteína de fusión se identificó mediante análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti-Mage-1.
Un fragmento de restricción EcoRI-NCO1 que contiene el promotor PL largo y una parte de las secuencias CLYTA se preparó a partir del plásmido pRIT DVA6 y se insertó entre los sitios EcoRI-NCO1 del plásmido pRIT14613.
Se obtuvo el plásmido recombinante pRIT14614.
El plásmido recombinante pRIT14614 (véase la figura 17) que codifica la proteína de fusión CLYTA-Mage-1-His se usó para transformar AR120 de E. coli. Se seleccionó y se caracterizó una cepa candidata resistente a Kan.
Se cultivaron bacterias en medio Lb suplementado con 50 mg/ml de kanamicina a 30 ºC. Cuando el cultivo había alcanzado una DO = 400 (a 620 nm) se añadió ácido nalidíxico hasta una concentración final de 60 mg/ml.
Después de 4 horas de inducción, se recogieron las células, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron mediante disgregación (tipo de “un disparo” de CLS de disgregación). Después de la centrifugación, el sobrenadante sedimentado y el extracto total se analizaron mediante SDS -PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos por azul Comassie, cuando la proteína de fusión representaba aproximadamente el 1 % de las proteínas totales de
E. coli. La proteína de fusión se identificó mediante análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti -Mage-1 de conejo. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con un peso molecular aparente de aproximadamente 49 kD.
Ejemplo X:
A: Antígeno recombinante de rechazo de tumores: una proteína de fusión CLYTA-Mage-3-His cuando la pareja de fusión de C-lyt A condujo a la expresión de una proteína soluble, actúa como marca de afinidad y proporciona un auxiliar T útil.
Preparación de la cepa de E. coli que expresa una proteína de fusión CLYTA -MAGE-3-cola His
Construcción del plásmido de expresión pRIT14646 y transformación de la cepa huésped AR 120:
Diseño de proteína:
El diseño de la proteína de fusión Clyta-Mage-3-His a expresar en E. coli se describe en la figura 18.
La estructura primaria de la proteína resultante tiene la secuencia descrita en la SECUENCIA ID nº 9 y la secuencia codificadora en la secuencia ID Nº 10.
La secuencia codificadora correspondiente al diseño de proteína anterior se colocó bajo el control del promotor λ pL en un plásmido de expresión de E. coli.
El material de partida era el vector PCUZ1 que contiene los 117 codones C terminales de la región que codifica LytA de Streptoccocus pneumoniae, descrita en Gene 43, (1986) p. 265 -272 y el vector pRIT14426, en el que los inventores han subclonado previamente el ADNc del gen de MAGE-3 a partir de un plásmido recibido del Dr Tierry
5
15
25
35
45
55
Boon del Instituto Ludwig.
La estrategia de clonación para la expresión de la proteína CLYTA-MAGE-3-His (véase el esquema en figura 19) incluía las siguientes etapas
1.1 La primera etapa era una amplificación de PCR, destinada a flanquear las secuencias CLYTA con los sitios de restricción AflII y AflIII. La amplificación de PCR se realizó usando el plásmido PCUZ1 como molde y como cebadores el oligonucleótido de sentido: 5’ tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, y el oligonucleótido de sentido opuesto: 5’ ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Esto conduce a la amplificación de una secuencia CLYTA de 427 nucleótidos de longitud. El fragmento amplificado anteriormente se clonó en el vector de clonación TA de Invitrogen para conseguir el vector intermedio pRIT14661.
1.2 La segunda etapa era la unión de las secuencias CLYTA a las secuencias MAGE-3-His, para generar la secuencia codificadora para la proteína de fusión. Esta etapa incluye la escisión de un fragmento Afl II-Afl-III Clyta e inserción en el vector pRIT14426 abierto previamente mediante las enzimas de restricción Afl II y NcoI (NcoI y AfIII compatible) y dio lugar al plásmido pRIT14662.
Un fragmento de restricción BgIII -XbaI que contenía el promotor pL corto y las secuencias codificadoras CLYTAMage-3-His se preparó a partir del plásmido pRIT14662, y se insertó entre los sitios BglII -XbaI del plásmido TCM67 (un derivado de pBR322 que contiene la resistencia a ampicilina, y el promotor λ pL largo, descrito en la solicitud internacional PCT/EP92/O1827). Se obtuvo el plásmido pRIT14607.
El plásmido pRIT14607 recombinante que codifica la proteína de fusión Clyta-Mage-3-His se usó para transformar AR 120 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, 82: 88). Una cepa candidata resistente a ampicilina se seleccionó y caracterizó.
Finalmente se construyó un plásmido similar a pRIT 14607 pero que tenía la selección de kanamicina (pRIT 14646)
Se cultivaron las bacterias sobre un medio LB suplementado con 50 mg/ml de kanamicina a 30 ºC. Cuando el cultivo había alcanzado una DO = 400 (a 600 nm) se añadió ácido nalidíxico hasta una concentración final de 60 ?g/ml.
Después de 4 horas de inducción, se recogieron las células, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron mediante disgregación (tipo de “un disparo” de CLS de disgregación). Después de la centrifugación, el sobrenadante sedimentado y el extracto total se analizaron mediante SDS -PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos con azul Coomassie, cuando la proteína de fusión representaba aproximadamente el 1 % de las proteínas totales de
E. coli. La proteína de fusión se identificó mediante análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti-Mage-3 de conejo. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con un peso molecular aparente de aproximadamente 58 kD.
Ejemplo XI:
Las bacterias recombinantes AR120 (pRIT 14646) se cultivaron en un fermentador de 20 litros en condiciones de alimentación por lote a 30 ºC. La expresión de la proteína recombinante se indujo añadiendo ácido nalidíxico a una concentración final de 60 ? g/ml. Las células se recogieron al final de la fermentación y se lisaron a 60 DO/600 mediante dos pases a través de un disgregador de prensa francesa (20.000 psi (137895 kPa)). Las células lisadas se centrifugaron 20 minutos a 15000 g a 4 ºC. El sobrenadante que contiene la proteína recombinante se cargó en resina de intercambio de DEAE Sepharose CL6B (Pharmacia) preequilibrada en NaCl 0,3 M, Tris HCl 20 mM pH 7,6 tampón A. Después de un lavado de columna con tampón A, la proteína de fusión se eluyó mediante el 2 % de colina en (Tampón A). Se reunieron las fracciones de antígeno positivas como reveló el análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti Mage-3. El antígeno eluido con DEAE se llevó hasta el 0,5 % de Empigen BB (un detergente bipolar) y a NaCl 0,5 M antes de cargar en una columna de cromatografía de afinidad de iones metálicos preequilibrada en el 0,5 % de Empigen BB, NaCl 0,5 M, tampón fosfato 50 mM pH 7,6 (tampón B).
La columna de IMAC se lavó con tampón B hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó la línea base. Un segundo lavado en tampón B sin Empigen BB (tampón C) con el fin de eliminar el detergente se ejecutó antes de la elución del antígeno mediante un gradiente de imidazol imidazol 0 -250 mM en tampón C.
Se reunieron las fracciones de imidazol 0,090 -0,250 M, se concentraron en una membrana Filtron omega de 10 kDa antes de la diálisis frente a tampón PBS.
Los inventores han demostrado que la proteína de fusión LPD-MAGE3-His es inmunogénica en ratones, y que esta inmunogenicidad (la respuesta proliferativa y respuesta de anticuerpo) se puede incrementar adicionalmente mediante el uso del adyuvante descrito anteriormente. La purificación se puede potenciar derivando los tioles que forman enlaces disulfuro.
Los inventores han demostrado que una mejor respuesta de anticuerpo se desencadenó mediante la vacunación con LPD-MAGE-3-His en presencia del adyuvante. El isotipo predominante encontrado en el suero de C57BL/6 que es IgG2b sugiere que se alcanzó una respuesta inmune de tipo TH1.
En el escenario clínico humano, un paciente tratado con LPD-MAGE3-His en una formulación no adyuvantada quedó libre de melanoma.
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10 -Patard J.J., Brasseur F., Gil-Diez S., et al. Int. J. Cáncer, 64: 60 (1995).
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LISTADO DE SECUENCIAS
- (1)
- INFORMACIÓN GENERAL
- (i)
- SOLICITANTE: SmithKline Beecam Biologicals
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
- (A)
- DESTINATARIO: SmithKline Beecham
- (B)
- CALLE: 2 New Horizons Court, Great West Road, B
- (C)
- CIUDAD: Middx
- (D)
- ESTADO:
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
- (F)
- CÓDIGO: TW8 9EP
- (v)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows versión 2.0
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
(vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
(viii) INFROMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:
- (A)
- NOMBRE: Dalton, Marcus J
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: B45126
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
- (A)
- TELÉFONO: 0181 9756348
- (B)
- TELEFAX: 0181 9756177
- (C)
- TELEX:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 452 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 1353 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
22
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 1341 pares de bases 10 (B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA 5 (A) LONGITUD: 466 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
25
- (A)
- LONGITUD: 404 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 1212 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6: 10
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 445 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
(D)TOPOLOGÍA: lineal 20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 1338 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 454 aminoácidos 15 (B) TIPO: aminoácido
(C) TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína 20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 1362 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: individual (D)TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 10
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
Claims (10)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Uso de un derivado de antígeno asociado a tumores de la familia MAGE que comprende residuos de tioles derivados para la fabricación de una vacuna para tratar de forma inmunoterapéutica a un paciente que padece un tumor asociado a MAGE, en el que el tumor asociado a MAGE se selecciona de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago.
-
- 2.
- Uso como se reivindica en la reivindicación 1 en el que los tioles libres derivatizados están carboxiamidados o carboximetilados.
-
- 3.
- Uso como se reivindica en las reivindicaciones 1 y 2, en el que el antígeno comprende una pareja de fusión seleccionada de proteína D o un derivado de la proteína D que comprende aproximadamente el primer 1/3 de proteína D.
-
- 4.
- Uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el antígeno comprende una marca de afinidad.
-
- 5.
- Uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la proteína D o el dicho fragmento de la misma está lipidada.
-
- 6.
- Uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la proteína MAGE se selecciona del grupo:
MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 y MAGE C2. -
- 7.
- Uso de cualquier reivindicación precedente, en el que la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante y/o citoquina o quimioquina inmunoestimuladora.
-
- 8.
- Uso de la reivindicación 7, en el que la proteína se presenta en un vehículo de emulsión de aceite en agua o agua en aceite.
-
- 9.
- Uso de la reivindicación 7 u 8 en el que el adyuvante comprende 3D-MPL, QS21 o un oligonucleótido CpG.
-
- 10.
- Uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que comprende adicionalmente uno o más otros antígenos.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9802543 | 1998-02-05 | ||
| GBGB9802543.0A GB9802543D0 (en) | 1998-02-05 | 1998-02-05 | Vaccine |
| GB9802650 | 1998-02-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2367998T3 true ES2367998T3 (es) | 2011-11-11 |
Family
ID=10826561
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06075363T Expired - Lifetime ES2367998T3 (es) | 1998-02-05 | 1999-02-02 | Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, usados para la preparación de proteínas de fusión y de composiciones para vacunación. |
| ES05076599T Expired - Lifetime ES2362783T3 (es) | 1998-02-05 | 1999-02-02 | Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, usados para la preparación de proteínas de fusión con epítopes de auxiliares t y de composiciones para vacunación. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05076599T Expired - Lifetime ES2362783T3 (es) | 1998-02-05 | 1999-02-02 | Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, usados para la preparación de proteínas de fusión con epítopes de auxiliares t y de composiciones para vacunación. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (2) | ES2367998T3 (es) |
| GB (1) | GB9802543D0 (es) |
| ZA (1) | ZA99872B (es) |
-
1998
- 1998-02-05 GB GBGB9802543.0A patent/GB9802543D0/en not_active Ceased
-
1999
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- 1999-02-02 ES ES05076599T patent/ES2362783T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 ZA ZA9900872A patent/ZA99872B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2362783T3 (es) | 2011-07-13 |
| ZA99872B (en) | 2000-08-04 |
| GB9802543D0 (en) | 1998-04-01 |
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