PL203658B1 - Bia lko fuzyjne zawieraj ace antygen kodowany przez rodzin e genów MAGE oraz jego zastosowanie, sekwencja kwasu nukleinowego i jego zastosowanie, wektor, komórka gospodarza i szczepionka - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest bia lko fuzyjne zawieraj ace antygen kodowany przez rodzin e ge- nów MAGE oraz jego zastosowanie, sekwencja kwasu nukleinowego i jego zastosowanie, wektor, komórka gospodarza i szczepionka. Wynalazek dotyczy pochodnych bia lka, obejmuj acych antygeny zwi azane z nowotworami, które znajduj a zastosowanie w szczepionkowej terapii przeciwnowotworowej. W szczególno sci, pochodne we- d lug wynalazku obejmuj a bia lka fuzyjne obejmuj ace antygen kodowany przez rodzin e genów MAGE (np. MAGE-3, MAGE-1), po laczony z immunologicznym sk ladnikiem fuzji, który zapewnia epitopy limfocytom pomocniczym T, takim jak przyk ladowo lipidowana posta c bia lka D z Hemophilus influen- zae B. Bia lka fuzyjne mog a zawiera c chemicznie modyfikowane bia lka MAGE, w których mostki di- siarczkowe antygenu s a zredukowane, za s powsta le tiole zablokowane, oraz genetycznie zmodyfiko- wane bia lka MAGE wyposa zone w znacznik powinowactwa i/lub genetycznie zmodyfikowane, aby zapobiec tworzeniu mostka disiarczkowego. Opisano równie z sposoby oczyszczania bia lka MAGE oraz formu lowania szczepionek do leczenia wielu nowotworów, w tym, cho c nie wy lacznie, czerniaka, raka sutka, p echerza, p luc, NSCLC, raka luskowatokomórkowego g lowy i szyi, raka okr eznicy i prze lyku. Antygeny kodowane przez rodzin e genów MAGE ulegaj a g lównie ekspresji na komórkach czer- niaka (w tym czerniaka z lo sliwego) i niektórych innych nowotworach, w tym NSCLC (nie- drobnokomórkowy rak p luca), rakach g lowy i szyi, komórkach przej sciowych raka p echerza i raka prze lyku, ale nie s a wykrywane w prawid lowych tkankach z wyj atkiem j ader i lo zyska (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 ulega ekspresji w przypadku 69% czerniaków (Gaugler, 1994) i mo zna go stwierdzi c w 44% NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48% raków luskowatokomórkowych g lowy i szyi, 34% komórek przej sciowych raków p echerza, 57% raków prze lyku, 32% raków okreznicy i 24% raków sutka (Van Pel, 1995); Inoue, 1995; Fujie, 1997; Nishimura, 1997). Nowotwory wyra zaj a- ce MAGE znane s ajako nowotwory zwi azane z MAGE. Immunogennosc ludzkich komórek czerniaka zosta la wykazana w do swiadczeniach z u zyciem mieszanych hodowli komórek czerniaka i autologicznych limfocytów. Hodowle te cz esto wytwarza ly cytotoksyczne limfocyty T (CTL), zdolne do lizy wy lacznie autologicznych komórek czerniaka, ale nie autologicznych fibroblastów ani limfocytów B transformowanych EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Obecnie, zosta ly zidentyfikowane niektóre z antygenów rozpoznawanych przez klony CTL na autolo- gicznych komórkach czerniaka, lacznie z antygenami nalezacymi do rodziny MAGE. Pierwszy antygen, który mo zna by lo zidentyfikowa c przez to, ze by l on rozpoznawany przez swoiste CTL na autologicznych komórkach czerniaka, zosta l okre slony jako MZ2-E (Van den Eynde, 1989) i kodowany jest przez gen MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). CTL skierowane przeciwko MZ2-E rozpo- znaj a i rozk ladaj a autologiczne komórki czerniaka MZ2-E-pozytywne, jak równie z te od innych pacjen- tów, przy za lo zeniu, ze komórki te majaallele HLA.A1. Gen MAGE-1 nale zy do rodziny 12 blisko spokrewnionych genów, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11 i MAGE-12, polo zo- nych na chromosomie X i wykazuj acych ze sob a od 64 do 85% homologii sekwencji koduj acej (De Plaen, 1994). S a one czasem okre slane jako MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11 i MAGE A12 (rodzina MAGE A). Dwie inne grupy bia lek stanowi a równie z cz esc rodziny MAGE, jakkolwiek bardziej odlegle spokrew- nionej. S a to grupy MAGE B i MAGE C. Rodzina MAGE B obejmuje MAGE B1 (znan a równie z jako MAGE Xp1 i DAM 10), MAGE B2 (znane równie z jako MAGE Xp2 i DAM 6), MAGE B3 i MAGE B4 - rodzina MAGE C obecnie obejmuje MAGE C1 i MAGE C2. W ogólnym uj eciu, bia lko MAGE mo zna zdefiniowa c jako zawieraj ace sygnatur e sekwencji rdzeniowej po lozon a w kierunku ko nca C bia lka (przyk ladowo w przypadku MAGE A1, bia lka o 309 aminokwasach, sygnatura rdzeniowa odpowiada aminokwasom 195-279). Wzorzec zgodno sci sygnatury rdzeniowej opisano poni zej, przy czym x oznacza dowolny ami- nokwas, reszty pisane mala liter a s a konserwowane (dopuszczalne s a warianty konserwatywne), za s reszty pisane wielk a liter a s a ca lkowicie konserwowane. Sygnatura sekwencji rdzeniowej: LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWex1(2x)m(3-4x)Gxe- (3-4x)gxp(2x)11t(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv Zast apienia konserwatywne sa dobrze znane i podane jako matryce oceny domy slnej w pro- gramach komputerowych do przyrównywania sekwencji. Programy te obejmuj a PAM250 (Dayhoft i in.,PL 203 658 B1 3 (1978), „A model of evolutionary changes in proteins" w „Atlas of Protein se auence and structure", Dayhof (red.) 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington i Blosum 62 (Steven Henikof i Jorja Henikof (1992), „Amino acid substitution matricies from protein blocks") Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry):10915-10919. Ogólnie zast apienie w nast epuj acych grupach stanowi zast apienie konserwatywne, ale zast a- pienia pomi edzy grupami nie s a uwa zane za konserwatywne. Grupy stanowi a i) asparaginian/asparagina/glutaminian/glutamina ii) seryna/treonina iii) lizyna/arginina iv) fenyloalanina/tyrozyna/tryptofan v) leucyna/izoleucyna/walina/metionina vi) glicyna/alanina. Ogólnie i w kontek scie wynalazku, bia lko MAGE powinno by c w przynajmniej 50% identyczne w regionie rdzeniowym z aminokwasami 195 do 279 MAGE A1. Niektóre epitopy CTL zosta ly zidentyfikowane w bia lku MAGE-3. Jeden z tych epitopów, MAGE-3.A1 jest nonapeptydow a sekwencj a po lo zon a pomiedzy aminokwasami 168 i 176 bia lka MAGE-3, która stanowi epitop swoisty dla CTL gdy jest prezentowana w po laczeniu z cz asteczk a MHC klasy I HLA.A1. Ostatnio zidentyfikowano dwa dodatkowe epitopy w sekwencji peptydowej MAGE-3, dzi eki ich zdolno sci do wywo lywania reakcji CTL w mieszanej hodowli komórek czerniaka i autologicznych limfocytów. Te dwa epitopy wykazuj a swoisty motyw wi azania dla alleli, odpowiednio, HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) i HLA.B44 (Herman, 1996). Wynalazek dostarcza bia lka fuzyjnego zawieraj acego antygen kodowany przez rodzin e genów MAGE po laczony ze sk ladnikiem fuzji wybranym spo sród: (i) bia lka D z Haemophilus influenzae B albo jego fragmentu zawieraj acego pocz atkow a 1/3 bia lka D lub 109, 110 lub 111 N-ko ncowych aminokwasów bia lka D; (ii) bia lka NS1 z wirusa grypy albo jego fragmentu zawieraj acego 81 N-ko ncowych aminokwa- sów bia lka NS1; albo (iii) LytA ze Streptococcus pneumoniae albo jego fragmentu zawieraj acego: (a) C-ko ncow a cz esc Lyt-A; (b) cz esc zawieraj ac a powtórzenia cz asteczki LytA znajduj acej si e na ko ncu C, pocz aw- szy od reszty 178; i/lub (c) reszty aminokwasowe 188-305 LytA. Korzystnie sk ladnikiem fuzji jest bia lko D z Haemophilus influenzae B albo jego fragment okre- slony powy zej. Takie pochodne bia lka MAGE s a przydatne do zastosowa n terapeutycznych w formulacjach szczepionek, które s a przydatne do leczenia wielu rodzajów nowotworów. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bia lka fuzyjnego wed lug wynalazku do wytwarzania szczepionki do immunoterapeu- tycznego traktowania pacjenta cierpi acego na czerniaki albo inne nowotwory zwi azane z MAGE. Bia lka mo zna laczy c chemicznie, ale korzystnie s a one wyra zane jako rekombinowane bia lka fuzyjne, co umo zliwia ich zwi ekszone wytworzenie w uk ladzie ekspresyjnym w porównaniu z bia lkiem nie poddanym fuzji. Tak wi ec, sk ladnik fuzji mo ze zapewni c epitop limfocytu T (immunologiczny sk lad- nik fuzji), korzystnie epitop limfocytu pomocniczego T rozpoznawany u ludzi, albo u latwi c ekspresj e bia lka (wzmacniacz ekspresji) na wysokim poziomie w porównaniu z natywnym bia lkiem rekombino- wanym. Korzystnie, sk ladnik fuzji jest immunologicznym sk ladnikiem fuzji i sk ladnikiem wzmacniaj a- cym ekspresj e. W korzystnej postaci wynalazku, immunologiczny sk ladnik fuzji pochodzi z bia lka D, bia lka po- wierzchniowego bakterii Gram-ujemnej, Haemophilus influenzae B (W091/18926). Korzystnie, po- chodna bia lka D obejmuje w przybli zeniu pierwsz a 1/3 bia lka, w szczególno sci oko lo pierwsze 100-110 aminokwasów ko nca N. Korzystnie, pochodna bia lka D jest lipidowana. Korzystnie, pierwsze 109 reszt sk ladnika fuzji lipidoproteiny D jest przy laczone do ko nca N w celu zapewnienia potencjal- nego antygenu szczepionkowego, z dodatkowym egzogennym epitopem limfocytów T, oraz zwi ek- szonym poziomem ekspresji w E. coli (tak wi ec dzia laj acym równie z jako wzmacniacz ekspresji). Ogon lipidowy zapewnia optymaln a prezentacj e antygenu komórkom prezentuj acym antygen. Inne sk ladniki fuzji obejmuj a niestrukturalne bia lko wirusa grypy NS1 (hemaglutynina). Zwykle, wykorzystuje si e 81 aminokwasów ko nca N, jakkolwiek mo zna wykorzysta c ró zne fragmenty, zaklada- jac, ze zawieraj a epitopy limfocytów pomocniczych T. W innym wykonaniu, immunologicznym sk ladnikiem fuzji jest bia lko zwane LYTA. Korzystnie wykorzystuje si e fragment ko nca C bialka. Lyta pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, która synte-PL 203 658 B1 4 tyzuje amidaz e N-acetylo-L-alaninow a amidaz e LYTA (kodowan a przez gen lytA, (Gene 43 (1986) str. 265-272), autolizyn e, która swoi scie degraduje pewne wi azania w szkielecie peptydoglikanowym. Domena ko nca C bia lka LYTA jest odpowiedzialna za powinowactwo do choliny albo niektórych ana- logów choliny, takich jak DEAE. W lasciwo sc t e wykorzystano do opracowania plazmidów ekspresyj- nych E. coli - LYTA przydatnych do ekspresji bia lek fuzyjnych. Opisano oczyszczanie bia lek hybrydo- wych zawieraj acych fragment C-LYTA na ko ncu aminowym (Biotechnology: 10 (1992) str. 795-798). Korzystnie wykorzystuje si e cz esc zawieraj ac a powtórzenia cz asteczki LYTA znajduj ace si e na ko ncu C, pocz awszy od reszty 178. Szczególnie korzystna posta c obejmuje reszty 188-305. Immunologiczne sk ladniki fuzji opisane wy zej s a równie z korzystne we wspomaganiu ekspresji. W szczególno sci, takie fuzje ulegaj a ekspresji z wi eksz a skuteczno scia ni z rekombinowane natywne bia lka MAGE. Wykazano, ze takie konstrukty w zastosowaniach klinicznych s a zdolne do leczenia czerniaka. W jednym przypadku, u pacjenta z czerniakiem w IV stopniu zaawansowania po dwóch dawkach nie- adiuwantowanego bia lka fuzyjnego lipo D 1/3 MAGE 3 His stwierdzono usuni ecie przerzutów. Tak wi ec, niniejszy wynalazek dostarcza bia lek fuzyjnych obejmuj acych antygen zwi azany z nowotworem z rodziny MAGE w polaczeniu z immunologicznym sk ladnikiem fuzji. Korzystnie, im- munologiczny sk ladnik fuzji stanowi bia lko D w postaci lipidowanej. Korzystnymi bia lkami MAGE w bia lku fuzyjnym wed lug wynalazku s a antygeny MAGE wybrane z grupy obejmuj acej MAGE A2, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 i MAGE C2. Cz es c stanowi aca lipoprotein e D korzystnie obejmuje pierwsz a 1/3 lipoproteiny D. Korzystnie bia lko fuzyjne wed lug wynalazku obejmuje ponadto znacznik powinowactwa. Bia lka fuzyjne wed lug wynalazku mog a by c wyra zane w E. coli. Bia lka wed lug wynalazku mog a by c wyra za- ne z „ogonem" histydynowym, obejmuj acym od 5 do 9, za s korzystnie 6 reszt histydyny. Jest to ko- rzystne przy oczyszczaniu. Wynalazek dostarcza równiez kwasu nukleinowego koduj acego bia lka fuzyjne wed lug wynalaz- ku. Takie sekwencje mo zna wprowadza c do odpowiednich wektorów ekspresyjnych i stosowa c do szczepienia DNA/RNA albo do ekspresji w odpowiednim gospodarzu. Jako szczepionki mo zna zasto- sowa c odpowiednie wektory drobnoustrojów wyra zaj ace kwas nukleinowy. Takie wektory obejmuj a, przyk ladowo, wirusa ospy, adenowirusa, alfa-wirusa, listeri e i monarfaga. Sekwencj e DNA koduj ac a bia lka wed lug wynalazku mo zna syntetyzowa c stosuj ac standardowe techniki syntezy DNA, takie jak enzymatyczna ligacja, jak opisana przez Roberts'a i in., Biochemistry 1985 24:5090-5098, synteza chemiczna, polimeryzacja enzymatyczna in vitro, lub technologia PCR wykorzystuj aca przyk ladowo termostabiln a polimeraz e, albo przez kombinacj e tych technik. Polimeryzacj e enzymatyczn a DNA mo zna przeprowadzi c in vitro stosuj ac polimeraz e DNA, tak a jak polimeraza I DNA (fragment Klenowa) w odpowiednim buforze zawierajacym trifosforany nukle- ozydów dATP, dCTP, dGTP i dTTP, w temperaturze 10-37°C, zasadniczo w obj eto sci 50 µl albo mniejszej. Enzymatyczn a ligacj e fragmentów DNA mo zna przeprowadzi c stosuj ac ligaz e DNA, tak a jak ligaza DNA T4 w odpowiednim buforze, takim jak 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl 2 , 0,01 M ditio- treitol, 1 mM spermidyn e, 1 mM ATP i 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydl ecej, w temperaturze od 4°C do temperatury otoczenia, zasadniczo w obj eto sci 50 µl albo mniejszej. Chemiczn a syntez e polimeru albo fragmentów DNA mo zna przeprowadzi c konwencjonaln a reakcj a z zastosowaniem fosfotioestru, fosforynu albo amidynofosforynu, stosuj ac techniki na pod lo zu sta lym, tak a jak opisana w Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (red. Gassen i Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) albo w innych publikacjach naukowych, przyk ladowo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucl. Acids Res. 1982 10:6243; B.S. Sproat i W. Bannwarth, Tetrahedron Lett. 1983 24:5771; M.D. Matteuci i M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 1980 21:719; M.D. Matteuci i M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 1981 103:3185; S.P. Adams i in., J. Am. Chem. Soc. 1983 105:661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, i H. Koester, Nucl. Acids Res. 1984 12:4539, oraz H.W.D. Matthes i in., EMBO J. 1984 3:801. Przedmiotem wynalazku jest te z zastosowanie kwasu nukleinowego wed lug wynalazku do wy- twarzania szczepionki do immunoterapeutycznego traktowania pacjenta cierpi acego na czerniaki albo inne nowotwory zwi azane z MAGE. Pochodn a antygenu wed lug wynalazku mo zna otrzyma c konwencjonalnymi technikami rekom- binacji, jak opisane w Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982-1989.PL 203 658 B1 5 W szczególno sci, sposób wytwarzania bia lka fuzyjnego mo ze obejmowa c etapy: i) wytwarzania zdolnego do replikacji albo integracji wektora ekspresyjnego, zdolnego w komór- ce gospodarza do wyra zania polimeru DNA obejmuj acego sekwencj e nukleotydow a, która koduje bia lko albo jego immunogenn a pochodn a; ii) transformowania komórki gospodarza takim wektorem; iii) hodowania transformowanej komórki gospodarza w warunkach umo zliwiaj acych ekspresj e polimeru DNA z wytworzeniem bia lka; i iv) pozyskiwania bia lka. Okre slenie „transformowanie" w znaczeniu tu zastosowanym oznacza wprowadzanie obcego DNA do komórki gospodarza. Mo zna to osi agn ac, przyk ladowo, przez transformacj e, transfekcj e albo infekcj e odpowiednim wektorem plazmidowym albo wirusowym, stosuj ac np. konwencjonalne techniki, jak opisane w Genetic Engineering; red. S.M. Kingsman i A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publica- tions; Oxford, Anglia, 1988. Okre slenie „transformowany" albo „transformant" b edzie si e odnosi lo do po- wsta lej komórki gospodarza, zawieraj acej i wyra zaj acej obcy gen, b ed acy przedmiotem zainteresowania. Wektory ekspresyjne, obejmuj ace kwas nukleinowy wed lug wynalazku, s a nowe i stanowi a równie z cz esc wynalazku. Zdolne do replikacji wektory ekspresyjne mo zna wytworzy c zgodnie z wynalazkiem, przez ci ecie wektora zgodnego z komórk a gospodarza z uzyskaniem liniowego segmentu DNA z kompletnym re- plikonem i po laczenie takiego liniowego segmentu, w warunkach ligacji, z jednym albo wieloma cz a- steczkami DNA, takimi jak polimer DNA koduj acy bia lko wed lug wynalazku albo jego pochodn a które wraz z liniowym segmentem koduj a po zadany produkt. Tak wi ec, polimer DNA mo zna tworzy c wcze sniej albo podczas konstruowania wektora, zale z- nie od potrzeb. Wybór wektora b edzie okre slony cz esciowo przez komórk e gospodarza, która mo ze by c proka- riotyczna albo eukariotyczna, ale korzystna jest komórk a E. coli lub CHO. Odpowiednie wektory obej- muja plazmidy, bakteriofagi, kosmidy i rekombinowane wirusy. Wytwarzanie zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego mo zna przeprowadzi c konwencjo- nalnie przy u zyciu odpowiednich enzymów do restrykcji, polimeryzacji i ligacji DNA, procedurami opi- sanymi przyk ladowo w Maniatis i in., cytowanym wy zej. Przedmiotem wynalazku jest równie z rekombinowana komórka gospodarza transformowana wektorem wed lug wynalazku. Rekombinowana komórk e gospodarza wytwarza si e przez transformo- wanie komórki gospodarza wektorem zdolnym do replikacji wed lug wynalazku w warunkach transfor- mujacych. Odpowiednie warunki transformuj ace s a konwencjonalne i opisano je przyk ladowo w Ma- niatis i in., cytowanym wy zej albo w DNA Cloning, tom II, D.M. Glover (red.), IRL Press Ltd., 1985. Wybór warunków transformuj acych okre slony jest komórk a gospodarza. Tak wi ec, bakteryjnego gospodarza, takiego jak E. coli mo zna traktowa c roztworem CaCl 2 (Cohen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1973 69:2110) albo roztworem obejmuj acym mieszanin e RbCl, MnCh, octanu potasu i glicerolu, a nast epnie kwasem 3-[N-morfolino]-propanosulfonowym, RbCl i glicerolem. Komórki ssaka w hodowli mo zna transformowa c przez precypitacj e wapniem wektora DNA do komórek. Hodowanie transformowanej komórki gospodarza w warunkach umo zliwiaj acych ekspresj e po- limeru DNA prowadzi si e w sposób konwencjonalny jak to opisano przyk ladowo w Maniatis i in., wy zej albo w „DNA Cloning", przytoczonym wy zej. Tak wi ec, korzystnie komórkom dostarcza si e po zywki i hoduje w temperaturze poni zej 50°C. Produkt pozyskuje si e sposobami konwencjonalnymi, zale znie od komórki gospodarza oraz lo- kalizacji wyra zanego produktu (wewn atrzkomórkowa lub produkt wydzielony do po zywki hodowlanej lub peryplazmy komórkowej). Tak wi ec, gdy komórk a gospodarza jest bakteria, taka jak E. coli, mo zna ja podda c lizie fizycznej, chemicznej albo enzymatycznej, za s produkt bia lkowy izolowa c z powsta lego lizatu. Gdy komórk a gospodarza jest komórka ssaka, produkt mo zna zasadniczo izolowa c z po zywki hodowlanej albo z ekstraktów bezkomórkowych. Konwencjonalne techniki izolowania bia lka obejmuj a wybiórcz a precypitacj e, chromatografi e adsorpcyjn a i chromatografi e powinowactwa, w tym kolumn e powinowactwa z przeciwcia lem monoklonalnym. Bia lka wed lug wynalazku dostarczone s a albo jako rozpuszczalne w postaci ciek lej albo w po- staci liofilizowanej. Ogólnie oczekuje si e, ze dawka ludzka zawiera c b edzie od 1 do 1000 µg bia lka, korzystnie 30-300 µg. Przedmiotem wynalazku jest tak ze szczepionka zawieraj aca bia lko fuzyjne wed lug wynalazku lub kwas nukleinowy wed lug wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest równie z jej zastosowanie w medycynie.PL 203 658 B1 6 Kompozycja szczepionki mo ze obejmowa c przynajmniej fuzj e lipoproteina D-MAGE-3. Szcze- pionka wed lug wynalazku mo ze korzystnie dodatkowo zawiera c jeden albo wi ecej innych antygenów. Dodatkowe antygeny mog a by c zwi azane z nowotworem i nale ze c rodzin MAGE i GAGE. Inne, odpo- wiednie antygeny zwi azane z nowotworem obejmuj a MAGE-1, GAGE-1 albo bia lka tyrozynazy. Wytwarzanie szczepionek opisane jest ogólnie w Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach (wyd. Powell i Newman), Pharmaceutical Biotechnology tom. 6, Plenum Press, 1995. Za- mykanie w liposomach opisa l Fullerton, patent USA nr 4,235,877. Korzystnie szczepionka wed lug wynalazku dodatkowo zawiera adiuwant i/lub immunostymuluj ac a cytokin e lub chemokin e. Ponadto korzystnie w szczepionce wed lug wynalazku bia lko jest prezentowane w no sniku stanowi acym emulsj e oleju w wodzie lub wody w oleju. Jeszcze korzystniej adiuwant w szcze- pionce wed lug wynalazku obejmuje 3D-MPL, QS21 albo oligonukleotyd CpG. Odpowiednie adiuwanty obejmuj a sole glinu, takie jak zel wodorotlenku glinu (alum) albo fosfo- ran glinu, ale mog a by c równie z sol a wapnia, zelaza albo cynku, albo mog a by c nierozpuszczaln a zawiesin a acylowanej tyrozyny albo acylowanych cukrów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, albo polifosfazenami. Do innych znanych adiuwantów nale za oligonukleotydy zawie- rajace CpG. Takie nukleotydy charakteryzuj a si e tym, ze dinukleotyd CpG jest niemetylowany. Takie oligonukleotydy s a dobrze znane i opisane, np. w WO 96/02555. Kompozycja adiuwanta powinna wywo lywa c wybiórczo reakcj e typu TH1. Odpowiednie uk lady adiuwantów obejmuj a, przyk ladowo, kombinacj e monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowa- nego monofosforylolipidu A (3D-MPL) wraz z solami glinu. Oligonukleotydy CpG tak ze korzystnie in- dukuj a odpowied z TFU. Wzmocniony uk lad obejmuje kombinacj e monofosforylolipidu A i pochodnej saponinowej, w szczególno sci kombinacj e QS21 i 3D-MPL, jak ujawniona w WO 94/00153, albo mniej reaktogenn a kompozycj e, w której QS21 jest wyt lumione cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie siln a formulacj e adiuwantow a, obejmuj ac a QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji ole- ju w wodzie opisano w WO 95/17210, i jest ona korzystn a formulacj a. Wed lug jednego wykonania wynalazku, dostarczono szczepionki zawieraj acej bia lko wed lug wynalazku, korzystniej fuzj e lipoproteina D (albo jej pochodna) - MAGE-3, wspomagane przez mono- fosforylolipid A lub jego pochodn a. Korzystnie, szczepionka dodatkowo zawiera saponin e, korzystniej QS21. Formulacj a mo ze do- datkowo obejmowa c emulsj e oleju w wodzie i tokoferol. Niniejszym opisano równie z sposób formu lowania szczepionki obejmuj acej mieszanie bia lka wed lug wynalazku z zaróbk a dopuszczaln a farmaceutycznie, tak a jak 3D-MPL. Niniejszym opisano równie z sposób oczyszczania rekombinacyjnie wytworzonego bia lka MAGE. Sposób obejmuje solubilizacj e bia lka, przyk ladowo, w silnie chaotropowym czynniku (takim jak, przy- k ladowo, mocznik, chlorowodorek guanidyny) albo detergencie obojnaczym np. (Empigen BB - n-do- decylo-N,N-dimetyloglicyna), redukcje wewn atrz- i mi edzycz asteczkowego wi azania disiarczkowego, blokowanie tioli, aby zapobiec ich ponownemu laczeniu si e w wyniku utleniania i poddawanie bia lka jednemu albo wielu etapom chromatografii. Korzystnie czynnikiem blokuj acym jest srodek alkiluj acy. Takie czynniki blokuj ace obejmuj a cho c nie s a ograniczone do alfa-fluorowcokwasów i alfa-fluorowcoamidów. Przyk ladowo, kwas jodo- octowy i jodoacetoamid, które wywo luj a karboksymetylacj e albo karboksyamidacj e (karbamidometyla- cje) bia lka. Inne czynniki blokuj ace, które mo zna zastosowa c, opisano w literaturze (patrz, przyk lado- wo, The Proteins, tom. II, red. H. Neurath, R.L. Hill i C.-L. Boeder, Academic Press 1976, albo Chemi- cal Reagents for Protein Modification, tom I, red. R.L. Lundblad i CM. Noyes, CRC Press, 1985). Ty- powe inne czynniki blokuj ace obejmuj a N-etylomaleimid, fosforan chloroacetylu, O-metyloizomocznik i akrylonitryl. Zastosowanie czynników blokuj acych jest korzystne, poniewa z zapobiega agregacji pro- duktu oraz zapewnia stabilno sc w dalszych etapach oczyszczania. Czynniki blokuj ace wybrane s a tak, ze wywo luj a powstanie stabilnej i nieodwracalnej pochodnej (np. alfa-fluorowcokwasowej albo alfa-fluorowcoamidowej). Jednak ze, mo zna wybra c inne czynniki blokuj ace, takie, ze po oczyszczaniu bia lka czynnik blokuj acy mo zna usunac z uwolnieniem bia lka niederywatyzowanego. W korzystnym wykonaniu wynalazku, bia lka dostarczone s a ze znacznikiem powinowactwa, ta- kim jak CLYTA albo ogon polihistydynowy. W takich przypadkach, bia lko po etapie blokowania korzystnie poddaje si e chromatografii powi- nowactwa. Dla tych bia lek z ogonem polihistydynowym, mo zna przeprowadzi c chromatografi e powi-PL 203 658 B1 7 nowactwa z unieruchomionym jonem metalu (IMAC). Jonem metalu mo ze by c dowolny odpowiedni jon, przyk ladowo, cynku, niklu, zelaza, magnezu albo miedzi, korzystnie cynku albo niklu. Korzystny bufor IMAC zawiera detergent obojnaczy, taki jak Empigen BB (zwany dalej, Empigen), poniewa z powoduje to niski poziom endotoksyny w produkcie ko ncowym. Je zeli bia lko wytwarzane jest z czescia Clyta, mo zliwe jest wykorzystanie powinowactwa z cho- lina lub analogami choliny, takimi jak DEAE w celu oczyszczenia produktu. W wykonaniu wynalazku dostarczono bia lka z ogonem polihistydynowym oraz z czesci a Clyta. Mo zna je oczyszcza c w prostym dwuetapowym schemacie oczyszczania przez chromatografi e powinowactwa. Wynalazek jest dalej opisany w odniesieniu do nast epuj acych Przyk ladów. P r z y k l a d I Wytwarzanie rekombinowanego szczepu E. coli wyra zaj acego bia lko fuzyjne lipoproteiny D-MAGE-3-His (LPD 1/3-MAGE-3-His albo LpD MAGE-3-His) 1. Uk lad ekspresyjny E. coli Do wytworzenia lipoproteiny D klonowano DNA koduj acy bia lko D do wektora ekspresyjnego pMG81. Plazmid ten wykorzystuje sygna ly z DNA faga lambda do prowadzenia transkrypcji i translacji wprowadzonego obcego genu. Wektor zawiera promotor PL lambda PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystania (NutL i NutR), aby zniwelowa c polarnosc transkrypcyjn a gdy dostarczane jest bia lko N (Gross i in., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1015). Wektory zawieraj ace promotor PL, s a wprowadzane do lizogennego gospodarza E. coli w celu stabilizacji plazmidowego DNA. Lizogenne szczepy gospoda- rza zawieraj a zintegrowany z genomem niezdolny do replikacji DNA faga lambda (Shatzman i in., 1983; Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouya (wyd.) str. 1-14. Academic Press Press NY). DNA faga lambda kieruje syntez e bia lka represorowego cl, które wiaze si e z represorem OL na wektorze i zapobiega wi azaniu si e polimerazy RNA z promotorem PL, przez co zapobiega transkrypcji wprowadzonego genu. Gen cl szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera mutacj e wra zliw a na temperatu- r e, tak ze transkrypcja kierowana przez PL mo ze by c regulowana zmian a temperatury, tj. wzrost tem- peratury w hodowli inaktywuje represor i zapocz atkowuje syntez e obcego genu. Ten uk lad ekspresyj- ny umo zliwia kontrolowan a syntez e obcych bia lek zw laszcza tych, które mog a by c toksyczne dla ko- mórki (Shimataka i Rosenberg, 1981, Nature 292:128). 2. Szczep E. coli AR58 Lizogenny szczep E. coli AR58 zastosowany do wytwarzania bia lka LPD-MAGE-3-His jest po- chodn a standardowego szczepu E. coli NIH KI 2 N99 (F-su- galK2, lacZ-, thr-). Zawiera on defektyw- nego lizogennego faga lambda (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). Fenotyp Kil- zapobiega wy laczeniu syntezy makrocz asteczek gospodarza. Mutacja cI857 zapewnia wra zliwe na temperatur e zmiany w represorze cl. Delecja DH1 usuwa prawy operon faga lambda i loci gospodarza bio, uvr3 i chlA. Szczep AR58 wytworzono przez transdukcj e N99 fagiem lambda P, uprzednio hodowanym na po- chodnej SA500 (ga1E::TN10, 1 Kil-, cI857 DH1). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 se- lekcjonowano na tetracyklinie, dzi eki obecno sci transpozonu TN10 koduj acego gen oporno sci na te- tracyklin e w s asiaduj acym genie galE. N99 i SA500 s a szczepami E. coli K12 pochodz acymi z labora- torium Dr Martina Rosenberga z NIH. 3. Konstruowanie wektora przeznaczonego do wyra zania rekombinowanego bia lka LPD-MAGE-3-His Przes lank a by lo wyra zenie MAGE-3 jako bia lka fuzyjnego z zastosowaniem N-ko ncowej jednej trzeciej lipidowanego bia lka D, jako sk ladnika fuzji, po laczonego z ko ncem N MAGE-3 oraz sekwencj a kilku reszt histydynowych (ogon His) na ko ncu C. Bia lko D jest lipoprotein a (42 kDa bia lkiem wiaz acym immunoglobuliny D, eksponowane na po- wierzchni Gram-ujemnej bakterii Haemophilus influenzae). Bia lko jest syntetyzowane jako prekursor o 18-aminokwasowej sekwencji sygna lowej, zawieraj acej sekwencj e zgodnosci z bakteryjnymi lipopro- teinami (WO 91/18926). Gdy sekwencja sygna lowa lipoproteiny przetwarzana jest podczas wydzielania, Cys (w pozycji 19 bia lka prekursorowego) staje si e reszt a ko nca aminowego i jest nast epnie modyfikowana przez kowalencyjne przylaczenie kwasów tluszczowych, zarówno wi azaniem estrowym jak i amidowym. Kwasy t luszczowe polaczone z reszt a ko nca aminowego dzia laj a jako zakotwiczenie w b lonie. Plazmid wyra zaj acy bia lko fuzyjne zosta l zaprojektowany w taki sposób, ze wyra za bia lko pre- kursorowe zawieraj ace 18-aminokwasow a sekwencj e sygna low a oraz pierwsze 109 reszt przetwarza- nego bia lka D, dwa niespokrewnione aminokwasy (Met i Asp), reszty aminokwasowe 2-314 MAGE-3, dwie reszty Gly dzia laj ace jako region zawiasowy w celu eksponowania dalszych siedmiu reszt His.PL 203 658 B1 8 Rekombinowany szczep wytwarza przetworzone, lipidowane bia lko fuzyjne o d lugo sci 432 ami- nokwasów z ogonem His, (patrz, Fig. 1), o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Id. Sekw. nr 1, oraz sekwencj e koduj ac aprzedstawion a w Id. Sekw. nr 2. 4. Strategia klonowania zastosowana w celu wytworzenia bia lka fuzyjnego LPD-MAGE-3-His (wektor pRIT 14477). Zastosowano plazmid cDNA (od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute) zawieraj acy sekwencj e ko- duj ac a genu MAGE-3 (Gaugler B. i in., 1994) oraz wektor pRIT 14586, zawieraj acy cz esc sekwencji koduj acej koniec N Lipo-D-1/3 (wytworzony jak opisano na Fig. 2). Strategia klonowania obejmowa la nast epuj ace etapy (Fig. 3). a) Amplifikacja PCR sekwencji przedstawionych w plazmidzie cDNA MAGE-3, z zastosowaniem oligonukleotydu sensownego 5'gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, oraz oligonu- kleotydu antysensownego 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tct caa); amplifikacja ta doprowadzi la do nast epuj acych modyfikacji na ko ncu N: zmiana pierwszych pi eciu kodonów w wykorzystaniu kodonów przez E. coli, zast apienie kodonu Pro przez kodon Asp w pozycji 1, wstawienie miejsca Ncol na ko ncu 5' i dodanie dwóch kodonów reszt Gly oraz 7 kodonów His na ko n- cu 5', a nast epnie miejsca Xbal na ko ncu C. b) Klonowanie do wektora klonowania TA (Invitrogen) powy zszego amplifikowanego fragmentu i wytworzenie po sredniego wektora pRIT 14647. c) Wyci ecie fragmentu Ncol Xbal z plazmidu pRIT 14647 i klonowanie do wektora pRIT 14596. d) Transformacja szczepu gospodarza AR58. e) Selekcja i charakterystyka transformantów szczepu E. coli zawieraj acych plazmid pRIT 14477, wyra zaj acych bia lko fuzyjne LPIMAGE-3-His. P r z y k l a d II Wytwarzanie antygenu LPD1/3-MAGE-3-His 1. Wzrost i indukcja szczepu bakteryjnego - ekspresja LPDl/3-MAGE-3-His Komórki AR58 transformowane plazmidem pRIT 14477 hodowano w 2-litrowych butelkach, za- wierajacych po 400 ml po zywki LY12 z dodatkiem ekstraktu dro zd zowego (6,4 g/l) i siarczanu kana- mycyny (50 mg/l). Po inkubacji na stole wstrz asanym w 30°C przez 8±1 godzin, ma la próbk e pobrano z ka zdej butelki do badania mikroskopowego. Zawarto sc dwóch butelek pulowano w celu dostarczenia zaszczepu do fermentatora 20-litrowego. Zaszczep, (oko lo 800 ml) dodano do uprzednio wysterylizowanego 20-litrowego (obj eto sc ca l- kowita) fermentatora, zawieraj acego 7 litrów po zywki, z dodatkiem 50 mg/l siarczanu kanamycyny. pH doprowadzono i utrzymywano na poziomie 6,8 przez okresowe dodawanie NH 4 OH (25% obj.), za s temperatur e ustalono i utrzymywano na poziomie 30°C. Tempo napowietrzania ustalono i utrzymywa- no na poziomie 12 litrów powietrza na minut e, za s ci snienie rozpuszczonego tlenu utrzymywano na poziomie 50% wysycenia przez kontrolowanie zwrotne szybko sci mieszania. W fermentatorze utrzy- mywano nadci snienie na poziomie 500 g/cm (0,5 bara). Hodowl e wsadow a przeprowadzono przez kontrolowane dodawanie roztworu zasilaj acego sta- nowi acego zród lo w egla. Roztwór zasilaj acy dodawano pocz atkowo przy szybko sci 0,04 ml/min. i zwi ekszano wyk ladniczo podczas pierwszych 42 godzin, aby utrzyma c tempo wzrostu 0,1 godz -1 . Po 42 godzinach, temperatur e fermentatora gwa ltownie podwy zszono do 39°C, za s szybko sc zasilania utrzymano na sta lym poziomie 0,005 ml/g DC W/min. podczas fazy indukcji przez dodatkowe 22-23 godziny, kiedy to wewn atrzkomórkowa ekspresja LPD-MAGE-3-His osi agn ela poziom maksy- malny. Porcje (15 ml) brzeczki pobierano w regularnych odst epach czasu podczas fazy wzro- stu/indukcji oraz na zako nczenie fermentacji, w celu monitorowania kinetyki wzrostu drobnoustrojów i ekspresji wewn atrzkomórkowej produktu oraz dodatkowo, w celu dostarczenia próbek do testów na identyfikacj e drobnoustrojów i czysto sc. Na zako nczenie fermentacji, g estosc optyczna hodowli wynosi la od 80 do 120 (co odpowiada lo g esto sci komórkowej 48 do 72 g DCW/1), za s ca lkowita obj etosc hodowli wynosi la oko lo 12 litrów. Hodowl e gwa ltownie sch lodzono do 6-10°C i oddzielono komórki ECK32 od brzeczki hodowlanej przez odwirowanie przy 5000 x g w 4°C przez 30 minut. Zat ezone komórki ECK32 szybko przecho- wywano w plastikowych workach i natychmiast zamra zano w -80°C. 2. Ekstrakcja bia lka Zamro zone, zag eszczone komórki ECK2 rozmra zano w 4°C, po czym zawieszano w buforze do niszczenia komórek do g estosci ko ncowej 60 (co odpowiada lo g esto sci komórek równej oko lo 36 g DCW/1).PL 203 658 B1 9 Komórki zniszczono przez dwukrotne przepuszczenie przez wysoko-ci snieniowy homogenizator (1000 bar). Zawiesin e zniszczonych komórek odwirowano (x 10000 g w 4°C przez 30 minut), za s frak- cje osadu p lukano dwukrotnie Triton X100 (1% wag./obj.) + EDTA (1 mM), a nast epnie roztworem soli, buforowanym fosforanem (PBS) + Tween 20 (0,1% wag./obj.), a na koniec PBS. Pomi edzy etapami p lukania, zawiesin e wirowano x 10000 g przez 30 minut w 4°C, nads acz usuwano odzyskuj ac frakcj e osadu. P r z y k l a d III Charakteryzacja bia lka lipo D - MAGE-3 1. Oczyszczanie LPD-MAGE-3-His oczyszczono z homogenatu komórkowego stosuj ac opisane ni zej etapy: a) rozpuszczenie p lukanej frakcji osadu po niszczeniu komórek; b) chemiczna redukcja wewn atrz- i mi edzybia lkowych wi aza n disiarczkowych, a nast epnie blo- kowanie grup tiolowych, aby zapobiec utleniaj acemu ich ponownemu laczeniu si e; c) mikrofiltrowanie mieszaniny reakcyjnej w celu usuni ecia drobin i redukcji endotoksyn; d) wychwyt i pocz atkowe oczyszczanie LPD-MAGE-3-His przez wykorzystanie oddzia lywania powinowactwa pomi edzy ogonem polihistydynowym i nasycon a cynkiem chelatuj ac a Sepharose; e) usuni ecie zanieczyszczaj acych bia lek przez chromatografi e anionowymienn a. Oczyszczone LPD-MAGE-3-His poddano licznym etapom oczyszczaj acym: f) wymiana bufora/usuni ecie mocznika przez chromatografi e wykluczania zale znego od wielko- sci cz asteczek stosuj ac Superdex 75; g) filtracj e sród-procesow a; h) wymian e bufora/odsalanie przez chromatografi e wykluczania zale znego od wielko sci cz aste- czek z u zyciem Sephadex G25. Ka zdy z etapów jest opisany dok ladnie poni zej. 1.1) Rozpuszczanie osadu homogenatu komórkowego Frakcj e osadu z ko ncowego etapu p lukania (jak opisano wy zej) ponownie rozpuszczano przez noc w 800 ml roztworu chlorowodorku guanidyny (6M) i fosforanu sodu (0,1 M, pH 7,0) w 4°C. 1.2) Redukcja i karboksymetylacja Rozpuszczony materia l (blado- zó lta, m etna zawiesina) przedmuchano argonem w celu usuni e- cia pozosta lo sci tlenu i dodano roztwór podstawowy 2-merkaptoetanolu (14 M) do stezenia ko ncowe- go 4,3 M (co odpowiada lo 0,44 ml 2-merkaptoetanolu na 1 ml roztworu). Powsta ly roztwór podzielono i przeniesiono do dwóch butelek, które podgrzano do 95°C w la zni wodnej. Po 15 minutach w 95°C, butelki wyj eto z la zni i pozostawiono do schodzenia, po czym zawar- tosc pulowano w zlewce przykrytej foli a (5 l) umieszczono na lodzie i energicznie mieszaj ac dodano jodoacetamid w postaci sta lej uzyskuj ac st ezenie ko ncowe 6M (co odpowiada lo 1,11 g jodoacetamidu na ml roztworu). Mieszanin e trzymano na lodzie w ciemno sci przez godzin e, aby zapeni c ca lkowite rozpuszczenie jodoacetamidu, po czym zneutralizowano (przy energicznym mieszaniu i ci ag lym moni- torowaniu pH) przez dodanie oko lo 1 litra wodorotlenku sodu (5 M) otrzymuj ac ko ncowe pH 7,5-7,8. Powstala mieszanin e utrzymywano na lodzie w ciemno sci przez dalsze 30 minut, po czym pH ponownie doprowadzono do warto sci 7,5-7,9. 1.3) Mikrofiltracja Mieszanin e mikrofiltrowano w jednostce Amicon Proflux Ml2 wyposa zon a we wk lad Minikross o pustych wewn atrz kapilarach (nr ref. M22M-600-01; pole powierzchni 5600 cm 2 , 0,2 µm). Permeat zachowano do dalszych etapów oczyszczania. 1.4) Chromatografia chelatowania metalu (Zn 2+ ) (IMAC) Chromatografi e chelatowania metalu przeprowadzono przy u zyciu chelatuj acej Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-0575-01) wype lniaj acej kolumn e BPG 100/500 (Pharmacia Bio- technology, nr kat. 18-1103-01). Wymiary z lo za: srednica 10 cm, pole powierzchni przekroju 79 cm 2 , wyso- ko sc z lo za 19 cm; obj eto sc z lo za 1500 ml. Pust a kolumn e czyszczono wodorotlenkiem sodu (0,5 M), a nast epnie p lukano wod a. Pod loze (dostarczone w 20% obj. etanolu) p lukano oczyszczon a wod a (8 litrów) na lejku Buch- nera (pod pró zni a) i nasycono cynkiem przez przepuszczenie przynajmniej 15 litrów roztworu ZnCl 2 (0,1 M). Nadmiar cynku usuni eto przez p lukanie pod loza 10 litrami oczyszczonej wody, dopóki pH wyp lywaj acego roztworu nie osi agn elo pH roztworu ZnCl 2 (pH 5,0). Nast epnie pod lo ze równowa zono 4 litrami roztworu zawieraj acego chlorowodorek guanidyny (6 M) i fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0).PL 203 658 B1 10 Permeat z mikrofiltracji zawieraj acy LPD-MAGE-3-His mieszano z pod lo zem (wi azanie wsado- we) przez za ladowaniem i upakowaniem kolumny BPG roztworem chlorowodorku guanidyny (6 M) i fosforanu sodu (0,1 M, pH 7,0). Nast epne etapy chromatografii chelatowania metalu przeprowadzono przy szybko sci przep lywu eluentu 60 ml/min. Kolumn e p lukano najpierw roztworem zawieraj acym chlorowodorek guanidyny (6 M) i fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0), nast epnie roztworem zawieraj acym mocznik (6 M) i fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0) dopóki eluent z kolumny nie wykaza l zerowej absorbancji OD 280 nm (t lo). Cz esciowo oczyszczon a frakcj e bia lka LPD-MAGE-3-His eluowano 2 obj eto sciami kolumny roz- tworu zawieraj acego mocznik (6 M), fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0) i imidazol (0,5 M). Przewodnictwo tej frakcji wynosi lo oko lo 16 mS/cm. 1.5) Chromatografia anionowymienna Przed przeprowadzeniem chromatografii anionowymiennej, przewodnictwo frakcji bia lka LPD- -MAGE-3-His cz esciowo oczyszczonego zmniejszono do oko lo 4 mS/cm przez rozcie nczenie roztwo- rem zawieraj acym mocznik (6 M) i Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). Chromatografi e anionowymienn a przeprowadzono przy u zyciu Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-0510-01) wype lniaj acej kolumn e BPG 200/500 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 18-1103-11). Wymiary z lo za: srednica 10 cm, pole powierzchni przekroju 314 cm 2 , wysokosc z lo za 9 cm, objetosc z lo za 2900 ml. Kolumn e wype lniono (w 20% obj. etanolu) i p lukano 9 litrami wody oczyszczonej przy szybko sci przep lywu eluentu 70 ml/min. Wype lnion a kolumn e oczyszczono 3 litrami wodorotlenku sodu (0,5 M), przep lukano 30 litrami oczyszczonej wody, a nast epnie zrównowa zono 6 litrami roztworu zawieraj ace- go mocznik (6 M) i Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). Rozcie nczone, na wpó l oczyszczone LPD-MAGE-3-His wprowadzono do kolumny i p lukano 9 litrami roztworu zawieraj acego mocznik (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) i Tween (0,1%) dopóki absorbancja (280 nm) eluentu nie osi agn ela warto sci zerowej. Dalszy etap p lukania przeprowadzono przy u zyciu 6 litrów roztworu zawieraj acego mocznik (6 M) i Tris-HCl (20 mM pH 8,0). Oczyszczone LPD-MAGE-3-His eluowano z kolumny roztworem zawieraj acym mocznik (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) i NaCl (0,25 M). 1.6) Chromatografia wykluczania zale znego od wielko sci Usuwanie mocznika z oczyszczonego LPD-MAGE-3-His oraz wymian e bufora przeprowadzono przy u zyciu chromatografii wykluczania zale znego od wielko sci. Przeprowadzono j a z zastosowaniem Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-1044-01) wype lniaj acej kolumn e XK 50/100 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 18-8753-01). Wymiary z lo za: srednica 5 cm, pole powierzchni prze- kroju 19,6 cm 2 , wysoko sc z loza 90 cm, obj etosc z lo za 1800 ml. Kolumn e wype lniono w etanolu (20%) i p lukano 5 litrami wody oczyszczonej przy szybko sci przep lywu eluentu 20 ml/min. Kolumn e oczyszczono 2 litrami wodorotlenku sodu (0,5 M), p lukano 5 litrami oczyszczonej wody, a nast epnie równowa zono 5 litrami roztworu soli buforowanego fosfora- nem z dodatkiem Tween 80 (0,1% obj.). Oczyszczon a frakcj e LPD-MAGE-3-His (maksimum 500 ml/cykl odsalania) wprowadzono do ko- lumny przy szybko sci przep lywu eluentu 20 ml/min. Odsalane LPD-MAGE-3-His eluowano z kolumny 3 litrami PBS zawieraj acego Tween 80 (0,1 % obj.). Frakcj e zawieraj ac a LPD-MAGE-3-His eluowano przy obj eto sci swobodnej kolumny. 1.7) Filtracja wewn atrzprocesowa Parti e LPD-MAGE-3-His z chromatografii wykluczania zale znego od wielko sci filtrowano przez membran e 0,22 µm w komorze przep lywu laminarnego (klasa 10000). Filtrowan a parti e zamro zono w -80°C i przechowywano do etapu odsalania. 1.8) Chromatografia odsalaj aca Poniewa z osmolarno sc ko ncowej partii nie powinna przekracza c 400 mOsM, konieczny by l ko- lejny etap wymiany bufora w celu zmniejszenia stezenia soli. Przeprowadzono to przez etap chroma- tografii odsalaj acej z u zyciem Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-0033-02) wype l- niaj acej kolumn e BPG 100/950 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 18-1103-03). Wymiary z lo za: sred- nica 10 cm, pole powierzchni przekroju 78,6 cm 2 , wysoko sc z lo za 85 cm, obj eto sc 6500 ml. Sephadex G25 uwodniono 7 litrami oczyszczonej wody i pozostawiono do sp ecznienia przez noc w 4°C. Zel pakowano do kolumny w czystej wodzie przy szybko sci przep lywu eluentu 100 ml/min.PL 203 658 B1 11 Kolumn e oczyszczono 6 litrami wodorotlenku sodu (0,5 M), nast epnie równowa zono 10 litrami roztworu zawieraj acego fosforan sodu (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) i Tween 80 (0,1% obj.). Oczyszczon a frakcj e LPD-MAGE-3-His (maksimum 1500 ml/cykl odsalania) wprowadzono do kolumny przy szybko sci przep lywu eluentu 100 ml/min. Odsolona frakcj e LPD-MAGE-3-His eluowano przy obj eto sci swobodnej kolumny, sterylizowano przez filtrowanie na membranie 0,22 µm i przecho- wywano w -80°C. Ko ncowa partia bia lka by la rozmra zana w 4°C, a nast epnie porcjowana do fiolek i liofilizowana w laktozie (3,2%) jako zaróbce. 2. Analiza na zelach poliakryloamidowych z SDS barwionych Coomassie Oczyszczony antygen LPD-MAGE-3-His analizowano przez SDS-PAGE na 12,5% zelu akrylo- amidowym w warunkach redukuj acych. Ladunek bia lka do barwienia b lekitem Coomassie wynosi l 50 µg, a do barwienia azotanem sre- bra 5 µg. Analizowano serie kliniczn a 96K19 i informacyjn a 96J22. Otrzymano pojedynczy g lówny prazek odpowiadaj acy ciezarowi cz asteczkowemu oko lo 60 kDa. Obserwowano równie z dwa dodat- kowe mniejsze pr azki wielko sci oko lo 45 kDa i 35 kDa. 3. Analiza metod a Western biot Peptydy wykazane podczas analizy SDS-PAGE bia lka LPD-MAGE-3-His zidentyfikowano przez badanie Western biot z u zyciem mysich przeciwcia l monoklonalnych. Przeciwcia la te opracowano na w lasny u zytek stosuj ac oczyszczone preparaty bia lka MAGE-3His (bia lko to nie zawiera lo LPD). Dwa preparaty przeciwcia l monoklonalnych (Mab 22 i Mab 54) wybrano na podstawie ich przy- datno sci do analizy Western blot i zastosowano w te scie potwierdzenia to zsamo sci dla poszczegól- nych partii. Figura 4 pokazuje wzorzec pr azków otrzymany dla partii 96K19 i 96J22 po znakowaniu Mab 32 i 54. 600 ng bia lka rozdzielono na 12,5% SDS-PAGE, przeniesiono na membran e nylonow a, poddano reakcji z Mab 32 i 54 (60 µg/ml) i obrazowano przeciwcia lami anty-mysimi sprz egni etymi z peroksydaz a. Peptyd 60 kDa i 30 kDa z SDS-PAGE jest wykryty przez obydwa Mab. P r z y k l a d IV 1. Wytwarzanie szczepionki z u zyciem bia lka LPD-MAGE-3-His Zastosowan a w do swiadczeniu szczepionk e wytworzono z rekombinowanego DNA, koduj acego lipoprotein e D l/3-MAGE-3-His, wyra zonego w E. coli szczepu AR58, w postaci adiuwantowanej albo nie. Jako adiuwant zastosowano w formulacji mieszanin e 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL) i QS21 w emulsji wodno-olejowej. Uk lad adiuwanta SBAS2 opisano uprzednio w WO 95/17210. 3D-MPL: jest immunostymulatorem pochodz acym z lipopolisacharydu (LPS) Gram-ujemnej bak- terii Salmonella minnesota. MPL deacylowano i nie posiada on grupy fosforanowej przy grupie lipidu A. To traktowanie chemiczne dramatycznie zmniejsza toksyczno sc zachowuj ac w la sciwo sci immuno- stymuluj ace (Ribi, 1986). Ribi Immunochemi-stry wytwarza i sprzedaje MPL dla SB-Biologicals. Do- swiadczenia przeprowadzone przez SmithKline Beecham Biologicals wykaza ly, ze 3D-MPL w po la- czeniu z ró znymi no snikami silnie wzmacnia odporno sc humoraln a oraz komórkow a typu TH1. QS21: jest naturaln a cz asteczk a saponiny ekstrahowan a z kory po ludniowoameryka nskiego drzewa Quillaja samonaria Molina. Technika oczyszczania opracowana do rozdzielania poszczegól- nych saponin z surowych ekstraktów kory, umo zliwi la identyfikacj e saponiny, QS21, która jest glikozy- dem triterpenowym, wykazuj acym silniejsz a aktywno sc adiuwantow a i ni zsz a toksyczno sc w porówna- niu ze zwi azkiem wyj sciowym. Wykazano, ze QS21 aktywuje CTL w kontek scie MHC klasy I wobec kilku podjednostkowych Ag, jak równie z pobudza proliferacj e limfocytów swoistych wobec Ag (Kensil, 1992). Aquila (oficjalnie, Cambridge Biotech Corporation) wytwarza i dostarcza QS21 dla SB-Biologicals. Do swiadczenia przeprowadzone przez SmithKline Beecham Biologicals wykaza ly wyra zny efekt synergiczny kombinacji MPL i QS21 w indukowaniu reakcji odporno sciowych typu humoralnego i ko- mórkowego typu TH1. Emulsja wodno/olejowa obejmuje faz e organiczn a wytworzona z 2 olejów (tokoferol i skwalen) i faz e wodn a PBS zawieraj ac a Tween 80 jako emulgator. Emulsja obejmowa la 5%, skwalenu, 5% tokoferolu, 0,4% Tween 80, za s srednia wielko sc cz astek wynosi la 180 nm i znana jest jako SB62 (patrz, WO 95/17210). Do swiadczenia przeprowadzone w SmithKline Beecham Biologicals wykaza ly, ze dodanie tej emulsji wodno-olejowej do 3D-MPL/QS21 (SBAS2) dalej wzmacnia w la sciwo sci immunostymuluj ace wobec ró znych antygenów podjednostkowych.PL 203 658 B1 12 2. Wytwarzanie emulsji SB62 (2-krotnie st ezonej) Tween 80 rozpuszczono w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) otrzymuj ac 2% roz- twór w PBS. Aby dostarczy c 100 ml dwukrotnie st ezonego koncentratu, 5 g DL-alfa-tokoferolu i 5 ml skwalenu wirowano w celu dok ladnego wymieszania. 90 ml roztworu PBS/Tween dodano i dok ladnie wymieszano. Powstala emulsj e przepuszczono nast epnie przez strzykawk e, a nast epnie mikrofluidy- zowano stosuj ac urz adzenie do mikrofluidyzacji M110S. Powsta le krople oleju mia ly wielko sc oko lo 180 nm. 3. Wytwarzanie formulacji lipoproteiny D1/3 - MAGE-3 - His QS21/3D MPL w emulsji olej w wo- dzie (SBAS2) Adiuwant formu lowano przez polaczenie MPL i QS21 w emulsji woda/olej. Preparat ten dostar- czono w fiolkach 0,7 ml w celu domieszania do liofilizowanego antygenu (fiolki zawiera ly 30 do 300 µg antygenu). Kompozycja rozcie nczalnika adiuwantowego do liofilizowanej szczepionki ma nast epuj acy sk lad: Sk ladnik Ilo sc (na dawk e) Adiuwant Emulsja SB62 250 µl skwalen 10,7 mg DL- a-tokoferol 11,9 mg Tween 80 4,8 mg Monofosforylo-lipid A 100 µg QS21 100 µg Konserwant Thiomersal 25 µg Bufor Woda do wstrzykniec q.s. do 0,5 ml dizasadowy fosforan sodu 575 µg jednozasadowy fosforan potasu 100 µg chlorek potasu 100 µg chlorek sodu 4,0 mg Szczepionk e ko ncow a otrzymano przez rekonstytucj e liofilizowanego preparatu LPD-MAGE-3-His z adiuwantem albo samym PBS. Kontrole adiuwanta bez antygenu wytworzono przez zast apienie bia lka przez PBS. 4. Antygen szczepionki: bia lko fuzyjne lipoproteiny D1/3 - MAGE-3 - His Lipoproteina D jest lipoprotein a eksponowan a na powierzchni Gram-ujemnej bakterii Haemophi- lus influenzae. W laczenie pierwszych 109 reszt przetworzonego bia lka D jako sk ladnika fuzji przeprowadzono w celu dostarczenia antygenu szczepionki z epitopami limfocytów T. Oprócz domeny LPD, bia lko za- wiera lo dwa nie spokrewnione aminokwasy (Met i Asp), reszty aminokwasowe 2 do 314 MAGE-3, dwie reszty Gly dzia laj ace jako region zawiasowy do eksponowania ko ncowych siedmiu reszt His.PL 203 658 B1 13 P r z y k l a d V 1. Immunogenno sc LPD-MAGE-3-His u myszy i ma lp W celu zbadania antygenowo sci i immunogenno sc i ludzkiego bia lka MAGE-3 potencjaln a szczepionk e wstrzykni eto dwóm ró znym szczepom myszy (C57BL/6 i Balb/C), ró zni acym si e pod lo- zem genetycznym i allelami MHC. Dla obu szczepów potencjalne motywy peptydowe MHC klasy I i MHC klasy II zosta ly przewi- dziane teoretycznie dla cz esci MAGE bia lka fuzyjnego LPD-MAGE-3-His. a) Protokó l immunizacji: 5 myszom ka zdego ze szczepów wstrzykni eto dwukrotnie w odst epie 2 tygodni w poduszeczk e lapy po 5 µg LPD-MAGE-3-His formu lowanego z albo w nieobecno sci SBAS2 w st ezeniu 1/10 st eze- nia stosowanego u ludzi. b) Test proliferacji: Limfocyty wyizolowano przez rozgniecenie sledzion albo w ez lów ch lonnych pachwinowych my- szy w 2 tygodnie po drugim wstrzykni eciu. 2 x 10 5 komórek umieszczono w potrójnym powtórzeniu w p lytkach 96-studzienkowych i restymulowano in vitro przez 72 godziny ró znymi st ezeniami (1 - 0,1 µg/ml) His-MAGE-3 jako takiego albo op laszczonego na lateksowych mikropere lkach. Zwi ekszon a aktywnosc limfoproliferacyjn a swoist a wobec MAGE-3 obserwowano zarówno w komórkach sledziony (patrz, Fig. 5 i 7), jak i w ez lów ch lonnych (patrz, Fig. 6 i 8) myszy C57BL/6 albo Balb/C, którym wstrzykni eto bia lko LPD-MAGE-3-His, w porównaniu z reakcj a limfoproliferacyjn a myszy, które otrzyma ly sam a formulacj e SBAS2 albo PBS. Ponadto, uzyskano istotnie wy zsz a odpowied z proliferacyjn a przy u zyciu limfocytów od myszy immunizowanych LPD-MAGE-3-His w adiuwancie SBAS2 (patrz, Fig. 6 i 8). c) Wnioski: LPD-MAGE-3-His jest immunogenne dla myszy, za s t e immunogenno sc mo zna zwi ekszy c przez zastosowanie formulacji adiuwanta SBAS2. 2. Reakcja przeciwcia l a) Protokó l immunizacji: Myszy Balb/c albo C57BL/6 immunizowano przez dwukrotne wstrzykni ecie w poduszk e lapy w odst epach 2-tygodniowych PBS albo SBAS2 albo 5 µg LPD-MAGE-3-His albo 5 µg LPD-MAGE-3-His z SBAS2. W grupach kontrolnych i testowanych stosowano 3 i 5 zwierz at odpowiednio. b) Po sredni test ELISA: Dwa tygodnie po drugim wstrzykni eciu, poszczególne surowice pobierano i poddawano po sred- niemu testowi ELISA. 2 µg/ml oczyszczonego His MAGE-3 zastosowano jako antygen do op laszczania studzienek. Po wysyceniu przez 1 godzin e w 37°C PBS + 1% surowica z nowonarodzonych ciel at, surowice kolej- no rozcie nczano (rozpoczynaj ac od 1/1000) w buforze wysycaj acymi inkubowano przez noc w 4°C albo 90 minut w 37°C. Po p lukaniu w PBS/Tween 20,0,1%, jako drugie przeciwcia lo dodawano anty- mysie biotynylowane kozie ca lkowite IgG (1/1000) albo antymysie kozie surowice IgG1, IgG2a, IgG2b (1/5000). Po 90 minutach inkubacji w 37°C, dodano streptawidyn e sprz egni et a z peroksydaz a, za s jako substrat zastosowano TMB (nadtlenek tetra-metylo-benzydyny). Po 10 minutach reakcj e zablo- kowano przez dodanie H 2 SO 4 , 0,5 M i oznaczono O.D. c) Wyniki: Figura 9 przedstawia porównanie pomi edzy ró znymi grupami myszy (N=5/grup e) mian surowic w srednim punkcie srodkowym, które stanowi a srednie rozcie nczenie konieczne do osi agni ecia punktu srodkowego na krzywej. Wyniki te pokazuj a, ze u obu badanych szczepów myszy wykszta lcana jest s laba reakcja prze- ciwcia l po dwóch wstrzykni eciach samego LPD-MAGE-3-His, ale znacznie silniejsze reakcje przeciw- cia l przeciwko MAGE-3 tworzone s a po wstrzykni eciu LPD-MAGE-3-His w obecno sci SBAS2. Tak wi ec, tylko 2 wstrzykni ecia LPD-MAGE-3-His + SBAS2 w odst epach 2 tygodni wystarczaj a do wytwo- rzenia obserwowanych silnych reakcji Ab. Lepsz a reakcj e przeciwcia l obserwowano u myszy Balb/c w porównaniu z reakcj a uzyskan a u myszy C57BL/6, co mo zna wyt lumaczy c ró znicami w haplotypach albo w pod lo zu genetycznym pomi edzy tymi szczepami, mimo ze miano przeciwcia l uzyskane u myszy C57BL/6 jest równie z wy z- sze po wstrzykni eciu LPD-MAGE-3-His + SBAS2 ni z po podaniu samego LPD-MAGE-3-His.PL 203 658 B1 14 Odpowiedzi swoiste wobec MAGE-3 podklas Ig po szczepieniu w ró znych grupach myszy przed- stawiono na Fig. 10 i 11, które daj a porównanie srednich punktów srodkowych rozcie ncze n surowic. Ani IgA, ani IgM nie zosta ly wykryte w zadnej próbce surowic, nawet w próbkach od myszy szczepionych LPD-MAGE-3-His w adiuwancie SBAS2. Przeciwnie, poziom ca lkowity IgG by l nieco wy zszy w surowicach myszy szczepionych samym LPD-MAGE-3-His i istotnie wzrasta l w surowicach zwierz at, którym podawano LPD-MAGE-3-His w SBAS2. Analiza st eze n ró znych podklas IgG wykazuje, ze mieszana reakcja Ab zosta la wywo lana u myszy, poniewa z poziomy wszystkich badanych podklas IgG (IgGl, IgG2a, IgG2b) by ly wy zsze u myszy szczepionych antygenem adiuwantowanym, ni z samym adiuwantem. Istota mieszanej reakcji Ab po szczepieniu LipoD-MAGE-3 w obecno sci SBAS2 zale zy jednak- ze od szczepu myszy, poniewa z IgGl i IG2b wyst epowa ly g lównie w surowicach myszy Balb/c i C57B1/6, odpowiednio. 3. Immunogenno sc lipoproteiny D1/3 MAGE-3-His + adiuwant SBAS2 u ma lp rezus Wybrano trzy grupy po piec ma lp rezus (Macaca Mulatta). Jako kontrol e pozytywn a zastosowa- no RTS, S i gp120. Grupy: Grupa 1 prawa noga: RTS, S/SBAS2 lewa noga: gp120/SBAS2 Grupa 2 prawa noga: RTS,S/SB26T lewa noga: gp120/SB26T Grupa 3 prawa noga: lipoD1/3 MAGE 3 His/SBAS2 Zwierz eta otrzyma ly szczepionk e w dniu 0, a nast epnie dawki przypominaj ace w dniu 28 i 84, po czym zosta ly skrwawione w celu okre slenia odpowiedzi przeciwcia l przeciwko MAGE 3 i bia lku D. Szczepionki podawano domi esniowo jako wstrzykni ecie w bolusie (0,5 ml) w tyln a cz es c nogi prawej. Ma le próbki krwi pobierano co 14 dni. Pobierane z zy ly udowej próbki krwi po 3 ml bez dodatku heparyny, pozostawiano do skrzepni ecia przez przynajmniej godzin e, a nast epnie wirowano je w tem- peraturze pokojowej przez 10 minut przy 2500 rpm. Surowic e pobierano, zamra zano w -20°C i przesy lano do oznaczenia poziomu przeciwcia l w swoistym te scie ELISA. 96-studzienkowe p lytki (maxisorb Nunc) op laszczano 5 µg His MAGE-3 albo bialkiem D przez noc w 4°C. Po godzinie wysycania w 37°C PBS z NCS 1%, kolejne rozcie nczenia surowicy króliczej dodawano na 1,5 godziny w 37°C (rozpoczynaj ac od rozcie nczenia 1/10), po 3 p lukaniach w PBS Tween, dodawano królicz a biotynylowan a surowic e (Amersham RPN 1004 partia 88) (1/5000). P lytki p lukano i dodawano kompleks peroksydazy ze streptawidyn a (1/5000) na 30 minut w 37°C. Po p luka- niu, dodano 50 µl TMB (BioRad) na 7 minut i przerwano reakcj e przez dodanie 0,2 M H 2 SO 4 i odczy- tano OD przy 450 nm. Rozcienczenia punktu srodkowego wyliczono z zastosowaniem oprogramowa- nia SoftmaxPro. Reakcja przeciwcia l Ma le próbki krwi pobierano co 14 dni w celu monitorowania z zastosowaniem ELISA kinetyki reakcji przeciwcia l wobec MAGE 3. Wyniki wskazuj a ze po jednym wstrzykni eciu LPD1/3 MAGE 3 His + SBAS2, ca lkowite miano Ig swoistych wobec MAGE 3 by lo niskie. Wyra zne wzmocnienie obserwowano u 3 z 5 zwierz at po drugim i trzecim wstrzykni eciu LipoD1/3 MAGE 3 + adiuwant u tych samych ma lp. Osobniki s labo reaguj ace pozostawa ly negatywne nawet po 3 wstrzykni eciach. 28 dni po II i po III, miana przeciwcia l wraca ly do poziomów podstawowych. Podklas e tych przeciwcia l oznaczono jako g lównie IgG, nie za s IgM. Prze laczenie na IgG sugeruje, ze wywo lano reakcj e limfocytów T pomocniczych. Swoista reakcja przeciwcia l przeciwko bia lku D, jakkolwiek s laba, jest zgodna z reakcj a przeciwcia l na MAGE 3. P r z y k l a d VI 1. LPD-MAGE 1 His W analogiczny sposób wytworzono LPD-MAGE 1-His. Sekwencje aminokwasowe i DNA przedsta- wiono w Id. Sekw. nr 3 i 4. Powsta le bia lko oczyszczono w sposób analogiczny do LPD-MAGE-3-His. Po- krótce, hodowl e komórkow a homogenizowano i traktowano 4M chlorowodorkiem guanidyny i 0,5 M beta-merkaptoetanolem w obecno sci 0,5% detergentu Empigen. Produkt filtrowano, za s permeat trak- towano 0,6 M jodoacetamidem. Frakcje karboksyamidowane poddano chromatografii IMAC (chelat cynku - Sepharose FF). Kolumn e najpierw zrównowa zono i przep lukano roztworem zawieraj acym 4M guanidyn e, HCl i fosforan sodu (20 mM, pH 7,5), a nast epnie p lukano roztworem zawieraj acym 4MPL 203 658 B1 15 mocznik w fosforanie sodu (20 mM, pH 7,5) i 0,5% Empigen. Bia lko eluowano w tym samym buforze, ale ze wzrastaj acym st ezeniem imidazolu (20 mM, 400 mM i 500 mM). Eluat rozcie nczano 4M mocznikiem. Kolumn e Sepharose Q równowa zono i p lukano 4M mocz- nikiem w 20 mM fosforanie sodu (pH 7,5) i 0,5% Empigen. Drugie p lukanie przeprowadzono w tym samym buforze, ale bez detergentu. Bia lko eluowano w tym samym buforze, ale z rosn acymi st eze- niami imidazolu (150 mM, 400 mM, IM). Eluat poddano ultrafiltracji. P r z y k l a d VII Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT 14426 i transformacja szczepu gospodarza AR58 w celu wytwarzania NS1-MAGE 3-His Projektowanie bia lka Projekt bia lka fuzyjnego NSl-MAGE-3-His, wyra zanego w E. coli przedstawiono na Fig. 12. Struktura pierwszorz edowa powsta lego bia lka ma sekwencj e przedstawion a w Id. Sekw. nr 5. Sekwencj e koduj ac a (Id. Sekw. nr 6) odpowiadaj ac a powy zszemu bia lku umieszczono pod kon- trol a promotora ?pL w plazmidzie ekspresyjnym E. coli. Strategia klonowania w celu wytworzenia bia lka fuzyjnego NSl-MAGE-3-His Jako materia l wyj sciowy zastosowano plazmid cDNA od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute, za- wierajacy sekwencj e koduj ac a genu MAGE-3 oraz wektor PMG81, zawieraj acy region koduj acy 81 aminokwasów NS1 (bia lko nie-strukturalne) wirusa grypy. Strategia klonowania przedstawiona na Fig. 3 obejmowa la nast epuj ace etapy: a) Amplifikacja PCR sekwencji prezentowanych w plazmidzie cDNA MAGE-3, przy u zyciu oli- gonukleotydu sensownego 5'gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, oraz oligonukle- otydu antysensownego 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tct caa; Amplifikacja ta doprowadzi la do nast epuj acych modyfikacji na ko ncu N: zmiana pierwszych pi e- ciu kodonów w wykorzystaniu kodonów przez E. coli, zast apienie kodonu Pro przez kodon Asp w po- zycji 1, wstawienie miejsca Ncol na ko ncu 5' i dodanie dwóch kodonów reszt Gly oraz 7 kodonów His na ko ncu 5', a nast epnie wstawienie miejsca Xbal na ko ncu C. b) Klonowanie do wektora klonowania TA (Invitrogen) powy zszego amplifikowanego fragmentu i wytworzenie po sredniego wektora pRIT 14647. c) Wyci ecie fragmentu Ncol Xbal z plazmidu pRIT 14647 i klonowanie do wektora pRIT PMG81. d) Transformacja szczepu gospodarza AR58. e) Selekcja i charakterystyka transformantów szczepu E. coli zawieraj acych plazmid pRIT 14426 (Fig. 14), wyra zaj acych bia lko fuzyjne NSl-MAGE-3-His. Charakterystyka rekombinowanego NSl-MAGE-3-His (pRIT 14426) Bakterie hodowano na pod lo zu LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi a- gn ela OD = 0,3 (620 nm) przeprowadzono indukcj e ciep lem przez podwy zszenie temperatury do 42°C. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono w PBS i poddano lizie (przez rozpad) przez trzykrotne przepuszczenie przez pras e French. Po odwirowaniu (60 minut w 100000 g) osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt zbadano przez SDS-PAGE. Bia lka uwidoczniono w zelach barwionych Coomassie B1, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% bia lka ca lkowitego E. coli. Bia lko rekom- binowane by lo widoczne w postaci pojedynczego pr azka o MW 44,9 kDa. Bia lko fuzyjne zidentyfiko- wano przez analize Western blot stosuj ac przeciwcia la monoklonalne przeciwko NS-1. P r z y k l a d VIII Oczyszczanie NS1-MAGE-3-His (E. coli) do immunizowania królików/myszy Schemat oczyszczania W celu oczyszczenia antygenu zastosowano poni zszy schemat: liza komórek + wirowanie ? rozpuszczenie antygenu + wirowanie ? agaroza Ni 2+ +-NTA ? zat ezanie ? elektroforeza preparatywna („Prep cell") ? precypitacja TCA i rozpuszczanie w PBSPL 203 658 B1 16 a. Liza Komórki bakterii (23 g) poddano lizie w 203 ml buforu 50 mM PO 4 pH 7 w homogenizatorze Rannie, po czym lizat odwirowano w rotorze JA 20 przy 15000 rpm przez 30 minut. Nads acz usuni eto. b. Rozpuszczanie antygenu 1/3 osadu rozpuszczono przez noc w 4°C w 34 ml 100 mM PO 4 - 6M GuHCl, pH 7. Po odwiro- waniu w rotorze JA 20 przy 15000 rpm przez 30 minut, osad usuni eto, za s nads acz dalej oczyszczono przez IMAC. c. Chromatografia powinowactwa: agaroza Ni 2+ -NTA (Qiagen) Obj eto sc kolumny: 15 ml (16 mm x 7,5 cm) Bufor do pakowania: 0,1 M PO 4 - 6 M GuHCl pH 7 Bufor do próbek: j.w. Bufor do przemywania: 0,1 M PO 4 - 6 M GuHCl pH 7 0,1 M PO 4 - 6 M mocznik pH 7 Elucja: gradient imidazolu (0 ? 250 mM) w 0,1 M PO 4 pH 7 z dodatkiem 6 M mocznika. Szybko sc przep lywu: 2 ml/min. d. Zat ezanie: Frakcja eluatu IMAC zawieraj ace antygen (160 ml) pulowano i zat ezano do 5 ml w komorze z mieszalnikiem Amicon na membranie Filtron (typ Omega, ci ezar odciecia 10000). Czysto sc na tym etapie wynosi la oko lo 70% jak oceniono przez SDS-PAGE. b. Elektroforeza preparatywna (Prep Cell BioRad) 2,4 ml zat ezonej próbki gotowano w 0,8 ml bufora redukuj acego do próbek i wprowadzano na 10% zel poliakryloamidowy. Antygen eluowano w buforze Tris-Glycine pH 8,3 z dodatkiem 4% SDS i pulowano frakcje zawieraj ace NS1-MAGE 3-His. e. Precypitacja TCA Antygen precypitowano z zastosowaniem TCA, a nast epnie wirowano w rotorze JA 20 przy 15000 rpm przez 20 minut. Nads acz usuwano. Osad rozpuszczano ponownie w buforze PBS pH 7,4. Bia lko by lo rozpuszczalne w PBS, po zamro zeniu/rozmro zeniu nie wykazywa lo sladów degra- dacji podczas przechowywania przez 3 godziny w 37°C, za s jego ci ezar cz asteczkowy wynosi l oko lo 50000 Da, co okre slono przez SDS (12,5% PAGE). P r z y k l a d IX Wytwarzanie szczepu E. coli wyra zaj acego bialko fuzyjne CLYTA-MAGE-1-ogon His 1. Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT14613 i transformowanie szczepu gospodarza AR58: Projektowanie bia lka: Projekt bia lka fuzyjnego Clyta-MAGE-1-His, wyra zanego w E. coli przedstawiono na Fig. 15. Struktura pierwszorz edowa powsta lego bia lka ma sekwencj e przedstawion a w Id. Sekw. nr 7. Sekwencj e koduj ac a (Id. Sekw. nr 8) odpowiadaj ac a powy zszemu bia lku umieszczono pod kon- trol a promotora XpL w plazmidzie ekspresyjnym E. coli. Klonowanie: Jako materia l wyj sciowy zastosowano plazmid PCUZ1, który zawiera 117 kodonów ko nca C re- gionu koduj acego LytA ze Streptococcus pneumoniae oraz wektor pRIT14518 w którym uprzednio subklonowano cDNA genu MAGE-1 z plazmidu otrzymanego od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute. Strategia klonowania w celu ekspresji bia lka CLYTA-MAGE-l-His (przedstawiona na Fig. 16) obejmowa la nast epuj ace etapy: a) Pierwszym etapem by la amplifikacja PCR w celu otoczenia sekwencji CLYTA miejscami re- strykcyjnymi Ndel-Afllll. Amplifikacj e przeprowadzono stosuj ac plazmid PCUZ1 jako matryc e oraz star- tery oligonukleotyd sensowny 5' taa aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac i antysensowny: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Prowadzi to do amplifikacji sekwencji CLYTA d lugo sci 378 nukleotydów. b) W drugim etapie polaczono sekwencje CLYTA z sekwencjami MAGE-1-His tworz ac sekwen- cje koduj ac a bia lko fuzyjne. Etap ten obejmowa l wyci ecie fragmentu Ndel-Aflll Clyta i wprowadzenie do wektora pRIT14518 uprzednio otworzonego przez enzymy restrykcyjne Aflll i Ncol (zgodne z Ncol i Afllll) daj ac plazmid pRIT14613.PL 203 658 B1 17 c) Transformowanie szczepu AR58 d) Selekcja i charakterystyka transformantów E. coli (opornych na KAN) zawieraj acych plazmid pRIT14613 (patrz, Fig. 16) 1. Charakteryzacja rekombinowanego CLYTA-MAGE-1-His (pRIT14613) Bakterie hodowano na po zywce LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 0,3 (620 nm) przeprowadzono indukcj e przez podniesienie temperatury do 42°C. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono ponownie w PBS i poddano lizie (przez rozpad) w jednym podej sciu. Po odwirowaniu osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt analizowano przez SDS-PAGE. Bia lka wykryto w zelach barwionych Coomassie B1, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% ca lkowitego bia lka E. coli. Bia lko rekombinowane by lo widoczne jako pojedynczy pr azek o pozornym MW 49 kDa. Bia lko fuzyjne zidentyfikowano przez analiz e Western biot stosuj ac przeciw- cia la poliklonalne anty-MAGE-1. Odtworzenie jednostki ekspresji obejmuj acej d lugi promotor ?pL (przydatny do indukcji kwasem nalidyksowym) oraz pRIT14614 koduj acy sekwencj e CLYTA-MAGE-3 Fragment restrykcyjny EcoRI-Ncol zawieraj acy d lugi promotor pL i cz esc sekwencji CLYTA wy- tworzono z plazmidu pRITDVA6 i wprowadzono pomi edzy miejsca EcoRI-Ncol plazmidu pRIT 14613. Otrzymano rekombinowany plazmid pRIT14614. Rekombinowany plazmid pRIT14614 (Fig. 17) koduj acy bia lko fuzyjne CLYTA-MAGE-1-His za- stosowano do transformowania E. coli AR120. Potencjalny szczep oporny na KAN wyselekcjonowano i scharakteryzowano. Charakteryzacja rekombinowanego bia lka Bakterie hodowano na po zywce LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 400 (600 nm) dodano kwas nalidyksowy w stezeniu 60 mg/ml. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono w PBS i poddano lizie przez rozpad (rozpad CLS w jednym podej sciu typu „one shot"). Po odwirowaniu osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt analizowano przez SDS-PAGE. Bia lka wykryto w zelach barwionych blekitem Coomassie, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% bia lka ca lkowitego E. coli. Bia lko fuzyjne zidentyfikowano przez analiz e Western biot stosuj ac królicze przeciwcia la poliklonalne anty-MAGE-1. Rekombinowane bia lko by lo widoczne jako pojedynczy pr azek o pozornym MW wynosz acym oko lo 49 kD. P r z y k l a d X CLYTA-MAGE3-HIS A: Odrzucenie nowotworu przy u zyciu rekombinowanego antygenu: bia lko fuzyjne CLYTA- MAGE-3-His, w którym sk ladnik fuzji C-lyt A prowadzi do ekspresji rozpuszczalnego bia lka, dzia la jak znacznik powinowactwa i dostarcza epitopów limfocytom T. Wytwarzanie szczepu E. coli wyra zaj ace- go bia lko fuzyjne CLYTA-MAGE-3-His. Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT 14646 i trans- formowanie szczepu gospodarza AR120: Projektowanie bia lka: Projektowanie bia lka fuzyjnego CLYTA-MAGE-3-His do wyra zania w E. coli opisano na Fig. 18. Struktura pierwszorz edowa powsta lego bia lka przedstawiona jest w Id. Sekw. nr 9, za s se- kwencja koduj aca w Id. Sekw. nr 10. Sekwencj e koduj ac a powy zszej konstrukcji bia lka umieszczono pod kontrol a promotora ?pL w plazmidzie ekspresyjnym E. coli. Klonowanie: Jako materia l wyj sciowy zastosowano plazmid PCUZ1, który zawiera 117 kodonów ko nca C re- gionu koduj acego LytA ze Streptococcus pneumoniae (Gene 43, 1986) str. 265-272) oraz wektor pRIT 14426, w którym uprzednio subklonowano cDNA genu MAGE-3 z plazmidu otrzymanego od Dr Thier- ry Boon z Ludwig Institute. Strategia klonowania w celu ekspresji CLYTA-MAGE-3-His (przedstawiona na Fig. 19) obejmo- wa la nast epuj ace etapy: 1. Wytwarzanie modu lu sekwencji koduj acej CLYTA-MAGE-3-His 1.1. Pierwszym etapem by la amplifikacja PCR w celu otoczenia sekwencji CLYTA miejscami restrykcyjnymi Aflll i Afllll. Amplifikacj e PCR przeprowadzono stosuj ac plazmid PCUZ1 jako matryc e oraz startery oligonukleotyd sensowny 5' taa aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac i antysensowny: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Prowadzi to do amplifikacji sekwencji CLYTA d lugo sci 427 nukleotydów. Powy zej wskazany amplifikowany frag- ment wklonowano do wektora TA (Invitrogen) otrzymuj ac pRIT 14661.PL 203 658 B1 18 1.2. Drugim etapem by lo po laczenie sekwencji CLYTA z sekwencjami MAGE-3-His w celu wy- tworzenia sekwencji koduj acej bia lko fuzyjne. Etap ten obejmowa l wyci ecie fragmentu Clyta Aflll-Afllll i wprowadzenie do wektora pRIT 14426 uprzednio otworzonego enzymami restrykcyjnymi Aflll i Ncol (zgodnego Ncol i Afllll) z wytworzeniem plazmidu pRIT 14662. 2. Odtworzenie jednostki ekspresji obejmuj acej d lugi promotor ?pL (przydatny do indukcji kwa- sem nalidyksowym) oraz sekwencj e koduj aca CLYTA-MAGE-3: Z plazmidu pRIT 14662 wytworzono fragment restrykcyjny BglII-XbaI zawieraj acy krótki promo- tor pL i sekwencj e koduj ac a CLYTA-MAGE-3-His i wprowadzono pomi edzy miejsca Bglll - Xbal pla- zmidu TCM67 (pochodna pBR322 z genem oporno sci na ampicylin e i d lugim promotorem ?pL, PCT/EP92/01827). Otrzymano rekombinowany plazmid pRIT 14607. Rekombinowany plazmid pRIT 14607 koduj acy bia lko fuzyjne CLYTA-MAGE-3-His zastosowa- no do transformowania E. coli AR120 (Mott i in., PNAS, 82:88). Potencjalny szczep oporny na ampicy- lin e wyselekcjonowano i scharakteryzowano. 3. Wytwarzanie plazmidu pRIT 14646 W ko ncu skonstruowano plazmid podobny do pRIT 14607, ale z genem oporno sci na kanamy- cyn e (pRIT 14646). Charakteryzacja rekombinowanego bia lka Bakterie hodowano na po zywce LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 400 (przy 600 nm) dodano kwas nalidyksowy w stezeniu 60 ?g/ml. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono w PBS i poddano lizie przez rozpad (rozpad CLS w jednym podej sciu typu „one shof"). Po odwirowaniu osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt analizowano przez SDS-PAGE. Bia lka wykryto w zelach barwionych blekitem Coomassie, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% bia lka ca lkowitego E. coli. Bia lko fuzyjne zidentyfikowano przez analiz e Western biot stosuj ac królicze przeciwcia la poliklonalne anty-MAGE-3. Bia lko rekombinowane by lo widoczne jako pojedynczy pr azek o pozornym MW oko lo 58 kDa. P r z y k l a d XI Oczyszczanie rekombinowanego bia lka CLYTA-MAHE-3-His Rekombinowane bakterie AR120 (pRIT 14646) hodowano w 20-litrowych fermentatorach stosu- jac fermentacje wsadowa w 30°C. Ekspresj e rekombinowanego bia lka wywo lano przez dodanie kwa- su nalidyksowego w stezeniu ko ncowym 60 ?g/ml. Komórki zebrano pod koniec fermentacji i poddano lizie przy 60 OD /600 przez dwukrotne przepuszczenie przez pras e French (20000 psi). Poddane lizie komórki wirowano przy 15000 x g w 4°C. Nads acz zawieraj acy rekombinowane bia lko wprowadzono do kolumny anionowymiennej DEAE Sepharose CL6B (Pharmacia) równowa zonej wst epnie 0,3 M NaCl, 20 mM Tris HCl, pH 7,6, Bufor A. Po przep lukaniu kolumny buforem A, bia lko fuzyjne eluowano 2% cholina w buforze A. Pulowano frakcje zawieraj ace antygen, co uwidoczniono analiz a Western blot z u zyciem przeciwcia l anty-MAGE-3. Antygen eluowany z DEAE wprowadzano do 0,5% Empigen BB (detergent obojnaczy) i 0,5 M NaCl, po czym ladowano do kolumny chromatografii powinowactwa z jonem metalu, zrównowa zonej uprzednio 0,5% Empigen BB, 0,5 M NaCl, 50 mM buforem fosfora- nowym pH 7,6 (Bufor B). Kolumn e IMAC p lukano buforem B do momentu osi agni ecia warto sci podstawowej absorbancji przy OD 280. Antygen eluowano gradientem st ezenia imidazolu 0-250 mM w buforze C. Frakcje imidazolu 0,090-0,250 M pulowano, zatezano na membranie Filtron Omega 10 kDa, po czym dializowano wobec bufora PBS. Wnioski Wykazano, ze bia lko fuzyjne LPD-MAGE-3-His jest immunogenne u myszy, za s ta immunogen- nosc (reakcja proliferacyjna i reakcja przeciwcia l) mo ze by c dalej wzmocniona przez zastosowanie adiuwanta opisanego wy zej. Oczyszczanie mo zna polepszy c przez derywatyzacj e tioli, które tworz a mostki disiarczkowe. Wykazano równie z, ze lepsz a reakcj e przeciwcia l uzyskuje si e przez szczepienie LPD-MAGE-3- -His w obecno sci adiuwanta. G lównym izotypem spotykanym w surowicy myszy szczepu C57B1/6 jest IgG2b, co wskazuje, ze zosta la wywo lana reakcja typu Thl. W warunkach klinicznych u pacjenta traktowanego LPD-MAGE-3-His w postaci bez adiuwanta nast api lo usuni ecie czerniaka.PL 203 658 B1 19 Literatura - Anichini A., Fossati G., Parmiani G. Immunol. Today, 8: 385 (1987). - De Plaen E., Arden K., Traversari C, et al. Immunogenetics, 40: 360 (1994). - Gaugler B., Van den Eynde B., van der Bruggen P., et al. J. Exp. Med., 179: 921 (1994). - Herman J., van der Bruggen P., Immanuel F., et al. Immunogenetics, 43: 377 (1996). - Inoue H., Mori M., Li J., et al. Int. J. Cancer, 63: 523 (1995). - Kensil C.R., So ltysik S., Patel U., et al. in: Channock R.M. , Ginsburg H.S., Brown F., et al., (eds.), Vaccines 92, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), 36-40: (1992). - Knuth A., Danowski B., Oettgen H.F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3511 (1984). - Patard J.J., Brasseur F., Gil-Diez S., et al. Int. J. Cancer, 64: 60 (1995). - Ribi E., et al. in: Levine L., Bonventre P.F., Morello J., et al. (eds)., American Society for Microbiology, Washington DC, Microbiology 1986, 9-13; (1986). - Van den Eynde B., Hainaut P., Hérin M. et al. Int. J. Cancer, 44: 634 (1989). - Van der Bruggen P., Traversari C, Chomez P., et al. Science, 254: 1643 (1991). - Van der Bruggen P., Bastin J., Gajewski T., et al. Eur. J. Immunol., 24: 3038 (1994). - Van Pel A., van der Bruggen P., Coulie P.G. , et al., Immunol. Rev., 145: 229 (1995). - Weynants P., Lethé B., Brasseur F., et al. Int. J. Cancer, 56: 826 (1994). - Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, Itoh K, Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997, Apr, 20 (2): 95-101. - Fuijie T et al, Ann Oncol 1997 Apr, 8 (4): 369-72.PL 203 658 B1 20PL 203 658 B1 21PL 203 658 B1 22PL 203 658 B1 23PL 203 658 B1 24PL 203 658 B1 25PL 203 658 B1 26PL 203 658 B1 27PL 203 658 B1 28PL 203 658 B1 29 PL PL

Claims (15)

1.Zastrze zenia patentowe 1. Bia lko fuzyjne zawieraj ace antygen kodowany przez rodzin e genów MAGE polaczony ze sk ladnikiem fuzji wybranym spo sród: (i) bia lka D z Haemophilus influenzae B albo jego fragmentu zawieraj acego pocz atkow a 1/3 bia lka D lub 109, 110 lub 111 N-ko ncowych aminokwasów bia lka D; (ii) bia lka NS1 z wirusa grypy albo jego fragmentu zawieraj acego 81 N-ko ncowych aminokwa- sów bia lka NS1; albo (iii) LytA ze Streptococcus pneumoniae albo jego fragmentu zawieraj acego: (a) C-ko ncow a cz esc Lyt-A; (b) cz esc zawieraj ac a powtórzenia cz asteczki LytA znajduj acej si e na ko ncu C, pocz aw- szy od reszty 178; i/lub (c) reszty aminokwasowe 188-305 LytA.

2. Bia lko fuzyjne wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze sk ladnikiem fuzji jest bia lko D z Ha- emophilus influenzae B albo jego fragment zawierajacy pocz atkow a 1/3 bia lka D lub 109, 110 lub 111 N-ko ncowych aminokwasów bia lka D.

3. Bia lko fuzyjne wed lug zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, ze obejmuje ponadto znacznik po- winowactwa.

4. Bia lko fuzyjne wed lug zastrz. 1-3, znamienne tym, ze bia lko D jest lipidowan a postaci a bia lka D.

5. Bia lko fuzyjne wed lug zastrz. 1-4, znamienne tym, ze antygen jest kodowany przez gen MAGE wybrany z grupy obejmuj acej MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 i MAGE C2.

6. Sekwencja kwasu nukleinowego koduj aca bia lko fuzyjne okre slone w zastrz. 1-5.

7. Wektor obejmuj acy kwas nukleinowy okre slony zastrz. 6.

8. Komórka gospodarza transformowana wektorem okre slonym w zastrz. 7.

9. Szczepionka, znamienna tym, ze zawiera bia lko okre slone w zastrz. 1-5 lub kwas nukle- inowy okre slony w zastrz. 6.

10. Szczepionka wed lug zastrz. 9, znamienna tym, ze dodatkowo zawiera adiuwant i/lub im- munostymuluj ac a cytokin e lub chemokin e.

11. Szczepionka wed lug zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, ze bia lko jest prezentowane w no- sniku stanowi acym emulsj e oleju w wodzie lub wody w oleju.

12. Szczepionka wed lug zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, ze adiuwant obejmuje 3D-MPL, QS21 albo oligonukleotyd CpG.

13. Szczepionka wed lug zastrz. 9-12, znamienna tym, ze dodatkowo zawiera jeden albo wi ecej innych antygenów.

14. Szczepionka okre slona w zastrz. 9-13 do zastosowania w medycynie.

15. Zastosowanie bia lka okre slonego w zastrz. 1-5 lub kwasu nukleinowego okre slonego w za- strz. 6 do wytwarzania szczepionki do immunoterapeutycznego traktowania pacjenta cierpi acego na czerniaki albo inne nowotwory zwi azane z MAGE. RysunkiPL 203 658 B1 30PL 203 658 B1 31PL 203 658 B1 32PL 203 658 B1 33PL 203 658 B1 34PL 203 658 B1 35PL 203 658 B1 36PL 203 658 B1 37PL 203 658 B1 38PL 203 658 B1 39PL 203 658 B1 40PL 203 658 B1 41PL 203 658 B1 42PL 203 658 B1 43PL 203 658 B1 44PL 203 658 B1 45PL 203 658 B1 46PL 203 658 B1 47PL 203 658 B1 48 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL