PL203499B1 - Sposób oczyszczania lub wytwarzania bia lka MAGE albo jego pochodnej oraz sposób wytwarzania szczepionki - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania lub wytwarzania bia lka MAGE albo jego po- chodnej oraz sposób wytwarzania szczepionki. Bia lka i szczepionki wytworzone zgodnie ze sposobem wed lug wynalazku mog a by c stosowane do leczenia wielu nowotworów, w tym, cho c nie wy lacznie, czerniaka, raka sutka, p echerza, p luc, NSCLC, raka luskowatokomórkowego g lowy i szyi, raka okr ez- nicy i prze lyku. Antygeny kodowane przez rodzin e genów MAGE ulegaj a g lównie ekspresji na komórkach czer- niaka (w tym czerniaka z lo sliwego) i niektórych innych nowotworach, w tym NSCLC (nie- drobnokomórkowy rak p luca), rakach g lowy i szyi, komórkach przej sciowych raka p echerza i raka prze lyku, ale nie s a wykrywane w prawid lowych tkankach z wyj atkiem j ader i lo zyska (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 ulega ekspresji w przypadku 69% czerniaków (Gaugler, 1994) i mo zna go stwierdzi c w 44% NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48% raków luskowatokomórkowych g lowy i szyi, 34% komórek przej sciowych raków p echerza, 57% raków prze lyku, 32% raków okreznicy i 24% raków sutka (Van Pel, 1995); Inoue, 1995; Fujie, 1997; Nishimura, 1997). Nowotwory wyra zaj a- ce MAGE znane s a jako nowotwory zwi azane z MAGE. Immunogennosc ludzkich komórek czerniaka zosta la wykazana w do swiadczeniach z u zyciem mieszanych hodowli komórek czerniaka i autologicznych limfocytów. Hodowle te cz esto wytwarza ly cytotoksyczne limfocyty T (CTL), zdolne do lizy wy lacznie autologicznych komórek czerniaka, ale nie autologicznych fibroblastów ani limfocytów B transformowanych EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Obecnie, zosta ly zidentyfikowane niektóre z antygenów rozpoznawanych przez klony CTL na autolo- gicznych komórkach czerniaka, lacznie z antygenami nalezacymi do rodziny MAGE. Pierwszy antygen, który mo zna by lo zidentyfikowa c przez to, ze by l on rozpoznawany przez swoiste CTL na autologicznych komórkach czerniaka, zosta l okre slony jako MZ2-E (Van den Eynde, 1989) i kodowany jest przez gen MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). CTL skierowane przeciwko MZ2-E rozpoznaj a i rozk ladaj a autologiczne komórki czerniaka MZ2-E-pozytywne, jak równie z te od innych pacjentów, przy za lo zeniu, ze komórki te maja allele HLA.A1. Gen MAGE-1 nale zy do rodziny 12 blisko spokrewnionych genów, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11 i MAGE-12, polo zo- nych na chromosomie X i wykazuj acych ze sob a od 64 do 85% homologii sekwencji koduj acej (De Plaen, 1994). S a one czasem okre slane jako MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11 i MAGE A12 (rodzina MAGE A). Dwie inne grupy bia lek stanowi a równie z cz esc rodziny MAGE, jakkolwiek bardziej odlegle spokrew- nionej. S a to grupy MAGE B i MAGE C. Rodzina MAGE B obejmuje MAGE B1 (znan a równie z jako MAGE Xp1 i DAM 10), MAGE B2 (znane równie z jako MAGE Xp2 i DAM 6), MAGE B3 i MAGE B4 - rodzina MAGE C obecnie obejmuje MAGE C1 i MAGE C2. W ogólnym uj eciu, bia lko MAGE mo zna zdefiniowa c jako zawieraj ace sygnatur e sekwencji rdzeniowej po lozon a w kierunku ko nca C bia lka (przyk ladowo w przypadku MAGE Al, bia lka o 309 aminokwasach, sygnatura rdzeniowa odpowiada aminokwasom 195-279). Wzorzec zgodno sci sygnatury rdzeniowej opisano poni zej, przy czym x oznacza dowolny ami- nokwas, reszty pisane mala liter a s a konserwowane (dopuszczalne s a warianty konserwatywne), za s reszty pisane wielk a liter a s a ca lkowicie konserwowane. Sygnatura sekwencji rdzeniowej: LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWex1(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)- gxp(2x)11t(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv Zast apienia konserwatywne sa dobrze znane i podane jako matryce oceny domy slnej w pro- gramach komputerowych do przyrównywania sekwencji. Programy te obejmuj a PAM250 (Dayhoft i in., (1978), „A model of evolutionary changes in proteins" w „Atlas of Protein sequence and structure", Dayhof (red.) 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington i Blosum 62 (Steven Henikof i Jorja Henikof (1992), „Amino acid substitution matricies from protein blocks") Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry):10915-10919. Ogólnie zast apienie w nast epuj acych grupach stanowi zast apienie konserwatywne, ale zast a- pienia pomi edzy grupami nie s a uwa zane za konserwatywne. Grupy stanowi a i) asparaginian/asparagina/glutaminian/glutamina ii) seryna/treonina iii) lizyna/argininaPL 203 499 B1 3 iv) fenyloalanina/tyrozyna/tryptofan v) leucyna/izoleucyna/walina/metionina vi) glicyna/alanina. Ogólnie i w kontek scie wynalazku, bia lko MAGE powinno by c w przynajmniej 50% identyczne w regionie rdzeniowym z aminokwasami 195 do 279 MAGE A1. Niektóre epitopy CTL zosta ly zidentyfikowane w bia lku MAGE-3. Jeden z tych epitopów, MAGE- -3.A1 jest nonapeptydow a sekwencj a po lozon a pomi edzy aminokwasami 168 i 176 bia lka MAGE-3, która stanowi epitop swoisty dla CTL gdy jest prezentowana w po laczeniu z cz asteczk a MHC klasy I HLA.A1. Ostatnio zidentyfikowano dwa dodatkowe epitopy w sekwencji peptydowej MAGE-3, dzi eki ich zdolno sci do wywo lywania reakcji CTL w mieszanej hodowli komórek czerniaka i autologicznych limfocytów. Te dwa epitopy wykazuj a swoisty motyw wi azania dla alleli, odpowiednio, HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) i HLA.B44 (Herman, 1996). Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania lub wytwarzania bia lka MAGE obejmuj acy redukowanie wi aza n disiarczkowych bia lka i blokowanie powsta lych wolnych grup tiolowych grup a blokuj ac a. Sposób wed lug wynalazku korzystnie obejmuje solubilizacj e bia lka z zastosowaniem silne- go czynnika chaotropowego, korzystniej mocznika lub chlorowodorku guanidyniowego, albo detergen- tu obojnaczego, korzystniej n-dodecylo-N,N-dimetyloglicyny (Empigen BB). Po redukcji wewn atrz- i mi edzycz asteczkowych wi aza n disiarczkowych tiole s a blokowane, aby zapobiec ich ponownemu laczeniu si e w wyniku utleniania. Korzystnie sposób wed lug wynalazku obejmuje ponadto co najmniej jeden etap oczyszczania chromatograficznego. Korzystnie czynnikiem blokuj acym jest czynnik alkiluj acy. Korzystniej czynnikiem blokuj acym jest alfa-fluorowcokwas i/lub alfa-fluorowcoamid. Najkorzystniej czynnik blokuj acy jest wybrany z grupy obejmuj acej kwas jodooctowy, jodoacetamid, N-etylomaleimid, fosforan chloroacetylu, O-mety- loizomocznik i akrylonitryl. Kwas jodooctowy i jodoacetoamid wywo luj a karboksymetylacj e albo kar- boksyamidacj e (karbamidometylacj e) bia lka. Inne czynniki blokuj ace, które mo zna zastosowa c, opisa- no w literaturze (patrz, przyk ladowo, The Proteins, tom. II, red. H. Neurath, R.L. Hill i C.-L. Boeder, Academic Press 1976, albo Chemical Reagents for Protein Modification, tom I, red. R.L. Lundblad i CM. Noyes, CRC Press, 1985). Zastosowanie czynników blokuj acych jest korzystne, poniewa z za- pobiega agregacji produktu oraz zapewnia stabilno sc w dalszych etapach oczyszczania. W jednym wykonaniu wynalazku, czynniki blokuj ace wybrane s a tak, ze wywo luj a powstanie stabilnej i nieodwracalnej pochodnej (np. alfa-fluorowcokwasowej albo alfa-fluorowcoamidowej). Jed- nak ze, mo zna wybra c inne czynniki blokuj ace, takie, ze po oczyszczaniu bia lka czynnik blokuj acy mo zna usun ac z uwolnieniem bia lka niederywatyzowanego. Korzystnie bia lko oczyszczane lub wytwarzane sposobem wed lug wynalazku obejmuje znacz- nik powinowactwa, którym korzystniej jest CLYTA albo ogon polihistydynowy. Bia lko zawieraj ace znacznik powinowactw po etapie blokowania korzystnie poddaje si e chroma- tografii powinowactwa, korzystniej chromatografii powinowactwa z unieruchomionym jonem metalu (IMAC). Chromatografii IMAC poddaje si e bia lka z ogonem polihistydynowym. Najkorzystniej jon meta- lu jest wybrany spo sród cynku, niklu, zelaza, magnezu albo miedzi. Korzystnie chromatografia powi- nowactwa jest prowadzona z zastosowaniem buforu zawieraj acego detergent obojnaczy, taki jak n-dodecylo-N,N-dimetyloglicyn e (Empigen BB, zwany dalej Empigen). Wykorzystanie takiego buforu obni za poziom endotoksyny w produkcie ko ncowym. Korzystnie w sposobie wed lug wynalazku bia lko obejmuj ace ClytA lub jego fragment jest oczyszczane przez chromatografi e powinowactwa wobec choliny lub analogów choliny, takich jak DEAE. W wykonaniu wynalazku dostarczono bia lka z ogonem polihistydynowym oraz z cz escia Clyta. Mo zna je oczyszcza c w prostym dwuetapowym schemacie oczyszczania przez chromatografi e powi- nowactwa. Korzystnie bia lko oczyszczane lub wytwarzane sposobem wed lug wynalazku jest bia lkiem fu- zyjnym obejmuj acym antygen z rodziny bia lek MAGE po laczony z heterologicznym sk ladnikiem fuzji. Bia lka mo zna laczy c chemicznie, ale korzystnie s a one wyra zane jako rekombinowane bia lka fuzyjne, co umo zliwia ich zwi ekszone wytworzenie w uk ladzie ekspresyjnym w porównaniu z bia lkiem nie pod- danym fuzji. Tak wi ec, sk ladnik fuzji mo ze zapewni c epitop limfocytu T (immunologiczny sk ladnik fu- zji), korzystnie epitop limfocytu pomocniczego T rozpoznawany u ludzi, albo u latwi c ekspresj e bia lka (wzmacniacz ekspresji) na wysokim poziomie w porównaniu z natywnym bia lkiem rekombinowanym.PL 203 499 B1 4 Sk ladnik fuzji mo ze by c jednocze snie immunologicznym sk ladnikiem fuzji i sk ladnikiem wzmacniaj a- cym ekspresj e. Korzystnie w bia lku oczyszczanym lub wytwarzanym sposobem wed lug wynalazku sk ladnikiem fuzji jest bia lko D z Haemophilus influenzae B albo jego fragment, bia lko NS1 z wirusa grypy albo jego fragment, lub LytA ze Streptococcus pneumoniae albo jego fragment. Korzystniej sk ladnik fuzji jest lipidowan a postaci a bia lka D lub jej fragmentem, z Haemophilus influenza B. Bia lko D jest bia lkiem powierzchniowym bakterii Gram-ujemnej, Haemophilus influenzae B (WO91/18926). Bia lko D jako sk ladnik fuzji mo ze obejmowa c pierwsz a 1/3 bia lka, w szczególno sci oko lo pierwsze 100-110 aminokwasów ko nca N. Pierwsze 109 reszt sk ladnika fuzji lipidoproteiny D mo ze by c przy laczone do ko nca N bialka MAGE w celu zapewnienia potencjalnego antygenu szcze- pionkowego, z dodatkowym egzogennym epitopem limfocytów T, oraz zwi ekszonym poziomem eks- presji w E. coli. Tak wi ec bia lko D dzia la równie z jako wzmacniacz ekspresji. Ogon lipidowy zapewnia optymaln a prezentacj e antygenu komórkom prezentuj acym antygen. Inne sk ladniki fuzji obejmuj a niestrukturalne bia lko wirusa grypy NS1 (hemaglutynina). Zwykle, wykorzystuje si e 81 aminokwasów ko nca N, jakkolwiek mo zna wykorzysta c ró zne fragmenty, zaklada- jac, ze zawieraj a epitopy limfocytów pomocniczych T. Immunologicznym sk ladnikiem fuzji mo ze te z by c bia lko LYTA. Zazwyczaj wykorzystuje si e fragment ko nca C bia lka. Lyta pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, która syntetyzuje amidaz e N-acetylo-L-alaninow a amidaz e LYTA (kodowan a przez gen lytA, (Gene 43 (1986) str. 265-272), auto- lizyn e, która swoi scie degraduje pewne wi azania w szkielecie peptydoglikanowym. Domena ko nca C bia lka LYTA jest odpowiedzialna za powinowactwo do choliny albo niektórych analogów choliny, ta- kich jak DEAE. W lasciwosc t e wykorzystano do opracowania plazmidów ekspresyjnych E. coli - LYTA przydatnych do ekspresji bia lek fuzyjnych. Opisano oczyszczanie bia lek hybrydowych zawieraj acych fragment C-LYTA na koncu aminowym (Biotechnology:10 (1992) str. 795-798). Jako sk ladnik fuzji cz esto wykorzystuje si e cz esc zawieraj ac a powtórzenia cz asteczki LYTA znajduj ace si e na ko ncu C, pocz awszy od reszty 178, w szczególno sci reszty 188-305. Immunologiczne sk ladniki fuzji opisane wy zej równie z mog a wspomaga c ekspresj e. W szcze- gólno sci, takie fuzje ulegaj a ekspresji z wi eksz a skuteczno sci a ni z rekombinowane natywne bia lka MAGE. Bia lko albo jego pochodna oczyszczane lub wytwarzane sposobem wed lug wynalazku zawiera antygen MAGE wybrany z grupy obejmuj acej MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 i MAGE C2. Korzystnie sposób wed lug wynalazku obejmuje ponadto co najmniej jeden etap oczyszczania. Przedmiotem wynalazku jest równie z sposób wytwarzania szczepionki obejmuj acy etap oczysz- czania lub wytwarzania bia lka MAGE albo jego pochodnej sposobem wed lug wynalazku opisanym powy zej, oraz formu lowania powsta lego bia lka jako szczepionki. Wykazano, ze takie konstrukty bia lkowe oczyszczane lub wytwarzane sposobem wed lug wyna- lazku w zastosowaniach klinicznych s a zdolne do leczenia czerniaka. W jednym przypadku, u pacjen- ta z czerniakiem w IV stopniu zaawansowania po dwóch dawkach nieadiuwantowanego bia lka fuzyj- nego lipo D 1/3 MAGE 3 His stwierdzono usuni ecie przerzutów. Bia lka oczyszczane sposobem wed lug wynalazku mog a by c wyra zane w E. coli i mog a zawie- ra c „ogon" histydynowy, obejmuj acy od 5 do 9, w szczególno sci 6 reszt histydyny, co jest korzystne przy oczyszczaniu. Kwas nukleinowy koduj acy bia lka oczyszczane lub wytwarzane sposobem wed lug wynalazku mo zna wprowadza c do odpowiednich wektorów ekspresyjnych i stosowa c do szczepienia DNA/RNA albo do ekspresji w odpowiednim gospodarzu. Jako szczepionki mo zna zastosowa c odpowiednie wektory drobnoustrojów wyra zaj ace kwas nukleinowy. Takie wektory obejmuja, przyk ladowo, wirusa ospy, adenowirusa, alfawirusa, listeri e i monarfaga. Odpowiedni a sekwencj e DNA mo zna syntetyzowa c stosuj ac standardowe techniki syntezy DNA, takie jak enzymatyczna ligacja, jak opisana przez Roberts'a i in., Biochemistry 1985 24:5090- 5098, synteza chemiczna, polimeryzacja enzymatyczna in vitro, lub technologia PCR wykorzystuj aca przyk ladowo termostabiln a polimeraz e, albo przez kombinacj e tych technik. Polimeryzacj e enzymatyczn a DNA mo zna przeprowadzi c in vitro stosuj ac polimeraz e DNA, tak a jak polimeraza I DNA (fragment Klenowa) w odpowiednim buforze zawierajacym trifosforany nukle- ozydów dATP, dCTP, dGTP i dTTP, w temperaturze 10-37°C, zasadniczo w obj eto sci 50 µl alboPL 203 499 B1 5 mniejszej. Enzymatyczn a ligacj e fragmentów DNA mo zna przeprowadzi c stosuj ac ligaz e DNA, tak a jak ligaza DNA T4 w odpowiednim buforze, takim jak 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl 2 , 0,01 M ditio- treitol, 1 mM spermidyn e, 1 mM ATP i 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydl ecej, w temperaturze od 4°C do temperatury otoczenia, zasadniczo w obj eto sci 50 µl albo mniejszej. Chemiczn a syntez e polimeru albo fragmentów DNA mo zna przeprowadzi c konwencjonaln a reakcj a z zastosowaniem fosfotioestru, fosforynu albo amidynofosforynu, stosuj ac techniki na pod lo zu sta lym, tak a jak opisana w Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (red. Gassen i Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) albo w innych publikacjach naukowych, przyk ladowo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucl. Acids Res. 1982 10:6243; B.S. Sproat i W. Bannwarth, Tetrahedron Lett. 1983 24:5771; M.D. Matteuci i M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 1980 21:719; M.D. Matteuci i M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 1981 103:3185; S.P. Adams i in., J. Am. Chem. Soc. 1983 105:661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, i H. Koester, Nuci. Acids Res. 1984 12:4539, oraz H.W.D. Matthes i in., EMBO J. 1984 3:801. Otrzymywanie bia lka oczyszczanego lub wytwarzanego sposobem wed lug wynalazku mo zna prowadzi c konwencjonalnymi technikami rekombinacji, jak te opisane w Maniatis i in., Molecular Clo- ning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor 1982-1989. W szczególno sci, sposób otrzymywania takiego bia lka mo ze obejmowa c etapy: i) wytwarzania zdolnego do replikacji albo integracji wektora ekspresyjnego, zdolnego w komór- ce gospodarza do wyra zania polimeru DNA obejmuj acego sekwencj e nukleotydow a, która koduje bia lko albo jego immunogenn a pochodn a; ii) transformowania komórki gospodarza takim wektorem; iii) hodowania transformowanej komórki gospodarza w warunkach umo zliwiaj acych ekspresj e polimeru DNA z wytworzeniem bia lka; i iv) pozyskiwania bia lka. Okre slenie „transformowanie" w znaczeniu tu zastosowanym oznacza wprowadzanie obcego DNA do komórki gospodarza. Mo zna to osi agn ac, przyk ladowo, przez transformacj e, transfekcj e albo infekcj e odpowiednim wektorem plazmidowym albo wirusowym, stosuj ac np. konwencjonalne techniki, jak opisane w Genetic Engineering; red. S.M. Kingsman i A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publica- tions; Oxford, Anglia, 1988. Okre slenie „transformowany" albo „transformat" b edzie si e odnosi lo do powsta lej komórki gospodarza, zawieraj acej i wyra zaj acej obcy gen, b ed acy przedmiotem zaintereso- wania. Zdolne do replikacji wektory ekspresyjne mo zna wytworzy c przez ci ecie wektora zgodnego z komórk a gospodarza z uzyskaniem liniowego segmentu DNA z kompletnym replikonem i po laczenie takiego liniowego segmentu, w warunkach ligacji, z jednym albo wieloma cz asteczkami DNA, takimi jak polimer DNA koduj acy przedmiotowe bia lko albo jego pochodn a które wraz z liniowym segmentem koduj a po zadany produkt. Tak wi ec, polimer DNA mo zna tworzy c wcze sniej albo podczas konstruowania wektora, zale z- nie od potrzeb. Wybór wektora b edzie okre slony cz esciowo przez komórk e gospodarza, która mo ze by c proka- riotyczna albo eukariotyczna, ale korzystna jest komórk a E. coli lub CHO. Odpowiednie wektory obej- muja plazmidy, bakteriofagi, kosmidy i rekombinowane wirusy. Wytwarzanie zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego mo zna przeprowadzi c konwencjo- nalnie przy u zyciu odpowiednich enzymów do restrykcji, polimeryzacji i ligacji DNA, procedurami opi- sanymi przyk ladowo w Maniatis i in., cytowanym wy zej. Rekombinowan a komórk e gospodarza wytwarza si e przez transformowanie komórki gospoda- rza wektorem zdolnym do replikacji w warunkach transformuj acych. Odpowiednie warunki transformu- jace s a konwencjonalne i opisano je przyk ladowo w Maniatis i in., cytowanym wy zej albo w DNA Clo- ning, tom II, D.M. Glover (red.), IRL Press Ltd., 1985. Wybór warunków transformuj acych okre slony jest komórk a gospodarza. Tak wi ec, bakteryjnego gospodarza, takiego jak E. coli mo zna traktowa c roztworem CaCl 2 (Cohen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1973 69:2110) albo roztworem obejmuj acym mieszanin e RbCl, MnCl 2 , octanu potasu i glicerolu, a nast epnie kwasem 3-[N-morfolino]-propanosulfonowym, RbCl i glicerolem. Komórki ssaka w hodowli mo zna transformowa c przez precypitacj e wapniem wektora DNA do komórek. Hodowanie transformowanej komórki gospodarza w warunkach umo zliwiaj acych ekspresj e po- limeru DNA prowadzi si e w sposób konwencjonalny jak to opisano przyk ladowo w Maniatis i in., wy zejPL 203 499 B1 6 albo w „DNA Cloning", przytoczonym wy zej. Tak wi ec, korzystnie komórkom dostarcza si e po zywki i hoduje w temperaturze poni zej 50°C. Produkt pozyskuje si e sposobami konwencjonalnymi, zale znie od komórki gospodarza oraz lo- kalizacji wyra zanego produktu (wewn atrzkomórkowa lub produkt wydzielony do po zywki hodowlanej lub peryplazmy komórkowej). Tak wi ec, gdy komórk a gospodarza jest bakteria, taka jak E. coli, mo zna ja podda c lizie fizycznej, chemicznej albo enzymatycznej, za s produkt bia lkowy izolowa c z powsta lego lizatu. Gdy komórk a gospodarza jest komórka ssaka, produkt mo zna zasadniczo izolowa c z po zywki hodowlanej albo z ekstraktów bezkomórkowych. Konwencjonalne techniki izolowania bia lka obejmuj a wybiórcz a precypitacj e, chromatografi e adsorpcyjn a i chromatografi e powinowactwa, w tym kolumn e powinowactwa z przeciwcia lem monoklonalnym. Szczepionka otrzymana zgodnie ze sposobem wed lug wynalazku mo ze obejmowa c bia lko w postaci ciek lej albo w postaci liofilizowanej. Ogólnie oczekuje si e, ze dawka ludzka zawiera c b edzie od 1 do 1000 µg bia lka, korzystnie 30-300 µg. Ponadto w szczepionka taka obejmuje farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e. Szczepionka mo ze obejmowa c przynajmniej fuzj e lipoproteina D - MAGE-3. Taka szczepionka mo ze ewentualnie zawiera c jeden albo wiele innych antygenów zwi azanych z nowotworem. Przyk la- dowo, innych przedstawicieli nale zacych do rodzin MAGE i GAGE. Inne, odpowiednie antygeny zwi a- zane z nowotworem obejmuj a MAGE-1, GAGE-1 albo bia lka tyrozynazy. Wytwarzanie szczepionek opisane jest ogólnie w Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach (wyd. Powell i Newman), Pharmaceutical Biotechnology tom. 6, Plenum Press, 1995. Za- mykanie w liposomach opisa l Fullerton, patent USA nr 4,235,877. Szczepionki mog a równie z obejmowa c adiuwanty. Odpowiednie adiuwanty obejmuj a sole glinu, takie jak zel wodorotlenku glinu (alum) albo fosforan glinu, ale mog a by c równie z sol a wapnia, zelaza albo cynku, albo mog a by c nierozpuszczaln a zawiesin a acylowanej tyrozyny albo acylowanych cu- krów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, albo polifosfazenami. Do innych zna- nych adiuwantów naleza oligonukleotydy zawieraj ace CpG. Takie nukleotydy charakteryzuj a si e tym, ze dinukleotyd CpG jest niemetylowany. Takie oligonukleotydy s a dobrze znane i opisane, np. w WO 96/02555. Korzystne jest, aby kompozycja adiuwanta wywo lywa la wybiórczo reakcj e typu TH1. Odpo- wiednie uk lady adiuwantów obejmuj a, przyk ladowo, kombinacj e monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL) wraz z solami glinu. Oligonukleotydy CpG tak ze indukuj a odpowied z TH1. Wzmocniony uk lad obejmuje kombinacj e monofosforylolipidu A i pochodnej saponinowej, w szczególno sci kombinacj e QS21 i 3D-MPL, jak ujawniona w WO 94/00153, albo mniej reaktogenn a kompozycj e, w której QS21 jest wyt lumione cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie siln a formulacj e adiuwantow a, obejmuj ac a QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji ole- ju w wodzie opisano w WO 95/17210. Szczepionki zawieraj ace fuzj e lipoproteina D (albo jej pochodna) - MAGE-3, moga by c wspo- magane przez monofosforylolipid A lub jego pochodn a. Szczepionka mo ze równie z zawiera c saponi- n e, na przyk lad QS21 oraz emulsj e oleju w wodzie i tokoferol. Szczepionka mo ze by c formu lowana przez mieszanie bia lka z zaróbk a dopuszczaln a farmaceutycznie, tak a jak 3D-MPL. Wynalazek jest dalej opisany w odniesieniu do nast epuj acych Przyk ladów. P r z y k l a d I Wytwarzanie rekombinowanego szczepu E. coli wyra zaj acego bia lko fuzyjne lipoproteiny D-MAGE-3-His (LPD l/3-MAGE-3-His albo LpD MAGE-3-His) 1. Uk lad ekspresyjny E. coli Do wytworzenia lipoproteiny D klonowano DNA koduj acy bia lko D do wektora ekspresyjnego pMG81. Plazmid ten wykorzystuje sygna ly z DNA faga lambda do prowadzenia transkrypcji i translacji wprowadzonego obcego genu. Wektor zawiera promotor PL lambda PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystania (NutL i NutR), aby zniwelowa c polarnosc transkrypcyjn a gdy dostarczane jest bia lko N (Gross i in., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1015). Wektory zawieraj ace promotor PL, s a wprowadzane do lizogennego gospodarza E. coli w celu stabilizacji plazmidowego DNA. Lizogenne szczepy gospoda- rza zawieraj a zintegrowany z genomem niezdolny do replikacji DNA faga lambda (Shatzman i in., 1983; Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouya (wyd.) str. 1-14. Academic Press Press NY). DNA faga lambda kieruje syntez e bia lka represorowego cl, które wiaze si e z represorem OL na wektorze i zapobiega wi azaniu si e polimerazy RNA z promotorem PL, przez co zapobiega transkrypcjiPL 203 499 B1 7 wprowadzonego genu. Gen cl szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera mutacj e wra zliw a na temperatu- r e, tak ze transkrypcja kierowana przez PL mo ze by c regulowana zmian a temperatury, tj. wzrost tem- peratury w hodowli inaktywuje represor i zapocz atkowuje syntez e obcego genu. Ten uk lad ekspresyj- ny umo zliwia kontrolowan a syntez e obcych bia lek zw laszcza tych, które mog a by c toksyczne dla ko- mórki (Shimataka i Rosenberg, 1981, Nature 292:128). 2. Szczep E. coli AR58 Lizogenny szczep E. coli AR58 zastosowany do wytwarzania bia lka LPD-MAGE-3-His jest po- chodn a standardowego szczepu E. coli NIH K12 N99 (F-su- galK2, lacZ-, thr-). Zawiera on defektyw- nego lizogennego faga lambda (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). Fenotyp Kil- zapobiega wy laczeniu syntezy makrocz asteczek gospodarza. Mutacja cI857 zapewnia wra zliwe na temperatur e zmiany w represorze cl. Delecja DH1 usuwa prawy operon faga lambda i loci gospodarza bio, uvr3 i ch1A. Szczep AR58 wytworzono przez transdukcj e N99 fagiem lambda P, uprzednio hodowanym na po- chodnej SA500 (galE::TN10, 1 Kil-, cI857 DH1). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 selek- cjonowano na tetracyklinie, dzi eki obecno sci transpozonu TN10 koduj acego gen oporno sci na tetracy- klin e w s asiadujacym genie galE. N99 i SA500 s a szczepami E. coli K12 pochodz acymi z laboratorium Dr Martina Rosenberga z NIH. 3. Konstruowanie wektora przeznaczonego do wyra zania rekombinowanego bia lka LPD-MAGE- -3-His Przes lank a by lo wyra zenie MAGE-3 jako bia lka fuzyjnego z zastosowaniem N-ko ncowej jednej trzeciej lipidowanego bia lka D, jako sk ladnika fuzji, po laczonego z ko ncem N MAGE-3 oraz sekwencj a kilku reszt histydynowych (ogon His) na ko ncu C. Bia lko D jest lipoprotein a (42 kDa bia lkiem wiaz acym immunoglobuliny D, eksponowane na po- wierzchni Gram-ujemnej bakterii Haemophilus influenzae). Bia lko jest syntetyzowane jako prekursor o 18-aminokwasowej sekwencji sygna lowej, zawieraj acej sekwencj e zgodnosci z bakteryjnymi lipopro- teinami (WO 91/18926). Gdy sekwencja sygna lowa lipoproteiny przetwarzana jest podczas wydzielania, Cys (w pozycji 19 bia lka prekursorowego) staje si e reszt a ko nca aminowego i jest nast epnie modyfikowana przez kowa- lencyjne przy laczenie kwasów t luszczowych, zarówno wi azaniem estrowym jak i amidowym. Kwasy t luszczowe polaczone z reszt a ko nca aminowego dzia laj a jako zakotwiczenie w b lonie. Plazmid wyra zaj acy bia lko fuzyjne zosta l zaprojektowany w taki sposób, ze wyra za bia lko pre- kursorowe zawieraj ace 18-aminokwasow a sekwencj e sygna low a oraz pierwsze 109 reszt przetwarza- nego bia lka D, dwa niespokrewnione aminokwasy (Met i Asp), reszty aminokwasowe 2-314 MAGE-3, dwie reszty Gly dzia laj ace jako region zawiasowy w celu eksponowania dalszych siedmiu reszt His. Rekombinowany szczep wytwarza przetworzone, lipidowane bia lko fuzyjne o d lugo sci 432 ami- nokwasów z ogonem His, (patrz, Fig. 1), o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Id. Sekw. nr 1, oraz sekwencj e koduj ac a przedstawion a w Id. Sekw. nr 2. 4. Strategia klonowania zastosowana w celu wytworzenia bialka fuzyjnego LPD-MAGE-3-His (wektor pRIT14477) Zastosowano plazmid cDNA (od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute) zawieraj acy sekwencj e ko- duj ac a genu MAGE-3 (Gaugler B. i in., 1994) oraz wektor pRIT14586, zawieraj acy cz esc sekwencji koduj acej koniec N Lipo-D-1/3 (wytworzony jak opisano na Fig. 2). Strategia klonowania obejmowa la nast epuj ace etapy (Fig. 3). a) Amplifikacja PCR sekwencji przedstawionych w plazmidzie cDNA MAGE-3, z zastosowaniem oligonukleotydu sensownego 5'gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, oraz oligonu- kleotydu antysensownego 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tct caa); amplifikacja ta doprowadzi la do nast epuj acych modyfikacji na ko ncu N: zmiana pierwszych pi eciu kodonów w wykorzystaniu kodonów przez E. coli, zast apienie kodonu Pro przez kodon Asp w pozycji 1, wstawienie miejsca Ncol na ko ncu 5' i dodanie dwóch kodonów reszt Gly oraz 7 kodonów His na ko ncu 5', a nast epnie miejsca Xbal na ko ncu C. b) Klonowanie do wektora klonowania TA (Invitrogen) powy zszego amplifikowanego fragmentu i wytworzenie po sredniego wektora pRIT14647. c) Wyci ecie fragmentu Ncol Xbal z plazmidu pRIT14647 i klonowanie do wektora pRIT14596. d) Transformacja szczepu gospodarza AR58. e) Selekcja i charakterystyka transformantów szczepu E. coli zawieraj acych plazmid pRIT14477, wyra zaj acych bia lko fuzyjne LPD-MAGE-3-His.PL 203 499 B1 8 P r z y k l a d II Wytwarzanie antygenu LPD1/3-MAGE-3-His 1. Wzrost i indukcja szczepu bakteryjnego - ekspresja LPD1/3-MAGE-3-His Komórki AR58 transformowane plazmidem pRIT14477 hodowano w 2-litrowych butelkach, za- wierajacych po 400 ml po zywki LY12 z dodatkiem ekstraktu dro zd zowego (6,4 g/l) i siarczanu kana- mycyny (50 mg/l). Po inkubacji na stole wstrz asanym w 30°C przez 8±1 godzin, ma la próbk e pobrano z ka zdej butelki do badania mikroskopowego. Zawarto sc dwóch butelek pulowano w celu dostarczenia zaszczepu do fermentatora 20-litrowego. Zaszczep, (oko lo 800 ml) dodano do uprzednio wysterylizowanego 20-litrowego (obj eto sc ca l- kowita) fermentatora, zawieraj acego 7 litrów po zywki, z dodatkiem 50 mg/l siarczanu kanamycyny. pH doprowadzono i utrzymywano na poziomie 6,8 przez okresowe dodawanie NH 4 OH (25% obj.), za s temperatur e ustalono i utrzymywano na poziomie 30°C. Tempo napowietrzania ustalono i utrzymywa- no na poziomie 12 litrów powietrza na minut e, za s ci snienie rozpuszczonego tlenu utrzymywano na poziomie 50% wysycenia przez kontrolowanie zwrotne szybko sci mieszania. W fermentatorze utrzy- mywano nadci snienie na poziomie 500 g/cm 2 (0,5 bara). Hodowl e wsadow a przeprowadzono przez kontrolowane dodawanie roztworu zasilaj acego sta- nowi acego zród lo w egla. Roztwór zasilaj acy dodawano pocz atkowo przy szybko sci 0,04 ml/min. i zwi ekszano wyk ladniczo podczas pierwszych 42 godzin, aby utrzyma c tempo wzrostu 0,1 godz -1 . Po 42 godzinach, temperatur e fermentatora gwa ltownie podwy zszono do 39°C, za s szybko sc zasilania utrzymano na sta lym poziomie 0,005 ml/g DCW/min. podczas fazy indukcji przez dodatkowe 22-23 godziny, kiedy to wewn atrzkomórkowa ekspresja LPD-MAGE-3-His osi agn ela poziom maksy- malny. Porcje (15 ml) brzeczki pobierano w regularnych odst epach czasu podczas fazy wzro- stu/indukcji oraz na zako nczenie fermentacji, w celu monitorowania kinetyki wzrostu drobnoustrojów i ekspresji wewn atrzkomórkowej produktu oraz dodatkowo, w celu dostarczenia próbek do testów na identyfikacj e drobnoustrojów i czysto sc. Na zako nczenie fermentacji, g estosc optyczna hodowli wynosi la od 80 do 120 (co odpowiada lo g esto sci komórkowej 48 do 72 g DCW/1), za s ca lkowita obj etosc hodowli wynosi la oko lo 12 litrów. Hodowl e gwa ltownie sch lodzono do 6-10°C i oddzielono komórki ECK32 od brzeczki hodowlanej przez odwirowanie przy 5000 x g w 4°C przez 30 minut. Zat ezone komórki ECK32 szybko przecho- wywano w plastikowych workach i natychmiast zamra zano w -80°C. 2. Ekstrakcja bia lka Zamro zone, zag eszczone komórki ECK2 rozmra zano w 4°C, po czym zawieszano w buforze do niszczenia komórek do g estosci ko ncowej 60 (co odpowiada lo g esto sci komórek równej oko lo 36 g DCW/1). Komórki zniszczono przez dwukrotne przepuszczenie przez wysoko-ci snieniowy homogenizator (1000 bar). Zawiesin e zniszczonych komórek odwirowano (x 10000 g w 4°C przez 30 minut), za s frak- cje osadu p lukano dwukrotnie Triton X100 (1% wag./obj.) + EDTA (1 mM), a nast epnie roztworem soli, buforowanym fosforanem (PBS) + Tween 20 (0,1% wag./obj.), a na koniec PBS. Pomi edzy etapami p lukania, zawiesin e wirowano x10000 g przez 30 minut w 4°C, nads acz usuwano odzyskuj ac frakcj e osadu. P r z y k l a d III Charakteryzacja bia lka lipo D - MAGE-3 1. Oczyszczanie LPD-MAGE-3-His oczyszczono z homogenatu komórkowego stosuj ac opisane ni zej etapy: a) rozpuszczenie p lukanej frakcji osadu po niszczeniu komórek; b) chemiczna redukcja wewn atrz- i mi edzybia lkowych wi aza n disiarczkowych, a nast epnie blo- kowanie grup tiolowych, aby zapobiec utleniaj acemu ich ponownemu laczeniu si e; c) mikrofiltrowanie mieszaniny reakcyjnej w celu usuni ecia drobin i redukcji endotoksyn; d) wychwyt i pocz atkowe oczyszczanie LPD-MAGE-3-His przez wykorzystanie oddzia lywania powinowactwa pomi edzy ogonem polihistydynowym i nasycon a cynkiem chelatuj ac a Sepharose; e) usuni ecie zanieczyszczaj acych bia lek przez chromatografi e anionowymienn a. Oczyszczone LPD-MAGE-3-His poddano licznym etapom oczyszczaj acym: f) wymiana bufora/usuni ecie mocznika przez chromatografi e wykluczania zale znego od wielko- sci cz asteczek stosuj ac Superdex 75; g) filtracj e sród-procesow a;PL 203 499 B1 9 h) wymian e bufora/odsalanie przez chromatografi e wykluczania zale znego od wielko sci cz aste- czek z u zyciem Sephadex G25. Ka zdy z etapów jest opisany dok ladnie poni zej. 1.1) Rozpuszczanie osadu homogenatu komórkowego Frakcj e osadu z ko ncowego etapu p lukania (jak opisano wy zej) ponownie rozpuszczano przez noc w 800 ml roztworu chlorowodorku guanidyny (6M) i fosforanu sodu (0,1 M, pH 7,0) w 4°C. 1.2) Redukcja i karboksymetylacja Rozpuszczony materia l (blado- zó lta, m etna zawiesina) przedmuchano argonem w celu usuni e- cia pozosta lo sci tlenu i dodano roztwór podstawowy 2-merkaptoetanolu (14 M) do stezenia ko ncowe- go 4,3 M (co odpowiada lo 0,44 ml 2-merkaptoetanolu na 1 ml roztworu). Powsta ly roztwór podzielono i przeniesiono do dwóch butelek, które podgrzano do 95°C w la zni wodnej. Po 15 minutach w 95°C, butelki wyj eto z la zni i pozostawiono do schodzenia, po czym zawar- tosc pulowano w zlewce przykrytej foli a (5 l) umieszczono na lodzie i energicznie mieszaj ac dodano jodoacetamid w postaci sta lej uzyskuj ac st ezenie ko ncowe 6M (co odpowiada lo 1,11 g jodoacetamidu na ml roztworu). Mieszanin e trzymano na lodzie w ciemno sci przez godzin e, aby zapewni c ca lkowite rozpuszczenie jodoacetamidu, po czym zneutralizowano (przy energicznym mieszaniu i ci aglym moni- torowaniu pH) przez dodanie oko lo 1 litra wodorotlenku sodu (5 M) otrzymuj ac ko ncowe pH 7,5-7,8. Powstala mieszanin e utrzymywano na lodzie w ciemno sci przez dalsze 30 minut, po czym pH ponownie doprowadzono do warto sci 7,5-7,9. 1.3) Mikrofiltracja Mieszanin e mikrofiltrowano w jednostce Amicon Proflux M12 wyposa zon a we wk lad Minikross o pustych wewn atrz kapilarach (nr ref. M22M-600-01; pole powierzchni 5600 cm 2 , 0,2 µm). Permeat zachowano do dalszych etapów oczyszczania. 1.4) Chromatografia chelatowania metalu (Zn 2+ ) (IMAC) Chromatografi e chelatowania metalu przeprowadzono przy u zyciu chelatuj acej Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-0575-01) wype lniaj acej kolumn e BPG 100/500 (Pharmacia Bio- technology, nr kat. 18-1103-01). Wymiary z lo za: srednica 10 cm, pole powierzchni przekroju 79 cm 2 , wysoko sc z lo za 19 cm; obj eto sc z lo za 1500 ml. Pust a kolumn e czyszczono wodorotlenkiem sodu (0,5 M), a nast epnie p lukano wod a. Pod loze (dostarczone w 20% obj. etanolu) p lukano oczyszczon a wod a (8 litrów) na lejku Buch- nera (pod pró zni a) i nasycono cynkiem przez przepuszczenie przynajmniej 15 litrów roztworu ZnCl 2 (0,1 M). Nadmiar cynku usuni eto przez p lukanie pod loza 10 litrami oczyszczonej wody, dopóki pH wyp lywaj acego roztworu nie osi agn elo pH roztworu ZnCl 2 (pH 5,0). Nast epnie pod lo ze równowa zono 4 litrami roztworu zawieraj acego chlorowodorek guanidyny (6 M) i fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0). Permeat z mikrofiltracji zawieraj acy LPD-MAGE-3-His mieszano z pod lo zem (wi azanie wsado- we) przez za ladowaniem i upakowaniem kolumny BPG roztworem chlorowodorku guanidyny (6 M) i fosforanu sodu (0,1 M, pH 7,0). Nast epne etapy chromatografii chelatowania metalu przeprowadzono przy szybko sci przep lywu eluentu 60 ml/min. Kolumn e p lukano najpierw roztworem zawieraj acym chlorowodorek guanidyny (6 M) i fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0), nast epnie roztworem zawieraj acym mocznik (6 M) i fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0) dopóki eluent z kolumny nie wykaza l zerowej absorbancji OD 280 nm (t lo). Cz esciowo oczyszczon a frakcj e bia lka LPD-MAGE-3-His eluowano 2 obj eto sciami kolumny roz- tworu zawieraj acego mocznik (6 M), fosforan sodu (0,1 M, pH 7,0) i imidazol (0,5 M). Przewodnictwo tej frakcji wynosi lo oko lo 16 mS/cm. 1.5) Chromatografia anionowymienna Przed przeprowadzeniem chromatografii anionowymiennej, przewodnictwo frakcji bia lka LPD- MAGE-3-His cz esciowo oczyszczonego zmniejszono do oko lo 4 mS/cm przez rozcie nczenie roztwo- rem zawieraj acym mocznik (6 M) i Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). Chromatografi e anionowymienn a przeprowadzono przy u zyciu Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-0510-01) wype lniaj acej kolumn e BPG 200/500 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 18-1103-11). Wymiary z lo za: srednica 10 cm, pole powierzchni przekroju 314 cm 2 , wysokosc z lo za 9 cm, objetosc z lo za 2900 ml. Kolumn e wype lniono (w 20% obj. etanolu) i p lukano 9 litrami wody oczyszczonej przy szybko sci przep lywu eluentu 70 ml/min. Wype lnion a kolumn e oczyszczono 3 litrami wodorotlenku sodu (0,5 M), przep lukano 30 litrami oczyszczonej wody, a nast epnie zrównowa zono 6 litrami roztworu zawieraj ace- go mocznik (6 M) i Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). Rozcienczone, na wpó l oczyszczone LPD-MAGE-3-HisPL 203 499 B1 10 wprowadzono do kolumny i p lukano 9 litrami roztworu zawieraj acego mocznik (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) i Tween (0,1%) dopóki absorbancja (280 nm) eluentu nie osi agn ela warto sci zerowej. Dalszy etap p lukania przeprowadzono przy u zyciu 6 litrów roztworu zawieraj acego mocznik (6 M) i Tris-HCl (20 mM pH 8,0). Oczyszczone LPD-MAGE-3-His eluowano z kolumny roztworem zawieraj acym mocznik (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) i NaCl (0,25 M). 1.6) Chromatografia wykluczania zale znego od wielko sci Usuwanie mocznika z oczyszczonego LPD-MAGE-3-His oraz wymian e bufora przeprowadzono przy u zyciu chromatografii wykluczania zale znego od wielko sci. Przeprowadzono j a z zastosowaniem Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-1044-01) wype lniaj acej kolumn e XK 50/100 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 18-8753-01). Wymiary z lo za: srednica 5 cm, pole powierzchni prze- kroju 19,6 cm 2 , wysoko sc z loza 90 cm, obj etosc z lo za 1800 ml. Kolumn e wype lniono w etanolu (20%) i p lukano 5 litrami wody oczyszczonej przy szybko sci przep lywu eluentu 20 ml/min. Kolumn e oczyszczono 2 litrami wodorotlenku sodu (0,5 M), p lukano 5 litrami oczyszczonej wody, a nast epnie równowa zono 5 litrami roztworu soli buforowanego fosfora- nem z dodatkiem Tween 80 (0,1% obj.). Oczyszczon a frakcj e LPD-MAGE-3-His (maksimum 500 ml/cykl odsalania) wprowadzono do ko- lumny przy szybko sci przep lywu eluentu 20 ml/min. Odsalane LPD-MAGE-3-His eluowano z kolumny 3 litrami PBS zawieraj acego Tween 80 (0,1% obj.). Frakcj e zawieraj ac a LPD-MAGE-3-His eluowano przy obj eto sci swobodnej kolumny. 1.7) Filtracja wewn atrzprocesowa Parti e LPD-MAGE-3-His z chromatografii wykluczania zale znego od wielko sci filtrowano przez membran e 0,22 µm w komorze przep lywu laminarnego (klasa 10000). Filtrowan a parti e zamro zono w -80°C i przechowywano do etapu odsalania. 1.8) Chromatografia odsalaj aca Poniewa z osmolarno sc ko ncowej partii nie powinna przekracza c 400 mOsM, konieczny by l ko- lejny etap wymiany bufora w celu zmniejszenia stezenia soli. Przeprowadzono to przez etap chroma- tografii odsalaj acej z u zyciem Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 17-0033-02) wype l- niaj acej kolumn e BPG 100/950 (Pharmacia Biotechnology, nr kat. 18-1103-03). Wymiary z lo za: sred- nica 10 cm, pole powierzchni przekroju 78,6 cm 2 , wysoko sc z lo za 85 cm, obj eto sc 6500 ml. Sephadex G25 uwodniono 7 litrami oczyszczonej wody i pozostawiono do sp ecznienia przez noc w 4°C. Zel pakowano do kolumny w czystej wodzie przy szybko sci przep lywu eluentu 100 ml/min. Kolumn e oczyszczono 6 litrami wodorotlenku sodu (0,5 M), nast epnie równowa zono 10 litrami roztworu zawieraj acego fosforan sodu (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) i Tween 80 (0,1% obj.). Oczyszczon a frakcj e LPD-MAGE-3-His (maksimum 1500 ml/cykl odsalania) wprowadzono do kolumny przy szybko sci przep lywu eluentu 100 ml/min. Odsolona frakcj e LPD-MAGE-3-His eluowano przy obj eto sci swobodnej kolumny, sterylizowano przez filtrowanie na membranie 0,22 µm i przecho- wywano w -80°C. Ko ncowa partia bia lka by la rozmra zana w 4°C, a nast epnie porcjowana do fiolek i liofilizowana w laktozie (3,2%) jako zaróbce. 2. Analiza na zelach poliakryloamidowych z SDS barwionych Coomassie Oczyszczony antygen LPD-MAGE-3-His analizowano przez SDS-PAGE na 12,5% zelu akrylo- amidowym w warunkach redukuj acych. Ladunek bia lka do barwienia b lekitem Coomassie wynosi l 50 µg, a do barwienia azotanem sre- bra 5 µg. Analizowano serie kliniczn a 96K19 i informacyjn a 96J22. Otrzymano pojedynczy g lówny prazek odpowiadaj acy ciezarowi cz asteczkowemu oko lo 60 kDa. Obserwowano równie z dwa dodat- kowe mniejsze pr azki wielko sci oko lo 45 kDa i 35 kDa. 3. Analiza metod a Western blot Peptydy wykazane podczas analizy SDS-PAGE bia lka LPD-MAGE-3-His zidentyfikowano przez badanie Western blot z u zyciem mysich przeciwcia l monoklonalnych. Przeciwcia la te opracowano na w lasny u zytek stosuj ac oczyszczone preparaty bia lka MAGE-3His (bia lko to nie zawiera lo LPD). Dwa preparaty przeciwcia l monoklonalnych (Mab 22 i Mab 54) wybrano na podstawie ich przy- datno sci do analizy Western blot i zastosowano w te scie potwierdzenia to zsamo sci dla poszczegól- nych partii. Figura 4 pokazuje wzorzec pr azków otrzymany dla partii 96K19 i 96J22 po znakowaniu Mab 32 i 54. 600 ng bia lka rozdzielono na 12,5% SDS-PAGE, przeniesiono na membran e nylonow a,PL 203 499 B1 11 poddano reakcji z Mab 32 i 54 (60 µg/ml) i obrazowano przeciwcia lami anty-mysimi sprz egni etymi z peroksydaz a. Peptyd 60 kDa i 30 kDa z SDS-PAGE jest wykryty przez obydwa Mab. P r z y k l a d IV 1. Wytwarzanie szczepionki z u zyciem bia lka LPD-MAGE-3-His Zastosowan a w do swiadczeniu szczepionk e wytworzono z rekombinowanego DNA, koduj acego lipoprotein e D 1/3-MAGE-3-His, wyra zonego w E. coli szczepu AR58, w postaci adiuwantowanej albo nie. Jako adiuwant zastosowano w formulacji mieszanin e 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL) i QS21 w emulsji wodno-olejowej. Uk lad adiuwanta SBAS2 opisano uprzednio w WO 95/17210. 3D-MPL: jest immunostymulatorem pochodz acym z lipopolisacharydu (LPS) Gram-ujemnej bak- terii Salmonella minnesota. MPL deacylowano i nie posiada on grupy fosforanowej przy grupie lipidu A. To traktowanie chemiczne dramatycznie zmniejsza toksyczno sc zachowuj ac w la sciwo sci immuno- stymuluj ace (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry wytwarza i sprzedaje MPL dla SB-Biologicals. Do- swiadczenia przeprowadzone przez SmithKline Beecham Biologicals wykaza ly, ze 3D-MPL w po la- czeniu z ró znymi no snikami silnie wzmacnia odporno sc humoraln a oraz komórkow a typu TH1. QS21: jest naturaln a cz asteczk a saponiny ekstrahowan a z kory po ludniowoameryka nskiego drzewa Quillaja samonaria Molina. Technika oczyszczania opracowana do rozdzielania poszczegól- nych saponin z surowych ekstraktów kory, umo zliwi la identyfikacj e saponiny, QS21, która jest glikozy- dem triterpenowym, wykazuj acym silniejsz a aktywno sc adiuwantow a i ni zsz a toksyczno sc w porów- naniu ze zwi azkiem wyj sciowym. Wykazano, ze QS21 aktywuje CTL w kontek scie MHC klasy I wobec kilku podjednostkowych Ag, jak równie z pobudza proliferacj e limfocytów swoistych wobec Ag (Kensil, 1992). Aquila (oficjalnie, Cambridge Biotech Corporation) wytwarza i dostarcza QS21 dla SB- Biologicals. Do swiadczenia przeprowadzone przez SmithKline Beecham Biologicals wykaza ly wyra zny efekt synergiczny kombinacji MPL i QS21 w indukowaniu reakcji odporno sciowych typu humoralnego i ko- mórkowego typu TH1. Emulsja wodno/olejowa obejmuje faz e organiczn a wytworzon a z 2 olejów (tokoferol i skwalen) i faz e wodn a PBS zawieraj ac a Tween 80 jako emulgator. Emulsja obejmowa la 5%, skwalenu, 5% tokoferolu, 0,4% Tween 80, za s srednia wielko sc cz astek wynosi la 180 nm i znana jest jako SB62 (patrz, WO 95/17210). Do swiadczenia przeprowadzone w SmithKline Beecham Biologicals wykaza ly, ze dodanie tej emulsji wodno-olejowej do 3D-MPL/QS21 (SBAS2) dalej wzmacnia w la sciwo sci immunostymuluj ace wobec ró znych antygenów podjednostkowych. 2. Wytwarzanie emulsji SB62 (2-krotnie stezonej) Tween 80 rozpuszczono w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) otrzymuj ac 2% roz- twór w PBS. Aby dostarczy c 100 ml dwukrotnie st ezonego koncentratu, 5 g DL-alfa-tokoferolu i 5 ml skwalenu wirowano w celu dok ladnego wymieszania. 90 ml roztworu PBS/Tween dodano i dok ladnie wymieszano. Powstala emulsj e przepuszczono nast epnie przez strzykawk e, a nast epnie mikrofluidy- zowano stosuj ac urz adzenie do mikrofluidyzacji M110S. Powsta le krople oleju mia ly wielko sc oko lo 180 nm. 3. Wytwarzanie formulacji lipoproteiny D1/3 - MAGE-3 - His QS21/3D MPL w emulsji olej w wo- dzie (SBAS2) Adiuwant formu lowano przez polaczenie MPL i QS21 w emulsji woda/olej. Preparat ten dostar- czono w fiolkach 0,7 ml w celu domieszania do liofilizowanego antygenu (fiolki zawiera ly 30 do 300 µg antygenu). Kompozycja rozcie nczalnika adiuwantowego do liofilizowanej szczepionki ma nast epuj acy sk lad: Sk ladnik Ilo sc (na dawk e) 1 2 Adiuwant Emulsja SB62 250 µl skwalen 10,7 mg DL- a-tokoferol 11,9 mg Tween 80 4,8 mgPL 203 499 B1 12 cd. tabeli 1 2 Monofosforylo-lipid A 100 µg QS21 100 µg Konserwant Thiomersal 25 µg Bufor Woda do wstrzykniec q.s. do 0,5 ml dizasadowy fosforan sodu 575 µg jednozasadowy fosforan potasu 100 µg chlorek potasu 100 µg chlorek sodu 4,0 mg Szczepionk e ko ncow a otrzymano przez rekonstytucj e liofilizowanego preparatu LPD-MAGE-3- -His z adiuwantem albo samym PBS. Kontrole adiuwanta bez antygenu wytworzono przez zast apienie bia lka przez PBS. 4. Antygen szczepionki: bia lko fuzyjne lipoproteiny D1/3 - MAGE-3 - His Lipoproteina D jest lipoprotein a eksponowan a na powierzchni Gram-ujemnej bakterii Haemophi- lus influenzae. W laczenie pierwszych 109 reszt przetworzonego bia lka D jako sk ladnika fuzji przeprowadzono w celu dostarczenia antygenu szczepionki z epitopami limfocytów T. Oprócz domeny LPD, bia lko za- wiera lo dwa nie spokrewnione aminokwasy (Met i Asp), reszty aminokwasowe 2 do 314 MAGE-3, dwie reszty Gly dzia laj ace jako region zawiasowy do eksponowania ko ncowych siedmiu reszt His. P r z y k l a d V 1. Immunogenno sc LPD-MAGE-3-His u myszy i ma lp W celu zbadania antygenowo sci i immunogenno sci ludzkiego bia lka MAGE-3 potencjaln a szczepionk e wstrzykni eto dwóm ró znym szczepom myszy (C57BL/6 i Balb/C), ró zni acym si e pod lo- zem genetycznym i allelami MHC. Dla obu szczepów potencjalne motywy peptydowe MHC klasy I i MHC klasy II zosta ly przewidziane teoretycznie dla cz esci MAGE bia lka fuzyjnego LPD-MAGE-3-His. a) Protokó l immunizacji: 5 myszom ka zdego ze szczepów wstrzykni eto dwukrotnie w odst epie 2 tygodni w poduszeczk e lapy po 5 µg LPD-MAGE-3-His formu lowanego z albo w nieobecno sci SBAS2 w st ezeniu 1/10 st eze- nia stosowanego u ludzi. b) Test proliferacji: Limfocyty wyizolowano przez rozgniecenie sledzion albo w ez lów ch lonnych pachwinowych my- szy w 2 tygodnie po drugim wstrzykni eciu. 2x10 5 komórek umieszczono w potrójnym powtórzeniu w p lytkach 96-studzienkowych i restymulowano in vitro przez 72 godziny ró znymi st ezeniami (1 - 0,1 µg/ml) His-MAGE-3 jako takiego albo op laszczonego na lateksowych mikropere lkach. Zwi ekszon a aktywnosc limfoproliferacyjn a swoist a wobec MAGE-3 obserwowano zarówno w komórkach sledziony (patrz, Fig. 5 i 7), jak i w ez lów ch lonnych (patrz, Fig. 6 i 8) myszy C57BL/6 albo Balb/C, którym wstrzykni eto bia lko LPD-MAGE-3-His, w porównaniu z reakcj a limfoproliferacyjn a myszy, które otrzyma ly sam a formulacj e SBAS2 albo PBS. Ponadto, uzyskano istotnie wy zsz a odpowied z proliferacyjn a przy u zyciu limfocytów od myszy immunizowanych LPD-MAGE-3-His w adiuwancie SBAS2 (patrz, Fig. 6 i 8). c) Wnioski: LPD-MAGE-3-His jest immunogenne dla myszy, za s t e immunogenno sc mo zna zwi ekszy c przez zastosowanie formulacji adiuwanta SBAS2. 2. Reakcja przeciwcia l a) Protokó l immunizacji: Myszy Balb/c albo C57BL/6 immunizowano przez dwukrotne wstrzykni ecie w poduszk e lapy w odst epach 2-tygodniowych PBS albo SBAS2 albo 5 µg LPD-MAGE-3-His albo 5 µg LPD-MAGE-3- -His z SBAS2. W grupach kontrolnych i testowanych stosowano 3 i 5 zwierz at odpowiednio. b) Po sredni test ELISA:PL 203 499 B1 13 Dwa tygodnie po drugim wstrzykni eciu, poszczególne surowice pobierano i poddawano po sred- niemu testowi ELISA. 2 µg/ml oczyszczonego His MAGE-3 zastosowano jako antygen do op laszczania studzienek. Po wysyceniu przez 1 godzin e w 37°C PBS + 1% surowica z nowonarodzonych ciel at, surowice kolej- no rozcie nczano (rozpoczynaj ac od 1/1000) w buforze wysycaj acymi inkubowano przez noc w 4°C albo 90 minut w 37°C. Po p lukaniu w PBS/Tween 20, 0,1%, jako drugie przeciwcia lo dodawano anty- mysie biotynylowane kozie ca lkowite IgG (1/1000) albo anty-mysie kozie surowice IgG1, IgG2a, IgG2b (1/5000). Po 90 minutach inkubacji w 37°C, dodano streptawidyn e sprz egni et a z peroksydaz a, za s jako substrat zastosowano TMB (nadtlenek tetra-metylo-benzydyny). Po 10 minutach reakcj e zablo- kowano przez dodanie H 2 SO 4 , 0,5 M i oznaczono O.D. c) Wyniki: Figura 9 przedstawia porównanie pomi edzy ró znymi grupami myszy (N=5/grup e) mian surowic w srednim punkcie srodkowym, które stanowi a srednie rozcie nczenie konieczne do osi agni ecia punktu srodkowego na krzywej. Wyniki te pokazuj a, ze u obu badanych szczepów myszy wykszta lcana jest s laba reakcja prze- ciwcia l po dwóch wstrzykni eciach samego LPD-MAGE-3-His, ale znacznie silniejsze reakcje przeciw- cia l przeciwko MAGE-3 tworzone s a po wstrzykni eciu LPD-MAGE-3-His w obecno sci SBAS2. Tak wi ec, tylko 2 wstrzykni ecia LPD-MAGE-3-His + SBAS2 w odst epach 2 tygodni wystarczaj a do wytwo- rzenia obserwowanych silnych reakcji Ab. Lepsz a reakcj e przeciwcia l obserwowano u myszy Balb/c w porównaniu z reakcj a uzyskan a u myszy C57BL/6, co mo zna wyt lumaczy c ró znicami w haplotypach albo w pod lo zu genetycznym pomi edzy tymi szczepami, mimo ze miano przeciwcia l uzyskane u myszy C57BL/6 jest równie z wy z- sze po wstrzykni eciu LPD-MAGE-3-His + SBAS2 ni z po podaniu samego LPD-MAGE-3-His. Odpowiedzi swoiste wobec MAGE-3 podklas Ig po szczepieniu w ró znych grupach myszy przedstawiono na Fig. 10 i 11, które daj a porównanie srednich punktów srodkowych rozcie ncze n surowic. Ani IgA, ani IgM nie zosta ly wykryte w zadnej próbce surowic, nawet w próbkach od myszy szczepionych LPD-MAGE-3-His w adiuwancie SBAS2. Przeciwnie, poziom ca lkowity IgG by l nieco wy zszy w surowicach myszy szczepionych samym LPD-MAGE-3-His i istotnie wzrasta l w surowicach zwierz at, którym podawano LPD-MAGE-3-His w SBAS2. Analiza st eze n ró znych podklas IgG wykazuje, ze mieszana reakcja Ab zosta la wywo lana u myszy, poniewa z poziomy wszystkich badanych podklas IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b) by ly wy zsze u myszy szczepionych antygenem adiuwantowanym, ni z samym adiuwantem. Istota mieszanej reakcji Ab po szczepieniu LipoD-MAGE-3 w obecno sci SBAS2 zale zy jednak- ze od szczepu myszy, poniewa z IgG1 i IG2b wyst epowa ly g lównie w surowicach myszy Balb/c i C57B1/6, odpowiednio. 3. Immunogenno sc lipoproteiny D 1/3 MAGE-3-His + adiuwant SBAS2 u ma lp rezus Wybrano trzy grupy po piec ma lp rezus (Macaca Mulatta). Jako kontrol e pozytywn a zastosowa- no RTS,S i gp120. Grupy: Grupa 1 prawa noga: RTS, S/SBAS2 lewa noga: gp120/SBAS2 Grupa 2 prawa noga: RTS, S/SB26T lewa noga: gp120/SB26T Grupa 3 prawa noga: lipoD1/3 MAGE 3 His/SBAS2 Zwierz eta otrzyma ly szczepionk e w dniu 0, a nast epnie dawki przypominaj ace w dniu 28 i 84, po czym zosta ly skrwawione w celu okre slenia odpowiedzi przeciwcia l przeciwko MAGE 3 i bia lku D. Szczepionki podawano domi esniowo jako wstrzykni ecie w bolusie (0,5 ml) w tyln a czes c nogi prawej. Ma le próbki krwi pobierano co 14 dni. Pobierane z zy ly udowej próbki krwi po 3 ml bez dodatku heparyny, pozostawiano do skrzepni ecia przez przynajmniej godzin e, a nast epnie wirowano je w tem- peraturze pokojowej przez 10 minut przy 2500 rpm. Surowic e pobierano, zamra zano w -20°C i przesy lano do oznaczenia poziomu przeciwcia l w swoistym te scie ELISA. 96-studzienkowe p lytki (maxisorb Nunc) op laszczano 5 µg His MAGE-3 albo bialkiem D przez noc w 4°C. Po godzinie wysycania w 37°C PBS z NCS 1%, kolejne rozcie nczenia surowicy króliczej dodawano na 1,5 godziny w 37°C (rozpoczynaj ac od rozcie nczenia 1/10), po 3 p lukaniach w PBSPL 203 499 B1 14 Tween, dodawano królicz a biotynylowan a surowic e (Amersham RPN 1004 partia 88) (1/5000). P lytki p lukano i dodawano kompleks peroksydazy ze streptawidyn a (1/5000) na 30 minut w 37°C. Po p luka- niu, dodano 50 µl TMB (BioRad) na 7 minut i przerwano reakcj e przez dodanie 0,2 M H 2 SO 4 i odczy- tano OD przy 450 nm. Rozcienczenia punktu srodkowego wyliczono z zastosowaniem oprogramowa- nia SoftmaxPro. Reakcja przeciwcia l Ma le próbki krwi pobierano co 14 dni w celu monitorowania z zastosowaniem ELISA kinetyki reakcji przeciwcia l wobec MAGE 3. Wyniki wskazuj a, ze po jednym wstrzykni eciu LPD 1/3 MAGE 3 His + SBAS2, ca lkowite miano Ig swoistych wobec MAGE 3 by lo niskie. Wyra zne wzmocnienie ob- serwowano u 3 z 5 zwierz at po drugim i trzecim wstrzykni eciu LipoD1/3 MAGE 3 + adiuwant u tych samych ma lp. Osobniki s labo reaguj ace pozostawa ly negatywne nawet po 3 wstrzykni eciach. 28 dni po II i po III, miana przeciwcia l wraca ly do poziomów podstawowych. Podklas e tych przeciwcia l ozna- czono jako g lównie IgG, nie za s IgM. Prze laczenie na IgG sugeruje, ze wywo lano reakcj e limfocytów T pomocniczych. Swoista reakcja przeciwcia l przeciwko bia lku D, jakkolwiek s laba, jest zgodna z reak- cja przeciwcia l na MAGE 3. P r z y k l a d VI 1. LPD-MAGE 1 His W analogiczny sposób wytworzono LPD-MAGE 1-His. Sekwencje aminokwasowe i DNA przed- stawiono w Id. Sekw. nr 3 i 4. Powsta le bia lko oczyszczono w sposób analogiczny do LPD-MAGE-3- -His. Pokrótce, hodowl e komórkow a homogenizowano i traktowano 4M chlorowodorkiem guanidyny i 0,5 M beta-merkaptoetanolem w obecno sci 0,5% detergentu Empigen. Produkt filtrowano, za s per- meat traktowano 0,6 M jodoacetamidem. Frakcje karboksyamidowane poddano chromatografii IMAC (chelat cynku - Sepharose FF). Kolumn e najpierw zrównowa zono i przep lukano roztworem zawieraj a- cym 4M guanidyn e, HCl i fosforan sodu (20 mM, pH 7,5), a nast epnie p lukano roztworem zawieraj a- cym 4M mocznik w fosforanie sodu (20 mM, pH 7,5) i 0,5% Empigen. Bia lko eluowano w tym samym buforze, ale ze wzrastaj acym st ezeniem imidazolu (20 mM, 400 mM i 500 mM). Eluat rozcie nczano 4M mocznikiem. Kolumn e Sepharose Q równowa zono i p lukano 4M mocz- nikiem w 20 mM fosforanie sodu (pH 7,5) i 0,5% Empigen. Drugie p lukanie przeprowadzono w tym samym buforze, ale bez detergentu. Bia lko eluowano w tym samym buforze, ale z rosn acymi st eze- niami imidazolu (150 mM, 400 mM, 1M). Eluat poddano ultrafiltracji. P r z y k l a d VII Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT14426 i transformacja szczepu gospodarza AR58 w celu wytwarzania NS1-MAGE 3-His Projektowanie bia lka Projekt bia lka fuzyjnego NS1-MAGE-3-His, wyra zanego w E. coli przedstawiono na Fig. 12. Struktura pierwszorz edowa powsta lego bia lka ma sekwencj e przedstawion a w Id. Sekw. nr 5. Sekwencj e koduj ac a (Id. Sekw. nr 6) odpowiadaj ac a powy zszemu bia lku umieszczono pod kon- trol a promotora ?pL w plazmidzie ekspresyjnym E. coli. Strategia klonowania w celu wytworzenia bia l- ka fuzyjnego NS1-MAGE-3-His Jako materia l wyj sciowy zastosowano plazmid cDNA od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute, za- wierajacy sekwencj e koduj ac a genu MAGE-3 oraz wektor PMG81, zawieraj acy region koduj acy 81 aminokwasów NS1 (bia lko nie-strukturalne) wirusa grypy. Strategia klonowania przedstawiona na Fig. 3 obejmowa la nast epuj ace etapy: a) Amplifikacja PCR sekwencji prezentowanych w plazmidzie cDNA MAGE-3, przy u zyciu oli- gonukleotydu sensownego 5'gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, oraz oligonukle- otydu antysensownego 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tct caa; Amplifikacja ta doprowadzi la do nast epuj acych modyfikacji na ko ncu N: zmiana pierwszych pi e- ciu kodonów w wykorzystaniu kodonów przez E. coli, zast apienie kodonu Pro przez kodon Asp w po- zycji 1, wstawienie miejsca Ncol na ko ncu 5' i dodanie dwóch kodonów reszt Gly oraz 7 kodonów His na ko ncu 5', a nast epnie wstawienie miejsca Xbal na ko ncu C. b) Klonowanie do wektora klonowania TA (Invitrogen) powy zszego amplifikowanego fragmentu i wytworzenie po sredniego wektora pRIT14647. c) Wyci ecie fragmentu Ncol Xbal z plazmidu pRIT14647 i klonowanie do wektora pRIT PMG81. d) Transformacja szczepu gospodarza AR58. e) Selekcja i charakterystyka transformantów szczepu E. coli zawieraj acych plazmid pRIT14426 (Fig. 14), wyra zaj acych bia lko fuzyjne NS1-MAGE-3-His.PL 203 499 B1 15 Charakterystyka rekombinowanego NS1-MAGE-3-His (pRIT14426) Bakterie hodowano na pod lozu LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 0,3 (620 nm) przeprowadzono indukcj e ciep lem przez podwy zszenie temperatury do 42°C. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono w PBS i poddano lizie (przez rozpad) przez trzykrotne przepuszczenie przez pras e French. Po odwirowaniu (60 minut w 100000 g) osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt zbadano przez SDS-PAGE. Bia lka uwidoczniono w zelach barwionych Coomassie B1, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% bia lka ca lkowitego E. coli. Bia lko rekom- binowane by lo widoczne w postaci pojedynczego pr azka o MW 44,9 kDa. Bia lko fuzyjne zidentyfiko- wano przez analize Western blot stosuj ac przeciwcia la monoklonalne przeciwko NS-1. P r z y k l a d VIII Oczyszczanie NS1-MAGE-3-His (E. coli) do immunizowania królików/myszy Schemat oczyszczania W celu oczyszczenia antygenu zastosowano poni zszy schemat: liza komórek + wirowanie ? rozpuszczenie antygenu + wirowanie ? agaroza Ni 2+ +-NTA ? zat ezanie ? elektroforeza preparatywna („Prep cell") ? precypitacja TCA i rozpuszczanie w PBS a. Liza Komórki bakterii (23 g) poddano lizie w 203 ml buforu 50 mM PO 4 pH 7 w homogenizatorze Rannie, po czym lizat odwirowano w rotorze JA 20 przy 15000 rpm przez 30 minut. Nads acz usuni eto. b. Rozpuszczanie antygenu 1/3 osadu rozpuszczono przez noc w 4°C w 34 ml 100 mM PO 4 - 6M GuHCl, pH 7. Po odwiro- waniu w rotorze JA 20 przy 15000 rpm przez 30 minut, osad usuni eto, za s nads acz dalej oczyszczono przez IMAC. c. Chromatografia powinowactwa: agaroza Ni 2+ -NTA (Qiagen) Obj eto sc kolumny: 15 ml (16 mm x 7,5 cm) Bufor do pakowania: 0,1 M PO 4 - 6 M GuHCl pH 7 Bufor do próbek: j.w. Bufor do przemywania: 0,1 M PO 4 - 6 M GuHCl pH 7 0,1 M PO 4 - 6 M mocznik pH 7 Elucja: gradient imidazolu (0 ? 250 mM) w 0,1 M PO 4 pH 7 z dodatkiem 6 M mocznika. Szybko sc przep lywu: 2 ml/min. d. Zat ezanie: Frakcja eluatu IMAC zawieraj ace antygen (160 ml) pulowano i zat ezano do 5 ml w komorze z mieszalnikiem Amicon na membranie Filtron (typ Omega, ci ezar odciecia 10000). Czysto sc na tym etapie wynosi la oko lo 70% jak oceniono przez SDS-PAGE. b. Elektroforeza preparatywna (Prep Cell BioRad) 2,4 ml zat ezonej próbki gotowano w 0,8 ml bufora redukuj acego do próbek i wprowadzano na 10% zel poliakryloamidowy. Antygen eluowano w buforze Tris-Glycine pH 8,3 z dodatkiem 4% SDS i pulowano frakcje zawieraj ace NS1-MAGE 3-His. e. Precypitacja TCA Antygen precypitowano z zastosowaniem TCA, a nast epnie wirowano w rotorze JA 20 przy 15000 rpm przez 20 minut. Nads acz usuwano. Osad rozpuszczano ponownie w buforze PBS pH 7,4. Bia lko by lo rozpuszczalne w PBS, po zamro zeniu/rozmro zeniu nie wykazywa lo sladów degra- dacji podczas przechowywania przez 3 godziny w 37°C, za s jego ci ezar cz asteczkowy wynosi l oko lo 50000 Da, co okre slono przez SDS (12,5% PAGE). P r z y k l a d IX Wytwarzanie szczepu E. coli wyra zaj acego bialko fuzyjne CLYTA-MAGE-1-ogon HisPL 203 499 B1 16 1. Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT14613 i transformowanie szczepu gospodarza AR58: Projektowanie bia lka: Projekt bia lka fuzyjnego Clyta-MAGE-1-His, wyra zanego w E. coli przedstawiono na Fig. 15. Struktura pierwszorz edowa powsta lego bia lka ma sekwencj e przedstawion a w Id. Sekw. nr 7. Sekwencj e koduj ac a (Id. Sekw. nr 8) odpowiadaj ac a powy zszemu bia lku umieszczono pod kon- trol a promotora ?pL w plazmidzie ekspresyjnym E. coli. Klonowanie: Jako materia l wyj sciowy zastosowano plazmid PCUZ1, który zawiera 117 kodonów ko nca C re- gionu koduj acego LytA ze Streptococcus pneumoniae oraz wektor pRIT14518 w którym uprzednio subklonowano cDNA genu MAGE-1 z plazmidu otrzymanego od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute. Strategia klonowania w celu ekspresji bia lka CLYTA-MAGE-1-His (przedstawiona na Fig. 16) obejmowa la nast epuj ace etapy: a) Pierwszym etapem by la amplifikacja PCR w celu otoczenia sekwencji CLYTA miejscami re- strykcyjnymi Ndel-Afllll. Amplifikacj e przeprowadzono stosuj ac plazmid PCUZ1 jako matryc e oraz star- tery oligonukleotyd sensowny 5' taa aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac i antysensowny: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Prowadzi to do amplifikacji sekwencji CLYTA d lugo sci 378 nukleotydów. b) W drugim etapie polaczono sekwencje CLYTA z sekwencjami MAGE-1-His tworz ac sekwen- cje koduj ac a bia lko fuzyjne. Etap ten obejmowa l wyci ecie fragmentu Ndel-Aflll Clyta i wprowadzenie do wektora pRIT14518 uprzednio otworzonego przez enzymy restrykcyjne Aflll i Ncol (zgodne z Ncol i Afllll) daj ac plazmid pRIT14613. c) Transformowanie szczepu AR58 d) Selekcja i charakterystyka transformantów E. coli (opornych na KAN) zawieraj acych plazmid pRIT 14613 (patrz, Fig. 16) 1. Charakteryzacja rekombinowanego CLYTA-MAGE-1-His (pRIT14613) Bakterie hodowano na po zywce LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 0,3 (620 nm) przeprowadzono indukcj e przez podniesienie temperatury do 42°C. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono ponownie w PBS i poddano lizie (przez rozpad) w jednym podej sciu. Po odwirowaniu osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt analizowano przez SDS-PAGE. Bia lka wykryto w zelach barwionych Coomassie B1, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% ca lkowitego bia lka E. coli. Bia lko rekombinowane by lo widoczne jako pojedynczy pr azek o pozornym MW 49 kDa. Bia lko fuzyjne zidentyfikowano przez analiz e Western blot stosuj ac przeciw- cia la poliklonalne anty-MAGE-1. Odtworzenie jednostki ekspresji obejmuj acej d lugi promotor ?pL (przydatny do indukcji kwasem nalidyksowym) oraz pRIT14614 koduj acy sekwencj e CLYTA-MAGE-3. Fragment restrykcyjny EcoRI-Ncol zawieraj acy d lugi promotor pL i cz esc sekwencji CLYTA wy- tworzono z plazmidu pRITDVA6 i wprowadzono pomi edzy miejsca EcoRI-Ncol plazmidu pRIT14613. Otrzymano rekombinowany plazmid pRIT14614. Rekombinowany plazmid pRIT14614 (Fig. 17) koduj acy bia lko fuzyjne CLYTA-MAGE-1-His za- stosowano do transformowania E. coli AR120. Potencjalny szczep oporny na KAN wyselekcjonowano i scharakteryzowano. Charakteryzacja rekombinowanego bia lka Bakterie hodowano na po zywce LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 400 (600 nm) dodano kwas nalidyksowy w st ezeniu 60 mg/ml. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono w PBS i poddano lizie przez rozpad (rozpad CLS w jednym podej sciu typu „one shot"). Po odwirowaniu osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt analizowano przez SDS-PAGE. Bia lka wykryto w zelach barwionych blekitem Coomassie, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% bia lka ca lkowitego E. coli. Bia lko fuzyjne zidentyfikowano przez analiz e Western blot stosuj ac królicze przeciwcia la poliklonalne anty-MAGE-1. Rekombinowane bia lko by lo widoczne jako pojedynczy pr azek o pozornym MW wynosz acym oko lo 49 kD. P r z y k l a d X CLYTA-MAGE3-HIS A: Odrzucenie nowotworu przy u zyciu rekombinowanego antygenu: bia lko fuzyjne CLYTA- MAGE-3-His, w którym sk ladnik fuzji C-lyt A prowadzi do ekspresji rozpuszczalnego bia lka, dzia la jak znacznik powinowactwa i dostarcza epitopów limfocytom T. Wytwarzanie szczepu E. coli wyra zaj ace- go bia lko fuzyjne CLYTA-MAGE-3-His. Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT14646 i transfor- mowanie szczepu gospodarza AR120:PL 203 499 B1 17 Projektowanie bia lka: Projektowanie bia lka fuzyjnego CLYTA-MAGE-3-His do wyra zania w E. coli opisano na Fig. 18. Struktura pierwszorz edowa powsta lego bia lka przedstawiona jest w Id. Sekw. nr 9, za s se- kwencja koduj aca w Id. Sekw. nr 10. Sekwencj e koduj ac a powy zszej konstrukcji bia lka umieszczono pod kontrol a promotora ?pL w plazmidzie ekspresyjnym E. coli. Klonowanie: Jako materia l wyj sciowy zastosowano plazmid PCUZ1, który zawiera 117 kodonów ko nca C re- gionu koduj acego LytA ze Streptococcus pneumoniae (Gene 43, 1986) str. 265-272) oraz wektor pRIT14426, w którym uprzednio subklonowano cDNA genu MAGE-3 z plazmidu otrzymanego od Dr Thierry Boon z Ludwig Institute. Strategia klonowania w celu ekspresji CLYTA-MAGE-3-His (przedstawiona na Fig. 19) obejmo- wa la nast epuj ace etapy: 1. Wytwarzanie modu lu sekwencji koduj acej CLYTA-MAGE-3-His 1.1. Pierwszym etapem by la amplifikacja PCR w celu otoczenia sekwencji CLYTA miejscami restrykcyjnymi Aflll i Afllll. Amplifikacj e PCR przeprowadzono stosuj ac plazmid PCUZ1 jako matryc e oraz startery oligonukleotyd sensowny 5' taa aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac i antysensowny: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Prowadzi to do amplifikacji sekwencji CLYTA d lugo sci 427 nukleotydów. Powy zej wskazany amplifikowany frag- ment wklonowano do wektora TA (Invitrogen) otrzymuj ac pRIT14661. 1.2. Drugim etapem by lo po laczenie sekwencji CLYTA z sekwencjami MAGE-3-His w celu wy- tworzenia sekwencji koduj acej bia lko fuzyjne. Etap ten obejmowa l wyci ecie fragmentu Clyta Aflll-Afllll i wprowadzenie do wektora pRIT14426 uprzednio otworzonego enzymami restrykcyjnymi Aflll i Ncol (zgodnego Ncol i Afllll) z wytworzeniem plazmidu pRIT14662. 2. Odtworzenie jednostki ekspresji obejmuj acej d lugi promotor ?pL (przydatny do indukcji kwa- sem nalidyksowym) oraz sekwencj e koduj aca CLYTA-MAGE-3: Z plazmidu pRIT14662 wytworzono fragment restrykcyjny BglII-XbaI zawieraj acy krótki promo- tor pL i sekwencj e koduj ac a CLYTA-MAGE-3-His i wprowadzono pomi edzy miejsca Bglll - Xbal pla- zmidu TCM67 (pochodna pBR322 z genem oporno sci na ampicylin e i d lugim promotorem ?pL, PCT/EP92/01827). Otrzymano rekombinowany plazmid pRIT14607. Rekombinowany plazmid pRIT14607 koduj acy bia lko fuzyjne CLYTA-MAGE-3-His zastosowano do transformowania E. coli AR120 (Mott i in., PNAS, 82:88). Potencjalny szczep oporny na ampicylin e wyselekcjonowano i scharakteryzowano. 3. Wytwarzanie plazmidu pRIT14646 W ko ncu skonstruowano plazmid podobny do pRIT14607, ale z genem oporno sci na kanamy- cyn e (pRIT14646). Charakteryzacja rekombinowanego bia lka Bakterie hodowano na po zywce LB z dodatkiem 50 µg/ml kanamycyny w 30°C. Gdy hodowla osi agn ela OD = 400 (przy 600 nm) dodano kwas nalidyksowy w stezeniu 60 µg/ml. Po 4 godzinach indukcji komórki zebrano, zawieszono w PBS i poddano lizie przez rozpad (rozpad CLS w jednym podej sciu typu „one shot"). Po odwirowaniu osad, nads acz i ca lkowity ekstrakt analizowano przez SDS-PAGE. Bia lka wykryto w zelach barwionych blekitem Coomassie, przy czym bia lko fuzyjne stanowi lo oko lo 1% bia lka ca lkowitego E. coli. Bia lko fuzyjne zidentyfikowano przez analiz e Western blot stosuj ac królicze przeciwcia la poliklonalne anty-MAGE-3. Bia lko rekombinowane by lo widoczne jako pojedynczy pr azek o pozornym MW oko lo 58 kDa. P r z y k l a d XI Oczyszczanie rekombinowanego bia lka CLYTA-MAHE-3-His Rekombinowane bakterie AR120 (pRIT14646) hodowano w 20-litrowych fermentatorach stosu- jac fermentacje wsadowa w 30°C. Ekspresj e rekombinowanego bia lka wywo lano przez dodanie kwa- su nalidyksowego w st ezeniu ko ncowym 60 µg/ml. Komórki zebrano pod koniec fermentacji i poddano lizie przy 60 OD/600 przez dwukrotne przepuszczenie przez pras e French (20000 psi). Poddane lizie komórki wirowano przy 15000 x g w 4°C. Nads acz zawieraj acy rekombinowane bia lko wprowadzono do kolumny anionowymiennej DEAE Sepharose CL6B (Pharmacia) równowa zonej wst epnie 0,3 M NaCl, 20 mM Tris HCl, pH 7,6, Bufor A. Po przep lukaniu kolumny buforem A, bia lko fuzyjne eluowano 2% cholin a w buforze A. Pulowano frakcje zawieraj ace antygen, co uwidoczniono analiz a Western blot z u zyciem przeciwcia l anty-MAGE-3. Antygen eluowany z DEAE wprowadzano do 0,5% Empigen BB (detergent obojnaczy) i 0,5 M NaCl, po czym ladowano do kolumny chromatografii powinowactwaPL 203 499 B1 18 z jonem metalu, zrównowa zonej uprzednio 0,5% Empigen BB, 0,5 M NaCl, 50 mM buforem fosfora- nowym pH 7,6 (Bufor B). Kolumn e IMAC p lukano buforem B do momentu osi agni ecia warto sci podstawowej absorbancji przy OD 280. Antygen eluowano gradientem st ezenia imidazolu 0-250 mM w buforze C. Frakcje imidazolu 0,090-0,250 M pulowano, zatezano na membranie Filtron Omega 10 kDa, po czym dializowano wobec bufora PBS. Wnioski Wykazano, ze bia lko fuzyjne LPD-MAGE3-His jest immunogenne u myszy, za s ta immunogen- nosc (reakcja proliferacyjna i reakcja przeciwcia l) mo ze by c dalej wzmocniona przez zastosowanie adiuwanta opisanego wy zej. Oczyszczanie mo zna polepszy c przez derywatyzacj e tioli, które tworz a mostki disiarczkowe. Wykazano równie z, ze lepsz a reakcj e przeciwcia l uzyskuje si e przez szczepienie LPD-MAGE-3- -His w obecno sci adiuwanta. G lównym izotypem spotykanym w surowicy myszy szczepu C57B1/6 jest IgG2b, co wskazuje, ze zosta la wywo lana reakcja typu Th1. W warunkach klinicznych u pacjenta traktowanego LPD-MAGE-3-His w postaci bez adiuwanta nast api lo usuni ecie czerniaka. Lista sekwencjiPL 203 499 B1 19PL 203 499 B1 20PL 203 499 B1 21PL 203 499 B1 22PL 203 499 B1 23PL 203 499 B1 24PL 203 499 B1 25PL 203 499 B1 26PL 203 499 B1 27 PL PL

Claims (21)

1.Zastrze zenia patentowe 1. Sposób oczyszczania lub wytwarzania bia lka MAGE albo jego pochodnej, znamienny tym, ze obejmuje redukowanie wi aza n disiarczkowych bia lka i blokowanie powsta lych wolnych grup tiolo- wych grup a blokuj ac a.

2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze ponadto obejmuje co najmniej jeden etap oczyszczania chromatograficznego.

3. Sposób wed lug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze bia lko jest solubilizowane z zastoso- waniem silnego czynnika chaotropowego albo detergentu obojnaczego.

4. Sposób wed lug zastrz. 3, znamienny tym, ze czynnikiem chaotropowym jest mocznik lub chlorowodorek guanidyniowy.

5. Sposób wed lug zastrz. 3, znamienny tym, ze detergentem obojnaczym jest n-dodecylo- N,N-dimetyloglicyna.

6. Sposób wed lug zastrz. 1-5, znamienny tym, ze czynnikiem blokuj acym jest czynnik alkiluj acy.

7. Sposób wed lug zastrz. 6, znamienny tym, ze czynnikiem blokuj acym jest alfa- fluorowcokwas i/lub alfa-fluorowcoamid.

8. Sposób wed lug zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, ze czynnik blokuj acy jest wybrany z grupy obejmuj acej kwas jodooctowy, jodoacetamid, N-etylomaleimid, fosforan chloroacetylu, O-metylo- izomocznik i akrylonitryl.

9. Sposób wed lug zastrz. 1-8, znamienny tym, ze bia lko obejmuje znacznik powinowactwa.

10. Sposób wed lug zastrz. 9, znamienny tym, ze znacznikiem powinowactwa jest CLytA lub ogon polihistydynowy.

11. Sposób wed lug zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, ze po etapie blokowania bia lko zawiera- jace znacznik powinowactw poddaje si e chromatografii powinowactwa.

12. Sposób wed lug zastrz. 11, znamienny tym, ze chromatografi a powinowactwa jest chroma- tografia powinowactwa z unieruchomionym jonem metalu (IMAC).

13. Sposób wed lug zastrz. 12, znamienny tym, ze jon metalu jest wybrany spo sród cynku, ni- klu, zelaza, magnezu albo miedzi.

14. Sposób wed lug zastrz. 11, 12 albo 13, znamienny tym, ze chromatografia powinowactwa jest prowadzona z zastosowaniem buforu zawieraj acego detergent obojnaczy n-dodecylo-N,N- dimetyloglicyn e.

15. Sposób wed lug zastrz. 10-14, znamienny tym, ze bia lko obejmuje ClytA lub jego fragment i jest oczyszczane przez chromatografi e powinowactwa wobec choliny lub analogów choliny, takich jak DEAE.

16. Sposób wed lug zastrz. 1-15, znamienny tym, ze bia lko jest bia lkiem fuzyjnym zawieraj a- cym antygen MAGE oraz sk ladnik fuzji.

17. Sposób wed lug zastrz. 16, znamienny tym, ze sk ladnikiem fuzji jest bia lko D z Haemophi- lus influenzae B albo jego fragment, bia lko NS1 z wirusa grypy albo jego fragment, lub LytA ze Strep- tococcus pneumoniae albo jego fragment.

18. Sposób wed lug zastrz. 17, znamienny tym, ze sk ladnik fuzji jest lipidowan a postaci a bia lka D lub jej fragmentem, z Haemophilus influenza B.

19. Sposób wed lug zastrz. 1-18, znamienny tym, ze antygen MAGE jest wybrany z grupy obej- mujacej MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE BI, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 i MAGE C2.

20. Sposób wed lug zastrz. 1-19, znamienny tym, ze obejmuje ponadto co najmniej jeden etap oczyszczania.

21. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, ze obejmuje etap oczyszczania lub wy- twarzania bia lka MAGE albo jego pochodnej sposobem okre slonym w zastrz. 1-20, oraz formu lowania powsta lego bia lka jako szczepionki.PL 203 499 B1 28 RysunkiPL 203 499 B1 29PL 203 499 B1 30PL 203 499 B1 31PL 203 499 B1 32PL 203 499 B1 33PL 203 499 B1 34PL 203 499 B1 35PL 203 499 B1 36PL 203 499 B1 37PL 203 499 B1 38PL 203 499 B1 39PL 203 499 B1 40PL 203 499 B1 41PL 203 499 B1 42 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL