ES2255248T3 - Derivados de antigenos asociados a tumor de la familia mage, y secuencias de acidos nucleicos que los codifican, usados para la preparacion de proteinas de fusion y de composiciones para vacunas. - Google Patents
Derivados de antigenos asociados a tumor de la familia mage, y secuencias de acidos nucleicos que los codifican, usados para la preparacion de proteinas de fusion y de composiciones para vacunas.Info
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Abstract
Un derivado de antígenos asociado a tumores de la familia MAGE en el que el derivado comprende residuos de tiol derivatizados.
Description
Derivados de antígenos asociados a tumor de la
familia MAGE, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican,
usados para la preparación de proteínas de fusión y de
composiciones para vacunas.
La presente invención se refiere a derivados de
proteínas, que comprenden un antígeno asociado a tumores, que
encuentran utilidad en terapia de vacunas de cáncer. En particular
los derivados de la invención incluyen proteínas químicamente
modificadas que comprenden un antígeno codificado por la familia de
genes MAGE (por ejemplo MAGE-3,
MAGE-1), en el que el derivado comprende residuos de
tiol derivatizados. También se describen procedimientos para
purificar proteínas MAGE y para formulas vacunas para tratar una
gama de cánceres, que incluye, pero no se limita a, melanoma, mama,
vejiga, pulmón, NSCLC, cabeza y carcinoma de células escamosas,
carcinoma de colon y carcinoma de esófago.
Los antígenos codificados por la familia de genes
MAGE se expresan predominantemente sobre células de melanoma
(incluyendo melanoma maligno) y algunos otros cánceres incluyendo
NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de
células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células
transitorias de vejiga y carcinoma de esófago, pero no son
detectables sobre tejidos normales excepto en los testículos y
placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995).
MAGE-3 se expresa en el 69% de los melanomas
(Gaugler, 1994), y también se puede detectar en el 44% de NSCLC
(Yoshimatsu 1988), 48% de carcinoma de células escamosas de cabeza y
cuello, 34% de carcinoma de células transitorias de vejiga, 57% de
carcinoma de esófago, 32% de cánceres de colon y 24% de cánceres de
mama (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Los
cánceres que expresan proteínas MAGE se conocen como tumores
asociados a Mage.
La inmunogenicidad de células de melanoma humano
se ha demostrado airosamente en experimentos que usan cultivos
mixtos de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos cultivos
a menudo generan linfocitos T citotóxicos específicos (CTLs) capaces
de lisar exclusivamente las células de melanoma autólogas pero ni
fibroblastos autólogos ni los linfocitos B autólogos transformados
por EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Varios de los antígenos
reconocidos sobre células autólogas de melanoma por estos clones de
CTL están ahora identificados, incluyendo los de la familia
MAGE.
El primer antígeno que se podría definir a través
de su reconocimiento por CTL específicos sobre células de melanoma
autólogas se denomina MZ2-E (Van den Eynde, 1989) y
está codificado por el gen MAGE-1 (Van der Bruggen,
1991). Los CTL dirigidos contra MZ2-E reconocen y
lisan células de melanoma positivas MZ2-E de
autólogos así como de otros pacientes con tal que estas células
tengan el alelo HLA.A1.
El gen MAGE-1 pertenece a una
familia de 12 genes estrechamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE
3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11,
MAGE 12, localizados en el cromosoma X y que comparten entre sí 64 a
85% de homología en su secuencia codificadora (De Plaen, 1994).
Estos son algunas veces conocidos como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3,
MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE
A11, MAGE A12 (la familia MAGE A). Otros dos grupos de proteínas
también son parte de la familia MAGE aunque relacionados de manera
más distante. Éstos son el grupo MAGE B y MAGE C. La familia MAGE B
incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1, y DAM 10), MAGE B2
(también conocido como MAGE Xp2, y DAM 6), MAGE B3 y MAGE B4 - la
familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2. En términos
generales, una proteína MAGE se puede definir por contener una
firma de secuencia central localizada hacia el extremo terminal C de
la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1 una proteína de 309
aminoácidos, la firma central corresponde a 195-279
aminoácidos).
El patrón de consenso de la firma del núcleo se
describe así como sigue en la que x representa cualquier aminoácido,
los residuos del caso inferior se conservan (variantes conservadoras
permitidas) y los residuos del caso superior se conservan
perfectamente.
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxqvPxsx
P(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
P(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
Las sustituciones conservadoras son bien
conocidas y generalmente se exponen como las matrices de puntuación
por defecto en programas de ordenador de alineación de secuencias.
Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M. O. et. col., (1978),
"A model of evolutionary changes in proteins", en "Atlas of
Protein sequence and estructure" 5 (3) M. O. Dayhoft (ed.),
345-352), National Biomedical Research Foundation,
Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992),
"Amino acids sustitution matricies from protein blocks"), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry):
10915-10919.
En términos generales, la sustitución dentro de
los siguientes grupos son sustituciones conservadoras, pero las
sustituciones entre los grupos se consideran no conservadas. Los
grupos son:
i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina
ii) Serina/treonina
iii) lisina/arginina
iv) fenilalanina/tirosina/triptófano
v) Leucina/isoleucina/valina/metionina
vi) Glicina/alanina
En general y en el contexto de esta invención,
una proteína MAGE será aproximadamente 50% idéntica en esta región
central con 195 a 279 aminoácidos de MAGE A1.
Varios epítopes de CTL se han identificado sobre
la proteína MAGE-3. Tal epítope,
MAGE-3.A1, es una secuencia nonapeptídica localizada
entre los 168 y 176 aminoácidos de la proteína
MAGE-3 que constituye un epítope específico para las
CTL cuando se presentan en asociación con la molécula de la clase i
de MHC HLA.A1. Recientemente se han identificado dos epítopes de CTL
adicionales sobre la secuencia de péptidos de la proteína
MAGE-3 por su capacidad de montar la respuesta CTL
en un cultivo mixto de células de melanoma y linfocitos autólogos.
Estos dos epítopes tienen motivos de unión específica para los
alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) y HLA.B44 (Herman, 1996)
respectivamente.
La presente invención proporciona un antígeno
asociado a tumores derivado de la familia MAGE en la que el derivado
comprende residuos de tiol derivatizados. Tales derivados son
adecuados para uso en las formulaciones de vacunas terapéuticas que
son adecuadas para el tratamiento de una gama de tipos de
tumores.
Los tioles derivatizados están preferiblemente
carboxiamidados o carboximetilados.
La proteína D, es una proteína de superficie de
la bacteria gram-negativa, Haemophilus influenza B
(documento WO 91/18926). En una realización de la presente
invención, el derivado de antígeno comprende una pareja de fusión
derivada de la proteína D, en la que el derivado de la proteína
D comprende aproximadamente el primer1/3 de la proteína, en
particular aproximadamente los primeros 100-110
aminoácidos N-terminales. Las proteínas se pueden
conjugar químicamente, pero se expresan preferiblemente como
proteínas de fusión recombinantes que permiten la producción de
niveles incrementados en un sistema de expresión cuando se comparan
con la proteína no condensada. De este modo la pareja de fusión
puede asistir en la proporción de los epítopes auxiliares T (pareja
de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes de los auxiliares
T reconocidos por seres humanos, o asisten en la expresión de la
proteína (potenciador de expresión) a rendimientos altos que la
proteína recombinante nativa. Preferiblemente la pareja de fusión
será tanto una pareja de fusión inmunológica como pareja
potenciadora de expresión.
Preferiblemente el derivado de la proteína D está
lipidado. Preferiblemente los 109 primeros restos de la pareja de
fusión de la lipoproteína D se incluye en el extremo N para
proporcionar el antígeno candidato de vacuna con epítopes de células
T exógenos adicionales e incrementan el nivel de expresión en E.
coli (actuando así como un potenciador de expresión). La cola
lipídica asegura la presentación óptima del antígeno a las células
presentadoras de antígeno.
Otras parejas de fusión incluyen la proteína no
estructural de virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Típicamente
se utilizan los 81 aminoácidos N terminales, aunque se pueden usar
diferentes fragmentos con tal que incluyan epítopes de auxiliares
T.
En otra realización la pareja de fusión
inmunológica es la proteína conocida como LYTA. Preferiblemente se
usa la porción terminal C de la molécula. LYTA se deriva de
Streptococcus pneumoniae que sintetiza una
N-acetil-L-alanina
amidasa, amidasa LYTA, (codificada por el gen lytA (Gene, 43 (1986)
página 265-272) una autolisina que degrada
específicamente ciertos enlaces en la estructura central de
peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína
LYTA es responsable de la afinidad a la colina o algunos análogos de
colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el
desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA en E.
coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha
descrito la purificación de las proteínas híbridas que contienen el
fragmento LYTA en su extremo amino (Biotechnology: 10, (1992) página
795-798). Como se usa en esta memoria descriptiva
una realización preferida utiliza la porción repetida de la molécula
Lyta encontrada en el terminal C y que comienza en el residuo 178.
Una forma particularmente preferida incorpora los residuos
188-305.
Las parejas de fusión inmunológicas indicadas
anteriormente son también ventajosas para ayudar en la expresión. En
particular, tales fusiones se expresan con rendimientos mayores que
las proteínas MAGE recombinantes nativas.
Los presentes inventores han mostrado que tales
construcciones en un escenario clínico son capaces de tratar
melanomas. En un caso, se eliminó la metástasis de un paciente con
melanoma de fase IV después de dos dosis de proteína lipo D 1/3 MAGE
3 His no adyuvantada.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
en la realización proporciona proteínas de fusión que comprenden un
antígeno asociado a tumores derivado de la familia MAGE en la que
el derivado comprende residuos tiol derivatizados, unidos a una
pareja de fusión inmunológica. La pareja de fusión inmunológica es
proteína D o derivado del fragmento del mismo que comprende el
primer 1/3 de la proteína D. Preferiblemente la lipoproteína D.
Las proteínas MAGE son preferiblemente MAGE 11 o MAGE A3. La parte
de lipoproteína D preferiblemente comprende el primer 1/3 de la
lipoproteína D.
Las proteínas de la presente invención
preferiblemente se expresan en E. coli. En una realización
preferida las proteínas se expresan con una marca de afinidad tag,
tal como por ejemplo, una cola histidina que comprende entre 5 y 9 y
preferiblemente seis residuos histidina. Éstos son ventajosos
ayudando a la purificación.
La presente invención también proporciona un
ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión de la presente
invención. Tales secuencias se pueden insertar en un vector de
expresión adecuado y usarse para vacunación de ADN/ARN o expresarse
en un huésped adecuado. Los vectores microbianos que expresan el
ácido nucleico se pueden usar como vacunas. Tales vectores incluyen
por ejemplo, poxvirus, adenovirus, alfavirus, listeria y
monarfago.
Una secuencia de ADN que codifica las proteínas
de fusión de la presente invención se pueden sintetizar usando
técnicas de síntesis de ADN convencionales, tales como mediante
ligamiento enzimático como describen D. M. Roberts y col, en
Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, mediante síntesis
química, por polimerización enzimática in vitro, o mediante
tecnología PCR que utiliza por ejemplo una polimerasa estable al
calor, o mediante una combinación de estas técnicas.
La polimerización enzimática de ADN se puede
llevar a cabo in vitro usando una ADN polimerasa tal como ADN
polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón apropiado que contiene
los trifosfatos de nucleósidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP como se
requiere a una temperatura de 10º a 37ºC, generalmente en un volumen
de 50 \mul o menos. El ligamiento enzimático de los fragmentos de
ADN se puede llevar cabo usando una ADN ligasa tal como ADN ligasa
de T4 en un tampón apropiado tal como Tris 0,05 M (pH 7,4),
MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y
0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina, a una temperatura de 4ºC a
ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml o menos. La síntesis
química del polímero o fragmentos de ADN se puede llevar a cabo
mediante química de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita, usando
técnicas de fase sólida tal como las descritas en "Chemical and
Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory
Manual" (ed. H. G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim
(1982), o en otras publicaciones científicas, por ejemplo M. J.
Gait, H. W. D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat, y R. C. Titmas,
Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat, y W.
Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci y M.
H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci y
M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981,
103, 3185; S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical
Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, y H.
Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H. W. D. Mattes y
col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
El procedimiento de la invención se realiza
mediante técnicas recombinantes convencionales tal como describen
Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual;
Cold Spring Harbor, 1982-1989.
En particular, el procedimiento comprende las
etapas de:
- i)
- preparar un vector de expresión replicable o de integración capaz, en una célula huésped, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o derivado inmunogénico de la misma;
- ii)
- transformar una célula huésped con dicho vector;
- iii)
- cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones que permiten la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y
- iv)
- recuperar dicha proteína.
El término "transformación" se usa en esta
memoria descriptiva para significar la introducción de ADN foráneo
en una célula huésped. Esto se puede lograr por ejemplo mediante
transformación, transfección o infección con un plásmido apropiado o
vector viral que usa, por ejemplo, técnicas convencionales como se
describe en Genetic Engineering: Eds. S. M. Kingsman y A. J.
Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra,
1988. El término "transformado" o "transformante" se
aplicará de aquí en adelante a la célula huésped resultante que
contiene y expresa el gen foráneo de interés.
Los vectores de expresión son novedosos y también
forman parte de la invención.
Los vectores de expresión replicables se pueden
preparar de acuerdo con la invención, mediante escisión de un vector
compatible con la célula huésped para proporcionar un segmento de
ADN lineal que tiene un replicón intacto, y combinando dicho
segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho
segmento lineal codifican el producto deseado, tal como el polímero
de ADN que codifica la proteína de la invención, o derivado de la
misma, en condiciones ligantes.
De este modo, el polímero de ADN se puede
preformar o formar durante la construcción del vector, según se
desee.
La elección del vector se determinará en parte
por la célula huésped, que puede ser procariótica o eucariótica pero
son preferiblemente E. coli o células CHO. Los vectores
adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus
recombinantes.
La preparación del vector de expresión replicable
se puede llevar a cabo de manera convencional con enzimas apropiadas
para restricción, polimerización y ligamiento del ADN, mediante
procedimientos descritos en por ejemplo, Maniatis et al.,
citado anteriormente.
La célula huésped recombinante se prepara, de
acuerdo con la invención, transformando una célula huésped con un
vector de expresión replicable de la invención en condiciones de
transformación. Las condiciones adecuadas de transformación son
convencionales y se describen, por ejemplo, en Maniatis et
al., citado anteriormente, o "DNA Cloning" Vol. II, D. M.
Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.
La elección de las condiciones de transformación
la determina la célula huésped. De esta manera, un huésped
bacteriano tal como E. coli se puede tratar con una solución
de CaCl_{2} (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69,
2110) o con una solución que comprende una mezcla de RbCl,
MnCl_{2}, acetato de potasio y glicerol, y después con ácido
3-[N-morfolino]-propano-sulfónico,
RbCl y glicerol. Las células de mamífero en cultivo se pueden
transformar mediante coprecipitación con calcio del ADN del vector
en las células. La invención también se extiende a una célula
huésped transformada con un vector de expresión replicable de la
invención.
El cultivo de la célula huésped transformada en
condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN se lleva a
cabo de manera convencional, como se describe, por ejemplo, en
Maniatis et al., y "DNA Cloning" citado anteriormente.
De esta manera, preferiblemente la célula se suministra con
nutriente y se cultiva a una temperatura por debajo de 50ºC.
El producto se recupera mediante procedimientos
convencionales de acuerdo con la célula huésped y de acuerdo con la
localización del producto de expresión (intracelular o secretado en
el medio de cultivo o en el periplasma de la célula). De este modo,
cuando la célula huésped es bacteriana, tal como E. coli, se
puede, por ejemplo, lisar física, química o enzimáticamente y el
producto proteico se aísla del lisado resultante. Cuando la célula
huésped es un mamífero el producto se puede generalmente aislar del
medio nutriente o de los extractos libres de células. Las técnicas
de aislamiento de proteínas convencionales incluyen precipitación
selectiva, cromatografía de adsorción, y cromatografía de afinidad
que incluye una columna de afinidad de anticuerpos monoclonales.
Las proteínas de la presente invención se
proporcionan o bien solubles en una forma líquida o en una forma
liofilzada.
En general se espera que cada dosis humana
comprenderá 1 a 1000 \mug de proteína, y preferiblemente
30-300 \mug.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente
invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una
composición de vacuna preferida comprende al menos lipoproteína
D-MAGE-3. Tal vacuna puede
opcionalmente contener uno o más otros antígenos asociados a
tumores. Por ejemplo otros miembros que pertenecen a las familias
MAGE y GAGE. Otros antígenos asociados a tumores adecuados incluyen
MAGE-1 y GAGE-1 o proteínas de
tirosinasa.
La preparación de vacunas generalmente se
describe en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach"
(eds. Powell M. F. & Newman M. J.). (1995) Plenum Press Nueva
York). La encapsulación dentro de liposomas la describe Fullerton,
patente de Estados Unidos nº 4.235.877.
Las proteínas de la presente invención se
adyuvantan preferiblemente en la formulación de vacuna de la
invención. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal
como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio,
pero también puede ser una sal de calcio, hierro o cinc, o puede ser
una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados,
polisacáridos o polifosfacenos derivatizados catiónicamente o
aniónicámente. Otros adyuvantes conocidos incluyen oligonucleótidos
que contienen CpG. Los oligonucleótidos se caracterizan porque el
dinucleótido CpG está sin metilar. Tales oligonucleótidos se conocen
bien y se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/02555.
En la formulación de la invención se prefiere que
la composición de adyuvantes induzca una respuesta inmune
preferentemente del tipo TH1. Los sistemas de adyuvantes adecuados
incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A,
preferiblemente
3-de-O-acilado
monofosforil lípido A (3D-MPL) junto con una sal de
aluminio. Los oligonucleótidos CpG también inducen preferentemente
una respuesta TH1.
Un sistema potenciado implica la combinación de
un monofosforil lípido A y un derivado de saponina particularmente
la combinación de QS21 y 3D- MPL como se describe en el documento WO
94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se
inactiva con colesterol como se describe en el documento WO
96/33739.
Una formulación adyuvante particularmente potente
que implica QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión
de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una
formulación preferida.
De acuerdo con lo anterior en una realización de
la presente invención se proporciona una vacuna que comprende una
proteína de la presente invención, más preferiblemente una
lipoproteína D(o derivado de la
misma)-MAGE-3 adyuvantada con un
monofosforil lípido A o derivado del mismo.
Preferiblemente la vacuna adicionalmente
comprende una saponina, más preferiblemente QS21.
Preferiblemente la formulación adicional
comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La presente
invención también proporciona un procedimiento para proporcionar una
formulación de vacuna que comprende mezcla de una proteína de la
presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente
aceptable, tal como 3D-MPL.
En un aspecto de la invención se proporciona un
procedimiento para purificar una proteína MAGE o una fusión MAGE
producida de manera recombinante como se ha descrito en esta memoria
descriptiva. El procedimiento comprende la solubilización de la
proteína, por ejemplo en un agente caotrópico fuerte (tal como por
ejemplo, urea, clorhidrato de guanidinio), o en un detergente de ion
bipolar, por ejemplo, Empigen
BB-n-dodecil-N,N-dimetilglicina),
que reduce los enlaces intra e intermoleculares disulfuro de la
proteína, bloqueando los tioles resultante para evitar el
reacoplamiento oxidante, y someter la proteína a una o más etapas
cromatográficas.
Preferiblemente, el agente bloqueante es un
agente alquilante. Tales agentes bloqueantes incluyen pero no se
limitan a haloácidos alfa o haloamidas alfa. Por ejemplo ácido
yodoacético y yodoacetamida que da como resultado la
carboximetilación o carboxiamidación (carbamidometilación) de la
proteína. Otros agentes bloqueantes se pueden usar y se describen en
la bibliografía (véase, por ejemplo, The Proteins Vol II Eds H
neurath, RL Hill y C-L Boeder, Academic Press 1976,
o Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad
y CM Noyes, CRC Press 1985). Los ejemplos típicos de tales otros
agentes incluyen N-etilmaleimida, fosfato de
cloroacetilo, O-metilisourea y acrilonitrilo. El uso
del agente bloqueante es ventajoso ya que previene la agregación del
producto, y asegura la estabilidad de la purificación cadena
abajo.
En una realización de la invención los agentes
bloqueantes se seleccionan para que induzcan un derivado covalente e
irreversible estable (por ejemplo haloácidos alfa o haloamidas
alfa). Sin embargo se pueden seleccionar otros agentes bloqueantes
de manera que después de la purificación el agente bloqueante se
pueda retirar para liberar la proteína no derivatizada.
Las proteínas MAGE que tienen residuos tiol
libres derivatizados son nuevas y forman un aspecto de la invención.
En particular los derivados carboxiamidados o carboximetilados son
una realización preferida de la invención.
En una realización preferida de la invención las
proteínas de la presente invención se proporciona con una marca de
afinidad, tal como CLYTA o una cola de polihistidina.
En tales casos la proteína después de la etapa de
bloqueo se somete preferiblemente a cromatografía de afinidad. Para
las proteínas con una cola de polihistidina, se puede realizar
cromatografía de afinidad por ion metálico inmovilizado (IMAC). El
ion metálico, puede ser cualquier ion metálico por ejemplo, cinc,
níquel, hierro, magnesio o cobre, pero es preferiblemente cinc o
níquel. Preferiblemente el tampón IMAC contiene un detergente de ion
bipolar tal como Empigen BB (de aquí en adelante en esta memoria
descriptiva Empigen) ya que esto da como resultado niveles
inferiores de endotoxina en el producto final.
Si la proteína se produce con una parte Clyta, la
proteína se puede purificar explotando su afinidad para colina o
análogos de colina tal como DEAE. En una realización de la invención
las proteínas se proporcionan con una cola de polihistidina y una
parte Clyta. Éstas se pueden purificar en un programa sencillo de
purificación cromatográfico de afinidad de dos etapas.
La invención se describirá adicionalmente por
referencia a los siguientes ejemplos que tienen referencia a las
figuras, en las que:
Figura
1
LPD-MAGE-3-His
Figura
2
Construcción del vector de expresión pRIT
14586
Figura
3
Construcción del plásmido pRIT 14477 que expresa
la proteína de fusión Prot. D
1/3-MAGE-3-cola
His
Figura
4
Análisis de transferencia de Western de la
proteína
LPD-MAGE-3-His;
anticuerpos monoclonales Anti-MAGE-3
Mab 32 y Mab 54.
Figura
5
Inmunogenicidad de MAGE-3 en
ratones (C57BL6); linfoproliferación sobre células de bazo
Figura
6
Inmunogenicidad de MAGE-3 en
ratones (C57BL6); linfoproliferación sobre células de nódulo
linfático
Figura
7
Inmunogenicidad de MAGE-3 en
ratones (BalbC); linfoproliferación sobre células de bazo
Figura
8
Inmunogenicidad de MAGE-3 en
ratones (BalbC); linfoproliferación sobre células de nódulo
linfático poplíteo
Figura
9
Anticuerpos
Anti-MAGE-3 en el suero de ratones
inmunizados con LipoD MAGE-3 His en SBAS2 o no
Figura
10
Respuestas de anticuerpos específicas de subclase
en ratones BalbC
Figura
11
Respuestas de anticuerpos específicas de subclase
en ratones C57BL/6
Figura
12
Proteína de fusión
NS1-MAGE-3-His
Figura
13
Construcción del plásmido pRIT14426
Figura
14
Mapa plasmídico de pRIT14426
Figura
15
Proteína de fusión
Clyta-Mage-1-His
Figura
16
Construcción del plásmido pRIT14613
Figura
17
Construcción del plásmido pRIT14614
Figura
18
Proteína de fusión
Clyta-Mage-3-His
Figura
19
Construcción del plásmido pRIT14646
\newpage
Ejemplo
I
Para la producción de Lipoproteína D el ADN que
codifica la proteína D se ha clonado en el vector de expresión pMG
81. Este plásmido utiliza señales del ADN del fago lambda que dirige
la transcripción y traducción de genes foráneos insertados. El
vector contiene el promotor de PL lambda PL, operador OL y dos
sitios de utilización (NutL y NutR) para liberar los efectos de
polaridad transcripcional cuando se proporciona la proteína N (Gross
et al., 1985 Mol. & Cell. Biol. 5:1015). Los vectores que
contienen el promotor PL, se introducen en un huésped lisogénico de
E. coli para estabilizar el ADN de plásmido. Las cepas
huésped lisogénicas contienen ADN de fago lambda defectuoso de
replicación integrado en el genoma (Shatzman et al., 1983; en
Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) p.
1-14. Academic Press N. Y.) El ADN del fago lambda
dirige la síntesis de la proteína represora cI que se une al
represor OL del vector y previene la unión de ARN polimerasa al
promotor PL y por lo tanto la transcripción del gen insertado. El
gen cI de la cepa de expresión AR58 contiene una mutación sensible a
temperatura de manera que la transcripción dirigida por PL se puede
regular por deslazamiento de temperatura, es decir, un incremento en
la temperatura de cultivo inactiva el represor y se inicia la
síntesis de la proteína foránea. Este sistema de expresión permite
la síntesis controlada de proteínas foráneas especialmente de
aquellas que pueden ser tóxicas a la célula (Shimataka &
Rosenberg, 1981. Nature 292: 128).
La cepa de E. coli lisogénica AR58 usada
para la producción de la proteína
LPD-MAGE-3-His es un
derivado de la cepa de K12 de E. coli de NIH N99 patrón
(F-su- galK2, LacZ-thr). Contiene un
fago lambda lisogénico defectuoso (galE::TN10, 1
Kil-cI857 DH1). El fenotipo Kil previene el corte de
la síntesis macromolecular del huésped. La mutación cI857 confiere
una lesión sensible a la temperatura al represor cI. La supresión
DH1 retira el operón derecho del fago lambda y los loci bio, uvr3, y
chlA de huéspedes. La cepa AR58 se generó mediante transducción de
N99 con una disolución madre de fago lambda P desarrollada
previamente sobre un derivado SA500 (galE::TN10, 1
Kil-c-I857 DH1). La introducción de
lisogen defectuoso N99 se seleccionó con tetraciclina en virtud de
la presencia de un transposón TN10 que codifica resistencia a
tetraciclina en el gen adyacente galE. N99 y SA500 son cepas de
E. coli K12 derivadas del laboratorio del Dr. Martin
Rosenberg en el Instituto Nacional de Salud.
Los racional era expresar MAGE 3 como una
proteína de fusión que usa el tercio N-terminal de
la proteína D lipidada como una pareja de fusión conectada ¡en el
extremo N de MAGE-3 y una secuencia de varios
residuos de histidina (cola His9 colocada en el extremo C.
La proteína D es una lipoproteína (una proteína
de unión a la inmunoglobulina D de 42 kDa expuesta sobre la
superficie de la bacteria Gram-negativa
Haemophilus influenzae). La proteína se sintetiza como un
precursor con una secuencia señal de residuo de 18 aminoácidos, que
contiene una secuencia de consenso para la lipoproteína bacteriana
(documento WO 91/18926).
Cuando la secuencia señal de una lipoproteína se
procesa durante la secreción, la Cys (en la posición 19 en la
molécula precursora) llega a ser el residuo amino terminal y se
modifica de manera simultánea mediante unión covalente de ácidos
grasos tanto unidos por éster como unidos por amida.
Los ácidos grasos unido a al residuo cisteína
amino terminal entonces funcionan como un anclaje de
membra-
na.
na.
El plásmido que expresa la proteína de fusión se
diseñó para expresar una proteína precursora que contiene una
secuencia señal de 18 aminoácidos y los 109 restos primeros de la
proteína D procesada, dos aminoácidos no relacionados (Met y Asp),
restos de aminoácidos 2 a 314 de MAGE-3, dos
residuos Gly que funcionan como una región bisagra para exponer los
siete restos His posteriores.
La cepa recombinante de esta manera produce la
proteína de fusión con cola His lipidada procesada de 432 restos de
aminoácidos (véase la figura 1), con la secuencia de aminoácidos
descrita en ID No 1 y la secuencia codificadora se describe en ID Nº
2.
Se usaron un plásmido de ADNc (del Dr Thierry
Boon del Instituto Ludwig) que contiene la secuencia codificadora
para el gen MAGE-3 (Gaugler B et al., 1994),
y el vector PRIT 14586, que contiene la porción
N-terminal de la secuencia codificadora de
Lipo-D-1/3 (preparada como se
esquematiza en la figura 2). La estrategia de clonación incluía las
siguientes etapas (figura 3).
- a)
- - Amplificación de PCR de las secuencias presentadas en el plásmido MAGE del ADNc usando el oligonucleótidos de sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, y el oligonucleótido de sentido opuesto: 5' gcg tgct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa); esta amplificación conduce a las modificaciones siguientes en el extremo N: cambiando los cinco primeros codones al uso del codón de E. coli, reemplazo del codón Pro mediante un codón de Asp en la posición 1, instalación de un sitio NcoI en la extremidad 5' y finalmente la adición de dos codones 2 Gly y el codón de 7 His seguido de un sitio XbaI en el extremo C.
- b)
- - Clonación en el vector de clonación de TA de invitrogen del fragmento amplificado anteriormente y preparación del vector intermedio pRIT14647.
- c)
- - escisión del fragmento NcoI XbaI del plásmido pRIT14647 y clonación en el vector pRIT14586.
- d)
- transformación de la cepa huésped AR58.
- e)
- Selección y caracterización de los transformantes de la cepa de E. coli que contienen el plásmido pRIT 14477, que expresa la proteína de fusión LPD-MAGE-3-His.
Ejemplo
II
Células de AR58 transformadas con plásmido
pRIT14477 se desarrollaron en matraces de 2 litros, conteniendo cada
uno 400 ml de medio LY12 suplementado con extracto de levadura (6,4
g/l) y sulfato de kanamicina (50 mg/l). Después de la incubación
sobre una mesa en agitación a 30ºC durante 8 +/- 1 h, se retiró una
pequeña muestra de cada matraz para examen microscópico. El
contenido de los dos matraces se reunió proporcionando el inóculo
para el fermentador de 20 litros.
El inóculo (aproximadamente 800 ml) se añadió a
un fermentador preesterilizado de 20 litros (volumen total) que
contenía 7 litros de medio, suplementado con 50 mg/l de sulfato de
kanamicina. El pH se ajustó y se mantuvo a 6,8 mediante la adición
periódica de NH_{4}OH (25% v/v), y la temperatura se ajustó y se
mantuvo a 30ºC. La velocidad de aireación se ajustó y se mantuvo a
12 l de aire/minutos y la tensión de oxígeno disuelto se mantuvo a
50% de saturación mediante control por retroalimentación de la
velocidad de agitación. La sobrepersión en el fermentador se mantuvo
a 500 g/cm^{2} (0,5 bares (50 kPa)).
El cultivo por lote de alimentación se llevó a
cabo mediante la adición controlada de una solución de alimentación
de carbono. La solución de alimentación se añadió a una velocidad
inicial de 0,04 ml/min, y se incrementó de manera exponencial
durante las primeras 42 horas para mantener una velocidad de
crecimiento de 0,1 h^{-1}.
Después de 42 horas, la temperatura en el
fermentador se incrementó rápidamente hasta 39ºC, y la velocidad de
alimentación se mantuvo constante a 0,005 ml/g DCW/min durante la
fase de inducción durante 22-23 horas adicionales,
tiempo durante el que la expresión intracelular de
LPD-MAGE-3-His
alcanzó un máximo nivel.
Se tomaron alícuotas (15 ml) de caldo a
intervalos regulares a lo largo de las fases de
crecimiento/inducción y al final de la fermentación para seguir la
cinética de crecimiento microbiano y expresión del producto
intracelular y además, proporcionando muestras para ensayos de
identificación/pureza microbiana.
Al final de la fermentación, la densidad óptica
del cultivo estaba entre 80 y 120 (correspondiente a una
concentración de células de entre 48 y 72 g de DCW/L) y el volumen
de líquido total era aproximadamente 12 litros. El cultivo se
enfrió rápidamente hasta entre 6 y 10ºC, y las células de ECK32 se
separaron del caldo de cultivo mediante centrifugación a 5000 x g a
4ºC durante 30 minutos. Las células concentradas de ECK32 se
almacenaron rápidamente en bolsas de plástico y se congelaron
inmediatamente a -80ºC.
Las células congeladas de ECK32 se descongelaron
hasta 4ºC antes de que se volvieran a suspender en tampón de
rompimiento de células hasta una densidad óptica final de 60 (que
corresponde a una concentración de células de aproximadamente 36 g
de DCW/L).
Las células se rompieron mediante dos pases
mediante un homogeneizador de alta presión (1000 bares (100000
kPa)). La suspensión de células rotas se centrifugó (x 10000 g a 4ºC
durante 30 minutos) y la fracción sedimentada se lavó dos veces con
Triton x 100 (1% p/v) + EDTA (1 mM), seguido de un lavado con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) + Tween 20 (0,1% v/v) y
finalmente un lavado con PBS. Entre cada fase de lavado, la
suspensión se centrifugó a x 10000 g durante 30 minutos a 4ºC, el
sobrenadante se desechó y se retuvo la fracción sedimentada.
LPD-MAGE-3-His
se purificó del homogenato celular usando una secuencia de etapas
descritas más adelante:
- a)
- Solubilización de la fracción sedimentada lavada del rompimiento celular,
- b)
- reducción química de los enlaces disulfuro intra- e inter-proteína seguido de bloqueo de los grupos tiol para prevenir el reacoplamiento oxidante,
- c)
- microfiltración de la mezcla de reacción para la retirada de partículas y reducción de endotoxinas,
- d)
- captura y purificación primaria de LPD-MAGE-3-His mediante explotación de la interacción de afinidad entre la cola de polihistidina y Sepharose quelante cargada con cinc,
- e)
- retirada de las proteínas contaminantes mediante cromatografía de intercambio aniónico
La LPD-MAGE 3-His
purificada se sometió a un número de fases de refinamiento:
- f)
- intercambio de tampón/retirada de urea mediante cromatografía de exclusión de tamaño usando Superdex 75
- g)
- filtración en - proceso,
- h)
- intercambio de tampón/desalación mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando Sephadex G25.
Cada una de estas etapas se describen con más
detalle más adelante:
La fracción sedimentada de la fase de lavado
final (como se ha descrito anteriormente) se volvió a solubilizar
durante toda una noche en 800 ml de una solución de clorhidrato de
guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) a 4ºC.
El material solubilizado (una suspensión de color
amarillo claro, turbio) se purgó con argón para depurar cualquier
oxígeno restante, y se añadió una solución madre de
2-mercaptoetanol (14 M) para proporcionar una
concentración final de 4,3 M (que corresponde a 0,44 ml de
2-mercaptoetanol por ml de solución).
La solución resultante se dividió y se transfirió
en dos matrices de vidrio que se calentaron ambos hasta 95ºC en un
baño de agua. Después de 15 minutos a 95ºC, se retiraron los
matraces del baño de agua y se dejó enfriar, después el contenido se
reunió en un recipiente cubierto con una hoja delgada (5 l), se
colocó en hielo, y se añadió yodoacetamida sólida con mezcla
vigorosa proporcionando una concentración final de 6 M (que
corresponde a 1,11 g de yodo acetamida por ml de solución). La
mezcla se mantuvo en hielo en la oscuridad durante 1 hora para
asegurar la completa solubilización de la yodo acetamida, antes de
neutralizarse (manteniendo agitación vigorosa y control continuado
de pH) mediante la adición de aproximadamente 1 l de hidróxido
sódico (5 M) proporcionando un pH final de
7,5-7,8.
La mezcla resultante se mantuvo en hielo en la
oscuridad durante 30 minutos adicionales, después de lo cual el pH
se volvió a ajustar hasta pH de 7,5-7,8.
La mezcla se microfiltró en una unidad de flujo
tangencial Amicon Proflux M12 equipada con un cartucho de fibra
hueca Minikros (ref. Nº M22M-600.01N; 5600 cm^{2}
de área, 0,2 \mum). El permeato se retuvo para posterior
purificación cromatográfica.
La cromatografía por metales quelados se realizó
con Sepharose quelante FF (Pharmacia Biotechnology Nº de catálogo
17-0575-01) envasado en una columna
BPG 100/500 (Pharmacia Biotechnology Nº de catálogo
18-1103-01). Las dimensiones del
lecho envasado eran: diámetro 10 cm; área de la sección transversal
79 cm^{2}; altura del lecho 19 cm; volumen de envase 1500 ml. La
columna vacía se sanitizó con hidróxido de sodio (0,5 M), después se
lavó con agua purificada.
El soporte (distribuido en etanol al 20% v/v) se
lavó con agua purificada (8 litros) sobre un embudo Buchner (a
vacío) y se cargó con cinc pasando al menos 15 litros de una
solución de ZnCl_{2} (0,1 M). El exceso de cinc se retiró lavando
el soporte con 10 litros de agua purificada, hasta que el pH del
líquido de salida alcanzó el pH de la solución de ZnCl_{2} (pH
5,0). Después el soporte se equilibró con 4 litros de una solución
que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M,
pH 7,0).
El permeado de la microfiltración, que contenía
LPD-MAGE-3 His, se mezcló con el
soporte ((unión de lote), antes de cargar y envasar la columna de
BPG con la solución que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y
fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0).
Las fases siguientes de cromatografía por metal
quelado se llevaron a cabo a un caudal de eluyente de 60 ml/min. La
columna se lavó, primero con la solución que contenía clorohidrato
de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0), después con la
solución que contenía urea (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0),
hasta que el eluyente de la columna alcanzó absorbancia cero a
DO_{280} nm (línea base).
La fracción de proteína semipura de
LPD-MAGE-3-His se
eluyó con 2 volúmenes de columna de una solución que contenía urea
(6 M), fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) e imidazol (0,5 M). La
conductancia de esta fracción era aproximadamente 16 mS/cm.
Antes de continuar con la cromatografía de
intercambio aniónico, la conductancia de la fracción de proteína
semipura de
LPD-MAGE-3-His se
redujo hasta aproximadamente 4 mS/cm mediante dilución con una
solución que contiene urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM,
pH 8,0).
La cromatografía de intercambio aniónico se
realizó usando Q-Sepharose FF (Pharmacia
Biotechnology, nº de catálogo
17-0510-01) envasada en una columna
BPG 200/500 (Pharmacia Biotechnology, nº de catálogo
18-1103-11). Las dimensiones del
lecho envasado eran: diámetro 10 cm; área de la sección transversal
314 cm^{2}; altura del lecho 9 cm; volumen de envase 2.900
ml.
La columna se envasó (con etanol al 20% v/v) y se
lavó con 9 litros de agua purificada a un caudal de eluyente de 70
ml/min. La columna envasada se sanitizó con 3 liltros de hidróxido
de sodio (0,5 M), se lavó con 30 litros de agua purificada, después
se equilibró con 6 litros de una solución que contenía urea (6 M) y
Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). La
LPD-MAGE-3-His
diluida, semipurificada se cargó en la columna y después se lavó
con 9 litros de una solución que contenía urea (6 M),
Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) y Tween
(0,1%), hasta que la absorbancia (280 nm) del eluyente caía hasta
cero.
Se realizó una etapa de lavado adicional con 6
litros de una solución que contenía urea (6 M) y
Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).
La
LPD-MAGE-3-His
purificada se eluyó de la columna con una solución que contenía
urea (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) y NaCl (0,25
M).
La retirada de urea de la
LPD-MAGE-3-His
purificada y el intercambio de tampón se lograron ambos mediante
cromatografía por exclusión de tamaño. Esto se realizó usando
Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo
17-1044-01) envasada en una columna
XK 50/100 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo
18-8753-01) Las dimensiones del
lecho envasado eran: diámetro 5 cm; área de la sección transversal
19,6 cm^{2}; altura del lecho 90 cm; volumen envasado 1.800
ml.
La columna se envasó en etanol (20%) y se lavó
con 5 litros de agua purificada a un caudal de eluyente de 20
ml/min. La columna se sanitizó con 2 litros de hidróxido sódico (0,5
M), se lavó con 5 litros de agua purificada, después se equilibró
con 5 litros de solución salina tamponada con fosfato que contenía
Tween 80 (0,1% v/v).
La fracción de
LPD-MAGE-3-His
purificada (máximo 500 ml/desarrollo de desalado) se cargó en una
columna a un caudal de eluyente de 20 ml/min. La
LPD-MAGE-3-His
purificada desalada se eluyó de la columna con 3 litros de PBS que
contenía Tween 80 (0,1% v/v).
La fracción que contenía
LPD-MAGE-3-His se
eluyó hasta el volumen de vaciado de la columna.
La
LPD-MAGE-3-His a
granel de la cromatografía de exclusión por tamaño se filtró a
través de una membrana de 0,22 \mum en una campana de flujo
laminar (clase 10.000). El volumen filtrado se congeló hasta -80ºC y
se almacenó hasta la etapa de desalación.
Ya que la osmolalidad del volumen final debe ser
menor que 400 mOsM, se requería una etapa de intercambio de tampón
adicional para reducir la concentración de sal. Esto se realizó
mediante una etapa de cromatografía de desalación usando Sephadex
G25 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo
17-0033-02) envasada en una columna
BPG 100/950 (Pharmacia Biotechnology nº de catálogo
18-1103-03). Las dimensiones del
lecho envasado eran: diámetro 10 cm; área de la sección transversal
78,6 cm^{2}; altura del lecho 85 cm; volumen envasado 6.500
ml.
El Sephadex G25 se hidrató con 7 litros de agua
purificada y se dejó hinchar durante toda una noche a 4ºC. El gel se
envasó después en la columna con agua pura a una caudal de eluyente
de 100 ml/min.
La columna se sanitizó con 6 litros de hidróxido
sódico (0,5 M), después se equilibró con 10 litros de una solución
que contenía fosfato sódico (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) y Tween 80
(0,1% v/v).
La fracción de
LPD-MAGE-3-His
purificada (máximo 1500 ml/desarrollo de desalación) se cargó en la
columna a un caudal de eluyente de 100 ml/min. La fracción de
LPD-MAGE-3-His
purificada desalada eluida hasta el volumen de vaciado de la
columna, se filtró de manera estéril a través de una membrana de
0,22 \mum y se almacenó a -80ºC. La proteína a granel final se
descongeló hasta +4ºC antes de que se tomaran alícuotas en viales y
se secaron por congelación en un excipiente de lactosa (3,2%).
El antígeno de
LPD-MAGE-3-His
purificado se analizó mediante SDS-PAGE sobre un gel
de poliacrilamida al 12,5% en condiciones reductoras.
La carga de proteína era 50 \mug para la
tinción de azul Coomassie y 5 \mug para la tinción por nitrato de
plata. Se analizaron el lote clínico 96K19 y lote piloto 96J22. Se
visualizó una banda principal correspondiente a una de peso
molecular de 60kDa. También se observaron dos bandas adicionales
menores de aproximadamente 45 kDa y 35 kDa.
Los péptidos revelados mediante análisis de
SDS-PAGE de la proteína
LPD-MAGE-3-His se
identificaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos
monoclonales de ratón. Estos anticuerpos se desarrollaron en casa
usando una preparación purificada de la proteína
MAGE-3-His (esta proteína no
contiene la parte LPD de la
LPD-MAGE-3-His).
Se han seleccionado dos preparaciones de
anticuerpos monoclonales (Mab 22 y Mab 54) en base a la conveniencia
para análisis por transferencia de Western y se usaron en el ensayo
de identidad para la liberación del lote. La figura 4 muestra los
patrones de banda obtenidos para los lotes 96K19 y 96J22 después de
la tinción con Mabs 32 y 54. Se resolvieron 600 (600) ng de la
proteína sobre un SDS-PAGE al 12,5%, se
transfirieron a una membrana de nylon, se hicieron reaccionar con
Mabs 32 y 54 (60 \mug/ml) y se revelaron con anticuerpos
anti-ratón acoplados a peroxidasa.
Los péptidos de 60 kDa y 30 kDa detectados
mediante SDS-PAGE se revelaron mediante ambos
Mabs.
Ejemplo
IV
La vacuna usada en estos experimentos se produce
a partir de un ADN recombinante, que codifica una lipoproteína D
1/3-MAGE-3-His,
expresada en E. coli a partir de la cepa AR58, o bien
adyuvantada o no. Como un adyuvante, la formulación comprende una
mezcla de 3 de -O-acilado monofosforil lípido A
(3D-MPL) y QS21 en una emulsión aceite/agua. El
sistema adyuvante SBAS2 se ha descrito previamente en el documento
WO 95/17210.
3D-MPL: es un
inmunoestimulante derivado del lipopolisacárido (LPS) de la
bacteria Gram negativa Salmonella minnesota. MPL se ha
desacilado y carece de un grupo fosfato del resto del lípido A. El
tratamiento químico reduce notablemente la toxicidad mientras que
preserva las propiedades inmunoestimulantes (Ribi, 1986). La
inmunoquímica Ribi produce y suministra MPL a
SB-Biologicals. Los experimentos realizados en Smith
Kline Beecham Biologicals han mostrado que 3D-MPL
combinada con diversos vehículos potencia fuertemente tanto el tipo
humoral como el tipo TH1 de la inmunidad celular.
QS21: es una molécula de saponina natural
extraída de la corteza del árbol de Sur América Quillaja saponaria
molina. Una técnica de purificación desarrollada para separar las
saponinas individuales a partir de los extractos brutos de la
corteza, permitió el aislamiento de la saponina particular. QS21,
que es un glicósido de triterpeno que demuestra actividad adyuvante
más fuerte y menor toxicidad cuando se compara con el componente
precursor. QS21 se ha mostrado que activa las CTLs restringida de
clase I MHC a varias subunidades Ags, así como que estimula la
proliferación linfocítica específica de Ag (Kensil, 1992). Aquila
(formalmente Cambridge Biotech Corporation) produce y suministra
QS21 a SB-Biologicals.
Los experimentos realizados en SmithKline Beecham
Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de las
combinaciones de MPL y QS21 en la producción de respuestas inmunes
celulares tanto humorales como de tipo TH1.
La emulsión de aceite/agua se compone de
una fase orgánica hecha de 2 aceites (un tocoferol y un escualeno),
y una fase acuosa de PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La
emulsión comprendía 5% de escualeno 5% de tocoferol 0,4% de Tween
80 y tiene un tamaño medio de partícula de 180 nm y se conoce como
SB62 (véase el documento WO 95/17210).
Los experimentos realizados en SmithKline Beecham
Biologicals han probado que la adjunción de esta emulsión ac/ag a
3D-MPL/QS21 (SBAS2) incrementa adicionalmente las
propiedades inmunoestimulantes de esta última contra diversas
subunidades de antígenos.
Se disuelve Tween 80 en solución salina tamponada
con fosfato (PBS) proporcionando una solución al 2% en la PBS. Para
proporcionar 100 ml de la emulsión concentrada dos veces 5 g de DL
alfa tocoferol y 5 ml de escualeno se agitaron en un aparato vortex
para mezclar completamente. Se añaden 90 ml de solución PBS/Tween y
se mezcla concienzudamente. La emulsión resultante se pasa después a
través de una jeringa y finalmente se microfluidifica usando una
máquina de microfluidoficación M110S. Las gotas de aceite resultante
tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.
El adyuvante se formula en forma de una
combinación de MPL y QS21, en una emulsión aceite/agua. Esta
preparación se distribuye en viales de 0,7 ml a mezclar con el
antígeno liofilizado (viales que contienen entre 30 y 300 \mug de
antígeno).
La composición del diluyente de adyuvante para
la vacuna liofilizada es como sigue:
Ingredientes: | Cantidad (por dosis): | |
.Adyuvantes | ||
Emulsión Sb62: | 250 \mul | |
\hskip0.5cm - Escualeno | 10,7 mg | |
\hskip0.5cm - DL \alpha-tocoferol | 11,9 mg | |
\hskip0.5cm - Tween 80 | 4,8 mg | |
Monofosforil lípido A | 100 \mug | |
\hskip0.5cm QS21 | 100 \mug | |
Conservante | ||
\hskip0.5cm Tiomersal | 25 \mug | |
Tampón | ||
\hskip0.5cm Agua para inyección | c. s. ajust 0,5 ml | |
\hskip0.5cm - Fosfato sódico dibásico | 575 \mug | |
\hskip0.5cm Fosfato potásico monobásico | 100 \mug | |
\hskip0.5cm - Cloruro potásico | 100 \mug | |
\hskip0.5cm - \hskip0.2cm - Cloruro sódico | 4,0 mg |
La vacuna final se obtiene después de
reconstitución de la preparación de
LPD-MAGE-3-His
liofilizada con el adyuvante o con PBS solo.
Los controles de adyuvantes sin antígeno se
prepararon reemplazando la proteína por PBS.
La lipoproteína D es una lipoproteína expuesta
sobre la superficie de la bacteria Gram-negativa
Haemophilus influenzae
La inclusión de los 109 restos primeros de la
proteína D procesada como pareja de fusión se incorpora para
proporcionar el antígeno de vacuna con epítopes de células T. Además
del resto LPD, la proteína contiene dos aminoácidos no relacionados
(Met y Asp), restos de aminoácidos 2 a 314 de
Mage-3, dos restos Gly que funcionan como región
bisagra para exponer los siete restos His posteriores.
Ejemplo
V
Con el fin de ensayar la antigenicidad e
inmunogenicidad de la proteína MAGE-3 humana, la
vacuna candidato se inyectó en 2 cepas diferentes de ratones
(C57BL/6 y Balb/C), variando en sus antecedentes genéticos y alelos
MHC. Para ambas cepas de ratones, los motivos de péptido MHC
clase-I y MHC clase-II se predijeron
teóricamente para la parte MAGE de la proteína de fusión
LPD-MAGE-3-His.
5 ratones de cada raza se inyectaron dos veces a
intervalos de dos semanas en la almohadilla de la pata con 5 \mug
de LPD-MAGE-3-His,
formulada o no en SBAS2 a 1/10 de la concentración usada en las
situaciones humanas.
Los linfocitos se prepararon aplastando el bazo o
los ganglios linfáticos popliteales de los ratones, 2 semanas
después de la última inyección. Se colocaron 2 x 10^{5} células
por triplicado en placas de 96 pocillos y las células se volvieron a
estimular in vitro durante 72 horas con diferentes
concentraciones (1-0,1 \mug/ml) de
His-Mage 3 como tal o revestidas en microperlas de
látex.
Se observó un incremento de la actividad
linfoproliferativa específica de MAGE-3 tanto con
células de bazo (figuras 5 y 7) como con células de ganglios
linfáticos (véanse las figuras 6 y 8) a partir de ratones o bien
C57BL/6 o Balb/C inyectados con la proteína
LPD-MAGE-3-His,
cuando se compara con la respuesta linfoproliferativa de ratones que
recibían la formulación SBAS-2 sola o PBS.
Además, una respuesta proliferativa mayor se
obtuvo con linfocitos de ratones inmunizados con
LPD-MAGE-3-His en el
adyuvante SBAS2 (véanse las figuras 6 y 8).
LPD-MAGE-3-His
es inmunogénica en ratones, y esta inmunogenicidad se puede
incrementar mediante el uso de la formulación de adyuvante
SBAS2.
Ratones C57BL/6 o Balb/C se inmunizaron mediante
2 inyecciones dentro de la almohadilla de la pata a intervalos de
dos semanas con o bien PBS, o SBAS2, o 5 \mug de
LPD-MAGE-3-His, o 5
\mug de
LPD-MAGE-3-His +
SBAS2.
Se usaron tres y cinco animales en los grupos de
control y en los grupos ensayados respectivamente.
Dos semanas después de la segunda inyección, se
tomaron sueros individuales y se sometieron a un ELISA
indirecto.
2 \mug/ml de His MAGE 3 purificada se usó como
antígeno revestido. Después de la saturación durante 1 hora a 37ºC,
en PBS + suero de ternera recién nacida al 1%, los sueros se
diluyeron en serie (partiendo a 1/1000) en el tampón de saturación y
se incubaron durante toda una noche a 4ºC, o 90 minutos a 37ºC.
Después de lavar en PBS/Tween 20,0,1%, se usaron antisueros de IgG
total anti ratón de cabra biotinilado (1/1000) o IgG1, IgG2a, IgG2b
de anti-ratón de cabra (1/5000) como anticuerpos
secundarios. Después de 90 minutos la incubación a 37ºC. Se añadió
estreptavidina acoplada a peroxidasa, y se usó TMB (peróxido de
tetra-metil-bencidina) como
sustrato. Después de 10 minutos la reacción se bloqueó mediante la
adición de H_{2}SO_{4} 0,5 M, y se determinó la D. O.
La figura 9 compara entre los diferentes grupos
de ratones (N = 5/grupo), la titulación media del punto medio
relativa de los sueros, que consiste en la dilución media necesaria
para alcanzar el punto medio de las curvas.
Estos resultados muestran que en ambas razas de
ratones ensayadas, se observó una respuesta débil de Ab después de2
inyecciones de
LPD-MAGE-3-His sola,
pero se generaron concentraciones mayores de Ab anti- MAGE 3 cuando
se inyecta
LPD-MAGE-3-His en
presencia de SBAS2. De esta manera, solamente dos inyecciones de
LPD-MAGE-3-His +
SBAS2, a intervalos de 2 semanas, son suficientes para generar la
respuesta alta de Ab observada.
La mejor respuesta de Ab observada en los ratones
Balb/c cuando se compara con la respuesta obtenida en los ratones
C57BL/6 se puede explicar mediante diferencias en haplotipos o en
antecedentes entre estas 2 razas, incluso aunque la valoración de Ab
en ratones C57BL/6 es también mayor después de inyecciones de
LPD-MAGE-3-His +
SBAS2 que después de inyecciones con
LPD-MAGE-3-His
sola.
Las respuestas de
anti-MAGE-3 específica de las
subclases de Ig después de vacunaciones en los diferentes grupos de
ratones se puede observar en las figuras 10 y 11, que proporcionan
una comparación de la dilución media del punto medio del suero.
Ni IgA, ni IgM se detectaron en cualquiera de las
muestras de suero incluso de los ratones vacunados con
LPD-MAGE-3-His en el
adyuvante SBAS2.
Por el contrario, el nivel de IgG total era
ligeramente mayor en los sueros de ratones vacunados con
LPD-MAGE-3-His sola,
y aumentaba significativamente en el suero d animales inyectados con
LPD-MAGE-3-His en
SBAS2.
El análisis de las concentraciones diferentes de
subclases IgG muestran que se indujo respuesta de Ab mixta en los
ratones, ya que los niveles de todas las subclases de IgG ensayadas
(IgG1, IgG2a, IgG2b) eran mayores en ratones vacunados con Ag
adyuvantada que en ratones inyectados con la Ag o el adyuvante
solo.
La naturaleza de esta respuesta de Ab mixta con
LipoD-MAGE-3 en presencia de SBAS2
parece sin embargo depender de la raza de ratón, ya que IgG1 e IgG2b
se encontraron predominantemente en el suero de ratones Balb/c y
C57BL/6 respectivamente.
Se seleccionaron tres grupos de cinco animales
Rhesus (Macaca mulatta). RTS,S y gp 120 se usaron como
control positivo.
Grupos:
- Grupo 1
- pierna derecha: RTS,S/SBAS2
- \quad
- pierna izquierda: GP120/SBAS2
- Grupo 2
- pierna derecha: RTS,S/SB26T
- \quad
- pierna izquierda: GP120/SB26T
- Grupo 3
- pierna derecha: LipoD 1/3 Mage 3 His/SBAS2
Los animales recibieron vacuna el día 0 y se
reinmunizaron los días 28, y 84 y se extrajo sangre para determinar
su respuesta de anticuerpo para tanto MAGE 3 como el componente de
la proteína D. Las vacunas se administraron por vía intramuscular
como una inyección de bolo (0,5 ml) en la parte posterior de la
pierna derecha.
Se tomaron pequeñas muestras de sangre cada 14
días. Se recogieron muestras de sangre no heparinizada de 3 ml de la
vena femoral, se dejaron coagular durante al menos 1 hora y se
centrifugaron a temperatura ambiente durante 10 minutos a 2500
rpm.
Se retiró suero, se congeló a -20ºC y se envió
para determinación de los niveles de anticuerpo mediante ELISA
específico.
Se revistieron placas de 96 pocillos (maxisorb
Nunc) o bien con 5 \mug de His Mage 3 o Proteína D durante toda
una noche a 4ºC. Después de 1 hora de saturación a 37ºC con PBS NCS
1%, se añadieron diluciones en serie del suero de conejo durante 1
hora a 37ºC (partiendo de 1/10), después de 3 lavados en PBS Tween,
se añadió suero biotinilado anti conejo (Amerham ref RPN 1004 lote
88) (1/5000). Las placas de lavaron y se añadió estreptavidina
acoplada a peroxidasa (1/5000) durante 30 minutos a 37ºC. Después de
lavar, se añadieron 50 \mul de TMB (BioRad) durante 7 minutos y se
detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,2 M, se midió la DO a 450
nm. Las diluciones de punto medio se calcularon mediante
SoftmaxPro.
Se tomaron muestras pequeñas de sangre cada 14
días para seguir la cinética de la respuesta de anticuerpos a Mage 3
mediante ELISA. Los resultados indican que después de una inyección
de LPD1/3 Mage 3 His + SBAA2, la valoración de Ig total específica
de Mage 3 era baja, se observó un estímulo claro en 3 de los 5
animales después de una segunda y tercera inyección de LipoD 1/3
Mage 3 + adyuvante en los mismos monos. Los respondedores pobres
permanecían negativos después de 3 inyecciones. 28 días después de
II o después de III, las valoraciones de anticuerpos han retornado a
los niveles basales. La subclasé de estos anticuerpos se determinó
como IgG predominantemente y no IgM. El cambio a IgG sugiere que se
ha desencadenado una respuesta de auxiliar T. La respuesta de
anticuerpo específica de la proteína D, aunque más débil, es
exactamente paralela a la respuesta de anticuerpo
Mage 3.
Mage 3.
Ejemplo
VI
Se preparó LPD-MAGE 1 His de una
manera análoga. Las secuencias de aminoácidos y ADN se muestran en
las SECUENCIAS ID números 3 y 4. La proteína resultante se purificó
de una manera análoga a la proteína
LPD-MAGE-3-His. En
resumen, el cultivo celular se homogeneizó y se trató con guanidina
HCl 4 M y beta mercaptoetanol 0,5 M en presencia de detergente
Empigen al 0,5%. El producto se filtró y se trató el permeado con
yodo acetamida 0,6 M. Las fracciones carboxiamidadas se sometieron a
cromatografía IMAC (quelato de cinc-sepharose FF).
Primero la columna se equilibró primero y se lavó con una solución
que contenía guanidina HCl 4 M, y fosfato sódico (20 mM, pH 7,5) y
Empigen al 0,5%, después la columna se lavó con una solución que
contenía urea 4 M en fosfato sódico (20 mM, pH 7,5) 0,5% de tampón
Empigen. La proteína se eluyó en el mismo tampón, pero con
concentración creciente de Imidazol (20 mM, 400 mM y 500 mM).
El eluato se diluyó con urea 4 M. La columna de
Q-sepharose se equilibró y se lavó con urea 4 M en
tampón fosfato 20 mM (pH 7,5) en presencia de Empigen al 0,5%. Se
realizó un segundo lavado en el mismo tampón, pero desprovisto de
detergente. La proteína se eluyó en el mismo tampón pero con
Imidazol creciente (150 mM, 400 mM, 1 M). El eluato se ultra
filtró.
Ejemplo
VII
El diseño de la proteína de fusión NS1,
-MAGE-3-His a expresar en E.
coli se describe en la figura 12.
La estructura primaria de la proteína resultante
tiene la secuencia expuesta en ID Nº 5.
La secuencia codificadora (ID Nº 6)
correspondiente al diseño de proteína anterior se colocó bajo el
control del promotor \lambdapL en un plásmido de expresión de
E. coli.
El material de partida era un plásmido de ADNc
recibido del Dr Tierra Boon del Instituto Ludwig, que contiene la
secuencia codificadora para el gen MAGE-3 y el
vector PMG81, que contiene los 81 aa de la región codificadora de
NS_{1} (proteína no estructural) de Influenza.
La estrategia de clonación esquematizada en la
figura 13 incluía las siguientes etapas:
- a)
- amplificación de PCR de las secuencias presentadas en el plásmido MAGE-3 del ADNc usando el oligonucleótido de sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, y el oligonucleótido de sentido opuesto 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa.
Esta amplificación conduce a las siguientes
modificaciones en el extremo N: cambiando los cinco primeros codones
al uso del codón de E. coli, reemplazo del codón Pro por un
codón Asp en la posición 1, la instalación de un sitio NcoI en el
extremo 5' y finalmente la adición de los 2 codones Gly y el codón 7
His seguido de un sitio XbaI en el extremo C.
- b)
- Clonación en el vector de clonación TA de invitrogen del fragmento amplificado anterior y preparación del vector intermedio pRIT14647
- c)
- Escisión del fragmento NcoI XbaI del plásmido pRIT14647 y clonación en el vector pRIT PMG81
- d)
- transformación de la cepa huésped AR58
- e)
- selección y caracterización de los transformantes de la cepa de E. coli que contienen el plásmido pRIT14426 (véase la figura 14) que expresa la proteína de fusión NS1-MAGE-3-His
Se desarrollaron bacterias sobre el medio LB
suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el
cultivo había alcanzado la DO = 0,3 (a 620 nm), la inducción por
calor se logró elevando la temperatura hasta 42ºC.
Después de 4 horas de inducción, se recogieron
las células, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron (mediante
disgregación) presionando tres veces en la prensa francesa. Después
de centrifugación (60 minutos a 100.000 g), el sobrenadante
sedimentado y el extracto total se analizaron mediante
SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles
teñidos con Coomassie B1 donde las proteínas de fusión representaban
aproximadamente 1% de las proteínas totales de E. coli. La
proteína recombinante aparecía en una sola banda con un peso
molecular aparente de 44,9 K. La proteína de fusión se identificó
mediante análisis de transferencia de Western usando
anti-NS1 monoclo-
nal.
nal.
Ejemplo
VIII
La purificación de NS1-MAGE
3-His (E. coli) para inmunización de
conejo/ratón.
Esquema de purificación:
Se usó el siguiente esquema de purificación para
purificar el antígeno:
- Lisis de células + centrifugación
- \downarrow
- Solubilización de antígeno + centrifugación
- \downarrow
- Ni^{2} + -NTA agarosa
- \downarrow
- Concentración
- \downarrow
- Prep. cell
- \downarrow
- Precipitación de TCA y solubilización en PBS
Se lisaron células bacterianas (23 g) en 203 ml
de un tampón de PO_{4} pH 7 50 mM mediante Rannie (homogeneizador)
y el lisado se centrifugó en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 30
minutos.
Se desechó el sobrenadante.
1/3 del sedimento se volvió a suspender en O/N a
4ºC en 34 ml de PO_{4} 100 mM GuHCl 6 M GuHCl pH 7. Después de la
centrifugación en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 30 minutos,
el sedimento se desechó y el sobrenadante se purificó mediante
IMAC.
Volumen de columna: 15 ml (16 mm x 7,5 cm)
Tampón de envasado: PO_{4} 0,1
M-GuHCl 6 M pH 7
Tampón de muestra: idem
Tampón de lavado: PO_{4} 0,1
M-GuHCl 6 M pH 7
\hskip2.7cmPO_{4} 0,1 M-urea 6 M pH 7
Elución: gradiente de imidazol (0 \rightarrow
250 mM) en tampón PO_{4} 0,1 M pH 7 suplementado con urea 6 M.
Caudal: 2 ml/min
Fracciones positivas de antígeno del eluato IMAC
(160 ml) se reunieron y se concentraron hasta 5 ml en una celda
agitada por Amicon sobre una membrana Filtron (tipo Omega corte
10.000). La pureza a esta fase es aproximadamente 70% como se estima
por SDS-PAGE.
2,4 ml de la muestra concentrada se sometió a
ebullición en 0,8 ml de tampón de muestra reductora y se cargó en un
gel de acrilamida al 10%. El antígeno se eluyó en un tampón
Tris-glicina pH 8,3 suplementado con SDS al 4% y se
reunieron fracciones positivas de Ns_{1} -MAGE 3 His.
El antígeno se precipitó por TCA y después de la
centrifugación en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 20 minuto, el
sobrenadante se desechó. El sedimento se volvió a solubilizar en
tampón PBS pH 7,4.
La proteína es soluble en PBS después de que la
congelación/descongelación no muestra ninguna degradación cuando se
almacena durante 3 horas a 37ºC y tiene un peso molecular aparente
de aproximadamente 50.000 Daltons como se determina por SDS (12,5%
de PAGE).
Ejemplo
IX
El diseño de la proteína de fusión
Clyta-Mage-1-His a
expresar en E. coli se describe en la figura 15.
La estructura primaria de la proteína resultante
tiene la secuencia expuesta en la secuencia ID Nº 7.
La secuencia codificadora (véase la SECUENCIA ID
Nº 8) correspondiente al diseño de proteína anterior de colocó bajo
el control del promotor \lambda pL en un plásmido de expresión de
E. coli.
El material de partida era el vector PCUZ1 que
contiene los 117 codones C terminales de la región codificadora de
LytA de Streptococcus pneumoniae y el vector pRIT14518, en el
que previamente se había subclonado el ADNc del gen
MAGE-1 de un plásmido recibido del Dr Thierry Boon
del instituto Ludwig.
La estrategia de clonación para la expresión de
la proteína CLYTA- Mage-1-His
(véase el esquema de la figura 16) incluía las siguientes
etapas:
a) La primera etapa era una amplificación de PCR,
destinada a flanquear las secuencias de CLYTA con los sitios de
restricción NdeI-AfIII. La amplificación de PCR se
realizó usando el plásmido PCUZ1 como molde y como cebadores el
oligonucleótido de sentido: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa
cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, y el oligonucleótido de
sentido opuesto: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG.
Esto conduce a la amplificación de una secuencia de CLYTA de 378
nucleótidos.
b) La segunda etapa era la unión de las
secuencias de CLYTA a las secuencias
MAGE-1-His, para generar la
secuencia codificadora para la proteína de fusión. Esta etapa
incluía la escisión de un fragmento NdeI-AfIIII
Clyta e inserción en el vector pRIT14518 abierto previamente
mediante las enzimas de restricción NdeI y NcoI (NcoI y AfIIII
compatible) y dio lugar al plásmido pRIT14613.
c) Transformación de la cepa huésped AR58
d) Selección y caracterización del transformante
de E. coli (resistente a KAN) que contiene el plásmido
pRIT14613. (Véase la figura 16).
Las bacterias se desarrollaron en un medio LB
suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el
cultivo había alcanzado una DO = 0,3 (a 620 nm), la inducción por
calor se logró elevando la temperatura a 38ºC.
Después de 4 horas de inducción, las células se
recogieron, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron (mediante
disgregación) por un disparo. Después de la centrifugación, el
sobrenadante sedimentado y extracto total se analizaron mediante
SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles
teñidos por Coomassie B1, cuando la proteína de fusión representaba
aproximadamente el 1% de las proteínas totales de E. coli. La
proteína recombinante aparecía en una sola banda con un peso
molecular aparente de aproximadamente 49 kD. La proteína de fusión
se identificó mediante análisis de transferencia de Western usando
anticuerpos policlonales
anti-Mage-1.
Un fragmento de restricción
EcoRI-NCO_{1} que contiene el promotor pL largo y
una parte de las secuencias CLYTA se preparó a partir del plásmido
pRIT DVA6 y se insertó entre los sitios
EcoRI-NCO_{1} del plásmido pRIT14613.
Se obtuvo el plásmido recombinante pRIT14614.
El plásmido recombinante pRIT14614 (véase la
figura 17) que codifica la proteína de fusión
CLYTA-Mage-1-His se
usó para transformar AR120 de E. coli. Se seleccionó y se
caracterizó una cepa candidata resistente a Kan.
Se desarrollaron bacterias en medio Lb
suplementado con 50 mg/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el cultivo
había alcanzado una DO = 400 (a 620 nm) se añadió ácido nalidíxico
hasta una concentración final de 60 mg/ml.
Después de 4 horas de inducción, se recogieron
las células, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron mediante
disgregación (tipo de "un disparo" de CLS de disgregación).
Después de la centrifugación, el sobrenadante sedimentado y el
extracto total se analizaron mediante SDS-PAGE. Las
proteínas se visualizaron en geles teñidos por azul Comassie, cuando
la proteína de fusión representaba aproximadamente 1% de las
proteínas totales de E. coli. La proteína de fusión se
identificó mediante análisis de transferencia de Western usando
anticuerpos policlonales anti-Mage-1
de conejo. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con
un peso molecular aparente de aproximadamente 49 kD.
Ejemplo
X
A: Antígeno recombinante de rechazo de tumores:
una proteína de fusión
CLYTA-Mage-3-His
cuando la pareja de fusión de C-lyt A condujo a la
expresión de una proteína soluble, actúa como marca de afinidad y
proporciona un auxiliar T útil.
Preparación de la cepa de E. coli que
expresa una proteína de fusión
CLYTA-MAGE-3-cola
His
Construcción del plásmido de expresión pRIT14646
y transformación de la cepa huésped AR 120:
El diseño de la proteína de fusión
Clyta-Mage-3-His a
expresar en E. coli se describe en la figura 18.
La estructura primaria de la proteína resultante
tiene la secuencia descrita en la SECUENCIA ID nº 9 y la secuencia
codificadora en la secuencia ID Nº 10.
La secuencia codificadora correspondiente al
diseño de proteína anterior se colocó bajo el control del promotor
\lambda pL en un plásmido de expresión de E. coli.
El material de partida era el vector PCUZ1 que
contiene los 117 codones C terminales de la región que codifica LytA
de Streptoccocus pneumoniae, descrita en Gene 43, (1986) p.
265-272 y el vector pRIT14426, en el que los
inventores han subclonado previamente el ADNc del gen de
MAGE-3 a partir de un plásmido recibido del Dr
Tierra Boon del Instituto Ludwig.
La estrategia de clonación para la expresión de
la proteína
CLYTA-MAGE-3-His
(véase el esquema en figura 19) incluía las siguientes etapas
1.1 La primera etapa era una amplificación de
PCR, destinada a flanquear las secuencias CLYTA con los sitios de
restricción AflII y AflIII. La amplificación de PCR se realizó
usando el plásmido PCUZ1 como molde y como cebadores el
oligonucleótido de sentido: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa
cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, y el oligonucleótido de
sentido opuesto: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt
ctg cca gtg. Esto conduce a la amplificación de una secuencia CLYTA
de 427 nucleótidos de longitud. El fragmento amplificado
anteriormente se clonó en el vector de clonación TA de Invitrogen
para conseguir el vector intermedio pRIT14661.
1.2 La segunda etapa era la unión de las
secuencias CLYTA a las secuencias
MAGE-3-His, para generar la
secuencia codificadora para la proteína de fusión. Esta etapa
incluye la escisión de un fragmento Afl
II-Afl-III Clyta e inserción en el
vector pRIT14426 abierto previamente mediante las enzimas de
restricción Afl II y NcoI (NcoI y AfIII compatible) y dio lugar al
plásmido pRIT14662.
Un fragmento de restricción
BgIII-XbaI que contenía el promotor pL corto y las
secuencias codificadoras
CLYTA-Mage-3-His se
preparó a partir del plásmido pRIT14662, y se insertó entre los
sitios BglII-XbaI del plásmido TCM67 (un derivado de
pBR322 que contiene la resistencia a ampicilina, y el promotor
\lambda pL largo, descrito en la solicitud internacional
PCT/EP92/O1827). Se obtuvo el plásmido pRIT14607.
El plásmido pRIT14607 recombinante que codifica
la proteína de fusión
Clyta-Mage-3-His
se usó para transformar AR 120 de E. coli (Mott et
al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, 82: 88). Una cepa candidata
resistente a ampicilina se seleccionó y caracterizó.
Finalmente se construyó un plásmido similar a
pRIT 14607 pero que tenía la selección de kanamicina (pRIT
14646)
Se desarrollaron las bacterias sobre un medio LB
suplementado con 50 mg/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el cultivo
había alcanzado una DO = 400 (a 600 nm) se añadió ácido nalidíxico
hasta una concentración final de 60 \mug/ml.
Después de 4 horas de inducción, se recogieron
las células, se volvieron a suspender en PBS y se lisaron mediante
disgregación (tipo de "un disparo" de CLS de disgregación).
Después de la centrifugación, el sobrenadante sedimentado y el
extracto total se analizaron mediante SDS-PAGE. Las
proteínas se visualizaron en geles teñidos con azul Coomassie,
cuando la proteína de fusión representaba aproximadamente el 1% de
las proteínas totales de E. coli. La proteína de fusión se
identificó mediante análisis de transferencia de Western usando
anticuerpos policlonales anti-Mage-3
de conejo. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con
un peso molecular aparente de aproximadamente 58 kD.
Ejemplo
XI
Las bacterias recombinantes AR120 (pRIT 14646) se
desarrollaron en un fermentador de 20 litros en condiciones de
alimentación por lote a 30ºC. La expresión de la proteína
recombinante se indujo añadiendo ácido nalidíxico a una
concentración final de 60 \mug/ml. Las células se recogieron al
final de la fermentación y se lisaron a 60 DO/600 mediante dos pases
a través de un disgregador de prensa francesa (20.000 psi (137895
kPa)). Las células lisadas se centrifugaron 20 minutos a 15000 g a
4ºC. El sobrenadante que contiene la proteína recombinante se cargó
en resina de intercambio de DEAE Sepharose CL6B (Pharmacia)
preequilibrada en NaCl 0,3 M, Tris HCl 20 mM pH 7,6 tampón A.
Después de un lavado de columna con tampón A, la proteína de fusión
se eluyó mediante 2% de colina en (Tampón A). Se reunieron las
fracciones de antígeno positivas como reveló análisis de
transferencia de Western usando un anticuerpo anti
Mage-3. El antígeno eluido con DEAE se llevó hasta
0,5% de Empigen BB (un detergente bipolar) y a NaCl 0,5 M antes de
cargar en una columna de cromatografía de afinidad de iones
metálicos preequilibrada en 0,5% de Empigen BB, NaCl 0,5 M, tampón
fosfato 50 mM pH 7,6 (tampón B).
La columna de IMAC se lavó con tampón B hasta que
la absorbancia a 280 nm alcanzó la línea base. Un segundo lavado en
tampón B sin Empigen BB (tampón C) con el fin de eliminar el
detergente se ejecutó antes de la elución del antígeno mediante un
gradiente de imidazol imidazol 0-250 mM en tampón
C.
Se reunieron las fracciones de imidazol
0,090-0,250 M, se concentraron en una membrana
Filtron omega de 10 kDa antes de la diálisis frente a tampón
PBS.
Los inventores han demostrado que la proteína de
fusión LPD-MAGE3-His es inmunogénica
en ratones, y que esta inmunogenicidad (la respuesta proliferativa y
respuesta de anticuerpo) se puede incrementar adicionalmente
mediante el uso del adyuvante descrito anteriormente. La
purificación se puede potenciar derivatizando los tioles que forman
enlaces disulfuro.
Los inventores han demostrado que una mejor
respuesta de anticuerpo se desencadenó mediante la vacunación con
LPD-MAGE-3-His en
presencia del adyuvante. El isotipo predominante encontrado en el
suero de C57BL/6 que es IgG2b sugiere que se alcanzó una respuesta
inmune de tipo TH1.
En el ser humano, el escenario clínico de un
paciente tratado con LPD-MAGE3-His
en una formulación no adyuvantada se limpió de melanoma.
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3511 (1984).
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- Fuijie T et al, Ann Oncol
1997 Apr, 8 (4): 369-72.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: SmithKline Beecam Biologicals
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: SmithKline Beecham
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2 New Horizons Court, Great West Road, B
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Middx
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: TW8 9EP
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFROMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dalton, Marcus J
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 245126
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 0181 9756348
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 0181 9756177
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 452 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1353 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1341 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 466 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 404 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1212 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 445 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1338 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 454 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1362 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Un derivado de antígenos asociado a tumores de
la familia MAGE en el que el derivado comprende residuos de tiol
derivatizados.
2. Un antígeno según la reivindicación 1 en el
que los tioles libres derivatizados están carboxiamidados o
carboximetilados.
3. Un antígeno según las reivindicaciones 1 y 2
en el que el antígeno comprende una pareja de fusión seleccionada
entre proteína D o un derivado de la proteína D que comprende
aproximadamente el primer 1/3 de la proteína D.
4. Un antígeno según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que el antígeno comprende una marca de
afinidad.
5. Un antígeno según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que la proteína D o dicho derivado del
mismo está lipidado.
6. Un antígeno según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en el que la proteína MAGE se selecciona
entre el grupo:
MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE
A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE
B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 y MAGE C2.
7. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 3 a
6.
8. Un vector que comprende un ácido nucleico de
la reivindicación 7.
9. Una célula huésped transformada con un ácido
nucleico de la reivindicación 7 o un vector de la reivindicación
8.
10. Una vacuna que contiene una proteína según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ácido nucleico según
la reivindicación 7.
11. Una vacuna según la reivindicación 10 que
comprende adicionalmente un adyuvante, y/o citoquina o quimioquina
inmunoestimuladora.
12. Una vacuna según la reivindicación 10 u 11 en
la que la proteína se presenta en un vehículo en emulsión aceite en
agua o agua en aceite.
13. Una vacuna según la reivindicación 11 ó 12 en
la que el adyuvante comprende 3D-MPL, QS21 o un
oligonucleótido CpG.
14. Una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 que comprende adicionalmente uno o más
otros antígenos.
15. Una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 para uso en medicina.
16. Uso de un antígeno según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 o ácido nucleico según la reivindicación 7
para la fabricación de una vacuna para tratar inmunoterapéuticamente
un paciente que sufre de melanomas u otros tumores asociados a
MAGE.
17. Un procedimiento para la purificación de una
proteína MAGE o fusión MAGE de la misma en la que dicha fusión de
MAGE contiene una pareja de fusión inmunológica que proporciona
epítopes de auxiliares T, que comprende la reducción de los enlaces
disulfuro, bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo
bloqueante, y someter el derivado resultante a una o más etapas de
purificación cromatográficas.
18. Un procedimiento para la producción de una
vacuna, que comprende las etapas de purificar una proteína MAGE o
fusión de MAGE de la misma en la que dicha fusión de MAGE contiene
una pareja de fusión inmunológica que proporciona epítopes
auxiliares T, mediante el procedimiento de la reivindicación 17 y
formular la proteína resultante como una vacuna.
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