CZ298364B6 - Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci - Google Patents

Abstract

Podstatu rešení tvorí derivát antigenu asociovaného s nádory z rodiny MAGE, vybraný ze skupiny antigenu MAGE, obsahujících derivatizované thiolové zbytky. Antigen muže mít formu fúzního proteinu. Rešení se týká také nukleové kyseliny, kódující tentoantigen, vektoru, který ji obsahuje nebo hostitelské bunky, která je takovou kyselinou nebo vektorem transformována. Soucástí rešení je také príslušná vakcina. Popisuje se rovnež použití antigenu nebo nukleové kyseliny pro výrobu vakciny, cištení antigenu a zpusob výroby vakciny.

Description

Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MÁGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kódující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fuzních proteinů a prostředků pro vakcinaci

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká proteinových derivátů obsahujících antigeny asociované s nádory, které mohou být použitelné při protinádorové vakcinaci. Přesněji, deriváty podle předkládaného vynálezu zahrnují fúzní proteiny obsahující antigen kódovaný rodinou MÁGE genů (například MAGE-3, MAGE-1) navázaný a imunologický fúzní partner, který dodává epitopy pro T-pomocné lymfocyty, jako je například lipidová forma proteinu D z Haemophilus influenzae B; chemicky modifikované MÁGE proteiny, ve kterých jsou disulfidové můstky redukovány a vzniklé thioly jsou blokovány a geneticky modifikované MÁGE proteiny opatřené afinitní koncovou a/nebo geneticky modifikované tak, aby bylo zabráněno tvorbě disulfidových můstků. Také jsou popsány způsoby pro přečištění MÁGE proteinů a pro přípravu vakcin pro léčbu různých zhoubných nádorů, včetně například melanomu, karcinomu prsu, plic, MSCLC, spinocelulámích karcinomů hlavy a krku, karcinomu tlustého střeva a karcinomu jícnu.

Dosavadní stav techniky

Antigeny kódované rodinou MÁGE genů jsou exprimovány především na melanomových buňkách (včetně buněk maligního melanomu) a na buňkách některých jiných nádorů včetně NSCLC (nemalobuněčného karcinomu plic), spinocelulámího karcinomu hlavy a krku, uroteliálního karcinomu močového měchýře a karcinomu jícnu, ale nejsou detekovatelné na normálních tkáních s výjimkou varlat a placenty (Gaugler, 1949; Weynants, 1949, Patard, 1995). MAGE-3 je exprimován v 69 % melanomu (Gaugler, 1994) a může být také detekován ve 44 % případů NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48 % případů spinocelulámího karcinomu hlavy a krku, 34 % případů ureteliálního karcinomu močového měchýře, 57 % případů karcinomu jícnu, 32 % případů karcinomu tlustého střeva a 24 % případů karcinomu prsu (Van Pel, 1995; Inoue, 1995; Fujie, 1997; Nishimura, 1997). Nádory exprimující MÁGE proteiny jsou známé jako nádory asociované s MÁGE.

Imunogenicita lidských melanomových buněk byla elegantně prokázána v pokusech využívajících smíšených kultur melanomových buněk a autologních lymfocytů. Tyto kultury často vytvářejí specifické cytotoxické T-lymfocyty (CTL) schopné lyžovat výlučně autologní melanomové buňky, ale ne autologní fibroblasty ani autologní lymfocyty transformované EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Nyní bylo identifikován několik antigenů rozpoznávaných na autologních melanomových buňkách těmito CTL klony, včetně antigenů MÁGE rodiny.

První antigen, který mol být definován pomocí rozpoznávání specifickými CTL na autologní melanomových buňkách, je označen MZ2-E (Van den Eynde, 1989) a je kódován genem MAGE-1 (van der Bruggne, 1991). CTL namířené proti MZ2-E rozpoznávají a lyžují MZ2-E pozitivní autologní melanomové buňky, stejně jako buňky od jiných pacient, pokud mají tyto buňky HLA.A1 alelu.

MAGE-1 gen náleží do rodiny 12 blízce příbuzných gen, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12, umístěných na chromosomu X a majících 64 až 85% vzájemnou homologii v kódujících sekvencích (De Plean, 1994). Tyto jsou někdy označovány jako MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12 (MÁGE A rodina). Dvě další skupiny proteinů také náleží do MÁGE rodiny, ačkoliv jsou příbuzné o něco méně. Tyto patří do MÁGE B a MÁGE C rodiny. MÁGE B rodina zahrnuje MÁGE BI (též známý jako MÁGE Xpl a

-1CZ 298364 B6

DAM 10), MÁGE B2 (též známý jako MÁGE Xp2 a DAM6), MÁGE B3 a MÁGE B4 - MÁGE C rodina v současnosti zahrnuje MÁGE Cl a MÁGE C2. Obecně může být MÁGE protein definován jako protein obsahující specifickou jadernou sekvenci umístěnou v oblasti C-konce proteinu (například pro M AGE Al protein o 309 aminokyselinách odpovídá specifická jaderná sekvence aminokyselinách 195-279).

Společná specifická jaderná sekvence může být zapsána následujícím způsobem, kde x představuje jakoukoliv aminokyselinu, zbytky uvedené malými písmeny jsou konzervované (konzervativní varianty jsou možné) a zbytky uvedené velkými písmeny jsou zcela konzervované.

Specifická jaderná sekvence:

LixvL (2x)I(3x)g(2x) apEExiWexl (2x)m(3^x)Gxe (3-4x)Gxe (3-4x)gxp (2x)l lt (3x) VqexYLxYxqVPxsxP (2x) yeFLWGprA (2x)Et(3x) kv

Konzervativní substituce jsou dobře známé a obyčejně jsou zadávány jako chybové skorovací matrice v počítačových programech pro seřazování sekvencí. Mezí tyto programy patří PAM250 (Dayhofit M.O. et al, (1978) „A model of evolutionary changes in proteins“, v „Atlas of Protein sequence and structure“, 5(3) M.O. Dayhort (ed.) 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, a Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G, Henikoft (1992), „Amino acid substitution matrices from protein blocks“), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

Obecně, substituce v následujících skupinách jsou konzervativní substituce, ale substituce mezi skupinami jsou považovány za nekonzervativní substituce. Těmito skupinami jsou:

(i) aspertat/asparagin/glutamat/glutamin;

(ii) serin/threonin;

(iii) lysin/arginin;

(iv) fenylalanin/tyrosin/tryptofan;

(v) leucin/izoleucin/valin/methionin;

(vi) glycin/alanin.

Obecně a v kontextu předkládaného vynálezu bude MÁGE protein přibližně z 50% identický v tomto jaderném regionu s aminokyselinami 195-279 MÁGE Al.

Na MAGE-3 proteinu bylo identifikováno několik CTL epitopů. Jeden takový epitop, MAGE-3.A1, je nepeptidová sekvence umístěná mezi aminokyselinami 168 a 176 MAGE-3 proteinu, která tvoří epitop specifický pro CTL, pokud je presentována společně s MHC molekulou třídy 1 HLA.A1. Nově byly identifikována další CTL epitopy na peptidové sekvenci MAGE3 proteinu podle své schopnosti vyvolat CTL odpověď ve smíšené kultuře melanomových buněk a autologních lymfocytů. Tyto dva epitopy mají specifické vazebné motivy pro HLA.A2. (Van der Bruggen, 1994) a HLA.B44 (Herman, 1996) alely, v příslušném pořadí.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří derivát antigenů asociovaného s nádory z rodiny MÁGE, vybraný ze skupiny antigenů MÁGE, obsahujících derivatizované thiolové zbytky.

V jednom provedení předkládaného vynálezu je derivátem fúzní protein obsahující antigen z MÁGE proteinové rodiny navázaný na heterologní fúzní partner. Proteiny mohou být chemicky konjugované, ale výhodněji jsou exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny umožňující vyšší úroveň produkce v expresním systému ve srovnání s non-fúzními proteiny. Fúzní partner může napomáhat dodáváním epitopů pro T-pomocné lymfocyty (imunologický fúzní partner), výhodně epitopy pro T-pomocné lymfocyty rozpoznávané člověkem, nebo může napomáhat v expresi proteinu (zesilovač exprese) ve vyšším množství ve srovnání s přirozeným rekombi

-2CZ 298364 B6 nantním proteinem. Výhodně je fúzní partner jak imunologickým fúzním partnerem, tak zesilovačem exprese.

Ve výhodném provedení vynálezu je imunologický fúzní partner odvozen od proteinu D, povrchového proteinu gram-negativní bakterie Haemophilus influenzae B (WO 91/18926). Výhodně obsahuje derivát proteinu D přibližně první 1/3 proteinu, přesněji přibližně prvních 100-110 N-koncových aminokyselin. Výhodně je derivát proteinu D lípidovaný. Výhodně je prvních 109 zbytků fúzního partnera tvořeného lipoproteinem D obsaženo na N-konci pro dodání potenciálního vakcinačního antigenů s dalšími exogenními epitopy pro T-lymfocyty a tento fúzní partner zvyšuje expresi v E. coli (takže působí jako zesilovač exprese). Lipidový konec zajišťuje optimální presentaci antigenů buňkám presentujícím antigen.

Mezi další fúzní partnery patří nestrukturální protein z chřipkového viru, NS1 (hemagglutinin). Obvykle je použito 81 N-terminální aminokyselin, ačkoliv mohou být použity jiné fragmenty, pokud obsahují epitopy pro T-lyfocyty.

V jiném provedení je imunologickým fúzním partnerem protein známý jako LYTA. Výhodně je použita C-koncová část molekuly. LYTA je odvozen od Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alanin amidasu, amidasu LYTA (kodovanou lytA genem (Gene, 43 (1986) str. 265-272), což je autolysin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanovém skeletu. C-koncová doména LYTA proteinu je odpovědná za afanitu k cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využita pro vývoj E. coli C-LYTA expresních plazmidů použitelných pro expresi fúzních proteinů. Přečištění hybridních proteinů obsahujících C-LYTA fragment na amino-konci bylo popsáno (Biotechnology, 10, (1986), str. 795-798). Výhodná provedení vynálezu využívaní repetitivní část Lyta molekuly na C-konci začínající zbytkem 178. Zejména výhodná provedení obsahují zbytky 188-305.

Imunologické fúzní partnery uvedené výše jsou také výhodné vtom, že napomáhají expresi. Konkrétně, takové fúzní proteiny jsou exprimovány s vyšším výtěžkem než přirozené rekombinantní MÁGE proteiny.

Vynálezci demonstrovali, že při klinickém použití jsou takové konstrukty schopné léčit melanom.

V jednom případě byl pacient s melanomem ve stadiu IV zbaven metastas po dvou dávkách lipo D 1/3 MÁGE 3 His proteinu bez adjuvans.

V jednom provedení předkládaný vynález proto obsahuje fúzní proteiny obsahující antigen asociovaný s nádory s MÁGE rodiny navázaný na imunologický fúzní partner. Výhodně je imunologický fúzní partner protein D nebo jeho fragment, nejlépe lipoprotein D. MÁGE proteiny jsou výhodně MÁGE Al nebo MÁGE A3. Složka lipoporoteinu D je výhodně tvořena první 1/3 lipoproteinu D.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou přednostně exprimovány vE. coli. Ve výhodném provedení jsou proteiny exprimovány s afinitní koncovkou, jako je například histidinová koncovka složená z 5 až 9, výhodně ze 6 histidinových zbytků. Tyto koncovky jsou výhodné v tom, že napomáhají při přečištění.

Předkládaný vynález také poskytuje nukleové kyseliny kódující proteiny podle předkládaného vynálezu. Taková sekvence mohou být insertovány do vhodného expresního vektoru a použity v DNA/RNA vakcinaci, nebo mohou být exprimovány ve vhodném hostiteli. Mikrobiální vektory exprimující nukleové kyseliny mohou být použity jako vakciny. Mezi takové vektory patří například poxvirus, adenovirus, alfavirus, listeria a monarfág.

DNA sekvence kódující proteiny podle předkládaného vynálezu může být syntetizována za použití standardních technik syntézy DNA, jako je enzymatická ligace popsána v D.M. Roberts et al. v Biochemistry 1985, 24: 5090-5098, chemická syntéza, enzymatická polymerizace in vitro

-3CZ 298364 B6 nebo PCR technologie využívající například termostabilní polymerasu, nebo pomocí kombinace těchto technik.

Enzymatická polymerizace DNA může být provedena in vitro za použití DNA polymeras jako je DNA polymerasa I (Klenow fragment) ve vhodném pufru obsahujícím nukleosid-trifosfaty dATP, dCTP, dGTP a dTTP podle potřeb při teplotě 10 až 37 °C, obyčejně v objemu 50 μΐ nebo menší. Enzymatická ligace DNA fragmentů může být provedena za použití DNA lipasy, jako je T4 DNA ligasa, ve vhodném pufru, jako je 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl₂, 0,01 M dithiothreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP a 0,1 mg/ml hovězí sérový albumin, při teplotě od 4 °C do teploty okolí, obyčejně v objemu 50 ml nebo menším. Chemická syntéza DNA polymeru nebo fragmentu může být provedena běžnou fosfotriesterovou, fosfítovou nebo fosforoamiditovou metodou, za použití techniky syntézy na pevné fázi, jak je popsána v „Chemical and Enzymatic Synthesis ofo Gene Fragments - A Laboratory Manual“ (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), nebo v jiných vědeckých publikacích, jako je například M.J. Gait, H.W. D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproata R.C. Titmas,Nucleic Actds Research, 1982, 10: 6243; B.S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24: 5771; M.D. Matteucci a M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21: 719; M.D. Matteuci a M.H. Caruthers, Journal of the Američan Chemical Society, 1981, 103: S.P. Adams et al., Journal of the Američan Chemical Society, 1983, 105: 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McManus a H, Koestrer, Nucleic Acids Reseach 1984, 12: 4539; a H.W. D. Matthes et al. EMBO Journal, 1984, 3:801.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být proveden za použití jakékoliv rekombinantní techniky, jako jsou například techniky popsané v Maniatis et al., Molecular Clonint - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Přesněji, způsob může obsahovat kroky:

(i) přípravu replikovatelného nebo integrovatelného expresního vektoru, kterýje schopen exprimovat v hostitelské buňce DNA polymer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo jeho imunogenní derivát;

(ii) transformaci hostitelské buňky uvedeným vektorem;

(iii) kultivaci uvedené transformované hostitelské buňky za podmínek umožňujících expresi uvedeného DNA polymeru pro produkci uvedeného proteinu; a (iv) získání uvedeného proteinu.

Termín „transformování“, jak je zde použit, označuje vložení cizorodé DNA do hostitelské buňky. Toto může být provedeno pomocí transformace, transfekce nebo infekce vhodného plazmidu nebo virového vektoru za použití běžných technik popsaných například v Genetics Engeneering, ed. S.M. Kingsman a A.J. Kingsman; Blackwell Scienplific Publications, Oxford, England, 1988. Termíny „transformovaná“ nebo „transformant“ jsou zde použity na výslednou hostitelskou buňku obsahující a exprimující vybraný cizorodý gen.

Expresní vektory jsou nové a tvoří také část předkládaného vynálezu.

Replikovatelné expresní vektory mohou být připraveny způsobem podle předkládaného vynálezu, štěpením vektoru kompatibilního s hostitelskou buňkou za zisku lineárního DNA segmentu majícího intaktní replikon a kombinováním uvedeného lineárního segmentu s jednou nebo více molekulami DNA, které spolu s uvedeným lineárním segmentem kódují požadovaný produkt, jako je například DNA polymer kódující protein podle předkládaného vynálezu nebo derivát, za vhodných ligačních podmínek.

Tak může být DNA polymer vytvořen před nebo během konstrukce vektoru.

Volba vektoru bude provedena podle hostitelské buňky, která může být prokaryotická nebo eukaryotická, ale výhodně se jedná o E. coli nebo CHO buňky. Mezi vhodné vektory patří plazmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry.

-4CZ 298364 B6

Příprava replikovatelných expresních vektorů může být provedena běžnými způsoby za použití vhodných enzymů pro restrikci polymerizaci a ligaci DNA. podle způsobů popsaných například vManiatis et al., výše.

Rekombinantní hostitelská buňka je připravena ve způsobu podle předkládaného vynálezu transformováním hostitelské buňky replikovatelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu za transformačních podmínek. Výhodnými transformačními podmínkami jsou běžné podmínky a jsou popsány například v Maniatis et al., výše, nebo v „DNA Cloning“, svazek II, D.M. Glover ed, IRL Press Ltd., 1985.

Volba transformačních podmínek závisí na hostitelské buňce. Bakteriální buňka, jako je E. coli, může být ošetřena roztokem CaCl₂ (Cohen et al, proč. Nati, Acad. Sci. 1973, 69:2110) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCl₂, octanu draselného a glycerolu, a potom kyselinou 3-[Nmorfolinoj-propansulfonovou, RbCl a glycerolem. Savčí buňky v kultuře mohou být transformovány vápníkovým vysrážením vektorové DNA do buněk. Vynález také zahrnuje hostitelské buňky transformovaná repl i kováte Iným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu.

Kultivace transformovaných hostitelských buněk za podmínek umožňujících expresi DNA polymeru je provedena běžným způsobem, jak je popsáno například v Maniatis et al., a v DNA Clonint, výše. Výhodně jsou buňkám dodávány živiny a kultivace probíhá při teplotách nižších než 50 °C.

Výsledný materiál může být získán za použití běžných metod vybraných podle hostitelských buněk a podle lokalizace exprimovaného materiálu (intracelulární nebo secemovaný do kultivačního média nebo do buněčné periplazmy). Když je hostitelská buňky bakteriální, jako jen například E. coli, tak může být například provedena fyzikální, chemická nebo enzymatická lýza buňky a proteinový produkt může být izolován z výsledného lyzátu. Když je hostitelskou buňkou savčí buňka, tak může být produkt obvykle izolován z živného média nebo z bezbuněčných extraktů. Mezi běžné techniky pro izolaci proteinů patří selektivní srážení, adsorpční chromatografie a afinitní chromatografie včetně afinitní kolony s monoklonální protilátkou.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou poskytnuty bud’jako rozpouštěný materiál v kapalné formě, nebo v lyofilizované formě.

Obecně se předpokládá, že každá dávka pro člověka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, výhodně 30 až 300 pg.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující protein podle předkládaného vynálezu ve farmaceuticky přijatelných přísadách. Výhodný vakcinační prostředek obsahuje alespoň lipoprotein D - MAGE-3. Taková vakcina může volitelně obsahovat jeden nebo více jiných antigenu asociovaných s nádory, například jiné antigeny náležící do MÁGE nebo GAGE rodiny. Mezi vhodné další antigeny asociované s nádory patří MAGE-1, GAGE-1 nebo tyrosinasa.

Příprava vakcin je obecně popsána v Vaccinc Design („The subunit and adjuvant aproach“ (ed. Powell M.F, and Newman, M.J.) (1995) Plenům Press New York). Obalení do liposomů je popsáno ve Fullerton, patent US 4 235 877.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně obsaženy ve vakcinačních prostředcích podle předkládaného vynálezu společně s adjuvans. Mezí vhodná adjuvans patří soli hliníku, jako je hydroxid hlinitý ve formě gelu (kamenec) nebo fosforečnan hlinitý, ale patří mezi ně také soli vápníku, železa nebo zinku nebo nerozpustné suspenze acylovaného tyrosinu nebo acylované cukry, kationtově nebo aniontově derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny, Mezi další známá adjuvans patří oligonukleotidy obsahující CpG. Oligonukleotidy se vyznačují tím, že CpG

-5CZ 298304 B6 dinukleotid je nemethylovaný. Takové oligonukleotidy jsou dobře známé a jsou popsány například ve WO 96/02555.

V prostředcích podle předkládaného vynálezu je výhodné, aby adjuvans přednostně vyvolávalo imunitní odpověď Thl typu. Mezi vhodné adjuvantní systémy patří, například, kombinace monofosforyl—lipidu A, výhodně 3-de-O-acylováného monofosforyllipidu A (3D-MPL) se solí hliníku. CpG oligonukleotidy také přednostně vyvolávají Thl odpověď.

Zesílený systém obsahuje kombinaci monofosforyl-lipidu A a saponinového derivátu, přesněji kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak je popsána ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní prostředek, ve kterém je QS21 utlumen cholesterolem, jako je popsáno ve WO 96/33739.

Zejména účinný adjuvantní prostředek obsahuje QS21 3D-MPL a tokoferol v olejové nebo vodní emulzy, jak je popsáno ve WO 95/17210, který je také přednostně použitým prostředkem.

V jednom provedení předkládaný vynález poskytuje vakcinační prostředek obsahující protein podle předkládaného vynálezu, nejlépe lipoprotein D (nebo jeho derivát) - MAGE-3 s adjuvans, který je monofosforyl-lipid A nebo jeho derivát.

Výhodně obsahuje vakcína dále saponin, nejlépe QS21.

Výhodný prostředek dále obsahuje emulzi olej ve vodě a tokoferol. Předkládaný vynález také obsahuje způsob přípravy vakcinačního prostředku obsahující smísení proteinu podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky přijatelnou přísadou, jako je 3D-MPL.

V jednom aspektu vynález obsahuje způsob pro přečištění rekombinantně připraveného MAGEproteinu. Tento způsob obsahuje solubilizaci proteinu, například v silném chaotropním činidle (jako je například močovina, guantdiniumhydrochlorid) nebo vobojetném detergačním činidle, jako je například Empigen BB - n-dodecyl-N,N-dimethylglycin), redukci intra- a intermolekulových disulfidových můstků proteinu, blokování vzniklých thíolů pro prevenci oxidačního obnovení vazeb a zpracování proteinu v jednom nebo ve více chromatografických stupních.

Výhodně je blokovacím činidlem alky lační činidlo. Mezi taková blokovací činidla patří, například, alfa halogenkyseliny nebo alfa halogenamidy, například kyselina jodoctová a jodacetamid, které způsobují karboxymethylaci nebo karboxyamidaci (karbamidomethylaci) proteinu. Další blokovací činidla, která mohou být použita, jsou popsána v literatuře (viz například The Proteins, svazek II, ed. H. Neurath, R.L. Hill, a C.L, Boeder, Academie Press, 1976, a Chemical Reagents for Protein Modificaton, svazek, ed., R.L. Lunblad a C.M. Noyes, CRC Press, 1985). Mezi typické příklady takových dalších blokovacích činidel patří N~ethylmaleimid, chloracetylfosfat, O-methylizomočovina a akrylonitril. Použití blokovacích činidel je výhodné, protože brání agregaci vzniklého materiálu a zajišťuje stabilitu při dalším přečištění.

V provedení vynálezu jsou blokovací činidla vybrána tak, aby indukovala vznikl stabilního kovalentního a ireversibilního derivátu (například je použito alfa-halogenkyseliny nebo alfa-halogenamidu). Nicméně, mohou být použita i jiná blokovací činidla, která mohou být po přečištění odstraněna za uvolnění nederivatizovaného proteinu.

MÁGE proteiny mající derivatizované volné thiolové zbytky jsou nové a tvoří aspekt předkládaného vynálezu. Výhodným provedením vynálezu jsou karboxyamidované nebo karboxymethylované deriváty.

Ve výhodném provedení jsou proteiny podle předkládaného vynálezu opatřeny afinitní koncovkou, jak oje CLYTA nebo polyhistidinová sekvence. V takových případech je protein po stupni blokování výhodně zpracován afinitní chromatografíi. Pro proteiny s polyhistidinovou koncovkou může být použita afinitní chromatografie s imobilizovaným iontem kovu (IMAC). lontem

-6CZ 2983M R6 kovu může být jakýkoliv vhodný iont jako je například zinek, nikl, železo, hořčík nebo měď, ale á výhodně je použit zinek nebo nikl. Výhodně obsahuje IMAC pufr obojetné detergenční činidlo, d jako je Empigen BB (dále pouze Empigen), protože snižuje koncentrace endotoxinu v konečném materiálu.

Pokud je připraven protein s Clyta částí, tak může být přečištěn za použití své afinity k cholinu nebo k analogům cholinu, jak oje DEAE. V jednom provedení vynálezu jsou proteiny připraveny s polyhistidinovou koncovkou a Clyta částí. Tyto proteiny mohou být přečištěny za použití jednoduchého dvoustupňového protokolu afínitní chromatografie.

Vynález bude dále popsán v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava rekombinantního kmene E. coli exprimujícího fúzní protein lipoprotein D-MAGE-3- His (LPD 1/3- MAGE-3-his nebo LpD MAGE-3-His)

1. Expresní systém E. coli

Pro produkci lipoproteinu D byla DNA kódující protein D klonována do expresního vektoru pMG 814. Tento plazmid využívá signály z DNA lambda fágu pro řízení transkripce a translace insertovaných cizorodých genů. Vektor obsahuje lambda PL protokol PL, operátoru OL a dvě využitelná místa (NutL aNutR) pro odstranění efektů transkripční polarity při použití N proteinu (Gross et al., 1985, Mol and Cell Biol. 5: 1015). Vektory obsahující PL promotor jsou vloženy do El coli lysogenního hostitele pro stabilizaci plazmidové DNA. Lysogenní hostitelské kmeny obsahují replikon-deficientní lambda fágovou DNA integrovanou do genomu (Shatzman et al., 1983; v Experimetal Manipulation of Gene Expression, Inouya (ed.) str. 1-14, Academie Press, NY). DNA lambda fágu řídí syntézu cl represorového proteinu, který se váže a OL represor vektoru a brání vazbě RNA polymerasy na PL promotor a tak transkripci insertovaného genu. Cl gen expresního kmene AR58 obsahuje teplotně sensitivní mutaci, takže transkripce řízená PL může být regulována teplotním posunem, to znamená, že zvýšení kultivační teploty inaktivuje represor a je zahájena syntéza cizorodého proteinu. Expresní systém umožňuje kontrolovanou syntézu cizorodých proteinů, zejména těch, které mohou být toxické pro buňky (Shimataka and Rosenberg, 1981, Nátuře 292: 128).

2. E. coli, kmen AR58:

Lysogenní kmen E. coli AR58 použitý pro produkci LPD-MAGE-3-His proteinu je derivát standardního NIH E. coli K12 kmene N99 (F-su-galK2, lacZ-, thr-). Obsahuje defektní lysogenní lambda fág (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). Kil- fenotyp brání ukončení makromolekulové syntézy hostitele. cI857 mutace způsobuje teplotní sensitivitu cl represoru. DH1 mutace odstraňuje pravý operon lambda fágu a bio, uvr3 a ChlA lokusy hostitele. Kmen AR58 byl připraven transdukcí N99 P lambda fágem předem kultivovaným na SA 500 derivátu (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). Vložení defektního lysogenu do N99 buněk bylo selektováno tetracyklinem, protože TN10 transposon kódující resistenci ne tetracyklin je umístěn v sousedství galE genu. N99 a SA500 jsou K12 kmeny E. coli získané od Dr. Martin Rosenberg's laboratoře v National Institute of Health.

3. Konstrukce vektoru navrženého pro expresi rekombinantního proteinu LPD-MAGE-3His:

Cílem bylo exprimovat MÁGE 3 jako fúzní protein za použití N-koncové třetiny lipidovaného proteinu D jako fúzního partner navázaného na N-konec MAGE-3 a sekvence několika histidinových zbytků (His koncovky) umístěné na jeho C-konci.

Protein D je lipoprotein (42 kDa vazebný protein pro imunoglobulin D umístěný na povrchu gram-negatívní bakterie Haemophilus influenzae). Protein je syntetizován jako prekurzor s 18 aminokyselinovou signální sekvencí, která obsahuje konvenční sekvenci pro bakteriální lipoprotein (WO 91/18926).

Po odstranění signální sekvence lipoproteinu během sekrece se stává Cys (v pozici 19 molekuly prekursoru) amino-koncovým zbytkem a současně je modifikován kovalentním navázáním jak esterovou vazbou vázaných, tak amidovou vazbou vázaných mastných kyselin.

Mastné kyseliny navázané na amino-koncový cysteinový zbytek potom působí jako membránové ukotvení.

Plazmid exprimující fúzní protein byl navržen tak, aby exprimoval prekursorový protein obsahující 18 aminokyselinovou signální sekvenci a prvních 109 zbytků zpracovaného proteinu D, dvě nepříbuzné aminokyseliny (Met a Asp), aminokyselinové zbytky 2 až 314 MAGE-3 a dva Gly zbytky působící jako pantový region pro navázání dalších sedmi His zbytků.

Takto připravený rekombinantní kmen produkoval lipidovaný fúzní protein s His koncovkou o 432 aminokyselinách (viz obr. 1), s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 1 a kódující sekvencí SEQ ID NO: 2.

4. Klonovací strategie pro přípravu LPD-MAGE-3-His fúzního proteinu (vektor pRIT14477), Byly použity cDNA plazmid (od Dr, Thierry Boon z Ludwig Institute) obsahující kódující sekvenci pro MAGE-3 gen (Gaugler, B. et al,, 1994) a vektor pRIT 14586, obsahující n-koncovou část Lipo-D-1/3 kódující sekvence (připravený podle obr. 2). Klonovací strategie obsahovala následující kroky:

(a) PCR amplifikaci sekvencí přítomných v plazmidové cDNA pro MAGE-3 za použití kódujícího oligonukleotidu: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, a protismyslného oligonukleotidu 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tet caa; tato amplifikace vedla k následujícím modifikacím na N-konci: změnu prvních pěti kodonů na kodony používané v E, coli; nahrazení Pro kodonu v pozici 1 Asp kodonem, vložení Ncol místa na 5' konci a adici 2 Gly kodonů a 7 His kodonů následovaných Xbal místem na C-konci;

(b) klonování výše uvedeného amplifikovaného fragmentu do TA klonovacího vektoru (Invitrogen) a přípravu pracovního vektoru pRIT 14647;

(c) vystřižení Ncol-Xbal fragmentu z plazmidu pRIT14647 a klonování do vektoru pRIT 14586;

(d) transformaci hostitelského kmene AR58;

(e) selekci a charakterizaci transformantů E. coli obsahujících plazmid pRIT 1447 exprimujících LPD-MAGE-3-His fúzní protein.

Příklad 2: Příprava LPDl/3-MAGE-3-His antigenu

1. Kultivace a indukce bakteriálního kmene - exprese LPD1/3 - MAGE-3-His

Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14477 byly kultivovány ve 2 litrových nádobách obsahujících 400 ml LY12 média doplněného kvasinkovým extraktem (6,4 g/1) a kanamycinsulfatem (50 mg/1). Po inkubaci za třepání při 30 °C po dobu 8 ± 1 hodiny se z každé nádoby odebral malý vzorek pro mikroskopické vyšetření. Obsah dvou nádob se potom smísil za vzniku inokula pro 20 litrovou fermentační nádobu.

Inokulum (přibližně 800 ml) bylo přidáno do předem sterilizované 20 litrové (celkový objem) fermentační nádoby obsahující 7 litrů média doplněného 50 mg/1 kanamycin-sultatem. pH bylo upraveno a udržováno na 6,8 pravidelným přidáváním NH₄OH (25% obj./obj.) a teplota byla

-8CZ 298304 B6 ,ί!

upravena a udržována na 30 °C. Provzdušňování bylo prováděno rychlostí 12 1/min. a tlak rozpouštěného kyslíku byl udržován na 50% saturaci pomocí zpětnovazebně kontroly rychlosti třepání. Přetlak ve fermentačním tlaku byl udržován na 500 g/cm² (0,5 baru).

Kultivace za přísunu živin byla provedena za kontrovaného přidávání uhlíkového živného roztoku. Živný roztok byl přidáván počáteční rychlostí 0,04 ml/min a rychlost se exponenciálně zvyšovala během prvních 42 hodin pro dosažení rychlosti růstu 0,1 h'¹.

Po 42 hodinách byla teplota ve fermentačním tanku rychle zvýšena na 39 °C a rychlost podávání živného roztoku byla udržována na 0,005 ml/g DCW/min. během indukční fáze po dobu dalších 22 až 23 hodin, během kterých dosáhla intracelulární exprese LPDl/3-MAGE-3-His maximální úrovně.

Alikvoty (15 ml) média byly odebírány v pravidelných intervalech během růstové/indukční fáze a na konci fermentace, aby bylo možno sledovat kinetiku růstu bakterií a intracelulární exprese produktu a dále pro získání vzorků pro identifikaci mikrobů/testy nečistoty.

Na konci fermentace byla optická hustota kultury mezi 80 a 120 (což odpovídá koncentraci buněk mezi 48 a 72 g DCW/1) a celkový objem kapaliny byl přibližně 12 litrů. Kultury byly rychle ochlazeny na teplotu 6 až 10 °C a buňky ECK32 byly separovány z kultivačního média odstředěním při 5000 x g při 4 °C během 30 minut. Koncentrované buňky ECK32 byly rychle uskladněny v plastových vacích a ihned zmrazený při -80 °C.

2. Extrakce proteinu

Zmrazené koncentrované buňky ECK32 se nechaly roztát při 4 °C a potom byly resuspendovány v pufru pro rozrušení buněk v konečné optické hustotě 60 (která odpovídá koncentraci buněk přibližně 36 g DCW/1).

Buňky byly rozrušeny dvěma průchody přes vysokotlaký homogenizační přístroj (1000 barů). Suspenze rozrušených buněk byla odstředěna (1000 x g při 4 °C, 30.minut) a peletová frakce byla promyta dvakrát Triton X100 (1% hmot./obj.) + EDTA 1 mM) a potom fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) + Tween 20 (0,1% obj./obj.) a nakonec PBS. Před každým stadiem promývání byla suspenze odstředěna při 10 000 x g po dobu 30 minut při 4 °C, supernatant byl odstraněn a peleta byla použita v dalším promývání.

Příklad 3: Charakterizace fúzního proteinu lípo D - MAGE-3

1. Přečištění:

LPD-MAGE-3-His byl přečištěn z buněčného homogenátu za použití následující sekvence kroků:

(a) solubilizace promyté peletové frakce z procesu destrukce buněk;

(b) chemická redukce intra- a inter-proteinových disulfidových můstků, po které následovalo blokování thiolových skupin pro zabránění oxídativnímu obnovení vazeb;

(c) mikrofiltrace reakční směsi pro odstranění částic a snížení obsahu endotoxinů;

(d) zachycení a primární přečištění LPD-MAGE-3-His pomocí využití afinitní interakce mezi polyhistidinovou koncovkou a chelatační sepharosou obsahující zinek;

(e) odstranění kontaminujících proteinů aniontovou iontoměničovou chromatografii.

Přečištěný LPD-MAGE-3-His byl zpracován v několika dalších krocích:

(f) výměna pufru/odstranění močoviny pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti za použití Superdex 75;

-9CZ 298364 B6 (g) filtrací během procesu;

(h) výměnou pufru/odsolením pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti za použití Sephadex G25.

Každý z těchto kroků bude nyní popsán podrobněji.

1.1) Solubilizace pelety buněčného homogenátu

Peleta z posledního promytí (jak je popsáno výše) byla resolubilizována přes noc v 800 ml roztoku guanidinhydrochloridu (6M) a fosforečnanu sodného (0,1 M, pH 7,0) při 4 °C.

1.2) Redukce a karboxymethylace

Solubilizovaný materiál (světle žlutá, kalná suspenze) se probublala argonem pro odstranění jakéhokoliv zbývajícího kyslíku a přidal se zásobní roztok 2-merkaptoethanolu (14 M) na konečnou koncentraci 4,3 M (která odpovídá 0,44 ml 2-merkaptoethanolu na ml roztoku).

Vzniklý roztok se rozdělil a přenesl se do dvou skleněných zkumavek, které se zahřály na 95 °C ve vodní lázni. Po 15 minutách při 95 ^ŮC se zkumavky odstranily z vodní lázně a nechaly se vychladnout a potom se jejich obsah slil do fólií pokryté kádinky (5 I), která se umístila na led a za důkladného míchání se přidal jodacetamid v pevném stavu v množství nutném pro dosažení konečné koncentrace 6 M (která odpovídá 1,11 g jodacetamidu na ml roztoku). Směs se ponechala na ledu ve tmě po dobu 1 hodiny pro zajištění úplné solubilizace jodacetamidu a potom byla neutralizována (za stálého důkladného třepání a kontinuálního sledování pH) přidáním přibližně 1 litru hydroxidu sodného (5 M) za dosažení konečného pH 7,5 až 7,8.

Získaná směs se nechala na ledu ve tmě po dobu dalších 30 minut a potom se pH opět upravilo na pH 7,5 až 7,8.

1.3) Mikrofiltrace

Směs se mikrofiltrovala na Amicon Proflux M12 jednotce s tangenciálním průtokem vybavené Minikos náplní z dutého vlákna (ref. č. M22M-600-0JN; plocha 5600 cm², 0,2 pm). Filtrát byl použit v následném chromatografickém přečištění.

1.4) Chelatační chromatografie za použití kovu (Zn²⁺) (IMAC)

Chelatační chromatografie za použití kovu byla provedena za použití Chelating Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology kat. č. 17-0575-01) naplněné do BPG 100/500 kolony (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-01). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 79 cm²; délka náplně 19 cm; objem 1500 ml. Prázdná kolona byla ošetřena hydroxidem sodným (0,5 M) a potom byla promyta přečištěnou vodou.

Nosič (aplikovaný ve 20% obj./obj. ethanolu) byl promyt přečištěnou vodou (8 litrů) na Buchnerově nálevce (ve vakuu) a byl naplněn zinkem pomocí průchodu alespoň 15 1 roztoku ZnCl₂ (0,1 M). Nadbytek zinku byl odstraněn promýváním nosiče 101 přečištěné vody, dokud pH kapaliny na výstupu nedosáhlo pH roztoku ZnCI₂ (pH 5,0). Nosič byl potom uveden do rovnováhy 4 1 roztoku obsahujícího guanidin hydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M, pH 7,0).

Filtrát z mikrofiltrace obsahující LPD-MAGE-3-HIS byl smísen s nosičem (vazba ve vsádce) před naplněním BPG kolony roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M, pH 7,0).

Další stadia chelatační chromatografie za použití kovu byla provedena za průtoku eluens 60 ml/min. Kolona byla promývána nejprve roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M, pH 7,0), potom roztokem obsahujícím močovinu (6M) a fosforečnan

-10CZ 298364 B6 sodný (O,1M, pH 7,0), dokud nedosáhl eluens kolony nulové absorbance při OD₂8o ^nm (základní hodnota).

Semi-přečištěná LPD-MAGE-3-His proteinová frakce byla eluována 2 objemy kolony roztoku obsahujícího močovinu (6M), fosforečnan sodný (0,lM, pH 7,0) a imidazol (0,5M). Vodivost této frakce byla přibližně 16 mS/cm.

1.5) Aniontová iontoměničová chromatografie

Před provedením aniontové iontoměničové chromatografie se vodivost semi-přečištěné LPD-MAGE-3-His proteinové frakce snížila na přibližně 4 mS/cm pomocí naředění roztokem obsahujícím močovinu (6M) a Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).

Aniontová iontoměničová chromatografie byla provedena za použití Q-Sepharose FF (Pharmacie Biotechnology, kat. č. 17-0510-D1) naplněné v BPG 200/500 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-11). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 314 cm¹; délka náplně 9 cm; objem náplně 3900 ml.

Kolona byla naplněna (20 % obj./obj. ethanolem) a byla promyta 9 1 přečištěné vody při průtoku eluens 70 ml/min. Naplněná kolona byla ošetřena 3 litry hydroxidu sodného (0,5 M), byla promyta 30 litry přečištěné vody a potom byla uvedena do rovnováhy 6 litry roztoku obsahujícího močovinu (6M) a Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). Ředěný, semi-přečištěný LPD-MAGE-3-His byl vnesen do kolony a potom byl promýván 9 litry roztoku obsahujícího močovinu (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) a Tween (0,1%), dokud absorbance (280 nm) eluens neklesla na nulu.

Další promytí bylo provedeno za použití roztoku obsahujícího močovinu (6M) a Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).

Přečištěný LPD-MAGE-3-His byl eluován z kolony roztokem obsahujícím močovinu (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) a NaCl (0,25M).

1.6) Chromatografie s vylučováním podle velikosti

Odstranění močoviny z přečištěného LPD-MAGE-3-His a výměna pufru byly provedeny za použití chromatografie s vylučováním podle velikosti. Tato byla provedena za použití Superdex 75 (Pharmacie Biotechnology, kat. ě. 17-1044-01) naplněné v XK 50/100 koloně (Pharmacie Biotechnology kat. č. 18-8753-01). Rozměry náplně byly: průměr 5 cm; plocha na příčném řezu 19,6 cm²; objem 1800 ml.

Kolona byla naplněna ethanolem (20%) a byla promyta 5 litry přečištěné vody při průtoku 20 ml/min. Kolona byla ošetřena 2 litry hydroxidu sodného (0,5 M), byla promyta 5 litry přečištěné vody a potom byla uvedena do rovnováhy 5 litry fosfátem pufrovaného salinického roztoku obsahujícího Tween 80 (0,1% obj./obj.).

Přečištěná LPD-MAGE-3-His frakce (maximum 500 ml/jedno odsolování) byla vnesena do kolony při průtoku eluens 20 ml/min. Odsolený přečištěný LPD-MAGE-3-His byl eluován z kolony 3 litry PBS obsahujícího Tween 80 (0,1% obj./obj.).

Frakce obsahující LPD-MAGE-3-His eluovala pří volném objemu kolony.

1.7) Filtrace během procesu

LPD-MAGE-3-His z chromatografie s vylučováním podle velikosti se filtruje pres 0,22 pm membránu v digestoři s laminámím prouděním (třída 100000). Filtrovaný materiál se zmrazí při -80 °C a uskladní se do kroku odsolení.

-11 CZ 298364 B6

1.8) Odsolovací chromatografie

Protože osmolalita konečného materiálu by měla být nižší než 400 mOsM, je nutný pro snížení koncentrací solí další výměna pufru. Tato výměna pufru se provede odsolovací chromatografií za použití Sehpadex G25 (Pharmacie Biotech no logy, kat. Č. 17-0033-02) naplněné v BPG 100/950 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-03). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 78,6 cm²; délka náplně 85 cm²; objem 6500 ml.

Sephadex G25 se hydratovala 7 litry přečištěné vody a nechala se bobtnat přes noc při 4 °C. Gel byl potom naplněn do kolony s čistou vodou při průtoku eluens 100 ml/min.

Kolona byla ošetřena 6 litry hydroxidu sodného (0,5 M) a potom byla uvedena do rovnováhy 10 litry roztoku obsahujícího fosforečnan sodný (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) a Tween 80 (0,1% obj./obj).

Přečištěná LPD-MAGE-3-His frakce (maximum 1500ml/jedno odsolování) byla vnesena do kolony při průtoku eluens 100 ml/min. Odsolený přečištěný LPD-MAGE-3-His byl eluován při volném objemu kolony, byl sterilně filtrován přes 0,22 μπι membránu a byl uskladněn při -80 °C. Výsledný proteinový materiál se nechal roztát při 4 °C před rozdělením do zkumavek a lyofilizací s laktosou (3,2%).

2. Analýza SDS-polyakrylamidových gelů barvených Coomasie modří

Přečištěný LPD-MAGE-3-His antigen byl analyzován SDS-PAGE na 12,5% akrylamidovém gelu za redukčních podmínek.

Pro barvení Coomasie modří byl obsah proteinu 50 pg a pro barvení dusičnanem stříbrným byl obsah proteinu 5 pg. Byla analyzována klinická šarže 96K19 a pilotní šarže 96J22. Byl vizualizován jeden hlavní proužek odpovídající molekulové hmotnosti 60 kDa. Také byly pozorovány dva vedlejší proužky odpovídající přibližně 45 kDa a 35 kDa.

3, Analýza westernovým přenosem

Peptidy získané při SDS-PAGE analýze LPD-MAGE-3-His proteinu byly identifikovány westernovým přenosem za použití myších monoklonálních protilátek. Tyto protilátky byly připraveny v myších za použití přečištěného přípravku MAGE-3-HÍs proteinu (tento protein neobsahuje LPD část LPD-MAGE-3-His).

Podle vhodnosti pro analýzu westernovým přenosem byly vybrány dva přípravky monoklonálních protilátek (MAb 22 a MAb 54) a byly použity testy identifikace. Obr. 4 ukazuje charakter proužků získaných pro šarže 96K19 a 96J22 po barvení Mab 32 a 54. 600 ng proteinu bylo izolováno na 12,5 % SDS-PAGE, tento materiál byl přenesen na nylonovou membránu, reagoval s MAb 32 a 54 (60 pg/ml) a tyto byly detekovány pomocí anti-myších protilátek navázaných na peroxidasu.

kDa a 30 kDa peptid detekovaný SDS-PAGE byl detekován oběma mAb.

Příklad 4

1. Příprava vakciny za použití LPD-MAGE-3-His proteinu

Vakcina použití v těchto pokusech byla připravena z rekombinantí DNA kódující lipoprotein D l/3-MAGE-3-his, exprimované v E. coli kmene AR58, a obsahovala, nebo neobsahovala adjuvans. Jako adjuvans prostředek obsahoval směs 3-de-O-acylováného monofosforyllipidu a

-12CZ 298364 B6 (3D-MPL) a QS21 v emulzi olej ve vodě. Adjuvantní systém SBAS2 byl popsán drive ve WO 95/17210.

3D-MPL je imunostimulační činidlo odvozené od li po póly sacharidu (LPS) gram-negativní bakterie Salmonella minnesota. MPL byl deacylován a postrádá fosfátovou skupinu na skupině lipidu A. Toto chemické zpracování dramaticky snižuje toxicitu za zachování imunostimulačních vlastností (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry vyrábí a dodává MPL do SB-Biologicals. Pokusy provedené ve Smith Kline Beecham Biologicals ukázaly, že 3D-MPL v kombinaci s různými vehikuly významně zvyšuje jak protilátkovou imunitu, tak Thl typ imunitní reakce.

QS21 je přirozená saponinová molekula extrahovaná z kůry jihoamerického stromu Quillaja saponaria Mol i na. Technika přečištění vyvinutá pro separaci jednotlivých saponinů ze surových extraktů z kůry umožňuje izolaci saponinů QS21, který je triterpenovaným glykosidem vykazujícím silnou adjuvantní aktivitu a nízkou toxicitu ve srovnání s původním materiálem. Bylo prokázáno, že QS21 aktivuje CTL restrihované MHC třídy I k několika podjednotkovým Ag, stejně jako bylo prokázáno, že stimuluje Ag specifickou proliferaci lymfocytů (Kensil, 1992). Aquila (formálně Cambridge Biotech Corporation) vyrábí a dodává QS21 do SB Biologicals.

Pokusy provedené ve SmithKline Beecham Biologicals prokázaly jasný synergní efekt kombinace MPL a QS21 v indukci jak protilátkové imunity, tak Thl typu imunitní reakce.

Emulze olej/voda je složena z organické fáze tvořené 2 oleji (tokoferolem askvalenem) a vodné fáze tvořené PBS obsahující Tween 80 jako emulgační činidlo. Emulze obsahuje 5 % skvalenu, 5 % tokoferolu, 0,4 % Tween 80 a má průměrnou velikost částic 180 nm a je známá jako SB62 (viz WO 95/17210).

Pokusy provedené ve SmithKline Beecham Biologicals prokázaly, že přidání této emulze olej/voda k 3D-MP/QS21 (SBAS2) dále zvyšuje imunostimulační vlastnosti 3D-MPL/QS21 pro různé podjednotkové antigeny.

2. Příprava emulze SB62 (2-násobný koncentrát)

Tween 80 se rozpustil ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) za zisku 2% roztoku v PBS. Pro získání 100 ml 2-krát koncentrované emulze se 5 g DL alfa tokoferolu a 5 ml skvalenu důkladně promísí. Přidá se 90 ml roztoku PBS/Tween a směs se důkladně promísí. Vzniklá emulze se potom protlačí stříkačkou a nakonec se mikrofluidizuje za použití M110S mikrofluidizačního přístroje. Výsledné olejové kapičky mají velikost přibližně 180 nm.

3. Příprava lipoprot. D1/3-MAGE-3-HÍS QS21/3D MPL emulze olej ve vodě (SBAS2)

Adjuvans je připraveno jako kombinace MPL a QS21, v emulzi olej ve vodě. Tento prostředekje aplikován do fiol o objemu 0,7 ml, ve kterých je smísen s lyofilizovaným antigenem (fiolly obsahující od 30 do 300 pg antigenu).

-13CZ 298364 B6

Složení ředidla obsahujícího adjuvans pro lyofilizovanou vakcinu je následující:

Složka	Množství (na dávku)
Adjuvans
Emulse SB62	250 pl
- skvalen	10,7 mg
- DL á-tokoferol	11,9 mg
- Tween 80	4,8 mg
Monofosforyl lipid A	100 pg
QS21	1Ó0 pg
Konzervační činidlo Thiómersal	25 pg
Pufr
	q. S. 0,5 ml
Voda pró injekce - hydrogenfosforečnan sodný	575 pg
- dihydrogenfosforečnan sodný	100 pg
- chlorid draselný	100 pg
- chlorid sodný	4,0 mg

Konečný vakcinační prostředek je získán po rekonstituci lyofilizovaného LPD-MAGE-3-His přípravku pomocí adjuvans nebo PBS samotným.

Kontroly obsahující adjuvans bez antigenu byly připraveny nahrazením proteinu PBS.

4. Vakcinační antigen: fúzní protein lipoprotein Dl/3-MAGE-3-His

Lipoprotein D je lipoprotein přítomný na povrchu gram-negativní bakterie hemophilus influenzae.

Použití prvních 109 zbytků zpracovaného proteinu D jako fúzního partnera poskytuje vakcinačnímu antigenu epitopy pro T-lymfocyty. Kromě LPD skupiny obsahuje protein dvě nepříbuzné aminokyseliny (Met a Asp), aminokyselinové zbytky 2 až 314 MAGE-3 a dva Gly zbytky působící jako pantový region pro navázání dalších sedmi His zbytků.

Příklad 5

1. Imunogenicita LPD-MAGE-3-His u myší a opic

Pro testování antigenicity a imunogenicity lidského MAGE-3 proteinu byla připravena vakcina injikována 2 různým kmenům myší (C57BL/6 a Balb/C), které se liší svým genetickým základem a MHC alelami. Pro oba kmeny myší byly teoreticky stanoveny peptidového motivy MHC-třídy I a MHC-třídy II pro MÁGE část LPD-MAGE-3-His fúzního proteinu.

(a) Imunizační protokol myším každého kmene bylo injekčně podáno 2—krát ve 2-týdenních intervalech do nohy 5 pg LPD-MAGE-3-His připraveného nebo nepřipraveného v SBAS2 v koncentraci rovné 1/10 koncentrace použité u člověka.

- 14CZ 298364 B6 (b) ProliferaČní test

Lymfocyty byly připraveny rozdrcením sleziny nebo popliteálních lymfatických uzlin od myší, 2 týdny po poslední injekci. 2 x 10⁵ buněk bylo umístěno trojmo jamek 96-jamkové plotny a buňky byly restímulovány in vitro po dobu 72 hodin různými koncentracemi (1-0,1 gg/ml) HisMAGE-3. který byl použit samotný nebo potažený na latexové mikrokorálky.

Zvýšená MAGE-3 specifická lymfoproliferativní aktivita byla pozorována jak u buněk sleziny (viz obr. 5 a 7), tak u buněk lymfatických uzlin (viz obr. 6 a 8) jak od C57BL/6 myší, tak od Balb/C myší, kterým byl injekčně podán LPD-MAGE-3-His protein, ve srovnání s lymfoproliferativní odpovědí myší, kterým byl podán přípravek SBAS2 samotný nebo PBS.

Kromě toho, významně vyšší proliferativní odpověď byla získána pro lymfocyty od myší imunizovaných LPD-MAGE-3-His v adjuvantním SBAS2 (viz obr. 6 a 8).

(c) Závěr

LPD-MAGE-3-His je imunogenní u myší a tato imunogenicita může být zvýšena použitím SBAS2 jako adjuvans.

2. Protilátková odpověď (a) Imunizační protokol:

Balb/C nebo C57BL/6 myši byly imunizovány 2 injekcemi do nohy ve 2-týdenm'ch intervalech za použití bud PBS, nebo SBAS2, nebo 5 pg LPD-MAGE-3-His, nebo 5 pg LPD-MAGE-3His + SBAS2. Tři zvířata byla použita v kontrolní skupině a pět zvířat bylo použito v testovací skupině.

(b) Nepřímá ELISA

Dva týdny po druhé injekci byla zvířatům odebrána séra a byla analyzována v nepřímém ELISA testu. 2 pg/ml přečištěného His MÁGE 3 byly použity jako potahový antigen. Po saturaci po dobu 1 hodiny při 37 °C v PBS + 1% fetální telecím séru byla séra sériově ředěna (od 1/1000) v saturačním pufru a byla inkubována přes noc při 4 °C nebo po dobu 90 minut při 37 °C. Po promytí PBS/Tween 20,01 % byla biotinylovaná kozí protilátka proti celkovému myšímu IgG (1/1000) nebo kozí protilátky proti myšímu IgGl, lgG2a, IgG2b (1/5000) použity jako sekundární protilátky. Po 90 minutové inkubaci při 37 °C byl přidán streptaviďm navázaný na peroxidasu a TMB (tetra-methyl-benzidin-peroxid) byl použít jako substrát. Po 10 minutách byla reakce blokována přidáním 0,5 M H2SO4 a byla stanovena OD.

(c) Výsledky

Obr. 9 srovnává různé skupiny myší (n = 5/skupinu), relativní průměrný střední titr séra, který je průměrným ředěním nutný pro dosažení středního bodu křivky.

Tyto výsledky ukazují, že u obou testovaných kmenů myší je přítomná slabá Ab odpověď po 2 injekcích LPD-MAGĚ-3-His samotného, ale že vyšší koncentrace protilátek proti MAGE-3 je přítomná v případě, že LPD-MAGE-3-His je injikován společně s SBAS2. Pouze 2 injekce LPD-MAGE-3-His + SBAS2 ve 2-týdenních intervalech, jsou dostatečné pro dosažení pozorované vysoké protilátkové odpovědi.

Lepší protilátková odpověď pozorovaná u Balc/c myší ve srovnání s odpovědí pozorovanou u C57BL/6 myší může být vysvětlena rozdíly v haplotypu nebo v genetickém základu mezi těmito dvěma kmeny, i když proti látkový titr dosažený u C67BL/6 myší je také vyšší po injekcích LPD-MAGE-3-His + SBAS2 než po injekcích LPD-MAGE-3-His samotného.

Anti-MAGE-3 odpovědi ve specifických podtřídách Ig po vakcinaci v různých skupinách myší jsou uvedeny na obr. 10 a 11, které uvádějí srovnání průměrných středních ředění séra.

-15CZ 298364 B6

Ani IgA, ani ígM nebyly detekovány v žádném vzorku séra, ani u myší vakcinovaných LPD-MAGE-3-His + SBAS2.

Naopak, celkové koncentrace IgG byly o něco vyšší v séru myší vakcinovaných LPD-MAGE-3His samotným a významně vyšší v séru myší vakcinovaných LPD-MAGE-3-His v SBAS2.

Analýza koncentrací různých podtříd IgG ukázala, že u myší byla indukována smíšená protilátková odpověď, protože koncentrace všech testovaných podtříd IgG (IgGl, IgG2a, IgG2b) byly vyšší u myší vakcinovaných antigenem sadhjuvans než u myší vakcinovaných antigenem samotným nebo adjuvans samotným.

Nicméně se zdá, že charakter této smíšené proti látkové odpovědi po vakcinaci LipoD-MAGE-3 za přítomnosti SBAS2 závisí na myším kmenu, protože v séru myší Balsb/C převládal IgGl a v séru myší C57BL/6 převládal IgG2b.

3. Imunogenicita lipoprotein D 1/3-MAGE-3 + SBAS2 adjuvans u opic makak

Byly vybrány tři skupiny opic makak (Macaca Mulatta). RTS,S a gpl 20 byly použity jako pozitivní kontroly.

Skupiny

Skupina 1 levá noha: RTS,S/SBAS2 pravá noha: GP120/SBAS2

Skupina 2 levá noha: RTS,S/SB26T pravá noha: GP120/SB26T

Skupina 3 pravá noha: LipoDl/3 MÁGE 3 His/SBAS2

Zvířatům byla podána vakcína v den 0 a dosycovací dávka v den 28 a 84 den a byla jim odebírána krev pro stanovení jejich protilátkové odpovědi na MAGE-3 a protein D. Vakciny byly podávány intramuskulámě jako bolusové injekce (0,5 ml) do zadní části pravé nohy.

Malé vzorky krve byly odebírány každých 14 dní. Neheparizované vzorky krve objemu 3 ml byly odebírány z véna femoralis, krev se nechala srážet po dobu nejméně 1 hodiny a odstředila se při teplotě okolí během 10 minut při 2500 rpm.

Sérum se odebralo, zmrazilo se při -20 °C a odeslalo se pro srovnání koncentrace protilátek pomocí specifické ELISA.

96-jamkové mikroplotny (Maxisorb Nunc) se potáhly přes noc při 4 °C buď 5 pg His MAGE-3, nebo Proteinem D. Po 1 hodině saturace při 37 ^ŮC s PBS NCS 1% se přidalo sériové ředění králičího séra na dobu 15, hodiny při 37 °C (počáteční ředění 1/10) a po 3 promytích v PBS Tween se přidalo anti—králičí biotynylované sérum (1/5000, Arnersham, ref. RPN 1004, šarže 88). Plotny se promyly a na dobu 30 minut při 37 °C se přidala peroxidasa navázaná na streptavidin (1/50000). Po promytí se na dobu 7 minut přidalo 50 μΐ TMB (BioRad) a reakce se ukončila 0,5 M H₂SO₄. OD se měřila při 450 nm. Střední ředění byla vypočítána za použití SoftmaxPro.

Protilátková odpověď

Malé vzorky krve byly odebírány každých 14 dnů pro stanovení kinetiky protilátkové odpovědi na MAGE-3 pomocí ELISA. Výsledky ukazují, že po 1 injekci LPD-MAGE-3-His + SBAS2 byl titr celkových Ig specifických pro MAGE3 nízký a jasné zvýšení bylo pozorováno u 3 z 5 zvířat po druhé a třetí injekci LipoDl/3 - MÁGE - 3 + adjuvans u stejných opic. Zvířata vykazující špatnou odpověď zůstávala negativní i po 3 injekcích. 28 dnů po II nebo po III dávce se titry

-16CZ 298364 B6 protilátek navrátily na základní hodnoty. Mezi těmito protilátkami převládaly podtřídy IgG a nikoliv IgM. Přesmyk na IgG ukazuje na spuštění odpovědi T-lymfocytů. Specifická odpověď pro protein D, ačkoliv byla slabá, měla paralelní průběh s protilátkovou odpovědí k MAGE-3.

Příklad 6

1. LPD-MAGE-1 His

Analogickým způsobem byl připraven LPD-MAGE-l-His. Aminokyselinová sekvence a DNA sekvence jsou uvedeny na SEQ ID NO: 3 a 4. Získaný protein byl přečištěn stejně jako LPD-MAGE-3-His protein. Stručně, buněčná kultura byla homogenizována a zpracována 4M guanidin HCI a 0,5 M β-merkaptoethanolem za přítomnosti 0,5% Empigen detergenčního činidla. Materiál byl filtrován a filtrát byl zpracován 0,6 M jodacetamidem. Karboxyamidovaná frakce byla zpracována IMAC (zinková chelatační sepharosa FF) chromatografií. Kolona byla nejprve uvedena do rovnováhy a promyta roztokem obsahujícím 4M guanidin HCI a fosforečnan sodný (20 mM, pH 7,5) a 0,5% Empigen, potom byla kolona promyta roztokem obsahujícím 4M močovinu ve fosforečnanu sodném (20 mM, pH 7,5) za přítomností 0,5% Empigen. Protein byl eluován ve stejném pufru, ale se stoupající koncentrací imidazolu (20 mM, 400 mM a 500 mM).

Eluat byl ředěn 4M močovinou. Q-sepharosová kolona byla uvedena do rovnováhy a byla promyta 4M močovinou ve 20 M fosfátovém pufru (pH 7,5) za přítomnosti 0,5% Empigen. Druhý výplach byl proveden ve stejném pufru, ale bez detergenčního činidla. Protein byl eluován ve stejném pufru, ale se stoupající koncentrací imidazolu (150 mM, 400 mM, 1M). Eluát byl potom ultra-filtrován.

Příklad 7: Konstrukce expresního plazmidu pRIT14426 a transformace hostitelského kmene AR58 pro produkci NSl-MAGE-3-His

Složení proteinu

Složení fúzního proteinu NS-l-MAGE-3-His, který je exprimován v E. coli, je uvedeno na obr. 12.

Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5.

Kódující sekvence (SEQ ID NO: 6) odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu XpL promotoru v E-coli expresním plazmidu,

Klonovací strategie pro výrobu NSl-MAGE-3-His fúzního proteinu

Výchozím materiálem byl cDNA plazmid získaný od Dr. Thierry Boon zLudwig Institute obsahující kódující sekvenci pro MAGE-3 gen a vektor pMGSl obsahující kódující region pro 81 aminokyselinový NS1 (nestrukturální protein) z Influenza.

Klonovací strategie obsahovala následující kroky:

(a) PCR amplifikací sekvencí přítomných v plazmidové cDNA pro MAGE-3 za použití kódujícího oligonukleotidu: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, a protismyslného oligonukleotidu 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tet caa; tato amplifikace vedla k následujícím modifikacím na N-konci: změnu prvních pěti kodonů na kodony používané v E. coli; nahrazení Pro kodonu v pozici 1 Asp kodonem, vložení Ncol místa na 5' konci a adici 2 Gly kodonů a 7 His kodonů následovaných Xbal místem na C-konci;

(b) klonování výše uvedeného amplifikovaného fragmentu do TA klonovacího vektoru (Invitrogen) a přípravu pracovního vektoru pRIT 14647;

-17CZ 298364 B6 (c) vystřižení Ncol-Xbal fragmentu z plazmidu pRIT 14647 a klonování do vektoru pRIT PMG81;

(d) transformaci hostitelského kmene AR58;

(e) selekcí a charakterizaci transformantů E. coli obsahujících plazmid pRIT 14426 exprimujících NSl-MAGE-3-His fúzní protein.

Charakterizace rekombinantního NSl-MAGE-3-His (pRIT 14426)

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 pg/ml kanamycinem při 30 °C. Poté, co kultura dosáhla OD = 0,3 (při 620 nm), byla provedena teplotní indukce zvýšením teploty na 42 °C.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací) trojím stlačením na French lisu. Po odstředění (60 minut, 100 000 x g) byly supernatanty pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v genech barvených Coomasie Bl, kde fúzní protein představuje přibližně 1% celkových proteinů E. coli. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností

44,9 kD. Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití anti-NSl monoklonální protilátky,

Příklad 8: Přečištění NSl-MAGE-3-His (E, coli) pro imunizaci králíků/myší

Schéma přečištění

Následující přečišťovací schéma bylo použito pro přečištění antigenu:

Lýza buněk + odstředění

Solubilizace antigenu + odstředění

Ni²⁺ + NTA agarosa koncentrování

Preparativní elektroforesa

I

Srážení TCA a solubilizace v PBS (a) Lýza buněk

Bakteriální buňky byly lyžovány ve 203 ml 50 mM PO4 pufru (pH 7,0) za použití homogenizačního přístroje (Rannie) a lyzát byl odstředěn na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 30 minut. Supematant byl odstraněn, (b) Solubilizace antigenu

1/3 pelety byla resolubilizována O/N při 4 °C ev 34 ml 100 mM PO₄ - 6m GuHCl, pH 1. Po odstředění na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 30 minut byla peleta odstraněna a supernatant byl dále přečištěn IMAC, (c) Afinitní chromatografie: Ni²⁺ + -NTA agarosa (Qiagen)

Objem kolony: 15 ml (16 mm x 7,5 cm)

Plnicí pufr: 0,1 Μ PO₄ - 6M GuHCl, pH 7

Vzorkový pufr: idem

Promývací pufr: 0,1 Μ PO₄ - 6M GuHCl, pH 7

-18CZ 298364 B6

0,1 M POj - 6M močovina, pH 7

Eluce: imidazolový gradient (0 -> 250 nM) v 0,1 M PO₄ pufru, pH 7, doplněném 6M močovinou.

Průtok: 2 ml/min ' a. Koncentrování

Antigen-pozitivní frakce IMAC eluatu (160 ml) byly odebrány a koncentrovány na 5 ml v Amicon míchací kývete na Filtron membráně (typ Omega s limitem 10000). Čistota v tomto stadiu byla přibližně 70 % podle SDS-PAGE.

io b. Preparativní elektroforesa (Prep Cell BioRad)

2,4 koncentrovaného vzorku byla zahřívána při teplotě varu v 0,8 ml redukčního vzorkového pufru a tento materiál byl vnesen na 10% akrylamidový gel. Antigen byl eluován vTrisGlycinovém pufru, pH 8,3, doplněném 4% SDS a NS1-MAGE 3 His-pozitivní frakce byly odebrány.

c. TCA srážení

Antigen byl srážen TCA a po odstředění na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 20 minut byl supematant odstraněn. Peleta byla resolubilizována v PBS pufru, pH 7,4,

Protein je solubilní v PBS a po zmrazení/rozmrazení nevykazuje známky jakékoliv degradace při skladování po dobu 3 hodin při 37 °C a má zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 50 000 Daltonů, jak je určeno SDS (12,5% PAGE).

' Příklad 9: Příprava kmene E. coli exprimujícího fúzní protein CLYTA-MAGE-l-His koncovka

1. Konstrukce expresního plazmidu pŘIT14426 a transformace hostitelského kmene AR58 pro produkci NSl-MAGE-3-His

Složení proteinu

Složení fúzního proteinu Clyta-MAGE-l-His, který je exprimován v E. coli, je uvedeno na obr. 15.

Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 7.

Kódující sekvence (SEQ ID NO: 8) odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu XpL promotoru v E-coli expresním plazmidu.

Klonování:

Výchozím materiálem byl vektor PCUZ1, který obsahuje 117 C-koncových kodonů LytA 40 kódujícího regionu ze Streptococcus pneumoniae a vektoru pRIT 14518, do kterého jsme předtím klonovali MAGE-1 genovou cDNA z plazmidu získaného od Dr. Thierry Boon zLudwig Institute.

Klonovací strategie pro expresi CLYTA-Mage-l-his proteinu (viz schéma na obr. 16) obsaho45 vala následující kroky:

2. Příprava modulu CLYTA-Mage-l-His kódující sekvence (a) Prvním krokem byla PCR amplifikace, která přidávala ke CLYTA sekvenci Ndel—AflIII restrikční místa na obou stranách. PCR amplifikace byla provedena za použití plazmidu PCUZ1 jako templátu a kódujícího oligonukleotidového primerů 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC

-19CZ 298364 B6

TGG CCT GTC TGC CAG. Tato amplifikace vedla k zisku 378 nukleotidů dlouhé CLYTA sekvence.

(b) Druhým krokem bylo navázání CLYTA sekvence na MÁGE-1-His sekvenci za získání kódující sekvence pro fúzní protein. Tento krok obsahoval excisi Ndel-AflIII Clyta fragmentu a jeho inserci do vektoru pRIT145l8, který byl předen nahrazen Ndel a Ncol (Ncol a AflIII kompatibilními) restrikčními enzymy a tento postup vedl k zisku plazmidu pRIT 14613.

(c) Transformace hostitelského kmene AR58.

(d) Selekce a charakterizace transformantů E. coli (KAN resistentních) obsahujících plazmid pRITl4613 (viz obr. 16).

1. Charakterizace rekombinantního proteinu CLYTA-MAGE-l-His (pRITl4613)

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 gg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 0,3 (při 620 nm), byla provedena teplotní indukce zvýšením teploty na 38 °C.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací) jedním stlačením. Po odstředění byly supematanty pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúzní protein představuje přibližně 1 % celkových proteinů E. coli. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 49 kD. Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití anti-Mage-1-monoklonální protilátky.

Obnovení expresní jednotky složené z dlouhého ÁpL promotoru (použitelného pro indukci kyseliny nalidixovou) a CLYTA-Mage-l-his kódující sekvence pRIT 14614.

EcoRI-NCOl restrikční fragment obsahující dlouhý pL promotor a část CLYTA sekvence byl připraven z plazmidu pRIT DVA6 a byl insertován mezi ECORI-NCOl místa plazmidu pRIT14613.

Byl získán rekombinantní plazmid pRIT 14614.

Rekombinantní plazmid pRITl4614 (viz obr. 17) kódující fúzní protein CLYTA-Mage-l-His byl použit pro transformaci E. coli AR120. Byl selektován a charakterizován Kan resistentní kmen.

Charakterizace rekombinantního proteinu

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 mg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 400 (při 620 nm), byla přidána kyselina nalidixová v konečné koncentraci 60 mg/ml.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací jedním nárazem). Po odstřední byly supematant pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúzní protein představuje přibližně 1 % celkových proteinů E. coli. Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití králičích antí-Mage-1 polyklonálních protilátek. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 49 kD.

Příklad 10: CLYTA-Mage-3-His

A. Rekombinantní antigen způsobující rejekci národu: fúzní protein CLYTA-Mage-3-His, kde je fúzním partnerem C-lyt A, který způsobuje expresi solubilního proteinu, působí jako afinitní koncovka a je epitopem pro T-pomocné lymfocyty.

-20CZ 298364 B6

Příprava kmene E. coli exprimujícího fúzní protein CLYTA-Mage-3-His

Konstrukce expresního plazmidu pRIT14646 a transformace hostitelského kmene AR120:

Složení proteinu

Složení fúzního proteinu Clyta-MAGE-3-His, který je exprimován v E. coli, je uvedeno na obr. 18.

Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 9 a kódující sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 10.

Kódující sekvence odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu XpL promotoru v E-coli expresním plazmidu.

Klonování:

Výchozí mateirál byl vektor PCUZ1, který obsahuje 17 C- koncových kodonů LytA kódujícího regionu za Sterptococcus pneumoniae (Gene 43, (1986), str. 265-272) a vektor pRIT 14426, do kterého jsme předtím klonovali MAGE-3 genovou cDNA z plazmidu získaného od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute.

Klonovací strategie pro expresi CLYTA-MAGE-3-His proteinu (viz schéma na obr, 19) obsahovala následující kroky:

1. Příprava modulu CLYTA-MAGE-3-His kódující sekvence

1.1 Prvním krokem byl PCR amplifikace, která přidávala ke CLYTA sekvenci AfHI a AflIII restrikční místa na obou stranách. PCR amplifikace byla provedena za použití plazmidu PCUZ1 jako templátu kódujícího oligonukleotidového primerů 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac; a protismyslného oligonukleotidového primerů 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Tato amplifikace vedla k zisku 472 nukleotidů dlouhé CLYTA sekvence. Tento amplifikovaný fragment byl klonován do TA klonovacího vektoru (Introgen) za vzniku pracovního vektoru pRIT 14661.

1.2 Druhým krokem bylo navázáno CLYTA sekvence na MAGE-3-His sekvenci za získání kódující sekvence pro fúzní protein. Tento krok obsahoval excizi AΠΙΙ-AflIII Clyta fragmentu a jeho inserci do vektoru pRIT 14426, kteiý byl předem natráven AflIII a Ncol (Ncol a AfHI kompatibilními) restrikčními enzymy a tento postup vedl k zisku plazmidu pRIT14662.

2. Obnovení expresní jednotky složené z dlouhého XpL promotoru (použitelného pro indukcí kyselinou nalidixovou) a CLYTA-Mage-3-His kódující sekvence

BglII—Xbal restrikční fragment obsahující dlouhý pL promotor a CLYTA-MAGE-3-His kódující sekvenci byl připraven zplazmidu pRIT14662 a byl insertován mezi BglII—Xbal místa plazmidu TCM67 (derivát pBR322 obsahující gen pro resistenci na ampicilin a dlouhý XpL promotor, popsaný v mezinárodní přihlášce PCT/EP 92/01827). Byl získán plazmid pRIT 14607.

Rekombinantní plazmid pRITl46607 kódující fúzní protein CLYTA-MAGE-3-His byl použit pro transformaci E. coli AR 120 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. 82:88). Byl selektován a charakterizován kmen resistentní na ampicilin.

-21 CZ 298364 B6

3. Příprava plazmidu pRIT 14646

Nakonec byl připraven plazmid podobný pRIT 14607, ale obsahující resistenci na kanamycin (pRIT14646).

Charakterizace rekombinantního proteinu

Bakterie byly kultivovány na LB médiu doplněném 50 mg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 400 (ph 620 nm), byla přidána kyselina nalidixová v konečné koncentraci 60 mg/ml.

Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací jedním nárazem). Po odstředění byly supernatanty pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Blue, kde fúzní protein představuje přibližně 1 % celkových proteinů E. coli. Fúzní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití králičích anti-Mage-3 polyklonálních protilátek. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 58 kD.

Příklad 11: Přečištění rekombinantního proteinu CLYTA-Mage-3-His

Rekombinantní bakterie AR120 (pRlT4646) byly kultivovány ve 201itrovém fermentačním tanku za doplňování živin při 30 °C. Exprese rekombinantního proteinu byla indukována přidáním kyseliny nalidixové v konečné koncentraci 60 mg/ml. Buňky byly sklízeny na konci fermentace a byly lyžovány při 60 OD/600 pomocí dvou průchodů French lisem (20 000 psi). Lyžované buňky byly peletovány během 20 minut při 15 000 g při 4°C. Supernatant obsahující rekombinantní protein byl vnesen do iontoměničové DEAE Sepharose CL6B pryskyřice (Pharmacia) předem uvedené do rovnováhy v pufru A (0,3 M NaCl, 20 mM Tris HC1, pH 7,6). Po promytí kolony pufrem A byl fúzní protein eluován 2% cholinem v pufru A. Byly odebrány frakce pozitivní na antigen, jak byly stanoveny westernovým přenosem za použití anti-Mage-3 protilátky. Antigen eluovaný z DEAE byl přenesen do 0,5% Empigen BB (obojetné detergenční činidlo) a do 0,5 M NaCl před tím, než byl vnesen do afinitní chromatografické kolony využívající iont kovu, která byla předem uvedena do rovnováhy v pufru B (0,5% Empigen BB, 0,5 M NaCl, 50 mM fosfátový pufru, pH 7,6).

IMAC kolona byla promývána pufrem B do té doby, než dosáhla absorbance ph 280 nm základní hodnoty. Druhé promytí pufrem B bez Empigen BB (pufr C) pro eliminaci detergenčního činidla byl proveden před elucí antigenů imidazolovým gradientem 0 až 250 mM imidazolu v pufru C.

0,090 až 0,250 M imidazolové frakce byly shromážděny a byly koncentrovány na 10 kDa Filtrom omega membráně před dialýzou proti PBS pufru.

Závěr:

Prokázali jsme, že fúzní protein LPD-MAGE-3-His je imunogenní u myší a že tato imunogenicita (proliferativní odpověď a protilátková odpověď) může být dále zvýšena použitím adjuvans popsaného výše. Přečištění může být zlepšeno derivatizací thiolů, které tvoří disulfidové můstky.

Také jsme prokázali, že lepší protilátková odpověď je spouštěna vakcinací LPD-MAGE-3-His za přítomnosti adjuvans. Převládající izotop nacházený v séru C57BL/6 je IgG2b, což naznačuje, že byla vyvolána imunitní odpověď Thl typu.

U člověka byl popsán případě pacienta léčeného LPD-MAGE-3-His v prostředku bez adjuvans, který byl vyléčen z maligního melanomu.

-22CZ 298364 B6

Odkazy:

Anichini A., Fossati G., Parmiani G. lmmunol. Today, 8: 385 (1987).

De Plaen E., Arden K., Traversari C., et al. Immunogenetics, 40: 360 (1994).

Gaugler B., Van den Eynde B., van der Brugen P., et al., J. Exp. Med. 1979: 921 (1994).

Herman J., van der Bruggen P., Immanuel F., et al, Immunogeneíics, 43:377 (1996).

Inoue H., Moři M., Li J., et al, Int. J. Cancer, 63. 523 (1995).

Kensil C.R., Soltysik S., Patel U., et al., in: Channock R.M., Ginsburg H.S., Brown F., et al,, (eds). Vaccines 92.

(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), 36-40: (1992).

Knuth A., Danowski B., Oettgen H.F., etal. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 3511 (1984).

Paterd J.J., Brasseur. F., Gil-Diez S., et al, Int. J. Cancer, 64: 60 (1995).

Ribi E., et al. in: Levine L., Bonventre P.F., Morello J., et al. (eds). Američan Society for Microbiology, Washington CD, Microbiology 1986, 9-13; (1986).

- Van den Eynde B., Hainaut P., Hérin M. et al., Ní. J. Cancer, 44: 634 (1989).

- Van der Bruggen P.₅ Traversari C., Chomez P., et al., Science 254: 1643 (1991).

Van der Bruggen P., Bastin J., Gajewski T., et al. Eur. J. lmmunol,, 24: 3038 (1994).

Van Pel A., van der Bruggen P., Coulie P.G., et al., lmmunol. Rev. 145: 229 (1995).

Weynants P., Léthé B., Brasseur F., et al., Int. J Cancer, 56: 826 (1994).

Nishimura S, Fujita M, Tarata N, Taní T. Komada M, Itoh K., Nihon Rinsho Memeki Gakkai Kaishi 1997, Apr. 20 (20): 95-101.

Fuijie T et al., Ann Oncol 1997 Apr, 8 (4): 369-72.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: SmitKline Beecham Biologicals (ii) Název vynálezu: Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MÁGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kódující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúzních proteinů a prostředků pro vakcinaci (iii) počet sekvencí: 10 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: SmithKline Beecham (B) Ulice: 2 New Horizons Court, Great West Road, B (C) Město: Middx (D) Země (E) Stát: UK (F) ZIP: TW8 9EP (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM kompatibilní (C) Operační systém: DOS

-23CZ 298364 B6

M3 (D) Software: FastSEQ pro Windows verze 2.0 j (vi) Data současné přihlášky: J (A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Data předchozí přihlášky:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(viii) Zástupce/Agent - informace (A) Jméno: Dalton, Marcus J (B) Registrační číslo:

(C) Reference/č. rejstříku: B45126 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 0181 9756348 (B) Telefax: 0181 9756177 (C) Telex;

(2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence, (A) Délka: 452 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchýj (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: protein

-24CZ 298364 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Met

Asp

Pro

Lys

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu .

Ala

Aia

Gly

Val

Leu

1

5

10:

15

Ala

Gly

Cys

Ser

Ser

His

Ser

Ser

Asn

Met

Ala ,

Asn

Thr

Gin

Met

Lys

20

25

30

Ser

Asp

Lys

Ile

Ile

Ile

Ala

His

Arg

C-lý

Aia

Ser.

Giy

Tyr

Leu

Pro

35

40

45

Glu

HiS

Thr

Leu

Glu

Ser

Lvs

Ala

Leu

Ala

Phe

Ala

Gin

Gin

Ala

Asp

50

55

60.

Tyr

Leu

Glu

Gin

Asp,

Leu

Ala

Met

Thr

Lyš

Asp

cly

Arg

Leu

Val

Val

65

7’0

75

80

Ile

His

Asp

His

Phe

Leu

Asp

Gly

Leu

Thr

Asp

Val

Aia.

Lys

Lyš

Phe

85

90*

95

Pro

His

Árg

His

Arg

Lys

Asp.

Gly

Are

Tyr

Tyr

Vál

Zle

Asp

Phe

Thr

100

105

no

Leu

lys

Glu

Ile

Gin

Ser

Leu

Glu

Met

Thr

Glu

'Asn

Phe

Glu

Thr

Me-

115

120

125

Asp

Leu

Glu

Gin

Arg

Ser

Gin

His'

Cys

Lys

Pro

Glu

Glu

Gly

Leu

du

130

135

140

Ala

Arg

C-Ly

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

Val

Gly

Aia

Gin.

Aia

Pro

Ala

Thr

1.45

1,50

155

160

Glu

Glu

Gin

Glu

Ala

Ala

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Leu

val

Glu

val

Thr

165

170

175

Leu

Gly

Glu

Val

Pro

Ala

Ala.

Glu

Ser

Pro

Asp

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

180

185

Asn

190

Gin

Gly

Ala

S.er

Ser

Leu

Pro

Τ'-i r·.

Thr

Met

T.yr

Pro

Leu

Trp

Ser

195

200

205

Gin

Ser

Tyr

Glu

Asp

Ser

Ser

Asn

Gin

Glu

Glu

Glu

Gly

Pro

Ser

Thr

210

215

,220

Phe

Pro

Asp

Leu

Glu

Ser

Glu

Phe

Gin

Ala

Ala

Leu

Sér

Arg

Lys

Val

225

250

235

240

Ala

Glu

Leu

Val

Híš

Phe

Leu

Leu

Leu

Lvs

Tyr

Arg

Ala

Arg

Glu

Pro

245

250

255

Val

Thr'

Lys

Ala

Glu

Met

Leu

Gly

Ser

Val

Val

Gly

Asn

Trp

Gin

Tyr

260

phe

265

270

Phe

Phe

Pro

Val

ile

.Ser

Lys

Ala

Ser

Ser

;Ser

Leu

Gin

Leu

Val

275

280

285

Phe

Gly

Zle

Glu·

Léu

Met

Glu

Val

Asp

Pro

Ile

Giy

His

Leu

Tyr

ile

290

295

300

Phe

Ála

Thr

Čvs

Leu

Glv

Leu

Ser

Tyr

Asp

Glv

Leu

Léu

Giy

Asp

Asn

305

Lvs

310

315

320

Gin

Ile-

Met

Pro

Ala

Gly

Leu

Leu

Ile

Ile

Val

Leu

Ala

Ile

Ile

325

330

335

Ala

Arg

Glu

Gly

Asp

•Cys

Ala

Pro

Glu

Glu

Lys

Zle

Trp

Glu.

Glu

Leu

3'40

345

350

Ser

Vál

Leu

Glu

Val

Phe

Glu

Gly

Arg

Glu

Asp

Ser

Ile

Leu

Giy

Asp

355

360

365

Pro

Lys

Lys

Leu

Leu

Thr

Gin

His

Phe

Val

Gin.

Glu

Asn

tyr

Leu

C-iu

370

375

380

Týr

Arg.

Gin

Val

Pro

Gly

Ser

Asp

Pro

Ala

Cvs

Tyr

Glu

Phe

Leu

Trp

385

390

395.

4'00

Gly

Pro

Arg

Ala.

Leu

Val

Glu

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Leu

His

His

.4 05'

-.410

415

Met

Val

Lys

ile

Ser

Gly

Giy

Pro

His

Zle

Ser

Tyr

Pro

Pro

Leu

His

:420

425

430

Glu

Trp

Val

Leu

Arg.

Glu

Gly

Glu

Glu.

Thr

Ser

Gly

Gly

His

His

His

435

440

445

His

His

His

5,0

-25CZ 298364 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1353 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

ATGGATCCAA	AAACTTTAGC	CGTTTCTTTA	TTAGCAGČT2	gcgtactagc	AGGTTGTAGC	60
AGCCATTCAT	CAAATATGGC	GAAŤAČCCAA	ATGAAATCÁG	ACAAAATCAT	TAŤTGČTCAC	120
CGTGGTGCTA	GCGGTTATTT	ACCAGAGCAT	ACGTTAGAAT	TAAAGCACT.	TGCGTTTGCA	180
CAACAGGCTG	ATTATŤTAGA	GGAAGATTTA	GCAATGAOŤA	AGGATGGT CG	TTTAGTGGTT	240
ATTCACGAŤČ	ACTTTTTAGA	TGGCTTGACT		AAAAATTCCC	AOATCGTČÁT	300
GGTAAAGATG	GGGGTTACTA	TGTCATCGAC	TTTACCT7AA	AAGAAATTCA	AAGTTTAGAA	350
ATGACAGAAA	ACTTTGAAAC	GAŤGGATCTG	GAACAGCGTA	GTCAGCACTG	CAÁGCCTGAA	423
GAAGGGCTTG	AGGCCCGAGG	AGAGGCCCTG	GGCCTGGTGG		TCCTGCTACT	480
GAGGAGCAGG	AGGCTGCC.TC	CTCCTCTTCT	ACTCTAGTTG	AAGTCACCCT	GGGGGAGGTG	540
CGTGCTGCCG	AGTCACCAGA	TCCTCCCCAG	AGTCCTCAyj1	GAGCCTCCAG	CC7CCCCACT	600
ACCATGAACT	ACGCTCTCTG	GAGCCAATCC	Τ’*1 rpr* Z* Λ iftlvftbwVw -	CCAGCAACCA	AGAAGAGGAG	660
GGGCCAAGCA	CCTTCCCTGA	CCTGGAGTCC	GAGTTCCAAG	CAGCACTCAG	TAGGAAG GTG	720
GCCGAAT7GG	TTCATTTTGT	GCTCGTCAAG	TATCGAGCCA	GGGAGCCGGT	CACAAAGGCA	780
GAAATGCTGG	TC GT	CGGAAATTGG	CAGTATTTCT	TTGGTGTGAT	CTTCAGCAAA	840
GCTTCCAGTT	CGTTGCAGCT	GGTCTTTGGC	ATCGAGCTGA	T G G AAG T kj íí A	CCGCATCGGC	900
CACTTGTACA	TCTTTGCCAC	CTGCCTGGGC	CTCTCC.TACG	ATGGCC7GCT	GGG T GACAAT	960
CAGATCATGC	C CrAG\»CAG G.	CCTCGTGATA	ATCGTCCTGG	CCATAATCGC	AAGAGAGGGC	1020
GACTGTGCCC	CTGAGGAGAA	.AATCTGGGAG	GAGCTGAGT--.	TGTTAGAGGT	GTTTGAGGGG	L08Ó
AGGGAAGACA	GTATCTTGGG	GGATCCCAAG	AAGCTGCTCA	CCCAACATTT	CGTGCAGGAA	114.0
AACTACGTGG	AíjTACCGGCA	GGTCCCCGGC	AGTGATCCTG	GATGTTATGA	ATTCCTGTGG	1200
GGTCGAAGGG·	CGCTCGTTGA	•AACCAGCTAT	GTGAAAGT”	TGCACCATAT	GGTAAAGATC	1250
AGTGGAGGAG	CTCACATTTC	GTACCCACCC	ctgcatgagt	GGGTTTTGAG	AG AG G GG GAA	132C
GAGGGCGGTC	ATCACCATCA	CCATCACCAT	TAA			1353

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1341 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

-26CZ 298364 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

AT	AAACTTTAGC	CCTTTCTTTA·	- »	GCGTACTAGC	AGGTTGTAGC	ĚO
AGCCATTCAT	CAAAT AT GG C	GAATACCCAA	AT G -------T GAG	ACAAAATCAT	TATTGCTCAC	12C
CGTGGTGCTA	GCGGTTATTT	ACCAGAGCAT	ACGTTAC-AAT	CTAAAGCACT	IxjCíj 1 ; ;	1S0
CAACAGGCTG	ATTATTTÁGÁ	GCÁAGATTŤA	GCAATG.ACŤA	aggatggtgg	TTTAGTGGTT	240
ATTCACGATC	ACTTTTTAGA	TGG.CTTGACT	GAT GT 7 G C G-·	AÁAAATTCCC	ACATCGTCAT	300
CGTAAAGATG	GCCGTTACTA	TGTCATCGAC	T T TAC C 7 7 AA	AAGAAAT.TČA	AAGTTTAGAA	360
AT G ACAG AAA.	ACTTTGAAAC	CATC-GGCTCT	CTGGAACAGG	G.TÁGTCTGCA	C7GCAAGCCT	420
CAGGAAGCCc	ttgagGccča	ACAAGAGGCC	ctgggggtgg	.TGTGTGTGČA	GGČTGCCACC	480
TCCTCCTCCT	CTCCTCTGGT	CCTGGGCAC.C	c tgga.gg.-gg	TGCCCACTGC	TGGGTCAA-CA	'54 0
GÁTCCTCCGC	AGAGTCCTCA	GG Grt G C CT. C C		CTACCATCAA	CT7CACTCGA	600
GAGAGG CAAC	CC AGTGAGuij	7TCCAGCAGC	CGTGAAGXGG	AGGGGCCAAG	CACCTČTTGT	660
ATCCTGGAGT	CCTŤGTŤCCG	AGCAGTAATC	AC T Aj-aj—-Aáj ij	7GGCTGATTT	GGTTGGTTTT	7-20
CTGČŤCČTCA.	AATATCGÁGC	CÁGGGAGC.CA.	G T CAČAAAGG	CAGAAATGCT	GGAGÁGTGTC	750
ATCAAAAATT	ACAAGCAGTG	T.TTTCCTGAG		AAGCCTCTGÁ	G7CCTTGCAG	840
CTGGTCTŤŤG	GCATTGACGT	gaaGgaagca	GA.C C 7 C.AC C G	GČGÁCTCGTA	ŤGŤČCTŤGTC	900
ACCTGCCTAG	G.TCTCTCCTA	T.GATGGCCTG	CTGGG7GATÁ	A7CAGÁTCÁT	GCCCAAGACA	960,
GGOTTCCTGA	TÁATTGTCCT	GGTCATGATT	GCAATGGAGG	G.C.G G CC ATGC	TCCTGAGGAG	L020·
GAÁAT.CTGGG	AGC-AGCŤGAG	TGTGATGGAG	:\jTG ΤΑ7;ςΑ7 ví	GGAGwvjAGCA	GAGŤGCCTAT	1080
GuGGAGCCCA	GGAAGCTGCT	CACCCAAGAT	TTGGTGCAGG:	AAAAGTACCT	GGAGTACCGG	1140
CAGGTGCCGG	ACÁGTGATCO	CGCACGČTAT	GÁGTTCČTGT	GGGGTCCAAG	GGCCCTCGCT	1200
GAAACCAGCT	ATGTGAAAGŤ	CCTTGAG.TAŤ	GT GA.TGAAGG	TCAGTGCAAG	AGTTCGCTTŤ	1260
η* <*| rp P *“ f * jyj CACČATCÁCG	CGCTGCGTGA ATCACČATTA	AGCAGCTTTG A	AGAGAGGA.GG	AAGAGGGAC-T	CGGCGGTCAT	1320 1341

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 466 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met

Asp

Pro Lys

Thr

Leú

Ala

Leu

Ser

*jSU·

Leu

Ala

Ala

Gly

Val

Leu

1

Gly

,5

1,0

Gin

15

Ala

Cvs Ser

Ser.

His

Ser

:S’er.

Asn·

Met

Ala.

Asr.

Thr

Met

Lys

20

ťie

25

30

Ser

Asp

Lvs Ile

Ile

Ala

His

Áig

Gly

Ala

Ser

Gly

Tyt

Leu

Pro

35

40

45,

Glu

His

Ťhr. Leu

Glu

Ser

Lva

Ala

Leu

Ala

'Phe

Ala

Gin

Gin

Ala

Asp

5C

55

60

Tvr

Leu·

Glu Gin

Asp

Leu·

Ala

Met

Ťhr

Lys

Ásp

Gly

Arg

Leů

Val

Val

65

70

75

80

Ile·

His

Asó His.

Phé

Leu. Asp

Gly

Leu,

Thr

Asp.

Val

Ala

Lys

Lvs

Phe

85

90'

95

-27CZ 298364 B6

Pró His Arg His

Arg Lys.

Ásp

Gly

Árg 105

Tvr

Tyr

Val

Ile·

Aso Phe 110

Thr

100.

Leu

Lys

Glu

Ile'

Glh· Ser

Leu

Glu

Met

Thr

Glu Asn

Phe

Glu

Thr

Met

115

120

125

Gly

Ser

Leu

Glu

Gin -Arg

Ser

Leu

His:

Cys

Lýs

Pro

Glu

Glu

Ala

Leu

130

135

140

Glu

Ala.

Gin

Gin

Glu. Ala

Leu

Gly

Leu

Val

.cys

Val

Gin

Ála

Ala

Thr

145

1ŠÓ

155

160’

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro Leu

Val

Leu

Gly

Ťhr

Leu.

Glu

Glu

val

Pro

Thr

,165.

170

175

Ala

Gly

Ser

Thr

Ásp Pró

Pro

Gin

Ser

Pro

.Glň

Gly

Ala

Ser

Ala

Phe

180

185.

190:

Prc

Thr

Thr

L Σ 5=

Asn Phe

Arg

Gin

Arg

Gin.

Pro

Ser

Glu

Glý

Sér

195

200

205

Ser

ser

Arg

Glu

Glu Glu

Glv

Pro

Ser

Thr

Ser

Cys

lis

Leu

Glu

-Ser

210

215

220

Leu

Phe·

.Arg

Ala

Val Ile

Thř

Lýs

Lys.

vál

Ala.

Asp

Leu

Val

Gly

Phe

225

230

225-

240

Leu·

Leu

Leu

Lys

Tvr Arg:

Ala

Árg

Glu

Pro

Vál·

Ťhr

Lys

Ala

Glu

Met.

245

250

255

Leu

Glu,

Sér

Vál

“la Lys

Asn

Tyr

Lvs

His

Cvs.

Phe

Pro

Glu

Zle

Phe

260

265

270

Gly Lys

.Ala

Ser

Gltí.. ;Ser

LéU

Gin

Léu

Val

Pne·

Gly

Zle

Asp

Val. Lys

27 5

290

.285

Glu.

Ala

Asp

Pro

Thr Gly

His

Ser-

Tyr

Val

Leu Val

Tta —

Čys

Leu

Gly

290

295

300

Leu:

Ser

Tyr

Asp

Gly 'Leu

Léu

Gly

Ásp

Asn

Gin

I-lé

Met;

Pro

Lys

Thr

305

310'

.315

320

Gly

Phe

Leu

Ile

ris Val

Leu

.Val

Měř

Ile

Ala

Me-

Glu

Gly

Gly

His

325

330

235

Ala

Pro

Glu

Glu

Glu. i*

Trp

Glu

Glu

Leu

Ser

Val

Met

Glu

Vál

Tyr

340'

345

350

Asp

Gly

Arg

Glu

His·. Ser

* 1 -

Tvr

Gly

Glu

Pro

Arg,

Lvs

Leu

Leu'

Thr

355

360

3'65

Gin

ÁSD

Leu

Val

Gin1 Glu

Lvs

Tyr'

Leu

Gíu

Tyr

Atg

Gin

Val

Pro

Asp

370'

375

380

Ser

Asp:

Pro

Ala

Are Tvr

Glu

.Phe

Leu

Tru

Gly

Pro

Arg.

Ála

Léu

Ala

335

39.C

395

4.00

Glu

Thr.·

Ser·

Tyr

Val Lvs

Val

Leu

Glu

Týr

Val

Ile

Lys

Val

Ser

Ala

405

410

415

Arg

Val

Arg·

Phe

.Phe Phe

Ser

Leu

Árg

Glu

.Ala

Ala

Leu

Arg

Glu

420

425

430

Glu

Glu

Glu

'Gly

Val Gly

Gly

His

His.

His

His

His

His

His

435

44 0

44 5

(2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 404 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární o

(ii) Typ molekuly: protein

-28CZ 298364 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Met

Asp

Pro

Asn Thr

Val

Ser

Ser

rhe

Glň

Val

Asp Cys.

Phe

Leu

Trp

I

,£Z •rf-

10

15

His

Val

Arg

Lys Arg

Val

Ála

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly Aso

Ala

Pro

Phe

2C

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu Arg

Arg Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

Glv

Arg

Gly

Ser

35

.40

4 5

Thr

:Leú

Gly

Leu Asp

Zlé-

GÍU

Ala

Thr'

Arg

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile.

50

55

60

Val

Glu

Arg

Ile Leu

Lys

Glu

Gl-

Ser

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Met

65

Glu- Gin

70

Cvs

75'

30

Met

Asp.

Leu

Arg

Ser

'C -LTi

His

Lvs

Pro

Glu

Glu

Gly

Leu

85

90

95

Glu

Ala

Arg

Giy Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

Val

Gly

Ala

Gin

Ala

Prc

Ala.

100

105

110

Thr

Glu

Glu

Gin Glu

Ála

Ala

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Leu

Val

G-u

val

115

GÍu Val

120

125

Thr

Leu

Gíy

Pro .Alá

Alé

Glu

Ser

Pro:

Asd

Pro

Pro

Gin

Ser

130

135

140

Pro

Gin

Gly

Ala Ser

Sér

Léu

Pro

Thr

Thr

Met

Ašn

Tyr

Pro

L'eu'

Trp

14 5

15C

155

163

Ser

Gin

Ser

Tvr Glu

Asp

Ser

Ser

Asn

Gin

Glu

Glu

Glu

Gly

Pro

Ser

165

17Ό

175

Thr·

Phe

Pro

As o. Leu

Glu

Ser

Glu

Phe

Gin

Ala

Ala

Leu

Ser

Arg

Lys

180

185

Leu

190

Val·

Ala

Glu

Leu Val

His

Phe

Leu

Leu

Lys

Tvr

Arg

Ala

Arg

Glu

195

200

Gly

205

Pro

Val

Thr

.Lys Ala

Glu

Mét

Leu

Sér

Val·

Val

Gi.y

Asn

Trp

Gin

210

215

220

Tvr

Phe

Phe

Pro Val

Ile

Phe

'Sér

Lys.

Ala

Ser

Seř

Ser

Leu

Gin.

'Leu

225

Ile Glu

230

Val

23’5

240

Val

Phe

Gly

Leu.

Met

Glu

Asd-

Pro

Ile

Glv

His

Leu

Tyr

2'45

2.50

25.5

lis

Phe

Alá

Thr Cýs

Leu

Gly

Leu

Sér

Tvr

Asp

Gly

Leu

Leu

Glv

Asp

260

265

270

Ásn

Gin

Ile

Meť Pro

Lys

Ala

Glv

Leu

Leu

T i Λ

Ile

Val

Leu

Ala

Ile

275

280

285

le

Ala

Arg

Glu Glv Asp

Cvs

Ale

Pro

Glu

Glu

Lvs

ule

Trp

Glu

Glu

290

295

300

Leu

Ser-

val

Leu. Glu

Val

Phe

Glu

Gly

Arg

Glu

Asp

Ser

Ile

Leu

Glv

3C5

3W

315

320

Asp

Pro

Lvs

lvs Leu

Leu·

thr·

Gin

His

Phe

Val

Gin

Glu

Asn

Tyr

Leu

325

330

335

Glu

tyr

Arg

Glh Val

Pro

Gly

Ser

Asp

Pro.

Klá

Cys

Tyr

Glu

Phe

Leu

34 0

3.45

350

Trp

Gly

Pro

Arg Ála

Leu

Val

Glu

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Leu

His

155

360

365

:HÍS

Měr

Val

.Lys Ile·

Ser

Gly

Gly

Pro

His

Ile

Ser

Tyr

pro

Pro

Leu

370

375

38 0

His

Glu

Trp

Val Léu

Arg

Glu

Gly

Glu

Glu

Gly

Gly

His

His.

His

His

385

390

395

400

Hi-S

His

HiS

(2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1212 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý io (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

-29CZ 298364 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

ATGGÁTCCAA	ACAČTGTGTC	AAGCTTTCAG	G T.AGAGT GCT	TTCTTTGGCA	i V» L	60
CGAGTTGCAG	ACCAAGAACT	ÁGGŤGATGCC	CCATTCCTTG	Αχ CGvjCTTCG		120
AAATCCCTAA	GAGGAAGGGG	CAGCACTCŤT	GGŤŤTGGACA	T CGAGAC Agc	CA CAC G 7G\_ T	180
GGAAAGČAGA	TAGTGGAGCG	GATTCTGAAA	GAAGÁATČCG	ATGAGGCACT	ŤAAÁATGACC	240
•'ATGGATCTGG	AACAGCGTAG	TCAGCACTGC	AAGC CT G A-.C	ArtC-GCCTTGA	G uL· C C k; nu	300
GAGGCCCTGG	GCCTGGTGGG	TGCGCAGGCT	* Cu ΙΛί. . J	aggagcagGa	GGCTGCCTCC	360
	CTC.TAGTTGA	AGTCACCCTG	GGGGÁGGTGC	CTGCTGCCGÁ	GTCACCAGAT	420
.CCTCCCCAGA	GTCCTCAGGG	AGCCTCCAGC	CTCCCCACTA	CCATGAACTA	CCCTCTCTGG	480
AGCCAATCCT	atgaggactc.	CAGCAACCAA	G AAGAGGAG0	GGCCAÁGCAC	CT.TCŤCTGAC	54p
CTGGAGTCCG	AGTTCCAAGC.	AGCACTCAGT	nm m rJjw/v.utf i	CCGAATTGGT	* C ^ ** ^* *~ 7	600
CTCCTCAAGT	AT CGAGCCAw	GGAGCCGGTC	A 0 AAAG ό CAG	AAATGCTGGG	GAGTGTCGTC	660.
•GGÁAATTGGC	AGTATTŤCTT	TCCTGTGATC	TT CAGCAAAG	CTTCCAGTTC	CTTGCAGdG	720
GTCTTTGGCA	TCGÁGCTGAT	GGAÁGTGGAC	CCCAT CGGCC	ACTTGTACAT	CTTTGCGACC	7 80
TG<_ CTGGGCC	TCTCCTACGA	TGGGCTCCTG	ggtgacaatc	AGAŤCATGCC	CAAGGCAGGC	840
CTCCTGAŤAA	TCGTCCTGGC	CATAATCGCA	AuAGAGGGCG	AČTGŤGCGCC	T GAG v AGAťxA	'900
ATCTGGGAGG	AGCTGAGTGT	GTTAGAGGTG	TTTGAGGGGA	GGGAAGACAG	TATGTTGGGG	960
GATGCCAAGA	AGČTGCTCAC	CCAACATTTC	G TGCAGGA.AA	AČŤACCTGGÁ	GTACCGGCAG	1'020.
GTCCGCGGCA	gťgátcctgg	ATGTTATGAA	TTCCTGTGGG	GTCCAAGGGC	CCTCGTTGAA	1080
ACCAGCTATG	TGAAAGTCCT	GCACCATATG	GTAAAGATCA	gtggaggacc	TCACAT.TTCC	1140
TACCCACCCC	tgcaťgagtg	GGTTTTGAGA	GówiGG^AAG	agggcggtca	TCACCATCAC	.1200
CATCÁCCATT	ΆΑ					1212

(2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence <

(A) Délka: 445 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Meť

Lys Gly

Gly

Ile

Val

His

Ser

Asp

Gly Ser

Tyr

Pro

Lys

Asp

Lys

-1’

5

10

15

Phe

Glu Lys

Ile

Asn

Gly

Thr

Trp-

Ť vr

Tyr- Phe

Asp

Ser

Šer

Gly

Tyr

•20

.25?

30

Měc.

Leu Ala·

Asp Arg

Trp Arg

Lys

His

Thr Asp'

Gly

Asn

Trp

Tyr

Trp

35

40

45

Phé·

Asp Asn

Ser

G1X

Glu

Met

Ala

Thr

Gly Trp

Lvs.

Lys

Ile

Alá

Asp

50

55

60

Lvs

Trp Tvr

Ťyr.

Phe

Asn

Glu

Glu

Glv

Ala Met

Lys

Thr

Gly

Trp

Val

65

70

7.5

80

Lys

Tyr Lys

Ásp

Thr

Trp

Tyr

Ťyr' Leu.

As o· Ala

Lvs

Glu

Gly

Au a

Met

85

90'

95

Val

Ser Asn

Ala

Phe

Ile

Gin

Ser

Ala

Asp Glv

Thr

Gly'

Tro

Tyr

Tyr

100

105

110

-30CZ 298364 B6

Leu

Lvs.

Pro Asp Gly Thr Leu Ala

Asp

Arg

Pro

Glu

Leu 125

Asp

Met

Gly

115

120

Ser

Leu

Glu

Gin

Arg

Ser

Leu

His

Cys

Lys

Pro

Glu

Glu

Ala

Leu

Glu

130

135

140

Ala

Gin

Gin

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

Val

Cys

Val

Gin

Ala

Ala

Thr

Ser

145

150

155

160

Ser

Ser

Ser

Pro

LiSU

Val

Leu

Gly

Thř

Leu

Glu

Glu

Val

Pro

Thr

Ala

i 65·

170

175

Gly

Ser

Thr

Aso

Pro

Pro

Gíň

Ser

Pro

Gin

Gly

Ála

Sér

Ala

Phe

Pro

130

185

190

Thr

Thr

TT a

Asn

Phe

Thr

Arg

Gin

Árg Gin

Pro

Ser

Glu

GÍy

Ser

Ser

195

200

205

Ser

Arg

Glu

Glu·

Glu

'Gly

Pro.

Ser

Thr

Ser

Cys

Zle

Leu

Glu

Ser

Leu

210.

21.5

220

Phe

Arg

Ala

Val

Ile

Thr

Lys

Lys

Val

Ala

ASO

Leu

Val

Gly

Phe

Leu.

225

230

235

240

Leu

Leu

Lys

Tyr

Arg

Ala

Arg

Glu.

Pro

Val

Thr

Lys

Ala

Glu

Met

Leu

245

250

25.5

Glu

Ser

Val

Zlé

Lys

Asn

Tyr

Lys

His

Cys

Phe

Pro

Glu

Ile

Phe.

Gly

260

265

270.

Lvs' Ala

Ser

Glu

Ser

Leu

Gin. Leu'

Val

Phe

Gly

Ile

ÁSD

Val

Lys

Glu

275

280

285

Ala

AS©

Pro

Thr

Gly

His

Sér

Tyr

Vaď

Léu·

Val

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

290

295

300

Ser

Tyr

Asp

Gly'

Leu

Leu

Gly

Asp

Asn

Gin

Zle

Met

Pro

Lys

Thr

Gly

305

310

Met

315

320

Phe

Leu

ile

Zle

Val

Leu

Vál

ile

Ala

Met

Glu

Gly

Gly

His

Ala

325

330

335

Pro

Glu

Glu

Glu

Ile

Trp

Glu

Glu

Leu

Ser

Val

Met

Glu

Val

Tyr

Asp

340

345

350

Gly

Arg

Glu

His

Ser

Ala

Tyr

Gly

Glu

Pró Arg Lys

Leu

Leu

Thr

Gin

355

360

365

Aaip

Leu

Val

Gin

Glu

Lys

Tyr

Leu

Glu

Tyr Arg

Gin

Vál

Pro.

Asp

Ser

370

375

380

Aso

Pro

Ala

Arg

Tyr

Glu

Phe

Leů

Trp

Gly

Pro

Arg

Ala

Leu

Ala Glu

385

390

395

400

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Leu

Glu

Tyr

Val

Ile

Lys

Val

Ser

Ala

Arg

405

410

415

Val

Arg

Phe

Phe

Phe

Pro

Ser

Leu

Aru

Glu

Ala

Ala

Leu

Arg

Glu

Glu

4’2.0'

425

43.0

Glu

Glu

Glv

Val

Glv Gly

His

His

His

His

His

His

Hi$

4 35

440

4 45

(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1338 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

-31CZ 298364 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

ATGAAAGGGG AATGGCACTT CACACAGACG AAAATCGCTG AAGTACAAGG TTTATCCAGT GACAGGCCAG GAAGCČCTTG TCCT.CCTCTC

CCTCCCCAGA AGG CÁACCCA

CT.CCTCAAAT AAAÁATTÁCA GTCT.TTGGCA TGCCTAGGTC T T CCTGATAA ATCTGuGrtGo GAGCCCAG^A GT G C CG u A¹—-*. ACCÁGCTATG TTCCCATCCC CÁŤČÁCGATG

GAATTGTACA GGTACTACTT GCAACTGG TA ATAAGTGGTA. ACACTTGGTA· CÁGCGGACGG· AATTGGACAT AGGCCCAACA CTCTGGTCCT

GTCCTCAGGG GTGAGGGTTC TGTTCCGAGC ATCGAGCCAG AGCACTGTTT TTGACGTGAA TC CC Τ'AT G A ŤTGTCCTGGT

AG CTGGTCAC GTG.ATCCCGC i '-'ΛΛΛ\:1 i TA«-- Ári-OAll A ř-r* IblaU i Urti-LkSÍJ AC.CATTAA

TTCAGACGGC TGACAGTTCA CTGGTTCGAČ CTATTTCAAC CTACTTAGAC AACAG G CT Gvj GGGCTCTCTG AGAGGCČCTG GGGCACCCTG AGCCTCCGCC CAGCAGCCGT AGTAATCACT GGAGCCAGTC TCCTGAGÁTC GGAAGCAGAC TGGCCŤGČTG CATGATTGCA GATGGAGGTG CCAAGATTTG ÁCGCTATGAG TGAGTATGTG AGCTTTGAGA

CTTATCCAA GsjC i ATATGC AACTCAGGCG eAAGAAG GTG gctaaagaag TAČTACČTCA GAACAGCGTA GGCCTGGTGT G.-iu uAGGT GC TTTCCCACTA gaagaggagg AAGAAGGTGG acaaaggcag. ŤTCGGCAAAG CC CACCGGCC ggtgataatc ATGGAGGGCG TATGATGGGA GTG CAGGAAA TTCCTGTGGG ÁTCÁAGGTCA GAGGAC-GAAG

AAGACÁAGTT TTGCAGAGČG AAAT GGCTAC CCATGAAGAC GCGCCATGGT AACCAGACGG GTCTGCACTG GTGTGCAGGC. *- _ ACTGC7GG CCATCAACTT 'GGCCAAGČAČ C.TGATTTGGT AAATGCTGGA Č.CTČTGAGTC ACTCCTATGT AGATČATGCC. GCCATGCTCG gggagcacag AGTACCTGGA G.TGCAAGGGC .GTGCAAGAGT AGGGAGTCGG

TGAGAAAATCCŤGGAGGAÁG AG G CT G GAAG ÁGGCTGGGTC ATCAAATGCC aacactggca CAAGCCTGAG TGCCACCTCC GTCAACAGAT CACTCGACAG CTCTTGTÁTC· TCGTTTT.CTG GAGTGTCATC .CTTGCAGCTG CCTTGTCACC CAAGAČAGGC •T GAG G AGG AA TGCCTATGGG GTACCGGCAG 'ČCT.CGCŤGAA TCGCTTTTTC CGGTCATCAČ

120

130

240

300

260

420

480

540

600

660

720

7»0

3.40

900

960 1C20 108Ό. iuo 12C0 1260 1320 1’338 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 454 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Met 1.

Lys

Gly

Gly Ile. 5

Vál

His

Ser

Asp

-Glý 10

Ser Tyr

Pró

Lys

Asd 15*

Lys

Phe

Giu

Lys

Ile

Asn

Gly

Thr

.Trp.

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Ser

Ser

Gly

Tyr

20.

25

30

.Met

Leu

Ala

Asp

Arg

Trp

Arg

Lvs

His

Thr

Asp

Glv

Asn

Trp

Tyr

Trp

35'

40

45

Phe

A‘SO

Asn

Ser

Gly

Glu

Met

Ala

Thr

Gly

Trp

Lvs

Lýs

Ile

Ala

Asp

50

55

60

Lvs

Trp

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Glu

Glu

Gly

Ala

Met

Lys

Thr

Gly

Trp

Val

65

70

75

80

Lvs

Tyr

Lys

Asp

Thr

Trp

Tyr

Tyr

Leu

Asd

Ala

Lys

Glu

Gly

.Ala

Met

85

90'

95

Val

Ser

Asii.

Ala

Phe

Ile

Glh

Ser

Ala

Asp Gly

Thr

Gly

Trp

Tyr

Tyr

.100'

10'5.

110

Leu

Lys

Pro

Asp

Glv

Thr

Leu

Ala

Asp

Arg

Pra

Glu

Leu

A«a

Ser

Met

115

120

.125

-32CZ 298364 B6

Leu	Asp	Met	Asp	Leu	Glu	Gin	Arg Ser Gin His Cvs	Lys	Pro	Glu	Glu
	130:					135	.140
Gly	Leu	Glu	Ala	Arg	Gly	Glu.	Ala Leu Gly Leu Val	Gly	Ala	Gin	Ala
US					150		153				160
Pro	Ala	Thr	Glu	Glu	Gin	Glu	Ala Ala. Ser Ser Sér	Sér	Thr	Leu	'Val
				165			170			175
Glu	Val	Thr	Leu·	Gly	Glu	Val	Pro Ala, Ala Glu Ser	Pro	ASO	Pro	Pro
			130				Tas		190
Gin	Ser	Pro	Gin	Gly	Ala	Ser	.Ser Leu Pro Thr thr	Met	Asn	Tyr	Pro
		195					2ÓC	205			Glv
Leu	Trp	Ser	Gin	Ser	'Tyr	Glu	Aso Ser Sér Asn Gin	Glu	Glu	Glu
	210				215	220
Pro	Ser	Thr	Phe	Pro	Asp	Le.u	Olu -Ser Glu Phe Glri	Ala	!Al-a·	Leu	ser
225					230		235				24 0
Arg	Lys	Val	Ala	Glu	Leu	Val	His Phe Léu Léu Leu	Lys	T.ýř	Arg	Ala
			24 5			250·			255
Arg	Glu	Pro	Val	Thr	Lys	Ala	Glu Met Leu Gly Ser	Val	Val	Gly	‘Asn
			.•260;			265		27Q
Trp,	Gin	Tyr	Phe	Phe	Pro·	val	Ile Phe Ser Lys Ala	Šer	Ser	Sér	Leu
	275					23Q.	295
Gin·	Leu	Val	Phe	Gly	Ile	Glu	Leu Met. Glu Val Asp	Pro·	Tle	Gly	His
	2'9’0					295	.300
Leu	Tyr	Ile	Phe	Ala	Ťhr	cys	Leu Gly Leu. Ser- Tvf	Asp,	Gly	Leu	Leu
305					210'		3.15		320
Gly	Asp	Asn·	Gin	Ile·	Me c.	Pro	Lys'' -Ala Glv· Leu Leu	Ile	Ile	Val.	Leu
				325			330			33.5.
Ala	Ile	Ile·	Alá	Arg	Glu	Gly	Aš'ó -Cvs Ala Pro Glu	'Glu	L.VS	•Í-le	trp.
			3'40				34 5		350
Glu	Glu	Leu.	:Sěr	Val	Leu	Glu	Val :Phe Glu Gly Arg	Glu,	Asc	Sér	Ile.
		'355					•360	365
Leu	Gly	'Asp	Pro	Lys	Lys	Leu.	Leu Thr GLn Hiš Phe	Vál	Glh	Glu	Asn
	370					375'	3ac
Tyr	Leu:	Glu	Tyr	Arg	Gin	Val,	Pro 'Glv· Ser Ašp Pro	Ala	Cys	Tyr	Glu
.335					39Ό		395’			4.00
Phe	Leu.	* 4U- U* *	Glv	Pro	Arg	Ala	Leu Val Glu Thr Ser	Tyr	Val	Lys	Vál
				405			410		415
Leu	His	H1S	Met	Val	Lys	Ile	Šer Glv Glv Přó His	I.le	Ser	Tyr	Prc
			420				425		4 30
Pro	Leu	His	Glu	Trp	Val	Leu	•Arg G_u G_y Glu Glu	Gly	Gly	His	His
		435					4 40	4 4 5
'His	Hrs	His	His	His
	4 50

(2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1362 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

-33CZ 298364 Β6 (xí) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

atgaaagggg.	GAATTGTACA.	TTCAGACGGC	TCTTATCCAA	•AAGACAAGTT	TGAGAAAATC	60
AATGGCACT?	GGTACTÁCŤT·	TGACAGTTCA	GGCTATATGC	T x Gx_AGAC<.G	CTGGAGGAAG	120
CACACAGACG'	GCAACTČGTA:	CTGGTTGGAC.	AACTCAGGCG	AAATGGCTAC	AGGCTGGAAG	180
AAAAT C GCTG	ATAAGTGGTA	CTATTTCAAC	GAAGAAGG7G	CCATGAAGAC	AGGCTGGGTC	240
AAGTACAAGG	ACACTTSGTA	CTACTTAGAC	GCTAAAGAAG	GCGCCATGGT	ATCAAATGCC	300
TTTATCCAGT	CAGCGGACGG	AACAGGCTGG	i.-a- ir.uc.Crt	AiCCAGACGG.	AACACTGGCA.	360
GÁCAGGCCAG	AATTGGCCAG.	.CATGCTGGAC	1 TI r~f~ -TI T- >· -w .UU	•AACAGCGTAG	TCAeeACTGC	420
AAGCCTGAÁG	AAGGCCTTGA.	GGCCCGAGGÁ	GAGGCCCŤGG GCCTGGTGGG	TGCGCAGGČŤ	4Θ0-
CCTGCTACTG	AGGAGCAGGA	GGCTGCCTCC	TCCTCTTCTA	CTCTAGTTGA	AGTCACCGTG	540
GGGGAGGTGC	***r*r» á	GTCACCAGAT	ČCTCCCČAGrt	GTCCTCAGGG	AGCCTCCAGC	600
CTCCCCACTA	c.catgaacta	CCCTCTCTGG	AísC^AkTCCT	ATGAGGACTC	CAGCAACCAÁ	660
GAAGAGGAGG.	GGCCAAGCAC	CTTCCCT.GAC	ctggagtctg	AGTTCGAAGC:	AGCACTCAGT	720
. AGGAAGGTGG	CCAAGTTGGT	TCÁTTTŤCTG·	ctcctcáágť	ÁTCGAGCCÁG	GGAGCCGGTG	78Ό
ACAAAGGCAG	AÁATGCTGGG	GAGTGTCGTC	GGAAAT7GGC	AGTACTT-CTT	TCCTGTGATC	84CT
TTCAGCAAAG	ČTTČCGATTC	CTTGCAGCTG	GTCTT7GGCA	TCGAGCTGAT	• GGAAGT GGAC	900-
CCCATCG^CC	ACGTGTACÁT	CTTTGCCACC	m <-» r* v»	TCTCC7ACGA	TGGCCTGCTG	960
GGTGACAATC	AGATCATGCC	CAAGACAGGG	ttcctgataa	7CATCC-TGGC	.CATAATCGC.A	1020
AAAGAGGGCG	ACTGTGCCCC	T GAGGÁGAAA	AT CŤ GGG AGG’	AGuTGAGiGT	GTTAGAGGTG	1080
TTTGAGGGGA	GGGAAGACAG	tatct.tcggg	GATCCCAAGA.	AGČTGCTCAC	CČAATATTTC	1140
GTGCAGGAAA	ACTACCTGGA.	G 1 ACC ^'jCAL:	GTCx-CCGGCA	XJ 1 Xj.“. £ £ XjO	AiVJVi xrtxbriAj	1200·
TŤCČTGTGGG	GTCCAÁGGGC	cctcattgaá	ACCAGCTAGG	TGAAAGTCCT	•GCACCATATG	1260
GTAAAGATCA	GTGGAGGACC	TCGCATTTC7	TACCCACTCC	TGCATGAGTG	GGCTTTGAGA	1320
G AGG G xjjyAíj	AGGGCGGTCA	TCACCATCAC	CATCACCATT	ΛΛ		1362

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát antigenu asociovaného s nádory z rodiny MÁGE, vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny antigenu MÁGE, obsahujících derivatizované thiolové zbytky.
2. 2. Antigen podle nároku 1, vyznačující se tím, žederivatizované volné thioly jsou karboxyamidované nebo karboxymethylované.
3. 3. Antigen podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jde o fúzní protein, v němž je fúzním partnerem protein D nebo jeho derivát, obsahující přibližně počáteční 1/3 proteinu D, NS1 protein influenzy nebo jeho fragment, obsahující N-terminálních 81 aminokyselin nebo C-lyta ze Streptococcus pneumoniae nebo jeho fragment, obsahující zbytky 188 az 305.
4. 4. Antigen podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje afinitní tag.
5. 5. Antigen podle některého z nároků 4, v y z n a č u j í c í se tím, že protein D nebo jeho fragment je lipidovaný.
6. 6. Antigen podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se protein MÁGE volí ze skupiny MÁGE Al, MÁGE A2, MÁGE A3, MÁGE A4, MÁGE A5, MÁGE A6, MÁGE A7, MÁGE A8, MÁGE A9, MÁGE A10.
7. 7. Sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein podle některého z nároků 3 až 6.
8. 8. Vektor, obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 7,
9. 9. Hostitelská buňka, transformovaná nukleovou kyselinou podle nároku 7 nebo vektorem podle nároku 8.

   -34CZ 298364 B6
10. 10. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle některého z nároků 1 až 6 nebo nukleovou kyselinu podle nároku 7.
11. 11. Vakcina podle nároku 10, vyznač uj ící se tím, že dále obsahuje adjuvans a/nebo imunostimulační cytokin nebo chemokin.
12. 12. Vakcina podle nároku 10 nebo 11, vyzn aču j ící se tím, že protein je připraven ve vehikulu, jím je emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji.
13. 13. Vakcina podle nároku 11 nebo 2, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje 3D-MPL, QS21 nebo CpG oligonukleotid.
14. 14. Vakcina podle některého z nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že dále obsahuje jeden nebo více dalších antigenů.
15. 15. Vakcina podle některého z nároků 10 až 13 pro použití v lékařství.
16. 16. Použití antigenů podle některého z nároků 1 až 6 pro výrobu vakciny pro imunotherapeutickou léčbu nemocných trpících melanomem, karcinomem prsu, močového měchýře, plic, NSCLC, hlavy a spinocelulámím karcinomem, karcinomem tlustého střeva nebo jícnu nebo jiným nádorem, asociovaným s MÁGE.
17. 17. Použití nukleové kyseliny podle nároku 7 pro výrobu vakciny pro imunotherapeutickou léčbu nemocných trpících melanomem, karcinomem prsu, močového měchýře, plic, NSCLC, hlavy a spinocelulámím karcinomem, karcinomem tlustého střeva nebo jícnu nebo jiným nádorem, asociovaným s MÁGE,

    19 výkresů