KR20060067977A - 백신접종을 위한 융합 단백질 및 조성물의 제조를 위해사용되는 ｍａｇｅ 군으로부터의 종양 관련 항원 유도체 및이들을 암호화하고 있는 핵산 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MAGE 군으로부터의 신규한 단백질과 이들의 생성물에 관한 것이다. 상세하게는, 리포단백질 D와 같은 면역학적 융합 파트너에 융합된 MAGE 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 항원은 광범위한 종양의 치료를 위한 백신을 제공하도록 제형화될 수 있다. 또한, MAGE 단백질을 정제하기 위한 신규한 방법을 제공한다.

MAGE 항원, 종양, 융합단백질, 단백질 D, NS1, C-lyta, 백신.

Description

백신접종을 위한 융합 단백질 및 조성물의 제조를 위해 사용되는 ＭＡＧＥ 군으로부터의 종양 관련 항원 유도체 및 이들을 암호화하고 있는 핵산 서열{TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN DERIVATIVES FROM THE MAGE FAMILY, AND NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING THEM, USED FOR THE PREPARATION OF FUSION PROTEINS AND OF COMPOSITIONS FOR VACCINATION}

도 1은 LPD-MAGE-3-His 융합 단백질을 도시한다.

도 2는 발현 벡터 pRIT 14586의 제조 방법을 도시한다.

도 3은 융합 단백질 단백질 D 1/3-MAGE-3-His 테일을 발현하는 플라스미드 pRIT 14477의 제조 방법을 도시한다.

도 4는 항-MAGE-3 단클론 항체 Mab 32 및 Mab 54를 사용한 LPD-MAGE-3-His 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다.

도 5 및 도 7과 도 6 및 도 8은 LPD-MAGE-3-His 단백질을 사용하여 주사된 C57BL/6 마우스 또는 Balb/C 마우스로부터의 비장 세포(도 5 및 도 7)와 림프절 세포(도 6 및 도 8)에서의 증가된 MAGE-3 특이성 림프구 증식 활성을 도시한다.

도 9는 마우스의 다른 군 사이(N=5/군)의 혈청의 상대적인 평균 중간값 역가를 비교한 것이며, 이것은 굴곡의 중간값에 도달하기 위해 필요한 평균 희석도이다.

도 10 및 도 11은 마우스의 서로 다른 군에서 백신접종후에 Ig 하위군-특이 성 항-MAGE-3 반응을 도시한다.

도 12는 대장균내에서 발현되기 위한 융합 단백질 NS1-MAGE-3-His의 설계를 도시한다.

도 13은 NS1-MAGE-3-His 융합 단백질의 생성을 위한 클로닝 방법에 관한 것이다.

도 14는 NS1-MAGE-3-His 융합 단백질을 발현시키는 플라스미드 pRIT14426을 도시한다.

도 15는 대장균내에서 발현되기 위한 융합 단백질 Clyta-Mage-1-His의 설계를 도시한다.

도 16은 CLYTA-Mage-1-His 단백질의 발현을 위한 클로닝 방법을 도시한다.

도 17은 융합단백질 CLYTA-Mage-1-His를 암호화하는 재조합 플라스미드 pRIT14614를 도시한다.

도 18은 대장균내에서 발현되는 융합 단백질 Clyta-Mage-3-His의 설계를 도시한다.

도 19는 CLYTA-MAGE-3-His 단백질의 발현을 위한 클로닝 방법을 도시한다.

본 발명은 종양 관련 항원을 포함하는 단백질 유도체, 및 암 백신 (vaccine) 치료에서 이들의 유용성을 알아내는 것에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명의 유 도체는 MAGE 유전자(예를 들면, MAGE-3, MAGE-1)의 군에 의해 암호화되어 있는 항원을 포함하며, 예를 들어, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B로부터의 단백질 D의 지질화된 형태와 같은 T 헬퍼 에피토프(T helper epitopes)를 제공하는 면역학적 융합 파트너에 연결되어 있는 융합 단백질; 항원의 이황화 가교결합이 환원되고 이에 따라 티올이 차단된 화학적으로 개질된 MAGE 단백질; 및 친화성 태그(tag)가 제공되어 있고/있거나 유전자적으로 개질되어 이황화 가교결합 형성이 방지된 유전자적으로 개질된 MAGE 단백질을 포함한다. 또한 MAGE 단백질의 정제 및 흑색종, 유방, 방광, 폐, NSCLC, 두부 및 편평 세포 암종, 결장 암종 및 식도 암종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암들의 치료를 위한 백신의 제형화를 위한 방법을 기술하였다.

MAGE 유전자의 군에 의해 암호화되어 있는 항원들은 (악성 흑색종을 포함하여)흑색종 세포 및 NSCLC(소세포 폐암), 두부 및 경부 편평세포 암종, 방광 이행세포 암종 및 식도 암종을 포함하는 일부 다른 암에서 우세하게 발현되지만, 고환과 태반을 제외한 정상 조직에서는 탐지되지 않는다(참조 : Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3는 흑색종 중의 69%에서 발현되고(참조 : Gaugler, 1994), 또한 NSCLC 중의 44%(참조 : Yoshimatsu 1998), 두부 및 경부 편평세포 암종 중의 48%, 방광 이행세포 암종 중의 34%, 식도 암종 중의 57%, 결장 암종 중의 32% 및 유방암 중의 24%(참조 ; Van Pel, 1995; Inoue, 1995; Fujie, 1997; Nishimura 1997)에서 탐지될 수 있다. MAGE 단백질을 발현시키는 암들은 Mage 관련 종양으로서 공지되어 있다.

인간 흑색종 세포의 면역원성은 흑색종 세포와 자가 림프구의 혼합 배양물을 이용하는 실험에서 명백하게 입증되어 왔다. 이 배양물은 종종 자가 흑색종 세포를 배타적으로 용해시킬 수 있지만 자가 섬유아세포 또는 자가 EBV 변형된 B 림프구는 용해시킬수 없는 특정한 세포상해 T 림프구(CTL)를 생성시킨다(참조 : Knuth, 1984; Anichini, 1987). CTL 클론(clone)에 의해 자가 흑색종 세포상에서 인식되는 항원 중 다수가 현재 동정되어 있으며, 이들은 MAGE 군의 항원을 포함하고 있다.

자가 흑색종 세포상에서 특이적인 CTL에 의한 인식을 통해 정의될 수 있는 첫번째 항원은 MZ2-E(참조 : Van den Eynde, 1989)이며 이것은 유전자 MAGE-1에 의해 암호화되어 있다(참조 : Van der Bruggen, 1991). MZ2-E에 대립하는 CTL은 HLA.A1 대립형질을 가진 세포를 제공받은 다른 환자 뿐만 아니라 자가 유래한 MZ2-E 양성 흑색종 세포를 인식하여 용해시킨다.

MAGE-1 유전자는 12개의 밀접하게 관련된 유전자(MAGE 1, MAGE 2, MAGE3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12) 중 한 군에 속하고 이들 유전자는 염색체 X에 위치하고 있으며 이들의 코딩 서열은 서로 64% 내지 85%의 상동성을 가지고 있다(참조 : De Plaen, 1994). 이들은 종종 MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12(MAGE A군)로서 공지되어 있다. 또한 관련성이 적긴 하지만 단백질의 다른 2개의 군도 MAGE 군의 일부이다. 이들은 MAGE B와 MAGE C 군이다. MAGE B 군에는 MAGE B1(MAGE Xp1, 및 DAM 10으로도 공지됨), MAGE B2(MAGE Xp2 및 DAM 6으로도 공지됨), MAGE B3 및 MAGE B4가 있고 - MAGE C 군은 일반적으로 MAGE C1 및 MAGE C2를 포함하고 있다. 일반적으로, MAGE 단백질을 단백질의 C-말단 부근에 위치하고 있는 중심 서열 기호를 포함시켜 정의할 수 있다(예를 들어 MAGE A1 309 아미노산 단백질에 대해, 중심 기호는 아미노산 195 내지 279와 상응한다).

따라서 중심 기호의 공통적인 패턴을 하기와 같이 기술할 수 있으며 여기에서 x는 임의의 아미노산을 나타내고, 소문자로 표기된 잔기는 보존되어 있음을 나타내고(보존적인 변화를 허용하며) 대문자로 표기된 잔기는 완벽하게 보존되어 있음을 나타낸다.

중심 서열 기호

LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x) VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv

보존적인 치환은 널리 공지되어 있으며 일반적으로 서열 정렬 컴퓨터 프로그램에서 디폴트 채점 매트릭스로서 설정되어 있다. 이러한 프로그램에는 PAM250[참조 : Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutinary changes in proteins", In "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft(ed.), 345-352, National Biomedical Research Foundation, Washington] 및 Blosum62[참조 : Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919]가 있다.

일반적으로, 하기 군 내에서의 치환은 보존적인 치환이지만, 군 사이의 치환 은 비보존적인 것으로 생각되고 있다. 이 군은 하기와 같다:

i) 아스파테이트/아스파라긴/글루타메이트/글루타민

ii) 세린/트레오닌

iii) 라이신/아르기닌

iv) 페닐알라닌/티로신/트립토판

v) 류신/이소류신/발린/메티오닌

vi) 글리신/알라닌

본 발명에 있어서 그리고 일반적으로, MAGE 단백질은 중심 부위에서 MAGE A1의 아미노산 195 내지 279와 대략 50% 동일할 것이다.

MAGE-3 단백질에서 몇몇 CTL 에피토프가 동정되었다. 이러한 에피토프 중 하나인 MAGE-3.A1은 MHC 클래스 I 분자 HLA.A1과 관련하여 나타난 CTL에 대해 특이적인 에피토프를 구성하고 있는 MAGE-3 단백질의 아미노산 168과 176사이에 위치한 비펩티드 서열이다. 최근에 2가지의 추가적인 CTL 에피토프가 흑색종 세포와 자가 림프구의 혼합 배양물에서 CTL 반응을 일으키는 능력에 의해 MAGE-3 단백질의 펩티드 서열상에서 동정되었다. 이 두 에피토프는 HLA.A2(참조 : Van der Bruggen, 1994)와 HLA.B44(참조 : Herman, 1996) 대립형질 각각에 대한 특이적인 결합 모티프를 가지고 있다.

본 발명은 MAGE 단백질 유도체를 제공한다. 이 유도체는 일련의 종양 유형의 치료를 위해 적합한 치료용 백신 제형에 사용하기 적합하다.

본 발명의 한 가지 양태에서, 이 유도체는 이형태성 파트너와 연결되어 있는 MAGE 단백질 군으로부터의 항원을 포함하는 융합단백질이다. 이 단백질은 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있지만, 바람직하게는 발현 시스템에서 비융합 단백질과 비교하여 증가된 수준으로 생성될 수 있는 재조합 융합 단백질로서 발현된다. 따라서 이 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프, 바람직하게는 인간에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프 제공을 보조(면역학적인 융합 파트너)하거나, 본래의 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질이 발현되는 것을 보조(발현 증폭제)한다. 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너인 동시에 발현 증폭 파트너인 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 바람직한 형태에서, 면역학적 융합 파트너는 그람-음성 세균(헤모필러스 인플루엔자 B)의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도된다(참조 : WO91/18926). 단백질 D 유도체는 대략적으로 단백질의 처음 1/3, 특히 대략적으로 N-말단의 100 내지 110개 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 단백질 D 유도체는 지질화되는 것이 바람직하다. 리포단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기는 추가적인 외인성 T-세포 에피토프를 가진 백신 후보 항원을 제공하는 N-말단상에 포함되어 있으며 대장균에서의 발현 수준을 증가시킨다(따라서 또한 발현 증폭제로서 작용한다). 지질 테일은 항원 제공 세포가 최적으로 항원을 제공하도록 한다.

다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스의 비구조 단백질인 NS1(헤마글루티닌; hemagglutinin)을 포함한다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 한 서로 다른 단편들이 사용될 수 있지만, 전형적으로 N 말단의 81개 아미노산이 사용된다.

또 다른 양태에서 면역학적 융합 파트너는 LYTA로서 공지된 단백질이다. 바람직하게는 이 분자의 C 말단 부위가 사용된다. Lyta는 스트렙토콕커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유도되며 이 세균은 펩티도클리칸 주쇄의 어떤 결합을 특이적으로 분해시키는 오토라이신(autolysin), N-아세틸-L-알라닌 아미다제, 아미다제 LYTA(lytA 유전자에 암호화됨[참조 : Gene, 43 (1986) page 265-272])를 합성한다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사물질에 대한 친화도에 기여한다. 이러한 특징은 융합 단백질의 발현을 위해 유용한 대장균 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용되었다. 아미노-말단에 C-LYTA 단편을 가진 하이브리드 단백질의 정제는 공지되어 있다[참조 : Biotechnology: 10, (1992) page 795-798]. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 바람직한 양태는 잔기 178에서 시작하는 C 말단에서 발견된 Lyta 분자의 반복 부위를 사용하는 것이다. 특히 바람직한 형태는 잔기 188 내지 305를 포함하고 있다.

상기 면역학적 융합 파트너는 또한 발현을 돕는 잇점이 있다. 특히, 이러한 융합체는 본래의 재조합 MAGE 단백질보다 더 높은 수율로 발현된다.

본 발명자들의 조사 결과 임상적인 셋팅에서 이러한 제조물들은 흑색종을 치료할 수 있는 것으로 나타났다. 한 경우에서, 4기 흑색종 환자는 애쥬번트 없이 리포 D 1/3 MAGE 3 His 단백질을 2회 복용한 후에 전이가 사라졌다.

따라서, 본 발명은 면역학적 융합 파트너에 연결된 MAGE 군으로부터의 종양 관련 항원을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는 면역학적 융합 파트너는 단백질 D 또는 이들의 단편이고, 가장 바람직하게는 리포단백질 D이다. MAGE 단백질은 바람직하게는 MAGE A1 또는 MAGE A3이다. 리포단백질 D 부분은 바람직하게는 리포단백질 D의 처음 1/3을 포함한다.

본 발명의 단백질은 바람직하게 대장균에서 발현된다. 바람직한 양태에서 이 단백질은 예를 들어, 5개 내지 9개, 바람직하게는 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 테일과 같은 친화성 태그를 가지면서 발현된다. 이들은 정제를 용이하게 하는 장점을 가지고 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 이 서열들은 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있으며 DNA/RNA 백신 접종을 위해 사용되거나 적합한 숙주 내에서 발현될 수 있다. 핵산을 발현시키는 미생물 벡터들은 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 벡터들에는 폭스바이러스 (poxvirus), 아데노바이러스(adenovirus), 알파바이러스(alphavirus), 리스테리아 (listeria) 및 모나파지(monarphage)가 있다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 표준 DNA 합성 기술, 예를 들어 문헌[참조 : D.M Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098]에 기술된 바와 같이 효소적 라이게이션, 화학적 합성, 시험관내 효소적 중합반응, 또는 예를 들어 열 안정성 중합효소를 사용하는 PCR 기술에 의하거나, 이러한 기술들을 조합하여 합성될 수 있다.

DNA의 효소적인 중합반응은 일반적으로 50㎕ 이하의 부피로 10℃ 내지 37℃의 온도에서 요구되는 것과 같이 뉴클레오시드 3인산염 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 적절한 버퍼 내에서 DNA 중합효소 I(Klenow fragment)와 같은 DNA 중 합효소를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. DNA 단편의 효소적인 결합은 일반적으로 50ml 이하의 부피로 4℃ 내지 주위 온도에서 0.05M 트리스(pH 7.4), 0.01M MgCl₂, 0.01M 디티오트레이톨, 1mM 스퍼미딘, 1mM ATP 및 0.1mg/ml 소 혈청 알부민과 같은 적절한 버퍼내에서 T4 DNA 결합효소와 같은 DNA 결합효소를 사용하여 수행될 수 있다. DNA 중합체 또는 단편의 화학적 합성은 문헌[참조 : 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Mannual'(ed. H. G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)] 또는 다른 과학 간행물(예를 들면, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5571; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801)에 기술되어 있는 바와 같은 고상 기술을 사용하는 전통적인 포스포트리에스테르, 아인산염 또는 포스포라미디트 화학에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 문헌[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기술되어 있는 바와 같은 전통적인 재조합 기술에 의해 수행될 수 있다.

상세하게는, 이 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

i) 단백질 또는 이들의 면역학적 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 숙주 세포내에서 발현시킬 수 있는, 복제가능하거나 인테그레이션(integration) 할 수 있는 발현 벡터를 제조하는 단계;

ii) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

iii) 상기 단백질을 생성시키는 상기 DNA 중합체를 발현시키는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양시키는 단계; 그리고

iv) 상기 단백질을 회수하는 단계.

본 명세서에서 '형질전환'이란 숙주 세포 내부로 외래 DNA의 도입을 의미하는 용어로 사용되었다. 예를 들어 이것은 문헌[참조 : Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwel Scientific Publications; Oxford, England, 1988]에 기술되어 있는 바와 같은 전통적인 기술을 사용하는 형질전환, 형질도입 또는 적절한 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 수행될 수 있다. 이하 하기에서 '형질전환된' 또는 '형질전환체'란 관심있는 외래 유전자를 포함하고 있고 발현시키는 숙주 세포를 나타낸다.

발현 벡터는 신규하며 또한 본 발명의 형태 부분이다.

복제가능한 발현 벡터는 본 발명에 따라 숙주 세포에 대해 적합성이 있는 벡터를 절단하여 온전한 레플리콘(replicon)을 가진 선형의 DNA 단편을 생성시키고, 라이게이션(ligation) 조건하에서 본 발명의 단백질 또는 이들의 유도체를 암호화 하는 DNA 중합체와 같은 원하는 생성물을 암호화하는 상기 선형 단편을 하나 이상의 DNA 분자와 라이게이션시킴으로써 제조될 수 있다.

따라서, DNA 중합체는 요망되는 경우 벡터의 제조 동안에 미리 형성되거나 형성될 수 있다.

벡터의 선정은 숙주 세포에 의해 부분적으로 결정될 것이고, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포가 될 수 있지만 바람직하게는 대장균 또는 CHO 세포이다. 적합한 벡터에는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 재조합 바이러스가 있다.

복제 가능한 발현 벡터의 제조는 DNA의 제한, 중합 및 라이게이션을 위한 적절한 효소를 사용하여 예를 들면 문헌[참조 : 상기에 인용된 Maniatis et al.]에 기술되어 있는 방법에 의해 전통적으로 수행될 수 있다.

본 발명에 따라서, 재조합 숙주 세포는 형질 전환 조건하에서 본 발명의 복제 가능한 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 제조되었다. 적합한 형질 전환 조건은 전통적인 것으로써 예를 들면 문헌[참조 : 상기에 인용된 Maniatis et al., 또는 "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985]에 기술되어 있다.

형질 전환 조건의 선정은 숙주 세포에 의해 결정된다. 따라서 대장균과 같은 세균 숙주는 CaCl₂ 용액 또는 RbC1, MnCl₂, 칼륨 아세테이트 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액을 사용하여 처리되고 나서 3-[N-모폴리노]-프로판-설폰산, RbC1 및 글리세롤을 사용하여 처리될 수 있다. 배양중인 포유동물 세포는 벡터 DNA를 세 포상으로 칼슘 공동 침전시켜 형질 전환될 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 복제 가능한 발현 벡터로 형질 전환시킨 숙주 세포까지도 포함한다.

DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 형질 전환된 숙주 세포의 배양은 전통적으로, 예를 들면 문헌[참조 : 상기에서 인용된 Maniatis et al. and "DNA Cloning"]에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 따라서, 바람직하게는 세포에 영양분을 공급해 주면서 50℃ 미만에서 배양시킨다.

생성물은 숙주 세포 및 발현 생성물의 위치(세포간 또는 배양 배지나 세포 페리플라즘으로 분비된)에 따른 전통적인 방법에 의해 회수된다. 따라서, 숙주 세포가 대장균과 같은 세균이라면, 예를 들어 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용해될 수 있으며 단백질 생성물이 이 용해질로부터 분리될 수 있다. 숙주 세포가 포유 동물이라면, 생성물은 일반적으로 영양 배지 또는 세포 비함유 추출물로부터 분리될 수 있다. 전통적인 단백질 분리 기술에는 선택적 침전법, 흡착 크로마토그래피, 단클론 항체 친화성 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피 등이 있다.

본 발명의 단백질은 액상 형태 또는 동결 건조 형태에서 모두 가용성이다.

일반적으로 개인 복용량은 1㎍ 내지 1000㎍, 바람직하게는 30㎍ 내지 300㎍의 단백질을 포함할 것으로 예상된다.

또한 본 발명은 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 본 발명의 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직한 백신 조성물은 적어도 리포단백질 D - MAGE-3를 포함한다. 이러한 백신은 임의로 종양 관련 항원을 하나 이상 함유할 수 있다. 예로는 MAGE 및 GAGE 군에 속하는 다른 구성원이 있다. 적합한 다른 종양 관련 항원에는 MAGE-1, GAGE-1 또는 티로시나제 단백질이 있다.

백신 제조는 일반적으로 문헌[참조 : Vaccine Design "The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J). (1995) Plenum Press New York]에 기술되어 있다. 리포솜내로의 캡슐화는 풀러톤(Fullerton)의 특허[참조 : 미국 특허 제 4,235,877호]에 기술되어 있다.

본 발명의 단백질은 바람직하게는 본 발명의 백신 제형에서 애쥬번트를 필요로 한다. 적합한 애쥬번트는 알루미늄 수산화 겔(alum) 또는 알루미늄 인산염과 같은 알루미늄 염을 포함하지만, 또한 칼슘, 철 또는 아연의 염일 수 있거나 아실화된 티로신의 불용성 현탁액, 또는 아실화된 당, 양이온 또는 음이온적으로 유도된 다당류, 또는 폴리포스파젠일 수도 있다. 다른 알려진 애쥬번트에는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드가 있다. 이 올리고뉴클레오티드는 CpG 디뉴클레오티드가 메틸화되지 않은 것이 특징이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[참조 : WO96/02555]에 기술되어 있다.

본 발명의 제형에서, 애쥬번트 조성물이 우선적으로 TH1 타입의 면역 반응을 유도시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 적합한 애쥬번트 시스템은 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 알루미늄 염의 조합물을 포함한다. 또한 CpG 올리고뉴클레오티드는 TH1 반응을 우선적으로 유도시킨다.

향상된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합, 특히 WO 94/00153에서 밝혀진 바와 같은 QS21과 3D-MPL의 조합과 관련이 있거나 WO 96/33739에서 밝혀진 바와 같은 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된(quenched) 반응유도성이 낮은 조성과 관련이 있다.

수중유 에멀전내에 QS21 3D-MPL 및 토코페롤을 함유하는 특히 효능이 있는 애쥬번트 제형은 WO 95/17210에 기술되어 있으며 이것이 바람직한 제형화이다.

따라서 본 발명의 한 가지 양태에서 본 발명의 단백질, 더욱 바람직하게는 모노포스포릴 지질 A 또는 이들의 유도체를 애쥬번트로 사용하는 리포단백질 D(또는 이들의 유도체) - MAGE-3를 함유하는 백신이 제공된다.

바람직하게는 백신은 추가적으로 사포닌, 더 바람직하게는 QS21을 포함한다.

바람직하게는 제형은 추가적으로 수중유 에멀전내에 토코페롤을 포함한다. 또한 본 발명은 본 발명의 단백질과 3D-MPL과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와의 혼합을 포함하는 백신 제형을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 가지 측면에서 재조합적으로 생성된 MAGE-단백질을 정제하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 예를 들어 강한 카오트로픽제(예를 들면, 요소, 구아니디움 하이드로클로라이드와 같은), 또는 양쪽성이온 세제(예를 들면, 엠피겐 BB-n-도데실-N,N-디메틸글라이신)에 단백질을 용해시키고, 단백질 내부 및 단백질간 분자 이황화 가교결합을 감소시키고, 이에 따라 티올을 차단시켜 산화적인 재결합을 방지시키고, 단백질을 하나 이상의 크로마토그래피 단계로 처리하는 것을 포함한다.

바람직하게는, 차단제는 알킬화제이다. 그러나 이러한 차단제는 알파 할로산 또는 알파 할로아미드에 한정되지 않는다. 예를 들면, 단백질의 카복시메틸화 또는 카복시아미드화(카브아미도메틸화)의 결과로 생성된 요오도아세트산 및 요오도아세트아미드가 있다. 다른 차단제가 사용될 수 있으며 문헌[참조 : The Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill and C-L Boeder, Academic press 1976, or Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985]에 기술되어 있다. 이러한 다른 차단제의 전형적인 예에는 N-에틸말레이미드, 클로로아세틸 인산염, O-메틸이소우레아, 아크릴로니트릴 등이 있다. 차단제의 사용은 생성물의 응집을 방지하여 이후 정제를 위해 안정성을 보장해주는 장점이 있다.

본 발명의 양태에서 차단제는 안정적인 공유적 및 비가역적 유도체(예를 들면, 알파 할로 산 또는 알파 할로아미드)를 유도시키기 위해 선택된다. 그러나 다른 차단제는 정제 후에 차단제가 유도되지 않은 단백질을 방출시키기 위해 제거될 수 있도록 선택될 수도 있다.

유도된 자유 티올 잔기를 가진 MAGE 단백질은 신규하며 본 발명의 한 양태를 형성한다. 특히 카복시아미드화되거나 카복시메틸화된 유도체가 본 발명의 바람직한 양태이다.

본 발명의 바람직한 양태에서 본 발명의 단백질은 CLYTA 또는 폴리히스티딘 테일과 같은 친화성 태그를 구비한다. 이런 경우에 차단 단계 이후의 단백질은 바람직하게는 친화도 크로마토그래피 처리된다. 폴리히스티딘 테일을 가진 이들 단백질에 대해, 부동화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)가 수행될 수 있다. 금속 이온은 예를 들어 아연, 니켈, 철, 마그네슘 또는 구리와 같은 적절한 이온이 될 수 있지만, 바람직하게는 아연 또는 니켈이다. 바람직하게 IMAC 버퍼는 엠피겐 BB(이하 엠피겐)와 같은 양쪽성이온 세제를 함유하는데 이는 최종 제품에 보다 적은 내독소가 함유되도록 한다.

만일 클리타(Clyta) 부분을 가진 단백질이 생성된다면, 단백질은 콜린 또는 DEAE와 같은 콜린 유사물질에 대한 그것의 친화도를 이용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 양태에서 단백질에는 폴리히스티딘 테일 및 클리타 부분이 제공된다. 이들은 간단한 2단계 친화성 크로마토그래피 정제 방법에 의해 정제될 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 상세히 기술할 것이다:

실시예 I

융합 단백질 리포단백질 D-MAGE-3-His(LPD 1/3-MAGE-3-His 또는 LpD MAGE-3-His)를 발현시키는 재조합 대장균 균주의 제조

1. 대장균 발현 시스템

리포단백질 D의 생성을 위해 단백질 D를 암호화하는 DNA를 발현 벡터 pMG 81내로 클로닝하였다. 이 플라스미드는 삽입된 외래 유전자의 전사와 번역을 위해 람다 파지 DNA로부터 유래된 신호를 사용한다. 벡터는 람다 PL 프로모터 PL, 오퍼레이터 OL 및 N 단백질이 제공될 때 전사적 극성 효과를 경감시키기 위한 두 개의 유용 부위(NutL 및 NutR)를 포함한다(참조 : Gross et al., 1985. Mol. & Cell. Biol. 5:1015). 플라스미드 DNA를 안정화시키기 위해 PL 프로모터를 가진 벡터를 대장균 용원성 숙주내로 도입시켰다. 용원성 숙주 균주는 게놈내에 인테그레이션된 복제-결함 람다 파지 DNA를 포함하고 있다(참조 : Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1-14. Academic Press NY). 람다 파지 DNA는 cI 억제제 단백질을 직접 합성하여 벡터의 OL 억제제와 결합시킴으로써 RNA 중합효소가 PL 프로모터에 결합하는 것을 방지시켜 삽입 유전자의 전사를 방지시킨다. 발현 균주 AR58의 cI 유전자는 온도 감수성 돌연변이를 가지고 있어서 직접적인 PL 전사는 온도 변화에 의해 조절될 수 있다, 즉 배양 온도의 증가가 억제제를 불활성화시키고 외래 단백질의 합성을 개시시킨다. 이러한 발현 시스템은 특히 세포에 유독할 수 있는 외래 단백질의 합성의 통제가 가능하도록 한다(참조 : Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).

2. 대장균 균주 AR58

LPD-MAGE-3-His 단백질의 생성을 위해 사용된 AR58 용원성 대장균 균주는 표준 NIH 대장균 K12 균주 N99(Fsu- galK2, LacZ- thr-)의 유도체이다. 이 균주는 결함 용원성 람다 파지(galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1)를 포함하고 있다. Kil-표현형은 숙주 거대분자 합성의 차단을 방지시킨다. cI857 돌연변이는 cI 억제제에 대한 온도 감수성 손상을 제공한다. DH1 결손은 람다 파지 우측 오페론과 숙주 bio, uvr3 및 chlA 좌위를 제거한다. AR58 균주는 SA500 유도체(galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1)에서 미리 성장시킨 P 람다 파지 보존균주를 사용한 N99의 형질도입에 의해 생성되었다. N99내부로의 결함 용원성 파지의 도입은 galE 유전자 인근에 테트라사이클린 내성을 암호화하는 TN10 트랜스포손의 존재에 의해 테트라사이클린을 사용하여 선별하였다. N99 및 SA500은 국립보건원의 마틴 로젠버그(Martin Rosenberg) 박사의 실험실로부터 유도된 대장균 K12 균주이다.

3. 재조합 단백질 LPD-MAGE-3-His를 발현시키기 위해 고안된 벡터의 제작

본 발명의 원리는 MAGE-3의 N-말단에 연결되는 융합 파트너로서 지질화된 단백질 D의 N-말단 1/3과 이것의 C-말단에 위치한 몇 개의 히스티딘 잔기(His 테일)의 서열을 사용하여 융합 단백질로서 MAGE 3를 발현시키는 것이다.

단백질 D는 리포단백질(그람-음성 세균 헤모필러스 인플루엔자의 표면에 노출되어 있는 42kDa 면역글로블린 D 결합 단백질)이다. 이 단백질은 18개 아미노산 잔기 신호 서열을 가진 전구체로서 합성되며, 세균성 리포단백질에 대한 공통서열(consensus sequence)을 포함하고 있다(참조 : WO 91/18926).

리포단백질의 신호 서열이 방출 동안에 프로세싱될 때, Cys(전구체 분자에서 19 위치에 존재)가 아미노 말단 잔기가 되고 에스테르-결합 지방산 및 아미드-결합 지방산의 공유적인 결합에 의해 동시에 개질된다.

그런 후에 아미노 말단의 시스테인 잔기에 결합된 지방산은 막 앵커(anchor)로서 기능한다.

융합 단백질을 발현시키는 플라스미드는 18개 아미노산 신호 서열 및 프로세싱된 단백질 D의 처음 109개 잔기들, 두 개의 관련되지 않은 아미노산(Met 및 Asp), MAGE-3의 아미노산 잔기 2 내지 314 및 후속되는 7개의 His 잔기를 노출시키는 힌지 영역으로서 기능하는 2개의 Gly 잔기를 포함하는 전구체 단백질을 발현시키기 위해 고안되었다.

따라서 재조합 균주는 432개 아미노산 잔기 길이의 프로세싱된 지질화된 His 테일을 갖는 융합 단백질을 생성하며[도 1 참조], 이 단백질은 ID 1번에 기술된 아 미노산 서열 및 ID 2번에 기술된 코딩 서열을 포함하고 있다.

4. LPD-MAGE-3-His 융합 단백질의 생성을 위한 클로닝 방법(벡터 pRIT14477)

MAGE-3 유전자에 대한 코딩 서열을 포함하고 있는 cDNA 플라스미드[루드위그 연구소(Ludwig Institute)의 티에리 분(Thierry Boon) 박사로부터][참조 : Gaugler B et al, 1994)와 리포-D-1/3 코딩 서열(도 2의 개략도에 따라 제조된)의 N 말단 부위를 포함하고 있는 벡터 pRIT 14586을 사용하였다. 클로닝 방법은 하기 단계들을 포함한다(도 3 참조).

a) 올리고뉴클레오티드 센스: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct와 올리고뉴클레오티드 안티센스: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa를 사용하여 플라스미드 cDNA MAGE 3에 존재하는 서열을 PCR 증폭시키는 단계; 이 증폭은 N 말단에 다음의 변화를 초래한다: 처음 5개 코돈의 대장균 코돈용으로의 변화, 1 위치에서의 Pro 코돈의 Asp 코돈으로의 치환, 5' 말단에 NcoI 부위의 생성 및 최종적으로 2개의 Gly 코돈 및 7개의 His 코돈의 첨가에 이은 C-말단에서의 XbaI 부위의 첨가.

b) 상기 증폭된 단편을 인비트로겐사의 TA 클로닝 벡터내로 클로닝하여 중간생성물 벡터 pRIT 14647을 제조하는 단계.

c) 플라스미드 pRIT 14647로부터 NcoI XbaI 단편을 절제하여 벡터 pRIT 14586내로 클로닝하는 단계.

d) 숙주 균주 AR58을 형질전환시키는 단계.

e) 플라스미드 pRIT 14477을 함유하는 대장균 균주 형질전환체를 선별하고 특징을 결정하여, LPD-MAGE-3-His 융합 단백질을 발현시키는 단계.

실시예 II

LPD1/3-MAGE-3-His 항원의 제조

1. 세균 균주의 성장과 유도 - LPD1/3-MAGE-3-His의 발현

플라스미드 pRIT 14477로 형질전환된 AR58 세포를 효모 추출물(ℓ당 6.4 g)을 보충한 LY12 배지 400 ml와 카나마이신 설페이트(ℓ당 50 mg)을 각각 함유하고 있는 2ℓ 플라스크 중에서 증식시켰다. 8+/-1시간 동안 30℃에서 진탕하에 배양시킨 후에 현미경 검사를 위해 각 플라스크로부터 소량의 샘플을 취하였다. 20ℓ 발효기용 접종물을 제공하기 위해 두 플라스크의 내용물을 혼합하였다.

7ℓ의 배지를 함유하고 있는 미리 멸균된 20ℓ(전체 부피) 발효기에 접종물(약 800 ml)을 첨가하였고, ℓ당 50 mg의 카나마이신 설페이트를 보충하였다. 주기적으로 NH₄OH(25% v/v)를 첨가함으로써 pH를 6.8로 적정하여 유지시켰고, 온도를 30℃로 맞추고 유지시켰다. 공기혼입 속도를 분당 공기 12ℓ로 조절하여 유지시켰고 용존 산소 압력을 교반 속력의 피드백 조절에 의해 50% 포화도로 유지시켰다. 발효기내의 과압을 500 g/cm²(0.5 bar)로 유지시켰다.

유가 배양을 탄소 공급 용액의 첨가를 조절함으로써 수행하였다. 공급 용액을 처음에 분당 0.04 ml의 속도로 첨가하였고, 0.1 h^-1의 성장 속도를 유지시키기 위해 처음 42시간 동안 지수적으로 증가시켰다.

42시간 후에, 발효기의 온도를 39℃로 신속하게 증가시키고, 추가적인 22시 간 내지 23시간 동안의 유도기 동안, 즉 LPD-MAGE-3-His의 세포내 발현이 최대 수준에 이르는 시간 동안 공급 속력을 분당 0.005 ml/g DCW로 일정하게 유지시켰다.

배양액의 분취액(15 ml)을 증식/유도기에 걸쳐 일정한 간격으로 취하고 발효 말기에 미생물 증식과 세포내 생성물 발현에 대한 역학을 연구하였으며, 추가적으로 미생물 동정/순도 시험을 위한 샘플을 제공하였다.

발효 말기에, 배양액의 흡광도는 80 내지 120(48 내지 72 g DCW/L의 세포 농도에 해당)이었고, 배양액의 전체 부피는 대략적으로 12ℓ였다. 배양액을 6℃ 내지 10℃로 신속하게 냉각시키고, 30분 동안 4℃에서 5000 x g로 원심분리시킴으로써 배양액으로부터 ECK32 세포를 분리하였다. 농축된 ECK32 세포를 신속하게 플라스틱 가방에 보관하였고 즉시 -80℃에서 냉동시켰다.

2. 단백질의 추출

냉동된 ECK32 농축 세포를 4℃에서 해동시킨 다음 세포 분해 버퍼에 재현탁시켜 최종 흡광도가 60이 되도록 하였다(약 36 g DCW/L의 세포 농도에 해당).

이 세포를 고압 균질기(1000 bar)를 2회 통과시켜 파쇄시켰다. 이 파쇄된 세포 현탁액을 원심분리(30분 동안 4℃에서 x 10000g)시키고 펠릿 분획을 트리톤 X100(1% w/v)과 EDTA(1 mM)을 사용하여 세척한 다음에 인산완충식염수(PBS)와 Tween 20(0.1% v/v)의 혼합물을 사용하여 세척하였고 마지막으로 PBS를 사용하여 세척하였다. 각 세척 단계 사이에, 이 현탁액을 30분 동안 4℃에서 x 10000g로 원심분리시키고, 상층액을 버리고 펠릿을 보존하였다.

실시예 III

융합 단백질 리포 D-MAGE 3의 특징 결정

1. 정제

하기 기술된 단계의 순서를 사용하여 세포 균질물로부터 LPD-MAGE-3-His를 정제하였다:

a) 세포 파쇄로부터 얻은 세척된 펠릿 분획을 가용화시키는 단계,

b) 티올 기를 차단함으로써 단백질내 및 단백질간 이황화 결합을 화학적으로 환원시켜 산화적인 재결합을 방지시키는 단계,

c) 반응 혼합액을 미세여과시켜 미립자를 제거시키고 내독소를 감소시키는 단계,

d) 폴리히스티딘 테일과 아연-적재 킬레이팅 세파로즈(zinc-loaded Chelating Sepharose)간의 친화성 상호작용을 사용함으로써 LPD-MAGE-3-His를 포착하고 1차적으로 정제하는 단계,

e) 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 불순물 단백질을 제거하는 단계.

정제된 LPD-MAGE-3-His를 여러번의 연마 단계로 처리하였다.

f) 슈퍼덱스 75(Superdex 75)를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 버퍼를 교환하고 요소를 제거하는 단계,

g) 공정 중 여과(In-process filtration) 단계,

h) 세파덱스 G25(Sephadex G25)를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 버퍼를 교환하고 탈염시키는 단계.

이들 각 단계를 더욱 상세하게 하기에 기술하였다:

1.1) 세포 균질물 펠릿의 가용화

최종 세척 단계(상기 기술된 바와 같음)로부터의 펠릿 분획을 4℃에서 하룻밤동안 구아니딘 하이드로클로라이드(6M) 및 인산 나트륨(0.1M, pH 7.0) 800 ml중에 재용해시켰다.

1.2) 환원과 카복시메틸화

*용해된 물질(옅은 황색, 탁한 현탁액)을 아르곤으로 세정하여 어떤 잔여 산소를 제거시키고, 2-머캅토에탄올(14M) 저장 용액을 첨가하여 최종 농도가 4.3M(용액의 ml당 2-머캅토에탄올 0.44ml에 해당)이 되도록 하였다.

수득한 용액을 2개의 유리 플라스크로 나누어 담고 항온조내에서 95℃로 가열하였다. 95℃에서 15분 동안 처리한 후에, 이 플라스크를 항온조에서 꺼내어 냉각되도록 하였으며, 여기에서 이 내용물들을 하나의 호일에 싸여진 비이커(5ℓ)내로 합치고, 얼음위에 정치시켰으며, 고형의 요오도아세트아미드를 격렬하게 혼합시키면서 첨가하여 최종 농도가 6M(용액의 ml당 요오도아세트아미드 1.11 g에 해당)이 되도록 하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 암실에서 얼음위에 정치시켜 요오도아세트아미드를 완전히 가용화시키고, 대략적으로 1ℓ의 수산화 나트륨(5M)을 첨가하여 중화(결렬하게 혼합시키면서 그리고 계속적으로 pH 모니터링을 하면서)시킴으로써 최종적으로 pH 7.5-7.8이 되도록 하였다.

이에 따른 혼합액을 30분 동안 암실에서 얼음위에 정치시키고, 그런 후에 pH를 pH 7.5-7.8로 다시 조절하였다.

1.3) 미세여과

이 혼합액을 미니크로스(Minikros) 중공 섬유 카트리지[참조 번호 : M22M-600-01N; 면적 5,600 cm², 0.2 ㎛]를 장착한 아미콘 프로플럭스 M12(Amicon Proflux M12) 접선-흐름 장치중에서 미세여과시켰다. 이 투과물을 후속 크로마토그래피 정제를 위해 보존하였다.

1.4) 금속(Zn²⁺) 킬레이트 크로마토그래피(IMAC)

금속 킬레이트 크로마토그래피는 킬레이팅 세파로즈 FF(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat. No. 17-0575-01)가 충전되어 있는 BPG 100/500 컬럼(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat No. 18-1103-01)내에서 수행되었다. 충전된 베드의 치수는: 직경 10 cm; 단면적 79 cm²; 베드 높이 19 cm; 충전된 부피 1,500 ml이었다. 빈 컬럼을 수산화 나트륨(0.5M)을 사용하여 살균하였고, 그런 다음 정제수를 사용하여 세척하였다.

지지물질(20% v/v 에탄올중에 전달된)을 부크너(Buchner) 깔때기(진공하에서)상에서 정제수(8ℓ)를 사용하여 세척하였고 적어도 15ℓ의 ZnCl₂(0.1M) 용액에 통과시킴으로써 아연을 사용하여 충전시켰다. 배출액의 pH가 ZnCl₂ 용액의 pH(pH 5.0)에 도달할 때까지, 정제수 10ℓ를 사용하여 지지물질을 세척함으로써 잉여 아연을 제거하였다. 그런 다음 구아니딘 하이드로클로라이드(6M) 및 인산염 나트륨(0.1M, pH 7.0)을 함유하는 용액 4ℓ를 사용하여 지지물질을 평형시켰다.

LPD-MAGE-3-His를 함유하는, 미세여과로부터의 투과물을 지지물질과 혼합하였고(배치 결합), 구아니딘 하이드로클로라이드(6M) 및 인산염 나트륨(0.1M, pH 7.0)을 함유하는 용액을 사용하여 BPG 컬럼내에 로딩시켜 채웠다.

금속성 킬레이트 크로마토그래피의 다음 단계는 용리액 유량을 분당 60 ml로 조절하는 것이다. 먼저 구아니딘 하이드로클로라이드(6M) 및 인산염 나트륨(0.1M, pH 7.0)을 함유하는 용액을 사용하여 컬럼을 세척하고 난 후에 컬럼 용리액이 OD₂₈₀nm(기준)에서 0 흡광도에 도달할 때까지, 요소(6M) 및 인산염 나트륨(0.1M, pH 7.0)을 함유하는 용액을 사용하여 세척하였다.

요소(6M), 인산염 나트륨(0.1M, pH 7.0) 및 이미다졸(0.5M)을 함유하는 용액의 2배 컬럼 부피를 사용하여 반순수한 LPD-MAGE-3-His 단백질 분획을 용리시켰다. 이러한 분획의 전도도는 대략적으로 cm당 16 mS이었다.

1.5) 음이온 교환 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피를 계속하기에 앞서서, 요소(6M) 및 트리스-HCl(20mM, pH 8.0)을 함유하는 용액을 사용한 희석에 의해 반순수한 LPD-MAGE-3-His 단백질 분획의 전도도를 대략적으로 cm당 4 mS로 감소시켰다.

음이온 교환 크로마토그래피는 Q-세파로즈 FF(참조 : Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-0510-01)가 충전된 BPG 200/500 컬럼(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat. No. 18-1103-11)을 사용하여 수행되었다. 충전된 베드의 치수는: 직경 10 cm; 단면적 314 cm²; 베드 높이 9 cm; 충전된 부피 2,900 ml 이다.

컬럼을 충전하고(20% v/v 에탄올을 사용하여) 분당 70 ml의 용리액 유량으로 정제수 9ℓ를 사용하여 세척하였다. 충전된 컬럼을 수산화 나트륨(0.5M) 3ℓ를 사용하여 살균하였고, 정제수 30ℓ를 사용하여 세척한 다음, 요소(6M) 및 트리스-HCl(20 mM, pH 8.0)을 함유하는 용액 6ℓ를 사용하여 평형시켰다. 희석된, 반정제된 LPD-MAGE-3-His를 컬럼에 넣고 나서 용리액의 흡광도(280nm)가 0으로 떨어질 때까지 요소(6M), 트리스-HCl(20 mM, pH 8.0), EDTA(1 mM) 및 Tween(0.1%)를 함유하는 용액 9ℓ를 사용하여 세척하였다.

추가적인 세척 단계를 요소(6M) 및 트리스-HCl(20 mM, pH 8.0)을 함유하는 용액 6ℓ를 사용하여 수행하였다.

정제된 LPD-MAGE-3-His를 요소(6M), 트리스-HCl(20 mM, pH 8.0) 및 NaCl(0.25 M)을 함유하는 용액을 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다.

1.6) 크기 배제 크로마토그래피

정제된 LPD-MAGE-3-His로부터 요소의 제거 및 버퍼 교환 모두는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 이것은 슈퍼덱스 75(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat. No. 17-1044-01)가 충전된 XK 50/100 컬럼(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat. No. 18-8753-01)을 사용하여 수행되었다. 충전된 베드의 치수는: 직경 5 cm; 단면적 19.6 cm²; 베드 높이 90 cm; 충전된 부피 1,800 ml이다.

컬럼을 에탄올(20%)중에서 충전시키고 분당 20 ml의 유량으로 정제수 5ℓ를 사용하여 세척하였다. 컬럼을 수산화 나트륨(0.5M) 2ℓ를 사용하여 살균하였고, 정제수 5ℓ를 사용하여 세척한 다음, Tween 80(0.1% v/v)을 함유하는 인산완충식염수 5ℓ를 사용하여 평형시켰다.

정제된 LPD-MAGE-3-His 분획(탈염 시험당 최대 500 ml)을 분당 20 ml의 용리액 유량으로 컬럼상에 로딩시켰다. 탈염 정제된 LPD-MAGE-3-His를 Tween 80(0.1% v/v)을 함유하는 PBS 3ℓ를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다.

LPD-MAGE-3-His를 함유하는 분획을 컬럼의 기공 부피로 용리시켰다.

1.7) 공정 중 여과

크기 배제 크로마토그래피로부터의 벌크 LPD-MAGE-3-His를 층류 후드(등급 10.000)에서 0.22 ㎛ 막을 통해 여과하였다. 여과된 벌크를 -80℃에서 냉동시키고 탈염 단계까지 보관하였다.

1.8) 탈염 크로마토그래피

최종 벌크의 삼투몰랄농도가 400 mOsM미만이어야 하기 때문에, 염 농도를 감소시키기 위해 추가적인 버퍼 교환 단계가 요구된다. 이것은 세파덱스 G25(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat. No. 17-0033-02)가 충전된 BPG 100/950 컬럼(참조 : Pharmacia Biotechnology Cat. No. 18-1103-03)을 사용하는 탈염 크로마토그래피 단계에 의해 수행되었다. 충전된 베드의 치수는: 직경 10 cm; 단면적 78.6 cm²; 베드 높이 85 cm; 충전된 부피 6,500 ml이다.

세파덱스 G25를 정제수 7ℓ를 사용하여 수화시키고 4℃에서 하룻밤 팽창시켰 다. 그런 다음 겔을 분당 100 ml의 용리액 유량으로 정제수를 사용하여 컬럼내에 충전시켰다.

컬럼을 수산화 나트륨(0.5M) 6ℓ를 사용하여 살균시키고 난 다음, 인산염 나트륨(10 mM, pH 6.8), NaCl(20 mM) 및 Tween 80(0.1% v/v)을 함유하는 용액 10ℓ를 사용하여 평형시켰다.

정제된 LPD-MAGE-3-His 분획(탈염 시험당 최대 1500 ml)을 분당 100 ml의 용리액 유량으로 컬럼상에 로딩시켰다. 탈염 정제된 LPD-MAGE-3-His 분획을 컬럼의 기공 부피로 용리하였고, 0.22 ㎛ 막을 통해 멸균 여과시켰으며 -80℃에 보관하였다.

최종 벌크 단백질을 +4℃로 해동시키고 바이알에 분취하고 락토오스 부형제(3.2%) 중에서 동결건조시켰다.

2. 쿠마시-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서의 분석

LPD-MAGE-3-His 정제된 항원을 환원 조건에서 12.5% 아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

단백질 로드는 쿠마시 블루 염색의 경우에는 50 ㎍ 및 질산은 염색의 경우에는 5 ㎍이다. 임상 로트 96K19와 파이롯 로트 96J22을 분석하였다. 분자량 60kDa에 상응하는 하나의 주요 밴드가 나타났다. 대략적으로 45kDa 및 35kDa의 2개의 작은 추가적인 밴드가 또한 나타났다.

3. 웨스턴 블롯 분석

LPD-MAGE-3-His 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 밝혀진 펩티드를 마우스 단 클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 동정하였다. 이들 항체는 MAGE-3-His 단백질의 정제된 제조물을 사용하여 조직내에서 발생한 것들이다(이 단백질은 LPD-MAGE-3-His의 LPD 부분을 포함하고 있지 않다).

두 개의 단클론 항체 제조물(Mab 22 및 Mab 54)은 웨스턴 블롯 분석을 위한 적합성에 근거하여 선택되었으며 로트 방출을 위한 동정 시험에 사용되었다. 도 4는 Mab 32 및 Mab 54로 염색한 후에 로트 96K19 및 로트 96J22에 대해 수득된 밴드 패턴을 보여준다. 12.5% SDS-PAGE상에서 단백질 600 ng을 용해시키고, 나일론 막으로 이동시켰으며, Mab 32 및 Mab 54(ml당 60 ㎍)와 반응시켜 페록시다제와 결합된 항 마우스 항체를 사용하여 가시화시켰다.

SDS-PAGE에 의해 탐지된 60kDa 펩티드 및 30kDa 펩티드를 양 Mab에 의해 가시화시켰다.

실시예 IV

1. LPD-MAGE-3-His 단백질을 사용한 백신 제조

본 실험에 사용된 백신은 애쥬번트를 필요로 하든/하지 않든 리포단백질 D 1/3-MAGE-3-His를 암호화하고 있으면서 균주 AR58로부터의 대장균에서 발현되는 재조합 DNA로부터 생성된다. 애쥬번트로서, 제형은 수중유 에멀전중의 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL) 및 QS21의 혼합물을 포함하고 있다. 애쥬번트 시스템 SBA S2는 상기 WO 95/17210에 기술되어 있다.

3D-MPL은 그람-음성 세균 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)의 지질다당류(LPS)로부터 유도된 면역촉진제이다. MPL은 탈아실화시켰으며 지질 A 잔기상 의 인산 기를 제거하였다. 이러한 화학 처리는 면역촉진제 성질을 보존하면서 독성을 극적으로 감소시킨다(참조 : Ribi, 1986). 리비 이뮤노케미스트리(Ribi Immunochemistry)가 MPL을 생산하여 스미스 클라인 비참-바이올로지칼즈(Smith Kline Beecham Biologicals)에게 제공하였다. 스미스 클라인 비참 바이올로지칼즈에서 수행된 실험은 다양한 운반체와 결합된 3D-MPL이 체액성 세포 면역성과 TH1 타입의 세포 면역성 둘 모두를 상당히 향상시킨다는 것을 보여준다.

Q21은 남아프리카산 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 나무껍질로부터 추출한 천연 사포닌 분자이다. 나무껍질의 미정제 추출물로부터 개별 사포닌을 분리시키기 위해 정제 기술을 개발하여, 특정 사포닌, QS21을 분리하였고, 이들은 모성분과 비교해서 더 강력한 애쥬번트 활성 및 더 낮은 독성을 나타내는 트리테르펜 글리코시드이다. QS21은 몇몇 소단위 Ag에 대한 MHC 클래스 I 제한된 CTL을 활성화시킬 뿐만 아니라 Ag에 특이적인 림프구 증식을 자극한다고 공지되어 있다[참조 : Kensil, 1992]. 아퀼라(Aquila : 공식적으로 Cambridge Biotech Corporation)가 QS21을 생산하여 스미스 클라인 비참 바이올로지칼즈에게 제공하였다.

스미스 클라인 비참 바이올로지칼즈에서 수행된 실험은 체액성 및 TH1 타입 세포의 면역 반응 모두의 유도에서 MPL 및 QS21의 조합 사용의 명백한 상승 효과를 보여주었다.

수중유 에멀전은 2개의 오일(토코페롤 및 스콸렌)로 제조된 유기상과 유화제로서 Tween 80을 함유하는 PBS의 수성상으로 구성되어 있다. 에멀전은 5% 스쿠알 렌, 5% 토코페롤, 0.4% Tween 80을 포함하고 있으며 평균 입자 크기는 180 nm이고 SB62로서 공지되어 있다(참조 : WO 95/17210).

스미스 클라인 비참 바이올로지칼즈에서 수행된 실험은 3D-MPL/QS21(SBAS2)에 대한 이 O/W 에멀전의 보조가 다양한 소단위 항원에 대한 나중의 면역촉진성을 더욱 증가시킨다는 것을 증명하였다.

2. 에멀전 SB62(2배 농도)의 제조

Tween 80을 인산완충식염수(PBS)중에 용해시켜 PBS중에 2% 용액을 제조하였다. 100 ml의 2배 농도 에멀전을 제공하기 위해 DL 알파 토코페롤 5 g 및 스쿠알렌 5 ml를 볼텍싱하여 완전히 혼합하였다. PBS/Tween 용액 90 ml를 첨가하고 완전히 혼합하였다. 그런 다음 이 에멀전을 시린지를 통해 통과시키고 최종적으로 M110S 미유체역학 기계를 사용함으로써 미유동화시켰다. 수득한 오일 방울의 크기는 대략적으로 180 nm였다.

3. 수중유(SBAS2)제형화에서 리포단백질 D 1/3 - MAGE-3-His QS21/3D MPL의 제조

애쥬번트를 수중유 에멀전 중에서 MPL과 QS21의 조합으로서 제형화하였다. 이 제조물을 0.7 ml 바이알로 옮기고 동결건조된 항원(30㎍ 내지 300㎍의 항원이 들어있는 바이알)과 혼합시켰다.

동결건조된 백신에 대한 희석 애쥬번트의 조성은 다음과 같다:

애쥬번트 또는 PBS를 단독으로 사용하여 동결건조된 LPD-MAGE-3-His 제조물을 재구성함으로써 최종적인 백신을 수득하였다.

PBS에 의해 단백질을 대체시킴으로써 항원없이 애쥬번트 대조물을 제조하였다.

4. 백신 항원 : 융합 단백질 리포단백질 D 1/3 - MAGE-3-His

리포단백질 D는 그람-음성 세균 헤모필러스 인플루엔자의 표면에 노출되어 있는 리포단백질이다.

융합 파트너로서 프로세싱된 단백질 D의 처음 109개 잔기를 함유시키는 것은 T-세포 에피토프와 함께 백신 항원을 제공하기 위한 것이다. LPD 잔기 외에, 이 단백질은 2개의 관련되지 않은 아미노산(Met 및 Asp), Mage-3의 아미노산 잔기 2 내지 314, 후속되는 7개의 His 잔기를 노출시키는 힌지 영역으로서 기능하는 2개의 Gly 잔기를 포함하고 있다.

실시예 V

1. 마우스와 원숭이에서의 LPD-MAGE-3-His의 면역원성

인간 MAGE-3 단백질의 항원성 및 면역원성을 시험하기 위해, 유전학적 배경과 MHC 대립형질에 차이가 있는 2가지 서로 다른 마우스 세포주(C57BL/6 및 Balb/C)내에 후보 백신을 주사시켰다. 양 마우스 세포주에 대해, 잠재적 MHC 클래스-I 및 MHC 클래스-II 펩티드 모티프를 LPD-MAGE-3-His 융합 단백질의 MAGE 부분에 대해 이론적으로 예측하였다.

a) 면역화 프로토콜

인간 세팅에서 사용되는 농도의 10분의 1로 SBAS2에서 제형화되거나/제형화되지 않은 LPD-MAGE-3-His 5 ㎍을 각 세포주의 마우스 5마리의 발바닥에 2주 간격으로 2회씩 주사하였다.

b) 증식 분석

마지막 주사 후 2주된 마우스로부터 비장 또는 오금 림프절을 분쇄시킴으로써 림프구를 준비하였다. 2 x 10⁵ 세포를 96 웰 플레이트중에 3개를 한벌로 위치시키고 이 세포를 라텍스 마이크로-비드상에 코팅되거나 코팅되지 않은 그대로의 His-Mage 3를 서로 다른 농도(1-0.1 ㎍/ml)로 사용하여 72시간 동안 시험관내에서 재자극시켰다.

SBAS-2 제형 단독 또는 PBS가 주사된 마우스의 림프구 증식 반응과 비교할 때, 증가된 MAGE-3 특이성 림프구 증식 활성이 LPD-MAGE-3-His 단백질을 사용하여 주사된 C57BL/6 마우스 또는 Balb/C 마우스로부터의 비장 세포(도 5 및 도 7 참조)와 림프절 세포(도 6 및 도 8 참조) 모두에서 관찰되었다.

또한, 애쥬번트 SBAS2중의 LPD-MAGE-3-His를 사용하여 면역된 마우스로부터의 림프구를 사용하여 더욱 높은 증식 반응을 수득하였다(도 6 및 도 8 참조).

c) 결론

LPD-MAGE-3-His는 마우스에서 면역원성이며, 이 면역원성은 SBAS2 애쥬번트 제형을 사용함으로써 증가될 수 있다.

2. 항체 반응

a) 면역화 프로토콜

PBS, 또는 SBAS2, 또는 LPD-MAGE-3-His 5μG, 또는 LPD-MAGE-3-His + SBAS2 5μG를 사용하여 2주 간격으로 발바닥에 2회씩 주사함으로써 Balb/c 마우스 또는 C57BL/6 마우스를 면역화시켰다.

대조군에 3마리를 시험군에서는 5마리를 각각 사용하였다.

b) 간접 ELISA

두번째 주사후 개별 혈청을 취하여 간접 ELISA에 사용하였다.

2 μG/ml의 정제된 His MAGE 3을 코팅된 항원으로서 사용하였다. PBS + 1% 신생 송아지 혈청중에 37℃에서 1시간 동안 포화시킨 후에, 혈청을 포화 버퍼중에 연속적으로 희석(1/1000로 시작)시키고 4℃에서 하룻밤 또는 37℃에서 90분 동안 배양시켰다. PBS/Tween 20,01%중에서 세척한 후에, 비오티닐화된 염소 항-마우스 전체 IgG(1/1000) 또는 염소 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 항혈청(1/5000)을 제 2의 항체로서 사용하였다. 37℃에서 90분 동안 배양시킨 후에, 페록시다제와 결합된 스트렙타비딘을 첨가하였고, TMB(테트라-메틸-벤지딘 페록사이드)를 기질로서 사용하였다. 10분 후에 H₂SO₄ 0.5M을 첨가함으로써 반응을 종료시키고 흡광도(O.D.)를 측정하였다.

c) 결과

도 9는 마우스의 다른 군 사이(N=5/군)의 혈청의 상대적인 평균 중간값 역가를 비교한 것이며, 이것은 굴곡의 중간값에 도달하기 위해 필요한 평균 희석도이다.

이 결과는 시험된 양 마우스 세포주에서 약한 Ab 반응이 LPD-MAGE-3-His를 단독으로 2회 주사한 후에 증가하였으나, LPD-MAGE-3-His가 SBAS2의 존재하에 주사되었을 때 더욱 높은 항-MAGE 3 Ab 농도가 발생된다는 것을 보여주는 것이다. 따라서 2주 간격으로 LPD-MAGE-3-His + SBAS2를 2회 주사하는 것만으로도 관찰된 높은 Ab 반응을 발생시키기에 충분하다.

또한 C57BL/6 마우스에서 달성된 Ab 역가가 LPD-MAGE-3-His를 단독으로 주사한 후보다 LPD-MAGE-3-His + SBAS2를 주입한 후에 더욱 높았지만, C57BL/6 마우스 에서 수득된 반응과 비교할 때 Balb/c 마우스에서 관찰된 더 높은 Ab 반응은 이들 2종의 균주간의 하프로타입 또는 배경에서의 차이에 의해 설명될 수 있다.

마우스의 서로 다른 군에서 백신접종후에 Ig 하위군-특이성 항-MAGE-3 반응은 도 10 및 도 11에서 볼 수 있으며, 이것은 혈청의 평균 중간값 희석도를 비교한 것이다.

IgA 또는 IgM 모두는 애쥬번트 SBSA2 중의 LPD-MAGE-3-His를 사용하여 백신접종된 마우스로부터의 어떠한 혈청 샘플에서도 탐지되지 않았다.

반면, 전체 IgG 수준은 LPD-MAGE-3-His 단독으로 백신접종된 마우스로부터의 혈청에서 조금 높았으며 SBAS2 중의 LPD-MAGE-3-His로 주사된 동물의 혈청에서 상당히 증가되었다.

시험된 모든 IgG 하위군(IgG1, IgG2a, IgG2b)의 수준이 Ag 또는 애쥬번트만을 주사한 마우스에서보다 애쥬번트와 함께 Ag를 사용하여 백신접종된 마우스에서 더욱 높았기 때문에, 서로 다른 IgG-하위군 농도의 분석은 혼합된 Ab 반응이 마우스에서 유도되었다는 것을 보여준다.

하지만 IgG1 및 IgG2b가 Balb/c 마우스 및 C57BL/6 마우스의 혈청에서 각각 우세하게 발견되었기 때문에, SBAS2의 존재하에서 리포D-MAGE 3를 사용하여 백신접종시킨 후에 이 혼합된 Ab 반응의 성질은 마우스 세포주에 따라 다른 것으로 보인다.

3. 붉은털 원숭이에서 리포단백질 D 1/3 MAGE-3-His + SBAS2 애쥬번트의 면역원성

5마리로 이루어진 붉은털 원숭이(Macaca Mulatta)의 3 군을 선택하였다. 양성 대조군으로서 RTS, S 및 gp120을 사용하였다.

군:

군 1 오른쪽 다리: RTS, S/SBAS2

왼쪽 다리: GP120/SBAS2

군 2 오른쪽 다리: RTS, S/SB26T

왼쪽 다리: GP120/SB26T

군 3 오른쪽 다리: 리포D 1/3 MAGE 3 His/SABA2

0일째에 붉은털 원숭이에게 백신접종을 하고 28일째와 84일째에 추가접종시키고 방혈시켜 MAGE 3 및 단백질 D 성분 모두에 대한 이들의 항체 반응을 결정하였다. 오른쪽 다리의 후부에 볼루스(bolus) 주사제(0.5 ml)로써 백신을 근육내 투약하였다.

소량의 혈액 샘플을 14일마다 취하였다. 헤파린을 포함하지 않은 혈액 샘플 3 ml을 대퇴부 혈관으로부터 수집함으로써 적어도 1시간 동안 응고되도록 하였고 실온에서 10분 동안 2500 rpm으로 원심분리시켰다.

혈청을 제거하고, -20℃에서 냉동시키고 특정 ELISA에 의한 항체 수준의 측정을 위해 사용하였다.

96 웰 마이크로플레이트(참조 : maxisorb Nunc)를 His Mage 3 또는 단백질 D를 사용하여 4℃에서 하룻밤 코팅시켰다. PBS NCS 1%를 사용하여 37℃에서 1시간 포화시킨 후에, PBS Tween, 항 토끼 비오티닐화된 혈청(참조 : Amersham ref RPN 1004 lot 88)을 첨가한 다음(1/5000) 토끼 혈청의 연속 희석물을 37℃에서 1시간 30분 동안 첨가하였다(1/10에서 시작). 플레이트를 세척하고 페록시다제 결합 스트렙타비딘(1/5000)을 37℃에서 30분 동안 첨가하였다. 세척 후에, TMB(참조 : BioRad) 50 ㎕를 7분 동안 첨가하였고 H₂SO₄ 0.2M을 사용하여 반응을 종료시켰으며, 450 nm에서 약물과량을 측정하였다. 중간값 희석도를 소프트맥스프로(SoftmaxPro)에 의해 계산하였다.

항체 반응

소량의 혈액 샘플을 14일 마다 취하여 ELISA에 의해 MAGE 3에 대한 항체 반응의 역학을 조사하였다. 이 결과는 LPD 1/3 Mage 3 His + SBAS2의 1회 주사이후, Mage 3 특이성 전체 Ig 역가가 낮아졌다는 것을 시사하는 것이며, 명백한 증가는 동일한 원숭이에 리포 D 1/3 Mage 3 + 애쥬번트의 제 2, 제 3의 주사 이후에 5마리 동물중 3마리에서 나타났다. 약한 반응을 나타내는 동물은 3회 주사 이후에도 음성을 유지하였다. 28일간의 포스트 II 또는 포스트 III후에, 항체 역가는 기본 수준으로 돌아왔다. 이 항체들의 하위군을 우세한 IgG 및 그렇지 않은 IgM으로서 결정하였다. IgG로의 전환은 T 헬퍼 반응이 촉발되었다는 것을 시사한다. 단백질 D 특이성 항체 반응은, 약하기는 하지만, Mage 3 항체 반응과 정확하게 평행관계이다.

실시예 VI

1. LPD-MAGE 1 His

유사한 방법으로 LPD-MAGE 1-His를 제조하였다. 아미노산 및 DNA 서열을 서 열 ID 3번 및 4번에 기술하였다. 수득한 단백질을 LPD-MAGE-3-His 단백질과 유사한 방법으로 정제하였다. 간략하게, 세포 배양액을 균질화시키고 0.5% 엠피겐 세제의 존재하에서 4 M 구아니딘 HCl과 0.5 M 베타 머캅토에탄올을 사용하여 처리하였다. 이 생성물을 여과시키고 투과물을 0.6 M 요오도아세트아미드를 사용하여 처리하였다. 카복시아미드화된 분획을 IMAC(아연 킬레이트-세파로즈 FF) 크로마토그래피로 처리하였다. 컬럼을 우선 평형시키고 4M 구아니딘, HCl, 인산 나트륨(20mM, pH 7.5) 및 0.5% 엠피겐을 함유하는 용액을 사용하여 세척한 다음, 이 컬럼을 인산 나트륨(20mM, pH 7.5)중의 4M 요소 및 0.5% 엠피겐 버퍼를 함유하는 용액으로 세척하였다. 동일하되, 이미다졸의 농도를 증가시킨(20mM, 400mM 및 500mM) 버퍼중에서 이 단백질을 용리시켰다.

이 용리액을 4M 요소로 희석하였다. Q-세파로즈 컬럼을 평형시키고 0.5% 엠피겐의 존재하에서 20mM 인산염 버퍼(pH 7.5)중의 4M 요소를 사용하여 세척하였다. 동일하되, 세제를 함유하지 않은 버퍼중에서 두번째 세척을 수행하였다. 동일하되 이미다졸을 증가시킨(150mM, 400mM, 1M) 버퍼중에서 이 단백질을 용리시켰다. 이 용리액을 한외여과시켰다.

실시예 VII

발현 플라스미드 pRIT14426의 제조 및 NS1-MAGE-3 His를 생성하기 위한 숙주 균주 AR58의 형질전환

단백질 설계

대장균내에서 발현되기 위한 융합 단백질 NS1-MAGE-3-His의 설계를 도 12에 기술하였다.

수득한 단백질의 1차 구조는 ID 5번에 기술되어 있는 서열을 가지고 있다.

상기 단백질 설계에 상응하는 코딩 서열(ID 6번 참조)을 대장균 발현 플라스미드중의 λpL 프로모터의 조절을 받게 하였다.

NS1-MAGE-3-His 융합 단백질의 생성을 위한 클로닝 방법

출발 물질은 루드위크 인스티투트(Ludwig Institute)의 티에리 분(Tierry Boon) 박사로부터 입수된 cDNA 플라스미드로서 MAGE-3 유전자 및 벡터 PMG81에 대한 코딩 서열을 포함하고 있으며, 벡터 PMG81은 인플루엔자로부터의 NS1(비구조 단백질) 코딩 영역인 81개의 아미노산을 포함하고 있다.

도 13에 개략된 클로닝 방법은 다음 단계들을 포함한다:

a) 올리고뉴클레오티드 센스: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, 및 올리고뉴클레오티드 안티센스: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa를 사용하여 플라스미드 cDNA MAGE-3내에 존재하는 서열을 PCR 증폭시키는 단계.

이 증폭은 N 말단에 다음의 변화를 초래한다: 처음 5개 코돈의 대장균 코돈용으로의 변화, 1 위치에서의 Pro 코돈의 Asp 코돈으로의 치환, 5' 말단에 NcoI 부위의 생성 및 최종적으로 2개의 Gly 코돈 및 7개의 His 코돈의 첨가에 이은 C-말단에서의 XbaI 부위의 첨가.

b) 증폭된 단편을 인비트로젠(Invitrogen)사의 TA 클로닝 벡터내로 클로닝하여 중간 생성물 벡터 pRIT14647을 제조하는 단계

c) 플라스미드 pRIT14647로부터 NcoI XbaI 단편을 잘라내어 벡터 pRIT PMG81내로 클로닝하는 단계

d) 숙주 균주 AR58을 형질전환시키는 단계

e) NS1-MAGE-3-His 융합 단백질을 발현시키는 플라스미드 pRIT14426(도 14 참조)를 함유하고 있는 대장균 균주 형질전환체를 선별하고 특징을 결정하는 단계

재조합 NS1-MAGE-3-His(pRIT14426)의 특징 결정

세균을 30℃에서 ml당 50㎍의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 성장시켰다. 배양물이 OD=0.3(620 nm에서)에 도달했을 때, 온도를 42℃로 상승시킴으로써 열 유도를 수행하였다.

4시간 유도 후에, 세포를 수확하여, PBS중에 재현탁시키고 프렌치 프레스(French press)에서 3시간 프레싱함으로써(분해시킴으로써) 용해시켰다. 원심분리(100,000 g에서 60분)후에, 펠릿, 상층액 및 전체 추출물을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 전체 대장균 단백질의 약 1%를 나타내는 융합 단백질이 있는 쿠마시 B1으로 염색된 겔중에서 단백질을 가시화시켰다. 재조합 단백질은 외견상 분자량(MW)이 44.9 K인 단일 밴드로서 나타났다. 이 융합 단백질을 항-NS1 단클론을 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 동정하였다.

실시예 VIII

토끼/마우스 면역화를 위한 NS1-MAGE-3-His(대장균)의 정제.

정제 개요:

항원을 정제하기 위해 다음의 정제 개요를 사용하였다:

세포의 용해 + 원심분리

↓

항원 가용화 + 원심분리

↓

Ni²+-NTA 아가로스

↓

농축

↓

세포 준비

↓

TCA 침전 및 PBS 가용화

a. 용해

세균 세포(23g)를 라니(Rannie)(균질기)에 의해 50mM PO₄ pH7 버퍼 203 ml중에 용해시켰고 이 용해질을 30분 동안 15,000 rpm으로 JA20 로터에서 원심분리시켰다.

상층액을 제거하였다.

b. 항원 가용화

펠릿의 1/3을 100mM PO4-6M GuHC1 pH7 34ml중에 4℃에서 하룻밤 재가용화시켰다. 30분 동안 15,000 rpm으로 JA20 로터에서 원심분리시킨 후에, 펠릿을 제거하 고 상층액을 IMAC에 의해 더욱 정제하였다.

c. 친화도 크로마토그래피: Ni²+-NTA 아가로스(Qiagen)

컬럼 부피: 15 ml(16 mm x 7.5 cm)

충전 버퍼: 0.1M PO₄-6M GuHC1 pH7

샘플 버퍼: 상동

세척 버퍼: 0.1M PO₄-6M GuHC1 pH7

0.1M PO₄-6M 요소 pH7

용리: 6M 요소를 첨가한 0.1M PO₄ 버퍼(pH7)중의 이미다졸 농도구배(0 → 250mM).

유량: 분당 2 ml

a. 농축:

IMAC 용리액(160 ml)중 항원 양성 분획을 합치고 필트론(Filtron) 막(타입 Omega cut-off 10,000)상에서 아미콘(Amicon) 교반된 세포에서 5 ml로 농축시켰다.

b. 제조용 전기영동(Prep Cell Biorad)

농축된 샘플 2.4 ml을 환원 샘플 버퍼 0.8 ml중에서 끓이고 10% 아크릴아미드 겔상에 로딩시켰다. 항원을 4% SDS가 첨가된 트리스-글리신 버퍼(pH 8.3)중에서 용리시키고 NS1-MAGE 3 His 양성 분획을 합쳤다.

a. TCA 침전:

항원을 TCA 침전시키고 20분 동안 15,000 rpm으로 JA20 로터에서 원심분리시킨 후에 , 상층액을 제거하였다. 펠릿을 PBS 버퍼 pH 7.4중에 재용해시켰다.

이 단백질은 냉동/해동이후 PBS에서 가용성이며 37℃에 3시간 동안 보관했을 때 어떤 분해도 보이질 않았고 SDS(12.5% PAGE)에 의해 결정된 바와 같이 외견상 분자량은 대략적으로 50,000 Dalton이다.

실시예 IX

융합 단백질 CLYTA-MAGE-1-His 테일을 발현시키는 대장균 균주의 제조

1. 발현 플라스미드 pRIT14613의 제조 및 숙주 균주 AR58의 형질전환:

단백질 설계:

대장균내에서 발현되기 위한 융합 단백질 Clyta-Mage-1-His의 설계는 도 15에 기술되어 있다.

수득한 단백질의 1차 구조는 서열 ID 7번에 기술되어 있는 서열을 가지고 있다.

상기 단백질 설계에 상응하는 코딩 서열(서열 ID 8번 참조)을 대장균 발현 플라스미드중의 λpL 프로모터의 조절을 받게 하였다.

클로닝:

출발 물질은 스트렙토콕커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 LytA 코팅 영역의 117개 C-말단 코돈을 함유하고 있는 벡터 PCUZ1과 벡터 pRIT14518이며, 여기에서 본 발명자들은 루드위그 인스티튜트의 티에리 분 박사로부터 입수된 플라스미드로부터의 MAGE-1 유전자 cDNA를 미리 서브클로닝하였다.

CLYTA-Mage-1-His 단백질의 발현을 위한 클로닝 방법(도 16 참조)은 다음 단계들을 포함한다:

2. CLYTA-Mage-1-His 코딩 서열 모듈의 제조:

a) 제 1단계는 PCR 증폭으로서 NdeI-AflIII 제한 부위를 CLYTA 서열의 측면에 부착시키기 위한 것이다. PCR 증폭은 주형으로서 플라스미드 PCUZ1을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 센스: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, 및 올리고뉴클레오티드 안티센스: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG를 사용함으로써 수행되었다. 이 결과 378개 뉴클레오티드 길이의 CLYTA 서열로 증폭되었다.

b) 제 2단계는 CLYTA 서열을 MAGE-1-His 서열과 연결시켜 융합 단백질을 위한 코딩 서열을 생성하는 것이다. 이 단계는 NdeI-AflIII Clyta 단편의 절제, NdeI 및 NcoI(NcoI 및 aflIII 호환성) 제한 효소에 의해 미리 개방된 벡터 pRIT14518내로의 삽입을 포함하고 있으며 플라스미드 pRIT14613을 생성한다.

c) 제 3단계는 숙주 균주 AR58를 형질전환시키는 단계이다.

d) 제 4단계는 플라스미드 pRIT14613(도 16 참조)을 함유하고 있는 대장균 형질전환체(KAN 내성)를 선별하고 특징을 결정하는 단계이다.

1. 재조합 단백질 CLYTA-MAGE-1-His(pRIT14613)의 특징 결정:

세균을 30℃에서 ml당 50㎍의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 성장시켰다. 배양물이 OD=0.3(620 nm에서)에 도달했을 때, 38℃로 온도를 상승시킴으로써 열 유도를 수행하였다.

4시간 유도 후에, 세포를 수확하여 PBS중에 재현탁시켰고 원샷(one shot)에 의해(분해시킴으로써) 용해시켰다. 원심분리시킨 후에, 펠릿, 상층액 및 전체 추출물을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질을 쿠마시 B1 염색된 겔에서 가시화시켰으며, 여기에서 융합단백질은 전체 대장균 단백질중 약 1%로 나타났다. 재조합 단백질은 외견상 MW가 약 49 kD인 단일 밴드로서 나타났다. 항-Mage-1 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 동정하였다.

긴 λpL 프로모터(날리딕스 산 유도를 위해 유용한) 및 CLYTA-Mage-1 코딩 서열 pRIT14614로 구성되어 있는 발현 단위의 재구성:

긴 PL 프로모터 및 CLYTA 서열의 일부를 포함하는 EcoRI-NcoI 제한 단편을 플라스미드 pRIT DVA6로부터 제조하였고 플라스미드 pRIT14613의 EcoRI-NcoI 부위 사이에 삽입하였다.

재조합 플라스미드 pRIT14614를 수득하였다.

융합단백질 CLYTA-Mage-1-His를 암호화하는 재조합 플라스미드 pRIT14614(도 17 참조)를 사용하여 대장균 AR120을 형질전환시켰다. Kan 내성 후보 균주를 선별하고 특징을 결정하였다.

재조합 단백질의 특징 결정:

세균을 30℃에서 ml당 50mg의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 성장시켰다. 배양물이 OD=400(620nm에서)에 도달했을 때, 날리딕스 산을 첨가하여 최종 농도가 ml당 60mg이 되도록 하였다.

4시간 유도 후에, 세포를 회수하여 PBS에 재현탁시켰고 분해(분해 CLS "원 샷" 타입)에 의해 용해시켰다. 원심분리시킨 후에, 펠릿, 상층액 및 전체 추출물을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질을 쿠마시 블루 염색된 겔에서 가시화시켰으며, 여기에서 융합 단백질은 전체 대장균 단백질중 약 1%로 나타났다. 토끼 항-Mage-1 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 융합 단백질을 동정하였다. 재조합 단백질은 외견상 분자량이 약 49 kD인 단일 밴드로서 나타났다.

실시예 X

CLYTA-MAGE-3-HIS

A: 종양 저지 재조합 항원: C-lyt A 융합 파트너가 가용성 단백질의 발현을 이끄는 융합 단백질 CLYTA-Mage-3-His는 친화성 태그로서 역할하며 유용한 T-헬퍼를 제공한다.

융합 단백질 CLYTA-Mage-3-His 테일을 발현시키는 대장균 균주의 제조

발현 플라스미드 pRIT14646의 제조 및 숙주 균주 AR120의 형질전환:

단백질 설계:

대장균내에서 발현되는 융합 단백질 Clyta-Mage-3-His의 설계를 도 18에 기술하였다.

수득한 단백질의 1차 구조는 서열 ID 9번에 기술된 서열: 및 서열 ID 10번에 코딩 서열을 가지고 있다.

상기 단백질 설계에 상응하는 코딩 서열을 대장균 발현 플라스미드중의 λpL 프로모터의 조절을 받게 하였다.

클로닝:

출발 물질은 문헌[참조 : Gene 43, (1986) p.265-272]에 기술된 스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 Lyt A 코딩 영역의 117개의 C-말단 코돈을 함유하고 있는 벡터 PCUZ1과 벡터 pRIT14426이며, 여기에서 본 발명자들은 루드위크 인스티튜트의 티에리 분 박사로부터 입수된 플라스미드로부터 MAGE-3 유전자 cDNA를 미리 서브클로닝하였다.

CLYTA-MAGE-3-His 단백질의 발현을 위한 클로닝 방법(도 19 참조)은 다음 단계들을 포함한다:

1. CLYTA-MAGE-3-His 코딩 서열 모듈의 제조:

1.1. 제 1단계는 PCR 증폭으로서, AflII 및 AflIII 제한 부위를 CLYTA 서열의 측면에 부착시키기 위한 것이다. PCR 증폭은 주형으로서 플라스미드 PCUZ1을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 센스: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, 및 올리고뉴클레오티드 안티센스: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg를 사용함으로써 수행되었다. 이 결과 427개 뉴클레오티드 길이의 CLYTA 서열로 증폭되었다. 상기 증폭된 단편을 인비트로젠사의 TA 클로닝 벡터내로 클로닝하여 중간 생성물 벡터 pRIT14661을 수득하였다.

1.2. 제 2단계는 CLYTA 서열을 MAGE-3-His 서열과 연결시켜 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 생성하는 것이다. 이 단계는 Afl II-Afl-III Clyta 단편의 절제와 Afl II 및 NcoI(NcoI 및 AflII 호환성) 제한 효소에 의해 미리 개방된 벡터 pRIT14426내로의 삽입을 포함하고 있으며 플라스미드 pRIT14662를 생성한다.

2. 긴 λpL 프로모터(날리딕스 산 유도를 위해 유용) 및 CLYTA-Mage-3 코딩 서열로 구성되어 있는 발현 단위의 재구성:

짧은 pL 프로모터 및 CLYTA-Mage-3-His 코딩 서열을 포함하고 있는 BglII-XbaI 제한 단편을 플라스미드 pRIT14662로부터 제조하여 플라스미드 TCM67(암피실린에 대한 내성 및 긴 λpL 프로모터를 포함하고 있는 pBR322의 유도체로서, 국제 출원 PCT/EP92/O1827에 기술되어 있음)의 BglII-XbaI 부위사이에 삽입하였다. 플라스미드 pRIT14607을 수득하였다.

융합 단백질 Clyta-Mage-3 His 를 암호화하는 재조합 플라스미드 pRIT14607을 사용하여 대장균 AR120을 형질전환시켰다[참조 : Mott et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, 82:88]. 암피실린 내성 후보 균주를 선별하고 특징을 결정하였다.

3. 플라스미드 pRIT14646의 제조:

최종적으로 pRIT14607과 유사하되 카나마이신 선별력을 가진 플라스미드를 제조하였다(pRIT14646).

재조합 단백질의 특징 결정:

세균을 30℃에서 ml당 50 mg의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 성장시켰다. 배양물이 OD=400(600 nm에서)에 도달했을 때 날리딕스 산을 첨가하여 최종 농도가 ml 당 60?g이 되도록 하였다.

4시간 유도후에, 세포를 수확하여 PBS중에 재현탁시켰고 분해(분해 CLS "원 샷" 타입)에 의해 용해시켰다. 원심분리시킨 후에, 펠릿, 상층액 및 전체 추출물을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질을 쿠마시 블루 염색된 겔에서 가시화시켰으 며, 여기에서 융합 단백질은 전체 대장균 단백질중 약 1%로 나타났다. 이 융합 단백질을 토끼 항-Mage-3 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 동정하였다. 재조합 단백질은 외견상 MW가 약 58 kD인 단일 밴드로서 나타났다.

실시예 XI

재조합 단백질 CLYTA-Mage-3 His의 제조:

재조합 세균 AR120(pRIT14646)을 30℃에서 유가배양조건으로 20ℓ 발효기에서 성장시켰다. 날리딕스 산을 첨가하여 최종 농도가 ml 당 60?g이 되도록 함으로써 재조합 단백질의 발현을 유도시켰다. 발효 말기에 세포를 수확하여 프렌치 프레스 분쇄기(20000 psi)를 2회 통과시켜 60 OD/600에서 용해시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 15000 g로 20분 동안 펠릿화하였다. 재조합 단백질을 함유하고 있는 상층액을 0.3M NaCl, 20mM 트리스 HCl pH 7.6 버퍼 A중에서 미리 평형시킨 교환 DEAE 세파로즈 CL6B 수지(Pharmacia)상에 로딩시켰다. 컬럼을 버퍼 A를 사용하여 세척한 후에, 융합 단백질을 버퍼 A중의 2% 콜린에 의해 용리시켰다. 항 Mage-3 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅 분석법에 의해 밝혀진 바와 같이, 양성 항원 분획을 합쳤다. DEAE-용리된 항원을 0.5% 엠피겐 BB(양쪽성 세제) 및 0.5M NaCl로 처리하고, 0.5% 엠피겐 BB, 0.5M NaCl, 50mM 인산염 버퍼 pH 7.6(버퍼 B)중에 미리 평형시킨 이온 금속 친화도 크로마토그래피 컬럼상에 로딩시켰다.

280 nm 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 IMAC 컬럼을 버퍼 B를 사용하여 세척하였다. 세제를 제거하기 위해 엠피겐 BB(버퍼C)를 포함하지 않은 버퍼 B중에서 두 번째 세척을 한 후에 버퍼 C중에서 이미다졸 농도구배 0-250mM 이미다졸에 의해 항원을 용리시켰다.

0.090-0.250 M 이미다졸 분획을 합치고, 10 kDa 필트론 오메가 막상에서 농축시킨 후에 PBS 버퍼에 대하여 투석시켰다.

결론:

본 발명자들은 융합된 단백질 LPD-MAGE3-His가 마우스에서 면역원성이며, 이 면역원성(증식 반응 및 항체 반응)이 상기 기술된 애쥬번트를 사용함으로써 더욱 증가될 수 있다는 것을 증명하였다. 정제는 이황화 결합을 형성하는 티올을 유도체화함으로써 향상될 수 있다.

또한 본 발명자들은 애쥬번트의 존재하에서 LPD-MAGE-3-His를 사용하는 백신접종에 의해 더 높은 항체 반응이 촉발될 수 있음을 증명하였다. C57BL/6의 혈청에서 발견되는 우세한 이소타입이 IgG2b라는 것은 TH1 타입 면역 반응이 증가되었다는 것을 시사하는 것이다.

인간에 있어서, 애쥬번트를 포함하지 않는 제형에서 LPD-MAGE3-His를 사용하여 환자를 치료하는 임상적 세팅은 흑색종을 제거시켰다.

[참조문헌]

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION (i) APPLICANT: SmithKline Beecham Biologicals (ii) TITLE OF THE INVENTION: Vaccine (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 10 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: SmithKline Beecham (B) STREET: 2 New Horizons Court, Great West Road, B (C) CITY: Middx (D) STATE: (E) COUNTRY: UK (F) ZIP: TW8 9EP (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Diskette (B) COMPUTER: IBM Compatible (C) OPERATING SYSTEM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows Version 2.0 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Dalton, Marcus J (B) REGISTRATION NUMBER: (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: B45126 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 0181 9756348 (B) TELEFAX: 0181 9756177 (C) TELEX: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 452 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 115 120 125 Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu 130 135 140 Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr 145 150 155 160 Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr 165 170 175 Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro 180 185 190 Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser 195 200 205 Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr 210 215 220 Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val 225 230 235 240 Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro 245 250 255 Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr 260 265 270 Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val 275 280 285 Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile 290 295 300 Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn 305 310 315 320 Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile 325 330 335 Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp 355 360 365 Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu 370 375 380 Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp 385 390 395 400 Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His 405 410 415 Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His 420 425 430 Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Thr Ser Gly Gly His His His 435 440 445 His His His 450 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1353 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA 180 CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240 ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300 CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360 ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGATCTG GAACAGCGTA GTCAGCACTG CAAGCCTGAA 420 GAAGGCCTTG AGGCCCGAGG AGAGGCCCTG GGCCTGGTGG GTGCGCAGGC TCCTGCTACT 480 GAGGAGCAGG AGGCTGCCTC CTCCTCTTCT ACTCTAGTTG AAGTCACCCT GGGGGAGGTG 540 CCTGCTGCCG AGTCACCAGA TCCTCCCCAG AGTCCTCAGG GAGCCTCCAG CCTCCCCACT 600 ACCATGAACT ACCCTCTCTG GAGCCAATCC TATGAGGACT CCAGCAACCA AGAAGAGGAG 660 GGGCCAAGCA CCTTCCCTGA CCTGGAGTCC GAGTTCCAAG CAGCACTCAG TAGGAAGGTG 720 GCCGAATTGG TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATCGAGCCA GGGAGCCGGT CACAAAGGCA 780 GAAATGCTGG GGAGTGTCGT CGGAAATTGG CAGTATTTCT TTCCTGTGAT CTTCAGCAAA 840 GCTTCCAGTT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC ATCGAGCTGA TGGAAGTGGA CCCCATCGGC 900 CACTTGTACA TCTTTGCCAC CTGCCTGGGC CTCTCCTACG ATGGCCTGCT GGGTGACAAT 960 CAGATCATGC CCAAGGCAGG CCTCCTGATA ATCGTCCTGG CCATAATCGC AAGAGAGGGC 1020 GACTGTGCCC CTGAGGAGAA AATCTGGGAG GAGCTGAGTG TGTTAGAGGT GTTTGAGGGG 1080 AGGGAAGACA GTATCTTGGG GGATCCCAAG AAGCTGCTCA CCCAACATTT CGTGCAGGAA 1140 AACTACCTGG AGTACCGGCA GGTCCCCGGC AGTGATCCTG CATGTTATGA ATTCCTGTGG 1200 GGTCCAAGGG CCCTCGTTGA AACCAGCTAT GTGAAAGTCC TGCACCATAT GGTAAAGATC 1260 AGTGGAGGAC CTCACATTTC CTACCCACCC CTGCATGAGT GGGTTTTGAG AGAGGGGGAA 1320 GAGGGCGGTC ATCACCATCA CCATCACCAT TAA 1353 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1341 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA 180 CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240 ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300 CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360 ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGCTCT CTGGAACAGC GTAGTCTGCA CTGCAAGCCT 420 GAGGAAGCCC TTGAGGCCCA ACAAGAGGCC CTGGGCCTGG TGTGTGTGCA GGCTGCCACC 480 TCCTCCTCCT CTCCTCTGGT CCTGGGCACC CTGGAGGAGG TGCCCACTGC TGGGTCAACA 540 GATCCTCCCC AGAGTCCTCA GGGAGCCTCC GCCTTTCCCA CTACCATCAA CTTCACTCGA 600 CAGAGGCAAC CCAGTGAGGG TTCCAGCAGC CGTGAAGAGG AGGGGCCAAG CACCTCTTGT 660 ATCCTGGAGT CCTTGTTCCG AGCAGTAATC ACTAAGAAGG TGGCTGATTT GGTTGGTTTT 720 CTGCTCCTCA AATATCGAGC CAGGGAGCCA GTCACAAAGG CAGAAATGCT GGAGAGTGTC 780 ATCAAAAATT ACAAGCACTG TTTTCCTGAG ATCTTCGGCA AAGCCTCTGA GTCCTTGCAG 840 CTGGTCTTTG GCATTGACGT GAAGGAAGCA GACCCCACCG GCCACTCCTA TGTCCTTGTC 900 ACCTGCCTAG GTCTCTCCTA TGATGGCCTG CTGGGTGATA ATCAGATCAT GCCCAAGACA 960 GGCTTCCTGA TAATTGTCCT GGTCATGATT GCAATGGAGG GCGGCCATGC TCCTGAGGAG 1020 GAAATCTGGG AGGAGCTGAG TGTGATGGAG GTGTATGATG GGAGGGAGCA CAGTGCCTAT 1080 GGGGAGCCCA GGAAGCTGCT CACCCAAGAT TTGGTGCAGG AAAAGTACCT GGAGTACCGG 1140 CAGGTGCCGG ACAGTGATCC CGCACGCTAT GAGTTCCTGT GGGGTCCAAG GGCCCTCGCT 1200 GAAACCAGCT ATGTGAAAGT CCTTGAGTAT GTGATCAAGG TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT 1260 TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA AGCAGCTTTG AGAGAGGAGG AAGAGGGAGT CGGCGGTCAT 1320 CACCATCACC ATCACCATTA A 1341 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 466 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 115 120 125 Gly Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu 130 135 140 Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Thr 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr 165 170 175 Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe 180 185 190 Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser 195 200 205 Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser 210 215 220 Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe 225 230 235 240 Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met 245 250 255 Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe 260 265 270 Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys 275 280 285 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly 290 295 300 Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr 305 310 315 320 Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His 325 330 335 Ala Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr 340 345 350 Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr 355 360 365 Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp 370 375 380 Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala 385 390 395 400 Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala 405 410 415 Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu 420 425 430 Glu Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His 435 440 445 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 404 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Met Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 85 90 95 Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 100 105 110 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 115 120 125 Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser 130 135 140 Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp 145 150 155 160 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser 165 170 175 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys 180 185 190 Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln 210 215 220 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 225 230 235 240 Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 245 250 255 Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 260 265 270 Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile 275 280 285 Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 290 295 300 Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly 305 310 315 320 Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu 325 330 335 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 340 345 350 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 355 360 365 His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 370 375 380 His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His 385 390 395 400 His His His (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1212 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: ATGGATCCAA ACACTGTGTC AAGCTTTCAG GTAGATTGCT TTCTTTGGCA TGTCCGCAAA 60 CGAGTTGCAG ACCAAGAACT AGGTGATGCC CCATTCCTTG ATCGGCTTCG CCGAGATCAG 120 AAATCCCTAA GAGGAAGGGG CAGCACTCTT GGTCTGGACA TCGAGACAGC CACACGTGCT 180 GGAAAGCAGA TAGTGGAGCG GATTCTGAAA GAAGAATCCG ATGAGGCACT TAAAATGACC 240 ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA 300 GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT CCTGCTACTG AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC 360 TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT 420 CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG 480 AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC 540 CTGGAGTCCG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT AGGAAGGTGG CCGAATTGGT TCATTTTCTG 600 CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC 660 GGAAATTGGC AGTATTTCTT TCCTGTGATC TTCAGCAAAG CTTCCAGTTC CTTGCAGCTG 720 GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC CCCATCGGCC ACTTGTACAT CTTTGCCACC 780 TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGGCAGGC 840 CTCCTGATAA TCGTCCTGGC CATAATCGCA AGAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA 900 ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTGGGG 960 GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAACATTTC GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG 1020 GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGTTATGAA TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGTTGAA 1080 ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCACCATATG GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCACATTTCC 1140 TACCCACCCC TGCATGAGTG GGTTTTGAGA GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC 1200 CATCACCATT AA 1212 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 445 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: Met Lys Gly Gly Ile Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr 100 105 110 Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Asp Met Gly 115 120 125 Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu Glu 130 135 140 Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Thr Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Ala 165 170 175 Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe Pro 180 185 190 Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser Leu 210 215 220 Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Leu 225 230 235 240 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu 245 250 255 Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe Gly 260 265 270 Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu 275 280 285 Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu 290 295 300 Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr Gly 305 310 315 320 Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His Ala 325 330 335 Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr Asp 340 345 350 Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln 355 360 365 Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp Ser 370 375 380 Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu 385 390 395 400 Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg 405 410 415 Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu Glu 420 425 430 Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His 435 440 445 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1338 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360 GACAGGCCAG AATTGGACAT GGGCTCTCTG GAACAGCGTA GTCTGCACTG CAAGCCTGAG 420 GAAGCCCTTG AGGCCCAACA AGAGGCCCTG GGCCTGGTGT GTGTGCAGGC TGCCACCTCC 480 TCCTCCTCTC CTCTGGTCCT GGGCACCCTG GAGGAGGTGC CCACTGCTGG GTCAACAGAT 540 CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCGCC TTTCCCACTA CCATCAACTT CACTCGACAG 600 AGGCAACCCA GTGAGGGTTC CAGCAGCCGT GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTCTTGTATC 660 CTGGAGTCCT TGTTCCGAGC AGTAATCACT AAGAAGGTGG CTGATTTGGT TGGTTTTCTG 720 CTCCTCAAAT ATCGAGCCAG GGAGCCAGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGA GAGTGTCATC 780 AAAAATTACA AGCACTGTTT TCCTGAGATC TTCGGCAAAG CCTCTGAGTC CTTGCAGCTG 840 GTCTTTGGCA TTGACGTGAA GGAAGCAGAC CCCACCGGCC ACTCCTATGT CCTTGTCACC 900 TGCCTAGGTC TCTCCTATGA TGGCCTGCTG GGTGATAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC 960 TTCCTGATAA TTGTCCTGGT CATGATTGCA ATGGAGGGCG GCCATGCTCC TGAGGAGGAA 1020 ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GATGGAGGTG TATGATGGGA GGGAGCACAG TGCCTATGGG 1080 GAGCCCAGGA AGCTGCTCAC CCAAGATTTG GTGCAGGAAA AGTACCTGGA GTACCGGCAG 1140 GTGCCGGACA GTGATCCCGC ACGCTATGAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGCTGAA 1200 ACCAGCTATG TGAAAGTCCT TGAGTATGTG ATCAAGGTCA GTGCAAGAGT TCGCTTTTTC 1260 TTCCCATCCC TGCGTGAAGC AGCTTTGAGA GAGGAGGAAG AGGGAGTCGG CGGTCATCAC 1320 CATCACCATC ACCATTAA 1338 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 454 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: Met Lys Gly Gly Ile Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr 100 105 110 Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Ala Ser Met 115 120 125 Leu Asp Met Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu 130 135 140 Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala 145 150 155 160 Pro Ala Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val 165 170 175 Glu Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro 180 185 190 Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro 195 200 205 Leu Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly 210 215 220 Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser 225 230 235 240 Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala 245 250 255 Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn 260 265 270 Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu 275 280 285 Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His 290 295 300 Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu 305 310 315 320 Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu 325 330 335 Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp 340 345 350 Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile 355 360 365 Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn 370 375 380 Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu 385 390 395 400 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val 405 410 415 Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro 420 425 430 Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His 435 440 445 His His His His His 450 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1362 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360 GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC 420 AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT 480 CCTGCTACTG AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG 540 GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC 600 CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA 660 GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC CTGGAGTCTG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT 720 AGGAAGGTGG CCAAGTTGGT TCATTTTCTG CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC 780 ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC GGAAATTGGC AGTACTTCTT TCCTGTGATC 840 TTCAGCAAAG CTTCCGATTC CTTGCAGCTG GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC 900 CCCATCGGCC ACGTGTACAT CTTTGCCACC TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG 960 GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC TTCCTGATAA TCATCCTGGC CATAATCGCA 1020 AAAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG 1080 TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTCGGG GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAATATTTC 1140 GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGCTATGAG 1200 TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCATTGAA ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCACCATATG 1260 GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCGCATTTCC TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA 1320 GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC CATCACCATT AA 1362 B45126 - 1 -

Claims (12)

1. 융합 파트너가 단백질 D 또는 이들의 단편; 인플루엔자로부터의 NS1 단백질 또는 이들의 단편; 또는 스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 C-lyta 또는 이들의 단편으로부터 선택되는 재조합적으로 발현된 MAGE 융합 단백질인 MAGE 항원 유도체.
2. 제 1항에 있어서, 항원이 친화성 태그를 추가로 가짐을 특징으로 하는 항원 유도체.
3. 제 1항에 있어서, 단백질 D 또는 이들의 단편이 지질화되어 있음을 특징으로 하는 항원 유도체.
4. 제 1항에 있어서, MAGE 단백질이 하기 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 항원 유도체:

   MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 및 MAGE C2.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서 청구된 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
6. 제 5항의 핵산을 함유하는 벡터.
7. 제 6항의 벡터로 형질전환된 숙주.
8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서 청구된 단백질을 함유하는 백신.
9. 제 8항에 있어서, 애쥬번트, 면역촉진성 시토카인 또는 케모카인, 또는 애쥬번트 및 면역촉진성 시토카인 또는 케모카인을 추가로 함유함을 특징으로 하는 백신.
10. 제 8항에 있어서, 단백질이 수중유 또는 유중수 에멀전 운반체에 제공됨을 특징으로 하는 백신.
11. 제 9항에 있어서, 애쥬번트가 3D-MPL, QS21 또는 CpG 올리고뉴클레오티드를 함유함을 특징으로 하는 백신.
12. 제 8항에 있어서, 의약용임을 특징으로 하는 백신.

Images