NO331719B1 - Fremgangsmate for rensing eller fremstilling av et MAGE protein samt fremstilling av en vaksine - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye proteiner og deres produksjon, fra MAGE-familien. Spesielt et MAGE-protein koblet til en immunologisk fusjonspartner, slik som Lipoprotein D. Slike antigener kan formuleres for å tilveiebringe vaksiner for behandling, av en rekke av tumorer. Nye metoder for å rense MAGE proteinene er også tilveiebrakt.

Description

Protein derivater, som omfatter et tumorassosiert antigen som kan benyttes i cancer vaksine terapi. Spesielt derivater som inkluderer fusjonsproteiner som omfatter et antigen som er kodet for av familien fra MAGE genene (for eksempel MAGE-3, MAGE-1). Koblet til en immunologisk fusjonspartner som tilveiebringer T hjelper epitoper, slik som, for eksempel, lipidiert form av protein D fra haemophilus influenzae B; kjemisk modifisert MAGE proteriner hvori antigenenes disulfid broer blir redusert og de resulterende tiolene blokkert og genetisk modifiserte MAGE proteiner far et affinitets merke og/eller genetisk modifisert for å hindre disulfid brodannelse. Metoder i følge oppfinnelsen blir beskrevet for å rense MAGE proteinene og for formulerings vaksiner for å behandle et spekter av cancere, inklusiv, men ikke begrenset til melanoma, bryst, blære, lunge, NSCLC, hode og plate celle carcinom, kolon carcinom og spiserørs carcinom.

Antigener som kodes for av familien fra MAGE genene er fortrinnsvis uttrykt på melanoma celler (inklusiv malingt melanom) og noen andre cancere inklusiv NSCLC (ikke små cellet lunge cancer), hode og nakke plate celle carcinom, blære transisjons celle carcinom og spiserørs carcinom, men er ikke detekterbare på normale vev med unntak i testis ogplacenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 ble uttrykt i 69% av melanomaene (Gaugler, 1994), og kan også detekteres i 44% av NSCLC (Yoshimatsu 1988), 48% av hode og nakke celle carcinom, 34% av blære transisjons celle carcinom 57% av spiserørs carcinom 32% av kolon cancer og 24% av bryst cancere (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Cancere som uttrykker MAGE proteinene er kjent som MAGE assosierte tumorer.

Immunogeniteten til humane melanoma celler har blitt vist i eksperimenter ved å bruke blandede kulturer av melanoma celler og autologe lymfocytter. Disse kulturene danner ofte spesifikke cytotoksiske T lymfocytter (CTL) som er i stand til å lysere eksklusivt autologe melanoma celler men verken autologe fibroblaster, eller autologe EBV transformerte B lymfocytter (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Flere av antigenene som gjenkjennes på autologe melanoma celler av disse CTL klonene er nå identifisert, inklusiv de fra MAGE familien.

WO 96/10413 Al omhandler sammensetninger som inneholder tumorantigener for eksempel MAGE og brak av disse for behandling av pasienter med melanom.

WO 95/04542 Al beskriver peptider derivert fra MAGE-1 og vaksiner innholdende disse, som stimulerer immunresponsen i pasienter med melanom. Det vises også MAGE uttrykt på andre cancere. Det samme blir også omtalt i Kocher et al.; Identification and intracellullar location of MAGE-3 gene product; Cancer research, vol. 55, nr. 11,1995, s. 2236-2239.

Det første antigenet som kunne defineres gjennom dets gjenkjenning ved spesifikk CTL på autologe melanoma celler er kalt MZ2-E (Van den Eynde, 1989) og kodes for av genet MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). CTL rettet mot MZ2-E gjenkjenner og lyserer MZ2-E positive melanoma celler fra autologe så vel som fra andre pasienter forutsatt at disse cellene har HLA.A1 allel.

MAGE-1 genet tilhører en familie av 12 nært beslektede gener, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, lokalisert på kromosom X og som deler fra 64 til 85 % med hverandre i deres kodene sekvens (De Plaen, 1994). Disse er noen ganger kjent som MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE Al 1, MAGE A12, (MAGE A familien). To andre grupper av proteiner er også en del av MAGE familien skjønt de er mer fjernt beslektet. Disse er MAGE B og MAGE C gruppen. MAGE B familien inkluderer MAGE Bl (også kjent som MAGE Xpl, og DAM 10), MAGE B2 (også kjent som MAGE Xp2 og DAM 6) MAGE B3 og MAGE B4 - MAGE C familien inkluderer for tiden MAGE Cl og MAGE C2.1 generelle vendinger kan MAGE proteinet defineres til å inneholde en kjerne sekvens signatur lokalisert mot den C terminale enden i proteinet (for eksempel med hensyn på MAGE Al et 309 aminosyre protein, hvor kjerne signaturen korresponderer til aminosyren 195-279).

Konsensus mønsteret til kjerne signaturen blir derfor beskrevet som følger hvori X representerer en hvilken som helst aminosyre, nedre tilfeller av residier er konservert (konservative varianter er tillatt) og øvre tilfeller av residier er perfekt konservert.

Kjerne sekvens signatur

Konservative substitusjoner er vel kjent og blir generelt satt opp som standard scorings matriser i sekvens oppstillings computer program. Disse programmene inkluderer PAM250 (Dayhoft M.O. et al, (1978), "En modell for evolusjonære endringer i proteiner", i "Atlas for protein sekvens og struktur" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, and Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies form protein blocks"), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

I generelle vendinger, er substitusjon innen følgende grupper konservative substitusjoner, men substitusjoner mellom grupper er betraktet som ikke konserverte.

Gruppene er:

i) Aspartat, aspargin, glutamat, glutamin

ii) Serin/treonin

iii) Lysin/arginin

iv) Fenylalanin/tyro sin/tryptofan

v) Leusin/isoleusin/valin/metionin

vi) Glysin/alanin

Generelt, og i sammenheng med denne oppfinnelsen, vil MAGE proteinet være omtrent 50% identisk i denne kjerneregionen med aminosyrene 195 til 279 fra MAGE Al.

Flere CTL epitoper har blitt identifisert på MAGE-3 proteinet. Et slikt epitop, MAGE-3.Al, er en nonapeptidsekvens lokalisert mellom aminosyrene 168 og 176 i MAGE-3 proteinet som består av et epitop spesifikt for CTL når den er presentert i sammenheng med MHC klasse 1 molekyl HLA.A1. Nylig har to ytterligere CTL epitoper blitt identifisert på peptid sekvensen til MAGE-3 proteinet ved deres evne til å reise en CTL respons i en blandet kultur av melanoma celler og autologe lymfocytter. Disse to epitopene har spesifikke bindings motiver for HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) og HLA.B44 (herman, 1996) alleler respektivt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for rensing eller fremstilling av et MAGE-protein, omfattende det å redusere disulfidbindingene i proteinet, å blokkere den resulterende frie tiolgruppe med en blokkeringsgruppe og ytterligere omfattende en eller flere kromatografiske trinn, der proteinet løseliggjøres ved bruk av et sterkt kaotropisk middel eller en zwitterion-detergent.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene for fremstilling eller rensing av et MAGE- protein ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17 og formulering av det resulterende protein som en vaksine.

Det kan ulveiebringes MAGE protein derivater. Slike derivater er egnet for anvendelse i terapeutiske vaksine formulering som er egnet for behandling av et spekter av tumor typer.

Derivat fusjonsproteiner kan fremstillessom omfatter et antigen fra MAGE protein familien koblet til en heterolog partner. Proteinene kan være kjemisk konjugert, men er fortrinnsvis uttrykt som rekombinante fusjonsproteiner som tillater økte nivåer og produseres i et ekspresjonssystem sammenlignet med ikke koblet protein. Derfor, kan fusjonspartneren assistere i å tilveiebringe T hjelper epitoper (immunologiske fusjons partnere), fortrinnsvis T hjelper epitoper gjenkjent av mennesker, eller assistere i å uttrykke proteinet (ekspresjons enhancer) ved høyere utbytter enn nativt rekombinant protein. Fortrinnsvis, vil fusjonspartneren være både en immunologisk fusjonspartner og ekspresj onsforsterkningspartner.

Den immunologiske fusjonspartneren kan være avledet fra protein D, et overflate protein fra gram-negativ bakterie, Haemophilus influenzae B (W091/18926). Fortrinnsvis, omfatter protein D derivatet omtrent den første 1/3 av proteinet, spesielt de første N-terrninale 100-110 aminosyrer. Fortrinnsvis er protein D derivater lipidiert. Fortrinnsvis, er de første 109 residiene av lipoprotein D fusjons partner inkludert i den N-terrninale enden for å tilveiebringe vaksine kandidat antigen med ytterligere eksogen T-celle epitoper og økt ekspresjons nivå i E-coli (for derved å virke også som en ekspresjonsenhancer). Lipidhalen sikrer optimal presentasjon av antigenet til antigen presenterende celler.

Andre fusjonspartnere inkluderer ikke strukturell protein fra influenzae virus, NS1 (hemagglutinin). Typisk blir de N-terminale 81 aminosyrer utnyttet, skjønt forskjellige fragmenter kan anvendes forutsatt at de inkluderer T hjelper epitoper.

Den immunologiske fusjonspartnerproteiner er kjent som LYTA. Fortrinnsvis, blir den C terminale delen av molekylet brukt. LYTA er avledet fra streptokokkus fenamoniae som syntetiserer en N-acetyl-L-alanin amidase, amidase LYTA, (kodet for av lytA genet {Gene, 43 (1986) page 265-272} et autolysin som spesifikt degraderer disse bindinger i peptidoglykan hovedkjeden. Det C terminale domene til LYTA proteinet er ansvarlig for affiniteten til cholin og til noen cholin analoger slik som DEAE. Denne egenskapen har blitt undersøkt for utviklingen av E.coli C-LYTA uttrykkende plasmider som er nyttig for ekspresjon av fusjonsproteinet. Rensning av hybridproteiner som inneholder C-LYTA fragmenter i dets amino terminale ende har blitt beskrevet {Biotechnology: 10, (1992) s. 795-798}. Som brukt heri, utgjør en foretrukket utførelsesform, den repeterte delen av Lyta molekylet funnet i den C terminale enden som starter ved residie 178. En spesielt foretrukket form inkorporerer residiene 188-305.

De immunologiske fusjonspartnere beskrevet over er også fordelaktig i å hjelpe til i ekspresjonen. Spesielt, blir slike fusjoner uttrykt med høyere utbytte enn native rekombinante MAGE proteiner.

Slike konstruksjoner i klinisk setting har blitt vist av oppfinnerne til å være i stand til å behandle melanom. I et tilfelle, ble en pasient med stadiet IV melanom fri for melanomer etter to doser av ikke adjuvantert lipo D 1/3 MAGE 3 His protein.

Følgelig kan fusjonsproteinene omfatte et tumor assosiert antigen fra MAGE familien koblet til en immunologisk fusjons partner. Fortrinnsvis, er den immunologiske fusjonspartneren protein D eller fragment derav, det er mest å foretrekke at lipoprotein D. MAGE proteinene er fortrinnsvis MAGE Al eller MAGE A3. Lipoprotein D del omfatter fortrinnsvis den første 1/3 av lipoprotein D.

Proteinene blir fortrinnsvis uttrykt i E, coli. Proteinene kan uttrykes med et affinitets merke, slik som for eksempel en histidin hale som omfatter mellom 5 til 9 og fortrinnsvis seks histidin residier. Disse er fordelaktig under rensingen i følge foreliggende oppfinnelse.

Det kan også skaffes tilveie nukleinsyre som kode for protein som beskrevet over. Slike sekvenser kan settes inn i egnede ekspresjonsvektorer og brukes til DNA/RNA vaksinering eller uttrykkes i en egnet vert. Mikrobielle vektorer som uttrykker nuklein syre kan brukes som vaksine. Slike vektorer inkluderer for eksempel, poksvirus, adenovirus, alfavirus, listeria og monarfag.

En DNA sekvens som koder for proteiner kan syntetiseres ved å bruke standard DNA syntese teknikker, slik som enzymatisk ligering som beskrevet av D.M. Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, ved kjemisk syntese, ved in vitro enzymatisk polymerisering, eller ved PCR teknologi som benytter for eksempel, en varme stabil polymerase, eller ved en kombinasjon av disse teknikkene.

Enzymatisk polymerisering av DNA kan bli utført in vitro ved å bruke en DNA polymerase slik som DNA polymerase I (Klenow fragment) i en egnet buffer som inneholder nukleosid trifosfatene dATP, dCTP, dGTP og dTTP som krever en temperatur på 10°-37°C, generelt i et volum på 50 ul eller mindre. Enzymatisk ligering av DNA fragmentene kan utføres ved å bruke en DNA ligase slik som T4 DNA ligase i en egnet buffer, slik som 0.05M Tris (pH 7.4), 0.01M MgCl2, 0.01M ditiotreitol, lmM spermidin, lmM ATP og 0.1 mg/ml bovin serum albumin, ved en temperatur på 4 °C til omkringliggende temperatur, generelt i et volum på 50 ml eller mindre. Den kjemiske syntese av DNA polymeren eller fragmenter kan bli utført ved konvensjonell fosfotriester, fosfit eller fosforamidit kjemi, ved å bruke fast fase teknikker slik som de som er beskrevet i 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), eller i andre forsknings publikasjoner, for eksempel M J. Gait, h.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982,10,6243; B.S. Sproat, and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983,24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980,21,719; M.D. Mettaucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983,105, 661; N.D. Sinna, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12,4539; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen kan utføres ved konvensjonelle rekombinante teknikker, slik som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Horbor, 1982-1989.

Spesielt, består fremgangsmåten av følgende trinn:

i) fremstille et replikerbart eller integrerende ekspresjonsvektor i stand til i en verts celle, å uttrykke en DNA polymer som omfatter en nukleotid sekvens som koder

proteinet eller et immunogent derivat derav;

ii) transformere en vert celle med nevnte vektor;

iii) å dyrke nevnte transformerte verts celle under betingelser som tillater ekspresjon

av nevnte DNA polymer for å produsere nevnte protein; og

i v) gjenvinning av nevnte protein.

Betegnelsen "transformering" blir brukt heri for å ha betydningen av å introdusere fremmed DNA inn i en vert celle. Dette kan oppnås for eksempel ved transformasjon, transfeksjon eller infeksjon med et egnet plasmid, eller viral vektor ved å bruke for eksempel konvensjonelle teknikker som beskrevet i Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and AJ. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. Betegnelsen "transformert" eller "transformanf' vil heretter anvendes på den resulterende vert cellen som inneholder og uttrykker det fremmede genet av interesse.

Ekspresjonsvektorene er nye.

De replikerbare ekspresjonsvektorene kan fremstilles ved å kutte en vektor kompatibel

med vert cellen for å tilveiebringe et lineært DNA segment som har et inntakt replikon, og kombinere nevnte lineære segment med en eller flere DNA molekyler som, sammen med nevnte lineære segment koder for det ønskede produktet, slik som DNA polymeren som koder for proteinet fra oppfinnelsen, eller derivat derav, under ligerings betingelser.

Derfor, kan DNA polymeren bli utført eller dannet under konstruksjonen av vektoren, som ønskelig.

Valg av vektoren vil bli bestemt delvis av vertcellen, som kan være prokaryot eller eukaryot men er fortrinnsvis E.coli eller CHO celler. Egnede vektorer inkluderer plasmider, bakteriofager, cosmider og rekombinante virus.

Fremstilling av replikerbare ekspresjonsvektor kan utføres konvensjonelt med egnede enzymer for restriksjon, polymerase og ligering av DNA, ved prosedyrer beskrevet i, for eksempel, Maniatis et al. som sitert over.

Rekombinant vert celle blir fremstilt ved å transformere en vert celle med replikerbar ekspresjonsvektor fra oppfinnelsen under transformerende betingelser. Egnede transformerende betingelser er konvensjonelle og er beskrevet i, for eksempel, Maniatis et al. sitert over, eller "DNA Cloning" Vol. E, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

Valg av transformerende betingelser er bestemt av vertcellen. Derfor, kan en bakterie-vert slik som E.coli bli behandlet med en løsning av CaCl2(Cohen et al., Proe. Nat. Acad. Sei., 1973,69, 2110) eller med en løsning som omfatter en blanding av RbCl, MnCk, kalium acetat og glyserol, og deretter med 3-[N-morfolino]-propan-sulfbn syre, RbCl og glyserol. Mammalske celler i kultur kan transformeres med kalsium kopresipitering av vektor DNA på cellen.

Dyrking av transformert vert celle under betingelser tillater at ekspresjon av DNA polymeren blir utført konvensjonelt, som beskrevet, for eksempel, Maniatis et al. and "DNA Cloning" sitert over. Derfor, blir cellene fortrinnsvis supplert med næring og dyrket ved en temperatur under 50°C.

Produktet gjenvunnet ved konvensjonelle metoder i overensstemmelse med vert cellen og i samsvar med lokalisering av ekspresjonsproduktet (intracellulær eller sekretert inn i kultur mediumet eller inn i celle periplasma). Derfor, der hvor vertcellen er bakteriell, slik som E.coli, kan den for eksempel bli lysert fysisk, kjemisk eller enzymatisk og proteinproduktet isolert fra deres resulterende lysat. Der hvor vertcellen er mammalsk, kan produktet generelt bli isolert fra næringsmediumet eller fra cellefrie ekstrakter. Konvensjonell protein isolasjonsteknikker inkluderer selektiv presipitering, absorpsjons- kromatografi, og affinitetskromatografi som inkluderer en monoklonal antistoff affinitetskolonne.

Proteinene er tilveiebrakt enten løselige i en flytende form eller i en lyofilisert form.

Det er generelt forventet at hver human dose vil omfatte 1 til 1000 u.g av protein, og fortrinnsvis 30-300 ug.

Det tilveiebringes også farmasøytisk sammensetning som omfatter et protein fra den foreliggende oppfinnelse i en farmasøytisk akseptabel eksipient. En foretrukket vaksine sammensetning omfatter minst lipoprotein D -MAGE-3. Slik vaksine kan eventuelt inneholde en eller flere andre tumor assosierte antigen. For eksempel, andre medlemmer som tilhører MAGE og GAGE familiene. Egnede andre tumor assosierte antigen inkluderer MAGE-1, GAGE-1 eller tyrosinase proteinene.

Vaksine fremstillingen er generelt beskrevet i Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman MJ.). (1995) Plenum Press New York). Innkapsling inne i liposomene er beskrevet av Fullerton, US Patent 4,235,877.

Proteinene fra den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis adjuvantert i vaksine formulering. Egnede adjuvanter inkluderer et aluminium salt slik som aluminium hydroksid gel (alum) eller aluminium fosfat, men kan også være et salt fra kalsium, jern eller sink, eller kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin, eller acylerte sukkere, kationiske eller anioniske derivatiserte polysakkarider, eller polyfosfazener. Andre kjente adjuvanter inkluderer CpG inneholdende oligonukleotider. Oligonukleotidene er kjennetegnet ved at CpG dinukleotidene er umetylert. Slike oligonukleotider er velkjent og er beskrevet i, for eksempel WO96/02555.

I formuleringen er det foretrukket at adjuvant sammensetningen induserer en immun respons fortrinnsvis av TH1 typen. Egnede adjuvant systemer inkluderer, for eksempel, en kombinasjon av monofosforyl lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl lipid A (3D-MPL) sammen med et aluminium salt. CpG oligonukleotidene induserer også fortrinnsvis en TH1 respons.

Et forsterket system involverer kombinasjonen av monofosforyl lipid A og et saponin derivat spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reaktogenetisk sammensetning hvor QS21 blir stoppet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739.

En spesielt potent adjuvant fomaulering som involverer QS21 3D-MPL & tokoferol i en olje i vann emulsjon er beskrevet i WO 95/17210 og er en foretrukket formulering.

Følgelig i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en vaksine som omfatter et protein fra den foreliggende oppfinnelse, mer foretrekkbart et lipoprotein D (eller derivat derav) -MAGE-3 adjuvantert med en monofosforyl lipid A eller derivat derav.

Fortrinnsvis, omfatter vaksinen ytterligere et saponin, mer foretrekkbart QS21.

Fortrinnsvis omfatter formuleringen en olje i vann emulsjon og tokoferol. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en metode for å produsere en vaksine fbmulering som omfatter å blande et protein fra den foreliggende oppfinnelse sammen med en farmasøytisk akseptabel eksipient, slik som 3D-MPL.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å rense et rekombinant produsert MAGE-protein. Fremgangsmåten omfatter oppløsning av proteinet, for eksempel i et sterkt kaotropisk middel (slik som for eksempel urea, guanidium hydroklorid), eller i zwitterionisk detergent, for eksempel (Empigen BB - n-dodekyl-N,N-dimetylglysin), å redusere proteinets intra og inter molekylære disulfidbindinger, som blokkerer de resulterende tioler og hindre oksidativ rekobling, og som utsetter proteinet for en eller flere kromatografiske trinn.

Fortrinnsvis, er det blokkerende middelet et alkyleringsmiddel. Slike blokkerende midler inkluderer men er ikke begrenset til alfa halosyrer eller alfa haloamider. For eksempel, jod eddik syre og jod acetamid som resulterer i karboksymetylering eller karboksyamidering (karbamidometylering) av proteinet. Andre blokkerings midler kan anvendes og er beskrevet i litteraturen (se for eksempel, The Proteins Vol II Eds H nuerath, RL Holl and C-L Boeder, Academics press 1976, eller Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985). Typiske eksempler på slike andre blokkerings midler inkluderer N-etylmaleimid, kloroacetyl fosfat, O-metylisourea og akrylonitril. Anvendelsen av blokkeringsmiddelet er fordelaktig siden det hindrer agregering av produktet, og sikrer stabilitet for nedstrøms rensning.

I en utførelsesform av oppfinnelsen, blir blokkeringsmiddelet selektert til å indusere en stabil kovalent og irreversibelt derivat (for eksempel alfa halo syrer eller alfa halo amider). Imidlertid, kan andre blokkeringsmidler bli selektert slik at etter rensning kan blokkeringsmiddelet fjernes for å frigi ikke derivatisert protein.

MAGE proteinene som har derivatisert frie tiol residier er nye og danner et aspekt av oppfinnelsen. Spesielt, er karboksyamiderte eller karboksymetylerte derivater en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, blir proteinet tilveiebrakt ved et affinitets merke, slik som CLYTA eller en polyhistidin hale. I slike tilfeller, er proteinet etter bloldcermgstrinnet fortrinnsvis utsatt for affinitetskromatografi. Fordi proteinene med en polyhistidin hale, kan imobilisert metallion affinitets kromatografi (IMAC) bli utført. Metall ionet, kan være et hvilket som helst egnet ion for eksempel sink, nikkel, jern, magnesium eller kobber, men er fortrinnsvis sink eller nikkel. Fortrinnsvis, inneholder IMAC bufferen et zwitterion detergent slik som Empigen BB (heretter Empigen) siden dette resulterer i lavere nivåer av endotoksin i slutt produktet.

Hvis proteinet blir produsert av en Clyta del, kan proteinet renses ved å undersøke dets affinitet for cholin eller cholin analoger slik som DEAE. I en utførelsesform av oppfinnelsen, blir proteinene tilveiebrakt med en polyhistidin hale og en Clyta del. Disse kan bli renset i en enkel to trinns affinitets kromatografisk rensnings måte.

Oppfinnelsen vil ytterligere bli beskrevet ved referanse til følgende eksempler:

EKSEMPEL I:

Fremstilling av rekombinant E. coli stamme som uttrykker fusjonsprotein lipoprotein D-MAGE-3-His (LPD l/3-MAGE-3-His eller LpD MAGE-3-His)

1. E. coli ekspresjons system:

Til produksjonen av lipoprotein D har DNA kodene protein D blitt klonet inn i ekspresjonsvektor pMG 81. Dette plasmidet benytter signalet fra lambda DNA for å drive transkripsjon og translasjonen av de innskutte fremmede genene. Vektoren inneholder lambda PL promoter PL, operator OL og to utnyttelses seter (NutL og NutR) for å gi transkripsjons polaritets effekter når N proteinet er tilveiebrakt (Gross et al, 1985. Mol. & Cell. Biol. 5:1015). Vektorene som inneholder PL promoteren, blir introdusert inn i en E. coli lysogen vert for å stabilisere plasmid DNA. Lysogene vert stammer inneholder replikajsonsdefektiv lambda fag DNA integrert inn i genome (Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1-14. Academic Press NY). Lambda fag DNA dirigerer syntese av cl repressor proteinet som binder til OL repressoren i vektoren og hindrer binding av RNA polymerase til PL promoteren og derved transkripsjon av det innskutte genet. CI genet til ekspresjonsstammen AR58 inneholder en temperatur sensitiv mutasjon slik at PL rettet transkripsjon kan reguleres ved temperatur skift, det vil si en økning i kultur ternperaturen som innaktiverer repressoren og syntese av det fremmede proteinet initsieres. Dette ekspresjonssystemet tillater kontrollert syntese av fremmede proteiner spesielt av de som kan være toksiske for cellen (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).

2. E. coli stammen AR58:

AR58 lysogen E. coli stammer som blir brukt for produksjon av LPD-MAGE-3-His protein er et derivat av standarden NIH E.coli K12 stammen N99 (F-su-galK2, lacZ-thr-). Den inneholder en defekt lysogen lambda (galE::TN10,1 Kil-cI857 DH1). Kil-fenotype hindrer avstenging av verts makromolekylær syntese. CI857 mutasjonen gir en temperatur sensitiv lesjon i cl repressoren. DH1 delesjonen fjerner lambda fagens høyre operon og vertenes bio, uvr3, og chlA loci. AR58 stammen ble dannet ved transduksjon av N99 med en P lambda fage stock som tidligere var dyrket på et SA500 derivat (galE::TN10,1 Kil- cI857 DH1). Introduksjonen av den defekte lysogenen inn i N99 ble selektert med tetracyklin i kraft av tilstedeværelse av et TN10 transposon som kode for tetracyklin resistens i det ved siden av liggende galE genet. N99 og SA500 er E.coli Kl2 stammer fra Dr. Martin Rosenberg's laboratorie ved the National Institutes of Health. 3. Konstruksjon av vektor fremstilt for å uttrykke det rekombinante proteinet LPD-MAGE-3-His: Rasjonale var å uttrykke MAGE 3 som et fusjonsprotein ved å bruke N-terminale tredje av det lipidierte protein D som fusjonspartner forbundet i N-terminal ende av MAGE-3 og en sekvens av flere histidin residier (His hale) plassert ved dets C-terminale ende.

Protein D er et lipoprotein (en 42 kDa immunglobulin D bindings protein eksponert på overflaten av den Gram-negative bakterien heamofilus influenzae). Proteinet blir syntetisert som en forløper med en 18 aminosyre residie signal sekvens, som inneholder en konsensus sekvens for bakterielt lipoprotein (WO 91/18926).

Når signal sekvensen til et lipoprotein blir prosessert under sekresjon, blir Cys (i posisjon 19 i forløper molekylet) den ammoterminale residien og blir samtidig modifisert ved kovalent forbindelse av både ester bundede og amid bundede fettsyrer.

Fettsyrene bundet til den amino terminale cystein residien fungerer derfor som et membran anker.

Plasmidet som uttrykker fusjonsproteinet ble fremstilt for å uttrykke et forløper protein som inneholder de 18 aminosyre signal sekvensene og de første 109 residiene av det prosesserte protein D, to ubeslektede aminosyrer (Met og Asp), aminosyre residier 2 til 314 av MAGE-3, to Gly residier som fungerer som et hengsel region for å eksponere de etterfølgende syv His residiene.

Den rekombinante stammen produserer derved det prosesserte lipodierte His hale fusjonsproteinet for 432 aminosyre residie langt (se figur 1), med aminosyre sekvensen beskrevet i ID Noi og den kodene sekvensen er beskrevet i ID No2.

4. Klonings strategi for generasjonen av LPD-MAGE-3-His fusjonsproteinet (vektor pRIT14477): Et cDNA plasmid (fra Dr Thierry Boon fra Ludwig Institute) som inneholder den kodende sekvensen for MAGE-3 genet (Gaugler B et al, 1994) og vektoren PRIT 14586, som inneholder den N terminale delen av lipo-D-1/3 kodende sekvens (fremstilt som beskrevet i figur 2) ble brukt. Kloningsstrategien inkluderte følgende trinn (figur 3). a) - PCR amplifisering av sekvensene tilstede i plasmid cDNA MAGE 3 ved å bruke oligonukleotid sense: 5' gc gcc atg gat etg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cet, og oligonukleotid antisense: 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tet caa); denne amplifiseringen fører til følgende modifiseringer i den N terminale enden: endring av de fem første kodonene til E.coli kodon anvendelse, erstattning av Pro kodonet av en Asp kodon i posisjon 1, installering av et Ncol sete i den ytterste 5' terminale ende og til slutt tilføyelse av to Gly kodoner og 7 His kodon etterfulgt av et Xbal sete i den C-terminale enden. b) - Kloning inn i TA Moningsvektoren i invitrogen av det ovenfor amplifiserte fragmentet og fremstilling av intermediat vektoren pRIT14647. c) - Utkutting av Ncol Xbal fragmentet fra plasmid pRIT14647 og kloning inn i vektor pRTT 14586.

d) - Transformering av vertsstammen AR58.

e) - Seleksjon og karakterisering av E.coli stamme transformanter som inneholder

plasmid pRIT 14477, som uttrykker LPD-MAGE-3-His fusjonsprotein.

EKSEMPEL 2:

Fremstilling av LPDl/3-MAGE-3-His antigen:

1. Vekst og induksjon av bakteriell stamme-ekspresjon av LPSl/3-MAGE-3-His: Cellene fra AR58 transformert med plasmid pRIT14477 ble dyrket i 2 liters flasker, som hver inneholder 400 ml av LY12 medium supplert med gjær ekstrakt (6.4 g/L) og kanamycin sulfat (50 mg/L). Etter inkubering på en bordrister ved 30°C i 8 +/-1 time, ble en liten prøve fjernet fra hver flaske for mikroskopisk undersøkelse. Inneholdet i de to flaskene ble samlet sammen for å tilveiebringe inoculum for 20 liters fermentoren.

Inoculumet (omtrent 800 mL) ble tilsatt til et presterilisert 20 liters (totalt volum)

fermentor som inneholder 7 liter medium, supplert med 500 mg/L av kanamycin sulfat. PH ble juster til og opprettholdt ved 6.8 ved periodisk tilsetting av NH4OH (25 % v/v), og temperaturen ble justert til og opprettholdt ved 30°C. Luftings raten ble justert til og opprettholdt ved 12 liter luft/minutt og den løste oksygen tensjonen ble opprettholdt ved 50% av mettningen ved feedback kontroll for ristings hastigheten. Overtrykk i fermentoren ble opprettholdt ved 500 g/cm<2>(0.5 bar).

"Fed-batch" dyrkningen ble utført ved kontrollert tilsetting av et karbon tilsettings løsning. Tilsettingsløsningen ble tilsatt ved en start rate på 0.04 mI7min., og økt eksponensielt under de første 42 timer for å opprettholde en vekstrate på 0.11"<1>.

Etter 42 timer, ble temperaturen i fermentoren raskt økt til 39°C, og tilsettings hastigheten ble opprettholdt konstant ved 0.005 mL/g DCW/min. under induksjons-fasen for ytterligere 22-23 timer, hvorved intracellulær ekspresjon av LPD-MAGE-3-His nådde et maksimums nivå.

Alikvoter (15 mL) av næringsmediumet ble tatt ved regulære intervaller under veksl/induksjonsfasene og på slutten av fermenteringen for å følge kinetikken til den mikrobielle veksten og intracellulær produkt ekspresjon og i tillegg, for å tilveiebringe prøver for mikrobiell identifisering/renhetstester.

På slutten av fermenteringen, var den optiske tettheten i kulturen mellom 80 og 120 (korresponderende til en celle konsentrasjon på mellom 48 og 72 g DCW/L), og det totale flytende volumet var omtrent 12 liter. Kulturen ble raskt avkjølt til mellom 6 og 10°C, og cellene fra ECK32 ble separert fra kultur mediumet ved sentrifugering ved 5000 x g i 4°C i 30 minutter. De konsentrerte cellene fra ECK32 ble raskt lagret i plastikkposer og umiddelbart frosset ved -80°C.

2. Ekstraksjon av proteinet:

De frosne konsentrerte cellene fra ECK32 ble tint til 4°C feir de ble resuspendert i celle ødeleggelsesbuffer til en slutt optisk tetthet på 60 (korresponderende til en celle konsentrasjon på omtrent 36 g DCW/L).

Cellene ble deretter ødelagt ved to passasjer gjennom en høytrykks homogenisator

(1000 bar). Den ødelagte celle suspensjonen ble sentrifugert (x 10 000 g ved 4°C i 30 minutter) og pellet fraksjonen ble vasket to ganger med triton XI00 (1% v/v) + EDTA (1 mM), etterfulgt av en vask med fosfat bufret saltvann (PBS) + Tween 20 (0.1% v/v) og til slutt en vask med PBS. Mellom hvert vasketrinn, ble suspensjonen sentrifugert ved x 10 000 g i 30 minutter ved 4°C, supernatanten ble kastet og pellet fraksjonen ble beholdt.

EKSEMPEL 3:

Karakterisering av fusjonsprotein Lipo D - MAGE 3:

1. Rensning:

LPD-MAGE-3-His ble renset fra celle homogenatet ved å bruke en sekvens av trinn som beskrevet under:

a) - Oppløsning av den vaskede pelletfraksjonen fra celleødeleggelsen,

b) - Kjemisk reduksjon av intr a- og inter-protein disulfidbmdinger etterfulgt av blokkering av tiol grupper for å hindre oksidativ rekobling, c) - Mikrofiltrering av reaksjonsblandingen for å fjerne partikler og reduksjon av endotoksiner, d) - Innsamling og primær rensning av LPD-MAGE-3-His ved å undersøke affinitets interaksjonen mellom polyhistidin halen og sink fylt chelaterende sefarose,

e) - Fjerning av kontaminerende proteiner ved anione bytte kromatografi.

Den rensede LPD-MAGE-3-His ble utsatt for et antall av pussingstrinn:

f) - Buffer bytte/urea fjerning ved størrelses eksklusjons kromatografi ved å bruke

Superdex 75,

g) - Inn-prosess filtrering,

h) - Buffer bytte/desalting ved størrelses eksklusjons kromatografi ved å bruke

Sephadex G25.

Hvert av disse trinnene er beskrevet i mer detalj under:

1.1) - Oppløselighet av celle homogenar pellet

Pellet fraksjonen fra slutt vaskings trinnet (som beskrevet over) ble reoppløst over natt i 800 mL av en løsning av guanidin hydroklorid (6M) og natrium fosfat (0.1 M, pH 7.0) ved4°C.

1.2) - Reduksjon og karboksymetylering

Det oppløste materialet (en blek gul, turbid suspensjon) ble skylt med argon for å rense ut gjenværende oksygen, og en stock løsning av 2-merkaptoetanol (14M) ble tilsatt for å tilveiebringe en slutt konsentrasjon på 4.3M (som korresponderer med 0.44 mL av 2-merkaptoetanol per mL løsning).

Den resulterende løsning ble delt og overført til to glassflasker som begge ble varmet opp til 95°C, i et vannbad. Etter 15 minutter ved 95°C, ble flaskene fjernet fra vannbadet og fikk stå å avkjøle seg, hvoretter inneholdene ble samlet sammen i et beger glass dekket med aluminiums folie (5 L), plassert på is, og fast jodoacetamid ble tilsatt med kraftig risting for å tilveiebringe en slutt konsentrasjon på 6M (som korresponderer til 1.11 g av jodoacetamid per mL løsning). Blandingen ble holdt på is i mørket i 1 time for å sikre fullstendig oppløselighet av jodoacetamid, før den ble nøytralisert (ved å opprettholde kraftig omrøring og kontinuerlig pH måling) ved tilsetting av omtrent 1 liter natrium hydroksid (5 M) for å gi en slutt pH på 7.5-7.8.

Den resulterende blandingen ble holdt på is i mørket ytterligere 30 minutter, hvoretter pH'en ble justert til pH 7.5-7.8.

1.3) - Mikrofiltrering

Blandingen ble mikrofiltrert i en Amicon Proflux M12 '^angential"-strømnings enhet utstyrt med en Minikros hel fiber innlegg (ref. No. M22M-600-01N; areal 5,600 cm<2>, 0.2 (im). Permeatet ble bibeholdt for etterfølgende kromatografisk rensning.

1.4) - Metall (Zn<2+>) chelat kromatografi (IMAC)

Metall chelat kromatografi ble utført med chelaterende sefarose FF (Pharmacia Biotechnology Cat. No. 17-0575-01) pakket inn i en BPG 100/500 kolonne (Pharmacia Biotechnology Cat. No. 18-1103-01). Dimensjonene av det pakkede sjiktet var: diameter 10 cm; kryss seksjons areale 79 cm<2>; sjikt høyde 19 cm; pakke volum 1,500 mL. Den empty kolonnen ble rengjort med natrium hydroksid (0.5M), og deretter vasket med renset vann.

Støtte sjiktet (avlevert i 20% v/v etanol) ble vasket med renset vann (8 liter) i en Buchner trakt (under vakuum) og ladet med sink av minst 15 liter av en løsning av ZnCb (0.1M) passere. Overskuddssink ble fjernet ved å vaske støtte materialet med 10 liter av renset vann, inntil pH av det flytende utkommet nådde pH til sink klorid løsningen (pH 5.0). Støtte materialet ble deretter ekvilibrert med 4 liter av en løsning som inneholder guanidin hydroklorid (6M) og natrium fosfat (0.1M, pH 7.0).

Permeatet fra mikrofiltreringen, som inneholdet LPD-MAGE-3 -His, ble blandet med støtte materialet (batch binding), før påsetting og pakking av BPG kolonnen med løsningen som inneholdt guanidin hydroklorid (6M) og natrium fosfat (0.1M, pH 7.0).

De neste trinnene av metall chelat kromatografien ble utført ved en eluent strømnings-rate på 60 ml/min. Kolonnen ble vasket, først med løsning som inneholdt guanidin hydroklorid (6M) og natrium fosfat (0.1M, pH 7.0), deretter med en løsning som inneholdt urea (6M) og natrium fosfat (0.1M, pH 7.0), inntil kolonne eluenten oppnådde null absorbans ved OD280nm (baselinje).

Det semi rene LPD-MAGE-3-His protein fraksjonen ble eluert med 2 kolonne volum av løsningen som inneholdt urea (6M), natrium fosfat (0.1M, pH 7.0) og imidazol (0.5M). Lede evnen av denne fraksjonen var omtrent 16 mS/cm.

1.5) - Anione bytte kromatografi

Før en fortsatte med anione byttekromatografien, ble leder evnen til den semi rene LPD-MAGE-3-His protein fraksjonen redusert til omtrent 4 mS/cm ved fortynning med en løsning som inneholdt urea (6M) og Tris-HCl (20 mM, pH 8.0).

Anione bytte kromatografien ble utført ved å bruke Q-sefarose FF (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-0510-01) pakket i en BPG 200/500 kolonne (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 18-1103-11). Dimensjonene av det pakkede sjiktet var: diameter 10 cm; kryss seksjons areale 314 cm<2>; sjikt høyden 9 cm; pakket volum 2,900 mL.

Kolonnen ble pakket (ved 20 % v/v etanol) og vasket med 9 liter renset vann ved en eluent strørnningsrate på 70 mL/min. Den pakkede kolonnen ble renset med 3 liter av natrium hydroksid (0.5M) vasket med 30 liter renset vann, deretter ekvilibrert med 6 liter av en løsning som inneholder urea (6M) og Tris-HCl (20 mM, pH 8.0). Den fortynnede, semi rensede LPD-MAGE-3-His ble satt på en kolonne og deretter vasket med 9 liter av en løsning som inneholdt urea (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8.0), EDTA (lmM) og Tween (0.1%), inntil absorbansen (280 nm) av eluentet falt til null.

Et ytterligere vasketrinn ble utført med 6 liter av en løsning som inneholdt urea (6M) og Tris-HCl (20 mM, pH 8.0).

Det rensede LPD-MAGE-3-His ble eluert fra kolonnen med en løsning som inneholdt urea (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8.0) ogNaCl (0.25M).

1.6) - Størrelses eksklusjons kromatografi

Fjerning av urea fra renset LPD-MAGE-3-His og buffer byttingen ble begge oppnådd ved størrelses eksklusjons kromatografi. Denne ble utfart ved å bruke Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-1044-01) pakket i en XK 50/100 kolonne (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 18-8753-01). Dimensjonene til det pakkede sjiktet var: diameter 5 cm; kryss seksjons areale 19.6 cm<2>; sjikt høyde 90 cm; pakket volum 1,800 mL.

Kolonnen ble pakket i etanol (20%) og vasket med 5 liter renset vann med en effluent strømningsrate på 20 rnlVmin. Kolonnen ble renset med 2 liter av natrium hydroksid (0.5M), vasket med 5 liter renset vann, deretter ekvilibrert med 5 liter av fosfat-bufferet saltvann som inneholdt Tween 80 (0.1% v/v).

Den rensede LPD-MAGE-3-His fraksjonen (maksimum 500 mL/desaltings kjøring) ble satt på en kolonne med en eluent strømnings rate på 20 mUmin. Det desaltede rensede LPD-MAGE-3 -His ble eluert fra kolonnen med 3 liter PBS som inneholdt Tween 80 (0.1% v/v).

Fraksjonen som inneholdt LPD-MAGE-3-His eluert i tomrommet i kolonnen.

1.7) - "ln-process" filtrering

Mengden LPD-MAGE-3-His fra størrelses eksklusjons kromatografi ble filtrert gjennom en 0.22 um membran i et laminær strømnings hette (hood) (klasse 10.000). Den filtrerte mengden ble frosset ved -80°C og lagret inntil desaltings trinnet.

1.8) - Desaltingskromatografi

Siden osmolaliteten til sluttmengden skulle være mindre enn 400 mOsM, var det påkrevet med et ytterligere bufferbytte trinn for å redusere saltkonsentrasjonen. Dette ble utført ved et desaltingskromatografiske trinn ved å bruke Sefadex G25 (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-0033-02) pakket i en BPG 100/950 kolonne (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 18-1103-03). Dimensjonene av det pakkede sjiktet var: diameter 10 cm; kryss seksjons areale 78.6 cm<2>; sjikt høyden 85 cm; pakket volum 6,500 mL.

Sefadex G25 ble hydrert med 7 liter renset vann og fikk lov å svelle over natt ved 4°C. Gelen ble deretter pakket i kolonnen med rent vann ved en eluent strømnings rate på lOOmi<y>min.

Kolonnen ble renset med 6 liter av natrium hydroksid (0.5M), deretter ekvilibrert med 10 liter av en løsning som inneholdt natrium fosfat (10 mM, pH 6.8), NaCl (20 mM) og Tween 80 (0.1% v/v).

Den rensede LPD-MAGE-3-His fraksjonen (maksimum 1500 mL/desaltings kjøring) ble satt på en kolonne med en eluent strømnings rate på 100 mUmin. Den desaltede rensede LPD-MAGE-3-His fraksjonen ble eluert i mellomroms volumet i kolonnen, og ble steril filtrert gjennom en 0.22 um membran og lagret ved -80°C.

Slutt mengde proteinet ble tint til + 4"C før den ble alikvotert i rør og fryse tørket i en laktose eksipient (3.2%).

2. Analyse på Coomassie-farget SDS-polyakrylamid geler:

LPD-MAGE-3-His renset antigen ble analysert ved SDS-PAGE på en 12.5% akrylamid gel i reduserende betingelser.

Protein mengden var 50 u.g for Coomassie blå farging og 5 p,g for sølvnitrat farging, Klinisk mengde nr. 96K19 og pilot mengde nr. 96J22 ble analysert. Et hovedband korresponderende til molekylvekt på 60kDa ble visualisert. To mindre ytterligere bånd på omtrent 45kDa og 35kDa kunne også sees.

3. Western Blot analyse:

Peptidene som man fikk ved SDS-PAGE analyse av LPD-MAGE-3-His proteinet ble identifisert ved Western blot ved å bruke muse monoklonale antistoffer. Disse antistoffene ble utviklet i huset ved å bruke en renset framstilling av MAGE-3-His protein (dette proteinet inneholder ikke LPD delen av LPD-MAGE-3-His).

To monoklonale antistoff fremstillinger (Mab 22 og Mab 54) har blitt selektert på basis av deres egnethet for Western blot analyse og anvendt i identitetstest for mengde frigivelse. Figur 4 viser bånd mønsterne ervervet for mengde nr. 96K19 og 96J22 etter farging med Mab 32 og 54. Seks hundre (600) ng av proteinet ble oppløst på en 12.5% SDS-PAGE, overført til en nylon membran, reagert med Mab 32 og 54 (60 p,g/ml) og vist med anti-muse antistoffer koblet til peroksydase. 60 kDa og 30 kDa peptider detektert ved SDS-PAGE kan sees ved begge Mab.

EKSEMPEL IV:

1. Vaksinefremstilling ved å bruke LPD-MAGE-3-His protein:

Vaksinen brukt i disse eksperimentene blir produsert fra et rekombinant DNA, som kode for et lipoprotein D l/3-MAGE-3-His, uttrykt i E.coli fra stamme AR58, enten adjuvantert eller ikke. Som en adjuvant, omfatter formuleringen en blanding av 3 de - O-acylert monofosforyl lipid A (3D-MPL) og QS21 i en olje/vann emulsjon. Adjuvant systemet SBAS2 har tidligere blitt beskrevet i WO 95/17210.

3D-MPL: er en immunostimulant avledet fra lipopolysakkarid (LPS) fra den Gram-negative bakterien Salmonelle minnesota. MPL har blitt deacylert og mangler en fosfat gruppe på lipid A delen. Denne kjemiske behandlingen reduserer dramatisk toksisiteten mens den opprettholder de immunostimulerende egenskapene (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry produserer og forsyner MPL til SB-Biologicals. Eksperimentene utført ved Smith Kline Beecham Biologicals har vist at 3D-MPL kombinert med forskjellige bindemidler sterkt øker både den humorale og TH1 type av cellulær immunitet.

QS21: er en naturlig saponin molekyl ekstrahert fra barken på det syd amerikanske treet Quillaja saponaria Molina. En rensnings teknikk utviklet for å separere de individuelle saponinene fra råekstraktene av barken, tillot isolering av det spesielle saponin, QS21, som er en triterpen glykosid som viser sterkere adjuvant aktivitet og lavere toksisitet sammenlignet med foreldre komponenten. QS21 har blitt vist å aktivere MHC klasse 1 begrenset CTL til flere subenhet Ag, så vel som stimulert Ag spesifikk Iymfosyttisk proliferering (Kensil, 1992). Aquila (formally Cambridge Biotech Corporation) produserer og forhandler QS21 til SB-Biologicals.

Eksperimenter utført ved SmithKline Beecham Biologicals har vist en klar synergistisk effekt av kombinasjonene av MPL og QS21 i induksjonen av både humoral og TH1 type cellulære immun responser.

Olje/vann emulsjon er sammensatt av en organisk fase fremstilt av 2 oljer (en tokoferol og squalen), og en vandig base av PBS som inneholder Tween 80 som emulgator. Emulsjonen omfatter 5% squalen 5% tokoferol 0.4% Tween 80 og har en gjennomsnitts- partikkel størrelse på 180 nm og er kjent som SB62 (se WO 95/17210).

Eksperimentene utført ved SnuthKline Beecham Biologicals har vist at tilføyelse av denne O/W emulsjonen til 3D-MPL/QS21 (SBAS2) ytterligere øker immunostimulerende egenskaper til en siste mot forskjellige subenhet antigener.

2. Fremstilling av emulsjon SB62 (2 ganger konsentrat):

Tween 80 er løst i fosfat bufferet saltvann (PBS) for å gi en 2% løsning i PBS. For å tilveiebringe 100 ml to ganger konsentrat emulsjon ble 5 g av DL alfa tokoferol og 5 ml squalen vortex mikset og blandet godt. 90 ml av PBS/Tween løsning ble tilsatt og blandet godt. Den resulterende emulsjonen passeres deretter gjennom en sprøyte og blir til slutt mikrofluidisert ved å bruke en Ml 10S mikrofluidiserings maskin. De resulterende oljedråpene har en størrelse på omtrent 180 nm. 3. Fremstilling av Lipoprotein Dl/3 - MAGE-3-His QS21/3D MPL olje i vann (SBAS2) formulering: Adjuvanten blir formulert som en kombinasjon av MPL og QS21, i en olje/vann emulsjon. Denne fremstillingen ble avlevert i rør på 0.7 ml for å bli blandet med det lyofUiserte antigenet (rørene inneholder fra 30 til 300 fig antigen).

Sammensetningen av adjuvant eluenten til den lyofiliserte vaksinen er som følger:

Sluttvaksinen erverves etter rekonstituering av lyofilisert LPD-MAGE-3-His fremstilling med adjuvanter eller med PBS alene.

Adjuvant kontrollene uten antigen blir fremstilt ved å erstatte proteinet med PBS.

4. Vaksine antigen: Fusjonsprotein Lipoprotein Dl/3 - MAGE-3-His: Lipoprotein D er et lipoprotein eksponert på overflaten av den Gram-negative bakterien Heamophilus influenzae.

Inkluderingen av de første 109 residiene av det prosesserte protein D som fusjon partner er inkorporert for å tilveiebringe vaksine antigenet med T-celle epitoper. Ved siden av LPD delen, inneholder proteinet to ubeslektede aminosyrer (Met og Asp), aminosyre residiene 2 til 314 fra Mage-3, to Gly residier som fungerer som hengselsregion for å eksponere de etterfølgende syv His residiene.

EKSEMPEL V:

1. Immunogenitet hos LPD-MAGE-3-His i mns og aper:

For å teste antigeniteten og immunogeniteten til humant MAGE-3 protein, ble kandidat vaksinen injisert i to forskjellige muse stammer (C57BL/6 og Balb/C), og som varierer i deres genetiske bakgrunn og MHC alleler. For begge musestammene, ble potensielle MHC klasse 1 og MHC klasse 2 peptid motiver teoretisk forutbestemt for MAGE delen av LPD-MAGE-3-His fusjonsproteinet.

a) - Immumserings protokoll:

5 mus fra hver stamme ble injisert to ganger 2 ukers intervaller i fotpoten med 5 ug

LPD-MAGE-3-His, formulert eller ikke i SBAS2 ved 1/10 av konsentrasjonen brukt i human sammenheng.

b) - Prohfererings analyse:

Lymfosytter ble fremstilt ved å knuse milten eller de popliteale lymfe knutene fra mus, 2 uker etter siste injeksjon. 2 x IO<5>celler ble plassert i triplett i 96 brønners plater og cellene ble restimulert in vitro i 72 timer med forskjellige konsentrasjoner (1-0.1 ug/ml) av His-Mage 3 som sådan eller overtrukket på latex mikro-kuler.

En økt MAGE-3 spesifikk lymfeproHferativ aktivitet ble observert hos både milt cellene (se figurene 5 og 7) og lymfe knute cellene (se figurene 6 og 8) fra enten C57BL/6 eller Balb/C mul injisert med LPD-MAGE-3-His protein, sammenlignet med den lymfeproliferative responsen hos mus som har mottatt SBAS-2 formuleringen alene eller PBS.

Dessuten, ble en signifikant høyere proliferativ respons ervervet med lymfosytter fra mus immunisert med LPD-MAGE-3-His i adj uvanten SBAS2 (se figurene 6 og 8).

c) - Konklusjon:

LPD-MAGE-3-His er irnmunogen i mus, og immunogeniteten kan økes ved anvendelse

av SBAS2 adjuvant formuleringen.

2. Antistoff respons:

a) - Immuniserings protokoll:

Balb/C eller C57BL/6 mus ble immunisert med 2 intra fotpote injeksjoner med 2 ukers

intervaller med enten PBS, eller SBAS2, eller 5 \ iG av LPD-MAGE-3-His, eller 5 uG av LPD-MAGE-3 -His + SBAS2.

Tre og fem dyr ble brukt i kontroll gruppene og i test gruppene respektiv.

b) -IndirekteELISA:

To uker etter den andre injeksjonen, ble individuelt sera tatt og utsatt for indirekte

ELISA.

2 u.G/ml av renset His MAGE 3 ble brukt som overtrukne antigen. Etter metting i 1 time ved 37°C, i PBS + 1% nyfødt kalve serum, ble sera serie fortynnet (ved å starte på 1/1000) i mettnings bufferen og inkubert over natt ved 4°C, eller 90 minutter ved 37°C. Etter vasking med PBS/Tween 20,01%, ble biotinylert geite anti-mus total IgG (1/1000) eller geite anti-mus IgGl, IgG2a, IgG2b antisera (1/5000) brukt som det andre antistoffet. Etter 90 minutters inkubering ved 37°C. Streptavidin koblet til peroksidase ble tilsatt og TMB (tetra-metyl-benzidin peroksid) ble brukt som substrat. Etter 10 minutter ble reaksjonen blokkert med tilsetting av H2SO40.5M, og O.D. ble bestemt.

c) - Resultater:

Figur 9 sammenligner mellom de forskjellige gruppene av mus (N=5/gruppe) den

relative gjennomsnittsmidtpunkt titer til sera, som består av gjennomsnitts fortynning som er nødvendig for å nå midtpunktet på kurvene.

Disse resultatene viser at i begge musestammene som ble testet, ble en svak Ab respons målt etter 2 injeksjoner av LPD-MAGE-3-His alene, men at en høyere anti-MAGE 3 Ab konsentrasjoner blir dannet når LPD-MAGE-3-His blir injisert med tilstedeværelse av SBAS2. Derfor, er bare 2 injeksjoner av LPD-MAGE-3-His + SBAS2, med 2 ukers intervaller tilstrekkelig for å danne høy Ab respons observert.

Den høyere Ab responsen observert i Balb/c mus sammenlignet med responsen som ble ervervet i C57BL/6 mus kan forklares ved forskjeller i haplotyper eller i bagrunn mellom disse to stammene, selv om Ab titere som ble oppnådd i C57BL/6 mus også er høyere etter injeksjoner med LPD-MAGE-3-His + SBAS2 enn etter injeksjoner med LPD-MAGE-3-His alene.

Ig subklasse spesifikk anti-MAGE-3 responser etter vaksineringer i forskjellige grupper av mus kan sees på figurene 10 og 11, som gir en sammenligning av gjennomsnitts midtpunkt fortynning av sera.

Verken IgA, eller IgM ble detektert i noen av serumprøvene selv fra musene som ble vaksinert med LPD-MAGE-3-His i adjuvant SBAS2.

I motsatt fall, ble totalt IgG nivå noe høyere i sera fra mus vaksinert med LPD-MAGE-3-His alene, og signifikant økt i sera hos dyr injisert med LPD-MAGE-3-His i SBAS2.

Analysen av forskjellige IgG subklasse konsentrasjoner viste at en blandet Ab respons ble indusert i musene, siden nivåene av alle IgG subklasser som ble testet (IgGl, IgG2a, IgG2b) var høyere i mus vaksinert med adjuvantert Ag enn i mus injisert med Ag eller adjuvant alene.

Egenskapen til denne blandede Ab responsen etter vaksinering med LipoD-MAGE 3 ved tilstedeværelse av SBAS2 ser imidlertid ut til å være avhengig av musestammen, siden IgGl og IgG2b fortrinnsvis ble funnet i sera hos Balb/C og C57BL/6 mus respektiv.

3. Immunogenitet hos Lipoprotein D 1/3 MAGE-3 - His + SBAS2 adjuvant i Rhesus aper

Tre grupper av fem Rhesus (Macaca Mulatta) dyr ble selektert. RTS,S og gpl20 ble brukt som positiv kontroll.

Grupper:

Gruppe 1 høyre ben: RTS,S/SBAS2

venstre ben: GP120/SBAS2

Gruppe 2 høyre ben: RTS,S/SB26T

venstre ben: GP120/SB26T

Gruppe 3 høyre ben: LipoDl/3 Mage 3 His/SBAS2

Dyrene mottok vaksine på dag 0 og fikk en ny på dag 28, og 84 og det ble tatt blodprøver for å bestemme deres antistoff respons med henhold til både MAGE 3 og protein D komponenten. Vaksinen ble administrert intramuskulært som en bolus injeksjon (0.5ml) i den bakre delen av høyre ben.

Små blodprøver ble tatt hver 14 dag. Uheparinisert blodprøver på 3 ml ble samlet fra den femorale vene, og fikk lov til å koagulere for minst i 1 time og sentrifugert ved romtemperatur i 10 minutter ved 2500 rpm.

Serumet ble fjernet, frosse ved -20°C og sent for bestemmelse for antistoff nivåer ved spesifikk Elisa. 96 brønners mikroplater (maxisorb Nunc) ble enten overtrukket med 5 ug av His Mage 3 eller protein D over natt ved 4°C. Etter 1 times mettning ved 37°C med PBS NCS 1%, ble en serie fortynning av kanin sera tilsatt i 1,5 time ved 37°C (som startet ved 1/10), etter 3 vaskinger i PBS Tween, anti kanin biotynilert serum (Amersham ref RPN 1004 lot 88) ble tilsatt (1/5000). Platene ble vasket og peroksidase koblet strepta\ddin (1/5000) ble tilsatt i 30 minutter ved 37°C. Etter vasking, ble 50 ul TMB (BioRad) tilsatt i 7 minutter og reaksjonen ble stoppet med H2S04 0.2M, OD ble målt ved 450 nm. Midtpunkts fortynninger ble beregnet ved SoftmaxPro.

Antistoff respons:

Små blodprøver ble tatt hver 14 dag for å følge kinetikken til antistoff responsen til

Mage 3 ved Elisa. Resultatene indikerer at etter en injeksjon med LPD1/3 Mage 3 His + SBAS2, var Mage 3 spesifikk total lg titer lav, en klar "boost" kunne sees i 3 utav 5 dyr etter en andre og en tredje injeksjon av LipoDl/3 Mage 3 + adjuvant i de samme apene. De som responderte dårlig forble negative selv etter 3 injeksjoner. 28 dager post TJ eller post U-L hadde antistoff titerene returnert til basal nivåene. Subklassen av disse

antistoffene ble bestemt som fortrinnsvis IgG og ikke IgM. Bytte til IgG indikerer at en

T hjelper respons har blitt trigget. Protein D spesifikk antirespons, skjønt den var svakere, var fullstendig parallell til Mage 3 antistofrfespons.

EKSEMPEL VI:

1. LPD-MAGE 1 His

På en analog måte, ble - LPD - MAGE 1-His fremstilt. Aminosyren og DNA sekvensene er avbildet i SEQUENCE TD Nos. 3 og 4. Det resulterende proteinet ble renset, på en analog måte til LPD-MAGE-3-His protein. I korthet, celle kulturen ble homogenisert og behandlet med 4M guanidin HC1 og 0.5 M beta merkaptoetanol ved tilstedeværelse av 0.5% Empigen detergent. Produktet ble filtrert og permeatet behandlet med 0.6 M jodacetamid. Karboksyamiderte fraksjoner ble utsatt for IMAC (sink chelat-sefarose FF) kromatografi. Kolonnen ble først ekvilibrert og vasket med en løsning som inneholdt 4M guanidin. HC1 og natrium fosfat (20 mM, pH 7.5) og 0.5% Empigen, deretter ble kolonnen vasket med en tøsning som inneholdt 4M urea i natruim fosfat (20 mM, pH 7.5) 0.5% Empigen buffer. Proteinet ble eluert i samme buffer, men med økende konsentrasjon av imidazol (20 mM, 400 mM og 500 mM).

Eluatet ble fortynnet med 4M urea. Q-sefarose kolonnen ble ekvilibrert og vakset med 4M urea i 20 mM fosfat buffer (pH 7.5) ved tilstedeværelse av 0.5% Empigen. Den andre vasken ble utført i samme buffer, men uten detergentet. Proteinet eluerte i samme buffer men med økende imidazol (150 mM, 400 mM, IM). Eluatet ble ultra filtrert.

EKSEMPEL VII:

Konstruksjon av ekspresjons plasmid pRIT14426 og transformasjon av vert stammen AR58 for å produsere NS1 - MAGE -3 His:

Protein design:

Design av fusjonsprotein NS1, -MAGE-3-His som skulle uttrykket i E.coli er beskrevet i figur 12.

Den primære funksjonen til det resulterende protein har sekvensen som fremsatt i TD No. 5.

Den kodende sekvensen (ID No. 6) korresponderende til det ovenfor nevnte protein designet ble plassert under kontroll av XpL promotor i et E.coli ekspresjons plasmid.

Kloningsstrategien for dannelse av NSi-MAGE-3-His fusjonsprotein: Utgangsmaterialet var et cDNA plasmid mottatt fra Dr Thierry Boon fra Ludwig Instituttet, som inneholdt den kodene sekvensen for MAGE-3 genet og vektor PMG81, som inneholdt en 81 aminosyre av NSi(ikke strukturellt protein) kodene region fra influensa.

Kloningsstrategien som er beskrevet i figur 13 inkluderte følgende trinn:

a) PCR amplifisering av sekvensene tilstede i plasmid cDNA MAGE-3 ved å bruke oligonukleotid sense: 5' gc gcc atg gat etg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cet, og

oligonukleotid antisense: 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tet caa.

Amplifiseringen førte til følgende modifiseringer i den N terminale ende: endring av de første fem kodonene til E.coli kodon anvendelse, erstatning av Pro kodon av en Asp kodon i posisjon 1, installering av et Ncol sete i 5' ende og til slutt tilsetting av 2 Gly kodoner og 7 His kodon etterfulgt av et Xbal sete i den C-terminale enden. b) Kloning inn i TA klonings vektor fra invitrogen av det ovenfor nevte amplifiserte fragmentet og fremstilling av intermediat vektoren pRIT14647 c) Utkutting av Ncol Xbal fragmentet fra plasmid pRTT14647 og kloning inn i vektor pRITPMG81

d) Transformasjon av vertstammen AR58

e) Seleksjon og karakterisering av E.coli stamme transformanter som inneholder

plasmid pRIT14426 (se figur 14) som uttrykker NSI-MAGE-3-His fusjonsproteiner.

Karakterisering av det rekombinante NSi-MAGE-3-His (pRIT14426):

Bakterier ble dyrket på LB medium supplert med 50 jig/ml kanamysin ved 30°C. Når kulturen har nådd OD=0.3 (ved 620 nm), ble varme induksjonen oppnådd ved å øke temperaturen til 42 °C.

Etter 4 timers induksjon, ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert (ved disintegrasjon) ved tre ganger pressing i den franske pressen. Etter sentrifUgering (60

minutter ved 100,000 g), ble pellet supernatanten og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert på Coomassie B1 fargede geler hvor fusjonsproteinet representerte omtrent 1% av totale E.coli proteiner. Det rekombinante proteinet så ut til å være et enkelt bånd med en tydelig molekylvekt på 44,9 K. Fusjonsproteinet ble

identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke anti-NS 1 monoklonal.

EKSEMPEL VIII:

Rensning av NS1-MAGE 3-His (E.coli) for kanin/mus immunisering.

Rensningsskj erna:

Følgende rensningsskj erna ble brukt for å rense antigenet:

a. Lysis

Bakterie celler (23g) ble lysert i 203 ml av en 50 mM P04pH7 buffer ved Rannie (homogenisator) og lysatet ble sentrifugert i en JA 20 rotor ved 15,000 rpm i 30 minutter.

Supernatanten ble kastet.

b. Antigenoppløselighet

1/3 av pelleten ble reoppløst over natt ved 4°C i 34 ml av 100 mM PO4- 6M GuHCl pH7. Etter sentrifugering i en JA 20 rotor ved 15,000 rpm i 30 minutter, ble pelleten kastet og supernatanten ble ytterligere renset ved IMAC.

c. Affinitets kromatografi: Ni<2>+ -NTA agarose (Qiagen)

Kolonnevolum: 15 ml (16 mm x 7.5 cm)

Pakkebuffer: O.IMPO4-6MGuHClpH7

Prøvebuffer: idem

Vaskebuffer: O.IMPO4-6M GuHClpH7

0.1 MPO4-6M urea pH7

Eluering: imidazol gradient (0 -> 250 mM) i 0.1 M PO4buffer pH7 supplert med 6 M urea.

Strømningsrate: 2 ml/min

a. Konsentrasjon:

Antigen positive fraksjoner fra IMAC eluatet (160 ml) ble samlet sammen og konsentrert til 5 ml i en Amicon omrørt celle på en Filtren membran (type Omega "cut-off' 10,000). Renheten på dette stadium er omtrent 70% beregnet ved SDS-PAGE.

b. Preparativ elektroforese (Prep Cell Biorad)

2.4 ml av den konsentrerte prøven ble kokt i 0.8 ml reduserende prøve buffer og satt på

en 10% akrylamid gel. Antigenet ble eluert i en Tris-glysin buffer pH 8.3 supplert med 4% SDS og Nsi-MAGE 3 His positive fraksjoner ble samlet sammen.

a. TCA presiptering:

Antigenet ble TCA presiptert og etter sentrifugering i en JA 20 rotor ved 15,000 rpm i 20 minutter, ble supernatanten kastet. Pelleten ble reoppløst i PBS buffer pH 7.4. Proteinet er løselig i PBS etter frysing/tining og viser ingen degradering når den blir lagret i 3 timer ved 37°C og har en antatt molekylvekt på omtrent 50,000 Daltons bestemt ved SDS (12.5% PAGE).

EKSEMPEL IX:

Fremstilling av E.coli stammen som uttrykker et fusjonsprotein CLYTA-MAGE-1-His tail 1. Konstruksjon av ekspresjons plasmid pRIT14613 og transformasjon av vert stammen AR58:

Proteindesign:

Fremstilling av fusjonsproteinet Clyta-Mage-l-His som skal uttrykkes i E.coli er beskrevet i figur 15.

Den primære strukturen til det resulterende protein har sekvensen fremsatt i sekvens ID No. 7.

Den kodende sekvensen (se sekvens ID No. 8) korresponderende til den ovenfor nevnte proteinfremstilling ble plassert under kontroll av X pL promotor i et E.coli ekspresjons-plasmid.

Kloning:

Utgangsmaterialet var vektoren PCUZ1 som inneholder 117 C-tenninale kodon av LytA kodene region fra Streptococcus pneumoniae og vektor pRIT14518, hvori vi på forhånd kådde subklonet MAGE-1 gene cDNA fra et plasmid som vi har mottatt fra Dr. Thierry Boon fra Ludwig instituttet.

Kloningsstrategien for ekspresjon av CLYTA-Mage-l-His proteinet (se beskrivelsen i figur 16) inkluderer følgende trinn:

2. Fremstilling av CLYTA-Mage-l-His kodene sekvens modul:

a) Første trinnet var en PCR amplifisering, bestemt for å flankere CLYTA sekvensene med Ndel-Aflin restriksjons seter. PCR amplifiseringen ble gjort ved å bruke

plasmid PCUZ1 som templat og som primere ble det brukt oligonukleotid sense: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac, og oligonukleotid antisense: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Dette fører til amplifisering av en 378 nukleotiders lang CLYTA sekvens.

b) Det andre trinnet var kobling av CLYTA sekvenser til MAGE-l-His sekvenser, for å danne den kodene sekvensen for fusjonsproteinet. Dette trinnet inkluderer

ekskursjon av Ndel-Afim Clyta fragment og insersjon inn i vektor pRTT14518 tidligere åpnet opp med Ndel og Ncol (Ncol og AfllJJ kompatibel) restriksjons-enzymer og gav opphav til plasmid pRIT14613.

c) Transformering av vert stammen AR58

d) Seleksjon og karakterisering av E.coli transformanten (KAN resistent) som

inneholder plasmid pRIT14613. (Se figur 16)

1. Karakterisering av det rekombinante proteinet CLYTA-MAGE-l-His (pRIT14613): Bakterien ble dyrket på LB medium supplert med 50fig/ml kanamysin ved 30°C. Når kulturen hadde nådd OD=0.3 (ved 620 nm), ble en varme induksjon oppnådd ved å heve temperaturen til 38°C.

Etter 4 timers induksjon, ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert (ved disintegrering) ved et skudd. Etter sentrifugering, ble pellet supernatant og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert i Coomassie Bl fargede geler, hvor fusjonsproteinet representerte omtrent 1% av de totale E.coli proteinene. Det rekombinante proteinet fremsto som et enkelt bånd med en antatt molekylvekt på omtrent 49 kD. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke anti-Mage-1 polyklonale antistoff.

Rekonstituering av ekspresjonsenheten sammensatt av den lange X pL promotor (nyttig for Nalidiks syre induksjon) og CLYTA-MAGE-1 kodene sekvens pRTT14614): Et EcoRI-NCOi restriksjons fragment som inneholder den lange PL promotoren og en del av CLYTA sekvensen ble fremstilt fra plasmid pRIT DVA6 og satt inn mellom EcoRI-NCOt setene til plasmid pRIT14613.

Det rekombinante plasmidet pRIT14614 ble ervervet.

Det rekombinante plasmidet pRTT14614 (se figur 17) som koder for fusjonsproteinet CLYTA-Mage-l-His ble brukt for å transformere E.coli AR120. En Kan resistent kandidat stamme ble selektert ogkarakterisert.

Karakterisering av rekombinant protein:

Bakteriene ble dyrket på LB medium supplert med 50 mg/ml kanamysin ved 30°C. Når kulturen hadde nådd OD=400 (ved 620nm) Nalidiksin syre tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 60 mg/ml.

Etter 4 timers induksjon, ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert ved desintegrering (disintegrerings CLS "et skudd" type). Etter sentrifugering, ble pellet supernatant og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert i Coomassie blå fargede geler, hvor fusjonsproteinet representerte omtrent 1% av de totale E.coli proteinene. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke kanin anti-Mage-1 polyklonale antistoffer. Rekombinant protein fremsto som et enkelt bånd med antatt molekylvekt på omtrent 49 kD.

EKSEMPEL X:

CLYTA - MAGE-3-His

A: Tumor avvisnings rekombinant antigen: et fusjonsprotein CLYTA -Mage-3-His hvor C-lyt A fusjons partner førte til ekspresjon av et løselig protein, virket som et affinitets merke og tilveiebringer en nyttig T-hjelper.

Fremstilling av E.coli stammen som uttrykker et fusjonsprotein CLYTA-Mage-3-His hale.

Konstruksjon av ekspresjons plasmid pRTT14646 og transformasjon av vert stammen AR 120:

Proteitidesign:

Design av fusjonsproteiner Clyta-Mage-3-His for at dette skal uttrykkes i E.coli er beskrevet i figur 18.

Den primære strukturen til det resulterende protein har en sekvens beskrevet i sekvens JD No. 9: og den kodee sekvensen i sekvens ID No. 10

Den kodee sekvensen korresponderer til den ovenfor nevnte protein design ble plassert under kontroll av X pL promotor i et E.coli ekspresjons plasmid.

Kloning:

Utgangsmaterialet var vektoren PCUZ1 som inneholder 117 C-terminale kodon fra LytA kodene region fra Streptococcus pneumoniae, beskrevet i Gene 43, (1986) p. 265-272 og vektoren pRIT14426, som vi tidligere har subklonet MAGE-3 gene cDNA fra et plasmid mottatt fra Dr Thierry Boon fra Ludwig Institute.

Kloningsstrategien for ekspresjon av CLYTA-MAGE-3-His proteinet (se beskrivelsen i figur 19) inkluderte følgende trinn:

1- Fremstilling av CLYTA-MAGE-3-His kodene sekvens modul:

1.1 Første trinnet var en PCR amplifisering, bestemt for å flankere CLYTA sekvensene med Afin og Afini restriksjons sete. PCR amphfiseringen ble gjort ved å bruke plasmid PCUZ1 som templat og som primere oligonukleotid sense: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac, og oligonukleotid antisense: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att etg gcc tgt etg cca gtg. Det førte til amplifiseringen av et 427 nukleotider lang CLYTA sekvens. Det ovenfor nevnte amplifiserte fragmentet ble klonet inn i TA klonings vektor fra Invitrogen for å gi intermediat vektoren pRIT14661 1.2 Det andre trinnet var kobling av CLYTA sekvensene til MAGE-3-His sekvensene, for å danne den kodene sekvensen til fusjonsproteinet. Dette trinnet inkluderte utkutting av en Afl II-Afl-in Clyta fragment og insertering inn i vektoren pRJT14426 som på forhånd var åpnet av Afl JJ og Ncol (Ncol og Afin kompatible) restriksjons enzymer og gav opphav til plasmid pRJT14662. 2. - Rekonstituering av ekspresjonsenhet sammensatt a<y>den lange X pL promotor (nyttig for Nalidiksin syre induksjon) og CLYTA-Mage-3 kodende sekvens: Et BglJJ - Xbal restriksjons fragment som inneholdt den korte pL promotoren og CLYTA-Mage-3-His kodene sekvenser ble fremstilt fra plasmid pRJT14662, og satt inn mellom Bgin - Xbal setene til plasmid TCM67 (et pBR322 derivat som inneholder resistensen for ampicillin og den lange X pL promoter, beskrevet i den internasjonale søknaden PCT/EP92/01827). Plasmid pRIT14607 ble ervervet.

Det rekombinante plasmidet pRIT14607 som koder for fusjonsproteinet Cfyta- Mage- 3 His ble brukt til å transformere E.coli AR 120 (Mott et al. 1985, Proe. Nati. Acad. Sei, 82:88). En ampicOlin resistent kandidat stamme ble selektert ogkarakterisert.

3. Fremstilling av plasmid pRIT 14646:

Til slutt ble et plasmid likt pRIT 14607 men som hadde kanamysin seleksjon konstruert

(pRTT 14646)

Karakterisering av det rekombinante proteinet:

Bakterier ble dyrket på LB medium supplert med 50 mg/ml kanamysin ved 30°C. Når kulturen hadde nådd OD= 400 (ved 600nm) ble Nalidiksin syre tilsatt til en slutt konsentrasjon på 60?g/ml.

Etter 4 timers induksjon, ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert ved desintegrering (desintegrasjons CLS type "et skudd"). Etter sentrifugering, ble pellet supernatant og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert i Coomassie Blå fargede geler, hvor fusjonsproteiner representerte omtrent 1% av de totale E.coli proteinene. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke kanin anti-Mage-3 polyklonale antistoffer. Det rekombinante proteinet fremsto som et enkelt bånd med en antatt molekylvekt på omtrent 58 kD.

EKSEMPEL XI:

Rensing av det rekombinante proteinet CLYTA-MAGE-3 His:

Den rekombinante bakterien ARI 20 (pRIT 14646) ble dyrket i en 20 liters fermentor under "fed-batch" betingelser ved 30°C. Ekspresjonen av det rekombinante proteinet ble indusert ved å tilsette Nalidiksin syre til en slutt konsentrasjon på 60?g/ml. Cellene ble høstet på slutten av fermenteringen og lysert ved 60 OD/600 ved to passasje gjennom en fransk presse ødelegger (20 000 psi). Lyserte celler ble pelletert i 20 minutter ved 15 000 g ved 4 °C. Supernatanten som inneholdt det rekombinante proteinet ble satt på en ione bytte DEAE sefarose CL6B resin (Pharmacia) som på forhånd var ekvilibrert i 0.3M NaCl, 20 mM Tris HC1 pH 7.6 buffer A. Etter at kolonnen ble vasket med buffer A, ble fusjonsproteinet eluert ved 2% cholin i (buffer A). Positive antigen fraksjoner som kom frem ved Western Blot analyse ved å bruke et anti-Mage-3 antistoff, ble samlet sammen. DEAE eluert antigen ble brakt til 0.5% Empigen BB (et zwitterionisk detergent) og til 0.5 M NaCl før det ble satt på en ione metall affinitets kromatografi kolonne preekvilibrert i 0.5% Empigen BB, 0.5 M NaCl, 50 mM fosfat buffer pH 7.6 (bufferB).

IMAC kolonnen ble vasket med buffer B inntil 280 nm absorbans nådde base linjen. En andre vask i buffer B uten Empigen BB (buffer C) for å ehminere detergenten ble utført før antigen eluering med en imidazol gradient 0-250 mM imidazol i buffer C.

0.090-0.250 M imidazol fraksjoner ble samlet sammen, konsentrert på en 10 kDa filtron omega membran før dialyse versus PBS buffer.

Konklusjon:

Vi har vist at det fuserte proteinet LPD-MAGE-3-His er immunogent i mus, og at immunogeniteten (proliferativ respons og antistoff respons) kan ytterligere økes ved anvendelse av adjuvant beskrevet over. Rensningen kan forsterkes ved derivatisering av tioler som danner disulfid bindingene.

Vi har også vist at en bedre antistoffrespons ble trigget ved vaksinering med LPD-MAGE-3-His ved tilstedeværelse av adjuvanter. Den dominerende isotypen som ble funnet i serumet til C57BL/6 var IgG2b dette indikerer at en TH1 type immun respons ble reist.

1 den humane kliniske utførelsen, ble en pasient som ble behandlet med LPD-MAGE-3-His i en uadjuvantert formulering kvitt sitt melanom.

REFERANSER:

- Amchini A., Fossati G., Parmiani G. Immunol. Today, 8: 385 (1987).

- De Plaen E., Arden K., Traversari C, et al. Immunogenetics, 40: 360 (1994).

- Gaugler B., Van den Eynde B., van der Bruggen P., et al. J. Exp. Med.,

179: 921 (1994).

- Herman J., van der Bruggen P., Immanuel F. t et al. Immunogenetics,

43: 377 (1996).

- Inoue H., MoriM., Li J., et al. Int. J. Cancer, 63 : 523 (1995).

- Kensil C.R., Soltysik S., Patel U., et al. in: Channock R.M. , Ginsburg H.S., Brown F., et al., (eds.), Vaccines 92,

(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),

36-40: (1992).

- Knuth A., Danowski B., Oettgen H.F., et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA,

81: 3511 (1984).

- Patard J.J., Brasseur F., Gil-Diez S., et al. Int. J. Cancer, 64: 60 (1995).

- Ribi E., et al. in: Levine L., Bonventre P.F., Morello J., et al. (eds)., American Society for Microbiology, Washington DC, Microbiology 1986, 9-13; (1986). - Van den Eynde B., Hainaut P., Hérin M. et al. Int. J. Cancer, 44: 634 (1989). - Van der Bruggen P., Traversari C, Chomez P., et al. Science, 254: 1643 (1991).

- Van der Bruggen P., Bastin J., Gajewski T., et al. Eur. J. Immunol.,

24: 3038 (1994).

- Van Pel A., van der Bruggen P., Coulie P.G. t et al., Immunol. Rev.,

145: 229 (1995).

- Weynants P., Lethé B., Brasseur F., et al. Int. J. Cancer, 56: 826 (1994).

- Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, Itoh K, Ninon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997, Apr, 20 (2): 95-101.

- Fuijie T et al, Ann Oncoi 1997 Apr, 8 (4): 369-72.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for rensing eller fremstilling av et MAGE-protein, omfattende det å redusere disulfidbindingene i proteinet, å blokkere den resulterende frie tiolgruppe med en blokkeringsgruppe og ytterligere omfattende en eller flere kromatografiske trinn, der proteinet løseliggjøres ved bruk av et sterkt kaotropisk middel eller en zwitterion-detergent

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der det kaotropiske middel er urea eller guanidium-hydroklorid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der zwitterion-detergenten er Empigen BB - n-dodecyl-N,N-dimetylglycin.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der blokkeringsmidlet er et alkyleringsmiddel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, der blokkeringsmidlet er alfa halosyre og/eller alfa haloamid.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, der blokkeringsmidlet er en eller flere av de følgende: jodeddiksyre; jodacetamid; N-etylmaleimid; kloracetylfosfat; O-metylisourea og akrylonitril.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, der proteinet omfatter et affhntetsmerke.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, der affinitetsmerket er CLytA eller en polyhistidinhale.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, der proteinet som omfatter et affinitetsmerke utsettes for affinitetskromatografi etter blokkeringstrinnet.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, der affinitetskromatografien er immobilisert metallione-afimitetskromatografi (IMAC).

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, der metallionet er utvalgt fra følgende: sink, nikkel, jern, magnesium eller kobber.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 11, der affinitetskromatografien utføres ved bruk av buffer inneholdende zwitterion-detergenten Empigen BB.

13. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, der proteinet er et fusjonsprotein omfattende et MAGE-antigen og en fusjonspartner.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, der fusjonspartneren er protein D eller et fragment av dette fra Haemophilus influenzae B omfattende den første tredjedel av protein D, NS1-protein fra influensa eller et fragment av dette omfattende de N-terminale 81 aminosyrene av NS1, eller Lyt A fra Streptococcus pneumoniae eller et fragment av dette omfattende residiene 188-305 av LytA.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, der fusjonspartneren er den Upiderte form av protein D.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 15, der proteinet omfatter LytA eller et fragment av dette omfattende residiene 188-305, og der proteinet er renset ved affinitetskromatografi til cholin eller cholinanaloger slik som DEAE.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16, der MAGE-antigenet er utvalgt fra gruppen MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE Al 1, MAGE A12, MAGE Bl, MAGE B2, MAGE B3 og MAGE B4, MAGE Cl, MAGE C2.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine,karakterisertv e d at den omfatter trinnene for fremstilling eller rensing av et MAGE-protein ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17 og formulering av det resulterende protein som en vaksine.