ES2225824T3 - Nonapeptido aislado derivado del gen mage-3 y presentado por hla-a1, y sus usos. - Google Patents

Nonapeptido aislado derivado del gen mage-3 y presentado por hla-a1, y sus usos.

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ES2225824T3 ES93920419T ES93920419T ES2225824T3 ES 2225824 T3 ES2225824 T3 ES 2225824T3 ES 93920419 T ES93920419 T ES 93920419T ES 93920419 T ES93920419 T ES 93920419T ES 2225824 T3 ES2225824 T3 ES 2225824T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN "NONAPEPTIDE" DERIVADO DEL PRECURSOR ANTIGENO DE RECHAZO DE TUMORES, CODIFICADO COMO GEN MAGE-3. ESTE INAPEPTIDO SE PRESENTA POR MOLECULAS HLA-A1 DE HLA. LOS COMPLEJOS RESULTANTES SE IDENTIFICAN COMO CELULAS T CITOLITICAS. TAL RECONOCIMIENTO PUEDE USARSE EN DIAGNOSTICOS, O TERAPEUTICAMENTE.

Description

Nonapéptido aislado derivado del gen MAGE-3 y presentado por HLA-A1, y sus usos.
Esta solicitud es en parte una continuación de las solicitudes copendientes con Número de Serie 07/938.344, presentada el 31 de agosto de 1992, y con Número de Serie 08/037.230, presentada el 26 de marzo de 1993.
Ámbito de la invención
La invención se refiere a la inmunogenética y la química de péptidos. Más particularmente, se refiere a nonapéptidos útiles de diversas maneras, incluyendo el ser un inmunógeno y ser una diana para la molécula HLA-A1. Más particularmente, se refiere al llamado "antígeno de rechazo tumoral", derivado del precursor del antígeno de rechazo tumoral, codificado por el gen MAGE-3 y presentado por los antígenos de leucocitos humanos HLA-A1.
Antecedentes y técnica anterior
El estudio del reconocimiento o la falta de reconocimiento de las células cancerosas por organismos hospedantes ha evolucionado en muchas direcciones diferentes. El entendimiento en este campo supone algún grado de entendimiento tanto de la inmunología básica y la oncología.
La investigación inicial sobre tumores de ratón, reveló que éstos exhibían moléculas que provocaban el rechazo de las células tumorales, cuando se inyectaban en animales singénicos. Estas moléculas son "reconocidas" por células T en el animal receptor, y producen una respuesta de células T citolíticas, con lisis de las células trasplantadas. Esta evidencia se obtuvo primero con tumores inducidos in vitro por carcinógenos químicos, tales como el metilclorolantreno. Se observó que los antígenos expresados por los tumores, y que provocaban la respuesta de células T, eran diferentes para cada tumor. Véase Prehn, et al., J. Natl. Canc. Inst. 18: 769-778 (1957); Klein et al., Cancer Res. 20: 1561-1572 (1960); Gross, Cancer Res. 3: 326-333 (1943), Basombrio, Cancer Res. 30: 2458-2462 (1970), para enseñanzas generales sobre la inducción de tumores con carcinógenos químicos y sobre diferencias en antígenos de superficie celular. Esta clase de antígenos se ha conocido como "antígenos de trasplante específicos de tumor", o "TSTA". Después de la observación de la presentación de tales antígenos cuando se inducían con carcinógenos químicos, se obtuvieron resultados similares cuando se inducían tumores in vitro a través de la radiación ultravioleta. Véase Kripke, J. Natl. Canc. Inst. 53: 333-1336 (1974).
Mientras que las respuestas inmunes mediadas por células T se observaban para los tipos de tumor descritos anteriormente, se creía que los tumores espontáneos no eran inmungénicos. Así, se creía que éstos no presentaban antígenos que provocaran una respuesta al tumor en el sujeto portador del tumor. Véase Hewitt, et al., Brit. J. Cancer 33: 241-259 (1976).
La familia de líneas celulares presentadoras de antígenos tumorales son variantes inmunogénicas obtenidas mediante mutagénesis de células o líneas celulares de tumor de ratón, como describen Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980). Para elaborarlos, se obtienen antígenos tum^{-} mediante células tumorales mutantes que no generan una respuesta inmune en ratones singénicos, y que formarán tumores (es decir, células "tum^{+}"). Cuando estas células tum^{+} se someten a mutación, son rechazadas por ratones singénicos, y fracasan en producir tumores (así "tum^{-}"). Véase Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272 (1977). Muchos tipos de tumor han demostrado exhibir este fenómeno. Véase, por ejemplo, Frost et al., Cancer Res. 43: 125 (1983).
Parece que las variantes tum^{-} fracasan para formar tumores progresivos porque inician un proceso de rechazo inmune. La evidencia a favor de esta hipótesis incluye la capacidad de las variantes de tumores "tum^{-}", es decir, los que normalmente no forman tumores, para hacerlo en ratones con respuesta inmune suprimida por irradiación subletal, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5282-5285 (1979); y la observación de que las células de mastocitoma P815 tum^{-} inyectadas intraperitonealmente, se multiplican exponencialmente durante 12-15 días, y después son eliminadas solo en unos pocos días, en medio de un influjo de linfocitos y macrófagos (Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152: 1175-1183 (1980)). Más evidencia incluye la observación de que los ratones adquieren una memoria inmune que les permite resistir posteriores inyecciones de la misma variante tum^{-}, incluso cuando se administran cantidades de radiación inmunosupresoras, simultáneamente con la inyección de células (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272-275 (1977); Van Pel et al., arriba; Uyttenhove et al., arriba).
La investigación posterior encontró que cuando los tumores espontáneos se sometían a mutagénesis, se producían variantes inmunogénicas que generaban una respuesta. Es más, estas variantes eran capaces de provocar una respuesta inmune protectora contra el tumor original. Véase Van Pel et al., J. Exp. Med. 157: 1992-2001 (1983). Así, se ha demostrado que es posible provocar la presentación de los llamados "antígenos de rechazo tumoral", en un tumor que es diana para una respuesta de rechazo singénico. Se han obtenido resultados similares cuando se transfectan genes extraños en tumores espontáneos. Véase Fearson et al., Cancer Res. 48: 2975-1980 (1988), a este respecto.
Se ha reconocido una clase de antígenos que se presentan sobre la superficie de las células tumorales, y que son reconocidos por células T citotóxicas, produciendo la lisis. Esta clase de antígenos serán denominados "antígenos de rechazo tumoral", o "TRA" a partir de aquí. Los TRA pueden provocar o no respuestas de anticuerpos. La extensión con la que se han estudiado estos antígenos, ha sido a través de estudios de caracterización de células T citolíticas, in vitro, es decir, el estudio de la identificación del antígeno por un subgrupo de células T citólicas particulares ("CTL" a partir de aquí). El subgrupo prolifera tras el reconocimiento del antígeno de rechazo tumoral presentado, y las células que presentan el antígeno son lisadas. Los estudios de caracterización han identificado clones de CTL que lisan específicamente células que expresan los antígenos. Ejemplos de este trabajo pueden encontrarse en Levy et al., Adv. Cancer Res. 24: 1-59 (1977); Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980); Brunner et al., J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 406-412 (1982); Palladito et al., Canc. Res. 47: 5074-5079 (1987). Este tipo de análisis se requiere para otros tipos de antígenos reconocidos por CTL, incluyendo los antígenos menores de histocompatibilidad, los antígenos específicos masculinos H-Y, y la clase de antígenos conocidos como antígenos "tum^{-}", y discutidos aquí.
Un ejemplo de tumor del asunto descrito anteriormente se conoce como P815. Véase DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274-2278 (1988); Szikora et al., EMBO J 9: 1041-1050 (1990), y Sibille et al., J. Exp. Med. 172: 35-45 (1990). El tumor P815 es un mastocitoma, inducido en un ratón DBA/2 con metilcolantreno, y puede cultivarse como un tumor in vitro o como una línea celular. La línea P815 ha generado muchas variantes tum^{-} después de mutagénesis, incluyendo variantes denominadas P91A (DePlaen, arriba), 35B (Szikora, arriba), y P198 (Sibille, arriba). En contraste con los antígenos de rechazo tumoral -y esta es una distinción clave-, los antígenos tum^{-} solo se presentan después de que las células tumorales se han sometido a mutágenesis. Los antígenos de rechazo tumoral se presentan sobre células de un determinado tumor sin mutágenesis. De esta forma, con referencia a la literatura, una línea celular puede ser tum^{+}, tal línea celular denominada como "P1", y puede provocarse para producir variante tum^{-}. Como el fenotipo tum^{-} difiere del de la línea celular parental, uno espera una diferencia en el DNA de las líneas celulares tum^{-}, comparada con sus líneas parentales tum^{+}, y esta diferencia puede explotarse para localizar los genes de interés en células tum^{-}. Como resultado, se encontró que genes de variantes tum^{-} tales como P91A, 35B y P198, difieren de sus alelos normales en mutaciones puntuales en las regiones de codificación del gen. Véase Szikora y Sibille, arriba, y Lurquin et al., Cell 58: 293-303 (1989). Éste ha probado no ser el caso con los TRA de esta invención. Estas publicaciones también demostraban que péptidos derivados de antígenos tum^{-} son presentados por la molécula L^{d} para reconocimiento por los CTL. El P91A es presentado por L^{d}, P35 es presentado por D^{d} y P198 por K^{d}.
La solicitud PCT/US92/04354, presentada el 22 de mayo de 1992, asignaba la misma asignación como sujeto de la solicitud, muestra una familia de genes que codifican precursores de antígenos de rechazo tumoral humano, denominados familia MAGE. Varios de estos genes se han discutido también en van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991). Ahora está claro que varios genes de la familia MAGE se expresan en células tumorales, y sirven como marcadores para el diagnóstico de dichos tumores, así como para otros objetivos discutidos aquí. Véase también Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992), van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991). El mecanismo mediante el cual una proteína es procesada y presentada sobre la superficie celular está actualmente bastante bien documentado. Puede encontrarse una revisión superficial sobre el desarrollo en este campo en Barinaga, "Getting Some ``Backbone'': How MHC Binds Peptides", Science 257: 880 (1992); Véase también Fremont et al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992). Estas publicaciones generalmente apuntan al requerimiento de que el péptido que se une a una molécula MHC/HLA tenga nueve aminoácidos de largo (un "nonapéptido"), y a la importancia del primero y del noveno residuos de aminoácidos del nonapéptidos.
Estudios sobre la familia de genes MAGE han revelado actualmente que un nonapéptido particular, es de hecho presentado sobre la superficie de las células tumorales, y que la presentación del nonapéptido requiere que la molécula presentadora sea HLA-A1. Los complejos de antígeno de rechazo tumoral MAGE-1 (el "TRA" o nonapéptido), llevan a la lisis de la célula que los presenta por células T citolíticos ("CTL"). Esta observación tiene implicaciones tanto diagnósticas como terapéuticas, como aquí se discute.
La investigación presentada en, por ejemplo, la Solicitud de Patente con Nº de Serie 07/938.334, presentada el 31 de agosto de 1992, que es la precedente de la solicitud actual, mostraba que, cuando se comparan regiones homólogas de varios genes MAGE con la región del gen MAGE-1 que codifica el nonapéptido relevante, existe un alto grado de homología. Es más, estas observaciones llevan a uno de los aspectos de la invención descrito y reivindicado allí, que es una familia de nonapéptidos, todos los cuales tienen los mismos aminoácidos N-terminal y C-terminal. Estos nonapéptidos se describieron como útiles para diversos propósitos, que incluyen su utilización como inmunógenos, bien solos o combinados con los péptidos trasportadores. Los nonapéptidos son de un tamaño suficiente para constituir un epítopo antigénico, y los anticuerpos así generados se describieron como útiles para identificar el nonapéptidos, tanto si existen solos, o forman parte de un polipéptido mayor.
Los nonapéptidos se describieron como útiles para identificar diversos subtipos de HLA sobre la superficie de las células tumorales, tales como las de melanoma. A través de esta capacidad, han servido tanto como marcadores diagnósticos y como agentes terapéuticos. Estas características se discuten más adelante.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los nonapéptidos también se describieron allí. Estas secuencias de ácidos nucleicos, también se han descrito como útiles como sondas diagnósticas para detectar la presencia de tumor.
La Solicitud también mostraba como se había encontrado que podía utilizarse un modelo celular, en el que una célula no humana podía transfectarse con una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de HLA. La célula transfectada resultante podía entonces utilizarse para estudiar la especificidad de nonapéptido de la molécula particular de HLA, o como objeto de una segunda transfección con un gen MAGE. Las células co-transfectadas podían entonces utilizarse para determinar si el TRA particular basado en MAGE se presentaba por la molécula particular de HLA.
La presente invención se refiere a uno de los péptidos descritos en la primera de las dos solicitudes precedentes. Específicamente, el nonapéptido:
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
derivado del precursor del antígeno de rechazo de tumor codificado por el gen MAGE-3, del que se ha demostrado que es presentado por el antígeno de leucocitos humano HLA-A1. Este hallazgo, y sus ramificaciones, se describen a continuación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 expone el procedimiento mediante el que un fragmento de 300 pares de bases del gen MAGE-1, se identificó como el que codifica el antígeno de rechazo tumoral relevante.
La Figura 2 muestra estudios líticos en los que se incubaron células con varios péptidos MAGE-1.
La Figura 3 compara la lisis de células de ratón transfectadas con genes HLA-A1, en presencia del nonapéptido MAGE-1, y cuando se co-transfectaban con la secuencia que codifica MAGE-1.
La Figura 4 compara nonapéptidos de diversas secciones homólogas de genes MAGE y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican esos nonapéptidos.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de liberación de cromo, utilizando el clon 20/38 de CTL sobre diversas líneas celulares.
La Figura 6 presenta el resultado del ensayo llevado a cabo para determinar la especificidad antigénica del clon 20/38 de CTL.
La Figura 7 muestra los resultados obtenidos cuando se llevó a cabo un ensayo de liberación de TNF en diversas células transfectadas.
La Figura 8 expone los resultados de un ensayo lítico utilizando el péptido de la invención.
SEQ ID N^{OS}: 1-9, muestran nonapéptidos homólogos de genes MAGE y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas Ejemplo 1
Se sabe que el fragmento BamIII de 2,4 kb, descrito por van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991), contiene solo los exones 2 y 3 del gen que codifica la proteína MAGE-1. El fragmento transfiere la expresión del antígeno MZ2-E a una línea celular E^{-}, que ha perdido el antígeno, la variante MZ2-MEL.2.2, y lleva a la lisis de las células transfectadas por los CTLs E^{+}. Estudios previos de DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274 (1988), y Chomez et al., Immunogenetics 35: 241 (1990), habían establecido que pequeños fragmentos de gen que contienen las secuencias de codificación de los péptidos antigénicos expresan regularmente aquellos antígenos, incluso cuando no se han transfectado en forma de vectores de expresión. A la vista de estas observaciones, se llevaron a cabo experimentos con fragmentos más pequeños del fragmento de 2,4 kb. Se utilizaron diversos enzimas de restricción para cortar el fragmento de 2,4 kb en fragmentos menores. Los fragmentos resultantes, menores, se clonaron en el vector plásmido pTZ18R. Se obtuvo un fragmento de 300 pares de bases del exón 3, mediante la reacción de amplificación en cadena de la polimerasa ("PCR"), utilizando los oligonucleótidos VDB 14:
5'-CAGGGAGCCAGTCACAAAG-3'
y CHO 9:
5'-ACTCAGCTCCTCCCAGATTT-3'.
Estos cebadores amplifican un fragmento de 300 pares de bases de MAGE 1, entre las posiciones 422 y 722 del exón 1. El fragmento se clonó en el vector de expresión PSVK3. Las nuevas construcciones se co-transfectaron con el plásmido pSVtkneo\beta en las líneas celulares MZ2.MEL 2.2. Esto se consiguió utilizando el método de precipitación de fosfato cálcico (Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); Wölfel et al., Immunogenetics 26: 178 (1987)), utilizando 4 x 10^{6} células y 3 \mug de pSVtneo\beta (Nicolas et al., CSH Conf. Cell Prolif 10: 469 (1983)), y 30 \mug de las construcciones pTZ18R o PSVK3. Las células transfectadas se seleccionaron después en un medio que contenía el análogo de la neomicina G418. Quince días después de la transfección, las células resistentes se analizaron para su capacidad de estimular la producción de TNF, mediante el antígeno anti-E, CTL 82/30. Esto se llevó a cabo añadiendo 100 \mul de muestras que contenían 1500 CTL 82/30, a 4 x 10^{4} células transfectadas. Se recogieron muestras de sobrenadantes (50 \mul), y se añadieron a 3 x 10^{4} células del clon WEHI 164 (Espevik et al., J. Immunol. Meth. 95: 99 (1986)), para evaluar la presencia de TNF. La mortalidad de las células WEHI se estimó 24 horas más tarde, utilizando un ensayo colorimétrico MMT, como el utilizado por ejemplo en Traversari et al., arriba.
Como se muestra en la Figura 1, estos experimentos identificaron un fragmento de 300 pares de bases del exón 3 de MAGE-1, capaz de transferir eficazmente la expresión del antígeno MZ2E.
Ejemplo 2
El gen MAGE-1 pertenece a una familia de genes altamente relacionados. Véase van der Bruggen et al., arriba. Experimentos anteriores habían mostrado que MAGE-2 y MAGE-3 no dirigían la expresión del antígeno M22-E. Como el fragmento de 300 pares de bases lo hacía claramente, las secciones homólogas de los genes MAGE-2 y MAGE-3 se compararon con el fragmento de 300 pares de bases. Las diferencias eran claras, y se sintetizaron varios péptidos de 15 aminoácidos, utilizando F-moc para protección N-terminal transitoria, de acuerdo con Atherton et al., J. Chem. Soc. 1: 538 (1981). Los péptidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa C-18, y se caracterizaron mediante análisis de aminoácidos.
Una vez que los péptidos estaban seguros, se testaron en ensayos de lisis, utilizando la metodología de liberación de cromo de Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184 (1980). Brevemente, 1000 células diana E^{-} marcadas con ^{51}Cr, se incubaron en placas de microtitulación, utilizando varias concentraciones de péptidos, durante 30 minutos a 37ºC.
Se añadió un volumen igual de muestra que contenía CTL (línea celular 82/30), siendo el número de CTL cinco veces mayor que el de su diana. La liberación de cromo se midió después de cuatro horas. Se observó sensibilización de las células E^{-} a la lisis por los CTL anti E, con un péptido que corresponde a los codones 158-172 del marco de lectura abierto grande de MAGE-1. Se prepararon péptidos más cortos y se observó lisis eficaz con el péptido: Glu Ala Asp Pro Thy Gly His Ser Tyr.
Los resultados, mostrados en la figura 2, demuestran que el primer y el noveno aminoácidos eran críticos par la unión y la lisis eficaz. Esto está de acuerdo con referencias anteriores que establecen que las moléculas MHC-I generalmente se unen mediante nonapéptidos (Rotzschke et al., Nature 348: 252 (1990)). La figura 2 también muestra que la mitad de la lisis máxima se obtenía a una concentración de péptido de 5 nM.
Ejemplo 3
Se llevaron a cabo experimentos para determinar que molécula presentaba el antígeno MAGE-1 relevante. Para conseguirlo, se transfectó un gen HLA-A1, como mostró Girdlestone, Nucl. Acids. Res. 18: 6701 (1990), en una línea celular de ratón, P1.HTR. Esta línea celular es una variante altamente transfectable de la línea celular de mastocitoma de ratón P815. Los transfectantes resultantes, denominados "P1.HTR.A1", se incubaron en presencia del nonapéptido discutido arriba, utilizando el mismo ensayo de lisis. También se utilizaron testigos.
La figura 3 muestra que la línea celular estaba lisada, demostrando que se había desarrollado un modelo para el escrutinio de un péptido lítico, utilizando una célula no humana.
En experimentos no descritos aquí, se obtuvieron resultados similares con células COS.
También se realizaron experimentos adicionales, en los que la línea celular P1.HTR A1 se transfectó con cDNA de MAGE-1. Cuando se llevó a cabo el ensayo lítico del Ejemplo 2 con estas células co-transfectadas, se encontró que éstas también se lisaban.
Ejemplo 4
Dada la homología de los diversos genes dentro de la familia MAGE, se llevó a cabo una comparación para identificar similitudes entre las regiones homólogas de los genes. Estas regiones se muestran en la figura 4. Estos péptidos y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican no son idénticas, pero muestran mucha homología, especialmente los nueve primeros residuos idénticos.
Ejemplo 5
Este ejemplo, y los ejemplos 6-8 que le siguen, corresponden a los ejemplos 37-40 de la solicitud co-pendiente con número de Serie 08/037.230, presentada el 26 de marzo de 1993.
Se obtuvo un clon CTL citolítico "20/38", de linfocitos de sangre periférica de paciente con melanoma MZ2. Este clon está descrito por Van den Eynde et al., Int. J. Cancer 44: 634-640 (1989). El clon CTL se aisló siguiendo a Herin et al., Int. J. Cancer 39: 390-396 (1987). El ensayo se describe aquí, sin embargo. Se cultivaron células antólogas de melanoma in vitro, y después se resuspendieron a 10^{7} células/ml en DMEM, suplementado con 10% de HEPES y 30% de FCS, y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC con 200 \muCi/ml de Na(^{51}Cr)O_{4}. Las células marcadas se lavaron tres veces con DMEM, suplementado con HEPES 10 mM. Después se resuspendieron en DMEM suplementado con HEPES 10 mM y 10% de FCS, y después se distribuyeron partes alícuotas de 100 \mul, que contenían 10^{3} células, en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se añadieron muestras del clon CTL en 100 \mul del mismo medio, y se llevaron a cabo los experimentos por duplicado. Las placas se centrifugaron durante cuatro minutos a 100 g, y se incubaron durante cuatro horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5,5%.
Las placas se centrifugaron de nuevo, y se recolectaron partes alícuotas de 100 \mul de sobrenadante, que se contaron. El porcentaje de liberación de ^{51}Cr se calculó como sigue:
% de liberación de ^{51}Cr = [(ER-SR) / (MR-SR)] x 100
donde ER es la liberación de ^{51}Cr experimental observado, SR es la liberación espontánea medida mediante la incubación de 10^{3} células marcadas en 200 \mul de medio solo, y MR es la liberación máxima, obtenida mediante la adición de 100 \mul de Tritón X-100 al 0,3% a las células diana.
Aquellas muestras de células mononucleares de células que mostraban una actividad CTL elevada, se expandieron y se clonaron a través de dilución limitante, y se escrutaron de nuevo, utilizando la misma metodología.
Se utilizó el mismo método para analizar las células diana K562. Cuando se utilizaron células EBV-B, el único cambio fue el reemplazo del medio DMEM por medio de Hank, suplementado con 5% de FCS.
Estos experimentos llevaron al aislamiento del clon CTL 20/38.
La figura 5 presenta los resultados de estos ensayos. Específicamente, se observará que el clon CTL lisaba la línea celular autóloga de melanoma MZ2-MEL.3.0, pero no lisaba las líneas celulares de EBV-B, fibroblastos, K562 o la línea celular no autóloga de melanoma SK-MEL-29.
Ejemplo 6
Una vez que se reconoció que el clon CTL era específico para la línea celular autóloga, se analizó su especificidad antigénica. Para hacer esto, se analizaron variantes con pérdida de antígenos, derivados del paciente MZ2, con el mismo tipo de ensayo de liberación de cromo descrito previamente. Estas líneas celulares eran MZ2-MEL 3.0, que es D^{+}, E^{+}, F^{+}, A^{+}, MZ2-MEL.61, que es D^{-}, MZ2-MEL 2.2, que es E^{-}, y MZ2-MEL.4, que es F^{-}. Además del clon CTL 20/38, se analizaron clones conocidos por ser anti-A (CTL 28/336), anti-F (CTL 76/6), y anti-E (CTL 22/13).
Estos resultados se expresan en la figura 6. Se observará que el clon 20/38 lisaba todas las líneas celulares, produciendo liberación de cromo, excepto la línea celular D^{-} MZ2-MEL.61, indicando así que el clon CTL es anti-D. Este resultado se confirmó, en experimentos no incluidos aquí, mediante experimentos en los que se observó liberación de TNF por el clon, solamente en presencia de líneas de melanoma que presentaban el antígeno D.
Ejemplo 7
Una vez que el antígeno D se identificó como la molécula diana, se llevaron a cabo estudios para determinar el tipo de HLA que la presentaba. Los experimentos descritos en el ejemplo A mostraban que el antígeno D era presentado por MZ2-MEL, y la especificidad HLA de esta línea celular es conocida (esto es, A1, A29, B37, B44, Cw6, C.cl.10). También se conocía, sin embargo, que una variante de MZ2-MEL que había perdido las moléculas HLA A29, B44 y C.cl.10, todavía expresaba el antígeno D, por lo que estas moléculas podían eliminarse de la consideración. No se llevaron a cabo estudios sobre líneas que expresaban B37, ya que no pudo encontrarse ninguna.
En total, se analizaron 13 líneas alogénicas, que expresaban HLA-A1 (10 de 13), o Cw6 (3 de 13). Las líneas celulares se analizaron para su capacidad de estimular la liberación de TNF por el clon 20/38, utilizando el método de Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992). Este ensayo mide la liberación de TNF a través del análisis de toxicidad de los sobrenadantes sobre células WEHI 164-13.
En los ensayos, muestras de células (3000, 10.000 ó 30.000 células), de líneas alogénicas se cultivaron en presencia de 1.500 células del clon CTL, y 25 \mug/ml de IL-2. veinticuatro horas más tarde, los sobrenadantes del cultivo se analizaron contra células WEHI para toxicidad. Los resultados se presentan en la Tabla 1, que se expone a continuación.
Se encontraron ocho líneas celulares que estimulaban la liberación de TNF del clon CTL 20/38. Todas esta líneas tenían HLA-A1. Ninguna de las líneas presentadoras Cw6 lo hacía.
Las líneas celulares también se analizaron para determinar la expresión de MAGE. Las ocho líneas que estimulaban la liberación de TNF expresaban MAGE-3, mientras que dos líneas HLA-A1 que eran negativas, no lo hacían
TABLA 1
1
2
1.500 CTL 20/38 y 25 \mug/ml de IL-2 se mezclaron con el número de células indicado de los diferentes melanomas alógenos. Dos días más tarde, se analizó la cantidad de TNF presente en los sobrenadantes, analizando su citotoxicidad para células WEHI 164-13.
Ejemplo 8
A la vista de los resultados presentados en el ejemplo 7, se llevaron a cabo experimentos para determinar si el antígeno D era de hecho un antígeno de rechazo de tumor derivado de MAGE-3. Para ello, células recipientes COS-7 se transfectaron con 100 ng del gen para HLA-A1 clonado en pcDNA I/Amp, y 100 ng de uno entre (a) cDNA para MAGE-1 clonado en pcDNA I/Amp, (b) cDNA para MAGE-2 clonado en pcDSR\alpha, o (c) cDNA para MAGE-3 clonado en pcDSR\alpha. Las secuencias transfectantes se ligaron en los plásmidos, según las instrucciones del fabricante. Se sembraron muestras de células COS-7, a 15.000 células/pocillo, en placas de cultivo celular de micropocillos de fondo plano, en Medio Eagles modificado por Dulbeco ("DMEM"), suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Las células se incubaron durante la noche a 37ºC, se retiró el medio, y después se reemplazó con 30 \mul/pocillo de medio DMEM que contenía 10% de suero Un, 400 \mug/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 100 \muM, y los plásmidos anteriormente descritos. Después de cuatro horas de incubación a 37ºC, se retiró el medio, y se reemplazó con 50 \mul de PBS que contenía 10% de DMSO. Este medio se retiró después de dos minutos y se reemplazó con 200 \mul de DMEM suplementado con 10% de FCS.
Después de este cambio de medio, las células COS se incubaron durante 24 horas a 37ºC. El medió después se descartó, y se añadieron 1.500 células de clones CTL 20/38, en 100 \mu l de medio Iscove que contenía 10% de suero humano combinado, suplementado con 25 \mug/ml de IL-2. El sobrenadante se retiró después de 24 horas, y el contenido de TNF se determinó en un ensayo sobre células WEHI, como describieron Trasversari et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992). Estos resultados se muestran en la Figura 7.
Se podrá ver que el clon CTL se estimulaba fuertemente por las células COS 7 transfectadas con HLA-A1 y MAGE-3, pero no por las células transfectadas con los otros genes MAGE. Esto lleva a la conclusión de que el antígeno D es un antígeno de rechazo de tumor derivado del antígeno de rechazo de tumor precursor, codificado por el gen MAGE-3, y que este TRA es presentado por moléculas HLA-A1.
Ejemplo 9
Se llevaron a cabo más experimentos, utilizando el péptido
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr,
que se deriva del gen "MAGE-3".
El péptido se preparó de la misma forma que se prepararon los péptidos del ejemplo 2. También se utilizó el ensayo de liberación de cromo descrito en el ejemplo. La línea celular MZ2-MEL 61.2, que es una variante de MZ2.MEL43 que ha perdido el antígeno D, se marcó con ^{51}Cr, y después se ensayó con células citolíticas específicas para el antígeno D del clon CTL 20/38, y variando las concentraciones del péptido. Las células MZ2-MEL61.2 y CTL 20/38, se combinaron en una razón 1,5:1, junto con el péptido a concentraciones variables. La mezcla se incubó durante cuatro horas, después de las cuales se midió la liberación de cromo. Como testigos, se utilizaron células MZ2-MEL.43 marcadas con cromo.
Los resultados, presentados en la figura 8, muestran que el péptido actúa como un antígeno de rechazo de tumor, en que los clones de células T citolíticas reconocen y lisan las células diana.
Los siguientes ejemplos muestran que un nonapéptido derivado de MAGE-3 es presentado por moléculas HLA-A1, y que las células que presentan el complejo de HLA-A1 y el nonapéptido son reconocidas y lisadas por células CTL específicas. Esta observación indica que el nonapéptido de la invención puede utilizarse tanto terapéuticamente como para diagnóstico.
En el caso de utilización en la última categoría, el nonapéptido puede utilizarse, por ejemplo, para identificar tumores que expresan una molécula HLA particular, o células cancerosas per se. Se pone en contacto una muestra que contiene células cancerosas, o una célula tumoral, con el nonapéptido al que se une, y se combina el material con una muestra de CTL específica para el complejo. Si ocurre lisis, entonces la célula tumoral/cancerosa puede identificarse como presentadora de HLA-A1.
Terapéuticamente, hay dos formas principales en las que puede utilizarse el nonapéptido. En una aproximación terapéutica in vivo, el nonapéptido puede administrarse de forma que haga diana en los tumores que van a ser tratados. Esto puede hacerse mediante inyección directa, administración de liberación en el tiempo, unión a anticuerpos específicos de tumor, y así sucesivamente. Después de unirse a moléculas HLA-A1, hay una respuesta CTL, que lleva a la lisis del tumor. Por supuesto, en dicha aproximación terapéutica, el nonapéptdio se administra en una cantidad suficiente para producir la lisis del tumor. Esta cantidad variará, dependiendo del paciente particular, el tipo y el tamaño del tumor, y así sucesivamente.
También se contempla una forma de terapia "in vitro". Como se ha indicado arriba, cuando las moléculas HLA-A1 se unen al nonapéptido derivado de MAGE-3, si se ponen en contacto con CTLs específicos para el complejo péptido/HLA, ocurre una respuesta proliferativa. Como los CTLs son los agentes de lisis tumoral in vivo, la población expandida resultante puede administrarse al paciente. Los CTLs pueden expandirse utilizando la propia sangre del paciente, o cualquier otra fuente de CTLs, o poniendo en contacto las muestras de CTLs específicos de péptido que se han establecido previamente. En este sentido, es de señalar que el CTL 20/38, discutido arriba, ha estado disponible durante algún tiempo, así como la metodología para su desarrollo.
Las terapias del tipo descrito aquí son particularmente útiles para melanomas. El análisis de muestras ha demostrado que alrededor del 26% de la población caucásica presenta el alelo HLA-A1. Así, como mínimo, el 26% de la población caucásica con melanomas podrían ser considerados como sujetos potenciales para la terapia con el péptido. Los pacientes pueden también tratarse con células proliferativas que tengan complejos HLA-A1 y nonapéptido presentes sobre su superficie.
Las secuencias de ácidos nucleicos, como se indica, pueden utilizarse de una variedad de formas. Los genes MAGE se expresan en tumores, y así las secuencias de ácidos nucleicos pueden utilizarse como sondas para identificar células tumorales. Esto puede conseguirse a través de la hibridación de sondas, PCR, o cualquiera de los diversos ensayos basados en sondas de ácidos nucleicos conocidos en la técnica.
El desarrollo de líneas celulares no humanas descrito aquí, presenta una única forma de llevar a cabo algunos de los hechos de la invención descrita aquí. Los ejemplos muestran, por ejemplo, que los CTLs reconocen el complejo de HLA y nonapéptido, y no parecen diferenciar entre los tipos celulares que presentan los complejos. Así, las líneas celulares no humanas aisladas de la invención, pueden utilizarse para generar CTLs, y para identificar su presencia en muestras humanas.
Como se indica, la invención también incluye líneas celulares no humanas aisladas, transfectadas tanto con un gen HLA-A1 y una secuencia que codifica el nonapéptido. No se limita a la transfección con un gen que codifica HLA y un péptido MAGE, e incluso la invención contempla células politransfectadas, que pueden contener mas de un gen HLA y más de una secuencia de codificación de antígeno MAGE. El hallazgo de que tanto el nonapéptido derivado de MAGE-1 como el nonapéptido derivado de MAGE-3 son presentados por una molécula HLA común, apoya este punto de vista. Dichas células pueden ser vistas como células efectoras universales, y la presencia de pares apropiados de HLA y péptidos sobre la superficie, llevará bien a la identificación de CTL específicos de elección, o bien a la generación de proliferación de CTL en un contexto terapéutico. Dichas células, sean cotransfectadas o politransfectadas, pueden servir como vacunas cuando se combinan con un adyuvante adecuado, tal como los bien conocidos en la técnica. El tratamiento de varias enfermedades cancerosas, tales como el melanoma o el cáncer de mama, puede llevarse a cabo utilizando estos transfectantes.
Los términos y las expresiones que se han empleado son utilizados como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en la utilización de dichos términos y expresiones, de excluir ningún equivalente de los hechos mostrados y descritos o alguna de sus partes, siendo reconocido que son posibles varias modificaciones dentro del ámbito de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE. LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NONAPEPTIDO AISLADO DERIVADO DEL GEN MAGE-3 Y PRESENTADO POR HLA-A1, Y SUS USOS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Felfe & Lynch
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 805 Third Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: New York City
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: New York
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: EE. UU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO: 10022
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete, 5,25 pulgadas, 360 kb de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Wordperfect
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/073.103
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 de junio de 1993
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS ANTERIORES DE SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/938.334
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 31 de agosto de 1992
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/037.230
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 26 de marzo de 1993
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Hanson, Norman D.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30.946
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: LUD 293.1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 688-9200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (212) 838-3884
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-1
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GCA GAC CCC ACC GGC CAC TCC TAT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-2
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GTG GTC CCC ATC AGC CAC TTG TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-21
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GTG GTC CGC ATC GGC CAC TTG TAG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GTG GAC CCC ATC GGC CAC TTG TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GTG GAC CCC GCC AGC AAC ACC TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-41
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GTG GAC CCC ACC AGC AAC ACC TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-5
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GCG GAC CCC ACC AGC AAC ACC TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-51
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GCG GAC CCC ACC AGC AAC ACC TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO/CLAVE: secuencia de codificación del nonapéptido MAGE-6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAA GTG GAC CCC ATC GGC CAC GTG TAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr}

Claims (15)

1. Un nonapéptido aislado para utilización en terapia o diagnóstico, donde dicho nonapéptido es un nonapéptido derivado de MAGE, capaz de formar un complejo con una molécula HLA-A1, y provocar la lisis de las células que presentan complejos de dicho nonapéptido y dicha molécula de HLA, donde el nonapéptido se selecciona de:
Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID NO: 2)
Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 3)
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4)
Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 5)
Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 6)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 7)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 8); y
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID NO: 9)
2. Un nonapéptido aislado, según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos: Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4).
3. Un método in vitro para determinar la unión de un péptido a analizar a una molécula MHC, que comprende poner en contacto dicho péptido con una molécula del MHC, en combinación con un nonapéptido de unión a MHC, y determinar el grado de unión de dicho péptido a analizar con dicha molécula del MHC,
donde dicho nonapéptido de unión a MHC es un derivado de MAGE, y es capaz de formar un complejo con una molécula HLA-A1, y provocar la lisis de células que presentan complejos de dicho nonapéptido y dicha molécula HLA, siendo el nonapéptido seleccionado de:
Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID NO: 2)
Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 3)
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4)
Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 5)
Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 6)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 7)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 8); y
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID NO: 9)
4. Un método según la reivindicación 3, donde dicha molécula del MHC es presentada por una célula transfectada con una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula del MHC.
5. Una molécula inmunogénica que comprende un nonapéptido unido a una molécula transportadora, donde dicho nonapéptido es derivado de MAGE, y es capaz de formar un complejo con una molécula HLA-A1, y provocar la lisis de células que presentan complejos de dicho nonapéptido y dicha molécula HLA, siendo el nonapéptido seleccionado de:
Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID NO: 2)
Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 3)
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4)
Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 5)
Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 6)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 7)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 8); y
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID NO: 9)
6. Una línea celular no humana, aislada y transfectada con una molécula de ácido nucleico que codifica un nonapéptido derivado de MAGE, que es capaz de formar un complejo con una molécula HLA-A1, y provocar la lisis de células que presentan complejos de dicho nonapéptido y dicha molécula HLA, siendo el nonapéptido seleccionado de:
Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID NO: 2)
Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 3)
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4)
Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 5)
Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 6)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 7)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 8); y
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID NO: 9)
7. Una línea celular no humana, aislada y transfectada, capaz de generar una respuesta CTL, que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula HLA y una molécula de ácido nucleico que codifica un nonapéptido derivado de MAGE, que es capaz de formar un complejo con una molécula HLA-A1, y provocar la lisis de células que presentan complejos de dicho nonapéptido y dicha molécula HLA, siendo el nonapéptido seleccionado de:
Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID NO: 2)
Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 3)
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4)
Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 5)
Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 6)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 7)
Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 8); y
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID NO: 9)
8. Una línea celular no humana, aislada y transfectada, según la reivindicación 7, donde dicha molécula HLA es HLA-A1, y dicha molécula de ácido nucleico codifica Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4).
9. Una línea celular no humana, aislada y transfectada, según las reivindicaciones 6 ó 7, donde dicha línea celular es una línea celular de ratón, una línea celular COS, una línea celular P1 HTR A1 o una línea celular P1.A1, MAGE-1.
10. Una línea celular no humana, aislada y transfectada, según la reivindicación 7, transfectada con una pluralidad de secuencias codificadoras de la molécula HLA-A1, y con una pluralidad de secuencias codificadoras de nonapéptidos.
11. Un método para determinar la susceptibilidad de una célula humana a la lisis por una célula T citolítica específica para un complejo de un antígeno MAGE y una molécula HLA, que comprende poner en contacto una línea celular no humana, aislada y transfectada, según la reivindicación 7, con un antígeno MAGE, donde dicha línea celular ha sido transfectada con una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula HLA característica de dicha célula humana, y con una muestra de células T citolíticas específicas para dicho antígeno MAGE, y determinar la lisis de dicha línea celular transfectada, como una determinación de susceptibilidad de dicha línea celular humana a la lisis por dicha célula T citolítica.
12. Un método para determinar una molécula HLA que presenta un antígeno MAGE a una célula citolítica, que comprende cultivar una línea celular no humana, aislada, transfectada, como según la reivindicación 10, con una muestra de células T citolíticas, específicas para dicho antígeno MAGE, y determinar su lisis, como determinación de la presentación de dicho antígeno MAGE por dicha molécula HLA.
13. Un método para monitorizar la actividad CTL en un sujeto, que comprende mezclar una muestra de fluido corporal de CTL de dicho sujeto, con una línea celular según la reivindicación 7 in vitro, y determinar la reacción entre ellas como una medida de la actividad CTL en dicho paciente.
14. Un método de provocar proliferación de CTL, que comprende poner en contacto una muestra de fluido corporal de un sujeto, que contiene CTL, in vitro, con una línea celular según la reivindicación 7, donde dicha línea celular presenta un nonapéptido MAGE para el que al menos un CTL en dicha muestra es específico, donde dicho CTL específico prolifera en respuesta a dicho nonapéptido.
15. Un método para determinar una enfermedad cancerosa, que comprende poner en contacto una muestra de un sujeto del que se sospecha que tiene una enfermedad cancerosa, con una sustancia que se une específicamente a:
a.
Nonapéptido Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO: 4); o
b.
Complejos de una molécula HLA-A1 y dicho nonapéptido, y determinar la unión como indicación de dicha enfermedad cancerosa.
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