RS50101B - Farmaceutski preparati za imunomodulaciju - Google Patents

Abstract

Farmaceutski preparat, koji sadrži bar jedan peptid, protein ili fragment proteina sa imunomodulatornom aktivnošću zajedno sa adjuvansom, gde navedeni adjuvans je poliarginin. Prijava sadrži još 24 zavisna patentna zahteva.

Description

Pronalazak se odnosi na oblast imunomodulacije.

Pronalazak predstavlja dalje razvijanje terapeutske vakcine na bazi ćelija tumora. On se uglavnom zasniva na sledećim pretpostavkama: između ćelija tumora i normalnih ćelija postoje kvalitativne ili kvantitativne razlike; načelno, imunski sistem je sposoban da prepozna takve razlike; imunski sistem može, putem aktivnog specifičnog imuniziranja sa vakcinama, za to da bude stimuliran, da na osnovu tih razlika prepoznaje ćelije tumora i da ih onemogućuje.

Da bi se izazvao anti-tumorski odgovor moraju da budu ispunjene bar dve pretpostavke: prvo, ćelije tumora moraju da eksprimiraju antigene, koji na normalne ćelije ne deluju, ili samo tako ograničeno deluju, da imunski sistem može kvalitativno da razlikuje normalno tkivo i tkivo tumora. Drugo, imunski sistem mora na odgovarajući način da bude aktiviran da bi na takve antigene reagovao. Ozbiljna prepreka u imunskoj terapiji tumora je njihova mala imunogenost, pre svega kod ljudi.

U novije vreme otkriveni su tumor-asocirani i tumor-specifični antigeni, koji takve neo-epitope predstavljaju, pa bi time trebalo da budu potencijalni ciljevi (mete) za napad imunskog sistema. Da imunskom sistemu to ipak ne uspeva, da eliminiše tumore, koji ove neo-epitope eksprimiraju, očigledno je da ne bi trebalo pripisati greškama neo-epitopa, već tome što je imunološki odgovor na takve neo-antigene nedovoljan.

Za imunsku terapiju raka na celjskoj osnovi razvijene su dve opšte strategije: s jedne strane, adoptivna imunska terapija koja koristi in vitro ekspanziju prema tumoru reaktivnih T-limfocita i njihovo ponovno uvođenje u pacijente; s druge strane, aktivnu imunsku terapiju, koja koristi ćelije tumora, u očekivanju, da će time biti izazvan nov ili pojačan imunski odgovor protiv tumorskih antigena, koji će dovesti do sistemskog tumorskog odgovora. Tumorske vakcine na bazi imunske terapije pripremaju se na različite načine; jedan primer za to su ozračene ćelije tumora, kojima se dodaju imunski stimulirajući adjuvensi (dodaci), kao Corvnebacterium parvum ili Bacillus Calmette Guerin (BCG), da bi se izazvale imunske reakcije protiv tumorskih antigena (Oettgen i Old, 1991).

Poslednjih godina, za aktivnu imunsku terapiju protiv raka, pre svega se koriste genetski modifikovane ćelije tumora. Pregled tih različitih stavova, na osnovu kojih se ćelije tumora, da bi im se pojačala imunogenost, otuđuju uvođenjem različitih gena, dali su Zatloukal et al, 1993. Jedna od do sada uvedenih strategija koristi ćelije tumpora, koje su genetski modifikovane da proizvode citokine (zvtokin).

Identifikovanje i izolovanje tumorskih antigena i tumor-asociranih antigena (TAs), odn. od njih izvedenih peptida (npr. opisali su Wblfel et al., 1994 a) i 1994 b); Carrel et al., 1993, Lehmann et al, 1989, Tibbets et al, 1993, ili je opisano u objavljenim internacionalnim prijavama WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159), bilo je pretpostavka za dalju strategiju, u kojoj su korišćeni tumorski antigeni kao imunogeni za tumorsku vakcinu, i to kako u obliku proteina tako i peptida. Sa tumorskom vakcinom u obliku tumorskih antigena kao takvih, do sada ipak nije postignuta dovoljna imugenost, da bi se izazvao ćelijski imunski odgovor koji bi bio potreban za eliminisanje ćelija tumora koje nose tumorske antigene. Da bi se postiglo, da ćelije koje daju antigene ("Antigen-presenting cels", "APCs"), definisane peptid-antigene prezentiraju na svojoj površini, predloženo je da se peptidi "pulzuju", što je ipak dovelo do neefikasnog opterećivanja ćelija sa peptidima (Tvkocinski et al, 1996); takođe je pokazano, da jednovremeno korišćenje (ko-aplikacija) adjuvenasa samo uslovno pojačava imunski odgovor (Oettgen i Old, 1991).

Treća strategija aktivne imunske terapije u cilju povećavanja delotvornosti tumorske vakcine, zasniva se na ksenogeniziranju (otuđivanju) autologih ćelija tumora. Ovaj koncept se zasniva na pretpostavci da imunski sistem reaguje na ćelije tumora, koje eksprimiraju stran protein i da se u toku takve reakcije ipak izaziva imunski odgovor protiv onih tumorskih antigena koje daju tumorske--ćelije vakcine.

Centralnu ulogu u regulisanju specifičnog imunskog odgovora igra trimolekulski kompleks, koji se sastoji od komponenata, antigen-receptora T-ćelije, MHC ("Major Histocompatibilitv Complex")-molekula i njegovih liganada, koji je fragment peptida koji potiče od nekog proteina.

MHC-molekuli (odn. HLAs, odgovarajući humani molekuli) jesu peptidni--receptori koji za određenu specifičnost dozvoljavaju vezivanje mnogobrojnih različitih liganada. Pretpostavku za to predstavljaju Allel-specifični peptid-motivi, koji ispoljavaju sledeće kriterijume specifičnosti: peptidi imaju, u zavisnosti od MHC-haplotipa, definisanu dužinu; kod MHC-I haplotipa, po pravilu osam do deset ostataka amino kiselina. Na tipičan način, dva položaja amino kiselina pretstavljaju tzv. "anker", koji može da posedne samo jedna jedina amino kiselinu ili ostatak amino kiseline sa veoma bliskim bočnim nizovima. Tačan položaj anker-amino kiseline u peptidu i utkaj na njene osobine menja se u zavisnosti od MHC--haplotipova. C-završetak peptid-liganada najčešće je neki alifatski ili naelektrisan ostatak. Takvi MHC-I-peptid-liganada-motivi, do sada su između ostalog poznati zaH-2Kd, Kb, K<k>, Kkm<l>, D\ HLA-A*0201, A*0205 i B<*>2705 haplotipove.

U okviru konverzije proteina u granicama ćelije, na male peptide se razlazu regularni, otuđeni i strani genski proizvodi, npr. virusni proteini ili tumorski antigeni; neki od njih pretstavljaju potencijalne ligande za MHC-molekule. Time je data pretpostavka za njihovu prezentaciju preko MHC-molekula, a kao posledica toga pojava ćeiijskog imunskog odgovora, pri čemu još nije u pojedinostima objašnjeno, kako se u ćeliji stvaraju peptidi kao MHC-ligandi. Strani ili otuđeni proteini i njihovi razlomljeni delovi mogu se, i preko imunoglobulina, koji pretstavlja humoralni imunski odgovor, prepoznati, vezati i ukloniti. To važi i za sve tumorske antigene: na primeru, tumor-asociranih antigena MUCI, CEA i HER2/nov, dokazano je da imunski globulini, koji su specifični za ove proteine, mogu da prepoznaju i usmrte ćelije koje nose protein. Da bi se izazvao za tumorski antigen specifičan humoralni imunski odgovor, za to su na modelu životinja i kliničnim preliminarnim ispitivanjima isprobani različiti oblici MUCI i CEA, kao imunogena (npr. u rekombinantnim pox-vektorima; Bronte et al., J.Immunol. 154:5282 1995).

U okviru ovog pronalaska razmišljanja su išla dalje i iskorišćena su u razvoju ćelijske tumorske vakcine: dok imunski sistem toleriše ne-maligne, normalne ćelije organizma (tela), organizam reaguje imunskom odbranom na normalnu ćeliju, kada ona, npr. zbog virusne infekcije sintetizuje proteine strane za organizam. Uzrok za to leži u tome što MHC-molekuli prezentiraju strane peptide, koji potiču od proteina stranih za organizam. Kao posledicu toga, imunski sistem registruje da se nešto neželjeno, nepoznato događa sa tom ćelijom. APCs (u to se ubrajaju makrofage, dendritske ćelije, Langerhans-ćelije, B-ćelije, a moguće je i nedavno otkrivene bifenotipske ćelije, koje ispoljavaju svojstva kako B-ćelija tako i makrofaga; Tvkocinski et al, 1996) bivaju aktivirane, stvara se nov specifičan imunitet i ćelija se eliminiše.

Tumorske ćelije sadrže doduše odgovarajuće tumor-specifične tumorske antigene, ali su kao takvi nedovoljna vakcina, pošto njih, s obzirom na njihovu malu imunogenost, imunski sistem ignoriše. Ako se dakle tumorska ćelija optereti ne sa stranim proteinom, već sa stranim peptidom, to će tumorski antigeni same ćelije pored stranih peptida i tu ćeliju da prime kao stranu. Putem otuđivanja sa nekim peptidom, može se postići da se, zbog stranog peptida, izazvan ćelijski imunski odgovor usmeri protiv tumorskih antigena.

Razlog za malu imunogenost tumorskih ćelija može biti ne samo kvalitativan već i kvantitativan problem. Za peptid koji potiče od nekog tumorskog antigena to može da znači, da je, iako su ga prezentirali MHC-molekuli, ipak u isuviše maloj koncentraciji da bi izazvao ćelijski tumor-specifičan imunski odgovor. Povećavanje broja tumor-specifičnih peptida na tumorskoj ćeliji, trebalo bi time da izazove i otuđivanje tumorske ćelije, što dovodi do ćelijskog imunskog odgovora tumorske ćelije. Predloženo je da tumorski antigen, odn. od njega izveden peptid bude prezentiran na površini ćelije, na takav način, da bude transficiran sa DNK koja kodira odgovarajući protein, odn peptid, kao što je opisano u internacionalnim publikacijama WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 i WO 95/00159.

U nemačkoj patentnoj prijavi P 195 43 649.0 prikazana je ćelijska vakcina koja kao aktivne komponente sadrži tumorske ćelije, koje su sa jedan ili sa više peptida tako opterećene, da tumorske ćelije, u sklopu sa peptidima imunskog sistema pacijenta, bivaju prepoznate kao strane, pa izazivaju ćelijski imunski odgovor. Bitno svojstvo peptida je da su oni Ugandi za MHC-haplotip pacijenta. Zbog toga imunski sistem pacijenta prepoznaje peptide kao strane, jer oni sa jedne strane mogu biti "strani--peptidi" ili "kseno-peptidi", ti. oni su različiti od peptida koji su izvedeni od proteina koje tumorske ćelije pacijenta eksprimiraju. Jedna druga kategorija peptida potiče od tumorskih antigena, koje eksprimiraju ćelije pacijenta. One izazivaju povećavanje imunogenosti tako što su one u većoj koncentraciji prema tumorskim ćelijama vakcine, od koncentracije istog peptida na tumorskim ćelijama pacijenta.

Cilj ovog pronalaska je bio da se pripremi nov farmaceutski preparat sa imunomodulatorskim dejstvom, naročito vakcina.

U daljem razvoju koncepta ćelijske vakcine, prikazane u nemačkoj patentnoj prijavi P 195 43 649.0, razvijen je, u okviru ovog pronalaska, farmaceutski preparat koji peptide koji imunomodulatorski deluju ne sadrži u sklopu sa ćelijama, već zajedno sa nekim adjuvansom, kako bi izazvao ćelijski i/ili humoralni, prvenstveno sistemski, imunski odgovor prema patogenom izazivaču, odn. anti--tumorski odgovor, odn. da se ojača ili izazove tolerancija prema proteinima koji autoimunski deluju.

Pronalazak se odnosi na farmaceutski preparat, koji sadrži jedan ili više peptida sa imunomodulatorskim delovanjem, zajedno sa adjuvansom. Preparat je naznačen time što adjuvans ispoljava sposobnost da pojača vezivanje peptida na ćelije individue koja se leći, odn. ulazak peptida u ćelije i da izazove povećanje imunomodulatorskog delovanja peptida.

Pod "imunomodulatorskim delovanjem" podrazumeva se, sjedne strane, izazivanje ili pojačavanje ćelijske i/ili humoralne, prvenstveno sistemske imunske reakcije. U takvom obliku pripremanja, farmaceutski preparat, prema pronalasku, deluje kao vakcina.

U obliku pripremanja koji ima prednost, peptidi su Ugandi za bar jedan MHC--molekul, koji eksprimira osoba koja se leći. Humani MHC-molekuli su, prema internacionalnim običajima, u daljem izlaganju označeni i kao "HLA" ("Human Leucocvte Antigen").

Pod "ćelijski imunski odgovor" pre svega se podrazumeva citotoksični T-ćeUjski imunitet, koji s obzirom na generisanje citotoksično CD8-pozitivnih T-ćeUja i CD4--pozitivnih pomagača-T-ćeUja, izaziva uništavanje tumorskih ćelija iU ćelija koje je napao patogeni izazivač.

Pod "humoralni imunski odgovor" podrazumeva se stvaranje imunoglobulina, koji vrše selektivno prepoznavanje ćeUja tumora iU struktura koje potiču od patogenih izazivača, pa usled toga zajedno sa drugim sistemima, kao npr. komplement, ADCC (Antibodv dependent Cytotoxicity) iU fagocitoze, izazivaju uništenje ovih ćelija tumora, odn. patogenog izazivača iU ćeUja koje odatle potiču.

Peptid koji se nalazi u vakcini potiče od antigena, zbog koga treba da bude izazvan ćelijski i/ili humoralni imunski odgovor. Na taj način se postiže da T-ćeUje, odn. druge citotoksične efektorske ćeUje, prepoznaju izazivača bolesti, odn. ćelije tumora, koje stvaraju antigen, i/ili da se generiše antitelo.

Za imuniziranje protiv patogenih izazivača bolesti, kao što su bakterije, virusi, paraziti, koriste se peptidi, koji potiču od proteina jednog, odn. više pojedinih izazivača. Pri tome su pre svega pogodni proteini, koji ostaju zaštićeni (pošteđeni) od obično velikog broja mutacija tog izazivača. Objavljeni primeri su HPV16/17 (Human Papilloma Virus; Feltkamp et al., 1995), Hepatitis B Virus Ćore Antigen (Vitiello et al., 1995), Plasmodium Bergheii (VVidmann et al., 1992), Influenzavirus Nucleoprotein, Hepatitis C Virus.

Prema jednom od oblika izvođenja pronalaska, peptid, s obzirom na izazivanje anti--tumorskog odgovora, potiče od tumorskog antigena, pri čemu se farmaceutski preparat koristi kao tumorska vakcina. U tom slučaju, pri terapeutskoj primeni vakcine, peptid potiče od tumorskog antigena, koji je eksprimiran iz tumorskih ćelija pacijenta. Ovi tumorski antigeni, koje pacijent eksprimira u koncentraciji koja je isuviše mala, jesu npr. takvi, tako da ih ćelije tumora neće raspoznati kao strane.

Tumorski antigeni pacijenta mogu u toku postavljanja dijagnoze i plana terapije da budu utvrđeni pomoću standardnih metoda: tumorski antigeni mogu da se utvrde na jednostavan način, imunohistohemijski, pomoću antitela. Kad su tumorski antigeni enzimi, npr. tirozinaze, oni mogu da se dokažu pomoću enzimskih proba. Kod tumorskih antigena sa poznatim sekvencama može se primeniti RT-PCR--metoda (Boon, T., et al., 1994; Coulie, P.G., et al, 1994; Weynants, P., et al, 1994). Dalje metode za dokazivanje jesu probe na osnovu CTLs, specifične za tumorski antigen koji se određuje. Takve probe su opisali, između ostalih, Herin et al, 1987; Coulie et al, 1993; Cox et al, 1994; Rivoltini et al., 1995; Kawakami et al, 1995; kao i u WO 94/14459; u tim literaturnim navodima prikupljeni su i različiti tumorski antigeni, odn. peptid-epitopi koji potiču od njih.

Pregled poznatih, u okviru pronalaska upotrebljivih tumorskih antigena i od njih izvedenih peptida, dat je u tabeli.

Tumorska vakcina, koja sadrži peptide koji potiču od tumorskog antigena, može da bude upotrebljena ne samo terapeutski već i profilaktično. Kod profilaktične primene korisno je da se upotrebi smeša peptida koji potiču od pretstavnika tumorskih antigena koji se često javljaju. Kod terapeutske primene tumorske vakcine, prema pronalasku, koriste se jedan ili više peptida, od kojih se očekuje da se nalaze u tumorskom (im) antigenu (ima) pacijenta.

Tumorska vakcina, prema pronalasku, ima prednost u odnosu na ćelijsku vakcinu na bazi autolognih ćelija tumora, što je od terapeutske koristi i kod pacijenata u relativno ranom stadijumu (stadijum I i II) oboljenja, kod kojih nema dovoljno ćelija tumora za pripremanje ćelijske vakcine.

Prema jednom od oblika izvođenja pronalaska, koji ima prednost, peptid se s obzirom na izazivanje ćelijskog imunskog odgovora, određuje prema MHC-I- ili MIIC-II-podtipu, osobe koja se vakciniše; peptid dakle pokazuje sekvencu, odn. sadrži sekvencu, koja obezbeđuje njegovo vezivanje za MHC-molekul.

Prema jednom drugom obliku izvođenja pronalaska, farmaceutski preparat sadrži, u obliku u kome se primenjuje kao tumorska vakcina, osim nekog imuno-stimulišućeg polipeptid koji deluje imunostimulišući, naročito citokin. U jednom obliku izvođenja pronalaska, koji ima prdnost, kao citokin se koristi interleukin 2 (ILr2) ili GM-CSF, npr. u dozi od oko 1000 jedinica; dalji primeri za citokine jesu IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-p, IFN-y, IFN-co, TNF-a, kao i njihove kombinacije, npr.

IL-2 + IFN-7, IL-2 + IL-4, IL-2 + TNF-a ili TNF-a + IFN-y.

U jednom obliku izvođenja pronalaska, farmaceutski preparat služi za to da prouzrokuje tolerantnost prema proteinima, odn. njihovim fragmentima, koji izazivaju autoimunski indukovana oboljenja, dakle za terapiju autoimunskih oboljenja. Peptidi koji se koriste u ovom obliku izvođenja pronalaska potiču od proteina koji izazivaju autoimunska oboljenja.

Nasuprot primeni pronalaska kao tumorske vakcine ili kao vakcine protiv patogenog izazivača, kod koje se peptidi sa odsečkom izvornog proteina (tumorski antigen, odn. protein patogenog izazivača), uglavnom tako podudaraju, da peptid biva prepoznat kao "originalni antigen", kod primene pronalaska za lečenje autoimunskih oboljenja, između ostalog se koriste peptidi koji u odnosu na sekvencu amino kiseline izvornog proteina ispoljavaju kritične razlike. Na osnovu svoga anker-položaja ovi peptidi se doduše vezuju za MHC-molekul, ali ipak u svojim sekvencnim mutacijama, koje se javljaju, pokazuju da ti peptidi deluju kao antagonisti, koje aktivirane, specifične T-ćelije ponovo otpuštaju (Kersh i Allen, 1996).

Kao peptid-antagonisti pogodni su, kako "prirodni" antagonisti, koji su otkriveni u virusima (Bertoletti et al., 1994), tako i antagonisti koji su otkriveni kroz sistematsko istraživanje, npr. pretraživanjem peptid-biblioteka (banke podataka). Primer za peptid-aritagoniste jesu peptidi koji mogu da isključe T-ćelije, koje su specifične za Myelin Basic Protein, čije je delotvorno delovanje isprobano u eksperimentima sa životinjama (Brocke et al., 1996).

Peptid, koji treba da izazove ćelijski imunski odgovor, mora da može da se veže za MHC-molekul. Da bi se imunski odgovor u pacijentu izazvao, mora dakle u osobi koja se leči da postoji odgovarajući HLA-molekul, u njegovom repertoaru. Određivanje pacijentovog HLA-podtipa predstavlja dakle, s obzirom na izazivanje ćelijskog imunskog odgovora, jedan od bitnih preduslova za delotvornu primenu jednog peptida na tom pacijentu.

Pacijentov HLA-podtip može da se odredi standardnim metodama, kao što je test mikro-limfotoksičnosti (Practical Immunol., 1989). Taj test se zasniva na principu da se na limfocite izolovane iz pacijentove krvi prvo deluje sa antiserumom, ili sa monoklonskim antitelom protiv određenog HLA-molekula, u prisustvu kunićskog komplementa (C). Pozitivne ćelije se liziraju pa vezuju indikatorsku boju, dok neoštećene ćelije ostaju neobojene.

Za određivanje HLA-I- ili HLA-II-haplotipova nekog pacijenta može da se upotrebi i RT-PCR (Curr. Prot. Mol. Biol. glava 2 i 15). Za to se pacijentu uzima krv i iz nje se izoluje RNK. Ta RNK se prvo podvrgava reverznoj transkripciji, pri čemu nastaje pacijentova cDNK. cDNK služi kao matrica za lančanu reakciju polimeraze sa parovima primera, koji specifično izazivaju amplifikaciju DNK-fragmenta, koji predstavlja određeni HLA-haplotip. Ako se posle elektroforeze na agaroze-gelu pojavi DNK-traka, pacijent eksprimira odgovarajući HLA-molekul. Ukoliko se traka ne pojavi pacijent je zato negativan.

Definicija, prema pronalasku, korišćenog peptida, pomoću HLA-molekula određuje njega u pogledu njegovih anker-amino kiselina i njegovih dužina; definisani anker--položaji i dužine obezbeđuju da neki peptid odgovara vezivnom žljebu peptida, odgovarajućeg HLA-molekula pacijenta. Rezultat toga je da je imunski sistem stimulisan i da je izazvana ćeUjska imunska reakcija, koja se, u slučaju kada se koristi peptid dobijen od tumorskog antigena, usmerava protiv tumorskih ćelija pacijenta.

Peptidi, koji su pogodni za primenu u okviru ovog pronalaska, stoje na raspolaganju u širokoj lepezi. Njihova sekvenca može da potiče od prirodnih, imunogenih proteina, koji postoje, odn. njihovih ćelijskih proizvoda razlaganja, npr. od virusnih ili bakterijskih peptida, od tumorskih antigena, ili oni mogu biti antagonisti prema peptidima, koji potiču od proteina koji indukuju autoimuna oboljenja.

Pogodni peptidi mogu npr. da budu odabrani na osnovu literaturno poznatih peptid-sekvenci.

U pogledu izazivanja ćelijskog imunskog odgovora, peptidi mogu npr. da budu definisani na osnovu različitih HLA-motiva, peptida koji potiču iz imunogenih proteina, različitog porekla, koje su opisali Rammensee et al., 1993, Rammensee et al, 1995, Falk et al., 1991, koji odgovaraju vezivnim žljebovima molekula pojedinih HLA-podtipova.

Za peptide, koji imaju deo sekvence nekog proteina sa imunogenim delovanjem, može se na osnovu već poznatih ili eventualno onih koje će biti određene, sekvenci polipeptida, utvrditi, putem ujednačavanja sekvenci, vodeći računa o HLA-speci-fičnim zahtevima, koji peptidi pretstavljaju pogodne kandidate. Primeri za pogodne peptide nalaze se npr. u Rammensee et ai., 1993; Falk et al., 1991 i Rammensee, 1995; kao i u WO 91/09869 (HlV-peptidi); peptidi koji potiču od tumorskih antigena su, između ostalog, opisani u objavljenim internacionalnim patentnim prijavama WO 95/00159, WO 94/05304. Navođenje ovih literaturnih podataka i u njima citiranih članaka, u vezi sa peptidima, biće uzimano u obzir. U najpogodnije kandidate ubrajaju se peptidi čija je imunogenost već pokazana, dakle peptidi koji potiču od poznatih imunogena, npr. od virusnih ili bakterijskih proteina.

Umesto da se koriste originalni peptidi, koji odgovraju vezivnom žljebu MHC-I- i MHC-II-molekula, dakle peptidi koji neizmenjeni potiču od prirodnih proteina, mogu na osnovu minimalnih zahteva koje postavlja sekvenca originalnog peptida, kao podloga, da se izvrše varijacije koje se odnose na anker-pozicije i dužine, ukoliko tim varijacijama efektivna imunogenost peptida, koja se sastoji od njegovog afiniteta za vezivanje na MHC-molekul i njegove sposobnosti da stimuliše receptore T-ćelija, ne samo da nije oštećena, već je prvenstveno ojačana. U tom slučaju se dakle koriste veštački peptidi, prema pronalasku, koji su, odgovarajući zahtevima za sposobnost vezivanja za MHC-molekul, prikazani u osnovnim crtama. Tako se npr. polazeći od H2-K(i-liganada Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe lle

(LFEAIEGFI), menjaju amino kiseline, koje ne pretstavljaju anker-amino kiseline, da bi se dobio peptid sa sekvencom Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI); osim toga anker-amino kiselina Ile, u položaju 9, može da bude zamenjena sa Leu. Određivanje epitopa MHC-I-, odn. MHC-II-liganada, odn. njihovih varijacija, može npr. da se izvede na osnovu principa koji su opisali Rammensee et al., 1995. Dužina peptida odgovara, u slučaju njegovog određivanja na MHC-I-molekulu, prvenstveno minimalnoj sekvenci od 8 do 10 amino kiselina sa neophodnim anker-amino kiselinama. MHCII-vezivni-motiv, koji se pruža preko novih amino kiselina, pokazuje visok stepen degenerisanosti u anker-pozicijama. Nedavno su, polazeći od rendgenske strukturne analize MHOII-molekula, razvijene metode koje omogućuju tačnu analizu MHC-II-vezivnog-motiva, pa polazeći od toga dozvoljavaju varijacije peptid-sekvence (Rammensee et al., 1995, i tamo navedena originalna literatura).

Eventualno, peptid može da bude produžen takođe na C- i/ili na N-završetku, ukoliko to produžavanje ne utiče na sposobnost vezivanja za MHC-molekul, odn. produženi peptid može ćelijski da bude obrađen na minimalnu sekvencu.

Prema jednom obliku izvođenja pronalaska, peptid može da bude produžen sa negativno naelektrisanim amino kiselinama, ili negativno naelektrisane amino kiseline mogu da budu ugrađene u peptid, i to na drugim položajima nego gde su anker-amino kiseline, da bi se postiglo elektrostatičko vezivanje peptida na polikatjonski adjuvans, kao polilizin.

Pod izraz "peptidi" dolaze, u okviru ovog pronalaska, prema definiciji takođe i veći fragmenti proteina, odn. celi proteini, koji obezbeđuju da će oni, posle primene APCs, biti obrađeni u peptide koji "pasuju" na MHC-molekul.

Prema tom obliku izvođenja pronalaska, antigen se ne unosi u obliku peptida, već kao protein ili fragment proteina, odn. kao smeša proteina ili fragmenata proteina. Protein pretstavlja antigen, odn. tumorski antigen, od koga potiču, posle obrade dobijeni razlomljeni delovi. U tom obliku izvođenja postupka, adjuvans služi za to da omogući ili da pojača, opterećivanje ćelija, naročito APCs kao dendritskih ćelija ili makrofaga, sa tumorskim antigenom, odn. sa fragmentima. Usled toga prihvaćene proteine, odn. fragmente proteina, ćelije obrađuju, pa zatim mogu u MHC-sklopu da prezentiraju imunski efektorske ćelije, pa time da izazovu imunski odgovor, odn. da ga pojačaju (Braciale i Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski i Rock, 1995; York i Rock, 1996).

Oblik izvođenja pronalaska, prema kome se proteini, odn. veći fragmenti proteina, koriste kao antigeni, ima prednost, pošto postoji manja zavisnost od HLA-tipa pacijenta, jer se protein obrađuje u više razlomljenih delova pa se time pruža veća varijabilnost u pogledu "oblika koji pasuje" peptida.

U slučaju kada se upotrebljavaju proteini ili fragmenati proteina, identitet obrađenog finalnog proizvoda može da se dokaže pomoću hemijske analize (Edman-razgrađivanje ili masenaspektrometrija obrađenih fragmenata; vidi pregledni članak, Rammensee et al., 1995, kao i u njemu navedenu originalnu literaturu), ili biološkim probama (sposobnost APCs za stimulisanje T-ćelija, koje su specifične za obrađene fragmente).

Izbor peptid-kandidata, koji su pogodni da izazovu ćelijski imunski odgovor, principielno se izvodi u više stupnjeva: obično se kandidati, korisno je u serijskim ogledima, prvo ispitaju u testu vezivanja peptida, s obzirom na njihovu sposobnost vezivanja za MHC-molekul.

Jedna pogodna metoda ispitivanja zasniva se na sposobnosti peptida da mogu da stabilizuju prazne MHC-molekule, kako su npr. opisali Stuber et al., 1994, i Mclnlvre et al., 1996. Pri tome se peptid nanosi na ćelije, koje su u stanju da eksprimiraju odgovarajući MHC-molekul, ali da zbog genetskog nedostatka ne vezuju endogene peptide u MHC-sklop. Pogodne ćelijske linije tog tipa jesu RMA-S (miš) i T2 (humana), odn. njihove transficirane varijante. Tada se mogu dokazati MHC-molekuli koje je stabilizirao odgovarajući peptid, prvenstveno pomoću FACS--analize (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage ™ User's Guide, 1994; CELL Quest™ User's Guide, 1994), zasnovane na protočnoj citometriji. Stabilni MHC--molekuli mogu da se dokažu pomoću pogodnog anti-MHC-antitela i sa fluorescentnom bojom, npr. FITC (fluoresceinizotiocijanat), markiranim drugim (npr. poliklonalnim) antitelom. Zatim se, pri proricanju, pojedinačne ćelije pobuđuju pomoću lasera određene talasne dužine; meri se fluorescentnost koja se emituje, koja zavisi od količine peptida vezane za ćeliju.

Dalja metoda za određivanje količine vezanog peptida je Scatchard-Plot, kao što su opisali Sette et al., 1994. Za to se koristi peptid, koji je npr. markiran sa I<125>, pa inkubiran preko noći, na 4°C, sa izolovanim ili rekombinantno pripremljenim MHC-molekulima, sa različitim koncentracijama peptida. Da bi se odredila nespecifična interakcija peptida, u neke od proba se dodaje višak nemarkiranog peptida, koji sprečava nespecifičnu interakciju markiranog peptida. Potom se uklanja nespecifično vezan peptid, npr. pomoću gelhromatografije. Količina vezanog peptida se onda određuje u scintilacionom brojaču, na osnovu emitovane radioaktivnosti. Interpretacija tako dobijenih podataka vrši se prema standardnim metodama.

Pregled metoda za karakterizaciju MHC/peptid-interakcije, za analizu MHC--liganada i za probe vezivanja peptida, koje se u okviru ovog pronalaska mogu koristiti, dali su Rammensee et al., 1995.

U sledećem stupnju, peptid-kandidati sa dobrim osobinama vezivanja, ispituju se u pogledu svoje imunogenosti: Izazivanje ćelijskog imunskog odgovora može da bude potvrđeno dokazivanjem peptid-specifičnog CTLs (Current Protocols in Immunologv, glava 3). Dalji dokaz za postojanje ćelijskog imunskog odgovora je dobijen tada, kada se u otsustvu T-ćelija u nekoj opitnoj životinji (što se postiže time što se životinja tretira sa antitelima koje depletiraju (iscrpljuju) CD4- ili CD8-ćelije), ne dobija imunski odgovor (Current Protocols in Immunology, glava 3).

Ćelijski imunski odgovor može lakođe da se dobije pomoću dokaza "delayed-type hypersensitivity" (DTH)-reakcije u imuniziranim životinjama. Za to se peptidi

injiciraju u taban miša pa se meri otok na tom mestu (Grohman et al., 1995; Puccetti et al, 1994).

Indukovanje humoralnog imunskog odgovora pomoću peptida, a strani antigeni za organizam su npr. antigeni koje tretirani organizam eksprimira u maloj koncentraciji, može da se odredi putem dokazivanja specifičnih antitela u serumu. Pogodan postupak za određivanje koncentracije antitela u serumu jeste Enzvme Linked Immunoassav (ELISA). Pri tom se specifična antitela, posle vezivanja za peptid upotrebljen za imunizovanje, dokazuju bojenom reakcijom. Alternativna metoda je Western Blot. U njoj se specifična serumska antitela vezuju za peptid imobiliziran na membrani. Vezana antitela se zatim dokazuju opet pomoću bojene reakcije (referenca za obe metode: Current Protocols in Immunologv. Editors: Coligan et al, 1991).

Pre svega, posle vakcinacije sa stranim antigenima, npr. virusnog porekla, treba očekivati stvaranje antitela. Ipak, ne treba isključiti da se specifična antitela stvaraju takođe i protiv mutiranih ili preeksprimiranih peptida, koji potiču od ćelijskih tumorskih antigena. Uništenje tumora pomoću takvih antitela moglo bi, posle vezivanja antitela za ćelije tumora, da se dogodi delovanjem drugih komponenata imunskog sistema, kao npr. komplementa, antitela zavisnih od citotoksičnosti (ADCC) ili fagocitoze pomoću makrofaga (Roitt I.M., Brostoff J., Male D.K. Immunologv, Churchill Livingstone).

Izazivanje ćelijskog imunskog odgovora pomoću peptida, koji potiču od proteina, čije imunogeno dejstvo nije poznato, može npr. da se ispita kao što su opisali

Rivoltini et al, 1995, ili Kawakami et al., 1994 a. Za to su potrebne T-ćelije koje željeni peptid mogu da prepoznaju, kada ga MHC-molekuli prezentiraju. U slučaju peptida, koji potiču od ćelija tumora, odgovarajuće T-ćelije se dobijaju iz limfocita infiltriranih tumorom (TILs), kao što su Kawakami et al, 1994 b opisali; u slučaju stranih peptida, takve T-ćelije se dobijaju slično iz periferne krvi. T-ćelije se inkubiraju sa ćelijskim linijama kao T2 (Alexander et al., 1989) ili RMA-S (Karre et al., 1986), koje su tretirane sa odgovarajućim peptidom, pa se one inkubiraju i liziraju, ukoliko se radi o imunogenom peptidu.

Dalja mogućnost za ispitivanje peptid-kandidata, koje vezuje MHC, u pogledu njihove imunogenosti, sastoji se u tome da se ispita vezivanje peptida za T2-ćelije. Takav test se zasniva na svojstvu T2-ćelija (Alexander et al., 1989) ili RMA-S-ćelija (Karre et al., 1986) da nedostaju u transportnom mehanizmu TAP-peptida i da će tek tada dati stabilne MHC-molekule, kada se na njih nanesu peptidi, koji će se pojaviti u MHC-sklopu. Za test se koriste npr. T2-ćelije ili RMA-S-ćelije koje su stabilno transficirane sa HLA-genom, npr. sa HLAA1- i/ili HLA-A2-genima. Ako se na ćelije deluje sa peptidima, dobri HLA-ligandi su, ukoliko se oni u HLA-sklopu tako pojave da imunski sistem može da ih prepozna kao strane, takvi peptidi deluju tako da se HLA-molekuli u zanačajnijoj meri pojave na površini ćelije. Dokazivanje HlAs na površini ćelije, npr. pomoću monoklonalnog antitela, omogućuje identifikovanje pogodnih peptida (Malnati et al, 1995; Sykulev et al., 1994). I ovde je takođe preporučljivo da se upoterbi neki standardni peptid sa poznato dobrom sposobnošću HLA-vezivanja.

S obzirom na što je moguće širu primenljivost farmaceutskih preparata, prema pronalasku, korisno je da se koristi smeša više peptida, od kojih svaki može da se veže na neki drugi MHC-molekul, prvenstveno na jedan, od dva ili tri najčešće zastupljena MHC-podtipa. Sa vakcinom, na osnovu smeše peptida, koji mogu da se vežu na ove haplotipove, široka populacija pacijenata može biti obuhvaćena.

Prema jednom od oblika izvođenja pronalaska, vakcina može da sadrži više peptida sa različitim sekvencama. U tom slučaju, upotrebljeni peptidi mogu, sjedne strane, da se razlikuju po tome što se vezuju za različite HLA-podtipove. Time se može postići da više, odn. svi HLA-podtipovi nekog pacijenta ili veće grupe pacijenata budu obuhvaćeni.

Jedna dalja, eventualno dodatna, mogućnost promene, u pogledu upotrebljenih peptida, može da se sastoji u tome da se peptidi, koji se za jedan određeni HLA--podtip vezuju, ne razlikuju u pogledu njihove za HLA-vezivanje merodavne sekvence, ukoliko npr. potiču od različitih proteina istog patogenog izazivača ili od različitih izazivača. Takvom mogućnošću promene može da se postigne pojačavanje stimulisanja imunskog odgovora, odn. imunizovanje protiv različitih izazivača.

Količina delotvornog peptida, u preparatu prema pronalasku, može da varira u širokom opsegu. Količina peptida zavisi, između ostalog, od načina davanja i od odgovarajuće formulacije. Količina peptida koja se daje može da iznosi oko 1,0 ug do oko 5000 ug po dozi, obično 1,0 ug do oko 1000 ug, naročito oko 10 ug do oko 500 ug. Može da se daje jednom ili više puta, a kod davanja više puta korisno je bar triput. Naročito kod terapeutske primene, davanje može da bude u intervalima (npr. od 1 x nedeljno do 1 x mesečno) koji se protežu u proizvoljno dugom vremenskom periodu, koji zavisi od specifičnog imunskog stanja pacijenta, odn. od toka bolesti.

Farmaceutski preparat prema pronalasku, može takođe da se primeni iex vivaprincip mogućeex vivoprimene sastoji se u tome da se APCs, npr. dendritske ćelije,ex vivokultivišu, da se kultura ćelija inkubira sa preparatom prema pronalasku i da se APCs, koje sada sadrže peptid u MHC-sklopu, dadu osobi koja se leči. Za ovu mogućnost primene mogu da se upotrebe metode poznate iz literature, kao npr. one koje su opisali Porgador i Gilboa, 1995; Young i Inabe, 1996.

Adjuvans, koji sadrži preparat prema pronalasku, ima osobinu da olakšava ulaz peptida u ćelije, odn. vezivanje peptida za ćelije pacijenta. Adjuvans može npr. bar kratkotrajno da učini propustljivom membrane ciljnih ćelija, u koje peptid treba da stigne, kako bi se na taj način peptid uneo u ćeliju. Za to bi prednost trebalo da pretstavlja, ali nije bezuslovno potrebno, da peptid bude vezan za adjuvans, npr. usled elektrostatičkog međudejstva između elektronegativnog peptida i polikatjonskoga adjuvansa. Unošenje peptida u ćeliju može biti izazvano i time što peptid, zbog svoje prostorne blizine sa membranom ćelije, kroz nju uspeva da prođe, čim adjuvans deluje na njenu propustljivost. Delovanje adjuvansa može takođe da se zasniva i na tome što se, kritična koncentracija peptida za ulazak u ćeliju povećava na površini ćelije, ili što se javlja fagocitoza ili tečan transport (pinocitoza) peptida.

Iznenađujuće je da prisustvo adjuvansa ne pojačava samo prihvatanje peptida u ćeliji, već dovodi takođe i do pojačanja imunomodulatornog delovanja peptida, što bi trebalo da izazove korektnu prezentaciju peptida pomoću MHC-molekula.

Prema jednom od oblika izvođenja, mogu adjuvensi, između ostalog, načelno da budu sve one supstance koje izazivaju permeabilizovanje membrane, koje se koriste za prenošenje nukleinskih kiselina u ćeliju; u vezi sa tim treba uzeti u obzir publikaciju WO 93/19768, u kojoj su takve supstance navedene.

Prema jednom od oblika izvođenja pronalaska, koji ima prednost, adjuvans je bazna poliamino kiselina ili smeša baznih poliamino kiselina.

Stepen polimerizacije poliamino kiselina može da varira u širokom opsegu. On iznosi oko 5 do oko 1000, naročito oko 15 do oko 500.

U okviru ovog pronalaska prednost ima upotreba poliarginina kao adjuvensa.

Jedan drugi, u okviru ovog pronalaska, adjuvens koji ima prednost jeste polilizin.

Primeri za dalja, naročito polikatjonska, organska jedinjenja (bazne poliamino kiseline) jesu poliornitin, histoni, protamini, polietilenamini, ili njihove smeše.

Adjuvans je eventualno konjugovan sa nekim ćelijskim ligandima (npr. sa transferinom, gpl20, LDL (Low Densitiy Lipoprotein), a-fetuinom, EGF (Epidermal Growth Factor)-peptidima ili sa nekim pretstavnikom drugih ćelijskih liganada, koji su za prenošenje DNK pomoću endocitoze, koja receptorski posreduje, opisani u WO 93/07283), sa ostacima ugljenih hidrata, kao manoza ili fukoza (ligandi za makrofage) ili sa antitelom/ima (ili njihovim fragmentima) protiv proteina na površini ćelije.

Eventualno su polikatjonski adjuvansi, kao polilizin ili poliarginin, koji su eventualno konjugovani sa nekim ćelijskim ligandima, sastavni deo nekog kompleksa sa DNK, npr. u obliku plazmid-DNK, koji ne sadrži sekvence koje kodiraju funkcionalne peptide.

Ne oslanjajući se čvrsto na teoriju, moglo bi delovanje farmaceutskog preparata prema pronalasku da se sastoji u tome, što peptid pomoću adjuvansa prodire u ciljne ćelije ili se vezuje za ćelije, koje se nalaze u endodermalnoj oblasti kože. Ciljne ćelije su, između ostalih, ćelije koje daju antigen, koje će eventualno posle obrade, prezentirati peptid B- i/ili T-ćelijama. Primeri za ciljne ćelije su makrofage, fibroblasti, keratinociti, Langerhans-ćelije, dendritske ćelije ili B-ćelije.

U okviru ovog pronalaska ispitivano je, da li male peptide, u prisustvu baznih poliamino kiselina ili glikoziliranih oblika polikatjona, u većoj meri primaju ćelije, vrste makrofaga, koje daju antigen (APCs). Na osnovu korišćenih ostataka šećera poznato je da njih prihvataju makrofage preko endocitoze, posredstvom receptora. Na osnovu ponašanja APCs zna se, da onein vivopretstavljaju tip ćelije koji prihvata peptide i daje ih drugim imunskim ćelijama. Rezultati ogledain vitro,koji pokazuju da APCs, u prisustvu ispitivanih adjuvansa, endocitiraju povećanu količinu peptid-antigena, ukazuju na to da su takvi adjuvansi pogodni takođe iin vitro,da pojačaju davanje peptida kao i njihovo aktiviranje u odnosu na citotoksične efektorske ćelije, što dovodi do ukupno pojačanog imunskog odgovora protiv cilja koji sadrži vakcina.

Kao adjuvansi mogu takođe da se upotrebe i komponente u obliku (čvrstih) čestica, eventualno dodatno uz gore pomenute adjuvanse. Kao čestice, načelno su pogodni materijali koji se takođe koriste kao materijali u kolonama za sintezu peptida, npr. silikagel ili veštačke smole, ukoliko su fiziološki prihvatljivi i ako se od njih mogu pripremiti čestice koje su dovoljno male da bi dospele u ćeliju. Pomoću adjuvansa u obliku čestica mogu da se dostignu visoke lokalne koncentracije peptida, što olakšava njegov ulazak u ćelije.

Vrsta upotrebljenog adjuvansa, korist od njegovog modifikovanja ćelijskim ligandima, odn. dodavanje DNK, kao i potrebne količine adjuvansa, u odnosu na peptid, mogu pojedinačno da budu empirijski određeni, npr. pojedinačni odnos peptida prema adjuvansu, koji u principu može da varira u širokom opsegu, može da bude određen pomoću titracija.

Testiranje adjuvansa može u principu da se izvede prema istim metodama kao i testiranje peptida, eventualno u više stupnjeva: vSposobnost nekog adjuvansa da poveća vezivanje i/ili internaliziranje nekog peptida u APCs, može npr. da se izmeri u prvom stupnju, pošto se APCs inkubira sa fluorescecno-markiranim (obeleženim) peptidima i adjuvansom. Povećano primanje, odn. vezivanje, koje izaziva adjuvans, može da se odredi pomoću protočne citometrije, upoređivanjem sa ćelijama na koje je delovano samo sa peptidom.

II drugom stupnju, mogu adjuvansi koje treba testirati, da sein vitroispitaju na to, da li i u kojoj meri njihovo prisustvo dovodi do prezentacije nekog peptida na APCs, pri čemu se, prema gore opisanim metodama za testiranje peptida, može meriti MHC-koncentracija na ćelijama.

Dalja mogućnost za testiranje efikasnosti nekog adjuvansa jestein vitroprimena model-sistema. Pri tome se APCs inkubiraju zajedno sa adjuvansom i peptidom, pa se meri relaivno aktiviranje klona T-ćelije, koji upotrebljeni peptid specifično prepoznaje (Coligan et al., 1991; Lopez et al., 1993).

Efikasnost formulacije može takođe da se pokaže i preko ćelijskog imunskog odgovora, putem dokaza "delayed-type hypersensitivity" (DTH)-reakcije u imunizovanim životinjama.

Na kraju, meri se imunomodulatorno delovanje formulacije u opitu sa životinjama. Za to mogu, između ostalog, da se upotrebe prihvaćeni tumorski modeli, u kojima su poznate peptid-sekvence koje imunske ćelije prepoznaju. Vakcina, koja sadrži peptid i adjuvans, upotrebljava se sa promenljivim odnosima peptida u odnosu na adjuvans i ukupnu količinu. Zaštita od porasta tumora je mera delotvornosti tumorske vakcine.

Farmaceutski preparat može da se primenjuje parenteralno, površinski, oralno ili lokalno. Prvenstveno se primenjuje parenteralno, npr. subkutano, intradermalno ili intramuskularno, prvenstveno subkutano ili intradermalno, da bi se pre svega došlo do ćelija kože (keratinociti, fibroblasti), dendritskih ćelija, Langerhans-ćelija ili makrofaga, kao ciljnih ćelija. U okviru terapije tumora tumorska vakcina može da se primeni i intratumorski.

Preparat prema pronalasku, za parenteralnu primenu, obično je prisutan kao rastvor ili suspenzija peptida i adjuvansa, u nekom farmaceutski prihvatljivom nosaču, prvenstveno u vodenom nosaču. Kao vodeni nosači mogu, npr. da se koriste voda, puferovana voda, rastvor soli (0,4%), rastvor glicina (0,3%), hijaluronska kiselina i slični poznati nosači. Osim vodenih nosača mogu da se upotrebe i rastvarači, kao dimetilsulfoksid, propilenglikol, dimetilformamid i njihove smeše. Osim toga, preparat može da sadrži farmaceutski prihvatljiva pomoćna sredstva, kao supstance za puferovanje, kao i neorganske soli, da bi se obezbedili normalni osmotski pritisak i/ili delotvorno liofiliziranje. Primeri za takve dodatke su soli natrijum i kalijuma, npr. hloridi i fosfati, saharoza, glukoza, proteinski hidrolizati, dekstran, polivinilpirolidon ili polietilenglikol. Preparati mogu da se sterilišu postojećim tehnikama, npr. sterilnim filtriranjem. U tom obliku preparat može neposredno da se puni ili i da se liofilizira pa da se pre upotrebe meša sa nekim sterilnim rastvorom.

U jednom od oblika pripremanja, farmaceutski preparat prema pronalasku je formulisan za lokalnu primenu, npr. za dermalnu, odn. transdermalnu primenu. Farmaceutski preparat može npr. da bude kao hidrogel, na bazi poliakrilne kiseline ili poliakrilamida (kao npr. Dolobene<®>, Merckle), kao mast, npr. sa polietilenglikolom (PEG) kao podlogom, kao standardna mast DAB 8 (50% PEG 300, 50% PEG 1500), ili kao emulzija, pre svega kao mikroemulzija na bazi vode u ulju, odn. ulja u vodi, eventualno i sa dodatkom lipozoma. Kao ubrzivači permeacije (šleper) pogodni su, između ostalog, sulfoksid-derivati kao dimetilsulfoksid (DMSO) ili decilmetilsulfoksid (decil-MSO), kao transkutol (dietilenglikolmono-etiletar) ili ciklodekstrini, dalje, pirolidoni, npr. 2-pirolidon, N-metil-2-pirolidon, 2-pirolidon-5-karbonska kiselina ili biološki razgradiv N-(2-hidroksietil)-2-pirolidon ili njegovi estri masnih kiselina, derivati karbamida, kao dodecilkarbamid, 1,3-didodecilkarbamid i 1,3-difenilfkarbamid, terpeni, npr. D-limonen, menton, a-terpinol, karvol, limonenoksid ili 1,8-cineol.

Dalji oblici primene su aerosolovi, npr. za upotrebu kao nosni sprej ili za inhaliranje.

Preparat prema pronalasku može takođe da se daje i sa lipozomima, u obliku emulzija, pena, micela, nerastvornih monoslojeva (monolavers), fosfolipidnih disperzija, slojevitih nanosa i slično. Oni služe kao podloga (vehikel), da bi preneli peptide ka usmerenom cilju, ka nekom određenom tkivu, npr. limfoidnom tkivu ili tkivu tumora, odn. da bi produžili poluvreme trajanja peptida.

U slučaju kada je preparat prema pronalasku formulisan za lokalnu primenu, on može da sadrži i UV-absorber, da bi npr. kod profilaksne primene protiv melanoma jednovremeno delovao i kao sredstvo za zaštitu od sunca.

Stručnjak može odgovarajuća pomoćna sredstva i standardne uređaje za pripremanje formulacija da nađe u knjizi kao "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990.

Sadržaj slika

SI. 1: Vakcinisanje DBA/2- miševa protiv mastocitoma P815

SI. 2: Vakcinisanje DBA/2- miševa protiv mastocitoma P815 sa vakcinom koja

sadrži samo jedan peptid

SI. 3: Vakcinisanje DBA/2- miševa protiv melanoma M-3 sa smešom peptida

SI. 4: Vakcinisane DBA-2 miševa protiv metastaza melanoma M-3

SI. 5: Testiranje pojačavanja vezivanja peptida na APCs pomoću baznih

poliamino kiselina

SI 6: Testiranje permeabilizovanja ćelijske membrane pomoću baznih

poliamino kiselina

SI. 7: Testiranje internaliziranja peptida pomoću baznih poliamino kiselina

U sledećim primerima, ukoliko drugo nije navedeno, upotrebljeni su sledeći materijali i metode:

A) Ćelijske linije

Od ATCC dobijene su, mišjeg melanoma ćelijska linija Cloudman S91 (klon M-3; ATCC No. CCL 53.1), mastocitomska ćelijska Unija P815 (ATCC Nr. TIB 64) i monocita-makrofaga ćeUjska linija P388D1 (ATCC TIB 63).

B) Sinteza peptida

Peptidi su sintetizovani u uređaju za sintezu peptida (Peptid-Svnthesizer, Modeli 433 A sa Feedbackmonitor-om, Applied Biosvstems, Foster City, Kanada), uz upotrebu TentaGel-a S PHB (Rapp, Tibingen), kao čvrste faze, prema Fmoc-metodi (HBTU-aktiviranje, Fastmoc™, razmera 0:25 mmol). Peptidi su rastvarani u IM TEAA, pH 7,3, pa su prečišćavani pomoću reverzne hromatografije na Vydac C 18-koloni. Sekvence su potvrđivane pomoću posebne metode masene spektrometrije (Flugzeitmassenspektrometrie) na uređaju MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Kanada.

C) Spisak korišćenih peptida

Pepiiđne smeše:

Peptidna smeša I, za M-3 melanom-vakcinu:

kpepl43, kpepl45, kpepl46, kpeplSO.

Peplidna smeša III, za mastocitom P815-vakcinu:

kpepll?, kpepllS, Kpepl62, Kpepl63, Kpepl64

D) Pripremanje vakcine

Dl) Vakcina sa jednim peptidom

a) Kontrolne vakcine sa jednim peptidom, bez adjuvansa, pripremane su uzimanjem peptida u koncetraciji od 1 mg/ml u PBS. Vreme inkubacije,

do injekcije iznosilo je4h, na sobnoj temperaturi.

b) Vakcine sa jednim peptidom, sa polilizinom kao adjuvansom, pripremane su mešanjem peptida i polilizina u navedenim količinama u HBS-u. Vreme

inkubacije, do injekcije iznosilo je 4 h, na sobnoj temperaturi.

i) Da bi se dobila vakcina koja sadrži 16 ug delotvornog peptida, mešano je 11,8 ug polilizina sal60 ug peptida kpepll7, u ukupnoj zapremini od 1 ml HBS.

ii) Da bi se dobila vakcina koja sadrži 100 ug delotvornog peptida, mešano je 74 ug polilizina sa 1 mg peptida kpepll7, u ukupnoj zapremini od 1 ml HBS. c) Kontrolne vakcine sa nekompletnim Freund's adjuvansom (IFA), pripremane su emulgovanjem peptida i IFA, u navedenim količinama.

Vreme inkubiranja do injekcije iznosilo je 30 min, na sobnoj temperaturi.

i) Za kontrolnu vakcinu, koja sadrži 16 ug delotvornog peptida, emulgovano

je 192 ug peptida kpepll7 u 600 ul HBS, sa 600 ul IFA.

ii) Za kontrolnu vakcinu, koja sadrži 100 ug delotvornog peptida,

emulgovano je 1,2 mg peptida kpepll7 u 600 ul HBS sa 600 ul IFA.

D2) Peptidne smeše kao vakcine

a) Peptidna smeša I, kao kontrolna vakcina bez adjuvansa, sadržavala je 250 ug svakog od peptida kpepl43, kpepl45, kpepl46, kpepl50, u ukupnoj

zapremini od 1 ml PBS.

b) Peptidna smeša III, kao kontrolna vakcina bez adjuvansa, sadržavala je 250 ug svakog od peptida kpepll7, kpepll8, Kpepl62, Kpepl63, Kpepl64,

u ukupnoj zapremini od 1 ml PBS.

c) Peptidna smeša I, kao vakcina sa polilizinom kao adjuvansom, pripremana je mešanjem 1 mg peptidne smeše I (koja sadrži 250 ug svakog od

peptida) sa 74 ug polilizina u HBS. Vreme inkubacije do injekcije iznosilo je 4 h na sobnoj temperaturi.

d) Peptidna smeša III, kao vakcina sa polilizinom kao adjuvansom, pripremana je mešanjem 1,25 mg peptidne smeše III (koja sadrži 250 ug

svakog od peptida) sa 93 ug polilizina u HBS. Vreme inkubacije do injekcije iznosilo je 4 h na sobnoj temperaturi.

e) Peptidna smeša I, kao kontrolna vakcina sa nekompletnim Freund's adjuvansom pripremana je emulgovanjem 1,2 mg peptidne smeše I (koja

sadrži 300 ug svakog od peptida) u 600 ul HBS sa 600 ul IFA. Vreme inkubacije do injekcije iznosilo je 30 min na sobnoj temperaturi.

f) Peptidna smeša III, kao kontrolna vakcina sa nekompletnim Freund's adjuvansom pripremana je emulogovanjem 1,5 mg peptidne smeše III u

600ul HBS ( koja sadrži 300 ug svakog od peptida) sa 600 ul IFA. Vreme inkubacije pre injekcije iznosilo je 30 min na sobnoj temperaturi.

g) Za lokalnu primenu, sa polilizinom kao adjuvansom, inkubiran je 1 mg peptidne smeše I (koja sadrži 250 ug svakog od peptida) sa 74 ug

polilizina, tokom 4 h u ukupnoj zapremini od 400 ul HBS. Dobijena smeša je umešana u 1,6 g hidrogela DOLOBENE (Merckle).

h) Za lokalnu primenu, kontrolne vakcine bez adjuvansa, rastrljan je 1 mg peptidne smeše I (koja sadrži 250 ug svakog od peptida), u ukupnoj

zapremini od 200 ul HBS, u 1,8 g hidrogela DOLOBENE (Merckle).

i) Pripremanje sa fukozom kuplovanog polilizina (dužina lanca: 240)

izvođeno je prema metodi koju su opisali MacBroom et al., 1992, pri čemu je ostvarena supstizucija od oko 40%.

j) Kada su korišćeni trasferin/polilizin-konjugati (pripremljeni kao što je opisano u WO 93/07283), količina je tako podešavana da apsolutna količina polilizina iznosi 75 ug na 1 mg peptida. Kada je trebalo da plazmid-DNK (prazan plazmid pSP65, bez LPS, Boehringer Manhajm) bude integriran u kompleks, odnos je iznosio 37,5 ug DNK/75ugpolilizina/1 u g peptida. U slučaju korišćenja 160 ug, umesto 1 mg peptida, količine ostalih komponenata su smanjene za isti faktor (6,25).

E) Injekcija vakcine

Pre subkutane injekcije, miševi su u grupama do po osam životinja anestezirani u izolovanoj komori sa vazduhom. Posle 3,5 min tretiranja sa halotanom (4% u 02, broj davanja 4), miševi su oko 1 min bili opijeni; za to vreme je vakcina injicirana subkutano.

Interperitonealna injekcija je davan bez prethodnog anesteziranja. Zapremina injekcije za svaku vakcinu bila je 100 ul po životinji, što odgovara 100 ug pojedinačnog peptida ili peptidne smeše I po životinji. U slučaju peptidne smeše III davano je 125 ug ukupne peptidne smeše, po mišu.

F) Lokalna primena vakcine

Po mišu, u kožu obrijane životinje, utrljavano je 200 mg masti, koja je sadržavala 100 ug peptida ili peptidne smeše I, odn. 125 ug peptidne smeše I, i to u cela leđa i na uši. Tačna količina je kontrolisana pomoću vage.

G) Primena vakcine protiv rasta tumora na modelu miša

Protokol o testiranju delovanja vakcine protiv raka u profilaksnom ili terapeutskom modelu sa mišom, odgovara, ukoliko ništa drugo nije navedeno, principu opisanom u WO 94/21808, pri čemu je kao model miša korišćen DBA/2-model.

Primer 1

Vakcinisanje DBA/2-miševa protiv mastocitoma P815

Sa 11,8 ug polilizina 300, u 500 ul HBS, pomešano je 160 ug peptida sekvence KYQAVTTTL (kpepll8), koji potiče od liganada od H2-K<d>, tumorskog antigena P815, koji su opisali Lethe et al, 1992, pa je 4 h inkubirano na sobnoj temperaturi. Zatim je u to dodato 500 ul EBSS (Earl's-ov puferovan rastvor soli). Osam miševa je, sa jednonedeljnim razmakom, dobilo po 100 pl pripremljene mešavine. Posle ovog predimuniziranja, kroz jednu nedelju, svakom mišu je usađivan tumor, injiciranjem, kontralateralno, 5 x IO<4>ćelija, raastocitomske ćelijske linije P815 (ATCC Nr. TIB 64; ove ćelije eksprimiraju tumorski antigen od koga potiče peptid P815), u 100 ul EBSS. Rezultat ovog ogleda je prikazan na si. 1 (ispunjeni kvadrati).

U paralelnom ogledu, mešano je 200 ug peptida sa 500 ul HBS, pa je zatim emulgovano sa 500 ul Freund's adjuvansa. Sa po 100 ul pripremljene emulzije predimunizirano je 8 miševa, pa im je zatim usađen tumor sa P815-ćelijama, kao što je gore opisano (si. 1: popunjeni krugovi).

Za dalje uporedne oglede pripremljena je ćelijska tumorska vakcina na sledeći način: U 500 ul HBS-pufera pomeša se 160 ug peptida kpep 118 sa 3 ug transferin--polilizina (TfpL), 10 ug pL i 6 ug psp65 (bez LPS). Posle 30 min na sobnoj temperaturi, gornji rastvor je unet u T 75 bocu za ćelijske kulture, sa 1,5 x IO<6>ćelija alogene fibroblastne ćelijske linije NIH3T3 (ATCC Nr. CRL 1658) u 20 ml DMEM-medijuma (10% FCS, 20 raM glukoze) pa je inkubirano na 37°C. Posle 3 h u ćelije je dodato 15 ml svežeg medijuma, pa je tokom noći inkubirano na 37°C i 5% CO2. Četiri sata pre primene ćelije su ozračene sa 20 Gy. Dalja dorada vakcine izvedena je kao što je opisano u WO 94/21808. Predimuniziranje sa ovom vakcinom vršeno je sa jednonedeljnim razmakom, sa 10<f>) ćelija; posle sledeće nedelje vršeno je usađivanje tumora, kao što je gore opisano (si. 1: popunjeni trouglovi). Pokazalo se, da vakcina, koja sadrži peptid sjedinjen sa polilizinom, najbolje štiti miševe od stvaranja tumora.

Primer 2

Vakcinisanje DBA/2-miševa protiv mastocitoma P815, sa vakcinom sa jednim peptidom

Tri vakcine sa jednim peptidom, koje sadrže ili peptid kpepll7 sam u PBS (si. 2a), peptid kpepll7, emulgovan u IFA (si. 2b), ili peptid kpepll7 sa polilizinom (dužina lanca: 240) kao adjuvansom (si. 2c), ispitane su u pogledu svog zaštitnog dejstva protiv izazivanja P815-tumora. Vakcine su pripremljene kao što je gore opisano u odeljku D. Zapremina injekcije uvek je bila 100 ul; injekcija je davana subkutano (sc) ili intraperitonealno (ip). Naivni miševi su služili za negativnu kontrolu, vakcina sa celim ćelijama, koja se sastojala od P815 ćelija koje luče GM-CSF, za pozitivnu kontrolu (P815-GM-CSF; 10<5>ćelija u 100 ul, subkutano je injicirano svakoj životinji). Svaka od oglednih grupa imala je osam životinja, a vršena su tri vakcinisanja sa sedmodnevnim razmakom. Nedelju dana posle poslednjeg vakcinisanja životinjama je kontralateralno davan izazivač tumora sa 5 x IO<4>P815--ćelija. Životinje su svakodnevno pregledane, a pojava tumora je kontrolisana u nedeljnim razmacima. Peptid kpepll7, sa polilizinom kao adjuvansom, postizao je najbolje anti-tumorsko dejstvo, kada je 100 ug po životinji injicirano subkutano (zaštićene tri od osam životinja). Taj efekat je bio odprilike toliko dobar kao što je postizano sa vakcinom od celih ćelija (zaštićene četiri od osam životinja). 16 \ xg peptida zajedno sa polilizinom, po životinji, bilo je manje delotvorno (zaštićene dve životinje), ali primetno bolje nego 100 ug peptida u PBS (si. 2a, bez zaštitnog delovanja). Takođe, emulgovan u IFA peptid nije imao dejstvo koje ispoljava zajedno sa polilizinom (si. 2c).

Prime r 3

Vakcinisanje DBA/2-miševa protiv mastocitoma P815, tumorskom vakcinom koja sadrži sam P815-peptid ili smešu P815-peptida.

Za pripremanje vakcine upotrebljeni su sledeći peptidi:

kpepll8 (100 ug po injekciji)

peptidna smeša III (kpepll7, kpepll8, kpepl62, kpepl63, kpepl64; ova peptidna smeša sadržavala je sve do sada poznate P815-peptide; svakom od injekcija davano je po 25 ug svakog peptida)

Za pozitivnu kontrolu korišćene su P815-ćelije koje luče GM-CSF.

U preliminarnim ogledima, pokazao se kpepll7 kao peptid sa najboljim zaštitnim dejstvom protiv izazivača P815-tumora, kada se koristi 100 ug peptida zajedno sa polilizinom (7,5 ug polilizina/100 ug petida, što odgovara standardnom odnosu; polilizin: duzina lanca = 200). Manja količina (16 ug) kpepll7 bila je manje delotvorna. U ovom primeru injicirano je 100 ug kpepllS po životinji, i to jedanput samo sa polilizinom (grupa B), jedanput sa transferin-polilizinom (grupa C) i jedanput sa transferin-polilizinom/DNK (grupa D). Za kontrolu je upotrebljavan kpepll8 sa IFA. U ovom eksperimentu sam kpepllS nije pokazivao zaštitno dejstvo prema izazivanju tumora.

U ogledima izvedenim u primer 4 pokazano je da vakcina, koja sadrži peptidnu smešu od melanomskih peptida ima zaštitno dejstvo protiv melanoma. Zato je u tom primeru ispitano da li se koncept peptidne smeše odnosi takođe i na P815. Peptidna smeša III davana je, jedanput samo sa polilizinom (grupa E), jedanput sa transferin-polilizinom (grupa F) i jedanput sa transferin-polilizinom/DNK (grupa G). Za kontrolu je koriščena peptidna smeša III u IFA. Za negativnu kontrolu korišćeni su naivni miševi; za pozitivnu kontrolu GM-CSF-transficirane P815-ćelije (IO5 ćelija po mišu).

Ogledi izvedeni u ovom primeru odvijali su se netipično, u odnosu na druge oglede; u pozitivnoj kontrolnoj grupi (ćelije koje luče GM-CSF), kod svih životinja, tumor se javljao uskoro posle izazivanja, pri čemu je većina ovih tumora takođe brzo iščezavala, kao što se i pojavljivala. Jedno moguće objašnjenje za to je, da je tumor jedno vreme rastao, pre nego što je bio uništen. Drugo moguće objašnjenje bi bilo, da kao tumor dijagnosticirano oticanje nije poticalo od rasta tumora, već od jakog infiltrata imunskih ćelija (granulom). Pošto životinje nisu bile secirane razlog nije mogao definitivno da bude utvrđen; u svakom slučaju izazvani tumori su na kraju bili razoreni. Dalji interesantan rezultat dobijen je u grupi G, u kojoj su životinje tretirane sa kombinacijom peptidne smeše III i polilizina. U svim životinjama se razvijao tumor, ali kod dve od životinja veličina otoka tumora (odn. infiltrata imunskih ćelija) bila je realtivno mala, nije rastao, a miševi nisu izlgledali nezdravo. Obe ove životinje nisu bile ubijene već su dalje posmatrane. Iznenađujuće je bilo da tumori nisu više mogli da se dokažu, devet nedelja posle izazivanja tumora, što je do tada nezapažen događaj. Dve od osam životinja na kraju su uništile svoje tumorsko opterećenje. Uništavanje tumora moglo bi da se poveže sa prisustvom kpep!17 u peptidnoj smeši, što je slično sa primerom 2, u kome su dve od osam životinja bile zaštićene sa 16 ug kpepll7, a tri od osam životinja sa 100 ug kpepll7. Ipak je zaštitno delovanje moglo da bude izazvano sa više od jednog peptida u smeši

Primer 4

Zaštita DBA2-miševa protiv melanoma M-3, pomoću predimuniziranja sa tumorskom vakcinom koja sadrži smešu peptida

Primenjena je profilaksan vakcina, koja je sadržavala smešu melanomskih peptida (peptidna smeša I, odeljak D2).

Protokol o predimuniziranju sa vakcinom kao i o izazivanju tumora odgovara protokolu opisanom u primeru 2, sa razlikom što je izazivanje tumora vršeno sa M-3-ćelijama (IO<5>ćelija po životinji). Kao kontrolna vakcina upotrebljena je vakcina sa celim M-3-ćelijama, koje luče IL-2, a pripremljena je kao što su opisali Schmidt et al., 1995. Pod izabranim uslovima ogleda ova vakcina je postigla 100%-nu zaštitu (si. 3a-c).

SI. 3 ilustruje efekat zaštite peptidne vakcine sa polilizinom kao adjuvansom; 50% tretiranim miševa bilo je zaštićeno od izazivanja M-3-tumora. Ovo dejstvo je moglo da se postigne kada je peptid-polilizin-vakcina injicirana subkutano ili je kao hidrogel nanošena na kožu (si. 3a i b). Pod izabranim uslovima izvođenja ogleda nije bilo zaštite kada je peptidna vakcina sa polilizinom kao adjuvansom davana intraperitonalno. Tumori su se razvijali u miševima, vremenski uvek usporeno, u odnosu na životinje iz naivne kontrolne grupe, koje nisu bile tretirane pre izazivanja tumora. Isti marginalni efekt je zapažen kada je upotrebljena peptidna smeša I kao IFA-vakcina. Javljalo se samo vremensko usporavanje pri pojavi tumora, koji su se posle šest nedelja pojavili kod svih životinja, kako u grupi u kojoj je davano subkutano tako i intraperitonalno (si. 3c).

Primer 5

Zaštita DBA/2-miševa od M-3-metastaza

Primenjena je terapeutska vakcina koja je sadržala smešu melanomskih peptida (peptidna smeša I, opisana u odeljku D2). Izvršena su tri vakcinisanja sa jednonedeljnim razmakom. Prvo vakcinisanje je izvršeno pet dana posle pojave metastaza, dakle, izvršeno je vakcinisanje protiv petodnevne metastaze. Za izazivanje metastaza injicirano je 1,2 x IO<4>M-3-ćelija, a prema protokolu opisanom u WO 94/21808 i kod Schmidtet al., 1996.

Kao vakcina upotrebljena je peptidna smeša I: bez adjuvansa (pepmixl PBS), sa IFA kao adjuvansom (IFA pepmbd), ili sa polilizinom modifikovanim sa fukozom (fpL pepmbd). Kontrolnim grupama (naivne) nije davana vakcina ili je davana, u Be6 2 navedena vakcina od celih M-3-ćelija koje daju IL-2. SI. 4 prikazuje, da je najbolja zaštita ostvarena u grupi koja je tretirana sa peptidnom smešom I, sa polilizinom modifikovanim sa fukozom, kao adjuvansom. (si. 4a). U njoj je 50% miševa moglo da odbaci metastaze (4/8). Ovaj tretman je bio čak delotvorniji od onog sa vakcinom sa celim ćelijama, koja je štitila samo 33% miševa (3/9). Peptidna vakcina sa IFA ili bez adjuvansa izazivala je samo usporavanje porasta metastaza od tumora (si. 4b).

Primer 6

Testiranje različitih baznih poliamino kiselina u pogledu njihove sposobnosti da pojačaju internaliziranje i/ili vezivanje peptida u APCs

Za ove testove primenjena je fluorescencna-proba: peptid-antigenski-model, sekvence LFEAIEGFI (MHC Kd-ograničen) obeleži se sa fluorescentnom bojom, fluoresceinizocijanatom (FITC) prema uputstvu proizvođača (Molecular Probes). Prihvatanje, odn. vezivanje FITC-obeleženog peptida, samog ("pulsed") ili zajedno sa različitim koncentracijama baznih amino kiselina (polilizin dužine lanca 16 do 490, poliarginin dužine lanca od 15 do 720), od strane MHC Kd-ograničenih monocitnih-makrofagnih-ćelijskih linija P388D1, mereno je pomoću protočne citometrije. Za to je 1 x IO<6>P388Dl-ćelijskih linija, u konačnoj zapremini od 1 ml medijuma (DMEM/10% FCS) u cevčici za centrifugiranje, sa 5 ug, sa FITC obeleženim samim peptidom, ili sa smešom peptida i poliamino kiseline, inkubirano 30 min na 37°C, pa zatim intenzivno prano, da bi se uklonio slobodan peptid. Poliamino kiseline su dodavane u koncentraciji od 50, 25, 12, 6 i 3 ug po 1 ml medijuma, koji sadrži 5 ug peptida obeleženog sa FITC. Upoređivan je relativni intenzitet fluorescencije različitih proba da bi se odredila efikasnost prihvatanja i/ili vezivanja peptida. Rezultat ovog ogleda prikazan je na si. 5; ogledi su izvođeni uvek sa 25 ug pL450, odn. pArg450. Pod izabranim uslovima, poliarginin je se pokazao oko petputa efikasnijim od polilizina.

APCs mogu da prihvate peptide putem specifičnih mehanizama, kao makropinocitoze ili receptorskim posredstvom endocitoze (Lanzavecchia, 1996). Alternativni mehanizam može da se sastoji u tome što poliamino kiseline mogu da učine propustljivom ćelijsku membranu, pa da na taj način omoguće difuziju peptida iz medijuma u citoplazmu. Moguće internalizovanje peptida obeleženih sa FITC, u prisustvu ili otsustvu baznih poliamino kiselina, ispitano je na osnovu principa koji su objavili Avrameas et al, 1996: čestice koje su ćelije internalizirale prenose se u endozome. U poređenju sa citoplazmom ili medijumom sa kulturom ćelija, koji imaju neutralnu pH-vrednost, ove organele su kisele, sa pH-vređnošću od oko 5. Fluorescencija koju emituje FITC strogo zavisi od pH. U sredini sa pH-uslovima, koji se nalaze u endozomima, fluorescencija je umanjena za faktor oko 3 - 5. Zbog toga, sa FITC obeleženi peptidi, koje su prihvatile ćelije endozoma, pokazuju smanjenu fluorescenciju. Dodavanjem monenzina, niska pH-vrednost endozoma se neutrališe, što dovodi do merljivo pojačane fluorescencije, internaliziranih peptida obeleženih sa FITC.

Moguće permeabilizovanje ćelijske membrane je potvrđeno time što je izmereno oslobađanje citoplazmnog enzima laktadehidrogenaze (LDH), posle inkubacije P388Dl-ćelija sa poliamino kiselinama (polilizin ili poliarginin), pod izotonskim uslovima, uz upotrebu komercijano pristupačnih reaktiva ("kits", Cytotox 96, Promega, Madison, Wisconsin, SAD), a prema uputstvu proizvođača. Pokazalo je se, da inkubacija APCs sa određenim baznim poliamino kiselinama, kao polilizin (pLys) i poliarginin (pArg), pojačava prihvatanje, odn. vezivanje peptida za APCs.

(U izvedenim testovima, pod uporedivim uslovima, pArg je se pokazao oko petputa efikasnijim od pLys). Na osnovu na si. 6a dobijenih rezultata treba prihvatiti, da se delovanje pLys sastoji u tome što on čini propustljivom ćelijske membrane, što se, pod izotonskim uslovima, ispoljava oslobađanjem citoplazmatičnog enzima u velikoj koncentraciji. Nasuprot tome, posle obrade sa pArg (si. 6b), praktično nije dokazan LDH. Značajnije povećanje fluorescencije posle obrade sa monenzinom ukazuje na to, da opterećivanje peptida sa pArg dovodi do toga da se on akumulira u veztklama ćelije (si. 7).

Claims (25)

1. Farmaceutski preparat, koji sadrži bar jedan peptid, protein ili fragment proteina sa imunomodulatomom aktivnošću zajedno sa adjuvansom, gde navedeni adjuvans je poliarginin.

2. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 1,naznačen time,što je peptid ili ćelijski proizvod razlaganja proteina ili fragmenta proteina ligand vezan za bar jedan MHC molekul koji je eksprimiran kod individue koja će biti tretirana.

3. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 2,naznačen time,što je peptid ili ćelijski proizvod razlaganja proteina ili fragmenta proteina ligand vezan za MHC-I-molekul.

4. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 2,naznačen time,što je peptid ili ćelijski proizvod razlaganja proteina ili fragmenta proteina ligand vezan za MHC-II-molekul.

5. Farmaceutski preparat, prema jednom od prethodnih zahteva,naznačen time,što sadrži peptid koji potiče od proteina patogenog izazivača.

6. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 5,naznačen time,što peptid potiče od bakterijskog proteina.

7. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 5,naznačen time,što peptid potiče od virusnog proteina.

8. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 1 do 4, za upotrebu kao tumorska vakcina,naznačen time,što je protein tumorski antigen ili je fragment proteina ili jedan ili više peptida dobijeno iz jednog ili više tumorskih antigena.

9. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 8 za terapeutsku upotrebu,naznačen time,što su jedan ili više tumorskih antigena dobijeni iz tumorskih antigena koji su eksprimirani kod individue koja će biti tretirana.

10. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 8 za profilaktičku upotrebu,naznačen time,što su tumorski antigena dobijeni od predstavnika tumorskih antigena koji se često javljaju.

11. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 8 do 10,naznačen time,što tumorski antigen (i) jesu melanom-antigeni.

12. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 8 do 11,naznačen time,što pored toga sadrži citokin.

13. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 12,naznačen time,što je citokin izabran iz grupe IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-p. IFN-7, IFN-co, TNF-a, GM-CSF, ili od njihovih smeša.

14. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 2 do 11,naznačen time,što sadrži više peptida koji se razlikuju po tome što se vezuju za različite MHC-podtipove kod individua koje se tretiraju.

15. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 2 do 14,naznačen time,što sadrži jedan ili više peptida koja su dobijena iz imunogenog proteina koji se prirodno javlja ili od tumorskog antigena, ili njihovog ćelijskog proizvoda razlaganja.

16. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 2 do 14,naznačen time,što sadrži jedan ili više peptida koji su različiti od peptida koji su dobijeni iz imunogenog proteina ili od tumorskog antigena ili njihovog ćelijskog proizvoda razlaganja.

17. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 1,naznačen time,što je peptid antagonist peptidu koji je dobijen iz proteina koji izaziva autoimuno oboljenje.

18. Farmaceutski preparat, prema zahteva 1,naznačen time,što je poliarginin, konjugovan sa ćelijskim Ugandom.

19. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 18,naznačen time,što ligand jeste ugljeno-hidrat.

20. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 19,naznačen time,što ligand jeste fukoza.

21. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 18,naznačen time,što ligand jeste transferin.

22. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 1 do 21, za parenteralnu primenu.

23. Farmaceutski preparat, prema zahtevu 22,naznačen time,što je u obliku rastvora ili suspenzije peptida i adjuvansa u farmaceutskom pogodnom nosaču.

24. Farmaceutski preparat, prema jednom od zahteva 1 do 21 za topično nanošenje.

25. Farmaceutski preparat, prema zatevu 24, u obliku hidrogela.