PL189413B1 - Kompozycje farmaceutyczne do immunomodulacji osobnika - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna do immunomodulacji osobnika, znamienna tym, ze zawiera a) jeden lub wiecej antygenowych peptydów, bialek lub ich fragmentów, które pasuja do i wiaza sie z bruzda wiazaca czasteczki MHC, wyrazanej przez danego osobnika i b) adiuwant wybrany z grupy skladajacej sie z i. poliargininy, ii. polilizyny, iii. poliomityny, iv. histonów, v. protamin, vi. polietylenoimin i vii. ich mieszanki; przy czym adiuwant ten jest zdolny do zwiekszania wiazania tych peptydów z komórkami tego osobnika i/lub wejscia tych peptydów do komórek prezentujacych antygen i doprowa- dza w ten sposób do wzrostu aktywnosci immunomodulacyjnej tych peptydów. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje do iimmunomodulacji osobnika.

Przy opracowywaniu szczepionki leczniczej opartej na komórkach nowotworowych należy zasadniczo uwzględnić następujące warunki: istnieją jakościowe albo ilościowe różnice pomiędzy komórkami nowotworowymi i komórkami normalnymi; układ odpornościowy jest zasadniczo zdolny do rozpoznania tych różnic; układ odpornościowy może być pobudzony przez aktywną swoistą immunizację szczepionką do rozpoznania komórek nowotworowych dzięki tym różnicom i spowodowania ich odrzucenia.

W celu uzyskania odpowiedzi odpornościowej muszą być spełnione co najmniej dwa warunki: po pierwsze, komórki nowotworowe muszą wyrażać antygeny nie występujące na

189 413 komórkach normalnych lub wyrażać je w stopniu, który pozwala układowi odpornościowemu na odróżnienie jakościowe tkanek prawidłowych i nowotworowych. Po drugie, układ odpornościowy musi być odpowiednio aktywowany, aby mógł reagować z tymi antygenami. Istotną przeszkodą w immunoterapii nowotworów jest ich mała immunogenność, szczególnie u ludzi. Ostatnio ujawniono antygeny związane z nowotworem i swoiste dla nowotworu, które stanowią neoepitopy i w ten sposób powinny stanowić potencjalny cel dla ataku układu odpornościowego. Fakt, ze mimo to układ odpornościowy nie jest w stanie wyeliminować nowotworów, które wyrażają te neoepitopy nie jest więc spowodowany brakiem neoepitopów, ale faktem, ze reakcja odpornościowa na te neoepitopy jest nieadekwatna.

W celu immunoterapii nowotworu opartej na komórkach, opracowano zasadniczo dwie strategie: z jednej strony immunoterapię adoptywną, wykorzystującą namnażanie in vitro limfocytów T reagujących z nowotworem i ich ponowne wprowadzenie do organizmu pacjenta; z drugiej strony immunoterapię aktywną, wykorzystującą komórki nowotworowe, w oczekiwaniu, ze wywołają one nową albo silniejszą reakcję odpornościową na antygeny nowotworowe, prowadzącą do uogólnionej reakcji odpornościowej.

Szczepionki nowotworowe oparte na immunoterapii aktywnej wytwarzane są różnymi sposobami; jednym z przykładów są napromieniowane komórki nowotworowe zmieszane z immunostymulującym adiuwantem, takim jak Corynebacterium parvum albo Bacillus Calmette Guerin (BCG) w celu wywołania reakcji odpornościowej na antygeny nowotworowe (Oettgen i Old, 1991; Bomford, R. I wsp. 1991).

W European Journal of Imnunology, 1994, 24; str. 765-768 opisano białka mutanta p 53 ze zdolnością do wiązania z pewnymi cząsteczkami HLA bez sugerowania zastosowania mutanta w celu zwiększenia immunogenności.

W GB 2191 494 opisano chemicznie zmodyfikowane ligandy (adiuwanty), które wpływają na proliferację limfocytów B przez wiązanie ze specyficznymi receptorami limfocytów B.

Szczególnie w ostatnich latach, do aktywnej immunoterapii przeci\vno\vot\vc>rowej stosuje się nowotworowe komórki modyfikowane genetycznie. Zatloukal i in., 1993 dostarczył rozwiązania tych różnych podejść do problemu, w których komórki nowotworowe są alienizowane w celu zwiększenia immunogenności poprzez włączanie rozmaitych genów. W jednej z tych strategii stosowanych dotychczas wykorzystuje się komórki nowotworowe zmodyfikowane genetycznie w celu wytwarzania cytokin.

Identyfikacja i izolacja antygenów nowotworowych i antygenów związanych z nowotworem (TA) albo uzyskanych z nich peptydów, (np. jak to opisali Wólfel i in., 1994a) i 1994b); Carrel i in., 1993, Lehmann i in., 1989, Tibbets i in., 1993 albo jak opisano w opublikowanych zgłoszeniach międzynarodowych WO 92/20356, wO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159, była konieczna do innej strategii zastosowania antygenów nowotworowych jako immunogenów dla szczepionek przeciwnowctworcwych, zarówno w postaci białek jak i peptydów. Wiadomo z pracy Boon'a i in., 1992; Boon'a i in., 1994; Boon'a i in., 1995; van Peel'a i in., 1995; van Eynde'a, 1995, ze złośliwe czerniaki prezentują peptydy pochodzące z antygenów nowotworowych w kontekście MHC-I. Jednakże, szczepionka nowotworowa w postaci antygenów nowotworowych jako takich nie jest wystarczająco immunogenna do wywołania komórkowej reakcji odpornościowej, która jest konieczna do eliminacji komórek nowotworowych niosących antygen nowotworowy (Marchand i in., 1995). W celu uzyskania gwarancji, ze komórki prezentujące antygen (APC) prezentują zdefiniowane antygeny peptydowe na swojej powierzchni proponowano „pulsowanie” peptydami, lecz wynikiem tego było nieskuteczne naładowanie komórek peptydami (Tykocinski i in., 1996); wykazano również, że równoczesne podawanie adiuwantów zapewnia jedynie ograniczone możliwości nasilenia reakcji odpornościowej (Oettgen i Old, 1991).

Trzecia strategia immunoterapii aktywnej mająca na celu zwiększenie skuteczności szczepionek nowotworowych oparta jest na ksenogenizowanych (alienizowanych) autolcgicznych komórkach nowotworowych. Pomysł ten jest oparty na załozeniu, ze układ odpornościowy reaguje z komórkami nowotworowymi, wyrażającymi obce białko i w trakcie reakcji wywoływana jest odpowiedź odpornościowa przeciwko tym antygenom nowotworowym, które są prezentowane na komórkach nowotworowych szczepionki.

189 413

W regulacji swoistej odpowiedzi odpornościowej kluczową rolę odgrywa trójcząsteczkowy kompleks składający się z składników receptora antygenu limfocytów T, cząsteczki MHC (głównego układu zgodności tkankowej) i jej ligandu, którym jest fragment peptydowy pochodzący z białka.

Cząsteczki MHC (albo odpowiednie cząsteczki ludzkie, HLA) są receptorami peptydów, które umożliwiają wiązanie się licznych różnych ligandów z wysoką swoistością. Warunkują to swoiste allelicznie motywy peptydowe, które spełniają następujące kryteria swoistości: peptydy mają określoną długość, zaleznie od haplotypu MHC, która wynosi od ośmiu do dziesięciu reszt aminokwasowych dla haplotypu MHC-I. Zwykle, dwie z pozycji aminokwasowych są tzw. „kotwicami” i mogą być zajmowane wyłącznie przez pojedynczy aminokwas albo grupy aminokwasów o blisko spokrewnionych łańcuchach bocznych. Dokładna pozycja aminokwasów kotwiczących w peptydzie i wymagania odnośnie do ich właściwości różnią się w zalezności od haplotypu MHC-I. Koniec C ligandów peptydowych stanowi często grupa alifatyczna albo naładowana. Takie swoiste allelicznie motywy ligandu peptydowego-MHC-I poznano do tej pory dla m.in. haplotypów H-2K^d, K^b, K^k, K^kml, D^b, hLa-A*0201, A*0205 i B*2705.

W zakresie przekształceń białka w komórce produkty genowe regularne, zdegenerowane i obce, np. białka wirusowe albo antygeny nowotworowe, rozkładane są na małe peptydy, spośród których niektóre stanowią potencjalne ligandy dla cząsteczek MHC. Zapewnia to warunki do ich prezentacji przez cząsteczki MHC i, w wyniku, wyzwolenie komórkowej reakcji odpornościowej, jakkolwiek nie wyjaśniono do tej pory jak peptydy są tworzone w komórce jako ligandy MHC. Obce albo alienizowane białka oraz ich fragmenty mogą być rozpoznawane, wiązane i eliminowane przez immunoglobuliny, które stanowią humoralną reakcję odpornościową. Jest to również prawdziwe dla wszystkich antygenów nowotworowych: na przykładzie antygenów związanych z nowotworem MUC1, CEA i HER2/neu wykazano, ze immunoglobuliny, które są swoiste wobec tych białek, są zdolne do rozpoznawania i niszczenia komórek niosących to białko. W celu wyzwolenia humoralnej reakcji odpornościowej swoistej dla antygenu nowotworowego wypróbowano różne postaci MUC1 i CEa jako immunogeny (np. w rekombinowanych wektorach ospy, Bronte i in., J. Immunol. 154: 5282, 1995) w modelach zwierzęcych i wstępnych badaniach klinicznych.

W zakresie wynalazku, pewne pomysły wprowadzono w życie w celu stworzenia komórkowej szczepionki nowotworowej: podczas gdy niezłośliwe, normalne komórki organizmu są tolerowane przez układ odpornościowy, organizm reaguje z normalnymi komórkami przez reakcję odpornościową, jeżeli ta komórka wytwarza białka obce dla organizmu, np. w wyniku zakażenia wirusem. Spowodowane jest to tym, że cząsteczki MHC prezentują obce peptydy, pochodzące z obcych białek. W wyniku tego, układ odpornościowy rejestruje, ze w komórce zdarzyło się coś niepożądanego i obcego. APC (w tym makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki Langerhansa, limfocyty B i prawdopodobnie niedawno odkryte komórki o podwójnym fenotypie, które wykazują właściwości zarówno limfocytów B, jak i makrofagów; Tykocinski i in., 1996) ulegają aktywacji, wywoływana jest nowa swoista odporność i komórka ulega eliminacji.

Komórki nowotworowe zawierają specyficzne dla nowotworu antygeny nowotworowe, ale jako takie są nieskuteczną szczepionką, ponieważ są ignorowane przez układ odpornościowy z powodu ich małej immunogenności. Jeżeli komórka nowotworowa zostanie obciążona nie obcym białkiem ale obcym peptydem, oprócz obcego peptydu również antygeny nowotworowe komórki będą rozpoznawane jako obce. Przez alienizację peptydem próbuje się skierować komórkową reakcję odpornościową wyzwoloną wobec obcych peptydów na antygeny nowotworowe.

Powód słabej immunogenności komórek nowotworowych może być problemem ilościowym, a nie jakościowym. Dla peptydów otrzymanych z antygenu nowotworowego może to oznaczać, że jest on prezentowany przez cząsteczki MHC ale w stężeniu zbyt niskim do wyzwolenia komórkowej reakcji odpornościowej swoistej wobec nowotworu. Zwiększenie liczby peptydów swoistych dla nowotworu na komórce nowotworowej powinno spowodować również alienizację komórki nowotworowej powodując wyzwolenie komórkowej reakcji odpornościowej. Zaproponowano prezentację antygenu nowotworowego albo pochodzącego z niego peptydu na powierzchni komórki przez transfekowanie jej DNA kodującym dane białko albo peptyd, jak

189 413 to opisano w publikacjach międzynarodowych WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 i WO 95/00159.

Niemieckie zgłoszenie patentowe P 195 43 649.0 ujawnia szczepionkę komórkową, która zawiera jako składnik czynny komórki nowotworowe wypełnione jednym albo wieloma peptydami, wobec czego komórka w kontekście tych peptydów jest rozpoznawana jako obca przez układ odpornościowy pacjenta i wyzwala komórkową odpowiedź odpornościową. Zasadniczą cechą peptydów jest to, że są one ligandami dla haplotypu MHC pacjenta. Stąd, peptydy są rozpoznawane jako obce przez układ odpornościowy pacjenta, ponieważ mogą być z jednej strony „peptydami obcymi” albo „ksenopeptydami”, tj. różnią się od peptydów pochodzących z białek, które są wyrażane na komórkach nowotworowych pacjenta. Inną kategorią peptydów są peptydy pochodzące z antygenów nowotworowych wyrażanych przez komórki pacjenta. Powodują one wzrost immunogennośći przez to, ze występują na komórkach nowotworowych szczepionki w stężeniu, które jest większe niź stężenie samego peptydu na komórkach nowotworowych pacjenta.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej kompozycji farmaceutycznej o aktywności immunomodulacyjnej, w szczególności szczepionki.

W nawiązaniu do koncepcji szczepionek komórkowych ujawnionych w niemieckim zgłoszeniu patentowym P 195 43 649.0, opracowano kompozycję farmaceutyczną w zakresie wynalazku, która zawiera peptydy wywierające działanie immunomodulujące nie w kontekście komórek, ale razem z adiuwantem, w celu wyzwolenia albo wzmozenia komórkowej i/lub humoralnej, korzystnie układowej, reakcji odpornościowej na patogeny albo reakcji przeciwnowotworowej, albo w celu spowodowania tolerancji na białka o aktywności autoimmunizacyjnej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, ze niektóre adiuwanty, np. polikationy, które jak stwierdzono po raz pierwszy w 1965 roku, zwiększają transport białek do komórek (Ryser i in., 1965; Ryser i in., 1978; Shen i in., 1981) zwiększają immunogenność peptydów.

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do immunomodulacji osobnika, zawierającej

a) jeden lub więcej antygenowych peptydów, białek lub ich fragmentów, które pasują do i wiążą się z bruzdą wiążącą cząsteczki MHC, wyrażanej przez danego osobnika i

b) adiuwant wybrany z grupy składającej się z

i. poliargininy, ii. polilizyny, iii. poliomityny, iv. histonów,

v. protamin, vi. polietylenoimin i vii. ich mieszanki;

przy czym adiuwant ten jest zdolny do zwiększania wiązania tych peptydów z komórkami tego osobnika i/lub wejścia tych peptydów do komórek prezentujących antygen i doprowadza w ten sposób do wzrostu aktywności immunomodulacyjnej tych peptydów.

W celu uproszczenia, przykłady peptydów, białek albo fragmentów białkowych o działaniu immunomodulującym jak opisane wyżej określane tu będą jako „peptydy”. Określenie „peptydy” jeżeli nie odnosi się konkretnie do ligandu, może również wskazywać na większe fragmenty białkowe albo białka, z których otrzymano peptyd, albo na produkty rozkładu komórkowego.

Określenie „działanie immunomodulujące” oznacza z jednej strony wyzwalanie albo wzmozenie komórkowej i/lub humoralnej, korzystnie układowej, reakcji odpornościowej. W tym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku działa jako szczepionka.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera peptyd albo produkt rozkładu komórkowego białka albo fragmentu białka jako ligand przynajmniej jednej cząsteczki MHC, wyrażanej przez leczonego osobnika, korzystniej cząsteczki MHC-Ι lub MHC-II.

Ludzkie cząsteczki MHC są dalej określane jako HLA (antygen ludzkich leukocytów) zgodnie z konwencją międzynarodową.

Określenie „komórkowa reakcja odpornościowa” oznacza odporność zależną od cytotoksycznych limfocytów T, która w wyniku wywołania swoistych dla nowotworu cytotoksycznych

189 413 limfocytów T CD8-pozytywnych i pomocniczych limfocytów T CD4-pozytywnych, prowadzi do zniszczenia komórek nowotworowych lub komórek zaatakowanych przez patogen.

Wyrażenie „humoralna reakcja odpornościowa” oznacza wytwarzanie immunoglobulin, które swoiście rozpoznają komórki nowotworowe albo struktury pochodzące z patogenów i w konsekwencji, wraz z innymi układami, jak np. dopełniacz, ADCC (cytotoksyczność komórkowa zalezna od przeciwciał) albo fagocytoza, niszczą komórkę nowotworową albo komórkę zaatakowaną przez czynniki patogenne.

Peptyd zawarty w szczepionce pochodzi z antygenu, albo, w przypadku białek jest antygenem, przeciwko któremu ma być wyzwolona komórkowa i/lub humoralna reakcja odpornościowa. Zapewnia to, że zostaną wytworzone limfocyty T albo inne cytotoksyczne komórki efektorowe, które rozpoznają czynnik przyczynowy choroby albo komórki nowotworowe, które zawierają antygen i/lub przeciwciała.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera peptyd pochodzący z białka czynnika patogennego, korzystnie z białka bakteryjnego Iub wirusowego.

W celu immunizacji przeciwko czynnikom patogennym takim jak bakterie, wirusy i pasożyty, stosuje się białka albo peptydy, które stanowią białko patogenu albo patogenów; albo z nich pochodzą. Szczególnie przydatne są białka, które nie mają szybkiego tempa mutacji charakterystycznego dla tych patogenów Opublikowane przykłady obejmują HPY16/17 (ludzki wirus brodawczaków; Feltkamp i in., 1995), białko rdzeniowe wirusa zapalenia wątroby typu B (Vitiello i in., 1995), Plasmodium Bergheii (Widman i in., 1992), nukleoproteina wirusa grypy i wirus zapalenia wątroby typu C.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko, które jest antygenem nowotworowym albo fragment białka, albo peptyd, albo peptydy pochodzące z antygenu, albo antygenów nowotworowych przeznaczona jest do stosowania jako szczepionka przeciwnowotworowa. Korzystnie antygenem nowotworowym jest antygen czerniaka. W tym przypadku, gdy kompozycję farmaceutyczną według wynalazku stosuje się terapeutycznie, antygen albo antygeny nowotworowe pochodzą z antygenów nowotworowych wyrażanych przez leczonego pacjenta. Takimi antygenami nowotworowymi są np. takie, które ulegają ekspresji w stężeniu zbyt małym, co powoduje, że komórki nowotworowe nie są rozpoznawane jako obce.

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można stosować profilaktycznie, przy czym dla celów profilaktycznych korzystne jest zastosowanie mieszaniny peptydów pochodzących z reprezentatywnych, powszechnie występujących antygenów nowotworowych. Jeżeli kompozycje farmaceutyczne według wynalazku stosuje się terapeutycznie, stosuje się jeden albo wiele peptydów, co do których oczekuje się, ze występują w antygenach nowotworowych pacjenta.

Antygeny nowotworowe pacjenta można określać w trakcie przeprowadzania planu rozpoznania i leczenia metodami standartowymi; antygeny nowotworowe można łatwo wykryć stosując metody immunohistochemiczne wykorzystujące przeciwciała. Jeśli antygeny nowotworowe są enzymami, np. tyrozynazami, można je wykryć stosując testy enzymatyczne. W przypadku antygenów nowotworowych o znanej sekwencji można stosować metodę RT-PCR (Boon T. i in., 1994; Coulie P. G. i in., 1994; Weynants P. i in., 1994). Innymi sposobami wykrywania są testy oparte na CTL o swoistości wobec antygenów nowotworowych, które mają być wykrywane. Testy te opisano, przykładowo, przez Herin i in., 1987; Coulie i in., 1993; Cox i in., 1994; Rivoltini i in., 1995; Kawakami i in., 1995; oraz w WO 94/14459; odnośniki te ujawniają również różne antygeny nowotworowe i pochodzące z nich epitopy peptydowe, które są przydatne w zakresie niniejszego wynalazku. Przykłady przydatnych antygenów nowotworowych podane są również w artykułach opublikowanych ostatnio przez Rosenberga, 1996 oraz Hendersona i Finna, 1996. W odniesieniu do antygenów nowotworowych, które można zastosować w wynalazku nie ma żadnych ograniczeń; pewne przykłady znanych antygenów nowotworowych i peptydów z nich pochodzących, które można zastosować w celu wynalazku podano w tabeli.

Szczepionka nowotworowa według wynalazku ma taką zaletę w stosunku do szczepionki komórkowej opartej na autologicznych komórkach nowotworowych, ze jest przydatna terapeutycznie nawet u pacjentów na względnie wczesnym etapie choroby (stopień l albo Il), którzy

189 413 mają niewystarczającą ilość komórek nowotworowych do wytworzenia szczepionki komórkowej .

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera jeden albo wiele peptydów pochodzących z naturalnie występującego białka immunogennego albo antygenu nowotworowego, albo ich produktu rozkładu komórkowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera jeden albo wiele peptydów, które różnią się od peptydów pochodzących z naturalnie występującego białka(ek) immunogennego(ych) albo antygenu(ów) nowotworowego(wych), albo ich produktów rozkładu komórkowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera peptyd, który jest antagonistą peptydu pochodzącego z białka, które wywołuje chorobę z autoagresji.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, peptyd dobrany jest do podtypu MHC-I albo MHC-II szczepionego pacjenta, w celu wywołania komórkowej reakcji odpornościowej; tak więc peptyd ma sekwencję albo zawiera sekwencję, która zapewnia, że wiąże się on z cząsteczką Mhc.

W innym korzystnym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna w postaci szczepionki nowotworowej zawiera również polipeptyd wywierający działanie immunostymulujące, szczególnie cytokinę. W najkorzystniejszym wykonaniu, cytokinąjest interleukina 2 (IL-2) albo GMCSF, np. w dawce około 1000 jednostek; innymi przykładami cytokin jest: IL-4, IL-12, IFN-P, IFN-a, IFN-y, IFN-ω, TNF-a i ich kombinacje, np. IL-2 + IFN-y, IL-2 + IL-4, IL-2 + TNF-a albo TNF-a + IFN-y.

W jednym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna służy zapewnieniu tolerancji na białka albo ich fragmenty, które wyzwalają chorobę z autoagresji, tj. do leczenia chorób z autoagresji. Peptydy zastosowane w tym wykonaniu wynalazku pochodzą z białek, które wywołują chorobę z autoagresji.

W przeciwieństwie do zastosowania wynalazku jako szczepionki nowotworowej albo szczepionki przeciwko czynnikom patogennym, w których peptydy zasadniczo odpowiadają części oryginalnego białka (antygenu nowotworowego albo białka patogenu) do tego stopnia, ze peptyd jest rozpoznawany jako „oryginalny antygen”, gdy kompozycja według wynalazku stosowana jest do leczenia chorób z autoagresji, stosuje się m.in. peptydy, które różnią się sekwencją aminokwasową od oryginalnego białka w pewnych kluczowych aspektach. Peptydy te rzeczywiście wiążą się z cząsteczką MHC dzięki ich pozycji kotwiczących, ale mają mutacje w sekwencji, które powodują, ze peptydy te działają jako antagoniści wyłączający aktywowane limfocyty T (Kersh i Allen, 1996).

Przydatne peptydy antagonistyczne są „naturalnymi antagonistami”, które odkryto w wirusach (Bertoletti i in., 1994), jak również są antagonistami znalezionymi podczas systematycznego przeszukiwania, np. przeszukiwania biblioteki peptydów'. Przykładami antagonistów peptydowych są peptydy zdolne do wyłączania limfocytów T, które są swoiste wobec zasadowego białka mieliny; badano je pod kątem skuteczności w doświadczeniach na zwierzętach (Brocke i in., 1996).

Peptyd podejrzewany o wyzwalanie komórkowej reakcji odpornościowej musi być zdolny do wiązania cząsteczki MHC. W celu wyzwolenia odpowiedzi odpornościowej u pacjenta, leczony osobnik musi mieć w swoim repertuarze odpowiednią cząsteczkę HLA. Określenie podtypu HLA pacjenta stanowi jeden z istotnych warunków do skutecznego podawania peptydu pacjentowi, w sensie uzyskania reakcji odpornościowej.

Podtyp HLA pacjenta można określić standardowymi sposobami, takimi jak mikrotest limfotoksyczności (Practical Immunol., 1989). Ten test oparty jest na zasadzie mieszania limfocytów wyizolowanych z krwi pacjenta najpierw z surowicą odpornościową albo przeciwciałem monoklonalnym przeciwko konkretnej cząsteczce HLA w obecności króliczego dopełniacza (c). Komórki pozytywne ulegają lizie i absorbują barwnik wskaźnikowy, podczas gdy komórki nieuszkodzone pozostają niezabarwione.

W celu określenia hąplotypu HLA-I lub HLA-II pacjenta można zastosować również RT-PCR (Curr. Prot. Mol. Biol. rozdz. 2 i 15). W tym celu pobiera się krew od pacjenta i izoluje się RNA. RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji, co powoduje powstanie cDNA pacjenta. cDNA stosuje się jako matrycę do reakcji łańcuchowej polimerazy z parami starterów swoiście powodujących amplifikację fragmentu DNA stanowiącego określony haplotyp HLA.

189 413

Jeżeli po elektroforezie na zelu agarozowym pojawi się odpowiedni prążek DNA, pacjent wyraża odpowiednią cząsteczkę HLA. Jeżeli prążek nie pojawia się, pacjent jest negatywny pod tym względem.

Definicja peptydów zastosowana według wynalazku przez podtyp HLA określa je pod względem aminokwasów kotwiczących i ich długości; określone położenie kotwicy i długość zapewniają dopasowanie peptydu do szczeliny wiążącej peptyd danej cząsteczki HLA. Oznacza to, że układ odpornościowy będzie pobudzany i zostanie wywołana komórkowa reakcja odpornościowa wobec komórek nowotworowych pacjenta, gdy zostaną wykorzystane peptydy pochodzące z antygenów nowotworowych.

Peptydy, które są przydatne dla celów wynalazku dostępne są w szerokim zakresie. Ich sekwencję można uzyskać z naturalnie występujących białek immunogennych albo produktów ich rozkładu komórkowego, tj. peptydów wirusowych albo bakteryjnych, albo z antygenów nowotworowych obcych pacjentowi, albo mogą być one antagonistami peptydów pochodzących z białek wywołujących choroby z autoagresji

Przydatne obce peptydy można wybrać, przykładowo, na podstawie sekwencji peptydowych znanych z literatury.

Z uwagi na wywoływanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej peptydy mogą być określone np. jako peptydy opisane przez Rammensee i in., 1993, Rammensee i in., 1995, Falk i in., 1991, dla różnych motywów HLA, peptydy pochodzące z białek immunogennych różnego pochodzenia, które pasują do miejsc wiązania cząsteczek różnych podtypów HLA. Dla peptydów, które mają częściową sekwencję białka o aktywności immunogennej, możliwe jest ustalenie, które peptydy są odpowiednimi kandydatami dzięki sekwencjom polipeptydowym znanym albo możliwym do ustalenia, przez porównanie sekwencji uwzględniające wymogi swoistości HLA. Przykłady przydatnych peptydów można znaleźć przykładowo w Rammensee i in., 1993, Falk i in., 1991 i Rammensee, 1995 oraz w WO 91/09869 (peptydy HIV); peptydy pochodzące z antygenów nowotworowych opisane są m.in. w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym WO 95/00159 i WO 94/05304. Odnosi się to do ujawnienia zawartego w tych odnośnikach i cytowanych tam publikacjach w odniesieniu do peptydów. Korzystnymi kandydatami są peptydy, których immunogenność została już wykazana, tj. peptydy pochodzące ze znanych immunogenów, takich jak białka wirusowe albo bakteryjne.

Zamiast stosować oryginalne peptydy, które pasują do widełek wiążących cząsteczek MHC-I albo MHC-II, tj. nie zmienione peptydy pochodzące z białek naturalnych, możliwe jest przeprowadzenie koniecznych zmian, z uwzględnieniem minimalnych wymagań dotyczących pozycji kotwiczącej i długości, określonych na podstawie oryginalnej sekwencji peptydowej pod warunkiem, że te zmienności nie pogarszają, lecz korzystnie zwiększają efektywną immunogenność peptydu spowodowaną jego powinowactwem wiązania do cząsteczki MHC i jego zdolnością do stymulowania receptorów limfocytów T. W tym wypadku stosowane są peptydy syntetyczne zgodnie z wynalazkiem, które zaprojektowano zgodnie z wymaganiami dotyczącymi wiązania cząsteczki MHC-I.

Tak więc, przykładowo, wychodząc z ligandu H2-K^d Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile (LFEAIEGFI), możliwa jest zmiana aminokwasów, które nie są aminokwasami kotwiczącymi w taki sposób, że uzyskuje się peptyd o sekwencji Phe-Phe-Ile-Gly-Ala-Leu-Glu-Glu-Ile (FFIGALEEI); ponadto, aminokwas kotwiczący Ile w pozycji 9 można zastąpić Leu. Określenie epitopów ligandów MHC-I albo MHC-II albo ich odmian można przeprowadzić, przykładowo, stosując zasadę opisaną przez Rammensee i in., 1995. Długość peptydu korzystnie odpowiada minimalnej sekwencji 8 do 10 aminokwasów, niezbędnych do wiązania cząsteczki wraz z niezbędnymi aminokwasami kotwiczącymi. Motyw wiążący MHC-II, rozciągający się na 9 aminokwasów ma wysoki stopień degeneracji w pozycjach kotwiczących. Ostatnio opracowano sposoby, począwszy od strukturalnej analizy MHC-II promieniami rentgenowskimi, które umożliwiają dokładną analizę motywów wiążących MHC-II i na ich podstawie zmiany w sekwencji peptydowej (Rammensee i in., 1995 oraz cytowana tu literatura).

Jeżeli jest to pożądane, peptyd może być również wydłużony na końcu C i/lub N, przyjmując, ze takie wydłużenie nie zakłóca zdolności do wiązania cząsteczki MHC, tj. ze wydłużony peptyd może podlegać obróbce na poziomie komórkowym do sekwencji minimalnej.

189 413

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku korzystnie zawiera peptyd naładowany ujemnie.

Peptyd można wydłużyć ujemnie naładowanymi aminokwasami albo ujemnie naładowane aminokwasy można włączyć do peptydu, korzystnie w pozycjach, które nie są istotne dla rozpoznawania przez swoiste CTL albo jako aminokwasy kotwiczące w celu uzyskania wiązania elektrostatycznego peptydu z adiuwantem polikationowym, takim jak polilizyna.

W jednym wykonaniu wynalazku, antygen stosuje się nie w postaci peptydu, ale białka albo fragmentu białka, albo jako mieszaninę białek, albo fragmentów białka.

W zakresie wynalazku, przydatne są większe fragmenty białka albo całe białka, które z pewnością po podaniu pacjentowi zostaną przetworzone przez jego APC w peptydy, które pasują do cząsteczki MHC.

Białko jest antygenem albo antygenem nowotworowym, z którego po przetworzeniu uzyskuje się fragmenty. W tym wykonaniu, adiuwant służy do umożliwienia albo nasilenia upakowania w komórkach („transloading”), szczególnie APC, takie jak komórki dendrytyczne albo makrofagi, antygenami nowotworowymi albo fragmentami. Zaabsorbowane w ten sposób białka albo fragmenty białkowe są przez komórkę przetwarzane i mogą być prezentowane komórkom efektorowym w kontekście MHC i wyzwalają w ten sposób albo nasilają reakcję odpornościową (Braciale i Braciale, 1991; Kovacsovic, Bańkowski i Rock, 1995; York i Rock, 1996).

Wykonanie wynalazku, w którym jako antygeny stosuje się białka albo większe fragmenty białka ma taką zaletę, ze występuje mniejsza zalezność od rodzaju HLA pacjenta, ponieważ białko jest przetwarzane na wiele fragmentów, stąd większa zmienność „postaci dopasowania” peptydów.

Gdy stosuje się białka albo fragmenty białkowe, tożsamość przetworzonego produktu końcowego można wykazać analizą chemiczną (rozkład Edmana albo spektrometria masowa przetworzonych fragmentów; patrz przegląd Rammensee i in., 1995 i cytowana tu oryginalna literatura) albo testami biologicznymi (zdolność APC do pobudzania limfocytów T, które są swoiste wobec przetworzonych fragmentów).

W zasadzie, kandydaci peptydowi potrzebni do wywołania immunologicznej odpowiedzi komórkowej są selekcjonowani w kilku etapach: ogólnie, kandydaci są najpierw badani w teście wiązania peptydów pod względem ich zdolności wiązania z cząsteczką MHC, korzystnie w szeregu testów.

Jedna z przydatnych metod badania oparta jest na zdolności peptydów do stabilizacji pustych cząsteczek MHC, jak to opisano w Stuber i in., 1994 i McIntyre i in., 1996. Peptyd podaje się komórkom, które są zdolne do wyrażania cząsteczki danej MHC, ale nie wiążą żadnych endogennych peptydów w kontekście MHC z powodu defektu genetycznego. Przydatnymi liniami komórkowymi tego rodzaju są RMA-S (mysie) i T2 (ludzkie) i ich transfekowane odmiany. Stąd, tylko cząsteczki MHC stabilizowane przez dany peptyd są wykrywalne, korzystnie w oparciu o analizę FACS opartą na cytometrii przepływowej (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage™ User's Guide, 1994; CELL Quest™ User's Guide, 1994). Stabilne cząsteczki MHC są wykrywane przy wykorzystaniu przydatnych przeciwciał przeciwko MHC i z wtórnym (np. poliklonalnym) przeciwciałem znakowanym barwnikiem fluorescencyjnym, np. przy użyciu FITC (izotiocyjanian fluoresceiny). Podczas przepływu, poszczególne komórki wzbudzane są laserem o konkretnej długości fali; emitowana fluorescencja jest mierzona i zależy od ilości peptydu związanego z komórką.

Innym sposobem określania ilości związanego peptydu jest analiza Scatcharda, opisana przez Sette'a i in., 1994. Na przykład stosuje się do tego peptyd znakowany ¹²⁵I i inkubowany przez noc z izolowanymi Iub rekombinacyjnie wytwarzanymi cząsteczkami MHC w 4°C z różnymi określonymi stężeniami peptydu. W celu określenia nieswoistego oddziaływania peptydu z komórkami, do niektórych próbek dodaje się nadmiar nieznakowanego peptydu, zapobiegając swoistemu oddziaływaniu znakowanego peptydu. Następnie usuwa się niezwiązany peptyd, np. przez chromatografię na zelu. Ilość związanego peptydu mierzy się w liczniku scyntylacyjnym stosując wypromieniowaną radioaktywność. Uzyskane w ten sposób dane bada się standartowymi sposobami.

189 413

Streszczenie sposobów charakteryzowania oddziaływań MHC/peptyd, analizy ligandów MHC i testów wiązania peptydów, które można zastosować w zakresie wynalazku dostarczone jest w Rammensee i in., 1995.

Na drugim etapie, kandydaci o dobrej jakości wiązania badani są pod względem ich immunogenności.

Wyzwalanie komórkowej reakcji odpornościowej można potwierdzić przez wykrycie CTL swoistych wobec peptydu, przykładowo w Current Protocols in Immunology, rozdz. 3 albo Blomberg i in., 1993. Inny wskaźnik obecności komórkowej reakcji odpornościowej jest dostarczony, gdy pod nieobecność limfocytów T nie występuje reakcja odpornościowa u zwierzęcia doświadczalnego (co uzyskuje się przez traktowanie zwierzęcia doświadczalnego przeciwciałami, które usuwają limfocyty CD4+ albo CD8+) (Current Protocols in Immunology, rozdz. 3).

Komórkową reakcję odpornościową można również wykazać przez wykrywanie „reakcji nadwrażliwości typu późnego” (DTH) u immunizowanych zwierząt. W tym celu, peptydy wstrzykuje się tylko w jedną łapę myszy i mierzy się obrzęk w miejscu wstrzyknięcia (Grohman i in., 1995; Puccetti i in., 1994).

Indukcję humoralnej reakcji odpornościowej przez peptydy, które są dla organizmu obcymi antygenami albo antygenami wyrażanymi w niskim stężeniu w leczonym organizmie, można określić przez wykrywanie swoistych przeciwciał w surowicy. Przydatnym sposobem wykrywania poziomu przeciwciał w surowicy jest enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA). Swoiste przeciwciała są wykrywane, po związaniu z peptydem zastosowanym do immunizacji, przy użyciu reakcji barwnej. Alternatywną metodą jest metoda Western biot. W tej metodzie, swoiste przeciwciała surowicze wiązą się z peptydem unieruchomionym na membranie. Związane przeciwciała wykrywa się reakcją barwną (obie metody opisano np. w Current Protocols in Immunology, wyd. Coligan i in., 1991).

Wytwarzania przeciwciał można oczekiwać szczególnie po szczepieniu obcym antygenem, np. pochodzenia wirusowego. Jednakże, nie można wykluczyć, ze swoiste przeciwciała mogą się również tworzyć wobec zmutowanych albo nadmiernie wyrażanych peptydów, pochodzących z antygenów komórek nowotworowych. Zniszczenie nowotworu przez te przeciwciała może zachodzić po związaniu przeciwciał z komórkami nowotworowymi przez inne składniki układu odpornościowego, takie jak przykładowo dopełniacz, cytotoksyczność zależna od przeciwciał (ADCC) albo fagocytoza przez makrofagi (Roitt I. M., Brostoff J. i Male D. K., Immunology, Churchill Livingstone).

Wyzwalanie komórkowej reakcji odpornościowej przez peptydy pochodzące z białek, których aktywność immunogenna jest nieznana, można badać przykładowo jak to opisano wRivoltini i in., 1995 albo Kawakami i in., 1994a. W tym celu, konieczne są limfocyty T, które są zdolne do rozpoznawania pożądanego peptydu prezentowanego przez cząsteczki MHC. W przypadku peptydów pochodzących z komórek nowotworowych, odpowiednie limfocyty T uzyskuje się z limfocytów naciekających nowotwór (TIL) jak to opisał Kawakami i in., 1994b; w przypadku obcych peptydów, limfocyty T tego rodzaju otrzymuje się z krwi obwodowej. Limfocyty T inkubuje się z linią komórkową, taką jak T2 (Alexander i in., 1989) albo RMA-S (Karre i in., 1986), które miesza się z danym peptydem, zaś one powodują ich lizę jeżeli jest to peptyd immunogenny.

Innym możliwym sposobem badania kandydatów peptydów wiążących się z MHC pod względem ich immunogenności jest badanie wiązania peptydów z komórkami T2. Jeden z takich testów opiera się na szczególnej właściwości komórek T2 (Alexander i in., 1989) albo komórek RMA-S (Karre i in., 1986), które mają uszkodzony mechanizm transportu peptydów TAP i prezentują stabilne cząsteczki MHC wyłącznie poddane działaniu peptydów, które prezentowane są w kontekście MHC. W teście tym stosuje się komórki T2 albo RMA-S stabilnie transfekowane genem HLA, np. genami HLA-A1 i/lub HLA-A2. Jeżeli komórki poddaje się działaniu peptydów będących dobrymi ligandami HLA, przez prezentowanie ich w kontekście HLA w taki sposób, aby były rozpoznawane jako obce przez układ odpornościowy, peptydy te powodują pojawienie się cząsteczek HLA na powierzchni komórkowej w znacznych ilościach. Wykrywanie HLA na powierzchni komórek, np. przeciwciałami monoklonalnymi umożliwia iden12

189 413 tyfikację odpowiednich peptydów (Malnati i in., 1995; Sykulev i in., 1994). Ponownie stosuje się peptyd odniesienia o znanej zdolności dobrego wiązania się z HLA.

W świetle możliwie najszerszego zastosowania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, korzystne jest zastosowanie mieszaniny wielu peptydów, które różnią się tym, ze wiążą się z różnymi podtypami MHC leczonego osobnika, z których każdy jest zdolny do wiązania innej cząsteczki MHC, korzystnie jednego, dwóch albo trzech najpowszechniej występujących podtypów MHC. Szczepionkę opartą na mieszaninie peptydów, która może wiązać się z tymi haplotypami można zastosować do pokrycia szerokiej populacji pacjentów.

W niniejszym zgłoszeniu opisano szczepionkę, która może posiadać wiele peptydów o różnych sekwencjach. W tym przypadku, zastosowane peptydy mogą różnić się od siebie, z jednej strony tym, że wiążą się z różnymi podtypami HLA. W ten sposób możliwe jest wykrycie kilku albo wszystkich podtypów HLA pacjenta albo większej grupy pacjentów.

Inna, prawdopodobnie dodatkowa zmienność dotyczącą peptydów może opierać się na fakcie, że peptydy, które wiążą się z pewnym podtypem HLA różnią się sekwencją, która nie jest kluczowa dla wiązania się z HLA i pochodzi, przykładowo, z białek tego samego czynnika patogennego Iub z różnych patogenów. Oczekuje się, ze zmienność tego rodzaju może nasilać pobudzanie reakcji odpornościowej albo nadawać immunogenność przeciwko różnym patogenom.

Ilość skutecznego peptydu w kompozycji opisanej w niniejszym zgłoszeniu może się zmieniać w szerokim zakresie. Ilość peptydu zalezy m.in. od sposobu podawania i konkretnej zastosowanej postaci. Ilość podawanego peptydu może wynosić od około 1 pg do około 5000 pg na dawkę, generalnie od 1 pg do około 1000 pg, szczególnie od około 10 pg do około 500 pg. Mozę być podawany raz albo kilka razy, zaś jeżeli jest podawany kilka razy, korzystnie przynajmniej trzy razy. Do zastosowań terapeutycznych, konkretnie, peptyd można podawać w odstępach (np. raz w tygodniu do raz w miesiącu) przez dowolny, pożądany czas, określony stanem swoistej odporności pacjenta i postępem choroby.

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można zastosować również ex vivo: w zasadzie możliwe podawanie ex vivo obejmuje hodowanie APC, np. komórek dendrytycznych ex vivo, inkubację hodowli komórkowej z kompozycją według wynalazku i podawanie APC, które teraz prezentują peptyd w kontekście MHC, osobnikowi leczonemu. Do tego rodzaju zastosowania można użyć sposobów znanych z literatury, jak to opisano przykładowo w Porgador i Gilboa, 1995; Young i Inabe, 1996.

Adiuwant zawarty w kompozycji według wynalazku ma właściwość wspomagania wnikania peptydu do komórek albo wiązania peptydu z komórkami pacjenta i zwiększania immunogenności peptydu. Przykładowo, adiuwant może spowodować, że błony komórek docelowych, do których peptyd ma wnikać, stają się na krótki czas przenikalne dla peptydu, w celu umożliwienia przeniesienia peptydu tą drogą. Byłoby to korzystne choć nie absolutnie konieczne, gdyby peptyd związał się z adiuwantem, np. przez oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy ujemnym elektrycznie peptydem i polikationowym adiuwantem. Wniknięcie peptydu do komórki można również osiągnąć dzięki temu, że peptyd jest zdolny do przejścia przez błonę komórkową, gdy tylko adiuwant uczyni ją przenikalną, ponieważ jest w bliskim z nią kontakcie. Wpływ adiuwantu może również polegać na tym, że zwiększa on stężenie peptydu na powierzchni komórki, co jest krytyczne dla absorpcji peptydu do komórki albo że powoduje fagocytozę, albo transport płynny (pinocytozę) peptydu do komórki.

Nieoczekiwanie, obecność adiuwantu nie tylko zwiększa wychwyt peptydu do komórki, ale również powoduje wzrost wpływu immunomodulacyjnego peptydu, co jest prawdopodobnie spowodowane prawidłową prezentacją peptydu przez cząsteczki MHC.

Korzystnie adiuwantem jest polikation organiczny albo mieszanina polikationów organicznych.

W najkorzystniejszym wykonaniu wynalazku, adiuwantem jest zasadowy poliaminokwas albo mieszanina zasadowych poliaminokwasów, korzystnie poliarginina Iub polilizyna.

Stopień polimeryzacji poliaminokwasów może się zmieniać w szerokim zakresie. Może on wynosić od około 5 do około 1000, w szczególności od około 15 do 500.

Adiuwant jest korzystnie sprzęgnięty z ligandem komórkowym, np. z transferyną, gpl20, LDL (lipoproteina o niskiej gęstości), a-fetuiną, EGF (naskórkowy czynnik wzrostowy), peptydami albo innymi reprezentatywnymi ligandami komórkowymi, które opisano

189 413 w kontekście transportu DNA przez endocytozę zalezną od receptorów w WO 93/07283, resztami węglowodanów, takich jak mannoza albo fukoza (ligandy dla makrofagów), albo przeciwciałami, albo fragmentami przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym komórek.

Korzystnie ligandem jest grupa węglowodanowa, bardziej korzystnie fukoza.

Korzystnie ligandem komórkowym jest też transferyna.

Ewentualnie, adiuwanty polikationowe, takie jak poliarginina albo polilizyna, które są ewentualnie sprzęgnięte z ligandem komórkowym, występują jako składniki kompleksów z DNA, np. w postaci plazmidowego DNA. DNA może być pozbawiony sekwencji kodujących funkcjonalne peptydy, w tym wypadku jest to pusty plazmid.

Kompozycja farmaceutyczna, według wynalazku może zawierać również DNA, pozbawiony sekwencji kodujących funkcjonalne białka, może zawierać również DNA, który koduje białko immunomodulujące.

W jednym wykonaniu wynalazku, DNA zawiera sekwencje, które kodują białka immunomodulujące, zwłaszcza cytokiny, takie jak IL-2, interferony i GM-CSF.

Kompozycja farmaceutyczna zawiera białko immunomodulujące wybrane z grupy obejmującej IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a, EFN-β, IFN-y, IFN-co, TNF-a, GM-CSF albo ich mieszaniny.

W celu badania mechanizmu transportu peptydów za pomocą zasadowych poliaminokwasów, mierzono uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Podczas gdy w próbkach traktowanych poliargininą stężenie uwolnionej LDH było praktycznie niewykrywalne, po inkubacji z polilizyną w nadsączu komórkowym wykrywano wysokie stężenia LDH. Wyniki te prowadzą do wniosku, ze wpływ polilizyny musi być spowodowany zwiększeniem przenikalności błony komórkowej.

Nie chcąc wiązać się rozważaniami teoretycznymi, wpływ kompozycji farmaceutycznej według wynalazku wydaje się polegać na fakcie, że peptyd penetruje do komórek docelowych przy pomocy adiuwantu albo wiąże się z komórkami, co zachodzi w endodermalnym regionie skóry. Komórki docelowe obejmują, przykładowo, komórki prezentujące antygen, przez które zachodzi prezentacja peptydu, ewentualnie po przetworzeniu, limfocytom B i/lub T. Przykłady komórek docelowych obejmują makrofagi, fibroblasty, keratynocyty, komórki Langerhansa, komórki dendrytyczne albo limfocyty B.

W zakresie wynalazku badacze sprawdzili, czy małe peptydy są absorbowane w większym stopniu przez komórki prezentujące antygen (APC) typu makrofagów, w obecności zasadowych poliaminokwasów albo glikozylowanych postaci polikationów. Zależnie od zastosowanej reszty cukru wiadomo, że ulegają adsorpcji przez makrofagi dzięki endocytozie za pośrednictwem receptorów-. (W przypadku APC uważa się, ze in vivo stanowią one rodzaj komórek, które absorbują peptydy i prezentują je innym komórkom odpornościowym. Wyniki testów in vitro, które pokazują, ze endocytoza APC zwiększa ilość antygenów peptydowych w obecności testowanych adiuwantów wskazuje, że te adiuwanty są również przydatne in vivo do nasilania prezentacji peptydów efektorowym komórkom cytotoksycznym i ich aktywacji, co prowadzi do nasilenia całkowitej reakcji odpornościowej na cel zawarty w szczepionce).

Zastosowane adiuwanty mogą być również składnikami w postaci cząstek, ewentualnie wraz z adiuwantami wspomnianymi wyżej. Cząstki teoretycznie mogą być z dowolnego materiału, również z materiałów stosowanych do wytwarzania kolumn do syntezy peptydów, np. zelu krzemionkowego albo syntetycznych żywic, pod warunkiem, ze są one dopuszczalne fizjologicznie i że można je wytworzyć w cząstkach dostatecznie małych by wnikały do komórek. Stosując adiuwanty w postaci cząstek możliwe jest uzyskanie miejscowego wysokiego stężenia peptydu co ułatwia absorbcję do komórek.

Rodzaj zastosowanego adiuwantu, możliwość jego modyfikacji ligandem komórkowym albo dodanie DNA oraz niezbędnej ilości adiuwanta w odniesieniu do peptydu można ustalić doświadczalnie, np. konkretny stosunek peptydu do wybranego adiuwantu, który może teoretycznie wahać się w szerokim zakresie, można ustalić przez miareczkowanie.

Adiuwanty można teoretycznie badać w ten sam sposób co peptydy, ewentualnie w wielu etapach.

Zdolność adiuwantu do zwiększania wiązania i/lub internalizacji peptydu do APC można mierzyć, przykładowo w pierwszym etapie przez inkubację APC z fluorescencyjnie znakowanym pepty14

189 413 dem albo adiuwantem. Wzrost wychwytu albo wiązania wywołany przez adiuwant można określić cytometrią przepływową przez porównanie z komórkami mieszanymi z peptydem.

W drugim etapie badane adiuwanty można badać in vitro w celu stwierdzenia, czy i w jakim stopniu ich obecność wywołuje prezentację peptydu APC, zaś metody stosowane do badania peptydów można zastosować do mierzenia stężenia MHC na komórkach.

Inny możliwy sposób badania skuteczności adiuwantu obejmuje zastosowanie modelu in vitro. APC inkubuje się z adiuwantem i peptydem i mierzy się względną aktywację klonu limfocytów T, które swoiście rozpoznają zastosowany peptyd (Coligan i in., 1991; Lopez i in., 1993).

Skuteczność preparatu można również wykazać przez komórkową odpowiedź odpornościową, przez wykazanie nadwrażliwości typu późnego (DTH) u immunizowanych zwierząt.

Na koniec, wpływ immunomodulujący preparatu mierzy się w badaniach na zwierzętach. Można zastosować model zasiedlonych nowotworów, z sekwencjami peptydowymi rozpoznawanymi przez układ odpornościowy. Szczepionkę zawierającą peptyd i adiuwant podaje się w różnych proporcjach w odniesieniu do ilości peptydu do adiuwantu i całkowitej ilości. Ochrona przed wzrostem nowotworu stanowi pomiar skuteczności szczepionki nowotworowej.

Kompozycję farmaceutyczną można podawać pozajelitowo, miejscowo, doustnie albo miejscowo. Korzystne jest podawanie pozajelitowe, np. podskórne, śródskóme albo domięśniowe, korzystnie drogą podskórną albo śródskómą, w celu osiągnięcia komórek skóry, w szczególności (keratynocytów, fibroblastów) komórek dendrytycznych, komórek Langerhansa albo makrofagów jako komórek docelowych. W świetle terapii przeciwnowotworowej, szczepionkę nowotworową można podawać drogą doguzową.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku ma postać roztworu albo zawiesiny peptydu i adiuwanta w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku. Korzystnie kompozycja służy do podawania miejscowego. Szczególnie korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku występuje w postaci hydrozelu. Kompozycja do podawania pozajelitowego jest zwykle w postaci roztworu albo zawiesiny peptydu i adiuwanta w nośniku dopuszczalnym farmaceutycznie, korzystnie nośniku wodnym. Przykłady nośników wodnych, które można zastosować obejmują wodę, buforowaną wodę, roztwór soli (0,4%), roztwór glicyny (0,3%), kwas hialuronowy i podobne znane nośniki. Oprócz nośników wodnych, można również zastosować rozpuszczalniki, takie jak dimetylosulfotlenek, glikol propylenowy, dimetyloformamid i ich mieszaniny. Kompozycja może również zawierać zarobki dopuszczalne farmaceutycznie, takie jak substancje buforowe i sole nieorganiczne, w celu uzyskania normalnego ciśnienia osmotycznego i/lub skutecznej liofilizacji. Przykłady takich dodatków obejmują sole sodowe i potasowe, np. chlorki i fosforany, sacharozę, glukozę, hydrolizaty białek, dekstran, pcliwinylcpirolidon albo poliglikol etylenowy. Kompozycje można sterylizować sposobami konwencjonalnymi, np. przez filtrowanie. Kompozycje można dekantować bezpośrednio w takiej postaci albo liofilizować i mieszać z roztworem sterylnym przed zastosowaniem.

W jednym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest w postaci preparatu miejscowego, np. do podawania skórnego albo przezskórnego. Kompozycja farmaceutyczna może mieć, przykładowo, postać hydrożelu opartego na polikwasie akrylowym albo pcliakrylcamidzie (takim jak Dolobene®, Merckle), jako maść, np. z poliglikolem etylenowym (PEG) jako nośnikiem, jak standardowa maść DAB 8 (50% PEG 300, 50% PEG 1500) albo jako emulsja, zwłaszcza mikroemulsja oparta na wodzie w oleju, albo oleju w wodzie, ewentualnie z dodatkiem liposomów. Odpowiednie substancje przyspieszające przenikanie obejmują: pochodne sulfotlenku, takie jak dimetylosulfotlenek (DMSO) albo decylometylosulfotlenek (decyl-MSO) i transcutol (dietylenoglikclomoncetyloeter) albo cyklodekstryną, jak również pirolidony, np. 2-pirolidon, N-metylo-2-pirolidon, kwas 2-pirclidcno-5-karboksylowy albo ulegający degradacji biologicznej N-(2-hydroksyetylc)-2-pirclidon oraz ich estry z kwasami tłuszczowymi, pochodne mocznika takie jak dodecylomocznik, 1,3-didodecylomocznik i 1,3-difenylomocznik, terpeny, np. D-limonen, menton, a-terpinol, karwol, tlenek limonenualbo 1,8-cineol.

Innymi preparatami są aerozole, np. do podawania jako rozpylacze donosowe albo do inhalacji.

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można również podawać przy użyciu liposomów, które mogą mieć postać emulsji, pian, micelli, nierozpuszczalnych pojedynczych

189 413 warstw, dyspersji fosfolipidowych, warstw lamelli itp. Działają one jako nośniki do przenoszenia peptydów do ich konkretnych docelowych tkanek, np. tkanki limfatycznej albo tkanki nowotworowej albo w celu wydłużenia okresu półtrwania peptydu.

Jeżeli kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest w postaci kompozycji miejscowej, może również zawierać substancje absorbujące UV w celu działania, przykładowo, jako krem chroniący przed słońcem, przykładowo gdy kompozycja stosowana jest profilaktycznie przed czerniakiem.

Specjalista znajdzie przydatne postaci farmaceutyczne i adiuwanty w standardowych źródłach takich jak „Remington's Pharmaceutical Science”, 1990.

Streszczenie figur

Figura 1: Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko mastocytoma P815 peptydem KYQAVTTTL. Figura 2: Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko mastocytoma P815 peptydem SYFPEITHI. Figura 3: Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko mastocytoma P815 peptydem SYFPEITHI. Figura 4: Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko czerniakowi M-3 mieszaniną peptydów. Figura 5: Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko czerniakowi M-3 przez zastosowanie miejscowe.

Figura 6: Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko przerzutom czerniaka M-3.

Figura 7: Zdrowienie myszy z mikroprzerzutów czerniaka M-3 po szczepieniu mieszaniną peptydów.

Figura 8: Napełnianie komórek tyrozynazą za pośrednictwem polilizyny.

Figura 9: Aktywacja limfocytów T po szczepieniu w modelu terapeutycznym (uwalnianie IFN-γ ze splenocytów szczepionych zwierząt w reakcji na komórki M-3).

Figura 10: Indukcja odporności przeciwwirusowej przy użyciu peptydu nukleokapsydu wirusa grypy, ASNENMETM i fukozylowanej polilizyny jako adiuwantu (aktywacja CTL).

Figura 11: Nasilanie wiązania peptydów z APC przez zasadowe poliaminokwasy.

Figura 12: Przepuszczalność błony komórkowej wywołana zasadowymi poliaminokwasami (uwalnianie LDH po traktowaniu komórek polilizyną albo poliargininą).

Figura 13: Internalizacja peptydów przez poliargininę.

Figura 14: Transportowanie peptydów do komórek szpiku prezentujących antygen.

Figura 15: Wzrost transportowania peptydów do komórek prezentujących antygen przy użyciu polikationowych poliaminokwasów i histonów.

Figura 16: Skuteczność transportu jako funkcją stopnia polimeryzacji zasadowych aminokwasów.

Figura 17: Transportowanie peptydów przez poliargininy o niskim ciężarze cząsteczkowym. Figura 18: Wpływ na skuteczność transportu jako funkcja wypełniania peptydami.

W poniższych przykładach, o ile nie zaznaczono inaczej, stosowano następujące materiały i metody:

A) Komórki

a) Linie komórkowe

Linia komórkowa czerniaka mysiego Cloudman S91 (klon M-3; ATCC nr CCL 53.1), linia komórkowa mastocytoma P815 (ATCC TIB 64) i linia komórkowa monocytów-makrofagow P388D1 (ATCC TIB 63) pochodziły z ATCC. Komórki hodowano w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy (High Glucose DMEM, Life Technologies) z dodatkiem 10% FCS, 2 mM L-glutaminy i 20 pg/ml gertamγcγnγ. Komórki rutynowo badano pod względem nieobecności zanieczyszczeń mykoplazmą (zestaw do wykrywania mykoplazmy metodą PCR, Stratagene).

Mysia linia komórkowa RMA/S (białaczka mysia) opisana przez Karre'a i in., 1986 i przez Ljunggren'a i in., 1990.

b) Komórki szpiku prezentujące antygen

Po pierwsze, wypłukano kości udowe myszy DBA/2. Komórki szpiku hodowano w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy (High Glucose DMEM, Life Technologies) z dodatkiem 10% FCS, 5% surowicy końskiej, 2 mM L-glutaminy i 20 pg/ml gentamycyny, w obecności 200 jednostek/ml mysiego GM-CSF (Li i in., 1989, Genzyme, Cambridge, MA, USA). Przez pierwsze pięć dni dwie trzecie pożywki zmieniano co 24 godziny w celu usunięcia nie przylegających granulocytów i limfocytów B (Inaba i in., 1992). Komórki przylegające

189 413 i luźno przylegające zebrano pomiędzy dniem 8 i 10, przez inkubowanie z PBS/5 mM EDTA, po czym wysiano w gęstości 3 x 10⁴ komórek/studzienkę, w 8-studzienkowych szkiełkach mikroskopowych (Nunc, Roskilde. Dania). Ponad 90% komórek wykazywało reakcję pozytywną z przeciwciałem F4/80 (Endogen, Cambridge, MA, USA).

B) Synteza peptydowa

Peptydy syntetyzowano w syntezatorze peptydów (Model 433 A z monitorem sprzężenia, Applied Biosystems, Foster City, Canada) z użyciem TentaGel S PHB (Rapp, Tuebingen) w fazie stałej stosując metodę Fmoc (aktywacja HBTU, Fastmoc™, w skali 0:25 mmol). Peptydy rozpuszczono w lM TEAA, pH 7,3 i oczyszczono przez chromatografię w odwróconej fazie na kolumnie Vydac C 18. Sekwencje potwierdzono spektrometrią masową na urządzeniu MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Canada).

C) Lista wykorzystanych peptydów

Nazwa peptydu	Sekwencja	Towarzyszący antygen	Numeracja aminokwasów w białku	Haplotyp MHC
kpepl17	SYFPElTHl	kinaza tyrozynowa JAKl	355-363	H2-Kd
kpep118	KYQAVTTTL	Tum-P198	14-22	H2-Kd
kpep162	GPPHSNNFGY	Tum-P35B	4-13	H2-Dd
kpep163	lSTQNHRAL	P91A	12-20	H2-Ld
kpep164	LPYLGWLYF	P815	35-43	H2-Ld
kpep143	RYAEDYEEL	trp-1		H2-K.d
kpep145	PYLEQASRl	tyrozynaza		H2-K.d
kpep146	YYVSRDTLL	tyrozynaza		H2-Kd
kpep150	YYSVKKTFL	trp-1		H2-Kd
	ASNENMETM	peptyd nukleokapsydu grypy		H2-Kb

Mieszaniny peptydów:

Mieszanina peptydów I do szczepionki czerniaka M-3: kpep143, kpep145, kpep146, kpep150.

Mieszanina peptydów lll do szczepionki mastocytoma P815: kpep117, kpep188, kpep162,kpep163, kpep164.

D) Wytwarzanie szczepionek

Dl) Szczepionki pojedynczych peptydów

a) Szczepionki kontrolne poszczególnych peptydów bez adiuwantu wytworzono przez rozcieńczenie peptydu w stężeniu 1 mg/ml w PBS. Okres inkubacji przed wstrzyknięciem wynosił 4 godziny w temperaturze otoczenia.

b) Szczepionki pojedynczych peptydów z polilizyną jako adiuwantem (o ile nie zaznaczono inaczej stosowano polilizynę o długości łańcucha 200) wytworzono przez zmieszanie peptydu i polilizyny w podanych ilościach w HBS. Okres inkubacji przed wstrzyknięciem wynosił 4 godziny w temperaturze otoczenia.

i) w celu uzyskania szczepionki zawierającej 16 pg skutecznego peptydu, 11,8 pg polilizyny zmieszano z 160 pg peptydu kpep117 w objętości całkowitej równej 1 ml HBS.

ii) w celu uzyskania szczepionki zawierającej 100 pg skutecznego peptydu, 74 pg polilizyny zmieszano z 1 mg peptydu kpep117 w objętości całkowitej równej 1 ml HBS.

c) Szczepionki kontrolne pojedynczych peptydów z niekompletnym adiuwantem Freunda (lFA) wytworzono przez zmieszanie peptydu i lFA w podanych ilościach. Okres inkubacji przed wstrzyknięciem wynosił 4 godziny w temperaturze otoczenia.

189 413

i) w celu uzyskania szczepionki kontrolnej zawierającej 16 pg peptydu, 192 pg peptydu kpep117 emulgowano w 600 pl HBS z 600 pg IFA.

ii) w celu uzyskania szczepionki kontrolnej zawierającej 100 pg skutecznego peptydu, 1,2 mg peptydu kpep117 emulgowano w 600 pl HBS z 600 pg IFA.

D2) Mieszaniny peptydów jako szczepionki

a) Mieszanina peptydów I jako szczepionka kontrolna bez adiuwantu zawierała 250 pg każdego z peptydów kpep143, kpep145, kpep146 i kpep150 w objętości końcowej 1 ml PBS.

b) Mieszanina peptydów III jako szczepionka kontrolna bez adiuwantu zawierała 250 pg każdego z peptydów kpep117, kpep118, kpep162, kpep163 i kpep164 w objętości końcowej 1 ml PBS.

c) Mieszaninę peptydów I jako szczepionkę z polilizyną jako adiuwantem wytworzono przez zmieszanie 1 mg mieszaniny peptydów I (zawierającej po 250 pg każdego z peptydów) z 74 pg polilizyny w HBS. Okres inkubacji przed iniekcją wynosił 4 godziny w temperaturze otoczenia.

d) Mieszaninę peptydów III jako szczepionkę z polilizynąjako adiuwantem wytworzono przez zmieszanie 1,25 mg mieszaniny peptydów III (zawierającej po 250 pg każdego z peptydów) z 93 pg polilizyny w HBS. Okres inkubacji przed iniekcją wynosił 4 godziny w temperaturze otoczenia.

e) Mieszaninę peptydów I jako szczepionkę kontrolną z niekompletnym adiuwantem Freunda wytworzono przez emulgację 1,2 mg mieszaniny peptydów I (zawierającej po 300 pg każdego z peptydów) w 600 pl HBS z 600 pl IFA. Okres inkubacji przed iniekcją wynosił 30 minut w temperaturze otoczenia.

f) Mieszaninę peptydów III jako szczepionkę kontrolną z niekompletnym adiuwantem Freunda wytworzono przez emulgację 1,5 mg mieszaniny peptydów III (zawierającej po 300 pg każdego z peptydów) w 600 pl HBS z 600 pl IFA. Okres inkubacji przed iniekcją wynosił 30 minut w temperaturze otoczenia.

g) Do zastosowania miejscowego z polilizynąjako adiuwantem, 1 mg mieszaniny peptydów I (zawierającej po 250 pg każdego z peptydów) inkubowano z 74 pg polilizyny przez 4 godziny w objętości całkowitej 400 pl HBS. Mieszaninę domieszano do 1,6 g hydrozelu DOLOBENE (Merckle).

h) Do zastosowania miejscowego szczepionki kontrolnej bez adiuwantu, 1 mg mieszaniny peptydów I (zawierającej po 250 pg każdego z peptydów) w objętości całkowitej 200 pl HBS domieszano do 1,8 g hydrożelu DOLOBENE (Merckle).

i) Preparat polilizyny sprzęgniętej z fukozą (długość łańcucha 240) przeprowadzono stosując metodę opisaną przez MacBrootn i in., 1992, uzyskując podstawienie rzędu 40% (materiałami wyjściowymi były β-L-fukopiranozylofenyloizotiocyjanian i polilizyną, otrzymane z Sigma).

j) Zastosowano koniugaty transferryny/polilizyny (wytworzone jak to opisano w WO 93/07283), ilość ustalono w taki sposób, ze całkowita ilość polilizyny wynosiła 75 pg na mg peptydu. Gdy plazmidowy DNA (pusty plazmid pSP65, wolny od LPS, Boehringer Mannheim) poddano integracji w kompleksy, stosunek wynosił 37,5 pg DNA/75 pg polilizyny/1 mg peptydu. Gdy zastosowano 160 pg zamiast 1 mg peptydu, ilości innych składników zmniejszono o ten sam współczynnik (6,25).

E) Wstrzyknięcie szczepionek

Przed wstrzyknięciem podskórnym myszy znieczulono w izolowanej komorze powietrznej w grupach po osiem zwierząt. Po 3,5 minutach traktowania halotanem (4% w O?, przepływ 4) myszy znieczulono na około 1 minutę, w tym czasie wstrzyknięto szczepionkę podskórnie.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe podawano bez żadnego znieczulenia. Objętość wstrzykiwana wynosiła 100 pl szczepionki na zwierzę, co odpowiadało 100 pg poszczególnego peptydu albo mieszaniny peptydowej I na zwierzę. W przypadku mieszaniny peptydowej III, całkowitą ilość podawanego peptydu wynosiła 125 pg na zwierzę.

F) Zastosowanie miejscowe szczepionek

Każdej z myszy rozsmarowano na ogoloną skórę grzbietu i uszu 200 mg maści zawierającej 100 pg peptydu albo mieszaniny peptydowej I. Prawidłową ilość mierzono sprawdzając wagą.

189 413

G) Zastosowanie szczepionki przeciwko wzrostowi nowotworu na modelu mysim

Procedura badania skuteczności szczepionek nowotworowych w profilaktycznym albo terapeutycznym modelu mysim odpowiadała zasadzie opisanej w WO 94/21808, jeżeli nie zaznaczono inaczej, stosując w tym modelu myszy DBA/2.

Przykład 1

Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko mastocytoma P815

160 pg peptydu o sekwencji KYQAVTTTL (kpep118) pochodzącego z antygenu nowotworowego P815 opisanego przez Lethe i in., 1992, ligandu H2-K^d, zmieszano z 11,8 g polilizyny 300 w 500 pl HBS i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze otoczenia. Następnie dodano 500 pl EBSS (buforowany roztwór soli Earl'a). 100 pl porcje powstałej mieszaniny podawano podskórnie 8 myszom w odstępach 1 tygodnia. Po tej wstępnej immunizacji, po kolejnym tygodniu wytworzono guzy przez wstrzyknięcie każdej z myszy w przeciwny bok 5 x 10⁴ komórek linii komórkowej mastocytoma P815 (ATCC TIB 64; komórki te wyrażają antygen nowotworowy, z którego pochodzi peptyd P815) w 100 pl EBSS. Wyniki tych doświadczeń pokazuje fig. 1 (wypełnione kwadraty).

W równoległym doświadczeniu, 200 pg peptydu zmieszano z 500 pl HBS, a następnie emulgowano w 500 pl adiuwantu Freund'a. Immunizowano 8 myszy 100 pl powstałej emulsji, a następnie wytworzono guzy z komórkami P815 jak to opisano wyżej (fig. 1, wypełnione kółka). Do innego równoległego doświadczenia wytworzono komórkową szczepionkę nowotworową następująco.

160 pg peptydu kpep118 zmieszano z 3 pg transferryny-polilizyny (TfpL), 10 pg pL i 6 pg psp65 (wolny od LPS) w 500 pl buforu HBS. Po 30 minutach w temperaturze otoczenia powyższy roztwór dodano do butelki hodowlanej T 75 zawierającej 1,5 x 10⁶ komórek linii komórkowej allogenicznych fibroblasów NIH3T3 (ATCC Nr CRL 1658) w 20 ml pożywki DMEM (10% FCS, 20 mM glukoza) i inkubowano w 37°C. Po trzech godzinach komórki zmieszano z 15 ml świeżej pożywki i inkubowano przez noc w 37°C z 5% CO2. 4 godziny przed podaniem komórki napromieniowano dawką 20 Gy. Szczepionkę wytworzono jak to opisano w WO 94/21808.

Wstępna immunizacja tą. szczepionką została przeprowadzona w odstępach jednego tygodnia komórkami w ilości 10, po kolejnym tygodniu guzy wytworzono jak opisano powyżej (fig. 1: pełne trójkąty). Stwierdzono, że szczepionka zawierająca peptyd połączony z polilizyną najlepiej zabezpiecza myszy przed tworzeniem guza.

Przykład 2

Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko mastocytoma P815 szczepionką pojedynczego peptydu

a) Sprawdzano trzy szczepionki pojedynczego peptydu zawierające zarówno samodzielny peptyd kpep117 w PBS (fig. 2a), peptyd kpep117 emulgowany w IFA (fig. 2b) lub peptyd kpep117 z polilizyną (długość łańcucha: 240) jako adiuwantem (fig. 2c) w kierunku ich ochronnego działania przeciwko prowokacji nowotworem P815. Szczepionki przygotowano tak jak to opisano w zamieszczonej powyżej części D. W każdym przypadku objętość wstrzykiwana wynosiła 100 pl; szczepionki podawano podskórnie (sc) lub dootrzewnowo (ip). Naiwne myszy stosowano jako kontrolę ujemną, szczepionki o pełnych komórkach zawierające komórki P815 wydzielające GM-CSF używano jako kontrolę dodatnią (P815-GM-CSF, 10⁵ komórek w 100 pl wstrzykiwano podskórnie każdemu zwierzęciu). Każda grupa doświadczalna składała się z ośmiu zwierząt i trzy szczepienia przeprowadzano w odstępach 7-dniowych. W tydzień po ostatnim szczepieniu zwierzęta poddawano krzyżowo prowokacji nowotworem 5 x 104 komórek P815. Zwierzęta kontrolowano codziennie i pojawienie się jakiegokolwiek nowotworu monitorowano w odstępach tygodniowych.

Peptyd kpep117 z polilizynąjako adiuwantem wywoływał najlepszy efekt przeciwnowotworowy gdy był podawany każdemu zwierzęciu podskórnie w ilości 100 pg (trzy na osiem zwierząt otrzymywało ochronę). Ten wynik był porównywalnie tak dobry jak ten otrzymywany ze szczepionką z całych komórek (ochrona czterech na osiem zwierząt). 16 pg peptydu łącznie z polilizyną na zwierzę było mniej skuteczne (dwa zwierzęta otrzymywały ochronę), lecz znacząco lepsze niż 100 pg peptydu w PBS (fig. 2a, brak efektu ochronnego). Również peptyd emulgowany w iFa nie osiągał takiej aktywności, jaką osiągał peptyd łącznie z polilizyną (fig. 2c).

189 413

b) W innym modelu doświadczalnym guza z komórek tucznych p815, porównywano ze sobą dwie niezmodyfikowane polilizyny o różnych długościach łańcucha, krótka z jedynie 16 grupami lizynowymi (pL16) i długa z 240 grupami (pL240). Zwierzęta w grupie kontrolnej były szczepione 100 jag peptydu kpepl 17, zarówno rozpuszczonego w PBS jak i emulgowanego w IFA. Dwie szczepionki kontrolne zawierające komórki wydzielające GM-CSF stosowano jako kontrole dodatnie (cf. a), jedną szczepionkę uzyskano z stabilnych transfekowanych komórek P815, a drugą szczepionkę uzyskano przez przejściową transfekcję przy wykorzystaniu metody opisanej przez Wagnera i in., 1992 (AVET). Dwie szczepionki z pełnych komórek nadawały ochronę czterem z ogólnej ilości ośmiu zwierząt. Szczepionki oparte na peptydzie składające się z niezależnego peptydu lub peptydu emulgowanego w IFA nie wykazywały działania ochronnego, wszystkie zwierzęta wykazały rozwój guza szybko po prowokacji nowotworem. Jednakże, jeśli peptyd był podawany łącznie z polilizyną, szczepionka peptydowa chroniła zwierzęta przed prowokacją nowotworem: dwa z ośmiu zwierząt było chronionych, gdy zastosowano długą polilizynę (pL240), a cztery z ośmiu w przypadku krótkiej polilizyny. Te rezultaty, pokazane na fig. 3, pokazują, ze pojedynczy peptyd gdy jest podawany z polilizyną jako adiuwantem, zapewnia skuteczną ochronę przeciwnowotworową, która jest porównywalna z tą, którą zapewnia jedna z najbardziej efektywnych szczepionek z całych komórek wydzielających cytokiny opisywanych w piśmiennictwie jako standard dla szczepień przeciwnowotworowych (Dranoff i in., 1993; Schmidt i in., 1995).

Przykład 3

Szczepienie myszy DBA/2 przeciwko mastocytoma P815 szczepionką nowotworową zawierającą pojedynczy peptyd P815 lub mieszaniną peptydów P815

Następujące peptydy zostały wykorzystane do przygotowania szczepionki:

- kpepl 18 (100 fig na szczepionkę);

- mieszanina peptydów III (kpepll7, kpepll8, kpepl62, kpepl63, kpepl64); ta mieszanina peptydów zawiera wszystkie znane dotychczas peptydy P815; podawano po 25 g każdego peptydu w każdej iniekcji).

Komórki P815 wydzielające GM-CSF były wykorzystane jako kontrola dodatnia.

We wstępnych testach udowodniono, ze kpepl 17 jest peptydem o najlepszym efekcie zabezpieczającym przed zagnieżdżeniem guza P815, gdy 100 jag peptydu jest podawane łącznie z polilizyną (7,5 pg polilizyny/100 fig peptydu, odpowiadające standardowemu wskaźnikowi; polilizyna: łańcuch o długości = 200). Mniejsza ilość kpepl 17 (16 g) była mniej skuteczna. W tym przykładzie, wstrzykiwano 100 pg kpepl 18 każdemu zwierzęciu, w jednym przypadku jedynie z polilizyną (grupa B), następnie z transferyną-polilizyną (grupa C) i ponownie z transferyną-polilizyną/DNA (grupa D). Jako kontrolę zastosowano kpepl 18 w IFA. W tym doświadczeniu, kpepl 18 samodzielnie nie wykazuje ochronnego wpływu przeciwko zagnieżdżeniu guza.

W doświadczeniach przeprowadzonych w przykładzie 4 wykazano, że szczepionka zawierająca mieszaninę peptydową peptydów czerniaka wykazuje ochronne działanie przeciwko czerniakowi. Tak więc, ten przykład był użyty do zbadania czy pomysł z mieszaniną peptydów jest również skuteczny przeciwko P815.

Mieszanina peptydowa III była podawana raz z polilizyną (grupa E), raz z transferynąpolilizyną (grupa F) i raz z trannsferyną-polilizyną/DNA (grupa G). Mieszaninę peptydową ID w IFA stosowano jako kontrolę. Myszy naiwne stosowano jako kontrolę ujemną; komórki P815 transfekowane GM-CSF używano jako kontrolę dodatnią (IO⁵ komórek na mysz).

Doświadczenia przeprowadzone w tym przykładzie były raczej nietypowe w porównaniu z innymi doświadczeniami, w grupie kontroli dodatniej (komórki wydzielające GM-CSF) wszystkie zwierzęta wykazały powstanie guzów szybko po zagnieżdżeniu guza i większość z tych guzów znikła równie szybko jak powstała. Jednym możliwym wytłumaczeniem na to jest to, ze guzy powstały krótko przed ich zniszczeniem.

Drugim możliwym wytłumaczeniem może być to, ze obrzęknięcie zdiagnozowane jako guz nie powstało ze wzrostu guza lecz jako wynik silnego nacieczenia komórek immunologicznych (ziaminiak). Do momentu sekcjonowania zwierząt przyczyna nie może zostać ustalona definitywnie; jednakże w każdym przypadku wytworzone guzy zostały ostatecznie zniszczone. Inny interesujący wynik został uzyskany w grupie G, w której zwierzęta były traktowa20

189 413 ne kombinacją mieszaniny peptydowej III i polilizyny. Wszystkie zwierzęta wytworzyły guzy, lecz u dwóch zwierząt wielkość nacieczenia guzów (Iub naciek komórek immunologicznych) była relatywnie mała, nie zwiększała się i myszy nie wyglądały na chore. Te dwa zwierzęta nie zostały zabite lecz obserwowane. Nieoczekiwanie, guzy były niewykrywalne w dziewięć tygodni po zagnieżdżeniu nowotworu, wynik taki nie był wcześniej zaobserwowany. Na koniec dwa z ośmiu zwierząt zniszczyły swoje guzy. Zniszczenie guzów może wydawać się wynikiem zawartości kpepl 17 w mieszaninie peptydowej, co nie jest analogiczne do przykładu 2, w którym dwa z ośmiu zwierząt było chronionych 16 fig kpepl 17 i trzy z ośmiu zwierząt było chronionych 100 pg kpepl 17. Jednakże efekt ochronny może wywoływać więcej niż jeden peptyd w mieszaninie.

Przykład 4

Zabezpieczenie myszy DBA/2 przeciwko czerniakowi M-3 przez wstępną immunizację szczepionką nowotworową zawierającą mieszaninę peptydów

Użyto szczepionki profilaktycznej zawierającej mieszaninę peptydów czerniaka (mieszanina peptydowa I, ustęp D2).

Procedura wstępnej immunizacji szczepionką i zagnieżdżenia guzów odpowiada procedurze opisanej w przykładzie 2, za wyjątkiem tego, że zagnieżdżenie nowotworów przeprowadzono z komórkami M-3 (IO⁵ komórek na zwierzę). Szczepionką kontrolną była szczepionka z pełnych komórek z komórek M-3, wydzielających optymalna ilość IL-2 (1000-2000 jednostek na Io5 komórek) i przygotowana tak jak to opisał Schmidt i in., 1995. W zastosowanych warunkach testowych szczepionka osiągnęła 100% zabezpieczenia (fig. 4). Czterem grupom zwierząt doświadczalnych podano szczepionki z mieszaniny peptydowej. Dwóm grupom podano peptydy emulgowane w IFA, zarówno s.c. jak i i.p. Innym dwóm grupom podano peptydy razem z polilizyną (pL240), zarówno s.c., jak i i.p.

Na figurze 4 pokazano efekt zabezpieczający szczepionki peptydowej z polilizyną (pL240) jako adiuwantem; 50% leczonych myszy zostało zabezpieczonych przeciwko prowokacji guzem M-3, w porównaniu ze zwierzętami nie leczonymi, u których guzy lite rozwinęły się bardzo szybko. Ten efekt mógł być osiągnięty gdy szczepionka peptydowo-polilizynowa była wstrzyknięta podskórnie lub podana na skórę w postaci hydrozelu (fig. 5). W innych trzech grupach kontrolnych, które były leczone szczepionkami peptyd/polilizyna i.p. lub z peptydami w IFA, szczepionka była zasadniczo nieskuteczna. Tam, usadowione guzy nie zostały odrzucone i guzy rosły z jedynie niewielkim opóźnieniem w porównaniu z nie leczonymi zwierzętami kontrolnymi.

Wyniki te pokazują, że szczepionka zawierająca mieszaninę peptydową osiąga efekt zabezpieczający, jeżeli zawiera polilizynę. W wybranych warunkach testowych szczepionka peptydową posiada jedynie połowę takiej skuteczności jak szczepionka komórkowa IL-2, która zgodnie z wynikami, które ukazały się ostatnio (Zatloukal, 1993; Zatloukal, 1995), zabezpiecza zwierzęta do 100% przeciwko prowokacji IO5 żywych komórek M3.

Przykład 5

Ochrona myszy DBA/2 przed przerzutami M-3

a) Stosowano waco epionkę leczniczą zawi erającą mieązaninę n^entydów czerniaka (mieszanka peptydową I opisana w ustępie D2). Szczepiono trzykrotnie (se) w odstępach tygodniowych. Pierwsze szczepienie podawano pięć dni po zagnieżdżeniu przerzutów i kolejck szczepienia podawano przeciwko pięciodniowym przerzutom. W celu wprowadzenia przerzutów wstrzykiwano 1,2 x IO⁴ komórek M-3, stosując procedurę opisaną w zgłoszeniu WO 94/21808 i przez Schmidt’a i in., 1996.

Stosowana szczepionka była mieszaniną peptydową I: bez a^wa^^ (pkpmixl PBS), z IFA jako a^wa^^ (IFA pepmixl) albo z polilizyną modyfikowana fukozą (fpL pepm!^!). Grupa kontrolna nie ani dostawała szczepionki (naiwna), ani opisanej w przykładzie 4 szczepicnki z pełnych komórek wytwarzających IL2. Na fig. 6 pokazano, że najlepsze zabezpieczenie osiągano w grupie leczonej mieszanką peptydową I z polilizyną modyfikowaną fukozą jako a^wa^^m (fig. 6a). 50% myszy było zdolnych do odrzucenia przerzutów (4/8). To leczenie było nawet bardziej efektywne niż podawanie szczepionki z pełnych komórek, która zabezpieczała jedynie 33% myszy (3/9). Szczepionka peptydowa z IFA albo bez adiuwactu powodowała jedynie opóźnienie wzrostu przerzutów do wielkości guza (fig. 6b).

189 413

b) W innym doświadczeniu, działanie ochronne szczepionki zawierającej mieszaninę peptydową I i podawanej podskórnie badano na modelu terapeutycznym. Grupom kontrolnym podawano mieszaninę peptydowĄ w PBS (bez adiuwanta) lub mieszaninę peptydowĄ z IFA. NiemodyfikowanĄ polilizynę 240 stosowano jako adiuwant. Dodatkowo jako adiuwant używano polilizynę 200 modyfikowaną fukozą. Kontrola składała się z grupy zwierząt otrzymujących szczepionkę komórkową wyrażającą IL-2. Jak pokazano na fig. 7, szczepionka peptyd/polilizyna była skuteczna w leczeniu przerzutów M3. W tym doświadczeniu znaczący wskaźnik wyleczeń uzyskano jedynie z polilizyną modyfikowana fukozą. W tej grupie leczonej 50% zwierząt odrzuciło przerzuty, co jest dobiym wynikiem w porównaniu ze szczepionką IL-2, która leczy 70% zwierząt w tym przypadku.

c) W innym doświadczeniu badano efekt zmian i modyfikacji polikationu na aktywność przeciwnowotworową na modelu terapeutycznym. Dodatkowo badano niezmodyfikowanĄ izmodyfikowaną fukozą polilizynę 200, niezmodyfikowanĄ krótką polilizynę pL16, długą polilizynę pL450 i inny polikation, nazywany poliargininą (pArg720). Szczepionki komórkowe M3 wydzielające optymalną ilość (>10 ng na 1O⁵ komórek) GM-CSF stosowano jako kontrolę dodatnią (Schmidt, 1995). Także w tym doświadczeniu grupy kontrolne otrzymywały mieszankę peptydów w IFA lub bez adiuwantu. W tym przekładzie 5b) najlepszy efekt osiągano stosując fukozę-polilizynę jako adiuwant (fig. 7b). W tych grupach 40% zwierząt odrzuciło przerzuty, w porównaniu z 30% w grupie z krótką polilizyną pL16. Za wyjątkiem grupy, w której podawano peptydy łącznie z poliargniną zwierzęta w innych grupach, w których podawano szczepionkę peptydową wykazywały jedynie opóźnienie tworzenia guzów W tym badaniu niezmodyfikowana poliarginina była równie efektywna jak polilizyna modyfikowana fukozą i prowadziła do odrzucenia przerzutów u czterech na dziesięć zwierząt.

Na figurze 7c pokazano powtórzenie tego efektu osiągniętego z poliargininą w niezależnym doświadczeniu. Ponownie w tym doświadczeniu szczepienie mieszaniną peptydową łącznie z poliargininĄ wykazywało aktywność przeciwnowotworową u czterech z ośmiu leczonych zwierząt.

Przykład 6

Wypełnianie komórek tyrozynazą przy użyciu polilizyny jako adiuwantu

Przykład ten był doświadczeniem mającym na celu pokazanie, ze polilizyną jest przydatna jako adiuwant do napełniania komórek większymi fragmentami białka albo całymi białkami, z komórkami czerniaka M-3 zastosowanymi jako przykładowe komórki.

W celu wypełnienia komórek, 160 pg tyrozynazy znakowanej FITC (EC 1.14, 18.1; Sigma) zmieszano z 3 jig polilizyny (pL240) i inkubowano przez 3 godziny w temperaturze otoczenia. Następnie, uzyskany roztwór umieszczono w kolbie hodowlanej T 75 z 2 x IO⁶ komórek M-3 i inkubowano w 37°C. Następnie, komórki płukano dwukrotnie PBS i odklejono PBS/2 mM EDTA i pobrano w i ml pBs/5% FCS do analizy FACS. Na fig. 8 pokazano napełnianie komórek M-3 tyrozynazą (krzywa po lewej pokazuje kontrolę, krzywa po prawej pokazuje wypełnianie tyrozynazą).

Przykład 7

Określanie aktywacji limfocytów T po immunizacji w modelu terapeutycznym

Po dobitnym wykazaniu wpływu szczepionki peptydu/polilizyny w terapeutycznym modelu zwierzęcym (przykład 5) przeprowadzono badanie w celu stwierdzenia, czy leczenie to prowadzi również do aktywacji limfocytów T. W tym celu, zastosowano wydzielanie cytokin po inkubacji ze splenocytami od zwierząt immunizowanych rodzicielskimi komórkami M-3 działającymi jako znaczniki (Kawakami i in., 1994b).

Jednokomórkową zawiesinę splenocytów wytworzono ze zwierząt szczepionych i nie szczepionych, a następnie zlizowano erytrocyty przy użyciu buforu hipotonicznego (0,15 NH4CI, i mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Komórki przylegające usunięto przez inkubację 3 x IO6 splenocytów na ml w pożywce DMEM (10% FCS) w szalkach Petri’ego przez 90 minut w 37°C. Komórki nie przylegające hodowano z 1 x IO3 komórek rodzicielskich w różnych stosunkach. Komórki hodowano w 200 ul pożywki DMEM (10% FCS), 2 mM L-glutaminy i 20 pg/ml gentamycyny w 96-studzienkowych płaskodennych płytkach hodowlanych. W dniu 9 zebrano 100 (il nadsączu i mierzono zawartość IFN-y przy użyciu

189 413 dostępnego w handlu zestawu ELISA (Endogen, Cambridge, MA, USA) według instrukcji producenta.

Stwierdzono, ze po 9 dniach inkubacji tylko splenocyty zwierząt szczepionych wydzielały znaczne ilości IFN-y do pożywki, podczas gdy w hodowlach splenocytów od zwierząt nie uczulonych i komórek M-3 praktycznie nie można było wykryć IFN-y. Wyniki doświadczenia pokazano na fig. 9.

Przykład 8

Indukcja odporności przeciwwirusowej przy użyciu peptydu nukleokapsydu wirusa grypy ASNENMETM i fukozylowanej polilizyny jako adiuwanta

Zastosowano szczepionkę, która zawierała 75 pg fpLys na mg peptydu ASNENMETM. Szczepionkę podawano w pojedynczym wstrzyknięciu, jak to opisano w rozdziale dotyczącym metod, wstrzykując 100 pg peptydu/7,5 pg fpLys na zwierzę. Jako kontrolę, 100 pg peptydu wstrzykiwano w PBS albo w ogóle nie wstrzykiwano (zwierzęta naiwne).

Komórki chłoniaka mysiego RMA-S inkubowano przez noc w pożywce bez surowiczej w 26°C z 10 pg/ml peptydu ASNENMETM. 10 dni po szczepieniu wyizolowano splenocyty od szczepionych zwierząt, zmieszano z komórkami RMA-S wypełnionymi peptydem w stosunku 5:1 i hodowano przez dalsze 5 dni (Stuber i in., 1994).

Oznaczano liczbę przeżywających efektorowych splenocytów w różnych hodowlach, w celu określenia aktywności CTL przy użyciu standardowego 4-godzinnego testu uwalniania europu (Blomberg i in., 1993). Komórki zmieszano w różnych proporcjach z komórkami RMA-S, które uprzednio połączono z peptydem ASNENMETM i chelatorem europu. Jak pokazano na fig. 10, uzyskano swoistą odporność wyłącznie szczepiąc peptydem i fpLys, ale nie samym podawanym peptydem.

Przykład 9

Badanie różnych zasadowych poliaminokwasów pod względem ich zdolności do nasilania wbudowywania i/lub wiązania peptydów z APC

W tych doświadczeniach zastosowano test fluorescencyjny: modelowy antygen peptydowy o sekwencji LFEAIEGFI (rozpoznawany w kontekście MHC K^d) znakowano barwnikiem fluorescencyjnym izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) według instrukcji producenta (Molecular Probes). Wychwyt albo wiązanie samego peptydu znakowanego FITC („pulsowanie”) albo wraz z różnymi stężeniami zasadowych poliaminokwasów (polilizyna o długości łańcucha równej 16 do 490, poliarginina o długości łańcucha od 15 do 720) przez linię komórkową makrofagów o MHC K^d, P388D1 mierzono cytometrią przepływową.

W tym celu, 1 x 10⁶ komórek P388D1 inkubowano w objętości 1 ml pożywki (DMEM/10% FCS) w probówce wirowniczej z 5 pg samego peptydu znakowanego FITC albo mieszaniną peptydu i poliaminokwasu przez 30 minut w 37°C, a następnie dokładnie płukano w celu usunięcia wolnego peptydu. Poliaminokwasy dodawano w stężeniu 50, 25, 12, 6 i 3 pg na ml pożywki, zawierającej 5 pg peptydu znakowanego FITC.

Względne natężenie fluorescencji różnych próbek porównywano w celu oceny skuteczności wychwytu i/lub wiązania peptydu. Wyniki tych testów pokazano na fig. 11; testy przeprowadzano stosując 25 pg, odpowiednio, pL450 i pArg450. W zastosowanych warunkach stwierdzono, ze poliarginina jest około 5-krotnie skuteczniejsza niż polilizyną.

Przykład 10

Badanie mechanizmu absorbowania peptydów przez APC

Peptydy mogą być absorbowane przez APC przez swoiste mechanizmy, takie jak makropinocytoza albo endozytoza zależna od receptorów (Lanzavecchia, 1996). Alternatywny mechanizm może obejmować poliaminokwasy powodujące zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej i w ten sposób umożliwiające dyfuzję peptydów z ośrodka do komórki.

a) Możliwe zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej badano przez pomiar uwalniania cytoplazmatycznego enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) po inkubacji komórek P388D1 z poliaminokwasami (polilizyną albo poliargininą) w warunkach izotonicznych stosując dostępne w handlu zestawy (Cytotox 96, Promega, Madison, Wisconsin, USA) według instrukcji producenta.

189 413

Na podstawie wyników na fig. 12a można wywnioskować, że wpływ pLys obejmuje spowodowanie zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych, co wyraża się zwiększonym stężeniem enzymu cytoplazmatycznego uwalnianego w warunkach izotonicznych. W przeciwieństwie, po traktowaniu pArg (fig. 12b) LDH była praktycznie niewykrywalna. Gdy próbki traktowano samymi poliaminokwasami nie stwierdzono różnic w uwalnianiu LDH w porównaniu z mieszaniną polilizyny albo poliargininy z peptydem. Po inkubacji z samym peptydem nie wykrywano mierzalnej aktywności LDH.

b) Możliwą intemalizrcję peptydów znakowćaiych FITC w obecnobei albo pob nieobecność zasadowych pcliaminckwasów badano na podstawie zasady opublikowanej przez MMo^ i in., 1993: cząstki iatemalizowanz przez komórki są transportowane do zadosomów. W porównaniu z cytoplazmą albo pożywką hodowlaną, która ma obojętne wartości pH organelle te o pH około 5 są kwasowe.

Fluorescencja emitowana przez FlTC sUme zalezy od pH. W środowisku pH takim jak spotykane w eFnosomach, fluoresceFcja jest zahamowana. Stąd, peptydy znakowane FlTC, które są absorbowane przez komórki do ennosomaw wykazują zmniejszoną fluorescencję. Jeżeli dodaje się monenpzFę, niskie pH eFnoscmów jest zobojętniane, prowadząc do zwiększonej fluoresczFcji iaternalizcwanycC peptynaw znakowanych FlTC.

Komórki inkubowano z mieszaniną poliargiFiay (średni ciężar cząsteczkowy 100000, długość łańcucha 490) i znakowanym fluorzsceFcyjFie peptydem w 4°C i 37°C. Porcję próbki inkubowano w 37°C i pcFowFie traktowano w 4°C 50 μΜ monenzyną przed analizą cytometrią przepływową.

Stwierdzono, ze inkubacja APC ze swoistymi zasadowymi poliaminokwasami, takimi jak pclilizyFa (pLys) i pcliarginina (pArg) ϊ^ζ^ζΑ^ζ wychwyt albo wiązanie peptydów z APC.

Jak widać na fig. 13, obserwowano jedynie słabe zwiększenie fluorescencji w komórkach które traktowano samym pzptzdzm i mcFenpzFą. W przeciwieństwie, sygnały fluoresczFcji były znacznie zwiększone w próbkach, które traktowano moFenpyFą i mieszaniną poliargiFinz i peptydu. Nie obserwowano wychwytu peptydu, gdy próbki inkubowanc w 4°C. lstotny wzrost fluorescencji obserwowano po traktowaniu moaenpyFą, co wskazywało, że wypełnianie peptydami spowodowane pArg powodowało gromadzenie w pęcherzykach w komórce (Winoux i If., 1993, fig. 13).

Jak oczekiwano, po traktowaniu monenzyną próbek z polilizyaą obserwowano jedynie FizzFaczFz wzrost fluoresceacji. Wypełniacie polilizyną w 4°C powodowało mierzalny wzrost fluorzscencji, co jest dalszym wskaźnikiem, ze wpływ polilizyny jest spowodowany wzrostem przepuszczalności błon komórkowych (fig. 12b).

Przykład 11

Badanie wypełniania APC krótkimi peptydami

APC szpiku kostnego i uzyskane przy użyciu GM-CSF badano mikroskopią fluorescencyjną z kombinacją peptydu znakowanego flucrzsczacyJme z polilizyną (pL200; Sigma) albo samym peptydem. Do mikroskopowego wykrywania wychwytu peptydu, komórki APC wysiewano na szkiełkach i inkubowano z 40 pg peptydu LFEAlEGFl znakowanego fluoresceiną albo w mizszamnle 50 pg/ml poIIIIzzcz (pL200) i 40 pg/ml peptydu LFEAlEGFl przez 30 minut w 37°C. Po lntenszwFzm płukaniu, komórki utrwalano preparatem anti-Fadent (Dako, Glostrup, Dania) i poddawano mikroskopii fluorzscencyjazJ (Zeiss). Jądra podbarwiono 4,6-di-amiac-2-fenzloiadclem (DAPl; Sigma).

Jak pokazano na mikrofotografiach fluorescencyjnych na fig. 14, komórki, które inkubcwano z peptydem i pclillzyaą (A) wykazywały istotnie większy wychwyt peptydu niż komórki, które traktowano samym pzptynem (B). Podczas gdy fluorescencja występowała jedynie sporadycznie, zaś cząstki tworzyty się w komórkach, które traktowano („pulsowano”) samym peptydem, inteFszwFa flucresczacja komórek wypełnionych peptydem w obecności pclilizyay nie była zlokalizowana i gzazralmz bardziej jznnolicie rozmieszczona w kcmarcz.

Przykład 12

Pomiar ilościowy wypełniania komórek peptydem przy użyciu cytometrii przepływowej (test wypełniania)

189 413

a) Po przeprowadzeniu, test w przykładzie 11 wykazał, ze APC są doskonałymi komórkami docelowymi do wypełniania małymi peptydami; przeprowadzono test FACS in vitro w celu identyfikacji odpowiednich adiuwantów dla szczepionek nowotworowych.

Test ten umożliwia szybkie ilościowe badanie peptydów znakowanych fluorescencyjnie; peptyd o sekwencji LFEAIEGFI zastosowano jako peptyd modelowy. W tych testach zastosowano mysią linię P388D1 jako APC.

x 10⁶ komórek inkubowano w objętości końcowej 1 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy i 10% FCS przez 30 minut w 37°C z 5 pg peptydu w stężeniu końcowym fluoresceiny 5 nmoli/ml.

Komórki traktowano samym peptydem albo kombinacją peptydu i polikationu, albo peptydu i histonów w rosnących stężeniach (3 do 50 pg/ml), jak stwierdzono na fig. 15.

Zastosowano następujące składniki:

A: poliomityna (średni ciężar cząsteczkowy w zakresie 110000, długość łańcucha 580);

B: histon bogaty w argininę;

C: histon bogaty w lizynę;

D: poliarginina (średni ciężar cząsteczkowy 100000, długość łańcucha 490);

E: polilizyną (średni ciężar cząsteczkowy 94000, długość łańcucha 450).

We wstępnych testach stwierdzono, że okres inkubacji 30 minut dawał maksymalny wychwyt peptydu. Dłuższe traktowanie (4 albo 8 godzin) nie dawało istotnego zwiększenia sygnału fluorescencji. Przed analizą komórki płukano 5-krotnie dużą ilością PBS zawierającego 0,2% BSA. Komórki pobrano w ilości 1 ml lodowatego PBS/0,2% BSA i badano cytometrią przepływową (FACScan; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Poliarginina i polilizyną okazały się być najskuteczniejszymi adiuwantami; poliomityna wykazywała efekt cytotoksyczny w wybranych warunkach. Wzrost wychwytu peptydu spowodowany poliargininą i polilizyną korelował ze stężeniem (fig. 15d, e); wychwyt wzrastał z długością łańcucha (fig. 16).

Obserwowano, ze poliarginina ze wzrostem o 3 rzędy wielkości w porównaniu z kontrolą miała większy zakres przydatnych stężeń niż polilizyną, która wykazywała maksymalny wzrost mniejszy niż 2 rzędy wielkości i we wszystkich zastosowanych długościach łańcuchów jest bardziej skuteczna do transportowania białek niż polilizyną (fig. 16); poliarginina umożliwia skuteczny transport w stężeniach tak niskich jak 3 pg/ml, podczas gdy stężenie polilizyny > 25 pg/ml są konieczne do uzyskania istotnego wzrostu fluorescencji (fig. 15 d, e).

b) W celu określenia czy istnieje dolny limit długości łańcucha dla transportu peptydów, syntetyzowano poliargininy o różnej długości łańcucha (10-30 grup) i badano na zdolność do zwiększania transportu peptydów przy wysokich stężeniach polikationów (fig. 17). Do tych doświadczeń zastosowano peptyd LFEAIEGFI i polimery poliargininowe w stężeniu 100 pg/ml. Obserwowano wzrost, jednakże słaby, w transporcie peptydów nawet w przypadku zastosowanych poliarginin.

c) Zasadowe aminokwasy są cząsteczkami naładowanymi dodatnio. Można stąd wywnioskować, ze ujemnie naładowane peptydy powinny wiązać te polikationy przez oddziaływania elektrostatyczne, które mogą prawdopodobnie prowadzić do wzrostu wychwytu peptydów·'. W celu zbadania tej hipotezy porównywano zdolność kationowych poliaminokwasów do absorpcji peptydów do komórek P388D1 jako funkcję ich ładunku.

Poniższa tabela wymienia ujemnie naładowane peptydy zastosowane w doświadczeniu, które spełniają wszystkie warunki wymagane do wiązania MHC-I (Rammensee i in., 1995). Peptyd 1 pochodzi z mysiego TRP (białko pokrewne tyrozynie), peptyd 2 pochodzi z hemaglutyniny wirusa grypy (Smidt i in., 1996), peptyd 3 pochodzi z mysiej tyrozynazy, peptyd 4 pochodzi z antygenu nowotworowego P198, peptyd 5 pochodzi z beta-galaktozydazy (Gavin i in., 1993). („Mr” oznacza ciężar cząsteczkowy, „fluor” oznacza fluoresceinę).

189 413

Tabela

SCąkcaja	Mr	Mr + fluor	Ładunek	Łdunek + fluor
YAEDYEEL	1031	1389	4 x ujemny	6 x ujemny
LFEAIEGFI	1038	1396	2 x ujemny	4 x ujemny
IFMNGTMSQV	1127	1485	obojętny	2 x ujemny
KYQAVTTTL	1024	1382	1 x ujemny	1 x ujemny
TPHPARIGL	961	1319	2 x ujemny	obojętny

Z powodu zastosowanej metody do znakowania peptydu fluoresceiną, wprowadzono dwa ujemne ładunki. Stwierdzono, ze po inkubacji z poliargininą peptydy (5 nmol na próbkę) o najwyższej liczbie ładunków ujemnych ulegały najskuteczniejszemu transportowi do komórek P388D1, co wskazuje, że oddziaływania jonowe pomiędzy peptydem i polikaticnem dalej zwiększały transport peptydów do komórki (fig. 18).

Jednakże, w porównaniu z innymi komórkami, które traktowano samym peptydem, większe ilości były absorbowane w przypadku peptydów obojętnych w obecności polikationów. Traktowanie samym peptydem powodowało praktycznie identyczny sygnał fluOTescencji z wszystkimi badanymi peptydami; dla celów prezentacji sygnał fluoresceccji uzyskany z samym peptydem LFEAIEGFI pokazano na fig. 18 jako „sam peptyd” w reprezentatywnej wielkości.

LITERATURA

A^ander, J. et al., 1989, lmmuccgkcetics 29, 380 Allrad. D. C. et al., 1992, J. Glin. Oncol. 10 (4), 599-605 Avrameas, A. et al.,1996, Eur. J. Immunol. 26, 394-400 Behr, J. P., 1994, Bioconjug-Chem., Sept-Oct, 5(5), 382-9 Bertoletti, A. et al., 1994, Nature 369, 407-410

Biologie Therapy of Cancer, Editors: D^ita, Y. T. Jr., Heilman, S., Rosenberg, S. A., Verlag J. B. Lippmcctt Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown

Blomberg, K. und Ulfstedt, A. C., 1993, J. Immunol. Methods 160: 27-34 Bomford, R., et al., 1991, Vaccmcs 25-32

Booc, T., 1992, Adv. Cancer Res. 58,177-210 Boon, T., 1993, Spektrum der Wissenschaft (Mai), 58-66

Booc, T. et al., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 337-65 Boon, T. und van der Bruggen, P., 1996, J. Exp. Med. 183,725-729 Braciale, T. J. und Braciale, V. L., 1991, Immunol. Today 12, 124-129 Brocke, S. et al., 1996, Nature 379 (6563), 343-346

Bronte, et al., 1995, J. Immunol. 154, 5282

Carrel, S. und Johnson, J. P., 1993, Current Opinion in Occology 5, 383-389 Coligan, J. E., et 1991, Nature 351, 290-296

Coligan, J. E., et al., 1991, Current Prot, in Immunol., Wiley, New York

Coulie, P. G. et al., 1992, Int. J. Cancer, 50, 289-297

Coulie, P. G. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7976-80

Coulie, P. G. et al., 1994, J. Exp. Med. 180, 35-42 Cox, A.L. et al., 1994, Science 264,

5159, 716-9 Current Protocols im Molecular Biology, 1995, ^^^geber: Ausubel F.M., et al., John Wiley & Sons, Inc.

Dranoff, G. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543 Dracoff, G. und Mulligan, R.C., 1995, A^ances in Immunology 58, 417 Falk, K. tat., 1991, Nature 351, 290-296

Feigner, J. H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 Feltkamp, M. C. et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25 (9), 2638-2642

189 413

Fenton, R. G. et al., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16,1294-302

Fisk, B. ketal., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117 Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, Vol. 33, Herausgeber: Darzynkiewicz, Z. und Crissman, H.A.

Gedde Dani, T. et al., 1992, Hum Immunol. 33, 4, 266-74 Grohmann, U. et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25, 2797-2802

Guarini, A. et al., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64

Han, X. K. et al., 1995, PNAS 92, 9747-9751

Handbuch: FACS Yantage TM User's Guide, April 1994, Becton Dickinson

Handbuch: CELL Quest TM Software User's Guide, June 1994, Becton Dickinson

Henderson, R. A., und Finn, O. J., 1996, Advances in Immunology 62, 217-256

Herin M. et al., 1987, Int. J. Cancer, 39, 390

Hock, H. et al., 1993, Cancer Research 53, 714-716

Houbiers, J. G., et al., 1993; Eur. J. Immunol. 23, 2072-7

Huang, A. Y. C., und Pardoll, D. M. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-5

Inaba, K., et al., 1992, J. Exp. Med. 176, 1693-1702

Jung, S. et al., 1991, J. Exp. Med. 173, 1, 273-6

Kawakami, Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6458-62

Kawakami, Y. et al., 1994a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,9, 3515-9

Kawakami, Y. et al., 1994b, J. Exp. Med. 180, 1, 347-52

Kawakami, Y. et al., 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968

Karre, K. et al., 1986, Nature 319, 20. Feb., 675

Kersh, G J. et al., 1996, Nature 380 (6574), 495-498

Kovacsovics Bankowski, M. und Rock, K.L., 1995, Science 267, 243-246

Lanzavecchia. A., 1996, Cum Opin. Immunol. 8, 348-354

Lehmann, J. M. et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895

Lethe, B. et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22, 2283-2288

Li, H., et al., 1989, J. Exp. Med. 169, 973-986

Lili, N. L., Tevethia, M. J., Hendrickson, W. G., und Tevethia, S. S. (1992). J. Exp. Med. 176, 449-57

Ljunggren, H. G., et al., 1990, Nature 346: 476-480

Loeffler, J.-P. et al., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618

Lopez, J. A., et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 217-223

MacBroom, C. R. et al., 1972, Meth. Enzymol. 28, 212-219

Mackiewicz, A. et al., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811

Malnati, M. S. et al., 1995, Science 267, 1016-1018

Mandelboim, O. et al., 1994, Nature 369, 5 May, 67-71

Mandelboim, O. et al., 1995, Nature Medicine 1, 11, 1179-1183

Marchand, M., et al., 1995, Int. J. of Cancer 63, 883-5

Mcintyre, C. A., et al., 1996 Cancer Immunol. Immunother. 42: 246-250

Midoux, P., et al., 1993, NATO ASI Series H67,49-64

Morishita, R. et al., 1993, J. Glin. Invest. 91, 6, 2580-5

Nabel, G. J. et 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,11307-11311 Noguchi, Y. et 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3171-3175

Oettgen, H. F. und Old, L. J., 1991, Biologie Therapy of Cancer, Editors De Vita, Y. T. Jr., Heilman, S., Rosenberg, S.A., Verlag J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87-119

Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727

Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, Editors: Leslie Hudson and Frank C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne Peace, D. J. et 1991, J. Immunol. 146, 6, 2059-65

Peoples, G. E. et al., 1994, J. Immunol. 152, 4993-9

Plautz, G E. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649

Porgador, A., Gilboa, E., 1995, J. Exp. Med. 182, 255-260

Puccetti, P. et al., 1995, E-ur. J. Immunol. 24, 1446-1452

Rammensee, H. G., et al., 1993, Annu. Rev. Immunol. 11,21344

189 413

Rammensee, H. G., et al., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 3544 Rammensee, H. G., et al., 1995, Current Biology 7, 85-96 Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in immunology 7, 85-96 Rammensee, H. G., et al., 1995, Immunogenetics 41,178-228

Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Auflage 1990, Mack Publishing Company, Easton, Penn. 1990

Remy, J. S. et al., 1994, Bioconjug-Chem., Nov-Dec, 5(6), 647-54 Rennie, J. und Rusting, R., 1996, Scientific American September, 28-30 Rivoltini, L. et al., 1995, The Journal of Immunology 154, 5 2257-2265 Robbins, P. F., et aa., 1994, Gaiicem Res 54, 3124-6

Robbins, P. F.. ee ak. 11>95, J. Immirnok 114, 5994-50

Robbins, P. F. und IRżf^c^tn^c^r^r^, S.A.. H96, Ioum. Exp. Med. 183, 1185-92.

Robbins, P. F. und Kawakamą Y. D96, Cum Opin. Immimok 8, 628-636 Roitt I. M., Brostoff J., Male D. K. Immunology, Churchill Livingstone Rosenberg, S. A.,1996, Annual Reviews of Medicine. 47, 481-491 Ryser, H. J. und Hancock, R., 1965, Science 150, 501-503

Ryser, H. J. und Shen, W. C., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3867-3870 Schmidt, W., et al., May 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4711-4714 Schmidt, W., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9759-63 Sette. A. et 1 9944 Mol. Immuunl. 3ł (11): 818^8^2,

Shen, W. C. unu Ryser, H , J., 1 978, Proc.NatL Acad. Aci. U SA. 75. 18/71-1871

Shen, W. C. unu RyRer, H , H.j 1 979, M^l.JO^r^ac^i^a. ma, 61 4-62/2

Shen, W. C. unu Ry^^i^, H , H.j 1 981, Proc.NatL ANad. Aci. U Sci. 7S. 7587-7597

Skipper, J., und Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5,1493-2

Slingluff, C. L. et al., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740

Stein, D. et al., 1994, EMBO Journal, 13, 6, 1331-40

Stuber, G. et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 769-768

Sykuiev, Y. et al., 1994, Immunity

Theobald, M., L^ine, A. J., und Sherman, L. A. 11995) PNAS 92, 11993-7 Tibbets, L. M. et al., ^993, Cancer, Jan. 15, Vol. 71,2, 315-321 Tykocinski, M. L. et al., 1996, Am. J. Pathol. U—, 1-16 van der Bruggen, P. et al., )994, Eur. J. Immunol. 24, 9, 2134-40 Issn: 0014-2980 Van der Eynde, B. und Brichard, V. G., 1995, Current Opinion Immunol. 7, 674-2)

Van Pel, A. und Boon, T„ 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4812-4822 Van Pel, A., et al., 1995, Immunological Reviews 145, 229-250

Vitiello, A. et al, )495, J. Glin. Inv. 95,1, 341-349

Wagner, E., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-4

Wagner, E., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6099-)03

Wang, R. F., et al., ^, J. Exp. Med. 181, 744-804

Weynants, P. et al., 1994, Int. J. Cancer 56, 826-229

Widmann, C. et al., )992, J. Immunol. Methods 155 O), 99-99

Wolfel, T. et al., )994 a), Int. J. Cancer 97,413-4)2

Wolfel, T. et al., 1994 b), Eur. J. Immunol. 24, 759-764

York, I. A. und Rock, K. L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396

Yoshino, I. et al., 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400

Yoshino, I. et al., 1994 b), Cancer Res., 54, 13, 3387-90

Young, J. W., Inaba, K., )996, J. Exp. Med., 183, 7-11

Zatloukal, K. et al., 1993, Gene )39,199-20

Zatloukal, K. et al., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419

189 413

189 413

TYGODNIE PO ZASIEDLENIU GUZA

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

189 413

ZWIERZĘTA BEZ GUZA (%) ZWIERZĘTA BEZ GUZA (%)

117lFAs.o1B|is

117IFAsc100pa

117lFA|p1i|iO

117IFAIp 100μα

P81EOM-CSF

NAIWNE

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

117W 16μο sc

117trt16|iglp

117W100pflCC

117W100w)lp

P815OM-CSF

NAIWNE

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

189 413

FIG.3.

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

189 413

ZWIERZĘTA BEZ GUZA (%) ZWIERZĘTA BEZ GUZA (%)

NAIWNE M3 IL-2 AVET fpLpepmix1

TYGODNIE PO ZASIEDLENIU SIĘ PRZERZUTÓW

189 413

FIG.7a.

BEZ LECZENIA

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

189 413

FIG. 7b.

FIG. 7c.

TYGODNIE PO EKSPOZYCJI

189 413

BIU9Z0II2

189 413

FIG.9.

STOSUNEK KOMÓRKI EFEKTOROWE/KOMÓRKI RMA/S

189 413

ZLICZENIA

FIG.11.

LOG FLUORESCENCJI POLILIZYNĄ

LOG FLUORESCENCJI POLIARGININA

189 413

FIG. 12.

A POLIARGININA

O 10 20 30 40 50 60 70 % UWALNIANIA LDH

10 20 30 40 50 60 70 % UWALNIANIA LDH

FIG. 13.

<

UJ

N

O

pArg + MON pArg pArg 4C

SAM PEPTYD + MON SAM PEPTYD KONTROLA

LOG FLUORESCENCJI

189 413

Fig. 14

i.' ‘ , · # · · <*

189 413 <

z

UJ

N

O

FIG. 15a.

50gg

25gg

12gg

6gg

3gg

SAM PEPTYD KONTROLA

LOG FLUORESCENCJI POLIORNITYNA

LOG FLUORESCENCJI HISTON BOGATY W ARGININĘ

189 413

LOG FLUORESCENCJI ►

HISTON BOGATY W LIZYNĘ

POLIARGININA

189 413

ZLICZENIA

FIG. 15c.

50gg

25gg

12pg θμ9

3μ9

SAM PEPTYD KONTROLA

LOG FLUORESCENCJI POLILIZYNA

189 413

FIG. 16.

pLys 450 pLys 200 pLys 100 pLys 36

SAM PEPTYD KONTROLA

LOG FLUORESCENCJI -1

ZLICZENIA

189 413

LU

N

O _i

N

FIG. 18.

+ Arg

SAM PEPTYD KONTROLA

LOG FLUORESCENCJI

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz

Cena 6,00 zł

Claims (34)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja farmaceutyczna do immunomodulacji osobnika, znamienna tym, ze zawiera

   a) jeden lub więcej antygenowych peptydów, białek lub ich fragmentów, które pasują do i wiążą się z bruzdą wiążącą cząsteczki MHC, wyrażanej przez danego osobnika i

   b) adiuwant wybrany z grupy składającej się z

   1. poliargininy, ii. polilizyny, iii. poliomityny, iv. histonów,

   v. protamin, vi. polietylenoimin i vii. ich mieszanki;

   przy czym adiuwant ten jest zdolny do zwiększania wiązania tych peptydów z komórkami tego osobnika i/lub wejścia tych peptydów do komórek prezentujących antygen i doprowadza w ten sposób do wzrostu aktywności immunomodulacyjnej tych peptydów.
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, ze peptyd albo produkt rozkładu komórkowego białka, albo fragmentu białka jest ligandem przynajmniej jednej cząsteczki MHC, która jest wyrażana przez leczonego osobnika.
3. 3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, ze peptyd albo produkt rozkładu komórkowego białka, albo fragmentu białka jest ligandem cząsteczki MHC-I.
4. 4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że peptyd albo produkt rozkładu komórkowego białka, albo fragmentu białka jest ligandem cząsteczki MHC-II.
5. 5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera peptyd pochodzący z białka czynnika patogennego.
6. 6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, ze peptyd pochodzi z białka bakteryjnego.
7. 7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, ze peptyd pochodzi z białka wirusowego.
8. 8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, ze jest przeznaczona do zastosowania jako szczepionka nowotworowa i zawiera białko, które jest antygenem nowotworowym albo fragment białka, albo peptyd, albo peptydy pochodzące z antygenu, albo antygenów nowotworowych.
9. 9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że jest przeznaczona do zastosowania terapeutycznego i zawiera antygen albo antygeny nowotworowe pochodzące z antygenów nowotworowych wyrażanych przez leczonego osobnika.
10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, ze jest przeznaczona do zastosowania profilaktycznego i zawiera antygeny nowotworowe pochodzące z reprezentatywnych, powszechnie występujących antygenów nowotworowych.
11. 11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, ze antygen nowotworowy (antygeny nowotworowe) jest albo są antygenami czerniaka.
12. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, ze zawiera również cytokinę.
13. 13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 12, znamienna tym, ze cytokinąjest IL-2.
14. 14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że cytokina wybrana jest z grupy obejmującej IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, IFN-y, IFN-ω, TNF-a, GM-CSF albo ich mieszaniny.
15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera wiele peptydów, które różnią się tym, ze wiążą się z różnymi podtypami MHC leczonego osobnika.

    189 413
16. 16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, ze zawiera jeden albo wiele peptydów pochodzących z naturalnie występującego białka immunogennego albo antygenu nowotworowego, albo ich produktu rozkładu komórkowego.
17. 17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, ze zawiera jeden albo wiele peptydów, które różnią się od peptydów pochodzących z naturalnie występującego białka(ek) immunogennego(ych) albo antygenu(ów) nowotworowego(wych), albo ich produktów rozkładu komórkowego.
18. 18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, ze peptyd jest antagonistą peptydu, który pochodzi z białka, które wywołuje chorobę autoagresyjną
19. 19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, ze adiuwant jest polikationem organicznym albo mieszaniną polikationów organicznych.
20. 20. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, ze peptyd jest naładowany ujemnie.
21. 21. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19 albo 20, znamienna tym, że adiuwant jest zasadowym poliaminokwasem albo mieszaniną zasadowych poliaminokwasów.
22. 22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21, znamienna tym, że adiuwantem jest poliarginina.
23. 23. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21, znamienna tym, że adiuwantem jest polilizyna.
24. 24. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21, znamienna tym, że adiuwant jest sprzęgnięty z ligandem komórkowym.
25. 25. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 24, znamienna tym, ze ligandem jest grupa węglowodanowa.
26. 26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, ze ligandem jest fukoza.
27. 27. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 24, znamienna tym, ze ligandem jest transferyna.
28. 28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 24, znamienna tym, że zawiera również DNA, który jest pozbawiony sekwencji kodujących funkcjonalne białka.
29. 29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 24, znamienna tym, że zawiera również DNA, który koduje białko immunomodulujące.
30. 30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, ze białko immunomodulujące wybrane jest z grupy obejmującej IL2, IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, DFN-y, IFN-co, TNF-a, GM-CSF albo ich mieszaniny.
31. 31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że służy do podawania pozajelitowego
32. 32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 31, znamienna tym, ze ma postać roztworu albo zawiesiny peptydu i adiuwanta w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku.
33. 33. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że służy do podawania miejscowego.
34. 34. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, ze ma postać hydrozelu.