JP2007525157A - 肺炎連鎖球菌抗原 - Google Patents

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Abstract

本発明は、肺炎連鎖球菌由来の過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする核酸分子および過免疫血清反応性抗原またはその断片、かかる抗原の単離方法およびその特定の使用を開示する。

Description

本発明は、肺炎連鎖球菌により引き起こされる細菌感染症の予防および治療のための医薬の調製における使用に好適な、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の抗原をコードする単離核酸分子に関する。
肺炎連鎖球菌(肺炎球菌)は、槍状の、グラム陽性の、通性嫌気性細菌である。それはヒトおよび実験動物に対して病原性の唯一の被包性生物である。被膜は抗原性であり、血清型により肺炎球菌を分類するための基礎を形成する。90の血清型が、型特異的抗血清によるその反応に基づいて同定されている。ほとんどの肺炎連鎖球菌の血清型は重篤な疾患を引き起こすことが示されており、10のもっとも一般的な血清型は世界中の侵入型疾患の約62％の原因であると評価されている。順位および血清型有病率は年齢群および地理的領域によって異なる。
肺炎球菌は気道に一般的に生息し、正常な成人の5％〜70％の上咽頭から単離することが出来る。無症候性保因者の率は、年齢、環境、および上気道炎の存在によって変動する。子供をもたない成人では5％-10％のみが保因者である。学校および児童養護施設においては、学生と住人の27％〜58％が保因者であり得る。軍事施設では、人員の50％〜60％もが保因者であり得る。保因期間は様々であるが、一般に成人よりも子供の方が長い (Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases、7th Edition-Second Printing、The Pink Bookに概説)。
保因と自然免疫の発達との関係はよくわかっていない。さらに、保因者において疾患を起こらせる免疫学的機構はあまりよくわかっていない。
肺炎連鎖球菌は高齢者(the extremities of age)および基礎疾患を有するものにおいてはヒト疾患の重要な病原体である。肺炎球菌疾患は、その他のワクチンで予防できる疾患をすべてあわせたよりも多くのヒトの死因であり、米国では１年に４万人以上が死んでいる。肺炎球菌疾患の主な臨床症候群には、肺炎、菌血症、および髄膜炎が含まれる。疾患は、素因となる異常、特に肺疾患が存在する場合に起こりやすい。それは前駆ウイルス気道感染、例えばインフルエンザおよび麻疹、そして慢性症状、例えば、慢性閉塞性肺疾患、糖尿病、うっ血性心不全、腎不全、喫煙およびアルコール依存症に一般的な細菌性合併症である。肺炎球菌感染症は、呼吸器疾患が流行している冬季および早春においてより多くみられる。免疫不全(脾臓機能不全、医原性など)が致死的な肺炎球菌感染症の発達の危険因子である。というのは、細菌の排除力が低下し、抗体が欠損するからである。潜伏期間は短く、1-3日間である。症状には、突然の発熱および悪寒戦慄または硬直、喀痰を伴う咳、胸膜炎性胸痛、呼吸困難、頻脈および低酸素症が含まれる。
肺炎連鎖球菌は、米国における菌血症感染の88％の原因である。肺炎はもっとも一般的な形態の侵入型肺炎球菌疾患である:１年に150.000-570.000の症例(米国)である。 36％の成人地域感染型および50％の院内肺炎は肺炎連鎖球菌によって引き起こされる(米国)。65歳以上の成人の疾患の発生率は、~60症例/100.000であると報告されている。この疾患の致死率は、２歳以下では1.4％であるが、80歳以上では20.6％に上昇する。インフルエンザおよび肺炎球菌によって引き起こされる疾患はともに65歳以上のヒトの５番目までの死因に入る。これら病原体に起因する死亡率はこの年齢群では90％を超える。菌血症は肺炎を患う患者の約 25-30％において起こる。菌血症の全死亡率は約20％であるが、老人においては60％にもなりうる。1998年における、すべての死の51％が65歳を超える年齢群に起こった侵入型肺炎球菌疾患に起因する。肺炎球菌は米国における細菌性髄膜炎のすべての症例の13％-19％をもたらす。肺炎球菌髄膜炎の症例は毎年3,000〜6,000起こると評価される。肺炎球菌髄膜炎の患者の４分の１が肺炎も患っている。臨床症状、髄液プロフィールおよび神経性合併症は化膿性細菌性髄膜炎の別の形態に類似している (Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases、7th Edition-Second Printing、The Pink Bookに概説)。
子供においては、肺炎球菌は急性中耳炎の一般的な原因であり、中耳吸引液の28％-55％において検出される。12月齢までに、62％の子供は、急性中耳炎の少なくとも１回の発症を経験する。中耳感染症は米国においては小児科に訪れるもっとも多い理由であり、年間2000万以上の患者が訪れる。肺炎球菌中耳炎の合併症には、乳様突起炎および髄膜炎が含まれうる。感染部位がわからない菌血症は2歳未満の子供の中でもっとも一般的な侵入型臨床所見であり、この年齢群の侵入型疾患のおよそ70％を占める。菌血症肺炎は２歳未満の子供の侵入型肺炎球菌疾患の12％-16％を占める。侵入型 Hib 疾患の減少と共に、肺炎連鎖球菌は米国における５歳未満の子供の細菌性髄膜炎の最も多い原因となってきた。1歳未満の子供は肺炎球菌髄膜炎の率が最も高く、100,000 人につきおよそ10症例である。５歳未満の子供の肺炎球菌疾患による苦しみはかなりのものである。侵入型疾患は１年に17,000症例があると見積もられており、そのなかで13,000症例は感染部位のわからない菌血症であり、約 700症例は髄膜炎である。侵入型肺炎球菌疾患の結果、１年に200人の子供が死んでいると評価されている。侵入型疾患であるとは考えられていないが、急性中耳炎は１年に500万の症例が５歳未満の子供におこっていると見積もられている（Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases、7th Edition-Second Printing、The Pink Bookに概説)。
肺炎連鎖球菌による感染であるという決定的な診断は、血液またはその他の通常は無菌の身体の部位からのその生物の単離に一般的に依存する。体液における莢膜多糖類抗原を検出する試験も入手可能である。
ペニシリンは治療用に選ばれた薬剤である。しかし、抗-感染療法の実現の成功が、広範な抗菌薬耐性のために難しくなってきた。ペニシリンに対する耐性が生じ、最近の報告によると、米国において〜25％に達する｛Whitney、C. et al.、2000｝。マクロライド-耐性株の割合は〜20 ％ に達した｛Hyde、T. et al.、2001｝。抗菌薬の使用は、肺炎連鎖球菌の？-ラクタムおよびマクロライドへの耐性の上昇と強く相関している｛McCormick、A. et al.、2003｝。
しかし、有効な抗生物質治療 (感受性株)によっても、侵入型疾患の致死率は先進国において平均10％と高く、特定の血清型、老齢の患者および菌血症または髄膜炎の場合はより高くなるであろう(80％まで)。
したがって、肺炎球菌感染症の予防または軽減のための有効な治療法が必要とされている。ワクチンは連鎖球菌による感染症を予防できるだけでなく、より特異的に宿主組織 (特に上咽頭)への定着を予防または軽減することが出来、それによって、上気道炎およびその他の膿性感染症、例えば中耳炎の発生率を低下させる。侵入型疾患 - 肺炎、菌血症および髄膜炎、および敗血症 -の排除は、急性感染の発生率および生物の保因を直接の結果として減少させるであろう。ヒト感染症をもたらす肺炎連鎖球菌株の大多数に対して交差保護を示すことが出来るワクチンは、すべてのその他の連鎖球菌種、すなわち群A、B、CおよびGによってもたらされる感染症を予防または軽減するのに有用であろう。
ワクチンはいろいろな種類の抗原を含みうる。抗原の例としては、死んだまたは弱毒化した生物全体、これら生物/組織の細画分、タンパク質、またはそのもっとも単純な形態において、ペプチドが挙げられる。抗原はグリコシル化タンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識され得、多糖または脂質を含んでいてもよい。短いペプチドも利用できる。というのは例えば、細胞障害性Ｔ細胞(CTL)は主要組織適合性遺伝子複合体 (MHC)と結合した通常8-11アミノ酸長のペプチドの短い形態における抗原を認識するからである。B-細胞は 4-5 アミノ酸といった短い直鎖状エピトープおよび三次元構造 (高次構造エピトープ)を認識することが出来る。持続性の、抗原-特異的免疫応答を得るためには、アジュバントが、免疫系のすべての細胞を伴う免疫カスケードをトリガーする必要がある。第一に、アジュバントはその作用機序に限定されず、いわゆる抗原提示細胞(APC)に作用する。これら細胞は通常まず抗原に遭遇し、次いで加工されたかまたは非修飾の抗原を免疫エフェクター細胞に提示する。中間細胞タイプも関与しうる。適切な特異性を有するエフェクター細胞のみが生産的（productive）免疫応答において活性化される。アジュバントはまた、抗原および共注入されたその他の因子を局所的に保持しうる。さらに、アジュバントはその他の免疫細胞に対する化学誘引物質としても作用し得、あるいは免疫系の刺激剤として局所的および/または全身的に作用しうる。
有効な肺炎球菌ワクチンを開発する努力は1911年から始まっている。しかし、1940年代におけるペニシリンの出現により、ワクチンに関する興味は低くなり、多くの患者は抗生物質による治療にかかわらず死んでいることが観察された。60年代後半から、多価ワクチンの開発のために再び努力が行われた。最初の肺炎球菌ワクチンは、14種類の肺炎球菌細菌からの精製された莢膜多糖類抗原を含むものであった。1983年には、23-価の多糖ワクチン(PPV23)が認可され、14-価のワクチンにとってかわったため、それはもはや生産されていない。PPV23は、88％の菌血症肺炎球菌疾患を引き起こす23タイプの肺炎球菌細菌からの多糖抗原を含む。さらに、交差反応性が、さらに8％の菌血症疾患の原因となるいくつかの莢膜タイプに対して起こる。２つの多糖ワクチンが米国において入手できる(Pneumovax 23、Merck、および Pnu-Immune 23、Wyeth-Lederle)。両方のワクチンは、25 μgの各抗原を用量当たり含み、フェノールまたはチメロサールのいずれかを保存料として含む。
最初の肺炎球菌接合(conjugate)ワクチン (PCV7、Prevnar)は米国において2000年に認可された。それはCRM197として知られるジフテリア毒素の非毒性変異体と結合させた7つの血清型の肺炎連鎖球菌の精製された莢膜多糖(4、9V、14、19F、23F、18C、および6B)を含む。Prevnarに含まれる血清型は1978-1994年の米国における、菌血症の86％、髄膜炎の83％そして６歳未満の子供の急性中耳炎の65％を占める (Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases、7th Edition-Second Printing、The Pink Bookに概説)。肺炎連鎖球菌の9および11の血清型を含むさらなる肺炎球菌多糖接合ワクチンが開発されている。ワクチンは筋肉内に投与される。4用量のPrevnar ワクチンを受けた後、実質的にすべての健康な幼児において、ワクチンに含まれるすべての7の血清型に対する抗体が生じた。Prevnarは鎌形赤血球疾患および HIV感染を患うものも含む幼児および子供において免疫原性であることも示された。大規模な臨床試験において、Prevnarはワクチン血清型による侵入型疾患を低減し、ワクチンに含まれない血清型も含むすべての血清型による侵入型疾患を低減することが示された。Prevnarを与えられた子供では、ワクチンされなかった子供と比べて、急性中耳炎の発症が減り、中耳腔換気用チューブの装備が減った。Prevnarの後の保護の持続期間は現在は知られていない。Prevnarによる免疫化は、ワクチン血清型の上咽頭の保因率を低下させるが、全保因率には影響しない。残念なことに、血清型再分布、即ち、Prevnarによってカバーされない株によるワクチン血清型の置換が誘導されることが示されている｛Pelton、S. et al.、2003｝。
肺炎球菌ワクチンは定期的に以下のものに投与するよう推奨されている：i.、定期的な幼児期免疫化スケジュールの一部としてすべての子供、ii.、65歳以上の成人および、iii.、例えば、心血管疾患、肺疾患、糖尿病、アルコール依存症、硬変、または髄液漏を含む慢性疾患であって正常な免疫系を有する２歳以上の者。老人においては、肺炎球菌ワクチンとインフルエンザワクチンとに対する標的群はオーバーラップする。これらワクチンは、同時に異なる部位に、副作用を高めることなく与えることが出来る。
危険性の高い個体(基礎疾患 主にウイルス気道感染、免疫不全、を有する個体)において有効な抗生物質治療にもかかわらず高い死亡率が観察されている。mAb アプローチは重篤な疾患を患う患者を標的とし、細菌の排除のための迅速な免疫促進を提供する。オプソニン作用を介して、細菌は食細胞によって殺され、抗生物質によっては血中で溶解されない。この作用機構によって、敗血症患者の臨床症状を悪化させる毒素(例えば、肺炎球菌溶血素およびその他の細胞毒素)の放出の排除が助けられる。モノクローナル抗体産生技術における最近の進展により、ヒト抗体医薬の作成および抗体療法の再導入のための手段が提供される一方、血清療法に関連する毒性が避けられるようになった。免疫グロブリンは非常に多目的な抗微生物タンパク質のクラスであり、新たな感染性疾患の予防および治療に用いることが出来る。抗体療法は｛Burnie、J. et al.、1998｝に概説されているように様々な微生物に対して有効であった。
莢膜特異的抗体は高度な保護を示すが、どの濃度のかかる血清型-特異的抗体が疾患に対して保護するか明らかではなく、かかる抗体の、濃度よりもオプソニン活性および親和性が、保護のより重要な決定因子であることが最近明らかになった。
タンパク質接合ワクチンは、疑いなく肺炎球菌疾患に対する戦いにおいてアマルマトリウム（amarmatorium）に追加される強力な新兵器であるが、ワクチンは限られた数の肺炎球菌血清型しか含まず、適当な生態学的圧力を与えられると、非ワクチン血清型による置換疾患が現実的な脅威として残り、疾患の負荷が非常に高い領域では特にそれが残る。
ここ１０年間、いくつかの肺炎球菌タンパク質の免疫原性および保護能力が動物モデルにおいて記載されており、現在では種共通の（species-common）タンパク質に基づくワクチンの開発が求められている。かかるタンパク質は、肺炎球菌表面タンパク質 A (PspA、｛McDaniel、L. et al.、1991｝; ｛Roche、H. et al.、2003｝)、肺炎球菌表面アドヘシン A (PsaA、｛Talkington、D. et al.、1996｝)、コリン結合タンパク質 A (CbpA、｛Rosenow、C. et al.、1997｝)、LytB グルコサミニダーゼ、LytC ムラミダーゼ、PrtA セリンプロテアーゼ、PhtA (histidine triad A) および肺炎球菌ワクチン抗原 A (PvaA) ｛Wizemann、T. et al.、2001｝; ｛Adamou、J. et al.、2001｝である。
グラム陽性生物の表面に提示されるいくつかのタンパク質または酵素はかなり病原性に寄与しており、かかる病原体によっておこる疾患プロセスに関与している可能性がある。しばしば、これらタンパク質は、宿主組織との直接相互作用または宿主の防御機構からの細菌表面の保護に関与している｛Navarre、W. et al.、1999｝。肺炎連鎖球菌はこの点で例外ではない。いくつかの表面タンパク質が、肺炎球菌病原性に重要な病原性因子として特徴づけられており、｛Jedrzejas、M.、2001｝に要約されている。これらタンパク質に対する抗体がヒトに対してより良好な保護を付与するのであれば、より伝統的な莢膜多糖ワクチンとともに、あるいはそれにとってかわって用いられる、新規なタンパク質に基づく肺炎球菌ワクチンのソースを提供しうる。潜在的ワクチンのための抗原としての上記タンパク質のいくつか、および多数のさらなる候補の使用が｛Di Guilmi、A. et al.、2002｝ に概説されており、これらは同定の容易性または入手の機会に基づいた選択によって主に得られたものである。より網羅的なやり方で、肺炎連鎖球菌に対する関連抗原を同定することが求められている。
本発明者らは、特定の病原体、特に黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌からの過免疫血清反応性抗原の同定、単離および産生方法を開発した(WO 02/059148)。しかし、生物学的特性、病原性機能および遺伝的背景の相違により、肺炎連鎖球菌はブドウ球菌株とは異なっている。重要なことに、肺炎連鎖球菌からの抗原の同定のための血清の選択は、黄色ブドウ球菌のスクリーニングに適用したものとは異なる。３つの主なタイプのヒト血清をこの目的のために収集した。第一に、45歳未満の好ましくは家庭内に小さい子供がいる健康な成人を肺炎連鎖球菌の上咽頭での保因について試験した。肺炎連鎖球菌の保因者である幼児の割合は高く、子供は家族メンバーの曝露源とみなされる。相関データに基づくと、保護(定着中和)抗体は、肺炎連鎖球菌の保因者ではない曝された個人(家庭内に高い保因率の子供がいる)において存在しているようであった。関連血清源の選択を可能とするために、抗-肺炎連鎖球菌IgGおよびIgA 抗体レベルを測定する一連のELISAを、細菌可溶化液および培養上清タンパク質を用いて行った。高力価の非保因者からの血清をゲノムに基づく抗原同定に含めた。ヒト血清の選択のためのこのアプローチは黄色ブドウ球菌に用いたものとは基本的に非常に異なり、黄色ブドウ球菌の場合は、保因または非保因状態は抗体レベルと関連性が無かった。第二に、侵入型肺炎球菌疾患の回復期患者からの血清サンプルを特徴付け、同様に選択した。長期的に収集したサンプルを含む第三群の血清もまた、侵入型疾患の個体から得、主に確認の目的で用いた。この集収物の主な価値は、疾患前(プレ-)、発症時 (急性)および回復時(回復期)での抗原-特異的抗体レベルの変化を追跡することが出来ると言うことである。この最後の群は、前-疾患状態にはなく、疾患の際に抗体を誘導するエピトープの選択を助ける。
２つの細菌種、肺炎連鎖球菌および黄色ブドウ球菌のゲノムはそれ自体で多くの重要な相違を示す。肺炎連鎖球菌のゲノムはおよそ2.16 Mb含むが、黄色ブドウ球菌は2.85 Mb有する。それらの平均GC含量はそれぞれ39.7および33％であり、コードされる遺伝子のおよそ30〜45％は２種の病原体間で共有されていない。さらに、２つの細菌種は増殖のために異なる培養条件と培地を要求する。肺炎連鎖球菌は厳密にヒトの病原体であるが、黄色ブドウ球菌はある範囲の温血動物に感染することが見いだされている。２つの病原体によって与えられ得るもっとも重要な疾患のリストを以下に示す。黄色ブドウ球菌はおもに以下の院内、日和見感染をもたらす:膿痂疹、毛嚢炎、膿瘍、皮膚膿瘍（boils）、感染裂傷、心内膜炎、髄膜炎、敗血症、関節炎、肺炎、骨髄炎、熱傷様皮膚症候群 (SSS)、毒素性ショック症候群。肺炎連鎖球菌は主に以下の地域感染型感染症をもたらす:上気道 (咽頭炎、中耳炎)および下気道感染 (肺炎)、および菌血症、敗血症および髄膜炎。
TIGR4と称される肺炎連鎖球菌の莢膜血清型 4分離株の完全なゲノム配列をランダムショットガンシークエンシング戦略(GenBank 受託番号 AE005672; www.tigr.org/tigrscripts/CMR2/CMRHomePage.spl参照)によって決定した。この臨床分離株は、Kongsvinger、Norway の30歳の男性患者の血液から採取したものであり、感染のマウスモデルにおいて高度に侵入型かつ感染性である。
本発明の根底となる問題は、肺炎連鎖球菌感染症に対するワクチン等の医薬を開発するための手段を提供することであった。より具体的には、問題は、該医薬の製造に有用であり得る、有効かつ関連する網羅的なセットの肺炎連鎖球菌由来の核酸分子または過免疫血清反応性抗原を提供することであった。
それゆえ、本発明は、以下からなる群から選択される核酸配列を含む、過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする単離核酸分子を提供する:
a)配列番号 1、101-144から選択される核酸分子に対して少なくとも 70％の配列同一性を有する核酸分子、
b) a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
c) a)またはb)の核酸分子の少なくとも 15の連続する塩基を含む核酸分子、
d) a)、b)、またはc)の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c)またはd)の核酸分子とハイブリダイズしうる核酸分子。
本発明の好ましい態様によると、配列同一性は少なくとも 80％、好ましくは少なくとも 95％、特に100％である。
さらに、本発明は以下からなる群から選択される核酸配列を含む過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする単離核酸分子を提供する：
a)配列番号 2-6、8、10-16、18-23、25-31、34、36、38-42、44、47-48、51、53、55-62、64、67、71-76、78-79、81-94、96-100から選択される核酸分子に対して少なくとも 96％の配列同一性を有する核酸分子、
b) a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
c) a)またはb)の核酸分子の少なくとも15の連続する塩基を含む核酸分子、
d) a)、b)、またはc)の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c) またはd)の核酸とハイブリダイズしうる核酸分子。
別の態様によると、本発明は以下からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を提供する：
a)配列番号 9、17、24、32、37、43、52、54、65-66、70、80から選択される核酸分子、
b) a)の核酸と相補的な核酸分子,
c)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c) またはd)の核酸とハイブリダイズしうる核酸分子。
好ましくは、核酸分子はDNAまたはRNAである。
本発明の好ましい態様によると、核酸分子は、ゲノムDNA、特に肺炎連鎖球菌ゲノムDNAから単離されたものである。
本発明によると、本発明のいずれかによる核酸分子を含むベクターが提供される。
好ましい態様において、ベクターは本発明による核酸分子によってコードされる過免疫血清反応性抗原またはその断片の組換え発現に適するものである。
本発明はまた、本発明によるベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の態様によると、本発明はさらに、本発明による核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原を提供する。
好ましい態様において、アミノ酸配列 (ポリペプチド)は、配列番号 145、245-288からなる群から選択される。
別の好ましい態様において、アミノ酸配列 (ポリペプチド)は、配列番号 146-150、152、154-160、162-167、169-175、178、180、182-186、188、191-192、195、197、199-206、208、211、215-220、222-223、225-238、240-244からなる群から選択される。
さらに好ましい態様において、アミノ酸配列 (ポリペプチド)は、配列番号 153、161、168、176、181、187、196、198、209-210、214、224からなる群から選択される。
さらなる態様によると、本発明は表１の「予測免疫原性アミノ酸」および「同定された免疫原性領域の位置」の列のアミノ酸配列を含むペプチド;表2の血清反応性エピトープからなる群から選択される過免疫血清反応性抗原の断片、特に以下のアミノ酸を含むペプチドを提供する： 4-11、35-64、66-76、101-108、111-119 および 57-114 （配列番号 145）; 5-27、32-64、92-102、107-113、119-125、133-139、148-162、177-187、195-201、207-214、241-251、254-269、285-300、302-309、317-324、332-357、365-404、411-425、443-463、470-477、479-487、506-512、515-520、532-547、556-596、603-610、616-622、624-629、636-642、646-665、667-674、687-692、708-720、734-739、752-757、798-820、824-851、856-865 および 732-763 （配列番号 146）; 14-21、36-44、49-66、102-127、162-167、177-196、45-109 および 145-172 （配列番号 147）; 17-35、64-75、81-92、100-119、125-172、174-183、214-222、230-236、273-282、287-303、310-315、331-340、392-398、412-420、480-505、515-523、525-546、553-575、592-598、603-609、617-625、631-639、644-651、658-670、681-687、691-704、709-716、731-736、739-744、750-763、774-780、784-791、799-805、809-822、859-870、880-885、907-916、924-941、943-949、973-986、1010-1016、1026-1036、1045-1054、1057-1062、1082-1088、1095-1102、1109-1120、1127-1134、1140-1146、1152-1159、1169-1179、1187-1196、1243-1251、1262-1273、1279-1292、1306-1312、1332-1343、1348-1364、1379-1390、1412-1420、1427-1436、1458-1468、1483-1503、1524-1549、1574-1588、1614-1619、1672-1685、1697-1707、1711-1720、1738-1753、1781-1787、1796-1801、1826-1843、132-478、508-592 および 1753-1810 （配列番号 148）; 15-43、49-55、71-77、104-110、123-130、162-171、180-192、199-205、219-227、246-254、264-270、279-287、293-308、312-322、330-342、349-356、369-377、384-394、401-406、416-422、432-439、450-460、464-474、482-494、501-508、521-529、536-546、553-558、568-574、584-591、602-612、616-626、634-646、653-660、673-681、688-698、705-710、720-726、736-749、833-848、1-199、200-337、418-494 および 549-647 （配列番号 149）; 9-30、65-96、99-123、170-178 および 1-128 （配列番号 150）; 7-32、34-41、96-106、127-136、154-163、188-199、207-238、272-279、306-312、318-325、341-347、353-360、387-393、399-406、434-440、452-503、575-580、589-601、615-620、635-640、654-660、674-680、696-701、710-731、1-548 および 660-691 （配列番号 151）; 4-19、35-44、48-59、77-87、93-99、106-111、130-138、146-161 および 78-84 （配列番号 152）; 24-30、36-43、64-86、93-99、106-130、132-145、148-165、171-177、189-220、230-249、251-263、293-300、302-312、323-329、338-356、369-379、390-412 および 179-193 （配列番号 153）; 30-39、61-67、74-81、90-120、123-145、154-167、169-179、182-197、200-206、238-244、267-272 および 230-265 （配列番号 154）; 14-20、49-65、77-86 および 2-68 （配列番号 155）; 4-9、26-35、42-48、53-61、63-85、90-101、105-111、113-121、129-137、140-150、179-188、199-226、228-237、248-255、259-285、299-308、314-331、337-343、353-364、410-421、436-442 および 110-144 （配列番号 156）; 36-47、55-63、94-108、129-134、144-158、173-187、196-206、209-238、251-266、270-285、290-295、300-306、333-344、346-354、366-397、404-410、422-435、439-453、466-473、515-523、529-543、554-569、571-585、590-596、607-618、627-643、690-696、704-714、720-728、741-749、752-767、780-799、225-247 および 480-507 （配列番号 157）; 16-25、36-70、80-93、100-106 および 78-130 （配列番号 158）; 18-27、41-46、50-57、65-71、79-85、93-98、113-128、144-155、166-178、181-188、201-207、242-262、265-273、281-295、303-309、318-327 および 36-64 （配列番号 159）; 7-29、31-44、50-59、91-96、146-153、194-201、207-212、232-238、264-278、284-290、296-302、326-353、360-370、378-384、400-405、409-418、420-435、442-460、499-506、529-534、556-562、564-576、644-651、677-684、687-698、736-743、759-766、778-784、808-814、852-858、874-896、920-925、929-935、957-965、1003-1012、1021-1027、1030-1044、1081-1087、1101-1111、1116-1124、1148-1159、1188-1196、1235-1251、1288-1303、1313-1319、1328-1335、1367-1373、1431-1437、1451-1458、1479-1503、1514-1521、1530-1540、1545-1552、1561-1568、1598-1605、1617-1647、1658-1665、1670-1676、1679-1689、1698-1704、1707-1713、1732-1738、1744-1764、1-70、154-189、922-941、1445-1462 および 1483-1496 （配列番号 160）; 6-51、81-91、104-113、126-137、150-159、164-174、197-209、215-224、229-235、256-269、276-282、307-313、317-348、351-357、376-397、418-437、454-464、485-490、498-509、547-555、574-586、602-619 および 452-530 （配列番号 161）; 25-31、39-47、49-56、99-114、121-127、159-186、228-240、253-269、271-279、303-315、365-382、395-405、414-425、438-453 および 289-384 （配列番号 162）; 9-24、41-47、49-54、68-78、108-114、117-122、132-140、164-169、179-186、193-199、206-213、244-251、267-274、289-294、309-314、327-333、209-249 および 286-336 （配列番号 163）; 9-28、53-67、69-82、87-93、109-117、172-177、201-207、220-227、242-247、262-268、305-318、320-325 および 286-306 （配列番号 164）; 4-10、26-39、47-58、63-73、86-96、98-108、115-123、137-143、148-155、160-176、184-189、194-204、235-240、254-259、272-278 および 199-283 （配列番号 165）; 4-26、33-39、47-53、59-65、76-83、91-97、104-112、118-137、155-160、167-174、198-207、242-268、273-279、292-315、320-332、345-354、358-367、377-394、403-410、424-439、445-451、453-497、511-518、535-570、573-589、592-601、604-610 および 202-242 （配列番号 166）; 8-30、36-45、64-71、76-82、97-103、105-112、134-151、161-183、211-234、253-268、270-276、278-284、297-305、309-315、357-362、366-372、375-384、401-407、409-416、441-455、463-470、475-480、490-497、501-513、524-537、552-559、565-576、581-590、592-600、619-625、636-644、646-656 および 316-419 （配列番号 167）; 4-17、52-58、84-99、102-110、114-120、124-135、143-158、160-173、177-196、201-216、223-250、259-267、269-275 および 1-67 （配列番号 168）; 6-46、57-67、69-80、82-133、137-143、147-168、182-187、203-209、214-229、233-242、246-280 および 53-93 （配列番号 169）; 7-40、50-56、81-89、117-123、202-209、213-218、223-229、248-261、264-276、281-288、303-308、313-324、326-332、340-346、353-372、434-443、465-474、514-523、556-564、605-616、620-626、631-636、667-683、685-699、710-719、726-732、751-756、760-771、779-788、815-828、855-867、869-879、897-902、917-924、926-931、936-942、981-1000、1006-1015、1017-1028、1030-1039、1046-1054、1060-1066、1083-1092、1099-1112、1122-1130、1132-1140、1148-1158、1161-1171、1174-1181、1209-1230、1236-1244、1248-1254、1256-1267、1269-1276、1294-1299、1316-1328、1332-1354、1359-1372、1374-1380、1384-1390、1395-1408、1419-1425、1434-1446、1453-1460、1465-1471、1474-1493、1505-1515、1523-1537、1547-1555、1560-1567、1577-1605、1633-1651、1226-1309、1455-1536 および 1538-1605 （配列番号 170）; 4-10、31-39、81-88、106-112、122-135、152-158、177-184、191-197、221-227、230-246、249-255、303-311、317-326、337-344、346-362、365-371、430-437、439-446、453-462、474-484 および 449-467 （配列番号 171）; 9-15、24-35、47-55、122-128、160-177、188-196、202-208、216-228、250-261、272-303、318-324、327-339、346-352、355-361、368-373、108-218 および 344-376 （配列番号 172）; 6-14、17-48、55-63、71-90、99-109、116-124、181-189、212-223、232-268、270-294、297-304、319-325、340-348、351-370、372-378、388-394、406-415、421-434 および 177-277 （配列番号 173）; 21-39、42-61、65-75、79-85、108-115 および 11-38 （配列番号 174）; 4-17、26-39、61-76、103-113、115-122、136-142、158-192、197-203、208-214、225-230、237-251 および 207-225 （配列番号 175）; 5-11、27-36、42-53、62-70、74-93、95-104、114-119、127-150、153-159、173-179、184-193、199-206、222-241、248-253、257-280、289-295、313-319、322-342、349-365、368-389、393-406、408-413、426-438、447-461、463-470、476-495、532-537、543-550 および 225-246 （配列番号 176）; 4-29、68-82、123-130、141-147、149-157、178-191、203-215、269-277、300-307、327-335、359-370、374-380、382-388、393-400、410-417、434-442、483-492、497-503、505-513、533-540、564-569、601-607、639-647、655-666、693-706、712-718、726-736、752-758、763-771、774-780、786-799、806-812、820-828、852-863、884-892、901-909、925-932、943-948、990-996、1030-1036、1051-1059、1062-1068、1079-1086、1105-1113、1152-1162、1168-1179、1183-1191、1204-1210、1234-1244、1286-1295、1318-1326、1396-1401、1451-1460、1465-1474、1477-1483、1488-1494、1505-1510、1514-1521、1552-1565、1593-1614、1664-1672、1677-1685、1701-1711、1734-1745、1758-1770、1784-1798、1840-1847、1852-1873、1885-1891、1906-1911、1931-1939、1957-1970、1977-1992、2014-2020、2026-2032、2116-2134、1-348、373-490、573-767、903-1043、1155-1198、1243-1482、1550-1595、1682-1719、1793-1921 および 2008-2110 （配列番号 177）; 10-35、39-52、107-112、181-188、226-236、238-253、258-268、275-284、296-310、326-338、345-368、380-389、391-408、410-418、420-429、444-456、489-505、573-588、616-623、637-643、726-739、741-767、785-791、793-803、830-847、867-881、886-922、949-956、961-980、988-1004、1009-1018、1027-1042、1051-1069、1076-1089、1108-1115、1123-1135、1140-1151、1164-1179、1182-1191、1210-1221、1223-1234、1242-1250、1255-1267、1281-1292、1301-1307、1315-1340、1348-1355、1366-1373、1381-1413、1417-1428、1437-1444、1453-1463、1478-1484、1490-1496、1498-1503、1520-1536、1538-1546、1548-1570、1593-1603、1612-1625、1635-1649、1654-1660、1670-1687、1693-1700、1705-1711、1718-1726、1729-1763、1790-1813、1871-1881、1893-1900、1907-1935、1962-1970、1992-2000、2006-2013、2033-2039、2045-2051、2055-2067、2070-2095、2097-2110、2115-2121、2150-2171、2174-2180、2197-2202、2206-2228 および 1526-1560 （配列番号 178）; 4-17、35-48、54-76、78-107、109-115、118-127、134-140、145-156、169-174、217-226、232-240、256-262、267-273、316-328、340-346、353-360、402-409、416-439、448-456、506-531、540-546、570-578、586-593、595-600、623-632、662-667、674-681、689-705、713-724、730-740、757-763、773-778、783-796、829-835、861-871、888-899、907-939、941-955、957-969、986-1000、1022-1028、1036-1044、1068-1084、1095-1102、1118-1124、1140-1146、1148-1154、1168-1181、1185-1190、1197-1207、1218-1226、1250-1270、1272-1281、1284-1296、1312-1319、1351-1358、1383-1409、1422-1428、1438-1447、1449-1461、1482-1489、1504-1510、1518-1527、1529-1537、1544-1551、1569-1575、1622-1628、1631-1637、1682-1689、1711-1718、1733-1740、1772-1783、1818-1834、1859-1872、1-64 および 128-495 （配列番号 179）; 8-28、32-37、62-69、119-125、137-149、159-164、173-189、200-205、221-229、240-245、258-265、26
8-276、287-293、296-302、323-329 および 1-95 （配列番号 180）; 9-18、25-38、49-63、65-72、74-81、94-117、131-137、139-146、149-158、162-188、191-207、217-225、237-252、255-269、281-293、301-326、332-342、347-354、363-370、373-380、391-400、415-424、441-447 および 75-107 （配列番号 181）; 4-24、64-71、81-87、96-116、121-128、130-139、148-155、166-173、176-184、203-215、231-238、243-248、256-261、280-286、288-306、314-329 および 67-148 （配列番号 182）; 4-10、19-37、46-52、62-81、83-89、115-120、134-139、141-151、168-186、197-205、209-234、241-252、322-335、339-345、363-379、385-393、403-431、434-442、447-454、459-465、479-484、487-496 および 404-420 （配列番号 183）; 10-35、46-66、71-77、84-93、96-122、138-148、154-172、182-213、221-233、245-263、269-275、295-301、303-309、311-320、324-336、340-348、351-359、375-381 および 111-198 （配列番号 184）; 14-25、30-42、47-61、67-75、81-91、98-106、114-122、124-135、148-193、209-227 および 198-213 （配列番号 185）; 5-18、45-50、82-90、97-114、116-136、153-161、163-171、212-219、221-227、240-249、267-281、311-317、328-337、375-381、390-395、430-436、449-455、484-495、538-543、548-554、556-564、580-586、596-602 および 493-606 （配列番号 186）; 9-25、28-34、37-44、61-68、75-81、88-96、98-111、119-133、138-150、152-163、168-182、186-194、200-205、216-223、236-245、257-264、279-287、293-304、311-318、325-330、340-346、353-358、365-379、399-409、444-453 および 303-391 （配列番号 187）; 16-36、55-61、66-76、78-102、121-130、134-146、150-212、221-239、255-276、289-322、329-357 および 29-59 （配列番号 188）; 8-27、68-74、77-99、110-116、124-141、171-177、202-217、221-228、259-265、275-290、293-303、309-325、335-343、345-351、365-379、384-394、406-414、423-437、452-465、478-507、525-534、554-560、611-624、628-651、669-682、742-747、767-778、782-792、804-812、820-836、79-231 および 359-451 （配列番号 189）; 5-28、39-45、56-62、67-74、77-99、110-117、124-141、168-176、200-230、237-244、268-279、287-299、304-326、329-335、348-362、370-376、379-384、390-406、420-429、466-471、479-489、495-504、529-541、545-553、561-577、598-604、622-630、637-658、672-680、682-688、690-696、698-709、712-719、724-736、738-746、759-769、780-786、796-804、813-818、860-877、895-904、981-997、1000-1014、1021-1029、1-162、206-224、254-350、414-514 および 864-938 （配列番号 190）; 4-11、19-49、56-66、68-101、109-116、123-145、156-165、177-185、204-221、226-234、242-248、251-256、259-265、282-302、307-330、340-349、355-374、377-383、392-400、422-428、434-442、462-474 および 266-322 （配列番号 191）; 14-43、45-57、64-74、80-87、106-127、131-142、145-161、173-180、182-188、203-210、213-219、221-243、245-254、304-311、314-320、342-348、354-365、372-378、394-399、407-431、436-448、459-465、470-477、484-490、504-509、531-537、590-596、611-617、642-647、723-734、740-751、754-762、764-774、782-797、807-812、824-831、838-845、877-885、892-898、900-906、924-935、940-946、982-996、1006-1016、1033-1043、1051-1056、1058-1066、1094-1108、1119-1126、1129-1140、1150-1157、1167-1174、1176-1185、1188-1201、1209-1216、1220-1228、1231-1237、1243-1248、1253-1285、1288-1297、1299-1307、1316-1334、1336-1343、1350-1359、1365-1381、1390-1396、1412-1420、1427-1439、1452-1459、1477-1484、1493-1512、1554-1559、1570-1578、1603-1608、1623-1630、1654-1659、1672-1680、1689-1696、1705-1711、1721-1738、1752-1757、1773-1780、1817-1829、1844-1851、1856-1863、1883-1895、1950-1958、1974-1990、172-354、384-448、464-644、648-728 および 1357-1370 （配列番号 192）; 8-27、68-74、77-99、110-116、124-141、169-176、201-216、220-227、258-264、274-289、292-302、308-324、334-342、344-350、364-372、377-387、399-407、416-429、445-458、471-481、483-500、518-527、547-553、604-617、621-644、662-675、767-778、809-816、15-307、350-448 および 496-620 （配列番号 193）; 4-17、24-29、53-59、62-84、109-126、159-164、189-204、208-219、244-249、274-290、292-302、308-324、334-342、344-350、378-389、391-397、401-409、424-432、447-460、470-479、490-504、521-529、538-544、549-555、570-577、583-592、602-608、615-630、635-647、664-677、692-698、722-731、733-751、782-790、793-799、56-267、337-426 および 495-601 （配列番号 194）; 12-22、49-59、77-89、111-121、136-148、177-186、207-213、217-225、227-253、259-274、296-302、328-333、343-354、374-383、424-446、448-457、468-480、488-502、507-522、544-550、553-560、564-572、587-596、604-614、619-625、629-635、638-656、662-676、680-692、697-713、720-738、779-786、833-847、861-869、880-895、897-902、911-917、946-951、959-967、984-990、992-1004、1021-1040、1057-1067、1073-1080 および 381-403 （配列番号 195）; 4-10、26-31、46-56、60-66、70-79、86-94、96-102、109-118、132-152、164-187、193-206、217-224 および 81-149 （配列番号 196）; 4-21、26-37、48-60、71-82、109-117、120-128、130-136、142-147、181-187、203-211、216-223、247-255、257-284、316-325、373-379、395-400、423-435、448-456、479-489、512-576、596-625、641-678、680-688、692-715 および 346-453 （配列番号 197）; 10-16、25-31、34-56、58-69、71-89、94-110、133-176、186-193、208-225、240-250、259-266、302-307、335-341、376-383、410-416 および 316-407 （配列番号 198）; 11-29、42-56、60-75、82-88、95-110、116-126、132-143、145-160、166-172、184-216 および 123-164 （配列番号 199）; 11-29、54-63、110-117、139-152、158-166、172-180、186-193、215-236、240-251、302-323、330-335、340-347、350-366、374-381 および 252-299 （配列番号 200）; 18-27、35-42、50-56、67-74、112-136、141-153、163-171、176-189、205-213、225-234、241-247、253-258、269-281、288-298、306-324、326-334、355-369、380-387 および 289-320 （配列番号 201）; 7-15、19-41、56-72、91-112、114-122、139-147、163-183、196-209、258-280、326-338、357-363、391-403、406-416 および 360-378 （配列番号 202）; 11-18、29-41、43-49、95-108、142-194、204-212、216-242、247-256、264-273 および 136-149 （配列番号 203）; 18-24、33-40、65-79、89-102、113-119、130-137、155-161、173-179、183-203、205-219、223-231、245-261、267-274、296-306、311-321、330-341、344-363、369-381、401-408、415-427、437-444、453-464、472-478、484-508、517-524、526-532、543-548 および 59-180 （配列番号 204）; 5-13、52-65、67-73、97-110、112-119、134-155 および 45-177 （配列番号 205）; 6-28、34-43、57-67、75-81、111-128、132-147、155-163、165-176、184-194、208-216、218-229、239-252、271-278、328-334、363-376、381-388、426-473、481-488、492-498、507-513、536-546、564-582、590-601、607-623、148-269、420-450 および 610-648 （配列番号 206）; 4-12、20-38、69-75、83-88、123-128、145-152、154-161、183-188、200-213、245-250、266-272、306-312、332-339、357-369、383-389、395-402、437-453、455-470、497-503 および 1-112 （配列番号 207）; 35-59、74-86、111-117、122-137 および 70-154 （配列番号 208）; 26-42、54-61、65-75、101-107、123-130、137-144、148-156、164-172、177-192、213-221、231-258 および 157-249 （配列番号 209）; 29-38、61-67、77-87、94-100、105-111、118-158 および 1-97 （配列番号 210）; 7-21、30-48、51-58、60-85、94-123、134-156、160-167、169-183、186-191、216-229、237-251、257-267、272-282、287-298 および 220-243 （配列番号 211）; 6-29、34-47、56-65、69-76、83-90、123-134、143-151、158-178、197-203、217-235、243-263、303-309、320-333、338-348、367-373、387-393、407-414、416-427、441-457、473-482、487-499、501-509、514-520、530-535、577-583、590-602、605-612、622-629、641-670、678-690、37-71 および 238-307 （配列番号 212）; 7-40、121-132、148-161、196-202、209-215、221-235、248-255、271-280、288-295、330-339、395-409、414-420、446-451、475-487、556-563、568-575、580-586、588-595、633-638、643-648、652-659、672-685、695-700、710-716、737-742、749-754、761-767、775-781、796-806、823-835、850-863、884-890、892-900、902-915、934-941 および 406-521 （配列番号 213）; 9-18、24-46、51-58、67-77、85-108、114-126、129-137、139-146、152-165、173-182、188-195、197-204、217-250、260-274、296-313、343-366、368-384、427-434、437-446、449-455、478-484、492-506、522-527、562-591、599-606、609-618、625-631、645-652 および 577-654 （配列番号 214）; 13-20、26-37、41-53、56-65、81-100、102-114、118-127、163-188、196-202、231-238、245-252、266-285、293-298、301-306 および 19-78 （配列番号 215）; 10-23、32-42、54-66、73-91、106-113、118-127、139-152、164-173、198-207、210-245、284-300、313-318、330-337、339-346、354-361、387-393、404-426、429-439、441-453、467-473、479-485、496-509、536-544、551-558、560-566、569-574、578-588、610-615、627-635、649-675、679-690、698-716、722-734、743-754、769-780、782-787 および 480-550 （配列番号 216）; 6-39、42-50、60-68、76-83、114-129、147-162、170-189、197-205、217-231、239-248、299-305、338-344、352-357、371-377、380-451、459-483、491-499、507-523、537-559、587-613、625-681、689-729、737-781、785-809、817-865、873-881、889-939、951-975、983-1027、1031-1055、1063-1071、1079-1099、1103-1127、1151-1185、1197-1261、1269-1309、1317-1333、1341-1349、1357-1465、1469-1513、1517-1553、1557-1629、1637-1669、1677-1701、1709-1725、1733-1795、1823-1849、1861-1925、1933-1973、1981-2025、2029-2053、2061-2109、2117-2125、2133-2183、2195-2219、2227-2271、2275-2299、2307-2315、2323-2343、2347-2371、2395-2429、2441-2529、2537-2569、2577-2601、2609-2625、2633-2695、2699-2737、2765-2791、2803-2867、2889-2913、2921-2937、2945-2969、2977-2985、2993-3009、3023-3045、3073-3099、3111-3167、3175-3215、3223-3267、3271-3295、3303-3351、3359-3367、3375-3425、3437-3461、3469-3513、3517-3541、3549-3557、3565-3585、3589-3613、3637-3671、3683-3747、3755-3795、3803-3819、3827-3835、3843-3951、3955-3999、4003-4039、4043-4115、4123-4143、4147-4171、4195-4229、4241-4305、4313-4353、4361-4377、4385-4393、4401-4509、4513-4557、4561-4597、4601-4718、4749-4768、74-171、452-559 および 2951-3061 （配列番号 217）; 16-22、30-51、70-111、117-130、137-150、171-178、180-188、191-196 および 148-181 （配列番号 218）; 6-19、21-46、50-56、80-86、118-126、167-186、189-205、211-242、244-267、273-286、290-297、307-316、320-341 および 34-60 （配列番号 219）; 5-26、33-43、48-54、58-63、78-83、113-120、122-128、143-152、157-175、185-192、211-225、227-234、244-256、270-281、284-290、304-310、330-337、348-355、362-379、384-394、429-445、450-474、483-490、511-520、537-546、548-554、561-586、590-604、613-629、149-186、285-431 および 573-659 （配列番号 220）; 5-26、49-59、61-67、83-91、102-111、145-157、185-192、267-272、279-286、292-298、306-312、134-220、235-2
51 および 254-280 （配列番号 221）; 5-19、72-79、83-92、119-124、140-145、160-165、167-182、224-232、240-252、259-270、301-310、313-322、332-343、347-367、384-398、416-429、431-446、454-461 および 1-169 （配列番号 222）; 8-17、26-31、56-62、75-83、93-103、125-131、135-141、150-194、205-217、233-258、262-268、281-286 および 127-168 （配列番号 223）; 6-12、69-75、108-115、139-159、176-182、194-214 および 46-161 （配列番号 224）; 6-13、18-27、39-48、51-59、66-73、79-85、95-101、109-116、118-124、144-164、166-177、183-193、197-204、215-223、227-236、242-249、252-259、261-270、289-301、318-325 および 12-58 （配列番号 225）; 4-10、26-32、48-60、97-105、117-132、138-163、169-185、192-214、219-231、249-261、264-270、292-308、343-356、385-392、398-404、408-417、435-441 および 24-50 （配列番号 226）; 10-40、42-48、51-61、119-126 および 1-118 （配列番号 227）; 5-17、40-58、71-83、103-111、123-140、167-177、188-204 および 116-128 （配列番号 228）; 4-9、11-50、57-70、112-123、127-138 および 64-107 （配列番号 229）; 9-39、51-67 および 1-101 （配列番号 230）; 5-14、17-25、28-46、52-59、85-93、99-104、111-120、122-131、140-148、158-179、187-197、204-225、271-283、285-293 および 139-155 （配列番号 231）; 42-70、73-90、92-108、112-127、152-164、166-172、181-199、201-210、219-228、247-274、295-302、322-334、336-346、353-358、396-414、419-425、432-438、462-471、518-523、531-536、561-567、576-589、594-612、620-631、665-671、697-710、718-731、736-756、765-771、784-801 および 626-653 （配列番号 232）; 8-28、41-51、53-62、68-74、79-85、94-100、102-108、114-120、130-154、156-162、175-180、198-204、206-213、281-294、308-318、321-339、362-368、381-386、393-399、407-415 および 2-13 （配列番号 233）; 4-39、48-65、93-98、106-112、116-129 および 10-36 （配列番号 234）; 25-32、35-50、66-71、75-86、90-96、123-136、141-151、160-179、190-196、209-215、222-228、235-242、257-263、270-280 および 209-247 （配列番号 235）; 5-29、31-38、50-57、62-75、83-110、115-132、168-195、197-206、216-242、249-258、262-269、333-340、342-350、363-368、376-392、400-406、410-421、423-430、436-442、448-454、460-466、471-476、491-496、511-516、531-536、551-556、571-576、585-591、599-605、27-70、219-293、441-504 および 512-584 （配列番号 236）; 4-12、14-34、47-75、83-104、107-115、133-140、148-185、187-196、207-212、224-256、258-265、281-287、289-296、298-308、325-333、345-355、365-371、382-395、424-435、441-457、465-472、483-491、493-505、528-534、536-546、552-558、575-584、589-600、616-623 および 576-591 （配列番号 237）; 4-76、 78-89、 91-126、 142-148、 151-191、 195-208、 211-223、 226-240、 256-277、 279-285、 290-314、 317-323、 358-377、 381-387、 391-396、 398-411、 415-434、 436-446、 454-484、 494-512、 516-523、 538-552、 559-566、 571-577、 579-596、 599-615、 620-627、 635-644、 694-707、 720-734、 737-759、 761-771 および 313-329 （配列番号 238）; 7-38、44-49、79-89、99-108、117-123、125-132、137-146、178-187、207-237、245-255、322-337、365-387、398-408、445-462、603-608、623-628、644-650、657-671、673-679 および 111-566 （配列番号 239）; 6-20、22-35、39-45、58-64、77-117、137-144、158-163、205-210、218-224、229-236、239-251、263-277、299-307、323-334、353-384、388-396、399-438、443-448、458-463、467-478、481-495、503-509、511-526、559-576、595-600、612-645、711-721、723-738、744-758、778-807 および 686-720 （配列番号 240）; 10-33、35-41、72-84、129-138、158-163、203-226、243-252、258-264、279-302、322-329、381-386、401-406、414-435 および 184-385 （配列番号 241）; 4-9、19-24、41-47、75-85、105-110、113-146 および 45-62 （配列番号 242）; 4-25、52-67、117-124、131-146、173-180、182-191、195-206、215-221、229-236、245-252、258-279、286-291、293-302、314-320、327-336、341-353、355-361、383-389 および 1-285 （配列番号 243）; 14-32、38-50、73-84、93-105、109-114 および 40-70 （配列番号 244）; 5-26 および 22-34 （配列番号 245）; 23-28 および 13-39 （配列番号 246）; 8-14 および 21-34 （配列番号 247）; 4-13、20-29、44-50、59-74 および 41-69 （配列番号 248）; 4-9、 19-42、 48-59、 71-83 および 57-91 （配列番号 249）; 4-14 および 10-28 （配列番号 250）; 22-28、32-42、63-71、81-111、149-156、158-167、172-180、182-203、219-229 および 27-49 （配列番号 251）; 17-27 および 23-32 （配列番号 252）; 18-24 および 28-38 （配列番号 253）; 9-15 および 13-27 （配列番号 254）; 13-22 および 18-29 （配列番号 255）; 17-26 および 2-11 （配列番号 256）; 4-33 および 16-32 （配列番号 257）; 4-10、37-43、54-84、92-127 および 15-62 （配列番号 258）; 4-14、20-32、35-60、69-75、79-99、101-109、116-140 および 124-136 （配列番号 259）; 2-13 （配列番号 260）; 4-13、28-42 および 42-57 （配列番号 261）; 4-14、27-44 および 14-35 （配列番号 262）; 4-12 および 1-27 （配列番号 263）; 4-18、39-45、47-74 および 35-66 （配列番号 264）; 8-20、43-77 および 17-36 （配列番号 265）; 4-30、35-45、51-57 および 35-49 （配列番号 266）; 4-24、49-57 および 15-34 （配列番号 267）; 4-22 および 8-27 （配列番号 268）; 13-25、32-59、66-80 および 21-55 （配列番号 269）; 4-10、24-33、35-42、54-65、72-82、98-108 および 15-30 （配列番号 270）; 8-19 および 17-47 （配列番号 271）; 12-18、40-46 および 31-52 （配列番号 272）; 4-20、35-78、83-102、109-122 および 74-86 （配列番号 273）; 7-17、21-41、46-63 および 2-20 （配列番号 274）; 30-37 および 2-33 （配列番号 275）; 4-13、17-25 および 1-15 （配列番号 276）; 17-31、44-51 および 20-51 （配列番号 277）; 20-30 および 5-23 （配列番号 278）; 13-33、48-71 および 92-110 （配列番号 279）; 4-9、50-69、76-88、96-106、113-118 および 12-34 （配列番号 280）; 4-24 および 6-26 （配列番号 281）; 7-26 および 14-30 （配列番号 282）; 9-39、46-68、75-82、84-103 および 26-44 （配列番号 283）; 4-30、33-107 および 58-84 （配列番号 284）; 4-12 および 9-51 （配列番号 285）; 12-18、29-37 および 6-37 （配列番号 286）; 4-21、33-52、64-71 および 16-37 （配列番号 287）; 9-19 および 2-30 （配列番号 288）; 20-37 （配列番号 245）; 8-27 （配列番号 246）; 10-27 （配列番号 247）; 42-59 および 52-69 （配列番号 248）; 63-80 および 74-91 （配列番号 249）; 11-28 （配列番号 250）; 28-49 （配列番号 251）; 15-32 （配列番号 252）; 4-20 （配列番号 253）; 10-27 （配列番号 254）; 17-34 （配列番号 255）; 1-18 （配列番号 256）; 16-33 （配列番号 257）; 16-36、30-49 および 43-62 （配列番号 258）; 122-139 （配列番号 259）; 1-18 （配列番号 260）; 41-58 （配列番号 261）; 15-35 （配列番号 262）; 2-27 （配列番号 263）; 18-36 （配列番号 265）; 34-51 （配列番号 266）; 9-27 （配列番号 268）; 22-47 （配列番号 269）; 18-36 および 29-47 （配列番号 271）; 32-52 （配列番号 272）; 72-89 （配列番号 273）; 3-20 （配列番号 274）; 3-21 および 15-33 （配列番号 275）; 1-18 （配列番号 276）; 6-23 （配列番号 278）; 93-110 （配列番号 279）; 13-34 （配列番号 280）; 7-26 および 9-26 （配列番号 281）; 16-33 （配列番号 282）; 27-44 （配列番号 283）; 67-84 （配列番号 284）; 10-33 および 26-50 （配列番号 285）; 7-25 および 19-37 （配列番号 286）; 17-37 （配列番号 287）; 3-20 および 13-30 （配列番号 288）; 62-80 および 75-93 （配列番号 145）; 92-108 （配列番号 147）; 332-349、177-200 および 1755-1777 （配列番号 148）; 109-133、149-174、260-285 および 460-485 （配列番号 149）; 26-47 および 42-64 （配列番号 150）; 22-41、35-54、115-130、306-325、401-420 および 454-478 （配列番号 151）; 22-45 （配列番号 155）; 156-174、924-940、1485-1496、1447-1462 および 1483-1498 （配列番号 160）; 457-475 （配列番号 161）; 302-325 （配列番号 163）; 288-305 （配列番号 164）; 244-266 および 260-282 （配列番号 165）; 204-225 および 220-241 （配列番号 166）; 324-345、340-361、356-377、372-393 および 388-408 （配列番号 167）; 39-64 （配列番号 168）; 54-76 および 70-92 （配列番号 169）; 1227-1247、1539-1559、1554-1574、1569-1589、1584-1604、1242-1262、1272-1292、1287-1308、1456-1477、1472-1494、1488-1510 および 1505-1526 （配列番号 170）; 351-368 （配列番号 172）; 179-200、195-216、211-232、227-248 および 243-263 （配列番号 173）; 13-37 （配列番号 174）; 208-224 （配列番号 175）; 42-64、59-81、304-328、323-348、465-489、968-992、1399-1418、1412-1431 および 2092-2111 （配列番号 177）; 1528-1547 および 1541-1560 （配列番号 178）; 184-200、367-388、382-403、409-429、425-444 および 438-457 （配列番号 179）; 27-50 および 45-67 （配列番号 180）; 114-131 および 405-419 （配列番号 183）; 113-134、129-150、145-166、161-182 および 177-198 （配列番号 184）; 495-515 （配列番号 186）; 346-358 （配列番号 187）; 208-224 （配列番号 190）; 178-194、202-223、217- 238、288-308 および 1355-1372 （配列番号 192）; 57-78 （配列番号 194）; 347-369、364-386、381-403、398-420、415-437 および 432-452 （配列番号 197）; 347-372 （配列番号 198）; 147-163 （配列番号 199）; 263-288 （配列番号 200）; 361-377 （配列番号 202）; 82-104、99-121、116-138、133-155 および 150-171 （配列番号 204）; 110-130 および 125-145 （配列番号 205）; 613-631、626-644 および 196-213 （配列番号 206）; 78-100、95-117、112-134 および 129-151 （配列番号 208）; 158-180、175-197、192-214、209-231 および 226-248 （配列番号 209）; 30-50、45-65 および 60-79 （配列番号 210）; 431-455 および 450-474 （配列番号 213）; 579-601、596-618、613-635 および 630-653 （配列番号 214）; 920-927、98-119、114-135、130-151、146-167 および 162-182 （配列番号 217）; 36-59 （配列番号 219）; 194-216 および 381-404 （配列番号 220）; 236-251 および 255-279 （配列番号 221）; 80-100 および 141-164 （配列番号 222）; 128-154 （配列番号 223）; 82-100、95-116 および 111-134 （配列番号 224）; 55-76、71-92 および 87-110 （配列番号 227; 91-106 （配列番号 229）; 74-96 （配列番号 230）; 140-157 （配列番号 231）; 4-13 （配列番号 233）; 41-65 および 499-523 （配列番号 236）; 122-146、191-215、288-313、445-469 および 511-535 （配列番号 239）; 347-368 （配列番号 241）; 46-61 （配列番号 242）; 15-37、32-57、101-121、115-135、138-158、152-172、220-242 および 236-258 （配列番号 243）。
本発明はまた、好適な発現系において本発明による１以上の核酸分子を発現させることを含む本発明による肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片の産生方法も提供する。
さらに、本発明は、本発明によるベクターによって好適な宿主細胞を形質転換または形質移入することを含む、本発明による肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片を発現する細胞の生産方法を提供する。
本発明によると、医薬組成物、特に、本発明の過免疫血清反応性抗原またはその断片または本発明の核酸分子を含むワクチンが提供される。
好ましい態様において、医薬組成物はさらに、好ましくは以下を含む群から選択される免疫賦活物質を含む：ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性デオキシヌクレオチド(ODN)、少なくとも２つのLysLeuLysモチーフを含むペプチド、特にKLKLLLLLKLK、向神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン、ミョウバン(alumn)、フロイント完全または不完全アジュバントまたはそれらの組み合わせ。
より好ましい態様において、免疫賦活物質は、ポリカチオン性ポリマーと免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせまたは少なくとも２つのLysLeuLysモチーフを含むペプチドと免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせのいずれかである。
より好ましい態様において、ポリカチオン性ポリマーはポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンである。
本発明によると、本発明による核酸分子または本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の、医薬調製物の製造、特に肺炎連鎖球菌感染症に対するワクチンの製造のための使用が提供される。
また、少なくとも本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の選択的部分に結合する抗体、または少なくともその有効な部分が提供される。
好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
別の好ましい態様において、抗体の有効な部分はFab断片を含む。
さらに好ましい態様において、抗体はキメラ抗体である。
より好ましい態様において、抗体はヒト化抗体である。
本発明はまた、本発明による抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。
さらに、本発明は以下の工程によって特徴づけられる本発明による抗体の生産方法を提供する:
本発明において規定される過免疫血清反応性抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することにより、非ヒト動物において免疫応答を開始させる工程、
抗体を含有する体液を該動物から取り出す工程、および、
該抗体を含有する体液をさらなる精製工程に供することにより抗体を生産する工程。
したがって、本発明はまた、以下の工程によって特徴づけられる本発明による抗体の生産方法も提供する:
本発明の過免疫血清反応性抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することによって非ヒト動物において免疫応答を開始させる工程、
該動物から脾臓または脾臓細胞を取り出す工程、
該脾臓または脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作る工程、
該過免疫血清反応性抗原またはその断片に特異的なハイブリドーマ細胞を選択し、クローン化する工程、
該クローン化したハイブリドーマ細胞の培養、そして所望によりさらなる精製工程により抗体を産生する工程。
上記方法によって提供または生産された抗体は肺炎連鎖球菌感染症の治療または予防のための医薬の調製に使用されうる。
別の態様によると本発明は、本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片に結合するアンタゴニストを提供する。
本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片に結合することが出来るかかるアンタゴニストは以下の工程を含む方法によって同定されうる:
a)単離または固定化された本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片を、候補アンタゴニストと、該候補アンタゴニストと該過免疫血清反応性抗原または断片の結合を可能とする条件下で、候補アンタゴニストの該過免疫血清反応性抗原またはその断片への結合に応答した検出可能なシグナルを提供できる成分の存在下で接触させる工程;および、
b)アンタゴニストの過免疫血清反応性抗原またはその断片への結合に応答して生成したシグナルの存在または不在を検出する工程。
本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片とその相互作用パートナーとの相互作用活性を低減または阻害することができるアンタゴニストは以下の工程を含む方法によって同定されうる:
a) 本発明による過免疫血清反応性抗原またはその過免疫断片を提供する工程、
b)該過免疫血清反応性抗原またはその断片に対する相互作用パートナー、特に本発明による抗体を提供する工程、
c)該過免疫血清反応性抗原またはその断片の該相互作用パートナーとの相互作用を可能にして相互作用複合体を形成させる工程、
d)候補アンタゴニストを提供する工程、
e)候補アンタゴニストと相互作用複合体との間で競合反応を起こさせる工程、
f)過免疫血清反応性抗原またはその断片と相互作用パートナーとの相互作用活性を候補アンタゴニストが阻害または低減するかを判定する工程。
本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片は、該過免疫血清反応性抗原またはその断片の相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のために用いることが出来る。
本発明は、本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする核酸配列の存在または本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の存在を判定することを含む、本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の発現に関連する疾患をインビトロで診断する方法も提供する。
本発明はまた、本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする核酸配列の存在または本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の存在を分析することを含む、細菌感染症、特に肺炎連鎖球菌感染症をインビトロで診断する方法も提供する。
さらに、本発明は該過免疫血清反応性抗原またはその断片に対して結合するペプチドを作るための本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の使用を提供し、ここでペプチドはアンチカリン(anticaline)である。
本発明はまた、本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片の、機能的核酸の製造のための使用を提供し、ここで機能的核酸は、アプタマーおよびスピーゲルマー(spiegelmer)を含む群から選択される。
本発明による核酸分子はまた、機能的リボ核酸の製造のためにも使用することができ、ここで機能的リボ核酸はリボザイム、アンチセンス核酸およびsiRNAを含む群から選択される。
本発明は、複数のヒト血漿プールからの抗体の調製物および肺炎連鎖球菌のゲノム由来の表面発現ライブラリーを用いて肺炎連鎖球菌から同定された有効かつ関連する網羅的セットの単離核酸分子およびそれらにコードされる過免疫血清反応性抗原またはその断片を有利なことに提供する。したがって、本発明は肺炎連鎖球菌抗原、ワクチン、診断および抗体の調製および肺炎連鎖球菌感染症に対して有効な化合物の同定の手順において有用な産物に対する広く感じられていた要求を満たすものである。
有効なワクチンは、すべての株によって発現され、肺炎連鎖球菌の細胞表面成分に対する高親和性の豊富な抗体を誘導することが出来るタンパク質またはポリペプチドから構成されるべきである。抗体はオプソニン作用のためにはIgG1 および/または IgG3であるべきであり、付着および毒素作用の中和のためにはいずれかのIgG サブタイプおよびIgAであるべきである。化学的に規定されたワクチンは、全細胞ワクチン(弱毒化または死んだ)と比較して明確に優れていなければならない。というのはヒト組織と交差反応するかオプソニン作用を阻害する肺炎連鎖球菌の成分が排除でき、保護抗体および/または保護免疫応答を誘導する個々のタンパク質を選択できるからである。
本発明に用いられたアプローチは、肺炎球菌タンパク質またはペプチドとヒト血清に存在する抗体との相互作用に基づく。ヒト免疫系によって肺炎連鎖球菌に対して産生され、ヒト血清中に存在する抗体は、抗原性タンパク質のインビボでの発現およびその免疫原性を示す。さらに、あらかじめ選択された血清のプールを用いて細菌表面ディスプレー発現ライブラリーによって同定された抗原性タンパク質は、個々の選択または生成された血清による第二および第三ラウンドのスクリーニングによって加工される。したがって本発明は、医薬組成物、特に肺炎連鎖球菌による感染症の予防用ワクチンとしての有効かつ関連する網羅的セットの肺炎球菌抗原を供給する。
本発明による網羅的なセットの抗原を同定するための抗原同定プログラムにおいて、少なくとも２種類の細菌表面発現ライブラリーは、いくつかの血清プールまたは血漿画分またはその他のプールされた抗体を含有する体液(抗体プール)によってスクリーングされる。 抗体プールは、肺炎連鎖球菌の抗原性化合物、例えば全細胞抽出物および培養上清タンパク質に対して試験された血清収集物由来である。好ましくは、２種類の血清収集物を用いる: 1.非常に安定な抗体レパートリーを備えたもの: 正常な成人の、臨床的に健康なヒトであって、肺炎連鎖球菌の保因者ではなく、以前に遭遇しても克服したもの、または現在肺炎連鎖球菌の保因者であって急性の疾患および症状を有さないもの、2.病原性生物の存在によって急性に誘導された抗体を備えたもの: 様々な徴候を有する急性疾患の患者 (例えば、肺炎連鎖球菌咽頭炎、肺炎、菌血症、腹膜炎、髄膜炎および敗血症)。血清は過免疫であると考えられるためには複数の肺炎球菌-特異的抗原と反応しなければならず、それゆえ本発明に適用するスクリーニング方法に適切である。
本発明に用いられる発現ライブラリーはすべての可能性のある抗原の発現を可能とするもの、例えば肺炎連鎖球菌のすべての分泌および表面タンパク質に由来するものでなければならない。細菌表面ディスプレーライブラリーは、細菌宿主膜における２つの選択された外膜タンパク質 (LamBおよびFhuA)上に肺炎連鎖球菌の（すべての）セットの発現するペプチド配列をディスプレーする細菌宿主の組換えライブラリーによって表される｛Georgiou、G.、1997; Etz、H. et al.、2001｝。組換え発現ライブラリーを用いる利点の一つは、同定された過免疫血清反応性抗原を、さらなる組換えDNA技術またはクローニング工程を必要とせずに、過免疫血清反応性抗原を発現するスクリーニングおよび選択されたクローンのコード配列の発現によってすぐに産生できることである。
本発明による上記のプログラムによって同定された包括的なセットの抗原をさらに１以上のさらなるラウンドのスクリーニングによって分析する。それゆえ、免疫原性であると同定された選択されたペプチドに対して作られた個体の抗体調製物または抗体が用いられる。好ましい態様によると第二ラウンドのスクリーニングのための個体の抗体調製物は、肺炎連鎖球菌による急性感染症を患ったことのある患者、特に一定の最低レベルを超える抗体力価を示す患者、例えば抗体力価が試験したヒト(患者または健康個体)血清の80 パーセンタイル、好ましくは90 パーセンタイル、特に95 パーセンタイルを超える患者に由来する。かかる高力価の個体の抗体調製物を第二スクリーニングラウンドに用いることにより、肺炎連鎖球菌からの過免疫血清反応性抗原およびその断片の非常に選択性の高い同定が可能となる。
網羅的なスクリーニング手順の後、組換えタンパク質として、またはインビトロ翻訳産物として発現した選択された抗原性タンパク質（原核発現系で発現出来ない場合）、または同定された抗原性ペプチド(合成により作られたもの)を、一連のELISAおよびウェスタンブロッティングアッセイによる第二スクリーニングにて試験し、大きなヒト血清収集物(最低〜150の健康および患者血清)を用いてその免疫原性を評価する。
個体の抗体調製物 (選択された血清でもよい)は、第一ラウンドからのすべての有望な候補からのすべての過免疫血清反応性抗原のなかでもっとも有望な候補の選択的同定を可能にするものであることが重要である。それゆえ、好ましくは少なくとも10個体の抗体調製物 (即ち、選択された病原菌の感染症を患ったことがある少なくとも10の異なる個体からの抗体調製物 (例えば血清))を第二スクリーニングラウンドにおいてかかる抗原の同定に用いるべきである。もちろん、10個体未満の調製物を使用することも可能であるが、しかし工程の選択性は少ない個体数の抗体調製物では最適とならない。一方、ある過免疫血清反応性抗原 (またはその抗原性断片)が少なくとも 10個体の抗体調製物、好ましくは少なくとも30、特に少なくとも 50個体の抗体調製物によって認識されるなら、過免疫血清反応性抗原の同定は適切な同定に十分に選択的である。過免疫血清-反応性はもちろん、可能な限り多くの個体の調製物を用いて試験するとよい (例えば、100を超えるか、あるいは1,000を超える)。
それゆえ、本発明の方法による過免疫血清-反応性抗体調製物の関連する部分は、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも 30、特に少なくとも 50個体の抗体調製物であるべきである。あるいは(または組み合わせて) 過免疫血清反応性抗原は好ましくは第二スクリーニングラウンドに用いられるすべての個体の抗体調製物の少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも40％によって同定されるのがよい。
本発明の好ましい態様によると、第二ラウンドのスクリーニングのための個体の抗体調製物が調製される(または抗体調製物として用いられる)血清は、肺炎連鎖球菌(例えば、この病原菌の調製物、例えば溶解液、細胞壁成分および組換えタンパク質)に対するその力価によって選択される。好ましくは、ELISAにおける抗原として微生物全体(全溶解液または全細胞)が用いられる場合、総IgA 力価 2,000 Uを超え、特に 4,000 Uを超え、および/または IgG 力価5,000 Uを超え、特に12,000 Uを超える(U = ユニット、一定の希釈度でのOD405nm の読みから計算)ものが選択される。
ヒト免疫系によって連鎖球菌に対して産生され、ヒト血清に存在する抗体は、抗原性タンパク質のインビボ発現およびその免疫原性を示す。血清抗体によって認識される直線状エピトープの認識は4-5 アミノ酸程度の短い配列に基づきうる。もちろん、かかる短いペプチドが所与の抗体をインビボで誘導できるということを必ずしも意味しない。そのため、規定されたエピトープ、ポリペプチドおよびタンパク質をさらに、選択されたタンパク質に対する抗体をインビボで誘導する能力について動物(主にマウス)で実験すべきである。
好ましい抗原は細胞表面に位置するか分泌されており、それゆえ細胞外で接近可能なものである。細胞壁タンパク質に対する抗体は複数の目的に役立つと考えられる:付着の阻害、栄養獲得の阻害、免疫回避の阻害、そして食作用の促進である(Hornef,M.et.al,2002)。分泌タンパク質に対する抗体は、毒素または病原性成分としてのその機能の中和において有用である。細菌は分泌タンパク質を介して互いに情報交換していることも知られている。これらタンパク質に対する中和抗体は、連鎖球菌種間または種内の成長を促進するクロストークを妨害する。生物情報分析(シグナル配列、細胞壁局在化シグナル、膜貫通ドメイン)は、細胞表面局在または分泌の評価に非常に有用であることが判明している。実験アプローチは、対応するエピトープおよびタンパク質によるヒト血清からの抗体の単離、および細菌表面ディスプレースクリーニングにより選択された(ポリ)ペプチドに対するマウスにおける免疫血清の作成を含む。これらの血清は次いで以下のアッセイにおける試薬として第三ラウンドのスクリーニングに用いられる:様々な条件下で培養した肺炎連鎖球菌の細胞表面染色(FACSまたは顕微鏡観察)、中和能力 (毒素、付着)の測定、およびオプソニン作用および食作用(インビトロ食作用アッセイ)の促進。
この目的のために、細菌である大腸菌クローンをマウスに直接注入し、免疫血清を採取し、関連するインビトロアッセイにおいて機能的オプソニンまたは中和抗体について試験する。あるいは、特異的抗体をヒトまたはマウス血清から基質としてペプチドまたはタンパク質を用いて精製してもよい。
肺炎連鎖球菌に対する宿主防御は主にオプソニン食作用貪食（opsonophagocytic killing)機構に依存する。オプソニンおよび中和タイプの高親和性抗体をワクチン接種により誘導することにより、自然免疫系が細菌および毒素を排除することが助けられる。これによって本発明による方法は肺炎球菌抗原性タンパク質の同定の最適手段となる。
皮膚および粘膜は連鎖球菌による侵入に対して恐るべき障壁である。しかしいったん皮膚または粘膜を超えられると、非-適応細胞防御の最前線は補体および食細胞、特に多核白血球(PMN)を介した協調作用を開始する。かかる細胞は侵入する細菌の排除における基盤であると考えられる。肺炎連鎖球菌は本来細胞外病原菌であるため、主な抗-連鎖球菌適応応答は免疫系の体液性の武器から生じ、それは３つの主な機構によって媒介される:オプソニン作用、毒素中和の促進、および付着の阻害。オプソニン作用は特に重要であると考えられている。というのはそれは有効な食作用に必要であるからである。有効なオプソニン作用のためには微生物表面は、IgG分子のFc断片または活性化C3bに対する受容体を介するPMNによる認識のために抗体および補体因子によって被覆されなければならない。オプソニン作用の後、連鎖球菌は貪食され、殺される。細菌の細胞表面の特定の抗原に結合した抗体は、PMNへの結合のためのリガンドとして作用し、食作用を促進する。アドヘシンおよびその他の細胞表面タンパク質に結合した全く同じ抗体は付着を中和し、定着を防ぐと考えられる。本発明によって提供されるような抗原の選択は、動物モデルまたはヒトにおける感染症に対する防御を導くものの同定に非常に適している。
ここで用いた抗原同定方法によると、本発明は驚くべきことに、とりわけ以下に記載するようにして肺炎連鎖球菌の一連の網羅的な新規な核酸および新規な過免疫血清反応性抗原およびその断片を提供することが出来る。一つの態様によると、本発明は特に過免疫血清反応性抗原をコードするヌクレオチド配列（その配列は配列表の配列番号: 1-144、289-303に示される）および過免疫血清反応性抗原を表す対応するコードされるアミノ酸配列（その配列は配列表の配列番号 145-288および304-318に示される）に関する。
本発明の好ましい態様において、配列番号 1、101-144に示すヌクレオチド配列に対してその全長にわたって70％の同一性を示す核酸分子が提供される。もっとも好ましいのは配列番号 1、101-144に示す核酸分子に対してその全長に渡って少なくとも 80％ または少なくとも 85％同一である領域を含む核酸である。これに関して、同核酸分子に対してその全長に渡って少なくとも 90％、91％、92％、93％、94％、95％、または96％同一である核酸分子が特に好ましい。さらに、少なくとも 97％同一であるものが非常に好ましく、少なくとも 98％および少なくとも 99％同一であるものが特に好ましく、少なくとも 99％または 99.5％ 同一であるのがきわめて好ましく、100％ 同一であるのが特に好ましい。さらに、この点に関して好ましい態様は、配列番号 1、101-144に示す核酸によってコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生理機能または活性を保持する過免疫血清反応性抗原またはその断片 (ポリペプチド)をコードする核酸である。
当該技術分野で知られているように、ここで用いる同一性とは、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の、配列を比較して測定される関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によってはかかる配列の文字列の間の一致によって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味する。同一性は容易に計算することが出来る。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の間の同一性を測定する多くの方法が存在するが、この用語は当業者に周知である (例えば、Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987)。同一性を判定する好ましい方法は試験する配列間のもっとも大きい一致を与えるよう設計されたものである。同一性の判定方法はコンピュータ・プログラムにおいて体系化されている。２つの配列の間の同一性の判定の好ましいコンピュータ・プログラ方法としては、これらに限定されないが、GCGプログラムパッケージ｛Devereux、J. et al.、1984｝、BLASTP、BLASTN、および FASTA ｛Altschul、S. et al.、1990｝が含まれる。
本発明の別の態様によると、配列番号 2-6、8、10-16、18-23、25-31、34、36、38-42、44、47-48、51、53、55-62、64、67、71-76、78-79、81-94、96-100に示す核酸配列と少なくとも96％ の同一性を示す核酸分子が提供される。
本発明のさらなる態様によると、配列番号 9、17、24、32、37、43、52、54、65-66、70、80に示す核酸配列と同一な核酸分子が提供される。
本発明による核酸分子は、二番目の選択として、一番目の選択として上記した核酸に少なくとも実質的に相補的な核酸分子であってもよい。本明細書において用いる、相補的とは、核酸鎖がワトソン・クリック塩基対形成を介して第二の核酸鎖と塩基対形成することを意味する。本明細書において用いる、実質的に相補的とは、それぞれの鎖のすべての塩基について塩基対形成が起こっているわけではなく、一定数または一定率の塩基が対形成していないかまちがって対形成していることを意味する。正しく対形成している塩基のパーセンテージは、好ましくは少なくとも 70 ％、より好ましくは 80 ％、さらに好ましくは 90 ％、そしてもっとも好ましくは90 ％を超えるパーセンテージである。 70 ％が一致する塩基のパーセンテージは相同性であると考えられ、この程度に一致する塩基対を有するハイブリダイゼーションはストリンジェントであると考えられる。この種のストリンジェントなハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション条件は、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons、Inc.、1987)に記載されている。より具体的には、ハイブリダイゼーション条件は以下のようにすればよい:
例えば、5 x SSPE、5 x デンハルト試薬、0.1％ SDS、100 g/mLの剪断（sheared）DNA 中で68℃で行うハイブリダイゼーション
0.2xSSC、O.1％ SDS中、42℃での中程度のストリンジェンシーの洗浄、
0.1xSSC、0.1％ SDS中、68℃での高いストリンジェンシーの洗浄。
GC含量が50％のゲノムDNAはTMがおよそ96℃である。1％のミスマッチについて、TMはおよそ1℃低くなる。
さらに、本明細書に記載するその他のハイブリダイゼーション条件のいずれも理論的には同様に用いることが出来る。
もちろん、本発明によって同定されたものと同じポリペプチド分子をコードするすべての核酸配列分子が所与のコード配列の開示によって包含される。というのは、遺伝暗号の縮重は、かかる縮重核酸分子の数が多いとしても、所与のポリペプチド分子をコードするすべての可能な核酸分子を明らかに決定するために直接適用できるからである。断片が例えば能動または受動ワクチンのようにワクチン接種に関連して用いるのに好適なポリペプチドをコードするかぎり、所与のポリペプチドの断片に対してもこれは適用できる。
本発明による核酸分子は、三番目の選択として、上記本発明による核酸分子の第一および第二の選択による核酸分子の少なくとも 15 塩基のストレッチを含む核酸であってもよい。好ましくは、塩基は連続するストレッチの塩基を形成する。しかし、ストレッチが、いくつかの塩基によって分離されている２以上の部分からなる場合も本発明の範囲に含まれる。
本発明の核酸は好ましくは、少なくとも 20、より好ましくは少なくとも 30、特に少なくとも 50の本明細書に開示の配列からの連続塩基からなる。好適な長さは計画する使用領域によって容易に最適化できよう(例えば(PCR) プライマー、プローブ、捕捉分子(例えば(DNA)チップ上)などとして)。好ましい核酸分子は、表1および2に挙げる１以上の予測免疫原性アミノ酸配列、特に表2の配列であってスコア10を超え、好ましくは20を超え、特にスコア25を超えるものの少なくとも連続する15塩基部分を含む。特に好ましいのは、本発明の用途の配列プロトコールにおいて、公表された肺炎連鎖球菌株 TIGR4 ゲノム (｛Tettelin、H. et al.、2001｝; GenBank accession AE005672) および/またはその他の公表された肺炎連鎖球菌ゲノム配列またはその部分、特に株 R6 (｛Hoskins、J. et al.、2001｝; GenBank accession AE007317)のゲノム配列またはその部分と比較して１以上またはより好ましくは2を超え、特に5を超える、非同一核酸残基を示すいずれかの配列のDNA 配列の連続部分を含む核酸である。特に好ましい非同一核酸残基は、非同一アミノ酸残基を導く残基である。好ましくは、核酸配列は上記の公表された肺炎連鎖球菌対応物と比較して少なくとも 1、好ましくは 少なくとも 2、好ましくは少なくとも3の異なるアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードする。また本明細書で言及する、例えば配列表に挙げるタンパク質の断片である（または全タンパク質）かかる単離ポリペプチドであって少なくとも 6、7、または8 アミノ酸残基を有し、かかる核酸によってコードされるものも好ましい。
本発明による核酸分子は、四番目の選択として、上記第一、第二および第三の選択による本発明の核酸のいずれかとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は典型的には本明細書に記載するものである。
最後に、本発明による核酸分子は、五番目の選択として、上記第一、第二、第三および第四の選択による本発明のいずれかの核酸分子による核酸分子のいずれかと遺伝暗号の縮重がなければ、ハイブリダイズしうる核酸分子であってもよい。この種の核酸分子は、好ましくは本発明による核酸が、本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードすることをいう。この種の核酸分子は本発明による核酸分子の検出に特に有用であり、したがって、対応する微生物、例えば、肺炎連鎖球菌およびこの種の微生物が関与する疾患または疾患状態の診断に有用である。好ましくは、ハイブリダイゼーションは四番目の選択について記載したストリンジェントな条件下でおこるか行われる。
本明細書において用いる核酸分子は、一般にリボ核酸分子またはデオキシリボ核酸分子のいずれかであり、非修飾 RNAまたはDNAあるいは修飾RNAまたはDNAであってもよい。したがって例えば、本明細書において用いる核酸分子は、とりわけ、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖 RNAの混合物であるDNA、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖またはより典型的には二本鎖または三本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子である。さらに、本明細書において用いる核酸分子は、RNAまたは DNAあるいはRNAとDNAとの両方を含む三本鎖領域もさす。かかる領域における鎖は同一分子由来でも異なる分子由来でもよい。領域は１以上の分子のすべてを含んでもよいが、より典型的にはいくつかの分子の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書において用いる、核酸分子の語は、１以上の修飾塩基を含む上記のDNAまたは RNAを含む。したがって、安定性またはその他の理由で修飾された骨格を有するDNAまたは RNAは本明細書でいうところの「核酸分子」である。さらに、珍しい塩基、例えばイノシン、または修飾塩基、トリチル化塩基を含むDNAまたは RNAは、二例を挙げただけだが、本明細書でいうところの核酸分子である。多くの有用な目的に役立つDNA およびRNAに対する様々な修飾がなされていることは当業者に知られている。核酸分子の語は、本明細書で用いる場合、かかる化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態の核酸分子、およびとりわけウイルスおよび、単細胞および多細胞を含む細胞に典型的な化学形態のDNAおよび RNAを含む。核酸分子の語はまた、オリゴヌクレオチドとしばしば称される短い核酸分子も含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」または「核酸分子」は本明細書において互換的に用いられる。
本発明において提供される核酸分子は多数の独特の断片を含み、それらには肺炎連鎖球菌コード領域の配列表に示す核酸分子配列より長いものも短いものもあり、標準的クローニング方法によって作成できるものである。独特であるためには、断片はその他の既知の核酸配列と区別するのに十分な大きさで有る必要があり、その違いはコンピュータ・データベース、例えば、GenBankにおけるヌクレオチド 配列に対して選択した肺炎連鎖球菌断片を比較することによって簡単に決定される。
さらに、修飾は、本発明に含まれる核酸分子およびポリペプチドに対して行ってもよい。例えば、核酸によってコードされるポリペプチドを変更しないヌクレオチド置換を行ってもよく、したがって、過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードするあらゆる核酸分子が本発明に含まれる。
さらに本発明によって提供される過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする核酸分子はいずれも、標準的技術、例えば標準的クローニング技術を用いて、あらゆる所望の調節配列に機能的に連結させてもよく、これは肺炎連鎖球菌調節配列または異種調節配列、異種リーダー配列、異種マーカー配列または融合タンパク質を作る異種コード配列であってよい。
本発明の核酸分子はRNAの形態、例えば、 mRNAまたはcRNA、あるいはDNAの形態、例えば、クローニングによって得られるか、化学合成技術によって製造されるかまたはその組み合わせによって作られるcDNAおよびゲノムDNAであってもよい。DNAは、三本鎖、二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖 DNAはセンス鎖としても知られているコード鎖であってもよいし、アンチセンス鎖として知られている非コード鎖であってもよい。
本発明はさらに、配列表に示す推定肺炎連鎖球菌アミノ酸配列を有する過免疫血清反応性抗原およびその断片の、断片、アナログおよび誘導体をコードする上記の核酸分子の変異形にも関する。核酸分子の変異形は、天然の変異形、例えば、天然の対立遺伝子変異形でもよいし、天然には起こることが知られていない変異形であってもよい。かかる核酸分子の非天然の変異形は、例えば核酸分子、細胞または生物体に対して行われる突然変異誘発技術によって作ることが出来る。
これに関する変異形は、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって上記核酸分子と異なる変異形である。置換、欠失または付加は１以上のヌクレオチドを伴いうる。変異形はコードまたは非コード領域において変わっているものでも両方が変わっているものでもよい。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を作りうる。配列表に示す肺炎連鎖球菌配列を有する、変異形、アナログ、誘導体または断片、あるいは断片の変異形、アナログまたは誘導体をコードする核酸分子が好ましく、ここでいくつかの、数個、5〜10、1〜 5、1 〜 3、2、1または0のアミノ酸が置換、欠失または付加されているかあるいはその組み合わせである。このなかで特に好ましいのは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これらは配列表に示す肺炎連鎖球菌ポリペプチドの性質および活性を変化させない。この点で特に好ましいのは、保存的置換である。
本発明によるペプチドおよび断片はまた修飾エピトープを含み、ここで所与のエピトープの好ましくは１または２のアミノ酸が、例えば｛Tourdot、S. et al.、2000｝に開示の規則にしたがって、修飾されるか、置換されている。かかる修飾エピトープをコードする核酸配列も同様である。
アミノ酸置換による本発明のエピトープに由来するエピトープであって、エピトープのT 細胞活性化能力を向上、保存または少なくとも有意に阻害しないものも本発明によるエピトープに含まれることが明らかである。それゆえ、本発明のエピトープは肺炎連鎖球菌由来の元の配列を含まないが、T 細胞応答をトリガーし、好ましくはT 細胞応答を向上させるエピトープも含む。これらエピトープは「ヘテロクリティック」と称される; これらはMHC/HLA 分子に対して同様のまたは好ましくはより高い親和性を有している必要があり、元のエピトープに対するT 細胞受容体 (TCR)を同様にまたは好ましくはより強く刺激する能力を有する必要がある。
ヘテロクリティックエピトープは、合理的設計により得ることが出来る。即ち例えば｛Rammensee、H. et al.、1999｝に記載のように個々の残基のMHC/HLAへの結合に対する寄与を考慮し、それとともにTCRとの相互作用の能力がある残基を系統的に交換し、その結果得られた配列を元のエピトープに対するT 細胞を用いて試験するとよい。かかる設計は過度の実験をしなくても当業者に可能である。
もう一つの可能性は、元のエピトープに対するT 細胞によるペプチドライブラリーのスクリーニングを含む。好ましい方法は合成ペプチドライブラリーの位置スキャニング(positional scanning)である。かかるアプローチは、例えば｛Hemmer、B. et al.、1999｝およびそのなかの引用文献に詳細に記載されている。
本発明由来のアミノ酸配列またはヘテロクリティックエピトープによって代表されるエピトープの代わりに、これらエピトープを模倣する物質、例えば、「ペプチド疑似体」または「レトロ逆転（retro-inverso）-ペプチド」も利用できる。
改良エピトープの設計のその他の態様は、そのT 細胞の刺激能力を向上させる物質による製剤または修飾である。これらにはヘルパーT細胞エピトープ、脂質またはリポソームまたはWO 01/78767に記載の好ましい修飾が含まれる。
エピトープのT 細胞刺激能力を上昇させるもう一つの方法は、それらを免疫刺激物質、例えば、サイトカインまたはケモカイン、例えば、インターロイキン-2、-7、-12、-18、クラスIおよびII インターフェロン (IFN)、特にIFN-ガンマ、GM-CSF、TNF-アルファ、flt3-リガンドその他とともに製剤することである。
本発明の核酸分子アッセイについてさらに説明すると、例えば、上記の本発明の核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードする全長 cDNAおよびゲノムクローンの単離および本発明の核酸分子と高い配列類似性を有するその他の遺伝子のcDNAおよびゲノムクローンの単離のためのRNA、cDNAおよびゲノムDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることが出来る。かかるプローブは一般に少なくとも 15塩基を含む。好ましくは、かかるプローブは、少なくとも 20、少なくとも 25または 少なくとも 30塩基を有し、少なくとも 50塩基を有することもある。特に好ましいプローブは少なくとも 30塩基であって50塩基以下、例えば、30、35、40、45、または50塩基である。
例えば、本発明の核酸分子のコード領域はオリゴヌクレオチドプローブの合成のための既知のDNA 配列を用いて関連ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することが出来る。本発明の遺伝子の配列と相補的配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを用いて次にcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを判定する。
本発明の核酸分子およびポリペプチドは、とりわけ核酸分子アッセイに関してさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患の治療および診断の開発用試薬および材料として用いることが出来る。
オリゴヌクレオチドである本発明の核酸分子は、上記方法に用い、好ましくはPCRに用いて、全体または部分を本明細書において同定した肺炎連鎖球菌遺伝子が存在するか、および/または、血液などの感染組織において転写されているかを判定することが出来る。かかる配列は感染の段階および病原菌が達成した感染の種類の診断における有用性も有することが認識される。この目的および他の目的のために本明細書に記載する本発明による少なくとも１つの核酸を含むアレイを利用することが出来る。
本発明による核酸分子は、核酸分子およびこれら核酸を含む生物またはサンプルの検出に用いることが出来る。好ましくはかかる検出は診断のためであり、より好ましくは肺炎連鎖球菌の存在または量に関連または連動する疾患の診断のためである。
肺炎連鎖球菌により感染した真核生物(「個体」とも称する)、特に哺乳類、特にヒトを、様々な技術によってDNAレベルで検出される本発明による核酸分子のいずれかを検出することによって同定することが出来る。肺炎連鎖球菌をその他の生物と区別するための好ましい核酸分子候補を得ることが出来る。
本発明は肺炎連鎖球菌による感染によって生じる疾患の診断方法を提供し、該方法は、配列表に示す核酸分子の配列を有する核酸分子の発現レベルの上昇を、個体から単離または由来したサンプルから判定することを含む。核酸分子の発現は核酸分子の定量のための当該技術分野に周知の方法のいずれかを用いて測定することが出来、例えば、PCR、RT-PCR、Rnase 保護、ノザンブロッティング、その他のハイブリダイゼーション方法および本明細書に記載するアレイが挙げられる。
本明細書において用いる単離とは、その天然の状態から「人の手によって」分離されていることを意味する; 即ち、それが天然に存在する場合、その元の環境から変化または取り出されているか、その両方である。例えば、天然状態において生体に天然に存在する天然の核酸分子またはポリペプチドは「単離」されていないが、同じ核酸分子またはポリペプチドがその天然状態で共に存在する物質から分離されていると、ここで用いる用語では「単離」されていることになる。単離の一部としてまたは単離の後に、かかる核酸分子に例えば、融合タンパク質を形成させるための突然変異誘発のために、そして宿主での増殖または発現のために、DNA等のその他の核酸分子を結合させてもよい。単離核酸分子は単独でまたはベクター等のその他の核酸分子と結合させて、培養中または生体全体における宿主細胞に導入することが出来る。培養中または生体全体における宿主細胞に導入されても、かかるDNAは本明細書の意味ではいまだに単離されたままである。というのはそれらは天然の形態または環境にはないからである。同様に核酸分子およびポリペプチドは組成物、例えば、培地製剤、核酸分子またはポリペプチドの、例えば細胞への導入用の溶液、化学反応または酵素反応のための組成物または溶液中にあってもよく、これらは天然の組成物ではなく、そして本明細書の意味によるとそこでも単離核酸分子またはポリペプチドは単離された状態である。
本発明による核酸は化学合成してもよい。あるいは核酸は当業者に知られた方法によって肺炎連鎖球菌から単離してもよい。
本発明の別の態様によると、本明細書に記載の抗原同定方法の使用により、新規な過免疫血清反応性抗原およびその断片の網羅的セットが提供される。本発明の好ましい態様において、本明細書に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原およびその断片が提供される。本発明の別の好ましい態様において、配列番号 145、245-288に示されるポリペプチド配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む新規なセットの過免疫血清反応性抗原およびその断片が提供される。本発明のさらに好ましい態様において、配列番号 146-150、152、154-160、162-167、169-175、178、180、182-186、188、191-192、195、197、199-206、208、211、215-220、222-223、225-238、240-244に示されるポリペプチド配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原およびその断片が提供される。本発明のより好ましい態様において、配列番号 153、161、168、176、181、187、196、198、209-210、214、224に示されるポリペプチド配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原およびその断片が提供される。
本発明において提供される過免疫血清反応性抗原およびその断片には、配列表に示すあらゆるポリペプチド、および配列表に示すポリペプチドに対して少なくとも 70％の同一性を有するポリペプチド、配列表に示すポリペプチドに対して好ましくは 少なくとも 80％または85％の同一性を有するポリペプチド、より好ましくは配列表に示すポリペプチドに対して少なくとも 90％の類似性(より好ましくは少なくとも 90％の同一性)、さらにより好ましくは配列表に示すポリペプチドに対して少なくとも 95％、96％、97％、98％、99％または99.5％の類似性(さらにより好ましくは 少なくとも 95％、96％、97％、98％、99％、または 99.5％の同一性) を有するポリペプチドが含まれ、また、かかるポリペプチドの部分も含まれ、ここでポリペプチドの部分は一般に少なくとも 4 アミノ酸、より好ましくは少なくとも 8、より好ましくは少なくとも 30、さらにより好ましくは少なくとも 50 アミノ酸、例えば4、8、10、20、30、35、40、45または50 アミノ酸を含む。
本発明はまた、これら過免疫血清反応性抗原およびその断片の、断片、アナログ、および誘導体に関する。アミノ酸配列が配列表に示される抗原について用いられる、「断片」、「誘導体」および「アナログ」は、かかる過免疫血清反応性抗原およびその断片と実質的に同一または類似の生理機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。
過免疫血清反応性抗原およびその断片の、断片、誘導体またはアナログは以下であり得る：1)１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基 (好ましくは保存的アミノ酸残基)によって置換されており、かかる置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされるものであってもなくてもよいもの、または2)１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または3)成熟過免疫血清反応性抗原またはその断片が別の化合物、例えば、過免疫血清反応性抗原およびその断片の半減期を上昇させる化合物 (例えば、ポリエチレングリコール)と融合しているもの、または4)追加のアミノ酸（リーダーまたは分泌配列または成熟過免疫血清反応性抗原またはその断片の精製に利用される配列あるいはプロタンパク質配列）が成熟過免疫血清反応性抗原またはその断片に融合しているもの。かかる断片、誘導体およびアナログは本明細書の教示から当業者の技術範囲内である。
本発明はまた、様々な肺炎連鎖球菌分離株の抗原にも関する。かかるホモログは本明細書に開示する核酸およびアミノ酸配列に基づいて容易に単離できる。現在までに識別された40を超える血清学的グループ（serogroup）のなかには90を超える血清型(serotype)があり、分類は血清型特異的抗血清に基づいている。いずれかの抗原の存在をしたがって各血清型について判定すればよい。さらに様々な血清型における特定の抗原のばらつきもS. pyogenes sic 遺伝子｛Hoe、N. et al.、2001｝について記載されているように判定することが可能である。様々な血清型の様々な肺炎球菌感染症への寄与は、年齢群および地理的領域によって異なる（｛Gray、B. et al.、1979｝; ｛Gray、B. et al.、1986｝; ｛Orange、M. et al.、1993｝、概説は、Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diesases、7th Edition-Second Printing、The Pink Book)。非常に有効な保護抗原が様々な臨床株の間で保存されていると予測されるということが、重要な側面である。
この点で本発明の特に好ましい態様は、配列表に示す過免疫血清反応性抗原、その変異形、アナログ、誘導体および断片、ならびに断片の変異形、アナログおよび誘導体である。さらに過免疫血清反応性抗原、その変異形、アナログ、誘導体および断片、断片の変異形、アナログおよび誘導体を含む融合ポリペプチドも本発明に含まれる。かかる融合ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにそれらをコードする核酸分子は標準的技術を用いて容易に作ることが出来、かかる技術としては、融合タンパク質をコードする組み換えポリ核酸の産生および発現のための標準的組換え技術が含まれる。
変異形のなかで好ましいのは保存的アミノ酸置換によって基準（reference）と異なるものである。かかる置換はポリペプチド中の所与のアミノ酸を類似の特徴を有する別のアミノ酸で置換するものである。保存的置換として典型的にみられるのは、脂肪族アミノ酸、 Ala、Val、Leuおよび Ile内での互いの置換;ヒドロキシル残基 Ser およびThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基 Asnおよび Glnの置換、塩基性残基Lysおよび Arg の交換、および芳香族残基PheおよびTyrの置換である。
この点でさらに特に好ましいのは、配列表に示すいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列を有する、変異形、アナログ、誘導体および断片、そして断片の変異形、アナログおよび誘導体であって、いくつかの、数個、5 〜 10、1 〜 5、1〜 3、2、1または0のアミノ酸残基が置換、欠失または付加された、あるいはその組み合わせのものである。なかでも特に好ましいのは本発明のポリペプチドの性質および活性を変化させないサイレントな置換、付加および欠失である。この点で特に好ましいのは保存的置換である。もっとも好ましいのは配列表に示すアミノ酸配列を有し、置換を有さないポリペプチドである。
本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片は好ましくは単離形態で提供され、好ましくは均一に精製されたものである。
本発明の好ましい態様は、配列表に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片を含むポリペプチド、および配列表に示すポリペプチドの変異形および誘導体の断片である。
この点で断片とは、上記過免疫血清反応性抗原およびその断片、およびその変異形または誘導体、アナログ、断片のアミノ酸配列のすべてではないが一部と全く同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。かかる断片は「独立」であり得る。即ち、その他のアミノ酸またはポリペプチドの一部ではなくそれに融合しているわけではなくてもよいし、それらが一部または領域を形成するより大きいポリペプチドに含まれていてもよい。本発明のこの点で好ましいのは本発明のポリペプチドの構造または機能特性によって特徴づけられる断片、即ち、本発明のポリペプチドのアルファヘリックスおよびアルファヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターン・ターン-形成領域、コイル・コイル-形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ-両親媒性領域、可動性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高い抗原性指数領域を含む断片、およびかかる断片の組み合わせである。好ましい領域は本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片の活性を媒介する領域である。この点でもっとも好ましいのは本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片の化学、生物またはその他の活性を有する断片であり、例えば、類似の活性または向上した活性、または低下した望ましくない活性を有する断片である。特に好ましいのは肺炎連鎖球菌の生存に必須な機能またはヒトにおける疾患を引き起こす能力を付与する受容体または酵素のドメインを含む断片である。さらに好ましいポリペプチド断片は、動物、特にヒトにおける抗原または免疫原決定基を含むものである。
抗原性断片とは、それ自体が抗原性であるかハプテンとして提供されると抗原性となる、同定された抗原の断片として定義される。それゆえ、１または(より長い断片については)数個のみのアミノ酸交換を示す抗原または抗原性断片が本発明の範囲で可能であるが、ただし、アミノ酸交換を有するかかる断片の抗原性能力が交換によってひどく損なわれていないことを条件とする。即ち、この抗原によってワクチン接種された個体における適当な免疫応答の誘発に好適であり、個体の血清からの個体の抗体調製物によって同定されるものである。
過免疫血清反応性抗原のかかる断片の好ましい例は、表1の列「予測免疫原性アミノ酸」および「同定された免疫原性領域の位置」；表２の血清反応性エピトープのアミノ酸配列を含むペプチドからなる群から選択され、特に以下のアミノ酸を含むペプチド；4-11、35-64、66-76、101-108、111-119 および 57-114 （配列番号 145）; 5-27、32-64、92-102、107-113、119-125、133-139、148-162、177-187、195-201、207-214、241-251、254-269、285-300、302-309、317-324、332-357、365-404、411-425、443-463、470-477、479-487、506-512、515-520、532-547、556-596、603-610、616-622、624-629、636-642、646-665、667-674、687-692、708-720、734-739、752-757、798-820、824-851、856-865 および 732-763 （配列番号 146）; 14-21、36-44、49-66、102-127、162-167、177-196、45-109 および 145-172 （配列番号 147）; 17-35、64-75、81-92、100-119、125-172、174-183、214-222、230-236、273-282、287-303、310-315、331-340、392-398、412-420、480-505、515-523、525-546、553-575、592-598、603-609、617-625、631-639、644-651、658-670、681-687、691-704、709-716、731-736、739-744、750-763、774-780、784-791、799-805、809-822、859-870、880-885、907-916、924-941、943-949、973-986、1010-1016、1026-1036、1045-1054、1057-1062、1082-1088、1095-1102、1109-1120、1127-1134、1140-1146、1152-1159、1169-1179、1187-1196、1243-1251、1262-1273、1279-1292、1306-1312、1332-1343、1348-1364、1379-1390、1412-1420、1427-1436、1458-1468、1483-1503、1524-1549、1574-1588、1614-1619、1672-1685、1697-1707、1711-1720、1738-1753、1781-1787、1796-1801、1826-1843、132-478、508-592 および 1753-1810 （配列番号 148）; 15-43、49-55、71-77、104-110、123-130、162-171、180-192、199-205、219-227、246-254、264-270、279-287、293-308、312-322、330-342、349-356、369-377、384-394、401-406、416-422、432-439、450-460、464-474、482-494、501-508、521-529、536-546、553-558、568-574、584-591、602-612、616-626、634-646、653-660、673-681、688-698、705-710、720-726、736-749、833-848、1-199、200-337、418-494 および 549-647 （配列番号 149）; 9-30、65-96、99-123、170-178 および 1-128 （配列番号 150）; 7-32、34-41、96-106、127-136、154-163、188-199、207-238、272-279、306-312、318-325、341-347、353-360、387-393、399-406、434-440、452-503、575-580、589-601、615-620、635-640、654-660、674-680、696-701、710-731、1-548 および 660-691 （配列番号 151）; 4-19、35-44、48-59、77-87、93-99、106-111、130-138、146-161 および 78-84 （配列番号 152）; 24-30、36-43、64-86、93-99、106-130、132-145、148-165、171-177、189-220、230-249、251-263、293-300、302-312、323-329、338-356、369-379、390-412 および 179-193 （配列番号 153）; 30-39、61-67、74-81、90-120、123-145、154-167、169-179、182-197、200-206、238-244、267-272 および 230-265 （配列番号 154）; 14-20、49-65、77-86 および 2-68 （配列番号 155）; 4-9、26-35、42-48、53-61、63-85、90-101、105-111、113-121、129-137、140-150、179-188、199-226、228-237、248-255、259-285、299-308、314-331、337-343、353-364、410-421、436-442 および 110-144 （配列番号 156）; 36-47、55-63、94-108、129-134、144-158、173-187、196-206、209-238、251-266、270-285、290-295、300-306、333-344、346-354、366-397、404-410、422-435、439-453、466-473、515-523、529-543、554-569、571-585、590-596、607-618、627-643、690-696、704-714、720-728、741-749、752-767、780-799、225-247 および 480-507 （配列番号 157）; 16-25、36-70、80-93、100-106 および 78-130 （配列番号 158）; 18-27、41-46、50-57、65-71、79-85、93-98、113-128、144-155、166-178、181-188、201-207、242-262、265-273、281-295、303-309、318-327 および 36-64 （配列番号 159）; 7-29、31-44、50-59、91-96、146-153、194-201、207-212、232-238、264-278、284-290、296-302、326-353、360-370、378-384、400-405、409-418、420-435、442-460、499-506、529-534、556-562、564-576、644-651、677-684、687-698、736-743、759-766、778-784、808-814、852-858、874-896、920-925、929-935、957-965、1003-1012、1021-1027、1030-1044、1081-1087、1101-1111、1116-1124、1148-1159、1188-1196、1235-1251、1288-1303、1313-1319、1328-1335、1367-1373、1431-1437、1451-1458、1479-1503、1514-1521、1530-1540、1545-1552、1561-1568、1598-1605、1617-1647、1658-1665、1670-1676、1679-1689、1698-1704、1707-1713、1732-1738、1744-1764、1-70、154-189、922-941、1445-1462 および 1483-1496 （配列番号 160）; 6-51、81-91、104-113、126-137、150-159、164-174、197-209、215-224、229-235、256-269、276-282、307-313、317-348、351-357、376-397、418-437、454-464、485-490、498-509、547-555、574-586、602-619 および 452-530 （配列番号 161）; 25-31、39-47、49-56、99-114、121-127、159-186、228-240、253-269、271-279、303-315、365-382、395-405、414-425、438-453 および 289-384 （配列番号 162）; 9-24、41-47、49-54、68-78、108-114、117-122、132-140、164-169、179-186、193-199、206-213、244-251、267-274、289-294、309-314、327-333、209-249 および 286-336 （配列番号 163）; 9-28、53-67、69-82、87-93、109-117、172-177、201-207、220-227、242-247、262-268、305-318、320-325 および 286-306 （配列番号 164）; 4-10、26-39、47-58、63-73、86-96、98-108、115-123、137-143、148-155、160-176、184-189、194-204、235-240、254-259、272-278 および 199-283 （配列番号 165）; 4-26、33-39、47-53、59-65、76-83、91-97、104-112、118-137、155-160、167-174、198-207、242-268、273-279、292-315、320-332、345-354、358-367、377-394、403-410、424-439、445-451、453-497、511-518、535-570、573-589、592-601、604-610 および 202-242 （配列番号 166）; 8-30、36-45、64-71、76-82、97-103、105-112、134-151、161-183、211-234、253-268、270-276、278-284、297-305、309-315、357-362、366-372、375-384、401-407、409-416、441-455、463-470、475-480、490-497、501-513、524-537、552-559、565-576、581-590、592-600、619-625、636-644、646-656 および 316-419 （配列番号 167）; 4-17、52-58、84-99、102-110、114-120、124-135、143-158、160-173、177-196、201-216、223-250、259-267、269-275 および 1-67 （配列番号 168）; 6-46、57-67、69-80、82-133、137-143、147-168、182-187、203-209、214-229、233-242、246-280 および 53-93 （配列番号 169）; 7-40、50-56、81-89、117-123、202-209、213-218、223-229、248-261、264-276、281-288、303-308、313-324、326-332、340-346、353-372、434-443、465-474、514-523、556-564、605-616、620-626、631-636、667-683、685-699、710-719、726-732、751-756、760-771、779-788、815-828、855-867、869-879、897-902、917-924、926-931、936-942、981-1000、1006-1015、1017-1028、1030-1039、1046-1054、1060-1066、1083-1092、1099-1112、1122-1130、1132-1140、1148-1158、1161-1171、1174-1181、1209-1230、1236-1244、1248-1254、1256-1267、1269-1276、1294-1299、1316-1328、1332-1354、1359-1372、1374-1380、1384-1390、1395-1408、1419-1425、1434-1446、1453-1460、1465-1471、1474-1493、1505-1515、1523-1537、1547-1555、1560-1567、1577-1605、1633-1651、1226-1309、1455-1536 および 1538-1605 （配列番号 170）; 4-10、31-39、81-88、106-112、122-135、152-158、177-184、191-197、221-227、230-246、249-255、303-311、317-326、337-344、346-362、365-371、430-437、439-446、453-462、474-484 および 449-467 （配列番号 171）; 9-15、24-35、47-55、122-128、160-177、188-196、202-208、216-228、250-261、272-303、318-324、327-339、346-352、355-361、368-373、108-218 および 344-376 （配列番号 172）; 6-14、17-48、55-63、71-90、99-109、116-124、181-189、212-223、232-268、270-294、297-304、319-325、340-348、351-370、372-378、388-394、406-415、421-434 および 177-277 （配列番号 173）; 21-39、42-61、65-75、79-85、108-115 および 11-38 （配列番号 174）; 4-17、26-39、61-76、103-113、115-122、136-142、158-192、197-203、208-214、225-230、237-251 および 207-225 （配列番号 175）; 5-11、27-36、42-53、62-70、74-93、95-104、114-119、127-150、153-159、173-179、184-193、199-206、222-241、248-253、257-280、289-295、313-319、322-342、349-365、368-389、393-406、408-413、426-438、447-461、463-470、476-495、532-537、543-550 および 225-246 （配列番号 176）; 4-29、68-82、123-130、141-147、149-157、178-191、203-215、269-277、300-307、327-335、359-370、374-380、382-388、393-400、410-417、434-442、483-492、497-503、505-513、533-540、564-569、601-607、639-647、655-666、693-706、712-718、726-736、752-758、763-771、774-780、786-799、806-812、820-828、852-863、884-892、901-909、925-932、943-948、990-996、1030-1036、1051-1059、1062-1068、1079-1086、1105-1113、1152-1162、1168-1179、1183-1191、1204-1210、1234-1244、1286-1295、1318-1326、1396-1401、1451-1460、1465-1474、1477-1483、1488-1494、1505-1510、1514-1521、1552-1565、1593-1614、1664-1672、1677-1685、1701-1711、1734-1745、1758-1770、1784-1798、1840-1847、1852-1873、1885-1891、1906-1911、1931-1939、1957-1970、1977-1992、2014-2020、2026-2032、2116-2134、1-348、373-490、573-767、903-1043、1155-1198、1243-1482、1550-1595、1682-1719、1793-1921 および 2008-2110 （配列番号 177）; 10-35、39-52、107-112、181-188、226-236、238-253、258-268、275-284、296-310、326-338、345-368、380-389、391-408、410-418、420-429、444-456、489-505、573-588、616-623、637-643、726-739、741-767、785-791、793-803、830-847、867-881、886-922、949-956、961-980、988-1004、1009-1018、1027-1042、1051-1069、1076-1089、1108-1115、1123-1135、1140-1151、1164-1179、1182-1191、1210-1221、1223-1234、1242-1250、1255-1267、1281-1292、1301-1307、1315-1340、1348-1355、1366-1373、1381-1413、1417-1428、1437-1444、1453-1463、1478-1484、1490-1496、1498-1503、1520-1536、1538-1546、1548-1570、1593-1603、1612-1625、1635-1649、1654-1660、1670-1687、1693-1700、1705-1711、1718-1726、1729-1763、1790-1813、1871-1881、1893-1900、1907-1935、1962-1970、1992-2000、2006-2013、2033-2039、2045-2051、2055-2067、2070-2095、2097-2110、2115-2121、2150-2171、2174-2180、2197-2202、2206-2228 および 1526-1560 （配列番号 178）; 4-17、35-48、54-76、78-107、109-115、118-127、134-140、145-156、169-174、217-226、232-240、256-262、267-273、316-328、340-346、353-360、402-409、416-439、448-456、506-531、540-546、570-578、586-593、595-600、623-632、662-667、674-681、689-705、713-724、730-740、757-763、773-778、783-796、829-835、861-871、888-899、907-939、941-955、957-969、986-1000、1022-1028、1036-1044、1068-1084、1095-1102、1118-1124、1140-1146、1148-1154、1168-1181、1185-1190、1197-1207、1218-1226、1250-1270、1272-1281、1284-1296、1312-1319、1351-1358、1383-1409、1422-1428、1438-1447、1449-1461、1482-1489、1504-1510、1518-1527、1529-1537、1544-1551、1569-1575、1622-1628、1631-1637、1682-1689、1711-1718、1733-1740、1772-1783、1818-1834、1859-1872、1-64 および 128-495 （配列番号 179）; 8-28、32-37、62-69、119-125、137-149、159-164、173-189、200-205、221-229、240-245、258-265、268-276、287-293、296-30
2、323-329 および 1-95 （配列番号 180）; 9-18、25-38、49-63、65-72、74-81、94-117、131-137、139-146、149-158、162-188、191-207、217-225、237-252、255-269、281-293、301-326、332-342、347-354、363-370、373-380、391-400、415-424、441-447 および 75-107 （配列番号 181）; 4-24、64-71、81-87、96-116、121-128、130-139、148-155、166-173、176-184、203-215、231-238、243-248、256-261、280-286、288-306、314-329 および 67-148 （配列番号 182）; 4-10、19-37、46-52、62-81、83-89、115-120、134-139、141-151、168-186、197-205、209-234、241-252、322-335、339-345、363-379、385-393、403-431、434-442、447-454、459-465、479-484、487-496 および 404-420 （配列番号 183）; 10-35、46-66、71-77、84-93、96-122、138-148、154-172、182-213、221-233、245-263、269-275、295-301、303-309、311-320、324-336、340-348、351-359、375-381 および 111-198 （配列番号 184）; 14-25、30-42、47-61、67-75、81-91、98-106、114-122、124-135、148-193、209-227 および 198-213 （配列番号 185）; 5-18、45-50、82-90、97-114、116-136、153-161、163-171、212-219、221-227、240-249、267-281、311-317、328-337、375-381、390-395、430-436、449-455、484-495、538-543、548-554、556-564、580-586、596-602 および 493-606 （配列番号 186）; 9-25、28-34、37-44、61-68、75-81、88-96、98-111、119-133、138-150、152-163、168-182、186-194、200-205、216-223、236-245、257-264、279-287、293-304、311-318、325-330、340-346、353-358、365-379、399-409、444-453 および 303-391 （配列番号 187）; 16-36、55-61、66-76、78-102、121-130、134-146、150-212、221-239、255-276、289-322、329-357 および 29-59 （配列番号 188）; 8-27、68-74、77-99、110-116、124-141、171-177、202-217、221-228、259-265、275-290、293-303、309-325、335-343、345-351、365-379、384-394、406-414、423-437、452-465、478-507、525-534、554-560、611-624、628-651、669-682、742-747、767-778、782-792、804-812、820-836、79-231 および 359-451 （配列番号 189）; 5-28、39-45、56-62、67-74、77-99、110-117、124-141、168-176、200-230、237-244、268-279、287-299、304-326、329-335、348-362、370-376、379-384、390-406、420-429、466-471、479-489、495-504、529-541、545-553、561-577、598-604、622-630、637-658、672-680、682-688、690-696、698-709、712-719、724-736、738-746、759-769、780-786、796-804、813-818、860-877、895-904、981-997、1000-1014、1021-1029、1-162、206-224、254-350、414-514 および 864-938 （配列番号 190）; 4-11、19-49、56-66、68-101、109-116、123-145、156-165、177-185、204-221、226-234、242-248、251-256、259-265、282-302、307-330、340-349、355-374、377-383、392-400、422-428、434-442、462-474 および 266-322 （配列番号 191）; 14-43、45-57、64-74、80-87、106-127、131-142、145-161、173-180、182-188、203-210、213-219、221-243、245-254、304-311、314-320、342-348、354-365、372-378、394-399、407-431、436-448、459-465、470-477、484-490、504-509、531-537、590-596、611-617、642-647、723-734、740-751、754-762、764-774、782-797、807-812、824-831、838-845、877-885、892-898、900-906、924-935、940-946、982-996、1006-1016、1033-1043、1051-1056、1058-1066、1094-1108、1119-1126、1129-1140、1150-1157、1167-1174、1176-1185、1188-1201、1209-1216、1220-1228、1231-1237、1243-1248、1253-1285、1288-1297、1299-1307、1316-1334、1336-1343、1350-1359、1365-1381、1390-1396、1412-1420、1427-1439、1452-1459、1477-1484、1493-1512、1554-1559、1570-1578、1603-1608、1623-1630、1654-1659、1672-1680、1689-1696、1705-1711、1721-1738、1752-1757、1773-1780、1817-1829、1844-1851、1856-1863、1883-1895、1950-1958、1974-1990、172-354、384-448、464-644、648-728 および 1357-1370 （配列番号 192）; 8-27、68-74、77-99、110-116、124-141、169-176、201-216、220-227、258-264、274-289、292-302、308-324、334-342、344-350、364-372、377-387、399-407、416-429、445-458、471-481、483-500、518-527、547-553、604-617、621-644、662-675、767-778、809-816、15-307、350-448 および 496-620 （配列番号 193）; 4-17、24-29、53-59、62-84、109-126、159-164、189-204、208-219、244-249、274-290、292-302、308-324、334-342、344-350、378-389、391-397、401-409、424-432、447-460、470-479、490-504、521-529、538-544、549-555、570-577、583-592、602-608、615-630、635-647、664-677、692-698、722-731、733-751、782-790、793-799、56-267、337-426 および 495-601 （配列番号 194）; 12-22、49-59、77-89、111-121、136-148、177-186、207-213、217-225、227-253、259-274、296-302、328-333、343-354、374-383、424-446、448-457、468-480、488-502、507-522、544-550、553-560、564-572、587-596、604-614、619-625、629-635、638-656、662-676、680-692、697-713、720-738、779-786、833-847、861-869、880-895、897-902、911-917、946-951、959-967、984-990、992-1004、1021-1040、1057-1067、1073-1080 および 381-403 （配列番号 195）; 4-10、26-31、46-56、60-66、70-79、86-94、96-102、109-118、132-152、164-187、193-206、217-224 および 81-149 （配列番号 196）; 4-21、26-37、48-60、71-82、109-117、120-128、130-136、142-147、181-187、203-211、216-223、247-255、257-284、316-325、373-379、395-400、423-435、448-456、479-489、512-576、596-625、641-678、680-688、692-715 および 346-453 （配列番号 197）; 10-16、25-31、34-56、58-69、71-89、94-110、133-176、186-193、208-225、240-250、259-266、302-307、335-341、376-383、410-416 および 316-407 （配列番号 198）; 11-29、42-56、60-75、82-88、95-110、116-126、132-143、145-160、166-172、184-216 および 123-164 （配列番号 199）; 11-29、54-63、110-117、139-152、158-166、172-180、186-193、215-236、240-251、302-323、330-335、340-347、350-366、374-381 および 252-299 （配列番号 200）; 18-27、35-42、50-56、67-74、112-136、141-153、163-171、176-189、205-213、225-234、241-247、253-258、269-281、288-298、306-324、326-334、355-369、380-387 および 289-320 （配列番号 201）; 7-15、19-41、56-72、91-112、114-122、139-147、163-183、196-209、258-280、326-338、357-363、391-403、406-416 および 360-378 （配列番号 202）; 11-18、29-41、43-49、95-108、142-194、204-212、216-242、247-256、264-273 および 136-149 （配列番号 203）; 18-24、33-40、65-79、89-102、113-119、130-137、155-161、173-179、183-203、205-219、223-231、245-261、267-274、296-306、311-321、330-341、344-363、369-381、401-408、415-427、437-444、453-464、472-478、484-508、517-524、526-532、543-548 および 59-180 （配列番号 204）; 5-13、52-65、67-73、97-110、112-119、134-155 および 45-177 （配列番号 205）; 6-28、34-43、57-67、75-81、111-128、132-147、155-163、165-176、184-194、208-216、218-229、239-252、271-278、328-334、363-376、381-388、426-473、481-488、492-498、507-513、536-546、564-582、590-601、607-623、148-269、420-450 および 610-648 （配列番号 206）; 4-12、20-38、69-75、83-88、123-128、145-152、154-161、183-188、200-213、245-250、266-272、306-312、332-339、357-369、383-389、395-402、437-453、455-470、497-503 および 1-112 （配列番号 207）; 35-59、74-86、111-117、122-137 および 70-154 （配列番号 208）; 26-42、54-61、65-75、101-107、123-130、137-144、148-156、164-172、177-192、213-221、231-258 および 157-249 （配列番号 209）; 29-38、61-67、77-87、94-100、105-111、118-158 および 1-97 （配列番号 210）; 7-21、30-48、51-58、60-85、94-123、134-156、160-167、169-183、186-191、216-229、237-251、257-267、272-282、287-298 および 220-243 （配列番号 211）; 6-29、34-47、56-65、69-76、83-90、123-134、143-151、158-178、197-203、217-235、243-263、303-309、320-333、338-348、367-373、387-393、407-414、416-427、441-457、473-482、487-499、501-509、514-520、530-535、577-583、590-602、605-612、622-629、641-670、678-690、37-71 および 238-307 （配列番号 212）; 7-40、121-132、148-161、196-202、209-215、221-235、248-255、271-280、288-295、330-339、395-409、414-420、446-451、475-487、556-563、568-575、580-586、588-595、633-638、643-648、652-659、672-685、695-700、710-716、737-742、749-754、761-767、775-781、796-806、823-835、850-863、884-890、892-900、902-915、934-941 および 406-521 （配列番号 213）; 9-18、24-46、51-58、67-77、85-108、114-126、129-137、139-146、152-165、173-182、188-195、197-204、217-250、260-274、296-313、343-366、368-384、427-434、437-446、449-455、478-484、492-506、522-527、562-591、599-606、609-618、625-631、645-652 および 577-654 （配列番号 214）; 13-20、26-37、41-53、56-65、81-100、102-114、118-127、163-188、196-202、231-238、245-252、266-285、293-298、301-306 および 19-78 （配列番号 215）; 10-23、32-42、54-66、73-91、106-113、118-127、139-152、164-173、198-207、210-245、284-300、313-318、330-337、339-346、354-361、387-393、404-426、429-439、441-453、467-473、479-485、496-509、536-544、551-558、560-566、569-574、578-588、610-615、627-635、649-675、679-690、698-716、722-734、743-754、769-780、782-787 および 480-550 （配列番号 216）; 6-39、42-50、60-68、76-83、114-129、147-162、170-189、197-205、217-231、239-248、299-305、338-344、352-357、371-377、380-451、459-483、491-499、507-523、537-559、587-613、625-681、689-729、737-781、785-809、817-865、873-881、889-939、951-975、983-1027、1031-1055、1063-1071、1079-1099、1103-1127、1151-1185、1197-1261、1269-1309、1317-1333、1341-1349、1357-1465、1469-1513、1517-1553、1557-1629、1637-1669、1677-1701、1709-1725、1733-1795、1823-1849、1861-1925、1933-1973、1981-2025、2029-2053、2061-2109、2117-2125、2133-2183、2195-2219、2227-2271、2275-2299、2307-2315、2323-2343、2347-2371、2395-2429、2441-2529、2537-2569、2577-2601、2609-2625、2633-2695、2699-2737、2765-2791、2803-2867、2889-2913、2921-2937、2945-2969、2977-2985、2993-3009、3023-3045、3073-3099、3111-3167、3175-3215、3223-3267、3271-3295、3303-3351、3359-3367、3375-3425、3437-3461、3469-3513、3517-3541、3549-3557、3565-3585、3589-3613、3637-3671、3683-3747、3755-3795、3803-3819、3827-3835、3843-3951、3955-3999、4003-4039、4043-4115、4123-4143、4147-4171、4195-4229、4241-4305、4313-4353、4361-4377、4385-4393、4401-4509、4513-4557、4561-4597、4601-4718、4749-4768、74-171、452-559 および 2951-3061 （配列番号 217）; 16-22、30-51、70-111、117-130、137-150、171-178、180-188、191-196 および 148-181 （配列番号 218）; 6-19、21-46、50-56、80-86、118-126、167-186、189-205、211-242、244-267、273-286、290-297、307-316、320-341 および 34-60 （配列番号 219）; 5-26、33-43、48-54、58-63、78-83、113-120、122-128、143-152、157-175、185-192、211-225、227-234、244-256、270-281、284-290、304-310、330-337、348-355、362-379、384-394、429-445、450-474、483-490、511-520、537-546、548-554、561-586、590-604、613-629、149-186、285-431 および 573-659 （配列番号 220）; 5-26、49-59、61-67、83-91、102-111、145-157、185-192、267-272、279-286、292-298、306-312、134-220、235-251 および 254-280 （配
列番号 221）; 5-19、72-79、83-92、119-124、140-145、160-165、167-182、224-232、240-252、259-270、301-310、313-322、332-343、347-367、384-398、416-429、431-446、454-461 および 1-169 （配列番号 222）; 8-17、26-31、56-62、75-83、93-103、125-131、135-141、150-194、205-217、233-258、262-268、281-286 および 127-168 （配列番号 223）; 6-12、69-75、108-115、139-159、176-182、194-214 および 46-161 （配列番号 224）; 6-13、18-27、39-48、51-59、66-73、79-85、95-101、109-116、118-124、144-164、166-177、183-193、197-204、215-223、227-236、242-249、252-259、261-270、289-301、318-325 および 12-58 （配列番号 225）; 4-10、26-32、48-60、97-105、117-132、138-163、169-185、192-214、219-231、249-261、264-270、292-308、343-356、385-392、398-404、408-417、435-441 および 24-50 （配列番号 226）; 10-40、42-48、51-61、119-126 および 1-118 （配列番号 227）; 5-17、40-58、71-83、103-111、123-140、167-177、188-204 および 116-128 （配列番号 228）; 4-9、11-50、57-70、112-123、127-138 および 64-107 （配列番号 229）; 9-39、51-67 および 1-101 （配列番号 230）; 5-14、17-25、28-46、52-59、85-93、99-104、111-120、122-131、140-148、158-179、187-197、204-225、271-283、285-293 および 139-155 （配列番号 231）; 42-70、73-90、92-108、112-127、152-164、166-172、181-199、201-210、219-228、247-274、295-302、322-334、336-346、353-358、396-414、419-425、432-438、462-471、518-523、531-536、561-567、576-589、594-612、620-631、665-671、697-710、718-731、736-756、765-771、784-801 および 626-653 （配列番号 232）; 8-28、41-51、53-62、68-74、79-85、94-100、102-108、114-120、130-154、156-162、175-180、198-204、206-213、281-294、308-318、321-339、362-368、381-386、393-399、407-415 および 2-13 （配列番号 233）; 4-39、48-65、93-98、106-112、116-129 および 10-36 （配列番号 234）; 25-32、35-50、66-71、75-86、90-96、123-136、141-151、160-179、190-196、209-215、222-228、235-242、257-263、270-280 および 209-247 （配列番号 235）; 5-29、31-38、50-57、62-75、83-110、115-132、168-195、197-206、216-242、249-258、262-269、333-340、342-350、363-368、376-392、400-406、410-421、423-430、436-442、448-454、460-466、471-476、491-496、511-516、531-536、551-556、571-576、585-591、599-605、27-70、219-293、441-504 および 512-584 （配列番号 236）; 4-12、14-34、47-75、83-104、107-115、133-140、148-185、187-196、207-212、224-256、258-265、281-287、289-296、298-308、325-333、345-355、365-371、382-395、424-435、441-457、465-472、483-491、493-505、528-534、536-546、552-558、575-584、589-600、616-623 および 576-591 （配列番号 237）; 4-76、 78-89、 91-126、 142-148、 151-191、 195-208、 211-223、 226-240、 256-277、 279-285、 290-314、 317-323、 358-377、 381-387、 391-396、 398-411、 415-434、 436-446、 454-484、 494-512、 516-523、 538-552、 559-566、 571-577、 579-596、 599-615、 620-627、 635-644、 694-707、 720-734、 737-759、 761-771 および 313-329 （配列番号 238）; 7-38、44-49、79-89、99-108、117-123、125-132、137-146、178-187、207-237、245-255、322-337、365-387、398-408、445-462、603-608、623-628、644-650、657-671、673-679 および 111-566 （配列番号 239）; 6-20、22-35、39-45、58-64、77-117、137-144、158-163、205-210、218-224、229-236、239-251、263-277、299-307、323-334、353-384、388-396、399-438、443-448、458-463、467-478、481-495、503-509、511-526、559-576、595-600、612-645、711-721、723-738、744-758、778-807 および 686-720 （配列番号 240）; 10-33、35-41、72-84、129-138、158-163、203-226、243-252、258-264、279-302、322-329、381-386、401-406、414-435 および 184-385 （配列番号 241）; 4-9、19-24、41-47、75-85、105-110、113-146 および 45-62 （配列番号 242）; 4-25、52-67、117-124、131-146、173-180、182-191、195-206、215-221、229-236、245-252、258-279、286-291、293-302、314-320、327-336、341-353、355-361、383-389 および 1-285 （配列番号 243）; 14-32、38-50、73-84、93-105、109-114 および 40-70 （配列番号 244）; 5-26 および 22-34 （配列番号 245）; 23-28 および 13-39 （配列番号 246）; 8-14 および 21-34 （配列番号 247）; 4-13、20-29、44-50、59-74 および 41-69 （配列番号 248）; 4-9、 19-42、 48-59、 71-83 および 57-91 （配列番号 249）; 4-14 および 10-28 （配列番号 250）; 22-28、32-42、63-71、81-111、149-156、158-167、172-180、182-203、219-229 および 27-49 （配列番号 251）; 17-27 および 23-32 （配列番号 252）; 18-24 および 28-38 （配列番号 253）; 9-15 および 13-27 （配列番号 254）; 13-22 および 18-29 （配列番号 255）; 17-26 および 2-11 （配列番号 256）; 4-33 および 16-32 （配列番号 257）; 4-10、37-43、54-84、92-127 および 15-62 （配列番号 258）; 4-14、20-32、35-60、69-75、79-99、101-109、116-140 および 124-136 （配列番号 259）; 2-13 （配列番号 260）; 4-13、28-42 および 42-57 （配列番号 261）; 4-14、27-44 および 14-35 （配列番号 262）; 4-12 および 1-27 （配列番号 263）; 4-18、39-45、47-74 および 35-66 （配列番号 264）; 8-20、43-77 および 17-36 （配列番号 265）; 4-30、35-45、51-57 および 35-49 （配列番号 266）; 4-24、49-57 および 15-34 （配列番号 267）; 4-22 および 8-27 （配列番号 268）; 13-25、32-59、66-80 および 21-55 （配列番号 269）; 4-10、24-33、35-42、54-65、72-82、98-108 および 15-30 （配列番号 270）; 8-19 および 17-47 （配列番号 271）; 12-18、40-46 および 31-52 （配列番号 272）; 4-20、35-78、83-102、109-122 および 74-86 （配列番号 273）; 7-17、21-41、46-63 および 2-20 （配列番号 274）; 30-37 および 2-33 （配列番号 275）; 4-13、17-25 および 1-15 （配列番号 276）; 17-31、44-51 および 20-51 （配列番号 277）; 20-30 および 5-23 （配列番号 278）; 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27-44 （配列番号 283）; 67-84 （配列番号 284）; 10-33 および 26-50 （配列番号 285）; 7-25 および 19-37 （配列番号 286）; 17-37 （配列番号 287）; 3-20 および 13-30 （配列番号 288）; 62-80 および 75-93 （配列番号 145）; 92-108 （配列番号 147）; 332-349、177-200 および 1755-1777 （配列番号 148）; 109-133、149-174、260-285 および 460-485 （配列番号 149）; 26-47 および 42-64 （配列番号 150）; 22-41、35-54、115-130、306-325、401-420 および 454-478 （配列番号 151）; 22-45 （配列番号 155）; 156-174、924-940、1485-1496、1447-1462 および 1483-1498 （配列番号 160）; 457-475 （配列番号 161）; 302-325 （配列番号 163）; 288-305 （配列番号 164）; 244-266 および 260-282 （配列番号 165）; 204-225 および 220-241 （配列番号 166）; 324-345、340-361、356-377、372-393 および 388-408 （配列番号 167）; 39-64 （配列番号 168）; 54-76 および 70-92 （配列番号 169）; 1227-1247、1539-1559、1554-1574、1569-1589、1584-1604、1242-1262、1272-1292、1287-1308、1456-1477、1472-1494、1488-1510 および 1505-1526 （配列番号 170）; 351-368 （配列番号 172）; 179-200、195-216、211-232、227-248 および 243-263 （配列番号 173）; 13-37 （配列番号 174）; 208-224 （配列番号 175）; 42-64、59-81、304-328、323-348、465-489、968-992、1399-1418、1412-1431 および 2092-2111 （配列番号 177）; 1528-1547 および 1541-1560 （配列番号 178）; 184-200、367-388、382-403、409-429、425-444 および 438-457 （配列番号 179）; 27-50 および 45-67 （配列番号 180）; 114-131 および 405-419 （配列番号 183）; 113-134、129-150、145-166、161-182 および 177-198 （配列番号 184）; 495-515 （配列番号 186）; 346-358 （配列番号 187）; 208-224 （配列番号 190）; 178-194、202-223、217- 238、288-308 および 1355-1372 （配列番号 192）; 57-78 （配列番号 194）; 347-369、364-386、381-403、398-420、415-437 および 432-452 （配列番号 197）; 347-372 （配列番号 198）; 147-163 （配列番号 199）; 263-288 （配列番号 200）; 361-377 （配列番号 202）; 82-104、99-121、116-138、133-155 および 150-171 （配列番号 204）; 110-130 および 125-145 （配列番号 205）; 613-631、626-644 および 196-213 （配列番号 206）; 78-100、95-117、112-134 および 129-151 （配列番号 208）; 158-180、175-197、192-214、209-231 および 226-248 （配列番号 209）; 30-50、45-65 および 60-79 （配列番号 210）; 431-455 および 450-474 （配列番号 213）; 579-601、596-618、613-635 および 630-653 （配列番号 214）; 920-927、98-119、114-135、130-151、146-167 および 162-182 （配列番号 217）; 36-59 （配列番号 219）; 194-216 および 381-404 （配列番号 220）; 236-251 および 255-279 （配列番号 221）; 80-100 および 141-164 （配列番号 222）; 128-154 （配列番号 223）; 82-100、95-116 および 111-134 （配列番号 224）; 55-76、71-92 および 87-110 （配列番号 227）; 91-106 （配列番号 229）; 74-96 （配列番号 230）; 140-157 （配列番号 231）; 4-13 （配列番号 233）; 41-65 および 499-523 （配列番号 236）; 122-146、191-215、288-313、445-469 および 511-535 （配列番号 239）; 347-368 （配列番号 241）; 46-61 （配列番号 242）; 15-37、32-57、101-121、115-135、138-158、152-172、220-242 および 236-258 （配列番号 243）、および該配列の少なくとも 6、好ましくは8より長い、特に10より長いアミノ酸であって好ましくは70以下、50、40、20、15、11 アミノ酸を含む断片である。これらすべての断片は個々にそれぞれが独立に、本発明の好ましい選択された態様を形成する。
特定の抗原のすべての直鎖状の過免疫血清反応性断片は少なくとも10アミノ酸の長さの1 アミノ酸がオーバーラップするペプチドのセットによってタンパク質抗原の全体の配列を分析することによって同定できる。その後、非直鎖状エピトープは、発現した全長タンパク質またはそのドメインポリペプチドを用いて過免疫血清によってタンパク質抗原を分析することによって同定できる。タンパク質の異なるドメインはネイティブなタンパク質とは独立な3D構造を形成するのに十分であるとすると、それぞれ組換えまたは合成により作ったドメインポリペプチドの過免疫血清による分析により、マルチドメインタンパク質の個々のドメイン内の高次構造エピトープの同定が可能となるであろう。ドメインが直鎖状および高次構造エピトープを有する抗原については、直鎖状エピトープに対応するペプチドによる競合実験を用いて、高次構造エピトープの存在を確認することが出来る。
本発明はまた、とりわけ、上記断片をコードする核酸分子、該断片をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および断片をコードする核酸分子を増幅するためのPCR プライマー等の核酸分子にも関することが理解されよう。この点に関して、好ましい核酸分子は上記の好ましい断片に対応するものである。
本発明はまた、本発明の１以上の核酸分子を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による過免疫血清反応性抗原およびその断片の産生にも関する。
非常に様々な発現ベクターを用いて本発明による過免疫血清反応性抗原またはその断片を発現させることが出来る。一般に、宿主においてポリペプチドを発現するために核酸を維持、増殖または発現させるのに好適ないずれのベクターを発現に用いてもよい。本発明のこの態様によると、ベクターは例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖 RNAまたはDNA ウイルスベクターであってよい。ここに開示の開始プラスミドは市販されているか、公共のものか、あるいは、周知の公表された手順を常套に適用することによって入手可能なプラスミドから構築できるものである。好ましいベクターは、特定の態様では、本発明の核酸分子および過免疫血清反応性抗原またはその断片の発現のためのものである。宿主細胞中の核酸コンストラクトは組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生するための常套方法によって用いることが出来る。あるいは、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片は常套のペプチド合成器によって合成的に生産することも出来る。成熟タンパク質は適当なプロモーターの制御下で、哺乳類細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現させうる。かかるタンパク質を産生するのに本発明のDNA コンストラクト由来のRNAを用いて無細胞翻訳系を用いてもよい。
宿主細胞を遺伝子操作して核酸分子を組込み、本発明の核酸分子を発現させることが出来る。適当な宿主の代表例には、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセスおよび枯草菌細胞; 真菌細胞、例えば酵母細胞およびコウジカビ細胞; 昆虫細胞、例えば ショウジョウバエ S2 および スポドプテラ Sf9 細胞; 動物細胞、例えば CHO、COS、Hela、C127、3T3、BHK、293および Bowes メラノーマ細胞;および植物細胞が含まれる。
本発明はまた、肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原およびその断片の生産方法も提供し、該方法は本発明によって提供される核酸分子によってコードされる過免疫血清反応性抗原またはその断片を宿主細胞から発現させることを含む。本発明はさらに肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片を発現する細胞の生産方法も提供し、該方法は、好適な宿主細胞に本発明によるベクターを形質転換または形質移入して、形質転換または形質移入された細胞にベクターに含まれる核酸によってコードされるポリペプチドを発現させることを含む。
ポリペプチドは修飾形態、例えば融合タンパク質として発現させてもよく、分泌シグナルだけでなくさらなる異種機能性領域を含んでいてもよい。したがって例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドのN-またはC-末端に付加して、精製または続く操作および保存の際の宿主細胞における安定性および持続性を向上させてもよい。また、精製を容易にするために領域をポリペプチドに付加してもよい。かかる領域はポリペプチドの最終調製の前に除くとよい。分泌または排出を起こすため、安定性を向上させるため、または精製を促進するための、ペプチド部分のポリペプチドへの付加はよく知られており、当該技術分野で常套の技術である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドの可溶化または精製に有用な免疫グロブリンからの異種領域を含む。例えば、EP-A-O 464 533 (カナダ対応2045869)は、免疫グロブリン分子の定常部の様々な部分とともにその他のタンパク質またはその部分を含む融合タンパク質を開示している。創薬において、例えば、タンパク質を抗体 Fc 部分と融合させて、アンタゴニストの同定のためのハイスループットスクリーニングアッセイが行われている。例えば｛Bennett、D. et al.、1995｝および｛Johanson、K. et al.、1995｝を参照されたい。
肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片は組換え細胞培養物から周知の方法によって回収および精製できる。かかる方法は例えば、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーである。
本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片は化学合成および生物工学手段によって作ることが出来る。後者は、本発明による核酸を含むベクターによる宿主細胞の形質移入または形質転換、および、形質移入または形質転換された宿主細胞の当業者に知られた条件下での培養を含む。産生方法は作るべきポリペプチドの精製または単離のために精製工程を含んでいてもよい。好ましい態様において、ベクターは本発明によるベクターである。
本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片は生物またはそれ由来のポリペプチドを含むサンプルにおける１以上の生物の検出にも用いることが出来る。好ましくはかかる検出は診断のためであり、より好ましくは疾患の診断のためであり、もっとも好ましくは、グラム陽性細菌、特に連鎖球菌、ブドウ球菌およびラクトコッカスを含む群から選択される細菌の存在または量に関連または連関する疾患の診断のためである。より好ましくは、微生物はストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、化膿性連鎖球菌 （Streptococcus pyogenes）およびミュータンス菌（ Streptococcus mutans）を含む群から選択され、特に微生物は化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）である。
本発明はまた、細胞および組織における本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片のレベルの検出のための定量および診断アッセイといった診断アッセイにも関し、レベルが正常であるか異常であるかの判定も含む。したがって、例えば、正常対照組織サンプルと比較したポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明による診断アッセイを用いて感染の存在を検出することが出来、例えば、感染生物を同定することが出来る。宿主に由来するサンプルにおけるポリペプチドのレベルの測定のために用いることが出来るアッセイ技術は当業者に周知である。かかるアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISA アッセイが含まれる。なかでも、ELISAはしばしば好ましい。ELISA アッセイはまず、ポリペプチドに対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さらに、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が一般に調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば、放射性、蛍光性またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素などの酵素試薬、に結合している。
本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片はアレイの目的で、またはアレイと組み合わせて用いてもよい。より具体的には、少なくとも１つの本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片を支持体に固定化すればよい。該支持体は典型的には多様な過免疫血清反応性抗原およびその断片を含み、その多様性は１または数個の本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片および/または異なる過免疫血清反応性抗原およびその断片の使用によって作ることが出来る。かかるアレイおよび一般のアレイの特徴は、該支持体またはその表面上の特有の、またはあらかじめ決められた領域または位置において、特有のポリペプチドが固定化されているということである。このためアレイの特有の位置または領域のあらゆる活性を特定のポリペプチドに関連づけることが出来る。支持体に固定化された異なる過免疫血清反応性抗原およびその断片の数は10〜数千種類の範囲の過免疫血清反応性抗原およびその断片でありうる。１cm２当たりの過免疫血清反応性抗原およびその断片の密度は、好ましい態様において、１cm２当たり10 ペプチド/ポリペプチド〜１cm２当たり少なくとも 400種類のペプチド/ポリペプチドであり、より具体的には１cm２当たり少なくとも 1000種類の過免疫血清反応性抗原およびその断片である。
かかるアレイの製造は当業者に知られており、例えば、米国特許 5744309号に記載されている。アレイは好ましくは少なくとも第一の表面を有する平面状、多孔性または非孔性固体支持体を含む。本明細書に開示する過免疫血清反応性抗原およびその断片を該表面に固定化する。好ましい支持体材料は、特に、ガラスまたはセルロースである。アレイを本明細書に記載する診断用途のいずれに用いる場合も本発明に含まれる。本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片だけでなく、本発明による核酸分子も上記のアレイの作成に用いることが出来る。本明細書に記載する抗体、好ましくはモノクローナル抗体でできたアレイにもこれは当てはまる。
さらなる態様において、本発明は、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片、その誘導体または断片に対する抗体にも関する。本発明には例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、およびFab断片、またはFab 発現ライブラリーの生成物も含まれる。抗体がキメラである場合、即ち、その異なる部分が異なる種由来である場合、または少なくともそれぞれの配列が異なる種から得られたものである場合も本発明に含まれる。
本発明の配列に対応する過免疫血清反応性抗原およびその断片に対する抗体は、過免疫血清反応性抗原およびその断片の動物への直接の注射、または過免疫血清反応性抗原およびその断片の動物、好ましくは非-ヒトへの投与により得ることが出来る。そうして得られた抗体は過免疫血清反応性抗原およびその断片自体に結合する。このようにして、過免疫血清反応性抗原およびその断片の、断片のみをコードする配列であっても、全体のネイティブな過免疫血清反応性抗原およびその断片に結合する抗体の作成に用いることが出来る。かかる抗体はかかる過免疫血清反応性抗原およびその断片を発現する組織からの過免疫血清反応性抗原およびその断片の単離に用いることが出来る。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養によって作られる抗体を提供する当該技術分野で知られているあらゆる技術を用いることが出来る (元々｛Kohler、G. et al.、1975｝に記載されている）。
一本鎖抗体の産生について記載されている技術(米国特許第4946778号)は本発明による免疫原性過免疫血清反応性抗原およびその断片に対する一本鎖抗体の作成に適用することが出来る。また、トランスジェニックマウス、またはその他の哺乳類などのその他の生物を用いて、本発明による免疫原性過免疫血清反応性抗原およびその断片に対するヒト化抗体を発現させることができる。
あるいは、ファージディスプレー技術またはリボゾームディスプレー（ribosomal display）を用いて、それぞれの標的抗原を有するようにスクリーニングされたヒトからのリンパ球のPCR 増幅されたv-遺伝子のレパートリー、または未処置ライブラリーのいずれかから、過免疫血清反応性抗原およびその断片に対して結合活性を有する抗体遺伝子を選択することが出来る｛McCafferty、J. et al.、1990｝; ｛Marks、J. et al.、1992｝。かかる抗体の親和性は、鎖シャフリング（chain shuffling）によっても増強することが出来る｛Clackson、T. et al.、1991｝。
２つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは異なるエピトープに対するものでもよく、「二重特異的」抗体と称される。
上記抗体を用いて過免疫血清反応性抗原およびその断片を発現するクローンの単離または同定、あるいは本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片の精製を行ってもよく、これは、単離のための固体支持体への抗体の結合および/または親和性クロマトグラフィーによる精製による。
したがって、とりわけ、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片に対する抗体は感染、特に細菌感染症、特に肺炎連鎖球菌による感染症の阻害および/または治療に用いることが出来る。
過免疫血清反応性抗原およびその断片は、抗原的に、エピトープ的に（epitopically）または免疫学的に同等な誘導体を含み、これらは本発明の特定の態様を形成する。本明細書において用いる「抗原的に同等な誘導体」の語は、本発明によるタンパク質または過免疫血清反応性抗原およびその断片に対して生じた場合、病原菌と哺乳類宿主との相互作用に干渉する特定の抗体によって特異的に認識される過免疫血清反応性抗原およびその断片またはその同等物を含む。本明細書において用いる「免疫学的に同等な誘導体」の語は、脊椎動物において抗体をつくるための好適な製剤中で用いられた場合、抗体が病原菌と哺乳類宿主との相互作用を干渉するよう作用するペプチドまたはその同等物を含む。
過免疫血清反応性抗原およびその断片、例えば、抗原的または免疫学的に同等なその誘導体または融合タンパク質はマウスまたはその他の動物、例えばラットまたはニワトリの免疫化のための抗原として用いることが出来る。融合タンパク質は過免疫血清反応性抗原およびその断片に安定性を付与しうる。抗原は、例えば、免疫原性キャリアタンパク質、例えばウシ血清アルブミン (BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン (KLH)と、接合によって、結合させることが出来る。あるいは、多コピーのタンパク質または過免疫血清反応性抗原およびその断片、あるいは抗原的または免疫学的に同等な過免疫血清反応性抗原およびその断片を含む抗原性ペプチドは、キャリアの使用が不要となるよう免疫原性を向上させるよう十分に抗原性であり得る。
好ましくは、抗体またはその誘導体は個体中で免疫原性が低くなるよう改変する。例えば、個体がヒトの場合、抗体はもっとも好ましくは「ヒト化」し、ここで例えば｛Jones、P. et al.、1986｝または｛Tempest、P. et al.、1991｝に記載のように、ハイブリドーマ-由来抗体の相補性決定領域をヒトモノクローナル抗体に移植する。
遺伝子による免疫法における本発明のポリヌクレオチドの使用には、好ましくは好適な送達方法を用いる。例えば、筋肉へのプラスミド DNAの直接注射、特定のタンパク質キャリアと複合化したDNAの送達、DNA とリン酸カルシウムとの共沈、様々な形態のリポソーム中へのDNAのカプセル封入、微粒子銃 ｛Tang、D. et al.、1992｝、｛Eisenbraun、M. et al.、1993｝およびクローン化されたレトロウイルスベクターを用いたインビボ感染等である｛Seeger、C. et al.、1984｝。
さらなる態様において、本発明は、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片のいずれかに結合するペプチド、およびかかるペプチドの製造方法に関し、ここでその方法は、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片の使用および当業者に知られた基本的工程の使用を特徴とする。
かかるペプチドは当該技術分野の最新の方法、例えばファージディスプレーまたはリボゾームディスプレーを用いて作ることが出来る。ファージディスプレーの場合、基本的にはファージの形態においてペプチドのライブラリーを作り、この種のライブラリーを標的分子、ここでは本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片と接触させる。標的分子に結合するペプチドは次いで、好ましくは標的分子との複合体として、それぞれの反応から取り出す。結合特性は、少なくともある程度は、具体的に実施した実験設定、例えば、塩濃度等に依存することが当業者に知られている。高い親和性即ち強い力によって標的分子に結合するペプチドを、ライブラリーの非結合メンバーから分離した後、そして所望により標的分子とペプチドの複合体から標的分子を除いた後、それぞれのペプチドを特徴づけるとよい。特徴付けに先立って、所望により増幅工程をおこなってもよく、例えば、ペプチドをコードするファージを増殖させる。特徴付けは好ましくは標的結合ペプチドの配列決定を含む。基本的には、ペプチドは長さによって制限されないが、しかし、好ましくは約8〜20 アミノ酸の長さを有するペプチドが好ましくはそれぞれの方法において得られる。ライブラリーのサイズは約102〜1018、好ましくは 108 〜 1015種類のペプチドであるが、それに限定されない。
特定の形態の標的結合過免疫血清反応性抗原およびその断片はいわゆる「アンチカリン」であり、独特許出願DE 197 42 706に記載されている。
さらなる態様において、本発明は、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片のいずれかと相互作用する機能的核酸、およびかかる機能的核酸の製造方法に関し、ここで該方法は、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片および当業者に知られた基本的工程の使用を特徴とする。機能的核酸は好ましくはアプタマーおよびスピーゲルマーである。
アプタマーは、一本鎖または二本鎖であって、標的分子と特異的に相互作用するD-核酸である。アプタマーの製造または選択は、例えば欧州特許 EP 0 533 838に記載されている。基本的には以下の工程を実施する。第一に、核酸の混合物、即ち潜在的アプタマーを提供し、ここで各核酸は典型的には数個、好ましくは少なくとも８の続くランダムなヌクレオチドのセグメントを含む。この混合物をついで標的分子と接触させ、これによって例えば候補混合物と比較して標的に対する高い親和性または強い力に基づいて核酸が標的分子に結合する。結合核酸を次いで混合物の残りから分離する。所望により、こうして得られた核酸を、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する。これらの工程を数回繰り返して最終的に標的に特異的に結合する核酸の比が上昇した混合物が得られ、これから最終的な結合核酸が所望により選択される。かかる特異的に結合する核酸は、アプタマーと称される。アプタマーの作成または同定方法のいずれの段階においても、個々の核酸の混合物のサンプルを採取して、標準的技術を用いて配列を調べることが出来ることが明らかである。例えば、アプタマーの作成の当業者に知られた特定の化学基を導入することによってアプタマーが安定化されていてもよく、これも本発明に含まれる。かかる修飾は例えばヌクレオチドの糖部分の2'-位へのアミノ基の導入である。アプタマーは現在治療薬として用いられている。しかし標的バリデーションのため、および/または、医薬、好ましくは低分子に基づく医薬の開発のためのリード物質として、選択または作成したアプタマーを用いることができるということも本発明に含まれる。これは実際は競合アッセイにより行われ、ここで、標的分子とアプタマーとの特異的相互作用が候補薬剤によって阻害され、標的とアプタマーの複合体からのアプタマーの置換により、それぞれの薬剤候補が標的とアプタマーの間の相互作用の特異的阻害を可能にすると考えられ、その相互作用が特異的である場合、該候補薬剤は、少なくとも理論的には、標的の阻害に好適であり、したがってかかる標的を含むそれぞれの系における生物学的有効性または活性を減少させる。このように得られた低分子を次いでさらなる誘導体化および修飾に供し、その物理的、化学的、生物学的および/または医学的特徴、例えば、毒性、特異性、生分解性およびバイオアベイラビリティを最適化するとよい。
スピーゲルマーおよびその作成または製造は同様の原理に基づく。スピーゲルマーの製造は国際特許出願 WO 98/08856に記載されている。スピーゲルマーはL-核酸であり、アプタマーがD-ヌクレオチドから構成されるのに対してL-ヌクレオチドから構成されることを意味する。スピーゲルマーは生物系において非常に高い安定性を有することを特徴とし、アプタマーと同様、それが向けられた標的分子と特異的に相互作用する。スピーゲルマーの作成工程において、D-核酸の不均一な集団を作り、この集団を標的分子の光学異性体、この場合例えば、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片の天然の L-エナンチオマーのD-エナンチオマーと接触させる。次いで、標的分子の光学異性体と相互作用しないD-核酸を除く。しかし、標的分子の光学異性体と相互作用するD-核酸を分離し、所望により同定および/または配列決定し、次いで対応するL-核酸をD-核酸から得られた核酸配列情報に基づいて合成する。標的分子の光学異性体と相互作用する上記のD-核酸と配列の点では同じであるこれらL-核酸はその光学異性体ではなく、天然の標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの作成方法と同様に、様々な工程を数回繰り返して、標的分子の光学異性体に特異的に相互作用する核酸を濃縮することが可能である。
さらなる態様において、本発明は本発明による核酸分子のいずれかと相互作用する機能的核酸およびかかる機能的核酸の作成方法に関し、ここで該方法は本発明による核酸分子とそのぞれぞれの配列および当業者に知られた基本的工程の使用を特徴とする。機能的核酸は好ましくはリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAである。
リボザイムは触媒的に活性の核酸であり、好ましくはRNAからなり、基本的には２つの部分を含む。第一の部分は触媒活性を示し、第二の部分は標的核酸、この場合本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片をコードする核酸との特異的相互作用を担当する。典型的には、２つのハイブリダイズする鎖上の塩基の実質的に相補的なストレッチのハイブリダイゼーションとワトソン・クリック塩基対形成による、標的核酸とリボザイムの第二の部分との相互作用により、触媒活性部分が活性となる。即ち、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性の場合、それが分子内または分子間的に標的核酸を触媒する。次いで、さらに標的核酸の分解が起こり、最終的には標的核酸ならびに標的核酸に由来するタンパク質が分解される。リボザイム、その使用および設計原理は当業者に知られており、例えば、｛Doherty、E. et al.、2001｝および｛Lewin、A. et al.、2001｝に記載されている。
医薬の製造のため、および診断薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性および設計はそれぞれ同様の作用機序に基づく。基本的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは塩基相補性に基づき、標的RNA、好ましくは mRNAにハイブリダイズし、それによって RNase Hを活性化する。RNase Hはホスホジエステルおよびホスホロチオエート連結DNAの両方によって活性化される。ホスホジエステル-連結DNAはしかし、細胞内ヌクレアーゼによって容易に分解されるがホスホロチオエート連結DNA はそうではない。これらの耐性の、非-天然の DNA 誘導体はRNAとのハイブリダイゼーションによってRNase Hを阻害しない。言い換えると、アンチセンスポリヌクレオチドはDNA RNA ハイブリッド複合体としてのみ有効である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、米国特許5,849,902および5,989,912に記載されている。言い換えると、この場合は本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片に対する核酸分子である標的分子の核酸配列に基づいて、それぞれの核酸配列が論理的に推定された標的タンパク質から、あるいは、核酸配列、特にmRNA自体を知ることにより、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが塩基相補性の原理に基づいて設計できる。
短いストレッチのホスホロチオエート DNA (3〜9塩基)を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。細菌RNase H の活性化には最低3 DNA 塩基が必要であり、哺乳類RNase Hの活性化には最低5塩基が必要である。これらキメラオリゴヌクレオチドにおいて、RNase Hに対する基質を形成しない修飾ヌクレオチドからなるハイブリダイズする「腕」によって挟まれているRNase Hに対する基質を形成する中心領域がある。キメラオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする腕は例えば2’-O-メチルまたは2’-フルオロによって修飾されていてもよい。別のアプローチでは、メチルホスホネートまたはホスホラミダート結合を該腕において用いた。本発明の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる態様はP-メトキシオリゴヌクレオチド、部分P-メトキシオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはP-メトキシオリゴヌクレオチドである。
本発明に特に関連する用途はより具体的には上記２つの米国特許に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらオリゴヌクレオチドは天然の 5’→3’-連結ヌクレオチドを含まない。そうではなく、オリゴヌクレオチドは２タイプのヌクレオチドを有する: RNase H を活性化する2’-デオキシホスホロチオエート、および活性化しない2’-修飾ヌクレオチドである。 2’-修飾ヌクレオチド間の連結は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたは P-エトキシホスホジエステルでありうる。RNase Hの活性化は近接するRNase H-活性化領域によって達成され、これは細菌RNase Hの活性化には3〜 5の2’-デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含み、真核生物、特に哺乳類RNase Hの活性化のためには5〜10の2’- デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含む。分解からの保護は5’ および3’ 末端塩基を高度にヌクレアーゼに耐性にし、そして所望により3’末端保護基をつけることによって達成する。
より具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは5’末端および3’末端; そして位置11 〜 59に 2’-修飾ホスホジエステルヌクレオチドおよび 2’-修飾 P-アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドからなる群から独立に選択される5’→3’-連結ヌクレオチド; を含み、ここで5’末端ヌクレオシドは3〜10の近接するホスホロチオエート連結デオキシリボヌクレオチドのRNase H-活性化領域に連結し、該オリゴヌクレオチドの3’-末端は以下からなる群から選択される：逆位（inverted）デオキシリボヌクレオチド、近接するストレッチの1〜3のホスホロチオエート 2’-修飾リボヌクレオチド、ビオチン基およびP-アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチド。
5’ 末端ヌクレオシドが RNase H-活性化領域に連結しておらず、3’ 末端ヌクレオシドが上記のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることも出来る。また、オリゴヌクレオチドの3’ 末端ではなく5’ 末端が特定の基から選択されるものでもよい。
本発明による核酸および過免疫血清反応性抗原およびその断片は、医薬組成物、特にワクチンの製造に用いることが出来る。好ましくはかかる医薬組成物、好ましくはワクチンは肺炎連鎖球菌によって引き起こされる、または関連する疾患の予防または治療用である。さらなる態様において本発明は、個体、特に哺乳類において免疫応答を誘導する方法に関し、該方法は、感染、特に連鎖球菌感染、そしてもっとも具体的には肺炎連鎖球菌感染症から個体を保護するための抗体の産生に適当な本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片、またはその断片または変異形を個体に接種することを含む。
本発明のさらに別の態様は、個体における免疫応答の誘導方法に関し、該方法は、遺伝子療法その他を介して、過免疫血清反応性抗原およびその断片、またはその断片または変異形をインビボで発現する過免疫血清反応性抗原およびその断片、またはその断片または変異形を機能的にコードする核酸を、抗体を産生する免疫応答または、サイトカイン産生T 細胞または細胞障害性Ｔ細胞のいずれかの細胞媒介T 細胞応答を誘導するために送達することを含み、疾患から該個体を保護するためのものである。ここで疾患は既に個体に確立しているものでもそうでなくてもよい。遺伝子の投与の１つの方法は、粒子の被覆その他として所望の細胞へとそれを加速させることによる。
本発明のさらなる態様は免疫学的組成物に関し、そのなかで免疫応答を誘導することが出来る宿主に導入すると、かかる宿主に免疫応答を起こすものであり、ここで該組成物は本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片の抗原をコードおよび発現する組換え DNAを含む。免疫応答は治療的または予防的に用いてもよく、抗体免疫または細胞性免疫、例えばCTL またはCD4+ T 細胞によるもののいずれの形態でもよい。
本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片またはその断片はそれ自体では抗体を産生できないが、第一のタンパク質を安定化させることが出来、免疫原性および保護特性を有する融合タンパク質を作るような共-タンパク質と融合させてもよい。この融合組換えタンパク質は好ましくはさらに、抗原性共-タンパク質、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)または ベータ・ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、その産生および精製を容易にする比較的大きい共-タンパク質を含んでもよい。さらに共-タンパク質は免疫系の全身刺激を提供する意味でアジュバントとしても作用しうる。共-タンパク質は第一のタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端のいずれに結合させてもよい。
また、本発明によって、肺炎連鎖球菌による感染の動物モデルにおける遺伝子による免疫法の実験における上記核酸分子またはその特定の断片の使用方法も提供される。かかる断片は予防的または治療的免疫応答を誘発することができるタンパク質エピトープの同定に特に有用である。このアプローチにより、哺乳類、特にヒトにおける肺炎連鎖球菌感染症の予防薬または治療薬の開発のために、感染に抵抗し、排除することが出来る動物の要求される器官から、特に有用なモノクローナル抗体の調製が可能となる。
過免疫血清反応性抗原およびその断片は、細菌の侵入から保護する、例えば、細菌の損傷組織への付着を阻害する特異的抗体を産生するための、宿主のワクチン接種ための抗原として利用できる。組織損傷の例には、例えば、ウイルス感染（特に呼吸器、例えばインフルエンザ）、機械的、化学的または熱的損傷による、または留置装置の埋め込みによる皮膚または結合組織および粘膜組織の創傷、あるいは粘膜の損傷、例えば口腔、乳腺、尿道または膣の損傷が含まれる。
本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質と好適なキャリアを含むワクチン製剤も含む。タンパク質は胃で分解されるので、それは好ましくは非経口的に投与し、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内または経皮投与が挙げられる。非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および、製剤を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含んでいてもよい、水性または非水性無菌注射溶液; 懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の例えば、密封アンプルおよびバイアルなどの容器において提供されてもよいし、使用の直前に無菌の液体のキャリアを添加するだけでよい凍結乾燥状態で保存してもよい。ワクチン製剤は製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系を含んでいてもよく、例えば水中油系および当該技術分野で知られているその他の系が挙げられる。用量はワクチンの特定の活性に依存し、常套の実験によって容易に決定できる。
本発明は別の態様によると、肺炎連鎖球菌のための本発明において提供される過免疫血清反応性抗原またはその断片を含む医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は肺炎連鎖球菌に対する１以上の好ましくは少なくとも２以上の過免疫血清反応性抗原またはその断片を含んでいてもよい。所望により、かかる肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片はその他の病原菌に対する抗原を組み合わせ医薬組成物中にて混合したものでもよい。好ましくは、該医薬組成物は、肺炎連鎖球菌および/またはその抗原がワクチンに含まれているその他の病原菌によって引き起こされる感染症の予防または治療用のワクチンである。
さらなる態様によると、本発明は肺炎連鎖球菌について同定された過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする核酸分子を含む医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は１以上の肺炎連鎖球菌に対する過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする核酸分子を含んでいてよい。所望により、かかる過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする肺炎連鎖球菌核酸分子はその他の病原菌に対する抗原をコードする核酸分子を組み合わせ医薬組成物中にて混合したものでもよい。好ましくは、該医薬組成物は、肺炎連鎖球菌および/またはその抗原がワクチンに含まれているその他の病原菌によって引き起こされる感染症の予防または治療用のワクチンである。
医薬組成物はいずれの好適な補助物質を含んでいてもよく、例えば、緩衝物質、安定剤またはさらなる活性成分、特に医薬組成物および/またはワクチン産生に関連して知られている成分が挙げられる。
本発明による過免疫血清反応性抗原、その断片またはそれをコードする核酸分子のための好ましいキャリアまたは賦形剤は、所与の過免疫血清反応性抗原、その断片またはそれをコードする核酸分子に対する免疫応答をさらに刺激する免疫賦活性化合物である。好ましくは本発明による医薬調製物における免疫賦活性化合物は以下からなる群から選択される：ポリカチオン性物質、特にポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性核酸分子、好ましくは免疫賦活性デオキシヌクレオチド、ミョウバン、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、向神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン、またはそれらの組み合わせ。
本発明による過免疫血清反応性抗原、その断片および/またはそれをコードする核酸分子以外に、生物学的または医薬上活性なその他の化合物を含む医薬組成物、特にワクチンも本発明に含まれる。好ましくは、ワクチン組成物は少なくとも１つのポリカチオン性ペプチドを含む。本発明によって用いられるポリカチオン性化合物はWO 97/30721 に記載の特徴的な効果を示すいずれのポリカチオン性化合物でもよい。好ましいポリカチオン性化合物は塩基性ポリッペチド（polyppetide）、有機性ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはそれらの混合物から選択される。かかるポリアミノ酸は少なくとも4アミノ酸残基の長さの鎖を有さなければならない(WO 97/30721)。特に好ましいのはポリリジン、ポリアルギニンなどの物質および、20 ％より多い、特に50 ％より多い塩基性アミノ酸を含み、8を超える、特に20を超えるアミノ酸残基のポリペプチドまたはその混合物である。その他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物はWO 97/30721 (例えば、ポリエチレンイミン)および WO 99/38528に記載されている。好ましくはかかるポリペプチドは20〜500 アミノ酸残基、特に30〜200残基を含む。
かかるポリカチオン性化合物は化学的または組換え的に作ってもよいし、天然源由来のものでもよい。
カチオン性 (ポリ)ペプチドは｛Ganz、T.、1999｝に概説されている性質を有し、抗菌性でもありうる。これら(ポリ)ペプチドは原核生物または動物または植物のいずれの由来であってもよく、化学的に合成しても組換えにより作ってもよい(WO 02/13857)。ペプチドはデフェンシンのクラスに属するものでもよい(WO 02/13857)。かかるペプチドの配列は例えば、以下のインターネットアドレスのAntimicrobial Sequence Databaseにおいてみられる:http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.html。
かかる宿主防御ペプチドまたは防御物質（defensives）もまた本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、最終産物として、好ましくはAPC(樹状細胞を含む)によって媒介される適応性免疫系の活性化(または下方制御)を可能とする化合物が、ポリカチオン性ポリマーとして用いられる。
本発明におけるポリカチオン性物質としての使用に特に好適なのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体 (国際特許出願 WO 02/13857、引用により本明細書に含める)、特に哺乳類カテリシジン由来の抗菌ペプチド、好ましくはヒト、ウシまたはマウス由来のものである。
天然源由来のポリカチオン性化合物には、HIV-REVまたは HIV-TAT (由来カチオン性ペプチド、アンテナペディアペプチド、キトサンまたはその他のキチンの誘導体)あるいはこれらペプチドまたはタンパク質由来の生化学的または組換え産生によるその他のペプチドが挙げられる。その他の好ましいポリカチオン性化合物はカテリン（cathelin）またはカテリンに関連または由来する物質である。例えば、マウスカテリンはアミノ酸配列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOHを有するペプチドである。関連または由来カテリン物質は少なくとも 15-20 アミノ酸残基を有するカテリン 配列の全部または一部を含む。誘導には20の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然のアミノ酸の置換または修飾が含まれる。さらに、さらなるカチオン性残基をかかるカテリン分子に導入してもよい。これらカテリン分子は抗原との混合に好ましい。これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを添加しなくても抗原のためのアジュバントとして有効であることが判明した。それゆえ、さらなる免疫賦活性物質とともに、またはそれをともなわずに、ワクチン製剤中に有効なアジュバントとしてかかるカテリン分子を用いることが出来る。
本発明により用いられる別の好ましいポリカチオン性物質は、3 〜 7の疎水性アミノ酸のリンカーによって分離されている少なくとも 2のKLK-モチーフを含む合成ペプチドである (国際特許出願 WO 02/32451、引用により本明細書に含める)。
本発明の医薬組成物はさらに免疫賦活性核酸を含んでいてもよい。免疫賦活性核酸は例えば、天然または合成のCpG含有核酸、または非脊椎動物由来の短いストレッチの核酸、または非メチル化シトシン-グアニンジ-ヌクレオチド(CpG)を特定の塩基中に含む短いオリゴヌクレオチド(ODN)の形態である(例えば、WO 96/02555に記載)。あるいは、例えばWO 01/93903に記載のイノシンおよびシチジンに基づく核酸、またはデオキシ-イノシンおよび/または デオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸(WO 01/93905 および PCT/EP 02/05448に記載、引用により本明細書に含める)が好ましくは本発明の免疫賦活性核酸として用いることが出来る。好ましくは、異なる免疫賦活性核酸の混合物を本発明によって用いる。
上記のいずれかのポリカチオン性化合物が上記のいずれかの免疫賦活性核酸と組み合わされたものも本発明に含まれる。好ましくは、かかる組み合わせはWO 01/93905、WO 02/32451、WO 01/54720、WO 01/93903、WO 02/13857およびPCT/EP 02/05448および豪特許出願A 1924/2001に記載のものであり、引用により本明細書に含める。
さらにまたはあるいは、かかるワクチン組成物は本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片、およびそれをコードする核酸分子の他に向神経活性化合物を含んでいてもよい。好ましくは、向神経活性化合物は例えばWO 01/24822に記載のヒト成長因子である。また好ましくは、向神経活性化合物は上記のいずれかのポリカチオン性化合物および/または免疫賦活性核酸と組み合わされる。
さらなる態様において、本発明は医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は例えば、本明細書に記載するワクチンである。また、医薬組成物は、以下の化合物またはその組み合わせのいずれかを含む医薬組成物である: 本発明による核酸分子、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片、本発明によるベクター、本発明による細胞、本発明による抗体、本発明による機能的核酸、本発明によるアンチカリンなどの結合性ペプチド、本明細書に記載するようにスクリーニングされたいずれかのアゴニストおよびアンタゴニスト。それらに関連してこれら化合物のいずれも、非無菌または無菌の１以上の細胞、組織または生物用キャリア、例えば、対象への投与に好適な医薬用キャリアと組み合わせて用いることが出来る。かかる組成物は例えば、培地添加剤（media additive）または治療上有効量の本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片および医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤を含む。かかるキャリアにはこれらに限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが含まれる。製剤は投与様式に適合したものでなければならない。
医薬組成物は有効な便宜な方法で投与すればよく、例えば、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、気管内または皮内経路によって投与すればよい。
治療または予防において、活性薬剤は、注射可能組成物、例えば好ましくは等張の無菌水性分散液として個体に投与すればよい。
あるいは、組成物は局所用に製剤してもよく、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、洗口、浸透性包帯剤および縫合およびエアロゾルの形態であって、適宜便宜な以下のような添加剤を含んでいてもよい：例えば、保存料、薬剤浸透を補助する溶媒、および軟膏およびクリームにおける緩和剤。かかる局所製剤は適合性の常套のキャリア、例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローション用のエタノールまたはオレイルアルコールを含んでいてもよい。かかるキャリアは製剤の約 1 重量％ 〜約 98重量％を構成するのがよい;より通常は製剤の約 80 重量％までを構成する。
上記治療に加えて、本発明の組成物は、創傷組織において曝されたマトリックスタンパク質への細菌の付着を妨げる創傷治療剤としても一般に使用でき、抗菌予防法のかわりに、またはそれと組み合わせて歯科治療において予防的に用いることも出来る。
ワクチン組成物は便宜に注射可能形態である。常套のアジュバントを用いて免疫応答を増強させることが出来る。ワクチン接種のための好適な単位用量は0.05-5 μg 抗原 / kg体重であり、かかる用量を好ましくは1-3 週間の間をあけて1-3回投与する。
示された用量範囲において、好適な個体への投与が妨げられるような有害な毒性作用は本発明の化合物によって観察されるべきではない。
さらなる態様において、本発明は本発明の上記組成物の１以上の成分を入れた１以上の容器を含む診断および医薬パックおよびキットに関する。成分は有用な量、用量、剤形または組み合わせで存在すればよい。かかる容器には、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関によって規定された形態の指示書をつけて、ヒト投与への製品の製造、使用または販売が政府によって許可されたことを示してもよい。
本発明に関して本明細書に開示する疾患に関連する使用、例えば、医薬組成物またはワクチンの使用は、特に連鎖球菌、より好ましくは、肺炎連鎖球菌によってもたらされるか、それに関連する疾患または疾患状態である。それに関して、肺炎連鎖球菌は本明細書に開示するものを含む複数の株を含むことに注意されたい。本発明によって予防および/または治療すべき細菌感染症によって引き起こされるか、それに関する疾患としては、ヒトにおける、細菌性咽頭炎、中耳炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、腹膜炎および敗血症が含まれる。
さらなる態様において本発明は、本発明による過免疫血清反応性抗原または核酸のいずれかを用いるスクリーニング方法に関する。スクリーニング方法自体は当業者に知られており、アゴニストまたはアンタゴニストがスクリーニングされるように設計すればよい。好ましくは、この場合、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片の相互作用パートナーへの結合を阻害または防止するアンタゴニストをスクリーニングする。かかる相互作用パートナーは天然の相互作用パートナーであっても非天然の相互作用パートナーであってもよい。
本発明はまた、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片または核酸分子の機能、例えば、その結合性分子との相互作用を増強する(アゴニスト)または阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。スクリーニング方法はハイスループットのものも含みうる。
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、本発明による核酸分子および核酸の相互作用パートナーはそれぞれ、合成反応混合物、細胞内区画、例えば、膜、細胞外皮または細胞壁または、その調製物であってよく、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片に結合する分子を発現する細胞から調製できる。調製物をアゴニストまたはアンタゴニストの候補分子の不在下または存在下で、標識した過免疫血清反応性抗原およびその断片とともにインキュベートする。候補分子の結合性分子に対する結合能力は、標識したリガンドの結合の減少によって反映される。意味無く結合する分子、即ち、過免疫血清反応性抗原およびその断片の機能性効果を誘導しないものはおそらく良好なアンタゴニストであろう。良好に結合し、過免疫血清反応性抗原およびその断片と同じまたは密接に関連する機能性効果を誘発する分子は良好なアゴニストである。
潜在的アゴニストおよびアンタゴニストの機能性効果は、例えば、候補分子と細胞または適当な細胞調製物との相互作用を追跡するレポーターシステムの活性の測定、およびその効果を本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片または、過免疫血清反応性抗原およびその断片と同一の効果を誘発する分子による効果を比較することによって測定できる。この点で有用なレポーターシステムにはこれらに限定されないが、生成物に変換される比色標識された基質、過免疫血清反応性抗原およびその断片の機能的活性の変化に応答するレポーター遺伝子、および当該技術分野で知られた結合アッセイが含まれる。
アンタゴニストのアッセイの別の例は競合アッセイであり、これは、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片と、潜在的アンタゴニスト、膜結合型結合性分子、組換え結合性分子、天然の基質またはリガンドまたは基質またはリガンド疑似体とを、競合阻害アッセイに適当な条件下で混合するものである。過免疫血清反応性抗原およびその断片を放射能または比色化合物によって標識し、結合性分子に結合したか、または生成物に変換された過免疫血清反応性抗原およびその断片の分子数を正確に測定し、潜在的アンタゴニストの有効性を評価することが出来る。
潜在的アンタゴニストには、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片に結合し、それによってその活性を阻害または消失させる、有機低分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。潜在的アンタゴニストはまた、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片の機能的活性を誘導することなく、結合性分子の同じ部位に結合する有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば密接に関連するタンパク質または抗体であってもよい。
潜在的アンタゴニストには、過免疫血清反応性抗原およびその断片の結合部位に結合してその部位を占有し、それによって細胞の結合性分子への結合を阻害し、正常の生理活性を妨げる低分子も含まれる。低分子の例としては、これらに限定されないが、有機低分子、ペプチドまたはペプチド-様分子が挙げられる。
その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス分子が含まれる(かかる分子の説明については｛Okano、H. et al.、1991｝; OLOGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION; CRC Press、Boca Ration、FL (1988)、を参照されたい)。
好ましい潜在的アンタゴニストには本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片の誘導体が含まれる。
本明細書において用いる、本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片の活性は、その相互作用パートナーのいずれかと結合するその能力または、そのまたはいずれかの相互作用パートナーと結合するかかる能力の程度である。
特定の態様において、本発明は、本発明の過免疫血清反応性抗原およびその断片、核酸分子または阻害剤の、感染の後遺症の原因である病原菌と哺乳類宿主との最初の物理的相互作用を阻害するための使用を提供する。特に本発明の分子は以下のように用いられる: i)粘膜表面および留置装置上の哺乳類細胞外マトリックスタンパク質へのまたは創傷における細胞外マトリックスタンパク質への肺炎連鎖球菌の付着の予防; ii) 組織損傷または侵入を媒介する哺乳類細胞外マトリックスタンパク質と細菌タンパク質の細菌付着の阻害; iii)または免疫防御の回避を導く付着の阻害；iv) 例えば、栄養獲得の阻害を介した｛Brown、J. et al.、2001｝留置装置の移植またはその他の外科技術以外によって開始される感染における病因の正常の進行の阻害。
ここで提供されるDNA コード配列はいずれも抗細菌化合物の発見と開発に用いることが出来る。コードされるタンパク質は発現すると、抗細菌薬のスクリーニングのための標的として用いることが出来る。さらに、コードされるタンパク質のアミノ末端領域をコードするDNA 配列またはShine-Delgarno 配列またはその他のそれぞれのmRNAの翻訳促進配列を用いて問題のコード配列の発現を制御するアンチセンス配列を設計することが出来る。
アンタゴニストおよびアゴニストは、例えば、連鎖球菌、特に肺炎連鎖球菌による感染に起因する疾患、例えば敗血症を阻害するために用いることが出来る。
さらなる態様において、本発明は親和性装置に関し、かかる親和性装置は、少なくとも支持体材料および支持体材料に結合させた本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片のいずれかを含む。その標的細胞または標的分子またはその相互作用パートナーに対する本発明による過免疫血清反応性抗原およびその断片の特異性のために、過免疫血清反応性抗原およびその断片は、結合のための条件が合えば、支持体材料に適用したいずれかのサンプルから相互作用パートナーを選択的に取り出すことを可能とする。サンプルは生物サンプルまたは医学サンプルでよく、これらに限定されないが、発酵ブロス、細胞細片、細胞調製物、組織調製物、器官調製物、血液、尿、リンパ液、髄液などが含まれる。
過免疫血清反応性抗原およびその断片はマトリックスに共有または非共有結合させればよい。好適な支持体材料は当業者に知られており、セルロース、シリコン、ガラス、アルミニウム、常磁性ビーズ、デンプンおよびデキストランを含む群から選択される。
本発明はさらに、以下の図面、実施例および配列表によって説明され、そこから特徴、態様および利点が理解される。本実施例は説明の目的であって開示を限定するものではないことを理解されたい。
本発明に関して、
図 1は、肺炎連鎖球菌特異的ヒト血清の特徴付けを示す。
図 2は、肺炎連鎖球菌血清型 4からの小断片ゲノムライブラリー、LSPn-70の特徴付けを示す。
図 3は、ビオチン化ヒト IgGを用いたMACSによる細菌細胞の選択を示す。
図 4は、同定された抗原による遺伝子分布研究の一例を示す。
図 5は、様々な年齢群および肺炎球菌疾患の経過におけるエピトープ-特異的抗体レベルの変化の例を示す。
図 6は、フローサイトメトリーによるエピトープ-特異的抗血清での細胞表面染色の例を示す。
図 7は、インビトロアッセイにおける選択されたエピトープによって誘導される抗体の殺菌活性の測定を示す。
図 8は、マウス致死性敗血症モデルにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原による能動免疫の保護効果を示す。
図 9は、マウス致死性敗血症モデルにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原によって作られた血清による受動免疫の保護効果を示す。
図 10は、SP2216 抗原における保護ドメインの同定を示す。
図 11は、保護抗原によって誘導された抗体が様々な肺炎連鎖球菌血清型と交差反応性であることを示す。
図 12は、天然SP2216 変異形のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図 13は、天然SP1732 変異形のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図 14は、天然SP2190 変異形のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
表 1は、ゲノム肺炎連鎖球菌ライブラリーおよびヒト血清を用いて行ったすべてのスクリーニングの要約を示す。
表2は、ヒト血清によるエピトープ血清学分析の要約を示す。
表3は、50の肺炎連鎖球菌株において同定された抗原についての遺伝子分布分析の要約を示す。
表4は、表面染色および殺菌活性測定の要約を示す。
明細書において参照される図を以下により詳細に記載する。
図 1は、免疫アッセイによって測定した抗-肺炎連鎖球菌抗体に対するヒト血清の特徴付けを示す。抗-肺炎連鎖球菌IgG とIgAの総抗体レベルを、被覆抗原として肺炎連鎖球菌血清型 4 被膜陰性突然変異株 から調製した全細菌可溶化液または培養上清画分を用いた標準的 ELISAによって測定した。侵入型疾患の回復期患者からの97 血清サンプルまたは肺炎連鎖球菌を上咽頭に保因しない健康な成人からの50の血清を３種類の血清希釈度で分析した。以下を用いた代表的実験の結果を示す：(A) 患者の血清と細菌可溶化液、および(B) 健康な成人の血清と培養上清タンパク質。データは検出範囲で線形である血清希釈度における405nm の吸光度から計算した ELISAユニットとして表す(IgA について10.000X、IgG について50,000)。両ドナー群からの2x5の血清を細菌表面ディスプレーによる抗原同定のために選択し、プールした。２患者プール(PSPn3-IgG,-IgAおよびPSPn7-IgG)および２健康プール(NSPn4-IgG,-IgA およびNSPn5-IgG)に含まれていた選択された血清を丸で示す。 (C) タンパク質抗原による多重（multiple）免疫反応性を確実にするために、ELISAによってあらかじめ選択した血清を用いてイムノブロット分析を行った。肺炎連鎖球菌血清型 4 被膜陰性突然変異株から調製した全細菌可溶化液および選択した患者の血清を 5.000X希釈で用いた代表的実験の結果を示す。選択されなかった、低力価の血清を陰性対照として含めた。Mw: 分子量マーカー。(D)肺炎連鎖球菌血清型 4 被膜陰性突然変異株の表面染色をFACSによって行い、表面に位置する抗原に結合する抗体を比較した。ヒト血清は様々な濃度で用いた(0.5-5％)。代表的データを患者の血清を0.5％終濃度で用いた場合について示す。シグナルをFITC-標識抗-ヒト IgGFabで検出し、コンピュータプログラム CELLQuestで分析した。(E) 全細菌可溶化液を用いてELISA によって測定したIgG力価と、血清 IgGによる全生存肺炎連鎖球菌の表面染色の相関を示す。IgG力価はELISAユニットとして表し、表面染色はコンピュータ プログラム CELLQuestによって計算した染色された細菌の平均蛍光として表す。
図 2 (A)は、肺炎連鎖球菌型 4 小断片ゲノムライブラリー、LSPn-70の断片サイズ分布を示す。609のランダムに選択したクローンを配列決定した後、配列を切ってベクター残基を除き、様々なゲノム断片サイズを有するクローンの数をプロットした。 (B)は肺炎連鎖球菌染色体にわたるLSPn-70 の同じセットのランダムに配列決定したクローンの分布をグラフ表示で示す(TIGR4 ゲノムデータによる)。丸は注釈をつけたORFに対して一致する配列を示し、四角は、+/+または+/-方向における非コード染色体配列に完全に一致したクローンを表す。菱形はキメラ配列を有するすべてのクローンの位置を示す。塩基対の数の距離は一方向に環状のゲノムにわたって示す。ライブラリー内の様々なクローンセットの位置づけを図の下の数およびパーセンテージにて示す。
図 3 (A)はビオチン化ヒト IgGによるMACS 選択を示す。pMAL9.1における LSPn-70 ライブラリーを10 μg ビオチン化 IgG (PSPn3-IgG、ヒト血清から精製)でスクリーニングした。陰性対照においては、スクリーニングのためのライブラリー細胞に血清を添加しなかった。第一および第二溶出の後に選択された細胞数を各選択ラウンドについて示す (それぞれ上パネルおよび下パネル)。(B)は、 MACSによる選択のためにヒト血清 IgGプール (PSPn7-IgG、4μg/μl)を1:3,000希釈で用いたイムノブロット 分析によって分析した、細菌表面ディスプレーにより選択された特異的クローン (1-26)の反応性を示す。ローディングコントロールとして同じブロットを、過免疫ウサギ血清の1:5,000希釈のプラットフォームタンパク質 LamBに対する抗体によって分析した。LB、外来ペプチドインサートを有さないLamBを発現するクローンからの抽出物。
図 4 (A)は、遺伝子分布研究のために分析した肺炎連鎖球菌臨床分離株の様々な血清型の表示を示す。(B)は、それぞれのオリゴヌクレオチドによるSP1604の遺伝子分布についてのPCR 分析を示す。PCR断片の予測サイズは470 bpである。1-50、Aに挙げた肺炎連鎖球菌株、臨床分離株; -、ゲノムDNA無添加; +、ライブラリー構築のためのテンプレートとして用いた肺炎連鎖球菌血清型 4からのゲノムDNA。
図 5は、肺炎球菌疾患におけるエピトープ-特異的ヒト血清 IgG 抗体レベルのELISA測定を示す。疾患が起こる前 (プレ)、急性および回復期の３つの血清サンプルを侵入型肺炎球菌疾患を患う患者から長期的に回収した。２名の患者からの２セットの血清を用いた代表的実験を示す。(A) P1147および(B) P1150 を、同定された抗原、SP0069、SP0082、SP0117、SP1175、SP1937、SP2190および SP2216を表すペプチドと反応させた。ビオチン標識化ペプチドを200Xおよび1.000X 希釈でヒト 血清サンプルと反応させ、データはELISAユニットとして表した。
図 6は、フローサイトメトリーによる、肺炎連鎖球菌の細胞表面に結合する特異的抗体の検出を示す。図 5Aにおいて、免疫前マウス血清および肺炎連鎖球菌血清型 4 溶解液に対するポリクローナル血清を肺炎連鎖球菌株 血清型 4とインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。対照は肺炎連鎖球菌細胞の表面に対する二次抗体の非特異的結合のレベルを示す。図 5Bのヒストグラムは抗-SP2216、抗-SP0117、抗-SP0454および抗-CRF1992 抗体の特異的結合により、プラットフォームタンパク質 LamBに対する対照血清と比較して蛍光が上昇していることを示す。
図 7はインビトロ殺傷アッセイにおいて測定したエピトープ特異的抗体の殺菌活性を示す。免疫血清の殺傷活性を適当な対照血清と並行して測定、比較して計算した。データは肺炎連鎖球菌溶解液によって作成した過免疫 (HI) ポリクローナルマウス血清における(A)、LamB プラットフォームタンパク質において発現したSP0117 エピトープに対して作った免疫血清における(B)、そして FhuA プラットフォームタンパク質において発現したSP1287 エピトープに対して作ったマウス免疫血清における(C)、抗体の存在の結果としての細菌の cfu数の減少である殺菌率として表す。対照血清は、免疫前血清(PI)、Lambまたは FhuAを発現し、肺炎連鎖球菌由来エピトープを有さない大腸菌クローンによって誘導した血清である。肺炎連鎖球菌 血清型 4 細胞をマウス食細胞と60分間インキュベートし、生存していた細菌を、血液寒天培地に播いた後のcfuをカウントすることにより定量した。
図 8は、マウス致死性モデルにおける選択した肺炎連鎖球菌抗原による能動免疫によって達成された保護を示す。C3H マウス (各試験群につき10匹)を血清型 4 肺炎連鎖球菌株からクローニングした組換え抗原で免疫し、血清型 6B 株で攻撃した。攻撃の2〜3週間後に渡って生存をモニターした。A: マウスをSP0368、SP0667、SP2190およびSP2216 抗原で免疫し、静脈内から104 cfuの細菌で攻撃した。非免疫マウスを陰性対照として用い、PspA (SP0117)を陽性対照とした。B: マウスをSP2190および SP2216 抗原で免疫し、腹腔内に 105 cfuの細菌で攻撃した。PBSを注射したマウスまたはアジュバントのみで偽免疫したマウス(CFA/IFA)を陰性対照として用い、PspA (SP0117)を陽性対照として用いた。C: マウスをSP0498およびSP1732 抗原で免疫し、腹腔内に105 cfu の細菌で攻撃した。PBSを注射したマウスを陰性対照として用い、PspA (SP0117)を陽性対照として用いた。
図 9は、マウス致死性モデルにおいて選択した肺炎連鎖球菌抗原によって作成した過免疫マウス血清を用いた受動免疫によって達成された保護を示す。C3H マウス (各試験群につき10匹)にマウス血清を腹腔内に与え、2時間後に105 cfu の肺炎連鎖球菌血清型 6B 細菌で腹腔内攻撃した。生存を攻撃後３週間モニターした。それぞれ100μlの抗-SP2190、抗-SP2216 免疫血清および 100 μlの未処置マウスからの血清を与えられたマウスは例外として、SP2190またはSP2216 によって作成した150μlの免疫血清を与え、未処置マウスからの150μl 血清を補った。陰性対照はPBS 注射、非注射(未処置) または非免疫 CFA/IFA注射マウスからの300μlの血清のいずれかで処置した。
図 10は、SP2216 抗原内の保護ドメインの同定を示す。A:インシリコ (構造予測)分析および細菌表面ディスプレーによって同定されたエピトープの局在(灰色のバーおよび矢印)によって予測された２つのサブドメインを示すSP2216 抗原の模式図。B: C3H マウス (各試験群につき10匹)を組換え SP2216 抗原: 全長、N-末端またはC-末端ドメインで免疫し、腹腔内に 105 cfu与えた肺炎連鎖球菌血清型 6B 株で攻撃した。生存は攻撃の２〜３週間後にモニターした。 非免疫 (CFA/IFA アジュバント注射) マウスを陰性対照として用い、PspA (SP0117)を陽性対照として用いた。
図 11は、様々な肺炎連鎖球菌血清型の分析による抗体の交差反応性を示す。抗体の交差反応性を試験するために血清型 4 株からクローニングしたSP1732、SP2190およびSP2216 組換え抗原によって作った血清を用いて、 48種類の血清型を表す肺炎連鎖球菌の60の臨床分離株から調製した細菌可溶化液についてのイムノブロット分析を行った。７種類の血清型についての結果(レーン1-7)を完全な分析から取った代表的データとして示す。Mw: 分子量マーカー。
図 12は、肺炎連鎖球菌の様々な臨床分離株において発現される天然SP2216 変異形において検出されたアミノ酸変化を示す。47種類の肺炎連鎖球菌血清型を表す47 種類の臨床分離株からのSP2216遺伝子をDNA配列決定によって分析した。翻訳されるアミノ酸配列をこれらの血清型について示し、ここでアミノ酸変化は、公表されたTIGR4 ゲノム配列と比べて検出されたものである。
図 13は、肺炎連鎖球菌の様々な臨床分離株において発現される天然SP1732 変異形において検出されたアミノ酸変化を示す。６種の主な肺炎連鎖球菌血清型(4、6B、9V、18C、19F、23F)を表す６種の臨床分離株からのSP1732遺伝子をDNA 配列決定によって分析した。翻訳されるアミノ酸配列をこれらの血清型について示し、ここでアミノ酸変化は、公表されたTIGR4 ゲノム(血清型 4)配列と比べて検出されたものである。
図 14は、肺炎連鎖球菌の様々な臨床分離株において発現される天然SP2190 変異形において検出されたアミノ酸変化を示す。７種の主な肺炎連鎖球菌血清型 (4、6B、9V、14、18C、19F、23F)を表す７種の臨床分離株からのSP2190遺伝子をDNA 配列決定によって分析した。翻訳されるアミノ酸配列をこれらの血清型について示し、ここでアミノ酸変化は、公表されたTIGR4 ゲノム(血清型 4)配列と比べて検出されたものである。いくつかの遺伝子の中央部からの配列情報が無いために、N-末端および C-末端アミノ酸アラインメントを別々に示す。A: N-末端アミノ酸配列; B: C-末端アミノ酸配列。
表1: 細菌表面ディスプレーによって同定された免疫原性タンパク質。
A、fhuA における300bp ライブラリーとNSPn4-IgA (362)、B、fhuA における300bp ライブラリーとNSPn4-IgG (832)、C、fhuA における300bp ライブラリーとNSPn5-IgG (872)、D、fhuA における300bp ライブラリーとPSPn3-IgA (361)、E、fhuA における300bp ライブラリーとPSPn3-IgG (575)、F、fhuA における300bp ライブラリーと PSPn7-IgG (795)、G、lamBにおける70bp ライブラリー とNSPn4-IgA (1043)、H、lamBにおける70bp ライブラリーとNSPn4-IgG (929)、I、lamBにおける70bp ライブラリーと NSPn5-IgG (527)、K、lamBにおける70bp ライブラリーと PSPn3-IgA (1121)、L、lamBにおける70bp ライブラリーとPSPn3-IgG (1242)、M、lamBにおける70bp ライブラリーと PSPn7-IgG (514); *、5 アミノ酸より長い抗原性配列の予測は、プログラム ANTIGENIC ｛Kolaskar、A. et al.、1990｝を用いて行った。
表2: ヒト血清によるエピトープ血清学。
選択されたエピトープを表す個々の合成ペプチドと個々のヒト血清との免疫反応性を示す。反応性の程度は灰色のパターンで示す; 白: - (<50U)、淡灰色: + (50-119U)、濃灰色: ++ (120-199U)、黒: +++ (200-500U) および縦縞: ++++ (> 500U)。ELISAユニット (U)はバックグラウンドを修正した後のOD405nm の読みと血清希釈度から計算する。Sは全反応性の和として計算したスコアを意味する(すべての +の数の和); P1〜 P13血清は高力価であると測定され、侵入型肺炎球菌疾患の患者からのものであり、N1〜 N10血清は健康な成人由来で抗-肺炎連鎖球菌力価が高いものである。Sはスコアを表し、免疫反応性の和である: - =0; + =1; ++ =2; +++ =3 および ++++ =4。TIGR4 株のゲノム アノテーションによる抗原性 ORF内の合成ペプチドの位置をfrom および toという列に示し、これは最初と最後のアミノ酸残基をそれぞれ示す。ペプチド名称: SP0117.1-7はORFSP0117に割り当てられた; ARF0408.1は SP0408の選択的読み枠における新規なORFである可能性がある; CRF0129.1はSP0129の相補鎖にある新規なORFである可能性がある。
表3:肺炎連鎖球菌株における遺伝子分布。
図 4Aに示す50の肺炎連鎖球菌株を、関連する抗原をコードする遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCR によって試験した。１つの選択されたPCR断片のPCR断片を配列決定し、正しいDNA断片が増幅されているかを確認した。*、肺炎連鎖球菌 TIGR4 (血清型 4)と比較しての血清型 14 株 におけるアミノ酸置換の数。#、遺伝子が血清型 14 株に存在しないために配列決定に用いた代わりの株。
表4:抗原性エピトープの表面位置およびエピトープ-特異的抗体の機能。
45の肺炎連鎖球菌抗原を、肺炎連鎖球菌ペプチドに融合したプラットフォームタンパク質LamB またはFhuAをコードするプラスミドを有する大腸菌クローンによる免疫化によって作成したマウス血清を用いることにより、図 6に記載および図示したようなやり方で表面局在について試験した。データはFACSと示す列において要約されている。列PK (食作用による殺傷)においてFACSによって陽性であった試験したすべての抗原を例示的に表し、図 7において示したものとまったく同じ免疫試薬をインビトロ殺傷アッセイに用いた。-:陰性結果、+:行ったすべてのアッセイにおいて常に陽性ではない、++ および +++は対照試薬と比較して常に陽性である。
実施例1:ヒト血清に基づく抗-肺炎連鎖球菌抗体の特徴付けおよび選択、抗体スクリーニング試薬の調製
実験手順
酵素結合免疫測定法 (ELISA)
ELISA プレート (Maxisorb、Millipore)を、被覆バッファー (0.1M 炭酸ナトリウム pH 9.2)に希釈した5-10 μg/mlの全タンパク質で被覆した。３つの希釈度の血清(2,000X、10,000X、50,000X)をPBS-BSA中に作った。高度特異的セイヨウワサビペルオキシダーゼ (HRP)-結合抗-ヒト IgGまたは抗-ヒト IgA 二次抗体 (Southern Biotech)を製造業者の指示に従って用いた(希釈: 1,000x)。抗原-抗体複合体を、基質(ABTS)の着色生成物への変換を、自動ELIASリーダー(TECAN SUNRISE)によるOD405nmの読みに基づいて測定することによって定量した。
細菌抗原抽出物の調製
全細菌可溶化液: 細菌を一晩THB (Todd-Hewitt Broth)中で培養し、凍結乾燥サイクルを繰り返すことによって溶解した:ドライアイス/エタノール-混合物で凍結するまでインキュベーションし(1分)、37℃で解凍した(5分):これを3回繰り返した。この後超音波処理し、上清を遠心分離 (3,500 rpm、15分、4℃)によって回収した。
培養上清: 遠心分離によって細菌を除いた後、一晩培養した細菌培養物の上清を氷冷エタノールを用いて1部の上清と3部の無水エタノールを混合することによって沈殿させ、一晩-20℃でインキュベートした。沈殿を遠心分離 (2,600 g、15分)で回収した。乾燥ペレットをELISA のためにはPBSに、またはSDS-PAGEおよびイムノブロッティングのためには尿素および SDS-サンプルバッファーに溶解した。サンプルのタンパク質濃度はBradford アッセイによって測定した。
イムノブロッティング
全細菌可溶化液および培養上清サンプルをインビトロで培養した肺炎連鎖球菌血清型 4の莢膜を持たない突然変異株から調製した。10〜25μgの全タンパク質/レーンをBioRad Mini-Protean 3 Cell電気泳動システムを用いてSDS-PAGE によって分離し、タンパク質をニトロセルロースメンブレン (ECL、Amersham Pharmacia)にトランスファーした。5％ミルク中での一晩のブロッキングの後、ヒト血清を2,000x 希釈で添加し、HRPO 標識抗-ヒト IgGを用いて検出した。
細菌の表面染色
フローサイトメトリー分析を以下のように行った。肺炎連鎖球菌血清型 4の莢膜を持たない突然変異株をTodd-Hewitt培養液で一晩初期定常期となるまで培養した。細胞を回収し、ハンクス緩衝塩類溶液 (HBSS)で２回洗浄し、OD600 nmの読みに基づいて細胞密度を0.5％ BSAを含む100μl HBSS中におよそ1 X 106 CFUとなるよう調整した。終濃度0,5および 2％のヒト血清 との60分間 4℃でのインキュベーションの後、未結合の抗体を過剰のHBSS、0.5％ BSA中の遠心分離によって洗浄した。検出のためにフルオレセイン (FITC)標識二次ヤギ抗-ヒト IgG (F(ab')2断片特異的)を細胞と4℃で30分間インキュベートした。細胞の洗浄後、細胞を2％ パラホルムアルデヒドで固定した。表面染色抗体をBecton Dickinson FACScan フローサイトメーターを用いて検出し、さらにコンピュータ プログラム CELLQuestで分析した。
ゲノムスクリーニングのための抗体の精製
患者および健康群の両方からの５つの血清を、スクリーニング手順に用いた血清プールについての総抗-連鎖球菌力価に基づいて選択した。大腸菌タンパク質に対する抗体を、熱不活性化血清と全細胞大腸菌細胞 (細菌表面ディスプレーに用いたのと同じ条件下で培養したPHIE11で形質転換したDH5α)とをインキュベートすることによって除いた。プールされた枯渇した血清からの高度に濃縮されたIgGの調製物をタンパク質 G 親和性クロマトグラフィーによって、製造業者の指示に従って作成した(UltraLink Immobilized Protein G、Pierce)。IgA 抗体をストレプトアビジン-アガロース (GIBCO BRL)に固定化したビオチン-標識抗-ヒト IgA (Southern Biotech)を用いた親和性クロマトグラフィーによって精製した。枯渇と精製の有効性を、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ELISAおよびタンパク質濃度測定によって確認した。
結果
ヒト免疫系によって肺炎連鎖球菌に対して産生され、ヒト血清中に存在する抗体は、抗原性タンパク質のインビボ発現とその免疫原性を示す。これら分子は本発明に記載のアプローチにおける個々の抗原の同定に必須であり、このアプローチは、特異的抗-連鎖球菌抗体と対応する肺炎連鎖球菌ペプチドまたはタンパク質との相互作用に基づく。関連する抗体レパートリーを得るために、ヒト血清を以下から回収した：
I.侵入型肺炎連鎖球菌感染症、例えば、肺炎、菌血症および髄膜炎の回復期の患者(医学的微生物学的試験によって、肺炎連鎖球菌が原因物質であることが示されている)、
II.サンプル収集の際に保因者でない健康な成人。肺炎連鎖球菌定着および感染症は一般的であり、抗体が以前の接触からの自然免疫化の結果として存在する。
97の患者からの血清サンプルおよび50の健康な成人からの血清を一連の免疫アッセイによって抗-肺炎連鎖球菌抗体について特徴づけた。第一の特徴付けは２種類の抗原調製物、例えば肺炎連鎖球菌血清型 4 莢膜を持たない突然変異株から調製した全細菌抽出物および培養上清タンパク質を用いたELISAによって行った。莢膜を持たない株を分析したことは重要な側面である。というのは血清型特異的な豊富な抗-莢膜多糖抗体に起因する反応性が避けられるからである。
最近、IgGだけでなく、IgA 血清抗体も、PMNのFcRIII 受容体によって認識され、オプソニン作用 を促進することが出来ることが報告された｛Phillips-Quagliata、J. et al.、2000｝; ｛Shibuya、A. et al.、2000｝。IgA 抗体の第一の役割は、主に粘膜表面での中和である。血清 IgAレベルは、二量体の分泌されたIgAの質、量および特異性を反映する。このため、血清収集物は抗-連鎖球菌 IgGについてだけでなく、IgA レベルについても分析した。ELISA アッセイにおいて、高度に特異的な二次試薬を用いて高親和性型、例えば、IgGおよびIgAからの抗体を検出したが、IgMは避けた。IgM 抗体の産生は、一次適応性体液性応答において起こるが、低親和性抗体が生じ、一方、IgG および IgA 抗体はすでに親和性成熟を経ており、疾患と戦ったり予防したりするのにより価値がある。抗体力価は応答が線形である所与の希釈度にて比較した (図1Aおよび1B)。２つの複合体抗原性混合物に対するIgGおよび IgA 反応性に基づいて血清をランク付けし、もっとも高いものを、イムノブロッティングにより更に試験するために選択した。この分析は、特に選択されなかった低力価血清と比較した場合の、複数の肺炎球菌タンパク質に対するあらかじめ選択された血清の高い抗体反応性を確認するものであった(図1C)。血清のELISA ランク付けはまた、同じ肺炎連鎖球菌株の表面染色と非常によく相関しており(図1Dおよび 1E)、ELISAによって検出された抗体のほとんどが表面抗原に対応することを示唆する。大規模な抗体特徴付けアプローチにより、抗-肺炎球菌過免疫血清の明白な同定が導かれた。
患者および健康なドナー群の両方からの選択された血清、2x5をプールしてさらに豊富な抗体となるよう濃縮したが、異なる個体の抗体レパートリーを表すものであった。IgGおよびIgA 抗体をプールされた血清から親和性クロマトグラフィーにより精製し、大腸菌 -反応性抗体を枯渇させ、細菌表面ディスプレースクリーニングにおけるバックグラウンドを避けた。
実施例２: 肺炎連鎖球菌の、高度にランダムな、フレーム選択された、小断片ゲノムDNA ライブラリーの作成
実験手順
連鎖球菌 ゲノムDNAの調製
50 mlのTodd-Hewitt Broth培地に、凍結穿刺からの肺炎連鎖球菌血清型 4 (常套の血清型決定により分類した臨床分離株) 細菌を播き、18時間37℃で通気および撹拌しながら培養した。培養物を回収し、1,600x gで15分遠心分離し、上清を除いた。細菌ペレットを3回PBSで洗浄し、注意深く0.5 mlの リゾチーム溶液(100 mg/ml)に再懸濁した。0.1 mlの 10 mg/ml熱処理RNase A および 20 UのRNase T1を添加し、注意深く混合し、溶液を1時間37℃でインキュベートした。0.2 mlの20 ％ SDS 溶液および0.1 mlのプロテイナーゼ K (10 mg/ml)を添加した後、チューブを一晩 55℃でインキュベートした。1/3 容積 の飽和NaClを添加し、溶液を20分間4℃でインキュベートした。抽出物を微量遠心管(13,000 rpm)でペレットにし、上清を新しいチューブに移した。溶液をPhOH/CHCl3/IAA (25:24:1)およびCHCl3/IAA (24:1)で抽出した。 DNAを室温で0.6x 容積のイソプロパノールを添加することにより沈殿させ、無菌パスツールピペットで溶液から巻き取り、80％ 氷冷エタノールを含むチューブに移した。DNAを沈殿を10-12,000x gで遠心分離することにより回収し、次いで風乾し、ddH2Oに溶解した。
小ゲノムDNA断片の調製
ゲノムDNA断片をcup horn超音波処理器を用いて機械的に剪断して150〜300 bpのサイズの範囲の断片にするか (BB5 cup horn を備えたBandelin Sonoplus UV 2200超音波処理器、10 秒.
100 ％出力でパルス）、または穏やかなDNase I処理 (Novagen)によって50 〜70 bpのサイズの断片にした。DNAを150-300 bpサイズ範囲の断片にした場合、超音波処理によっては非常にタイトな断片サイズ分布が生じることが観察された。しかし、DNAを超音波-誘導性機械的剪断力に広範にさらしたにもかかわらず、その結果としての断片サイズの低下は十分ではなく、再現性が達成されなかった。それゆえ、50〜70 bpサイズの断片をNovagenショットガン切断キットを用いた穏やかなDNase I処理によって得た。キットに備えられた DNase Iの1:20 希釈液を調製し、消化は60 μl 容積中 MnCl2の存在下20℃で5分間行い、酵素による二本鎖切断を確実にした。反応を2 μl の0.5 M EDTAによって停止し、断片化効率を2％ TAE-アガロースゲルで評価した。この処理の結果、ほぼ50-70 bp 断片を生ずるゲノムDNAの全断片化が起こった。断片をT4 DNAポリメラーゼを100 μMの各dNTPの存在下で用いて２回平滑末端化し、末端の効率的なフラッシングを確実にした。断片をすぐにライゲーション反応に用いるか、または次に使用するまで-20℃で凍結した。
ベクターの説明
ベクター pMAL4.31をベータ・ラクタマーゼ (bla)遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と交換した pASK-IBAバックボーン上に構築した ｛Skerra、A.、1994｝。さらに bla遺伝子をマルチクローニングサイトにクローニングした。成熟ベータ・ラクタマーゼをコードする配列の前にompAのリーダーペプチド配列があるため、細胞膜を横切る効率的な分泌が可能である。さらに、成熟ベータ・ラクタマーゼの最初の 12 アミノ酸 (スペーサー配列)をコードする配列がompAリーダーペプチド配列の後にあるため、リーダーペプチダーゼ切断部位の直後の配列の融合が避けられる。というのは、例えばこの領域における正に荷電したアミノ酸のクラスターは細胞膜を横切る転移を減少または無くする可能性があるからである ｛Kajava、A. et al.、2000｝。SmaI 切断部位はライブラリー挿入に役立つ。選択された断片の回収のために用いる上流のFseI 部位および下流のNotI 部位が、SmaI 部位を挟んでいる。３つの切断部位は、12 アミノ酸スペーサー配列をコードする配列の後に、bla遺伝子が-1 読み枠で転写される結果、NotI 部位の15 bp後に停止コドンがくるように挿入されている。+1 bp挿入により、bla ORFが回復し、ベータ・ラクタマーゼタンパク質が産生される結果、アンピシリン耐性が獲得される。
ベクター pMAL9.はlamB遺伝子をpEH1 ｛Hashemzadeh-Bonehi、L. et al.、1998｝のマルチクローニングサイトにクローニングすることにより構築した。次いで、切断部位 FseI、SmaIおよびNotIを含む配列をlamBのアミノ酸 154の後に挿入した。この挿入のための読み枠は、プラスミド pMAL4.31からFseIおよびNotIでの消化によって切り出されたフレーム選択されたDNA断片の移動の結果、lamBおよび対応するインサートの連続した読み枠が生じるように構築した。
ベクター pMAL10.1をbtuB遺伝子をpEH1のマルチクローニングサイトにクローニングすることによって構築した。ついで、切断部位 FseI、XbaIおよびNotIを含む配列をアミノ酸 236の後にbtuB中に挿入した。この挿入の読み枠は、FseI および NotIでの消化によりプラスミド pMAL4.31から切り出されたフレーム選択された DNA断片の移動によって、btuBと対応するインサートの連続する読み枠が生じるように選択した。
ベクター pHIE11は、fhuA遺伝子をpEH1のマルチクローニングサイトにクローニングすることによって構築した。その後、切断部位 FseI、XbaIおよびNotIを含む配列をfhuA中のアミノ酸 405の後に挿入した。この挿入の読み枠は、プラスミド pMAL4.31からFseI および NotIによる消化により切り出されたフレーム選択された DNA断片の移動により、fhuAおよび対応するインサートの連続する読み枠が生じるように選択した。
フレーム選択のためのライブラリーのクローニングおよび評価
ゲノム肺炎連鎖球菌DNA断片をベクター pMAL4.31のSmaI 部位にライゲーションした。組換え DNAをDH10B エレクトロコンピテント大腸菌細胞 (GIBCO BRL)にエレクトロポーレーションし、形質転換体をカナマイシン (50 μg/ml)およびアンピシリン (50 μg/ml)を追加したLB-寒天培地に播いた。プレートを37℃で一晩インキュベートし、コロニーを回収してラージスケールDNA抽出に用いた。代表的なプレートを保存し、コロニー PCR 分析およびラージスケール配列決定のためのコロニーの回収のために保存した。簡便なコロニー PCR アッセイを用いてまず、だいたいの断片サイズ分布および挿入効率を判定した。配列決定データから、正確な断片サイズを評価し、挿入部位での接合の正確さおよびフレーム選択の精度を評価した(3n+1規則)。
細菌表面ディスプレーのためのライブラリーのクローニングおよび評価
ゲノムDNA断片を肺炎連鎖球菌ライブラリーを含むpMAL4.31 ベクターから、制限酵素 FseIおよび NotIによって切り出した。断片の全集団を、FseIおよび NotIで消化しておいた、プラスミドpMAL9.1 (LamB)または pHIE11 (FhuA)に移した。8 bp GCリッチ配列を認識するこれら２つの制限酵素を用いることにより、pMAL4.31 ベクターにおいて選択された読み枠が、プラットフォームベクターのそれぞれにおいて維持された。プラスミドライブラリーを次いで大腸菌 DH5α細胞にエレクトロポーレーションによって形質転換した。細胞を50 μg/ml カナマイシンを追加した大きいLB-寒天培地プレートに播き、明らかに目視できるシングルコロニーが生じる密度で一晩37℃で培養した。細胞を次にこれらプレートの表面から掻き取り、新しい LB培地で洗浄し、アリコート中でライブラリースクリーニング用に-80℃で保存した。
結果
フレーム選択のためのライブラリー
それぞれサイズがおよそ 70および300 bpの２つのライブラリー (LSPn70 およびLSPn300)をpMAL4.31 ベクター中に作成した。それぞれのライブラリーについて、およそ1 μgの pMAL4.31 プラスミド DNAおよび50 ngの断片化ゲノム肺炎連鎖球菌DNAを ライゲーションおよび形質転換し、フレーム選択後の4x 105 〜2x 106 クローンが得られた。ライブラリーのランダムさを評価するために、LSPn70のおよそ 600のランダムに選択したクローンを配列決定した。生物情報分析により、これらクローンのうち二度以上現れるものはほとんどないことが示された。さらに、90％のクローンが25〜100 bpのサイズ範囲内にあり、平均サイズ52 bpであることが示された(図 2)。ほとんどすべての配列が 3n+1規則にしたがっており、すべてのクローンが正しくフレーム選択されたことが示された。
細菌表面ディスプレーライブラリー
大腸菌表面へペプチドをディスプレーするためには、LSPn ライブラリーからのインサートを、フレーム選択ベクター pMAL4.31からディスプレープラスミド pMAL9.1 (LamB)またはpHIE11 (FhuA)に移す必要がある。ゲノムDNA断片を FseおよびNotI制限処理によって切り出し、5ngのインサートと0.1μg のプラスミド DNAをライゲーションし、DH5α細胞に形質転換した結果、2-5x 106 のクローンが生じた。クローンをLB プレートから掻き取り、さらに増幅せずに冷凍した。
実施例３
細菌表面にディスプレーしたゲノムライブラリーとヒト血清とを用いた、肺炎連鎖球菌からの高度に免疫原性のペプチド配列の同定
実験手順
MACS スクリーニング
所与のライブラリーからのおよそ2.5x 108 細胞を50 μg/ml カナマイシンを追加した5 ml LB-培地で2時間37℃で培養した。発現は1 mM IPTGの添加により30分間誘導した。細胞を新しいLB 培地で２回洗浄し、およそ 2x 107 細胞を100 μlのLB 培地に再懸濁し、エッペンドルフチューブに移した。
血清から精製した10 μgのビオチン化ヒト IgGを細胞に添加し、懸濁液を4℃で穏やかに振盪しながら一晩インキュベートした。900 μlのLB 培地を添加し、懸濁液を混合し、次いで10分間、6,000 rpm 、4℃で遠心分離した(IgA スクリーニングには、10 μg の精製IgAを用い、ビオチン化 抗-ヒト-IgG 二次抗体で捕捉した)。細胞を1 ml LBで１回洗浄し、100 μl LB 培地に再懸濁した。ストレプトアビジン (Miltenyi Biotech、Germany)に結合した10 μlのMACS マイクロビーズを添加し、インキュベーションを20分間4℃で続けた。その後、900 μlのLB 培地を添加し、MACS マイクロビーズ細胞懸濁液を磁石に固定化した平衡化したMSカラム(Miltenyi Biotech、Germany)にローディングした (MSカラムは、1 ml 70％ EtOHで１回、2 ml LB 培地で２回洗浄することによって平衡化した)。
カラムを次いで3 ml LB 培地で３回洗浄した。磁石を除いた後、細胞を2 ml LB 培地で洗浄することにより溶出させた。3 ml LB 培地でカラムを洗浄した後、2 mlの溶出液を再び同じカラムにローディングし、洗浄および溶出工程を繰り返した。ローディング、洗浄および溶出工程を３回行い、最終溶出液2 mlを得た。
第二ラウンドのスクリーニングは以下のように行った。最終溶出液からの細胞を遠心分離で回収し、50 μg/ml カナマイシンを追加した1 ml LB 培地に再懸濁した。培養物を37℃で90分間インキュベートし、1 mM IPTGで30分間誘導した。細胞を回収し、1 ml LB 培地で１回洗浄し、10 μl LB 培地に懸濁した。10 μg のヒトビオチン化 IgGを再び添加し、懸濁液を一晩4℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。すべてのさらなる工程は、第一の選択ラウンドと全く同じようにして行った。２ラウンドの選択の後に選択した細胞を50 μg/ml カナマイシンを追加したLB-寒天培地プレートに播き、一晩37℃で培養した。
選択されたクローンの配列決定およびウェスタンブロット分析による評価
選択されたクローンを一晩37℃で50 μg/ml カナマイシンを追加した3 ml LB 培地で培養し、プラスミド DNAを標準的手順で調製した。配列決定はMWG (Germany)または TIGR (U.S.A.)と連携して行った。
ウェスタンブロット分析のために、およそ10〜 20 μgの全細胞タンパク質を10％ SDS-PAGEで分離し、 HybondC メンブレン(Amersham Pharmacia Biotech、England)にブロッティングした。LamBまたは FhuA 融合タンパク質をヒト血清を一次抗体としておよそ1:5,000希釈で、そしてHRPと結合した抗-ヒト IgGまたはIgA 抗体を1:5,000希釈で二次抗体として用いて検出した。検出はECL 検出キット(Amersham Pharmacia Biotech、England)を用いて行った。あるいは、ウサギ 抗-FhuAまたはウサギ 抗-LamB ポリクローナル免疫血清を一次抗体として、それぞれHRPに結合した二次抗体と組み合わせて用いて融合タンパク質を検出した。
結果
ビオチン化 Igを用いた磁気活性化細胞ソーティング (MACS)による細菌表面ディスプレーライブラリーのスクリーニング
ライブラリー、pMAL9.1中の LSPn70およびpHIE11 中のLSPn300を、患者血清または健康な個体からの血清からのビオチン化ヒト IgGおよびIgA のプールによりスクリーニングした (実施例１: ヒト血清からの抗体の調製参照)。選択手順は実験手順に記載の通りに行った。図 3Aは、LSPn-70 ライブラリーおよびPSPn3-IgGを用いるスクリーニングの代表例を示す。MACS スクリーニングからの第一の選択サイクル後のコロニー数から理解されるように、最後に回収された細胞の総数は2x107 細胞からおよそ5x 104 細胞へと劇的に低下しているのに対し、抗体を添加しない選択では約 2x103 細胞 へと低下していた(図 3A)。第二ラウンドの後、類似数の細胞がPSPn3-IgGにより回収されたのに対し、ヒト血清からのIgGを添加しなかった場合には10細胞未満が回収され、選択が肺炎連鎖球菌特異的抗体に依存していたことが明らかに示される。スクリーニングの性能を評価するため、26の選択されたクローンをランダムに取り出し、スクリーニング IgGプール (PSPn7)でのイムノブロット分析に供した(図 3B)。この分析により、〜90％の選択されたクローンが関連する血清に存在する抗体と反応性を示すのに対し、肺炎連鎖球菌特異的インサートを含まないLamBを発現する対照株は同血清と反応しないことが明らかになった。一般に、観察された反応性の比は、35〜90％の範囲であった。コロニー PCR 分析により、すべての選択されたクローンが予測されたサイズ範囲におけるインサートを含んでいたことが示された。
続くより多数のランダムに取り出したクローン(600〜1200/ スクリーニング)の配列決定により、スクリーニングに用いたヒト血清抗体により特異的に認識された遺伝子および対応するペプチまたはタンパク質配列が同定された。特定のクローンが選択される頻度は少なくとも部分的には、選択に用いた血清中の、このクローンによって提示されるエピトープを認識する特異的抗体の量および/または親和性を反映する。この点で、いくつかのORF(例えば、SP2216、SP0117、SP0641、SP2136、SP2190、SP0107、SP0082)由来のクローンは100回以上取り出されたことは驚くべきであり、その高度に免疫原性の性質を示す。表1は全部で12回行ったスクリーニングから得られたデータを要約する。表1に示されるすべてのクローンはシングルクローンからの全細胞抽出物を用いたイムノブロット分析により、それぞれのスクリーニングに用いたヒト血清のプールと反応性を示すことが示された。表1から理解されるように、同定されたORFの異なる領域は免疫原性であると同定される。というのは、タンパク質のサイズの異なる断片がプラットフォームタンパク質によって表面にディスプレーされているからである。
細菌表面ディスプレースクリーニングによって同定された遺伝子のほとんどは、肺炎連鎖球菌の表面に付着および/または分泌されるタンパク質をコードすることは注目に値する。これは表面付着または分泌タンパク質の肺炎連鎖球菌の病原性において予測される役割と一致する。
実施例4:個体のヒト血清による高度に免疫原性のペプチド配列の反応性の評価
実験手順
ペプチド合成
ペプチドはRinkアミド樹脂(PepChem、Tubingen、Germany)上の標準的 F-moc 化学を用いて、SyroII 合成機(Multisyntech、Witten、Germany)を用いてスモールスケール (4 mg樹脂並行して 288まで)で合成した。配列を集めた後、ペプチドを Fmoc-イプシロン-アミノヘキサン酸 (リンカー)およびビオチン (Sigma、St. Louis、MO;通常のアミノ酸のように活性化)によって伸長させた。ペプチドを樹脂から、93％TFA、5％ トリエチルシラン、および2％を用いて１時間かけてはずした。ペプチドを減圧下で乾燥させ、アセトニトリル/水(1:1)から３回凍結乾燥させた。正しい質量の存在をReflex III MALDI-TOF (Bruker、Bremen Germany)での質量分析によって確認した。ペプチドはさらに精製せずに用いた。
酵素結合免疫測定法 (ELISA)
ビオチン標識化ペプチド(N-末端)をストレプトアビジン ELISA プレート (EXICON)に10 μg/ml濃度で製造業者の指示に従って被覆した。高特異性セイヨウワサビペルオキシダーゼ (HRP)-結合抗-ヒト IgG 二次抗体 (Southern Biotech) を製造業者の推奨にしたがって用いた(希釈: 1,000x)。血清は２種類の血清希釈、200X および 1,000Xで試験した。手操作での被覆の後、ペプチドプレートを内蔵ELISAリーダー(GENIOS、TECAN)を備えた Gemini 160 ELISA ロボット(TECAN) で加工および分析した。
およそ110名の患者および60名の健康な成人の血清を分析に用いた。選択されたクローンの生物情報分析の後、対応するペプチドを設計し合成した。26を超えるアミノ酸残基のエピトープの場合、オーバーラップするペプチドをつくった。すべてのペプチドは N-末端ビオチン-タグを付加して合成し、ストレプトアビジン-被覆ELISA プレート上での被覆試薬として用いた。
分析は２段階で行った。第一に、ペプチドを、細菌表面ディスプレーのためのIgG およびIgA スクリーニング試薬の調製に用いた血清プールに含まれていた、個体の血清との反応性に基づいて選択した。抗原同定に用いた20のヒト血清 (５つの血清の４種類のプールを表す)により分析したゲノムスクリーニングからの肺炎連鎖球菌エピトープを表す224のペプチドの血清反応性の要約を表2に示す。ペプチドを陽性の血清の数および反応性の程度に基づいて各ペプチドについて計算したスコアによって比較した。ペプチドには高度に広く反応性のものから弱く陽性のものまである。もっとも反応性の高いものの中には 既知の抗原があり、そのいくつかは上咽頭保因者または敗血症についての動物攻撃モデルにおいても保護を示す(例えば、PspA/SP0117、セリンプロテアーゼ/SP0641、ヒスチジン 三連構造(triad)タンパク質/SP1175)。陽性反応を示さないペプチドはさらなるより詳細な研究に含めなかった。
第二に、侵入型肺炎球菌疾患を患う患者または健康な成人および子供からの、多数のあらかじめ選択されていない個体の血清を、スクリーニング血清と特異的かつ高い反応性を示すペプチドに対して試験した。疾患の際の血清転換を高度に陽性のペプチドについて、侵入型肺炎球菌疾患を患う患者から長期的に回収した３種の血清サンプル（第一は疾患発生前(プレ)、第二は疾患の急性期(発症から５日以内)および第三は疾患の回復期 (発症後３週間を超える)）を用いることによって試験した。２つの代表的ELISA実験を２種類の患者について示し、これは多数のペプチドに対する血清転換を示し、エピトープ-特異的抗体レベルが疾患が起こる前は低く、急性期および回復期には誘導されるということが示唆された(図5)。この抗体プロフィールを示す抗原は特にワクチン開発に価値がある (例えば、SP2216、SP2109、SP1175、SP0117、SP0082)。
実施例5:肺炎連鎖球菌から同定した高度に免疫原性のタンパク質の遺伝子分布研究
実験手順
PCRによる肺炎球菌抗原の遺伝子分布
理想的なワクチン抗原は、ワクチンが望まれる標的生物のすべての、または大多数の株に存在する抗原であろう。同定された肺炎連鎖球菌抗原をコードする遺伝子が、肺炎連鎖球菌株において普遍的に存在するかを確認するために、PCRを一連の独立した肺炎連鎖球菌分離株に対して、目的遺伝子に特異的なプライマーを用いて行った。肺炎連鎖球菌分離株としては、図 4Aに示すように患者にもっともしばしば存在する血清型をカバーするものを得た。プライマーとしてのオリゴヌクレオチド配列をすべての同定されたORFについて設計し、すべての同定された免疫原性エピトープをカバーすることが出来るとすると、およそ1,000 bp の産物が生じる。すべての肺炎連鎖球菌株のゲノムDNAを実施例 2に記載のように調製した。PCRは反応容積25 μlで、Taq ポリメラーゼ (1U)、200 nM dNTP、10 pMolの各オリゴヌクレオチドおよびキットを用いて製造業者の指示に従って行った(Invitrogen、The Netherlands)。個々のプライマー対について条件を変える必要がないかぎり、 標準として、30サイクル (1x: 5分 95℃、30x: 30秒 95℃、30秒 56℃、30秒 72℃、1x 4分 72℃)を行った。
結果
免疫原性タンパク質をコードするすべての同定された遺伝子を、50種類の株の肺炎連鎖球菌におけるその存在についてPCR で試験した(図 4A)。一例として、図 4Bはすべての示された50の株を用いたSP1604に対するPCR反応を示す。明白に、分析したすべての株に遺伝子が存在していた。型14 株からのPCR断片を配列決定したところ、414 bpのなかで、6 bp が肺炎連鎖球菌型4 株と比較して異なっており、２つの分離株の間で３アミノ酸の差があった。
分析した全部で50の遺伝子では、31はすべての試験株に存在しており、9遺伝子は、試験した50 株のうち、10 を超える株で不在であった(表3)。いくつかの遺伝子(SP0667、SP0930)はサイズの変動を示し、すべての分離株には存在していなかった。いくつかの遺伝子はサイズの変動を示したが、それ以外は試験したすべての株で保存されていた。１つの株から得られたPCR断片を配列決定し、次いで型4 株と比較したところ、正しいDNA断片の増幅が確認され、配列の相違の程度は表 3に示すように明らかになった。重要なことに、多くの同定された抗原は配列およびサイズにおいてすべての株でよく保存されておりそれゆえ肺炎球菌による感染症の予防のための新規ワクチン候補である。
実施例6: 大腸菌表面にディスプレーされた肺炎連鎖球菌からの高度に免疫原性のタンパク質/ペプチドで免疫したマウスから得られた免疫血清の特徴付け
実験手順
マウスからの免疫血清の作成
肺炎連鎖球菌ペプチドに融合したプラットフォームタンパク質をコードするプラスミドを有する大腸菌クローンを、50μg/ml カナマイシンを追加したLB 培地で37℃で培養した。一夜培養物を1:10に希釈し、OD600 が0.5となるまで培養し、0.2 mM IPTGで2時間誘導をかけた。ペレットとなった細菌細胞を PBS バッファーに懸濁し、氷上で超音波処理して破壊し、粗細胞抽出物を得た。OD600測定により、5x107 細胞に対応するアリコートをNMRI マウス に静脈内注射し、2週間後追加免疫した。血清を２回目の注射の1週間後に採取した。エピトープ特異的抗体レベルをペプチド ELISAによって測定した。
抗原のインビトロ発現
インビトロで培養した肺炎連鎖球菌血清型 4 による抗原の発現をイムノブロッティングにより試験した。全溶解液および細菌培養上清における抗原の存在を検出するため、様々な培地および培養条件を試験した。発現は予測分子量および電気泳動度に対応する特異的バンドが検出された場合確認されたと見なした。
細胞表面染色
フローサイトメトリー分析を以下のように行った。細菌はイムノブロット分析によって示された抗原の発現を導く培養条件下で培養した。細胞をハンクス緩衝塩類溶液 (HBSS)で２回洗浄し、細胞密度を100μl HBSS、0.5％ BSA中 およそ1 X 106 CFU となるよう調整した。30〜60分間の4℃での50〜100-倍希釈のマウス抗血清とのインキュベーションの後、未結合抗体を過剰のHBSS、0.5％ BSA中での遠心分離により除去した。フルオレセイン (FITC)で標識した二次ヤギ抗-マウス抗体 (F(ab')2 断片特異的)を細胞と4℃で30〜60分間インキュベートした。洗浄後、細胞を 2％ パラホルムアルデヒドで固定した。結合抗体をBecton Dickinson FACScan フローサイトメーターを用いて検出し、データをさらにコンピュータ プログラム CELLQuestによって分析した。陰性対照血清にはマウス免疫前血清、および肺炎連鎖球菌ゲノムインサートを含まないlamBまたはfhuA遺伝子をコードするプラスミドで形質転換したIPTG誘導後の大腸菌細胞から調製した溶解液によって作成したマウスポリクローナル 血清を含めた。
殺菌 (殺傷) アッセイ
マウスマクロファージ細胞 (RAW246.7 またはP388.D1) および細菌をインキュベートし、60分間後の生存細菌の減少をコロニー計数により測定した。簡単に説明すると、細菌をハンクス緩衝塩類溶液 (HBSS)で２回洗浄し、細胞密度を50μl HBSS中およそ1X 105 CFU に調整した。細菌をマウス血清 (25％まで)、モルモット補体 (5％まで) と総容積 100μlで60分間 4℃でインキュベートした。オプソニン化前の細菌をマクロファージと (マウス 細胞株 RAW264.7またはP388.D1; 2X 106 細胞/100μl) 1:20の比で混合し、37℃で 回転振盪機で500 rpmでインキュベートした。各サンプルのアリコートを滅菌水で希釈し、室温で5分間インキュベートし、マクロファージを溶解した。段階希釈物をTodd-Hewitt Broth寒天培地プレートに播いた。プレートを一晩37℃でインキュベートし、コロニーをCountermat フラッシュコロニーカウンター(IUL Instruments)を用いて計数した。対照血清には、マウス免疫前血清および 、肺炎連鎖球菌ゲノムインサートを含まない遺伝子lamBまたはfhuAを有するプラスミドで形質転換したIPTG誘導後の大腸菌から調製した溶解液により作ったマウス ポリクローナル血清が含まれていた。
結果
抗原のインビトロ発現
抗原性タンパク質の発現を、インビトロで肺炎連鎖球菌血清型 4において、肺炎連鎖球菌ペプチドに融合したプラットフォームタンパク質をコードするプラスミドを有する大腸菌クローンに対して作った血清を用いることによって分析した。まず、特異的抗体の存在を、 LamB または FhuA プラットフォームタンパク質に含まれた所与のエピトープを発現する大腸菌 クローン を用いてペプチド ELISAおよび/またはイムノブロッティング によって判定した。陽性血清を肺炎連鎖球菌血清型 4 株から調製した全細菌可溶化液および培養上清を用いたイムノブロッティングによって分析した (データ示さず)。この分析はタンパク質が少しでも発現するか、するとすればどのような培養条件下で発現するかを判定するための第一段階であり、この結果によってFACS 分析によるポリペプチドの表面発現の評価をする。文献データに基づくと、すべてのタンパク質がインビトロ条件下で発現するわけではないことが予測された。
肺炎連鎖球菌の細胞表面染色
いくつかの抗原性タンパク質に対する細胞表面接近可能性を、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって次に示した。連鎖球菌を免疫前および肺炎連鎖球菌溶解液または肺炎連鎖球菌ペプチドに融合したプラットフォームタンパク質をコードするプラスミドを有する大腸菌クローンに対して作ったポリクローナルマウス血清とともにインキュベートし、蛍光タグを付加した二次抗体で検出した。図6Aに示すように、肺炎連鎖球菌溶解液に対して作った抗血清は、表面成分に対する抗体を含んでおり、これは肺炎連鎖球菌血清型 4 細胞集団の蛍光における有意なシフトによって示される。肺炎連鎖球菌血清型4 細胞の同様の細胞表面染色が同定された多くの肺炎球菌抗原のペプチドに対して作られたポリクローナル血清についても観察された (図 6Bおよび表 4)。有る例では、細菌の亜集団は染色されず、これはヒストグラムにおいて２つのピークの検出によって示される(図 6B)。この現象は、細菌の増殖の際の遺伝子産物の示差的発現、不十分な抗体レベルまたはその他の表面分子または血漿タンパク質によって起こる抗体結合の部分的阻害によると考えられる。
インビトロ殺菌活性
オプソニン食作用による（Opsonophagocytic）殺傷は細胞外細菌、例えば、肺炎連鎖球菌に対する宿主防御の基礎をなす。細菌抗原への抗体の細胞表面結合は、特定の抗原によって誘導された抗体が活性化補体成分(C3bi)に結合できれば、オプソニン化であり、食細胞(マクロファージおよび好中球顆粒球)による (殺菌の)殺傷を誘導する。インビトロアッセイで測定したヒト血清の抗-肺炎球菌殺菌活性は、ワクチン化された個体のインビボでの保護 と相関している可能性があることが示されている ｛Romero-Steiner、S. et al.、1999｝。図 7において例示されており、表4に要約されているのは、対応するエピトープによってマウスにおいて作られた抗原-特異的抗体により測定された殺菌活性である。これらのデータによると、いくつかの新規な肺炎球菌抗原が機能的抗体を誘導する(例えば、SP0082、SP2216、SP2136、SP0454、SP0069、SP0369、等)。重要なことに、周知の保護肺炎抗原、PspA (SP0117)は、全く同じアッセイにおいて強く陽性であることが判明している。
これらの実験は、タンパク質の多くが、そのシグナルペプチド配列によって輸送されるという生物情報予測を確認すると共に、肺炎連鎖球菌血清型 4の細胞表面に存在することを示した。さらにこれらタンパク質は機能的特性を有するヒト抗体によって認識可能であり、肺炎球菌疾患に対するワクチン開発の有用な候補となるということも確認された。
実施例7:保護免疫応答を誘導する肺炎球菌抗原の同定
実験手順
組換え肺炎球菌タンパク質の発現
遺伝子/DNA断片のクローニング:目的の遺伝子/DNA断片を肺炎連鎖球菌(株 T4、莢膜型 4)のゲノムDNAから、遺伝子特異的プライマーを用いるPCR によって増幅した。遺伝子特異的部分の他に、プライマーは増幅PCR産物の方向性クローニングに役立つ切断部位を有していた。プライマーの遺伝子アニーリング (特異的)部分は 15-24塩基長の範囲であった。得られたPCR産物を適当な制限酵素で消化し、pET28b(+) ベクター (NOVAGEN)にクローニングした。組換えプラスミドが目的遺伝子を含むことが確認されると、発現宿主としての大腸菌 BL21 star（登録商標） 細胞 (INVITROGEN) を形質転換した。これら細胞を目的遺伝子を有効に発現するよう最適化した。
タンパク質の発現および精製: 組換えプラスミドを有する大腸菌 BL21 star 細胞を必要な培養容積中で対数期になるまで培養した。OD600nmが 0.8に達すると、培養物を1 mM IPTGで3時間 37℃で誘導した。細胞を遠心分離で回収し、凍結乾燥法、次いでBug-buster（登録商標）、NOVAGENによる細胞の破壊の組み合わせにより溶解した。溶解液を遠心分離で分離して可溶性画分(上清)と不溶性画分(ペレット)に分けた。タンパク質の位置に応じて、異なる精製手法を用いた。タンパク質が可溶性画分にある場合は、タンパク質の精製は、上記上清と Ni-アガロースビーズ(Ni-NTA-Agarose（登録商標）、QIAGEN)との結合によって行った。発現したタンパク質のCまたは Nあるいは両方の末端にペンタヒスチジン (HIS)が存在するために、それはNi-アガロースに結合するが、その他の汚染タンパク質は洗浄バッファーによってカラムから洗浄される。タンパク質を100 mM イミダゾールによって溶出し、溶出液を濃縮し、タンパク質濃度についてはBradfordによりアッセイし、PAGEおよびウェスタンブロットによって確認した。タンパク質が不溶性画分に存在する場合、ペレットを8 M 尿素を含有するバッファーに可溶化した。精製は変性条件下で行い(8M 尿素含有バッファー)、上記と同じ材料と手順を用いた。溶出液を濃縮し、すべての尿素を段階的に徐々に除くように透析した。タンパク質を SDS-PAGEで確認し、濃度はBradford法で測定した。
動物保護研究
動物: C3H (HeNHsd; A、B、C、D:アグーチ、野生型、純系)雌性マウスを用いた。
能動免疫: 50 μgの組換えタンパク質を皮下注射し、完全フロイントアジュバント (CFA)で賦活した。14日目と28日目に動物に２回、同量のタンパク質で追加免疫し、ただし不完全フロイントアジュバント (IFA)で賦活した。周知の保護抗原 PspA (SP0117）を陽性対照として用い、非免疫 (PBSまたはCFA/IFA アジュバント注射) マウスを陰性対照とした。抗体力価は35-38日目にそれぞれの組換えタンパク質を用いたELISAで測定し、200.00-1.000.000 (最終点力価)の範囲にあることが測定された。
受動免疫: 未処置マウスに150-300μlのマウス血清を腹腔内に注射し、２時間後に腹腔内に肺炎連鎖球菌を接種した。
細菌攻撃: 肺炎連鎖球菌血清型 6Bの凍結グリセロールストックを調製し、すべての実験に用いた。おおよその細胞数をOD600nmの測定により判定した。凍結グリセロールストック培養物から調製した接種菌液に存在していた実際の生細胞数を測定するために、cfuを６段階希釈を用いてプレーティングすることによって測定した。104-108 細菌/マウスを尾静脈内または腹腔内に注射した。免疫化による保護効果を攻撃の2-3週間後の生存率をモニターすることにより測定し、全動物数(10/群)の％として表した。
結果
本発明において細菌表面ディスプレーによって同定された６種類の肺炎球菌抗原について、マウス敗血症/致死性モデルにおいて保護効果を有するか調べた。最高レベルの保護は、SP2190、SP2216およびSP0667 タンパク質を表す組換え抗原による免疫化によって達成され、SP0368、SP1732 および SP0498はより低いレベルの保護を示した(図8)。受動血清移動実験(図9)によって示されるように、保護効果は抗体によって媒介されていた。特異的抗-SP2190および 抗-SP2216 抗体を与えられた未処置マウスは、陰性対照群のマウスよりも、死から保護された。重要なことに、図9に示すようにこれら抗原の組み合わせによって保護が強化された。組換え SP2190 または 組換え SP2216 (150μl 未処置血清を追加) によって作られた150 μlの免疫血清による受動免疫の結果は、100μlの各特異的抗血清 (100μl 未処置血清を追加)による血清療法と比較すると生存率が低かった。これらの実験は、これら抗原の組み合わせが、肺炎球菌疾患に対するワクチン接種に有利な効果を有することを強く支持する。
免疫化に用いた抗原は血清型 4 株由来であり、攻撃株は血清型 6Bであったので、これら実験により、抗原は交差保護性であることが示された。
SP2216、SP2190および SP1732 組換えタンパク質は、侵入型肺炎球菌疾患の回復期の患者の血清、および肺炎球菌に曝された健康な個体における血清(家庭内の子供) における非常に高いレベルの抗体を検出した(データ示さず)。細菌表面ディスプレー スクリーニングにおいてもっとも頻繁に同定された抗原はSP2216 タンパク質であった。ヒト抗体によって選択された(N-末端アミノ酸配列)または選択されなかった(C-末端アミノ酸配列)このタンパク質のサブドメインの保護性を比較することに特に興味が持たれた (図10A)。(組換え抗原として発現した)２種類のドメインによる免疫化によって、SP2216 タンパク質の免疫原性部分が保護能力を有するのに対し、選択されなかったドメインは有効でなく陰性対照 と同程度であることが明らかとなった(図10B)。この実験に基づいて細菌表面ディスプレーによって検出されたエピトープは保護性エピトープおよび細菌タンパク質の領域を同定し、この情報を用いて、本発明に記載の抗原に基づくサブユニットワクチンの合理的設計が可能である。
実施例 8:保護抗原の配列保存の判定
実験手順
イムノブロッティング
全細菌可溶化液および培養上清サンプルをインビトロで培養した肺炎連鎖球菌株から調製した。48種類の血清型を代表する60 (臨床分離株)を研究に含めた。およそ25μg全タンパク質/レーンをBioRad Mini-Protean 3 Cell電気泳動システムを用いてSDS-PAGEで分離し、タンパク質をニトロセルロースメンブレン (ECL、Amersham Pharmacia)にトランスファーした。5％ミルク中での一晩のブロッキングの後、血清型 4 株由来の組換えタンパク質、 SP2216、SP1732 およびSP2190 (および内部対照としてSP0117/PspA)での免疫化により作成した過免疫マウス血清を5,000x 希釈で添加し、HRPO 標識抗-マウス IgG を用いて検出した。
DNA 配列決定
SP1732、SP2190およびSP22126の遺伝子を肺炎連鎖球菌 (血清型4、6B、9V、14、18C、19F および23F)のゲノムDNA から、プルーフリーディングポリメラーゼ Expand (ROCHE)を用いるPCRによって増幅した。27-31塩基長の範囲の遺伝子特異的プライマーを用いて完全なオープンリーディングフレームを増幅した。得られた PCR産物をpCR（登録商標）2.1-TOPO ベクター (Invitrogen)にクローニングした。組換え プラスミド DNAをQIAprep（登録商標） miniprep kit (Qiagen)を用いて精製した後、配列を確認した(MWG)。７つの血清型に加えて、その他の41の異なる血清型からのSP2216遺伝子がPCRによって増幅され、精製したPCR産物を配列決定した。
結果
異なる臨床分離株に交差反応性である抗体を誘導する保存抗原の同定は、有効なワクチンの開発に非常に重要である。それは肺炎球菌疾患を標的とするタンパク質に基づくワクチンに特に関係がある。というのは、肺炎連鎖球菌 (肺炎球菌)の90を超える種類の血清型がヒト感染症に関係があるからである。
徹底的な分析において、すべて血清型 4 株由来のSP2216、SP2190 およびSP1732によって誘導された抗体は、イムノブロット 分析において試験したすべての異なる血清型と広く交差反応性であることが示された (図 11)。注目すべきことに、電気泳動度において変動を示したSP2190 抗原 (様々なサイズを示す) が、抗体反応性を保存しており、免疫優性エピトープが保存されていることを強く示唆する。一方、抗-PspA 抗体によっては低い交差反応性が検出され、これはこの抗原の免疫原性アミノ酸配列における既知の相違に一致している。
同定された保護抗原が、肺炎連鎖球菌の様々な血清型において保存されているかという問題を直接解決するために、SP2216、SP1732および SP2190遺伝子についてDNA 配列分析を行った。SP2216および SP1732は高度に保存されており、わずかなアミノ酸変化が検出されたに過ぎなかった。SP2216遺伝子を、47 種類の肺炎連鎖球菌血清型を表す47種類の臨床分離株から配列決定したところ、分析した２株のみにおいて１つのみのアミノ酸変化が検出された(図12)。SP1732遺伝子において、１または２のアミノ酸変化が分析した株の大部分に検出された(６つのうち４つ) (図13)。2190 抗原は図14に示すように、対応する遺伝子のアミノ酸配列において大きな可変性を示した。挿入と欠失により、異なるSP2190 変異形の間の正確なアミノ酸相同性を計算するのは困難であるが、およそ60〜90％であると見積もることが出来る。しかし、アミノ酸同一性は、図8,9および 11に示す実験に基づくと、交差反応性 および交差保護性抗体を誘導するのに十分であった。
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表１：細菌表面ディスプレーによって同定された免疫原性タンパク質
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表2：ペプチド ELISAにおけるエピトープの免疫原性
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表3:肺炎連鎖球菌株における遺伝子分布
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表4.
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図 1は、肺炎連鎖球菌特異的ヒト血清の特徴付けを示す。 図 2は、肺炎連鎖球菌血清型 4からの小断片ゲノムライブラリー、LSPn-70の特徴付けを示す。 図 3は、ビオチン化ヒト IgGを用いたMACSによる細菌細胞の選択を示す。 図 4は、同定された抗原による遺伝子分布研究の一例を示す。 図 5は、様々な年齢群および肺炎球菌疾患の経過におけるエピトープ-特異的抗体レベルの変化の例を示す。 図 6は、フローサイトメトリーによるエピトープ-特異的抗血清での細胞表面染色の例を示す。 図 7は、インビトロアッセイにおける選択されたエピトープによって誘導される抗体の殺菌活性の測定を示す。 図 8は、マウス致死性敗血症モデルにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原による能動免疫の保護効果を示す。 図 9は、マウス致死性敗血症モデルにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原によって作られた血清による受動免疫の保護効果を示す。 図 10は、SP2216 抗原における保護ドメインの同定を示す。 図 11は、保護抗原によって誘導された抗体が様々な肺炎連鎖球菌血清型と交差反応性であることを示す。 図 12は、天然SP2216 変異形のアミノ酸配列のアラインメントを示す。 図 13は、天然SP1732 変異形のアミノ酸配列のアラインメントを示す。 図 14は、天然SP2190 変異形のアミノ酸配列のアラインメントを示す。

Claims (37)

  1. 以下からなる群から選択される核酸配列を含む過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする単離核酸分子：
    a)配列番号 1、101-144から選択される核酸分子に対して少なくとも 70％の配列同一性を有する核酸分子、
    b) a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
    c) a)またはb)の核酸分子の少なくとも15の連続する塩基を含む核酸分子、
    d) a)、b)、またはc)の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
    e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c)またはd)の核酸分子とハイブリダイズしうる核酸分子。
  2. 配列同一性が少なくとも 80％、好ましくは少なくとも95％、特に100％である、請求項 1の単離核酸分子。
  3. 以下からなる群から選択される核酸配列を含む過免疫血清反応性抗原またはその断片をコードする単離核酸分子：
    a)配列番号 2-6、8、10-16、18-23、25-31、34、36、38-42、44、47-48、51、53、55-62、64、67、71-76、78-79、81-94、96-100から選択される核酸分子に対して少なくとも 96％の配列同一性を有する核酸分子、
    b) a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
    c) a)またはb)の核酸分子の少なくとも15の連続する塩基を含む核酸分子、
    d) a)、b)、またはc)の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
    e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c) またはd)の核酸とハイブリダイズしうる核酸分子。
  4. 以下からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子：
    a) 配列番号 9、17、24、32、37、43、52、54、65-66、70、80から選択される核酸分子、
    b) a)の核酸と相補的な核酸分子、
    c)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c) またはd)の核酸とハイブリダイズしうる核酸分子。
  5. 核酸が DNAである、請求項1、2、3または4のいずれかの核酸分子。
  6. 核酸がRNAである、請求項1、2、3、4、または5のいずれかの核酸分子。
  7. 核酸分子がゲノムDNA、特に肺炎連鎖球菌ゲノムDNAから単離されたものである、請求項1〜5のいずれかの単離核酸分子。
  8. 請求項1〜7のいずれかの核酸分子を含むベクター。
  9. 請求項1〜7のいずれかの核酸分子によってコードされる過免疫血清反応性抗原またはその断片の組換え発現に適したものである、請求項 8のベクター。
  10. 請求項 8 または9のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項1、2、5、6または 7のいずれかの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原およびその断片であって、該アミノ酸配列が配列番号 145、245-288からなる群から選択される過免疫血清反応性抗原およびその断片。
  12. 請求項3、5、6、または7のいずれかの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原およびその断片であって、該アミノ酸配列が、配列番号 146-150、152、154-160、162-167、169-175、178、180、182-186、188、191-192、195、197、199-206、208、211、215-220、222-223、225-238、240-244からなる群から選択される過免疫血清反応性抗原およびその断片。
  13. 請求項4、5、6、または 7のいずれかの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む過免疫血清反応性抗原およびその断片であって、該アミノ酸配列が配列番号 153、161、168、176、181、187、196、198、209-210、214、224からなる群から選択される過免疫血清反応性抗原およびその断片。
  14. 表２の列「予測免疫原性アミノ酸」および「同定された免疫原性領域の位置」; 表２の血清反応性エピトープのアミノ酸配列を含むペプチド、特に以下のアミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される過免疫血清反応性抗原の断片； 4-11、35-64、66-76、101-108、111-119 および 57-114 （配列番号 145）; 5-27、32-64、92-102、107-113、119-125、133-139、148-162、177-187、195-201、207-214、241-251、254-269、285-300、302-309、317-324、332-357、365-404、411-425、443-463、470-477、479-487、506-512、515-520、532-547、556-596、603-610、616-622、624-629、636-642、646-665、667-674、687-692、708-720、734-739、752-757、798-820、824-851、856-865 および 732-763 （配列番号 146）; 14-21、36-44、49-66、102-127、162-167、177-196、45-109 および 145-172 （配列番号 147）; 17-35、64-75、81-92、100-119、125-172、174-183、214-222、230-236、273-282、287-303、310-315、331-340、392-398、412-420、480-505、515-523、525-546、553-575、592-598、603-609、617-625、631-639、644-651、658-670、681-687、691-704、709-716、731-736、739-744、750-763、774-780、784-791、799-805、809-822、859-870、880-885、907-916、924-941、943-949、973-986、1010-1016、1026-1036、1045-1054、1057-1062、1082-1088、1095-1102、1109-1120、1127-1134、1140-1146、1152-1159、1169-1179、1187-1196、1243-1251、1262-1273、1279-1292、1306-1312、1332-1343、1348-1364、1379-1390、1412-1420、1427-1436、1458-1468、1483-1503、1524-1549、1574-1588、1614-1619、1672-1685、1697-1707、1711-1720、1738-1753、1781-1787、1796-1801、1826-1843、132-478、508-592 および 1753-1810 （配列番号 148）; 15-43、49-55、71-77、104-110、123-130、162-171、180-192、199-205、219-227、246-254、264-270、279-287、293-308、312-322、330-342、349-356、369-377、384-394、401-406、416-422、432-439、450-460、464-474、482-494、501-508、521-529、536-546、553-558、568-574、584-591、602-612、616-626、634-646、653-660、673-681、688-698、705-710、720-726、736-749、833-848、1-199、200-337、418-494 および 549-647 （配列番号 149）; 9-30、65-96、99-123、170-178 および 1-128 （配列番号 150）; 7-32、34-41、96-106、127-136、154-163、188-199、207-238、272-279、306-312、318-325、341-347、353-360、387-393、399-406、434-440、452-503、575-580、589-601、615-620、635-640、654-660、674-680、696-701、710-731、1-548 および 660-691 （配列番号 151）; 4-19、35-44、48-59、77-87、93-99、106-111、130-138、146-161 および 78-84 （配列番号 152）; 24-30、36-43、64-86、93-99、106-130、132-145、148-165、171-177、189-220、230-249、251-263、293-300、302-312、323-329、338-356、369-379、390-412 および 179-193 （配列番号 153）; 30-39、61-67、74-81、90-120、123-145、154-167、169-179、182-197、200-206、238-244、267-272 および 230-265 （配列番号 154）; 14-20、49-65、77-86 および 2-68 （配列番号 155）; 4-9、26-35、42-48、53-61、63-85、90-101、105-111、113-121、129-137、140-150、179-188、199-226、228-237、248-255、259-285、299-308、314-331、337-343、353-364、410-421、436-442 および 110-144 （配列番号 156）; 36-47、55-63、94-108、129-134、144-158、173-187、196-206、209-238、251-266、270-285、290-295、300-306、333-344、346-354、366-397、404-410、422-435、439-453、466-473、515-523、529-543、554-569、571-585、590-596、607-618、627-643、690-696、704-714、720-728、741-749、752-767、780-799、225-247 および 480-507 （配列番号 157）; 16-25、36-70、80-93、100-106 および 78-130 （配列番号 158）; 18-27、41-46、50-57、65-71、79-85、93-98、113-128、144-155、166-178、181-188、201-207、242-262、265-273、281-295、303-309、318-327 および 36-64 （配列番号 159）; 7-29、31-44、50-59、91-96、146-153、194-201、207-212、232-238、264-278、284-290、296-302、326-353、360-370、378-384、400-405、409-418、420-435、442-460、499-506、529-534、556-562、564-576、644-651、677-684、687-698、736-743、759-766、778-784、808-814、852-858、874-896、920-925、929-935、957-965、1003-1012、1021-1027、1030-1044、1081-1087、1101-1111、1116-1124、1148-1159、1188-1196、1235-1251、1288-1303、1313-1319、1328-1335、1367-1373、1431-1437、1451-1458、1479-1503、1514-1521、1530-1540、1545-1552、1561-1568、1598-1605、1617-1647、1658-1665、1670-1676、1679-1689、1698-1704、1707-1713、1732-1738、1744-1764、1-70、154-189、922-941、1445-1462 および 1483-1496 （配列番号 160）; 6-51、81-91、104-113、126-137、150-159、164-174、197-209、215-224、229-235、256-269、276-282、307-313、317-348、351-357、376-397、418-437、454-464、485-490、498-509、547-555、574-586、602-619 および 452-530 （配列番号 161）; 25-31、39-47、49-56、99-114、121-127、159-186、228-240、253-269、271-279、303-315、365-382、395-405、414-425、438-453 および 289-384 （配列番号 162）; 9-24、41-47、49-54、68-78、108-114、117-122、132-140、164-169、179-186、193-199、206-213、244-251、267-274、289-294、309-314、327-333、209-249 および 286-336 （配列番号 163）; 9-28、53-67、69-82、87-93、109-117、172-177、201-207、220-227、242-247、262-268、305-318、320-325 および 286-306 （配列番号 164）; 4-10、26-39、47-58、63-73、86-96、98-108、115-123、137-143、148-155、160-176、184-189、194-204、235-240、254-259、272-278 および 199-283 （配列番号 165）; 4-26、33-39、47-53、59-65、76-83、91-97、104-112、118-137、155-160、167-174、198-207、242-268、273-279、292-315、320-332、345-354、358-367、377-394、403-410、424-439、445-451、453-497、511-518、535-570、573-589、592-601、604-610 および 202-242 （配列番号 166）; 8-30、36-45、64-71、76-82、97-103、105-112、134-151、161-183、211-234、253-268、270-276、278-284、297-305、309-315、357-362、366-372、375-384、401-407、409-416、441-455、463-470、475-480、490-497、501-513、524-537、552-559、565-576、581-590、592-600、619-625、636-644、646-656 および 316-419 （配列番号 167）; 4-17、52-58、84-99、102-110、114-120、124-135、143-158、160-173、177-196、201-216、223-250、259-267、269-275 および 1-67 （配列番号 168）; 6-46、57-67、69-80、82-133、137-143、147-168、182-187、203-209、214-229、233-242、246-280 および 53-93 （配列番号 169）; 7-40、50-56、81-89、117-123、202-209、213-218、223-229、248-261、264-276、281-288、303-308、313-324、326-332、340-346、353-372、434-443、465-474、514-523、556-564、605-616、620-626、631-636、667-683、685-699、710-719、726-732、751-756、760-771、779-788、815-828、855-867、869-879、897-902、917-924、926-931、936-942、981-1000、1006-1015、1017-1028、1030-1039、1046-1054、1060-1066、1083-1092、1099-1112、1122-1130、1132-1140、1148-1158、1161-1171、1174-1181、1209-1230、1236-1244、1248-1254、1256-1267、1269-1276、1294-1299、1316-1328、1332-1354、1359-1372、1374-1380、1384-1390、1395-1408、1419-1425、1434-1446、1453-1460、1465-1471、1474-1493、1505-1515、1523-1537、1547-1555、1560-1567、1577-1605、1633-1651、1226-1309、1455-1536 および 1538-1605 （配列番号 170）; 4-10、31-39、81-88、106-112、122-135、152-158、177-184、191-197、221-227、230-246、249-255、303-311、317-326、337-344、346-362、365-371、430-437、439-446、453-462、474-484 および 449-467 （配列番号 171）; 9-15、24-35、47-55、122-128、160-177、188-196、202-208、216-228、250-261、272-303、318-324、327-339、346-352、355-361、368-373、108-218 および 344-376 （配列番号 172）; 6-14、17-48、55-63、71-90、99-109、116-124、181-189、212-223、232-268、270-294、297-304、319-325、340-348、351-370、372-378、388-394、406-415、421-434 および 177-277 （配列番号 173）; 21-39、42-61、65-75、79-85、108-115 および 11-38 （配列番号 174）; 4-17、26-39、61-76、103-113、115-122、136-142、158-192、197-203、208-214、225-230、237-251 および 207-225 （配列番号 175）; 5-11、27-36、42-53、62-70、74-93、95-104、114-119、127-150、153-159、173-179、184-193、199-206、222-241、248-253、257-280、289-295、313-319、322-342、349-365、368-389、393-406、408-413、426-438、447-461、463-470、476-495、532-537、543-550 および 225-246 （配列番号 176）; 4-29、68-82、123-130、141-147、149-157、178-191、203-215、269-277、300-307、327-335、359-370、374-380、382-388、393-400、410-417、434-442、483-492、497-503、505-513、533-540、564-569、601-607、639-647、655-666、693-706、712-718、726-736、752-758、763-771、774-780、786-799、806-812、820-828、852-863、884-892、901-909、925-932、943-948、990-996、1030-1036、1051-1059、1062-1068、1079-1086、1105-1113、1152-1162、1168-1179、1183-1191、1204-1210、1234-1244、1286-1295、1318-1326、1396-1401、1451-1460、1465-1474、1477-1483、1488-1494、1505-1510、1514-1521、1552-1565、1593-1614、1664-1672、1677-1685、1701-1711、1734-1745、1758-1770、1784-1798、1840-1847、1852-1873、1885-1891、1906-1911、1931-1939、1957-1970、1977-1992、2014-2020、2026-2032、2116-2134、1-348、373-490、573-767、903-1043、1155-1198、1243-1482、1550-1595、1682-1719、1793-1921 および 2008-2110 （配列番号 177）; 10-35、39-52、107-112、181-188、226-236、238-253、258-268、275-284、296-310、326-338、345-368、380-389、391-408、410-418、420-429、444-456、489-505、573-588、616-623、637-643、726-739、741-767、785-791、793-803、830-847、867-881、886-922、949-956、961-980、988-1004、1009-1018、1027-1042、1051-1069、1076-1089、1108-1115、1123-1135、1140-1151、1164-1179、1182-1191、1210-1221、1223-1234、1242-1250、1255-1267、1281-1292、1301-1307、1315-1340、1348-1355、1366-1373、1381-1413、1417-1428、1437-1444、1453-1463、1478-1484、1490-1496、1498-1503、1520-1536、1538-1546、1548-1570、1593-1603、1612-1625、1635-1649、1654-1660、1670-1687、1693-1700、1705-1711、1718-1726、1729-1763、1790-1813、1871-1881、1893-1900、1907-1935、1962-1970、1992-2000、2006-2013、2033-2039、2045-2051、2055-2067、2070-2095、2097-2110、2115-2121、2150-2171、2174-2180、2197-2202、2206-2228 および 1526-1560 （配列番号 178）; 4-17、35-48、54-76、78-107、109-115、118-127、134-140、145-156、169-174、217-226、232-240、256-262、267-273、316-328、340-346、353-360、402-409、416-439、448-456、506-531、540-546、570-578、586-593、595-600、623-632、662-667、674-681、689-705、713-724、730-740、757-763、773-778、783-796、829-835、861-871、888-899、907-939、941-955、957-969、986-1000、1022-1028、1036-1044、1068-1084、1095-1102、1118-1124、1140-1146、1148-1154、1168-1181、1185-1190、1197-1207、1218-1226、1250-1270、1272-1281、1284-1296、1312-1319、1351-1358、1383-1409、1422-1428、1438-1447、1449-1461、1482-1489、1504-1510、1518-1527、1529-1537、1544-1551、1569-1575、1622-1628、1631-1637、1682-1689、1711-1718、1733-1740、1772-1783、1818-1834、1859-1872、1-64 および 128-495 （配列番号 179）; 8-28、32-37、62-69、119-125、137-149、159-164、173-189、200-205、221-229、240-245、258-265、268-276、287-293、296-302、323-329 および
    1-95 （配列番号 180）; 9-18、25-38、49-63、65-72、74-81、94-117、131-137、139-146、149-158、162-188、191-207、217-225、237-252、255-269、281-293、301-326、332-342、347-354、363-370、373-380、391-400、415-424、441-447 および 75-107 （配列番号 181）; 4-24、64-71、81-87、96-116、121-128、130-139、148-155、166-173、176-184、203-215、231-238、243-248、256-261、280-286、288-306、314-329 および 67-148 （配列番号 182）; 4-10、19-37、46-52、62-81、83-89、115-120、134-139、141-151、168-186、197-205、209-234、241-252、322-335、339-345、363-379、385-393、403-431、434-442、447-454、459-465、479-484、487-496 および 404-420 （配列番号 183）; 10-35、46-66、71-77、84-93、96-122、138-148、154-172、182-213、221-233、245-263、269-275、295-301、303-309、311-320、324-336、340-348、351-359、375-381 および 111-198 （配列番号 184）; 14-25、30-42、47-61、67-75、81-91、98-106、114-122、124-135、148-193、209-227 および 198-213 （配列番号 185）; 5-18、45-50、82-90、97-114、116-136、153-161、163-171、212-219、221-227、240-249、267-281、311-317、328-337、375-381、390-395、430-436、449-455、484-495、538-543、548-554、556-564、580-586、596-602 および 493-606 （配列番号 186）; 9-25、28-34、37-44、61-68、75-81、88-96、98-111、119-133、138-150、152-163、168-182、186-194、200-205、216-223、236-245、257-264、279-287、293-304、311-318、325-330、340-346、353-358、365-379、399-409、444-453 および 303-391 （配列番号 187）; 16-36、55-61、66-76、78-102、121-130、134-146、150-212、221-239、255-276、289-322、329-357 および 29-59 （配列番号 188）; 8-27、68-74、77-99、110-116、124-141、171-177、202-217、221-228、259-265、275-290、293-303、309-325、335-343、345-351、365-379、384-394、406-414、423-437、452-465、478-507、525-534、554-560、611-624、628-651、669-682、742-747、767-778、782-792、804-812、820-836、79-231 および 359-451 （配列番号 189）; 5-28、39-45、56-62、67-74、77-99、110-117、124-141、168-176、200-230、237-244、268-279、287-299、304-326、329-335、348-362、370-376、379-384、390-406、420-429、466-471、479-489、495-504、529-541、545-553、561-577、598-604、622-630、637-658、672-680、682-688、690-696、698-709、712-719、724-736、738-746、759-769、780-786、796-804、813-818、860-877、895-904、981-997、1000-1014、1021-1029、1-162、206-224、254-350、414-514 および 864-938 （配列番号 190）; 4-11、19-49、56-66、68-101、109-116、123-145、156-165、177-185、204-221、226-234、242-248、251-256、259-265、282-302、307-330、340-349、355-374、377-383、392-400、422-428、434-442、462-474 および 266-322 （配列番号 191）; 14-43、45-57、64-74、80-87、106-127、131-142、145-161、173-180、182-188、203-210、213-219、221-243、245-254、304-311、314-320、342-348、354-365、372-378、394-399、407-431、436-448、459-465、470-477、484-490、504-509、531-537、590-596、611-617、642-647、723-734、740-751、754-762、764-774、782-797、807-812、824-831、838-845、877-885、892-898、900-906、924-935、940-946、982-996、1006-1016、1033-1043、1051-1056、1058-1066、1094-1108、1119-1126、1129-1140、1150-1157、1167-1174、1176-1185、1188-1201、1209-1216、1220-1228、1231-1237、1243-1248、1253-1285、1288-1297、1299-1307、1316-1334、1336-1343、1350-1359、1365-1381、1390-1396、1412-1420、1427-1439、1452-1459、1477-1484、1493-1512、1554-1559、1570-1578、1603-1608、1623-1630、1654-1659、1672-1680、1689-1696、1705-1711、1721-1738、1752-1757、1773-1780、1817-1829、1844-1851、1856-1863、1883-1895、1950-1958、1974-1990、172-354、384-448、464-644、648-728 および 1357-1370 （配列番号 192）; 8-27、68-74、77-99、110-116、124-141、169-176、201-216、220-227、258-264、274-289、292-302、308-324、334-342、344-350、364-372、377-387、399-407、416-429、445-458、471-481、483-500、518-527、547-553、604-617、621-644、662-675、767-778、809-816、15-307、350-448 および 496-620 （配列番号 193）; 4-17、24-29、53-59、62-84、109-126、159-164、189-204、208-219、244-249、274-290、292-302、308-324、334-342、344-350、378-389、391-397、401-409、424-432、447-460、470-479、490-504、521-529、538-544、549-555、570-577、583-592、602-608、615-630、635-647、664-677、692-698、722-731、733-751、782-790、793-799、56-267、337-426 および 495-601 （配列番号 194）; 12-22、49-59、77-89、111-121、136-148、177-186、207-213、217-225、227-253、259-274、296-302、328-333、343-354、374-383、424-446、448-457、468-480、488-502、507-522、544-550、553-560、564-572、587-596、604-614、619-625、629-635、638-656、662-676、680-692、697-713、720-738、779-786、833-847、861-869、880-895、897-902、911-917、946-951、959-967、984-990、992-1004、1021-1040、1057-1067、1073-1080 および 381-403 （配列番号 195）; 4-10、26-31、46-56、60-66、70-79、86-94、96-102、109-118、132-152、164-187、193-206、217-224 および 81-149 （配列番号 196）; 4-21、26-37、48-60、71-82、109-117、120-128、130-136、142-147、181-187、203-211、216-223、247-255、257-284、316-325、373-379、395-400、423-435、448-456、479-489、512-576、596-625、641-678、680-688、692-715 および 346-453 （配列番号 197）; 10-16、25-31、34-56、58-69、71-89、94-110、133-176、186-193、208-225、240-250、259-266、302-307、335-341、376-383、410-416 および 316-407 （配列番号 198）; 11-29、42-56、60-75、82-88、95-110、116-126、132-143、145-160、166-172、184-216 および 123-164 （配列番号 199）; 11-29、54-63、110-117、139-152、158-166、172-180、186-193、215-236、240-251、302-323、330-335、340-347、350-366、374-381 および 252-299 （配列番号 200）; 18-27、35-42、50-56、67-74、112-136、141-153、163-171、176-189、205-213、225-234、241-247、253-258、269-281、288-298、306-324、326-334、355-369、380-387 および 289-320 （配列番号 201）; 7-15、19-41、56-72、91-112、114-122、139-147、163-183、196-209、258-280、326-338、357-363、391-403、406-416 および 360-378 （配列番号 202）; 11-18、29-41、43-49、95-108、142-194、204-212、216-242、247-256、264-273 および 136-149 （配列番号 203）; 18-24、33-40、65-79、89-102、113-119、130-137、155-161、173-179、183-203、205-219、223-231、245-261、267-274、296-306、311-321、330-341、344-363、369-381、401-408、415-427、437-444、453-464、472-478、484-508、517-524、526-532、543-548 および 59-180 （配列番号 204）; 5-13、52-65、67-73、97-110、112-119、134-155 および 45-177 （配列番号 205）; 6-28、34-43、57-67、75-81、111-128、132-147、155-163、165-176、184-194、208-216、218-229、239-252、271-278、328-334、363-376、381-388、426-473、481-488、492-498、507-513、536-546、564-582、590-601、607-623、148-269、420-450 および 610-648 （配列番号 206）; 4-12、20-38、69-75、83-88、123-128、145-152、154-161、183-188、200-213、245-250、266-272、306-312、332-339、357-369、383-389、395-402、437-453、455-470、497-503 および 1-112 （配列番号 207）; 35-59、74-86、111-117、122-137 および 70-154 （配列番号 208）; 26-42、54-61、65-75、101-107、123-130、137-144、148-156、164-172、177-192、213-221、231-258 および 157-249 （配列番号 209）; 29-38、61-67、77-87、94-100、105-111、118-158 および 1-97 （配列番号 210）; 7-21、30-48、51-58、60-85、94-123、134-156、160-167、169-183、186-191、216-229、237-251、257-267、272-282、287-298 および 220-243 （配列番号 211）; 6-29、34-47、56-65、69-76、83-90、123-134、143-151、158-178、197-203、217-235、243-263、303-309、320-333、338-348、367-373、387-393、407-414、416-427、441-457、473-482、487-499、501-509、514-520、530-535、577-583、590-602、605-612、622-629、641-670、678-690、37-71 および 238-307 （配列番号 212）; 7-40、121-132、148-161、196-202、209-215、221-235、248-255、271-280、288-295、330-339、395-409、414-420、446-451、475-487、556-563、568-575、580-586、588-595、633-638、643-648、652-659、672-685、695-700、710-716、737-742、749-754、761-767、775-781、796-806、823-835、850-863、884-890、892-900、902-915、934-941 および 406-521 （配列番号 213）; 9-18、24-46、51-58、67-77、85-108、114-126、129-137、139-146、152-165、173-182、188-195、197-204、217-250、260-274、296-313、343-366、368-384、427-434、437-446、449-455、478-484、492-506、522-527、562-591、599-606、609-618、625-631、645-652 および 577-654 （配列番号 214）; 13-20、26-37、41-53、56-65、81-100、102-114、118-127、163-188、196-202、231-238、245-252、266-285、293-298、301-306 および 19-78 （配列番号 215）; 10-23、32-42、54-66、73-91、106-113、118-127、139-152、164-173、198-207、210-245、284-300、313-318、330-337、339-346、354-361、387-393、404-426、429-439、441-453、467-473、479-485、496-509、536-544、551-558、560-566、569-574、578-588、610-615、627-635、649-675、679-690、698-716、722-734、743-754、769-780、782-787 および 480-550 （配列番号 216）; 6-39、42-50、60-68、76-83、114-129、147-162、170-189、197-205、217-231、239-248、299-305、338-344、352-357、371-377、380-451、459-483、491-499、507-523、537-559、587-613、625-681、689-729、737-781、785-809、817-865、873-881、889-939、951-975、983-1027、1031-1055、1063-1071、1079-1099、1103-1127、1151-1185、1197-1261、1269-1309、1317-1333、1341-1349、1357-1465、1469-1513、1517-1553、1557-1629、1637-1669、1677-1701、1709-1725、1733-1795、1823-1849、1861-1925、1933-1973、1981-2025、2029-2053、2061-2109、2117-2125、2133-2183、2195-2219、2227-2271、2275-2299、2307-2315、2323-2343、2347-2371、2395-2429、2441-2529、2537-2569、2577-2601、2609-2625、2633-2695、2699-2737、2765-2791、2803-2867、2889-2913、2921-2937、2945-2969、2977-2985、2993-3009、3023-3045、3073-3099、3111-3167、3175-3215、3223-3267、3271-3295、3303-3351、3359-3367、3375-3425、3437-3461、3469-3513、3517-3541、3549-3557、3565-3585、3589-3613、3637-3671、3683-3747、3755-3795、3803-3819、3827-3835、3843-3951、3955-3999、4003-4039、4043-4115、4123-4143、4147-4171、4195-4229、4241-4305、4313-4353、4361-4377、4385-4393、4401-4509、4513-4557、4561-4597、4601-4718、4749-4768、74-171、452-559 および 2951-3061 （配列番号 217）; 16-22、30-51、70-111、117-130、137-150、171-178、180-188、191-196 および 148-181 （配列番号 218）; 6-19、21-46、50-56、80-86、118-126、167-186、189-205、211-242、244-267、273-286、290-297、307-316、320-341 および 34-60 （配列番号 219）; 5-26、33-43、48-54、58-63、78-83、113-120、122-128、143-152、157-175、185-192、211-225、227-234、244-256、270-281、284-290、304-310、330-337、348-355、362-379、384-394、429-445、450-474、483-490、511-520、537-546、548-554、561-586、590-604、613-629、149-186、285-431 および 573-659 （配列番号 220）; 5-26、49-59、61-67、83-91、102-111、145-157、185-192、267-272、279-286、292-298、306-312、134-220、235-251 および 254-280 （配列番号 221）; 5-19
    、72-79、83-92、119-124、140-145、160-165、167-182、224-232、240-252、259-270、301-310、313-322、332-343、347-367、384-398、416-429、431-446、454-461 および 1-169 （配列番号 222）; 8-17、26-31、56-62、75-83、93-103、125-131、135-141、150-194、205-217、233-258、262-268、281-286 および 127-168 （配列番号 223）; 6-12、69-75、108-115、139-159、176-182、194-214 および 46-161 （配列番号 224）; 6-13、18-27、39-48、51-59、66-73、79-85、95-101、109-116、118-124、144-164、166-177、183-193、197-204、215-223、227-236、242-249、252-259、261-270、289-301、318-325 および 12-58 （配列番号 225）; 4-10、26-32、48-60、97-105、117-132、138-163、169-185、192-214、219-231、249-261、264-270、292-308、343-356、385-392、398-404、408-417、435-441 および 24-50 （配列番号 226）; 10-40、42-48、51-61、119-126 および 1-118 （配列番号 227）; 5-17、40-58、71-83、103-111、123-140、167-177、188-204 および 116-128 （配列番号 228）; 4-9、11-50、57-70、112-123、127-138 および 64-107 （配列番号 229）; 9-39、51-67 および 1-101 （配列番号 230）; 5-14、17-25、28-46、52-59、85-93、99-104、111-120、122-131、140-148、158-179、187-197、204-225、271-283、285-293 および 139-155 （配列番号 231）; 42-70、73-90、92-108、112-127、152-164、166-172、181-199、201-210、219-228、247-274、295-302、322-334、336-346、353-358、396-414、419-425、432-438、462-471、518-523、531-536、561-567、576-589、594-612、620-631、665-671、697-710、718-731、736-756、765-771、784-801 および 626-653 （配列番号 232）; 8-28、41-51、53-62、68-74、79-85、94-100、102-108、114-120、130-154、156-162、175-180、198-204、206-213、281-294、308-318、321-339、362-368、381-386、393-399、407-415 および 2-13 （配列番号 233）; 4-39、48-65、93-98、106-112、116-129 および 10-36 （配列番号 234）; 25-32、35-50、66-71、75-86、90-96、123-136、141-151、160-179、190-196、209-215、222-228、235-242、257-263、270-280 および 209-247 （配列番号 235）; 5-29、31-38、50-57、62-75、83-110、115-132、168-195、197-206、216-242、249-258、262-269、333-340、342-350、363-368、376-392、400-406、410-421、423-430、436-442、448-454、460-466、471-476、491-496、511-516、531-536、551-556、571-576、585-591、599-605、27-70、219-293、441-504 および 512-584 （配列番号 236）; 4-12、14-34、47-75、83-104、107-115、133-140、148-185、187-196、207-212、224-256、258-265、281-287、289-296、298-308、325-333、345-355、365-371、382-395、424-435、441-457、465-472、483-491、493-505、528-534、536-546、552-558、575-584、589-600、616-623 および 576-591 （配列番号 237）; 4-76、 78-89、 91-126、 142-148、 151-191、 195-208、 211-223、 226-240、 256-277、 279-285、 290-314、 317-323、 358-377、 381-387、 391-396、 398-411、 415-434、 436-446、 454-484、 494-512、 516-523、 538-552、 559-566、 571-577、 579-596、 599-615、 620-627、 635-644、 694-707、 720-734、 737-759、 761-771 および 313-329 （配列番号 238）; 7-38、44-49、79-89、99-108、117-123、125-132、137-146、178-187、207-237、245-255、322-337、365-387、398-408、445-462、603-608、623-628、644-650、657-671、673-679 および 111-566 （配列番号 239）; 6-20、22-35、39-45、58-64、77-117、137-144、158-163、205-210、218-224、229-236、239-251、263-277、299-307、323-334、353-384、388-396、399-438、443-448、458-463、467-478、481-495、503-509、511-526、559-576、595-600、612-645、711-721、723-738、744-758、778-807 および 686-720 （配列番号 240）; 10-33、35-41、72-84、129-138、158-163、203-226、243-252、258-264、279-302、322-329、381-386、401-406、414-435 および 184-385 （配列番号 241）; 4-9、19-24、41-47、75-85、105-110、113-146 および 45-62 （配列番号 242）; 4-25、52-67、117-124、131-146、173-180、182-191、195-206、215-221、229-236、245-252、258-279、286-291、293-302、314-320、327-336、341-353、355-361、383-389 および 1-285 （配列番号 243）; 14-32、38-50、73-84、93-105、109-114 および 40-70 （配列番号 244）; 5-26 および 22-34 （配列番号 245）; 23-28 および 13-39 （配列番号 246）; 8-14 および 21-34 （配列番号 247）; 4-13、20-29、44-50、59-74 および 41-69 （配列番号 248）; 4-9、 19-42、 48-59、 71-83 および 57-91 （配列番号 249）; 4-14 および 10-28 （配列番号 250）; 22-28、32-42、63-71、81-111、149-156、158-167、172-180、182-203、219-229 および 27-49 （配列番号 251）; 17-27 および 23-32 （配列番号 252）; 18-24 および 28-38 （配列番号 253）; 9-15 および 13-27 （配列番号 254）; 13-22 および 18-29 （配列番号 255）; 17-26 および 2-11 （配列番号 256）; 4-33 および 16-32 （配列番号 257）; 4-10、37-43、54-84、92-127 および 15-62 （配列番号 258）; 4-14、20-32、35-60、69-75、79-99、101-109、116-140 および 124-136 （配列番号 259）; 2-13 （配列番号 260）; 4-13、28-42 および 42-57 （配列番号 261）; 4-14、27-44 および 14-35 （配列番号 262）; 4-12 および 1-27 （配列番号 263）; 4-18、39-45、47-74 および 35-66 （配列番号 264）; 8-20、43-77 および 17-36 （配列番号 265）; 4-30、35-45、51-57 および 35-49 （配列番号 266）; 4-24、49-57 および 15-34 （配列番号 267）; 4-22 および 8-27 （配列番号 268）; 13-25、32-59、66-80 および 21-55 （配列番号 269）; 4-10、24-33、35-42、54-65、72-82、98-108 および 15-30 （配列番号 270）; 8-19 および 17-47 （配列番号 271）; 12-18、40-46 および 31-52 （配列番号 272）; 4-20、35-78、83-102、109-122 および 74-86 （配列番号 273）; 7-17、21-41、46-63 および 2-20 （配列番号 274）; 30-37 および 2-33 （配列番号 275）; 4-13、17-25 および 1-15 （配列番号 276）; 17-31、44-51 および 20-51 （配列番号 277）; 20-30 および 5-23 （配列番号 278）; 13-33、48-71 および 92-110 （配列番号 279）; 4-9、50-69、76-88、96-106、113-118 および 12-34 （配列番号 280）; 4-24 および 6-26 （配列番号 281）; 7-26 および 14-30 （配列番号 282）; 9-39、46-68、75-82、84-103 および 26-44 （配列番号 283）; 4-30、33-107 および 58-84 （配列番号 284）; 4-12 および 9-51 （配列番号 285）; 12-18、29-37 および 6-37 （配列番号 286）; 4-21、33-52、64-71 および 16-37 （配列番号 287）; 9-19 および 2-30 （配列番号 288）; 20-37 （配列番号 245）; 8-27 （配列番号 246）; 10-27 （配列番号 247）; 42-59 および 52-69 （配列番号 248）; 63-80 および 74-91 （配列番号 249）; 11-28 （配列番号 250）; 28-49 （配列番号 251）; 15-32 （配列番号 252）; 4-20 （配列番号 253）; 10-27 （配列番号 254）; 17-34 （配列番号 255）; 1-18 （配列番号 256）; 16-33 （配列番号 257）; 16-36、30-49 および 43-62 （配列番号 258）; 122-139 （配列番号 259）; 1-18 （配列番号 260）; 41-58 （配列番号 261）; 15-35 （配列番号 262）; 2-27 （配列番号 263）; 18-36 （配列番号 265）; 34-51 （配列番号 266）; 9-27 （配列番号 268）; 22-47 （配列番号 269）; 18-36 および 29-47 （配列番号 271）; 32-52 （配列番号 272）; 72-89 （配列番号 273）; 3-20 （配列番号 274）; 3-21 および 15-33 （配列番号 275）; 1-18 （配列番号 276）; 6-23 （配列番号 278）; 93-110 （配列番号 279）; 13-34 （配列番号 280）; 7-26 および 9-26 （配列番号 281）; 16-33 （配列番号 282）; 27-44 （配列番号 283）; 67-84 （配列番号 284）; 10-33 および 26-50 （配列番号 285）; 7-25 および 19-37 （配列番号 286）; 17-37 （配列番号 287）; 3-20 および 13-30 （配列番号 288）; 62-80 および 75-93 （配列番号 145）; 92-108 （配列番号 147）; 332-349、177-200 および 1755-1777 （配列番号 148）; 109-133、149-174、260-285 および 460-485 （配列番号 149）; 26-47 および 42-64 （配列番号 150）; 22-41、35-54、115-130、306-325、401-420 および 454-478 （配列番号 151）; 22-45 （配列番号 155）; 156-174、924-940、1485-1496、1447-1462 および 1483-1498 （配列番号 160）; 457-475 （配列番号 161）; 302-325 （配列番号 163）; 288-305 （配列番号 164）; 244-266 および 260-282 （配列番号 165）; 204-225 および 220-241 （配列番号 166）; 324-345、340-361、356-377、372-393 および 388-408 （配列番号 167）; 39-64 （配列番号 168）; 54-76 および 70-92 （配列番号 169）; 1227-1247、1539-1559、1554-1574、1569-1589、1584-1604、1242-1262、1272-1292、1287-1308、1456-1477、1472-1494、1488-1510 および 1505-1526 （配列番号 170）; 351-368 （配列番号 172）; 179-200、195-216、211-232、227-248 および 243-263 （配列番号 173）; 13-37 （配列番号 174）; 208-224 （配列番号 175）; 42-64、59-81、304-328、323-348、465-489、968-992、1399-1418、1412-1431 および 2092-2111 （配列番号 177）; 1528-1547 および 1541-1560 （配列番号 178）; 184-200、367-388、382-403、409-429、425-444 および 438-457 （配列番号 179）; 27-50 および 45-67 （配列番号 180）; 114-131 および 405-419 （配列番号 183）; 113-134、129-150、145-166、161-182 および 177-198 （配列番号 184）; 495-515 （配列番号 186）; 346-358 （配列番号 187）; 208-224 （配列番号 190）; 178-194、202-223、217- 238、288-308 および 1355-1372 （配列番号 192）; 57-78 （配列番号 194）; 347-369、364-386、381-403、398-420、415-437 および 432-452 （配列番号 197）; 347-372 （配列番号 198）; 147-163 （配列番号 199）; 263-288 （配列番号 200）; 361-377 （配列番号 202）; 82-104、99-121、116-138、133-155 および 150-171 （配列番号 204）; 110-130 および 125-145 （配列番号 205）; 613-631、626-644 および 196-213 （配列番号 206）; 78-100、95-117、112-134 および 129-151 （配列番号 208）; 158-180、175-197、192-214、209-231 および 226-248 （配列番号 209）; 30-50、45-65 および 60-79 （配列番号 210）; 431-455 および 450-474 （配列番号 213）; 579-601、596-618、613-635 および 630-653 （配列番号 214）; 920-927、98-119、114-135、130-151、146-167 および 162-182 （配列番号 217）; 36-59 （配列番号 219）; 194-216 および 381-404 （配列番号 220）; 236-251 および 255-279 （配列番号 221）; 80-100 および 141-164 （配列番号 222）; 128-154 （配列番号 223）; 82-100、95-116 および 111-134 （配列番号 224）; 55-76、71-92 および 87-110 （配列番号 227）; 91-106 （配列番号 229）; 74-96 （配列番号 230）; 140-157 （配列番号 231）; 4-13 （配列番号 233）; 41-65 および 499-523 （配列番号 236）; 122-146、191-215、288-313、445-469 および 511-535 （配列番号 239）; 347-368 （配列番号 241）; 46-61 （配列番号 242）; 15-37、32-57、101-121、115-135、138-158、152-172、220-242 および 236-258 （配列番号 243）。
  15. 請求項 1〜 7のいずれかの核酸分子を発現させることを含む、請求項11〜14のいずれかの肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片の生産方法。
  16. 請求項 8または請求項 9のベクターで好適な宿主細胞を形質転換または形質移入することを含む、請求項11〜14のいずれかの肺炎連鎖球菌過免疫血清反応性抗原またはその断片を発現する細胞の生産方法。
  17. 請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片または請求項 1〜 7のいずれかの核酸分子を含む、医薬組成物、特にワクチン。
  18. 好ましくは、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性デオキシヌクレオチド(ODN)、少なくとも２つのLysLeuLysモチーフを含むペプチド、向神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン、ミョウバン、フロイント完全または不完全アジュバントまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される免疫賦活性物質をさらに含むことを特徴とする、請求項 17の医薬組成物、特にワクチン。
  19. 医薬調製物の製造、特に、肺炎連鎖球菌感染症に対するワクチンの製造のための請求項 1〜 7のいずれかの核酸分子または請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の使用。
  20. 請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の選択された部分に少なくとも結合する、抗体、または少なくともその有効な部分。
  21. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項 20の抗体。
  22. 該有効な部分がFab 断片を含む、請求項 20または21の抗体。
  23. 抗体がキメラ抗体である、請求項20〜 22のいずれかの抗体。
  24. 抗体がヒト化抗体である、請求項20〜23のいずれかの抗体。
  25. 請求項20〜24のいずれかの抗体を生産するハイブリドーマ細胞株。
  26. 以下の工程を特徴とする請求項 20の抗体の生産方法:
    請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することにより、非ヒト動物において免疫応答を開始させる工程、
    該動物から抗体を含有する体液を取り出す工程、および、
    該抗体を含有する体液をさらなる精製工程に供することにより、抗体を生産する工程。
  27. 以下の工程を特徴とする請求項 21の抗体の生産方法:
    請求項 12 〜 15のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片を、非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始させる工程、
    該動物から脾臓または脾臓細胞を取り出す工程、
    該脾臓または脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作る工程、
    該過免疫血清反応性抗原またはその断片に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローン化する工程、
    クローン化したハイブリドーマ細胞の培養および所望によりさらなる精製工程により、抗体を生産する工程。
  28. 肺炎連鎖球菌感染症の治療または予防用医薬の調製のための請求項20〜 24のいずれかの抗体の使用。
  29. 請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片に結合するアンタゴニスト。
  30. 以下の工程を含む、請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片に結合することができるアンタゴニストの同定方法:
    a)単離または固定化された請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片と、候補アンタゴニストとを、該候補アンタゴニストの該過免疫血清反応性抗原または断片への結合を可能とする条件下で、該過免疫血清反応性抗原またはその断片に対する候補アンタゴニストの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる成分の存在下で、接触させる工程;および、
    b)アンタゴニストの、過免疫血清反応性抗原またはその断片に対する結合に応答して生成したシグナルの存在または不在を検出する工程。
  31. 以下の工程を含む、請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の、その相互作用パートナーに対する相互作用活性を低減または阻害することができるアンタゴニストの同定方法:
    a) 請求項 11-14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその過免疫断片を提供する工程、
    b)該過免疫血清反応性抗原またはその断片に対する相互作用パートナー、特に、請求項20〜 24のいずれかの抗体を提供する工程、
    c)該過免疫血清反応性抗原またはその断片と該相互作用パートナーとを相互作用させ相互作用複合体を形成させる工程、
    d)候補アンタゴニストを提供する工程、
    e)候補アンタゴニストと相互作用複合体の間で競合反応を起こさせる工程、
    f)候補アンタゴニストが、過免疫血清反応性抗原またはその断片と相互作用パートナーとの相互作用活性を阻害または低減するかを判定する工程。
  32. 該過免疫血清反応性抗原またはその断片の相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための、請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の使用。
  33. 請求項 1〜 7 のいずれかの過免疫血清反応性抗原および断片をコードする核酸配列の存在または請求項 11-14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の存在を判定することを含む、請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の発現に関連する疾患のインビトロ診断方法。
  34. 請求項 1〜 7のいずれかの過免疫血清反応性抗原および断片をコードする核酸配列の存在または請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の存在を分析することを含む、細菌感染症、特に肺炎連鎖球菌感染症のインビトロ診断方法。
  35. 過免疫血清反応性抗原またはその断片に結合するペプチドの作成のための請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の使用、ここで該ペプチドがアンチカリンを含む群から選択される。
  36. 機能的核酸の製造のための請求項 11〜14のいずれかの過免疫血清反応性抗原またはその断片の使用、ここで該機能的核酸がアプタマーおよびスピーゲルマーを含む群から選択される。
  37. 機能的リボ核酸の製造のための請求項 11〜14のいずれかの核酸分子の使用、ここで該機能的リボ核酸がリボザイム、アンチセンス核酸および siRNAを含む群から選択される。
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