JP2002533123A - 新規連鎖球菌抗原 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
-
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- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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-
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Abstract
Description
として有用な肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)病原のタンパク質抗原
に関する。
者における疾患の重要な作因である。肺炎連鎖球菌は菌血症/敗血症、肺炎、髄
膜炎などの浸襲性疾患患者から多くの場合単離されるバクテリアであり、世界中
で高い罹患率と死亡率を有している。適切な抗生物質療法をもってしてさえ、肺
炎球菌感染症は今なお多くの死を招いている。抗菌剤類の出現が全体として肺炎
球菌疾患の死亡率を低下させはしたが、耐性肺炎球菌体の存在が今日世界の主要
な問題となっている。有効な肺炎球菌ワクチンは肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae
)と関連する罹患率と死亡率に大きな衝撃を与えることができるに違いない。か
かるワクチンはまた乳児と幼児の中耳炎の予防に有用となる可能性がある。
ることに集中している。80種を超える肺炎球菌莢膜血清型が抗原性の差に基づ
き同定されている。現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、最も頻繁に疾患の原因
となる23種の莢膜多糖を含んでなるが、ある種莢膜多糖の免疫原性が弱いこと
、血清型が多様であること、および経時的に、地理的に、また年齢群により血清
型の分布に差のあることなどと主として関連する重要な欠点がある。特に、既存
のワクチンと現在開発中の莢膜接合ワクチンはすべての血清型に対し幼児を守り
きれないということが、他の肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)成分の評価に駆り
立てている。莢膜多糖の免疫原性を改善することはできるが、血清型の特異性が
なお多糖をベースとするワクチンの主たる限界となっている。抗原性を保持した
免疫原性肺炎球菌タンパク質抗原をそれ自体または他の成分と組合わせて使用す
ることが、タンパク質をベースとする肺炎球菌ワクチンの可能性を提供する。
ntigen and vaccines)”として1998年5月7日に公開されたPCT公開番
号WO98/18930はある種のポリペプチドを記載し、抗原として請求して
いる。しかし、これらのポリペプチドの生物活性については何ら報告がない。
連鎖球菌抗原について不適切な面についてはなお必要性が残されている。
〜75、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体
から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一
性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
ドを含んでなるベクター、並びに当該ベクターを移入した宿主細胞および当該宿
主細胞を発現に適した条件下に培養することを含んでなるポリペプチドの製造法
が提供される。 さらに他の側面においては、本発明のポリヌクレオチドがエンコードする新規
のポリペプチドが提供される。
する;配列番号7。 図8はBVH−3Aタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号8。 図9はBVH−3B遺伝子のDNA配列であり、BVH−3の3’末端に相当
する;配列番号9。 図10はBVH−3Bタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号10。 図11はマックベクター(MacVector)配列分析ソフトウエア(バージョン6.
5)からのプログラム・クラスタル(Clustal)Wを使用して、WU2、RX1
、JNR.7/87、SP64、P4241およびA66肺炎連鎖球菌(S. pneu
moniae)株から予測されるBVH−3オープンリーディングフレームのアミノ酸
配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列があるが、記号*
および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを示す。 図12はマックベクター(MacVector)配列分析ソフトウエア(バージョン6.
5)からのプログラム・クラスタル(Clustal)Wを使用して、WU2、RX1
、JNR.7/87、SP64、P4241、A66およびSP63肺炎連鎖球
菌(S. pneumoniae)株から予測されるBVH−11オープンリーディングフレ
ームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列が
あるが、記号*および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であることを
示す。 図13は種々の肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株から予測されるBVH−1
1タンパク質のアミノ酸配列を比較描出したものである。同一性(I)および類
似性(S)の度合いはマックベクター(MacVector)配列分析ソフトウエア(バ
ージョン6.5)からのプログラム・クラスタル(Clustal)Wを使用して決定し
た。 図14は完全BVH−3遺伝子を含むDNA配列である(ヌクレオチド177
7〜4896にオープンリーディングフレーム“ORF”);配列番号11。 図15は完全BVH−11遺伝子を含むDNA配列である(ヌクレオチド45
〜2567にORF);配列番号12。 図16は完全BVH−11−2遺伝子を含むDNA配列である(ヌクレオチド
114〜2630にORF);配列番号13。 図17はBVH−11−2タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号14。 図18はSP63 BVH−3遺伝子のDNA配列である;配列番号15。 図19はSP63 BVH−3タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号1
6。 図20はBVH−3Mタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号55。 図21はBVH−3ADタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号56。 図22はL−BVH−3−ADタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号5
7。 図23はNEW12タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号58。 図24はBVH−3Cタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号59。 図25はBVH−11Mタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号60。 図26はBVH−11Aタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号61。 図27はBVH−11B(New13とも呼称)タンパク質のアミノ酸配列で
ある;配列番号62。 図28はBVH−11Cタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号63。 図29はNEW1タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号64。 図30はNEW2タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号65。 図31はNEW3タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号66。 図32はNEW4タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号67。 図33はNEW5タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号68。 図34はNEW6タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号69。 図35はNEW7タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号70。 図36はNEW8タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号71。 図37はNEW9タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号72。 図38はBVH−11−2Mタンパク質のアミノ酸配列である;配列番号73
。 図39はNEW10タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号74。 図40はNEW11タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号75。 図41はNEW21遺伝子のDNA配列である;配列番号76。 図42はNEW14タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号77。 図43はNEW15タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号78。 図44はNEW16タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号79。 図45はGBS BVH−71遺伝子のDNA配列である;配列番号80。 図46はGBS BVH−71タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号8
1。 図47はGAS BVH−71遺伝子のDNA配列である;配列番号82。 図48はGAS BVH−71タンパク質のアミノ酸配列である;配列番号8
3。
〜75、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体
から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一
性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
〜75、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体
から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも95%の同一
性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
5、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から
選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択
される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有す
るポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
5、77〜79またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配
列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有するポリペ
プチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
58、59、64、65、66、78またはそのフラグメント、類似体または誘
導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の
同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供す
る。
59、64、65、66、78またはそのフラグメント、類似体または誘導体か
ら選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性
を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79または
そのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二の
ポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコードす
る単離体ポリヌクレオチドを提供する。
、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79またはそのフ
ラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペ
プチドに少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離
体ポリヌクレオチドを提供する。
77〜79またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を
含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有するポリペプチ
ドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
はそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二
のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコード
する単離体ポリヌクレオチドを提供する。
フラグメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリ
ペプチドに少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単
離体ポリヌクレオチドを提供する。
ント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチド
に少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリ
ヌクレオチドを提供する。
グメント、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプ
チドに少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体
ポリヌクレオチドを提供する。
ト、類似体または誘導体から選択される配列を含んでなる第二のポリペプチドに
少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌ
クレオチドを提供する。
または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有
するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有
するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
は誘導体の配列を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
体または誘導体を含んでなる第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を
有するポリペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチドを提供する。
ント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポ
リペプチドに関する。
〜75、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体
から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
5、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から
選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択
されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
5、77〜79またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるア
ミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
77〜79またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ
酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
グメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられ
るポリペプチドに関する。
誘導体から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する
。
または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関
する。
は誘導体の配列を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
はそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列により特
徴づけられるポリペプチドに関する。
8、69、72、74、77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から
選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
8、69、72、74、77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から
選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
8、69、72、74、77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から
選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
7またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択されるアミノ酸配列に
より特徴づけられるポリペプチドに関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
は誘導体の配列を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
体または誘導体を含んでなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに
関する。
リペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ
・ポリペプチドに関する。
以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでな
るキメラ・ポリペプチドに関する。
16、55〜75、77〜79、81、83から選択される1種またはそれ以上
のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキ
メラ・ポリペプチドに関する;ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント
、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
、62、64、67、68、69、72、74、77から選択される1種または
それ以上のポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含ん
でなる;ただし、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体
はキメラ・ポリペプチドを形成するように結合する。
、62、64、67、68、74、77から選択される1種またはそれ以上のポ
リペプチド、またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる;ただ
し、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポ
リペプチドを形成するように結合する。
、67、68、74、77から選択される1種またはそれ以上のポリペプチド、
またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなる;ただし、該ポリペ
プチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体はキメラ・ポリペプチドを
形成するように結合する。
ドを含んでなる。 さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは2ないし4個のポリペプチ
ドを含んでなる。 さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは2ないし3個のポリペプチ
ドを含んでなる。 さらなる態様において、該キメラ・ポリペプチドは2個のポリペプチドを含ん
でなる。
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Bは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Cは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される;および Dは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; で示されるキメラ・ポリペプチドが提供される。
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Bは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Cは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される;および Dは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される。
のフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Bは配列番号10、58、60、62、64、67、68、74、77またはそ
のフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Cは配列番号10、58、60、62、64、67、68、74、77またはそ
のフラグメント、類似体または誘導体から選択される;および Dは配列番号10、58、60、62、64、67、68、74、77またはそ
のフラグメント、類似体または誘導体から選択される。
って以下の態様が存在するものを含んでなる。 さらなる態様において、Aは配列番号10、58、62、64、67、68、
74、77であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号58であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号62であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号64であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号67であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号68であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号74であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Aは配列番号77であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。
74、77であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号10であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号58であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号64であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号64であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号67であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号68であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号74であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Bは配列番号77であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。
74、77であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号10であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号58であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号62であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号64であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号67であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号68であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号74であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Cは配列番号77であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。
74、77であるか、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号10であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号58であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号62であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号64であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号67であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号68であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号74であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、Dは配列番号77であるか、またはそのフラグメント
、類似体または誘導体である。
またはそのフラグメント、類似体または誘導体であり、Bは配列番号62である
か、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。 さらなる態様において、mおよびnは0であり、Aは配列番号62であるか、
またはそのフラグメント、類似体または誘導体であり、Bは配列番号64である
か、またはそのフラグメント、類似体または誘導体である。
るヌクレオチドはすべて本発明の範囲内のものである。 さらなる態様において、本発明によるポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチ
ドは抗原性である。 さらなる態様において、本発明によるポリペプチドまたはキメラ・ポリペプチ
ドは個体に免疫応答を誘発し得る。 さらなる態様において、本発明はまた上記定義の本発明ポリペプチドまたはキ
メラ・ポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成させ得るポリペプチド
に関する。
例えば、生体サンプル中の選択されたペプチドを認識し、それに結合するが、他
の分子は実質的に認識せず、また結合しない抗体である。特異的な結合は選択さ
れたペプチドを抗原として用いるELISAアッセイにより測定することができ
る。
発明の技術分野で当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に
引用する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべてその全文を参照
により本明細書の一部とする。矛盾のある場合には、定義も含め、本明細書が優
先する。さらに、材料、方法、例示などは単なる説明であって、制限しようとす
るものではない。
体”または“類似体”とは、1個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非
保存アミノ酸残基(好ましく保存)により置換されており、かつ、天然であって
も非天然であってもよいポリペプチドを包含する。一態様において、本発明ポリ
ペプチドの誘導体および類似体は図面に示した配列またはそのフラグメントと約
70%の同一性を有するものとする。すなわち、該残基の70%が同一である。
さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は80%を超える。さらなる態様
において、ポリペプチドの相同性は85%を超える。さらなる態様において、ポ
リペプチドの相同性は90%を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの
相同性は95%を超える。さらなる態様において、ポリペプチドの相同性は99
%を超える。さらなる態様において、本発明ポリペプチドの誘導体および類似体
は約20個未満のアミノ酸残基の置換、修飾または欠失を有し、好ましくはその
個数が10個未満である。好適な置換は技術上保存として周知のもの、すなわち
、置換された残基が疎水性、サイズ、電荷または官能基などの理化学的性質を分
け持つものである。
プチドの両方を包含する。 さらに包含されるポリペプチドは、該ポリペプチドの生物学的または薬理学的
性質を変える他の化合物が融合しているもの、すなわち、半減期を増大させるポ
リエチレングリコール(PEG)、精製をし易くするリーダーまたは分泌アミノ
酸配列、プレプロ−およびプロ−配列、および(多)糖類の融合したものである
。
鎖球菌株の異なるエピトープをより有効に模倣するために、1個以上の特定アミ
ノ酸を変更することが望ましい。
、またはチオグリコール酸のアミド化、末端カルボキシのアミド化、例えば、ア
ンモニアまたはメチルアミンによるアミド化)により修飾して、安定性を備わせ
、支持体または他の分子に連結または結合する疎水性を増大させることができる
。
のヘテロおよびホモ・ポリペプチド・マルチマーである。これらのポリマー形状
は、例えば、アビジン/ビオチン、グルタルアルデヒドまたはジメチル−スーパ
ーイミデートなどの架橋剤で架橋した1個以上のポリペプチドを包含する。かか
るポリマー形状はまた組換えDNA技法により生成させたマルチシストロンmR
NAから生じた2個以上の縦列または逆方向の隣接配列を含むポリペプチドを包
含する。好ましくは、本発明ポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体
は少なくとも1個の抗原性領域、すなわち、少なくとも1個のエピトープを含ん
でなる。
ハロアセチル基、ハロゲン化ニトロアリールなどを有するポリペプチドを利用し
てもよく、その場合、該試薬はチオ基に特異的である。従って、異なるペプチド
の2個のメルカプト基間の連結は単結合であってもよいし、あるいは少なくとも
2個の炭素原子、一般には少なくとも4個であるが16個以下であり、通常約1
4個以下の炭素原子の連結基から構成されていてもよい。
体はメチオニン(Met)の開始残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドは
リーダーまたは分泌配列(シグナル配列)を含んでいない。本発明ポリペプチド
のシグナル部分は確立された分子生物学技法に従い決定することができる。一般
に、対象となるポリペプチドは連鎖球菌培養物から単離し、次いで配列決定して
成熟タンパク質の開始残基、従って成熟ポリペプチドの配列を決めてもよい。
でなり、医薬的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントと混合したワクチ
ン組成物が提供される。適切なアジュバントは油、すなわち、フロインド完全ま
たは不完全アジュバント;塩類、すなわち、AlK(SO4)2、AlNa(SO4)
2、AlNH4(SO4)2、シリカ、カオリン、炭素ポリヌクレオチド、すなわ
ち、ポリICおよびポリAUなどを包含する。好適なアジュバントはQuilAま
たはAlヒドロゲルを包含する。本発明のワクチンは注射、迅速注入、鼻咽頭吸
収、皮膚吸収により非経口投与するか、または口腔もしくは経口により投与する
ことができる。医薬的に許容し得る担体としては破傷風トキソイドも包含する。
菌感染が介在する疾患および症状の治療または予防に使用する(P.R. Murray (E
d. in chief), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken, Ma
nual of Clinical Microbiology, ASM press, Washington D.C., sixth edition
, 1995, 1482p; 出典明示により本明細書の一部とする)。一態様において、本
発明のワクチン組成物は髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の治療または予防に
使用される。一態様において、本発明のワクチン組成物は連鎖球菌感染症および
/または連鎖球菌感染、特に、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)、A群連鎖球菌
(化膿菌、pyogenes)、B群連鎖球菌(GBSまたはアガラクチエ、agalactiae
)、ディスガラクチエ(dysgalactiae)、ユベリス(uberis)、ノカルディア(
nocardia)、並びにスタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)
が介在する疾患および症状の治療または予防に使用する。さらなる態様において
、連鎖球菌感染症は肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の感染である。
球菌感染の危険性のある個体に投与する。 本出願にて使用する場合、“個体”という用語は哺乳動物を包含する。さらな
る態様において、哺乳動物はヒトである。
)の投与単位形状、より好ましくは0.01〜10μg/kg、最も好ましくは
0.1〜1μg/kgの形状で、約1週間ないし6週間の免疫間隔で1〜3回投
与する。
、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選
択されるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドをエンコードするポリ
ヌクレオチドが提供される。
オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1、3、
5、7、9、11、12、13、15、76、80、82に示したポリヌクレオ
チドである。図面に示したポリヌクレオチド配列は縮重コドンにより変化してい
てもよいが、それでもなお本発明のポリペプチドをエンコードしていることが認
められよう。従って、本発明はさらに配列間で50%の同一性を有する上記のポ
リヌクレオチド配列(またはその相補配列)にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドを提供する。一態様において、配列間の同一性は少なくとも70%である。
一態様において、配列間の同一性は少なくとも75%である。一態様において、
配列間の同一性は少なくとも80%である。一態様において、配列間の同一性は
少なくとも85%である。一態様において、配列間の同一性は少なくとも90%
である。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは緊縮条件下、すなわち、少
なくとも95%の同一性をもつ条件下でハイブリダイズし得る。さらなる態様に
おいて、同一性は97%を超える。
ドする配列番号1、3、7、9、11、12、13、15、76、80、82に
示したポリヌクレオチドである。
ドし、オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1
、3、9、11、12、13、15、76、80、82に示したポリヌクレオチ
ドである。
ドし、オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1
、3、9、11、12、13、15、76に示したポリヌクレオチドである。
ドし、オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1
、3、7、9、11、12、13、15、76に示したポリヌクレオチドである
。
ドし、オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1
、7、9、11、15、76に示したポリヌクレオチドである。
ドし、オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1
、9、11、15、76に示したポリヌクレオチドである。
ドし、オープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいてもよい配列番号1
、7、9、11に示したポリヌクレオチドである。
ドする配列番号1に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号7に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号9に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号11に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号15に示したポリヌクレオチドである。
ドする配列番号3、12、13、76に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号3に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号12に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号13に示したポリヌクレオチドである。 さらなる態様において、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをエンコー
ドする配列番号76に示したポリヌクレオチドである。
を包含する。 本発明はまた本出願に記載したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
をも包含する。
または誘導体をエンコードするポリヌクレオチドはDNA免疫化法に使用し得る
。すなわち、該ポリヌクレオチドは、注射により複製発現可能であり、その結果
生体内で抗原性ポリペプチドを生じるベクター内に取込み得るものである。例え
ば、ポリペプチドは真核細胞内で機能的なCMVプロモーターの制御下にプラス
ミドベクターに取込み得る。好ましくは、該ベクターは筋肉内に注射する。
エンコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現したポリペプチド産物を回収
することによる本発明ポリペプチドの製造法が提供される。別法として、該ポリ
ペプチドは確立された合成化学技法に従い、すなわち、オリゴペプチドを液相ま
たは固相合成し、それを結合して完全なポリペプチドを製造することができる(
ブロック連結反応)。
文献に記載されている:Sambrook et al., 分子クローニング:実験室マニュア
ル、第2版、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;分子生物学における最新プロト
コール、編者:Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc. New York;
PCRクローニング・プロトコール、分子クローニングから遺伝子工学まで、編
者:White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 pages; タン
パク質精製、原理と実際、Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3rd Edit
ion, 1993, 380 pages; 免疫学における最新プロトコール、Edited by Coligan
J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., New York; これらは出典明示により本
明細書の一部とする。
移入し、次いで、プロモーター活性化、形質転換体選択または遺伝子増幅に適す
るように改変した栄養培地中で培養する。
非染色体および合成DNA配列、例えば、バクテリアプラスミド、ファージDN
A、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAを組合わ
せて誘導したベクターなどを包含する。ポリペプチド配列はベクターの適切な部
位に取込むことができるが、その際には制限酵素を使用し、プロモーター、リボ
ソーム結合部位(コンセンサス領域またはシャイン・ダルガルノ配列)、および
必要によりオペレーター(制御要素)を含んでなる発現制御領域に操作可能に結
合するようにする。発現制御領域の個々の要素は所定の宿主とベクターに適した
ものを確立された分子生物学の原理に従って選択することができる(Sambrook e
t al., 分子クローニング:実験室マニュアル、第2版、Cold Spring Harbor, N
.Y., 1989;分子生物学における最新プロトコール、編者:Ausubel F.M. et al.
, John Wiley and Sons, Inc. New York;出典明示により本明細書の一部とする
)。適切なプロモーターはLTRまたはSV40プロモーター、大腸菌lac、
tacまたはtrpプロモーターおよびファージ・ラムダPLプロモーターなど
であるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、好ましくは複製開始
点並びに選択マーカー、すなわち、アンピシリン耐性遺伝子を組入れている。適
切なバクテリアベクターは、pET、pQE70、pQE60、pQE−9、p
bs、pD10ファージスクリプト、psiX174、ブルースクリプトSK、
pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptr
c99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5お
よび真核ベクターpブルーバックIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG
44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLなど
である。宿主細胞は細菌性のもの、すなわち、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bac
illus subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces);真菌性のもの、すな
わち、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニズ
リンス(Aspergillus nidulins);酵母、すなわち、サッカロミセス(Saccharo
myces);または真核性、すなわち、CHO、COSであってもよい。
穫し、次いで物理的または化学的手段(もし発現されたポリペプチドが培地に分
泌されなければ)により破砕し、得られる粗製の抽出物を保持し、対象のポリペ
プチドを単離する。培地または溶菌液からポリペプチドを精製するには、ポリペ
プチドの性質に従って確立された技法により、すなわち、硫安沈殿またはエタノ
ール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーなどを使用
する。最終の精製はHPLCにより達成し得る。
することができる。前者の場合、リーダーは翻訳後プロセシングにより除去して
もよい(参照:US4,431,739;US4,425,437;およびUS
4,338,397;出典明示により本明細書の一部とする)し、または発現さ
れたポリペプチドを精製した後に化学的に除去してもよい。
に肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)感染の診断テストに使用することができる。
例えば、生物サンプル中の連鎖球菌菌体の検出など数種の診断方法が可能である
が、以下の手法により実施する: a)患者から生物サンプルを入手すること; b)本発明の連鎖球菌ポリペプチドと反応し得る抗体またはそのフラグメント
を該生物サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること;そして c)連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した混合物中の抗体またはフラグメン
トを検出すること。
サンプルについての当該抗体の検出は以下のように実施することができる: a)患者から生物サンプルを入手すること; b)1種以上の本発明連鎖球菌ポリペプチドまたはそのフラグメントを該生物
サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること;そして c)連鎖球菌に特異的な抗体の存在を示す特異的に結合した混合物中の抗原ま
たはフラグメントを検出すること。
的テスト法、例えば、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫
アッセイまたはラテックス凝集アッセイなどであって、該タンパク質に特異的な
抗体が生体中に存在するかどうかを測定する実質的な方法であることは当業者の
認めるところである。
れる生物サンプルについて、かかるバクテリアの存在を検出する際に使用するD
NAプローブの設計にも使用することができる。本発明の検出方法は以下の工程
を含んでなる: a)患者から生物サンプルを入手すること; b)本発明ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードするDNA配列
をもつ1種以上のDNAプローブを該生物サンプルとインキュベートし、混合物
を形成すること;そして c)連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した混合物中のDNAプローブを検出
すること。
の循環系連鎖球菌、すなわち、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)核酸を、例えば
、ポリメラーゼ連鎖反応を用い検出するためにも使用することができる。該プロ
ーブは常套の技法を用いて合成して、固相に固定化してもよいし、あるいは検出
可能なラベルで標識してもよい。これに適用するための好適なDNAプローブは
本発明肺炎連鎖球菌の少なくとも約6個の連接したヌクレオチドに相補的な配列
をもつオリゴマーである。
能なラベルで標識すること; b)標識した抗体または標識したフラグメントを該患者に投与すること;およ
び c)連鎖球菌の存在を示す特異的に結合した患者における標識抗体または標識
フラグメントを検出すること。
体を産生するために免疫原として本発明の連鎖球菌ポリペプチドを使用すること
である。適切な抗体は適当なスクリーニング法を用い、例えば、テストモデルに
おいて連鎖球菌に対し受動的に防御する特定抗体の能力を測定することにより決
定することができる。動物モデルの一例としては、本明細書の実施例に記載した
マウスのモデルである。該抗体は全抗体であっても、その抗原結合フラグメント
であってもよく、また免疫グロブリンのどの分類のものでもよい。該抗体または
フラグメントは動物起源、特に、哺乳動物起源のもの、より具体的にはマウス、
ラットまたはヒト起源のものである。それは天然の抗体またはそのフラグメント
であり、あるいは要すれば、組換え抗体または抗体フラグメントであってもよい
。組換え抗体または抗体フラグメントという用語は、それらの抗体または抗体フ
ラグメントが分子生物学の技法により製造されたものであることを意味する。該
抗体または抗体フラグメントはポリクローナルであるか、または好ましくはモノ
クローナルである。それは肺炎連鎖球菌ポリペプチドと関連する多くのエピトー
プに特異的であってもよいが、好ましくは1個のエピトープに対して特異的であ
る。
11、BVH−11−2、BVH−28およびBVH−71と命名した新規の抗
原にも関する。本発明はまたBVH−3、BVH−11、BVH−11−2、B
VH−28およびBVH−71と命名した新規の抗原のフラグメントを含んでな
る切断型ポリペプチドにも関する。本発明はまたBVH−3、BVH−11、B
VH−11−2、BVH−28およびBVH−71と命名した新規の抗原のフラ
グメントを含んでなるキメラ・ポリペプチドにも関する。下記の参照表は本発明
抗原間の関係を要約した表である。
説明する。 肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)遺伝子BVH−3(配列番号1)のコーディ
ング領域および肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)遺伝子BVH−28(配列番号
5)のコーディング領域は、血清型6肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株SP6
4のゲノムDNAから、制限部位BglII(AGATCT)およびXbaI(TCT
AGA)の付加用塩基エクステンションを含むオリゴ体を用い、PCR(DNA
サーマル・サイクラー・ジーンアンプPCRシステム2400、パーキン・エル
マー(Perkin Elmer)、サンホセ(San Jose)、CA)により増幅した。PCR
産物はキアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット(キアゲン(QIAgen)、チャッ
ツウオース(Chatsworth)、CA)を用いてアガロースゲルから精製し、BglII
−XbaI(ファルマシア(Pharmacia)カナダ・インク、バイデフルフ(Baie d'
Urfe)、カナダ)で消化し、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで
沈殿させた。スーパーリンカーベクターpSL301(インビトロゲン(Invitr
ogen)、サンジエゴ、CA)をBglIIとXbaIで消化し、キアクイック(QIAqui
ck)ゲル抽出キット(キアゲン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsworth)、
CA)を用いてアガロースゲルから精製した。BglII−XbaIゲノムDNAフラ
グメントをBglII−XbaI pSL301ベクターに連結した。連結した生成物
をシマニス(Simanis)の方法(Hanahan, D. DNAクローニング、D.M. Glove
r (ed), pp. 109-134)に従い、大腸菌株DH5a[f80 lacZ DM15
endA1recA1 hsdR17(rK−mK+)supE44 thi−11− gyrA9
6 relA1 D(lacZYA−argF)U169](ギブコ(Gibco)BRL、ゲ
イサースバーグ(Gaithersburg)、MD)に形質転換した。BVH−3またはB
VH−28のいずれかの遺伝子を含む組換えpSL301プラスミド(rpSL
301)をキアゲン(QIAgen)キット(チャッツウオース(Chatsworth)、CA
)により精製し、DNA挿入片はヌクレオチド配列分析(タック・ダイ・デオキ
シ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ABI、フォスター・シティ、
CA)により確認した。組換えrpSL301(rpSL301)を制限酵素B
glII(AGATCT)およびXhoI(CTCGAG)により消化した。DNAフ
ラグメントBglII−XhoIはキアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット(キアゲ
ン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsworth)、CA)を用いて精製した。チ
オレドキシン−Hisタグ配列を含むpET−32c(+)発現ベクター(ノバ
ゲン(Novagen)、マジソン、WI)をBamHI(GGATCC)およびXhoI
で消化し、ゲルはキアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット(キアゲン(QIAgen
)、チャッツウオース(Chatsworth)、CA)を用いて抽出した。BglII−Xho
IDNAフラグメントをBamHI−XhoIpET−32c(+)ベクターに連結
してチオレドキシン−Hisタグ−BVH−3またはチオレドキシン−Hisタ
グ−BVH−28融合タンパク質用のコーディング配列を創製した。連結した生
成物をシマニス(Simanis)の方法(Hanahan, D. DNAクローニング、1985、
D.M. Glover (ed), pp. 109-135)に従い、大腸菌株DH5a[f80 lacZ
DM15 endA1recA1 hsdR17(rK−mK+)supE44 thi−11
− gyrA96 relA1 D(lacZYA−argF)U169](ギブコ(Gibco
)BRL、ゲイサースバーグ(Gaithersburg)、MD)に形質転換した。組換え
pET−32c(+)プラスミドはキアゲン(QIAgen)キット(チャッツウオー
ス(Chatsworth)、CA)により精製し、チオレドキシン−HisタグとDNA
挿入片の融合部位でのヌクレオチド配列はDNA配列決定法(タック・ダイ・デ
オキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ABI、フォスター・シテ
ィ、CA)により証明した。
umoniae)タンパク質遺伝子のクローニングについて説明する。 肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)タンパク質のDNAコーディング領域をヒト
成長ホルモン(hGH)遺伝子の下流位相に挿入した;該hGH遺伝子はプラス
ミドベクターpCMV−GHのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの
転写制御下にあった(Tang et al., Nature, 1992, 356: 152)。CMVプロモー
ターは大腸菌細胞内では機能しないプラスミドとするが、真核細胞内プラスミド
の管轄下では活性である。該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子をも併合してい
た。
ディング領域は、制限酵素BglII(AGATCT)およびXbaI(TCTAGA
)を用いてrpSL301(実施例1参照)から得た。消化産物はキアクイック
(QIAquick)ゲル抽出キット(キアゲン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsw
orth)、CA)を用いてアガロースゲルから精製した。融合タンパク質を創製す
るために、ヒト成長ホルモンを含むpCMV−GHベクター(テキサス大学(ダ
ラス、テキサス)生化学部門、ジョンストン(Dr. Stephen A. Johnston)研究
室)をBglIIおよびXbaIで消化し、キアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット
(キアゲン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsworth)、CA)を用いてアガ
ロースゲルから精製した。BglII−XbaI DNAフラグメントをBglII−Xba
I pCMV−GHベクターに連結し、CMVプロモーターの制御下にhGH−
BVH−3またはhGH−BVH−28融合タンパク質を創製した。連結した生
成物をシマニス(Simanis)の方法(Hanahan, D. DNAクローニング、1985、
D.M. Glover (ed), pp. 109-135)に従い、大腸菌株DH5a[f80 lacZ
DM15 endA1recA1 hsdR17(rK−mK+)supE44 thi−11
− gyrA96 relA1 D(lacZYA−argF)U169](ギブコ(Gibco
)BRL、ゲイサースバーグ(Gaithersburg)、MD)に形質転換した。組換え
pCMVプラスミドはキアゲン(QIAgen)キット(キアゲン、チャッツウオース
(Chatsworth)、CA)により精製した。
球菌(S. pneumoniae)株SP64のゲノムDNAから、制限部位BglII(AG
ATCT)およびHindIII(AAGCTT)の付加用塩基エクステンションを含
むオリゴ体を用い、PCR(DNAサーマル・サイクラー・ジーンアンプPCR
システム2400、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、サンホセ(San Jose
)、CA)により増幅した。PCR産物はキアクイック(QIAquick)ゲル抽出キ
ット(キアゲン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsworth)、CA)を用いて
アガロースゲルから精製し、制限酵素(ファルマシア(Pharmacia)カナダ・イ
ンク、バイデフルフ(Baie d'Urfe)、カナダ)で消化し、フェノール/クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。該pCMV−GHベクター(テキサス
大学(ダラス、テキサス)生化学部門、ジョンストン(Dr. Stephen A. Johnsto
n)研究室)をBglIIおよびHindIIIで消化し、キアクイック(QIAquick)ゲル
抽出キット(キアゲン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsworth)、CA)を
用いてアガロースゲルから精製した。BglII−HindIII DNAフラグメントを
BglII−HindIII pCMV−GHベクターに連結し、CMVプロモーターの制
御下にhGH−BVH−11融合タンパク質を創製した。連結した生成物をシマ
ニス(Simanis)の方法(Hanahan, D. DNAクローニング、1985、D.M. Glove
r (ed), pp. 109-135)に従い、大腸菌株DH5a[f80 lacZ DM15
endA1recA1 hsdR17(rK−mK+)supE44 thi−11− gyrA9
6 relA1 D(lacZYA−argF)U169](ギブコ(Gibco)BRL、ゲ
イサースバーグ(Gaithersburg)、MD)に形質転換した。組換えpCMVプラ
スミドはキアゲン(QIAgen)キット(キアゲン、チャッツウオース(Chatsworth
)、CA)により精製し、DNA挿入片のヌクレオチド配列はDNA配列決定法
により証明した。
ためにDNAを使用することについて説明する。 メスBALB/cマウス(チャールズ・リバー(Charles River)、セントコン
スタント(St-Constant)、ケベック、カナダ)8匹を1群とし、BVH−3、
BVH−11またはBVH−28遺伝子を含む組換えpCMV−GH100μg
により、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)発現プラス
ミドpCMV−GH−GM−CSF(テキサス大学(ダラス、テキサス)生化学
部門、ジョンストン(Dr. Stephen A. Johnston)研究室)50μgの存在下、
2−ないし3−週間間隔で50μlを3回筋肉注射し、免疫した。対照として、
一群のマウスにはpCMV−GH−GM−CSF50μgの存在下、pCMV−
GHを100μg注射した。血液サンプルは各免疫化に先立ち、また3回目の注
射7日後に眼窩から採取し、血清抗体応答はコーティング抗原としてチオレドキ
シン−His・Tag−肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)融合タンパク質を用い
、ELISAにより測定した。BVH−3、BVH−11またはBVH−28肺
炎連鎖球菌(S. pneumoniae)タンパク質をエンコードする組換えプラスミドp
CMV−GHによるDNA免疫化は、それぞれの組換えタンパク質に対し反応す
る抗体を誘発した。吸光度値がバックグランド値の0.1以上であった最大血清
希釈と定義される相互の抗体価は、4×103以上であった。
につき説明する。 配列番号1、配列番号3または配列番号5に相当するBVH−3、BVH−1
1またはBVH−28遺伝子を含む組換えpETプラスミドをエレクトロポレー
ション(ジーン・パルサーII装置、バイオ−ラッド(BIO−RAD)ラボ、ミ
ッシソウガ(Mississauga)、カナダ)により大腸菌株AD494(DE3)(
Dara−leu7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR DmalF3 F'
[lac+(lacIq)pro]trxB::Kan)(ノバゲン(Novagen)、マジソン、W
I)に形質転換した。本大腸菌株では、融合タンパク質の発現を制御するT7プ
ロモーターがT7RNAポリメラーゼ(1DE3プロファージ上に存在)により
特異的に認識されるが、該ポリメラーゼの遺伝子はイソプロピル−β−d−チオ
−ガラクトピラノシド(IPTG)により誘導し得るlacプロモーターの制御
下にある。形質転換体AD494(DE3)/rpETは、1ml当たりアンピシ
リン(シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)カナダ株式会社、オークビル(O
akville)、カナダ)100μgを含むLBブロス(ペプトン10g/L、酵母エ
キス5g/L、NaCl10g/L)中で、A600が0.6の値に達するまで
、250rpmの攪拌下に37℃で増殖させた。チオレドキシン−His・Ta
g−BVH−3、チオレドキシン−His・Tag−BVH−11またはチオレ
ドキシン−His・Tag−BVH−28融合タンパク質の産生を誘導するため
に、最終濃度1mMのIPTGの存在下にさらに2時間培養した。培養物100
mlから誘導された細胞は遠心によりペレットとし、−70℃で凍結した。
融合タンパク質を精製するには、His結合金属キレート化樹脂に固定化した二
価カチオン(Ni2+)に結合するHis・Tag配列(6個の連続的ヒスチジ
ン残基)の性質に基づくアフィニティ・クロマトグラフィーにより実施した。簡
単に説明すると、IPTGにより誘導した培養物100mLから得たペレット状
細胞を、リン酸バッファー500mM−NaCl溶液(PBS)(pH7.1)
に再懸濁し、超音波処理、20,000×gで20分間遠心して破片を除去した
。上清を濾取し(0.22μm孔径の膜)、ハイトラップ(HiTrap; 登録商標)
1mLのキレート化プレパック常用カラム(ファルマシアバイオテック(Pharma
cia Biotech)、バイデフルフ(Baie d'Urfe)、カナダ)に載せた。チオレドキ
シン−His・Tag−肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)融合タンパク質は1M
イミダゾール/500mM−NaCl−PBS(pH7.1)により溶出した。
サンプルから塩とイミダゾールを除去するために4℃でPBSに対し透析した。
大腸菌の可溶性フラクションから得られた融合タンパク質量はマイクロBCA(
ピアース(Pierce)、ロックフォード、イリノイ)により評価した。
て説明する。 メスBALB/cマウス(チャールス・リバー)8匹の群につき、キルA(Qu
ilA)アジュバント(セダーレーン(Cedarlane)ラボラトリー株式会社、ホーン
バイ、カナダ)15μgの存在下にアフィニティ精製チオレドキシン−His・
Tag−BVH−3融合タンパク質により、または対照としてPBS中キルA(
QuilA)アジュバントのみにより、3週間間隔で3回皮下注射免疫した。血液サ
ンプルは各免疫化に先立ち1日目、22日目および43日目、また3回目の注射
7日後(50日目)に眼窩洞から採取した。1週間後、マウスに3型肺炎連鎖球
菌(S. pneumoniae)株WU2約106CFUをチャレンジした。肺炎連鎖球菌
(S. pneumoniae)植菌サンプルをチョコレート寒天平板上に塗付し、CFUを
決定し、チャレンジ用量を確認した。チャレンジ後14日間と14日目に死亡例
を記録し、生存マウスは犠牲にして、その血液サンプルは肺炎連鎖球菌(S. pne
umoniae)菌体の存在について試験した。生存データを表1に示す。
在するか否かについて標準的免疫検定法により分析した。ELISAおよび免疫
ブロットでは、大腸菌により調製した組換え肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)タ
ンパク質での免疫化が、組換えおよび本来の連鎖球菌タンパク質両方と反応する
抗体を誘導することを示した。
たが、アジュバントのみを投与した対照マウスに生存したものはなかった。マウ
ス両群間の生存には有意差があった(P<0.0001、生存曲線の非パラメト
リック分析用のログ・タンク検定;P=0.0002、フイッシャーの完全検定
)。生存マウスからの血液培養はチャレンジ後14日目に陰性であった。
よびBVH−11遺伝子のクローニング、およびこれら遺伝子の分子保存性につ
いて記載する。 BVH−3またはBVH−11の異なる領域に及ぶDNAプローブにより、種
々の肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)単離体からの染色体DNAを分析した結果
、BVH−3遺伝子のコピーが1種とBVH−11遺伝子のコピーが2種存在す
ることが明らかになった。BVH−11遺伝子のコピー2種は一致せず、これら
の遺伝子を任意にBVH−11(配列番号12;ヌクレオチド45〜2567に
ORF)およびBVH−11−2(配列番号13;ヌクレオチド114〜263
0にORF)と命名した。
ルペプチドとしても知られるリーダー配列の特性を有する。リポタンパク質改変
/プロセッシング部位の共通シグナルペプチダーゼ開裂部位L−X−X−Cが配
列内に存在した。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP64からの成熟BVH−
3、BVH−11およびBVH−11−2タンパク質は、それぞれ1019個、
821個および819個のアミノ酸を有する。成熟BVH−3、命名したBVH
−3M(ヌクレオチド1837〜4896;配列番号11)、BVH−11M(
ヌクレオチド102〜2567;配列番号12)、およびBVH−11−2M(
ヌクレオチド171〜2630;配列番号13)をコードする肺炎連鎖球菌(S.
pneumoniae)遺伝子の領域は、6種または7種の肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae
)株ゲノムDNAからPCR(DNAサーマル・サイクラー・ジーンアンプPC
Rシステム2400、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、サンホセ(San Jo
se)、CA)により増幅した。血清型6の肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP6
4および血清型9のSP63臨床分離株はケベック州立衛生研究所(セントアン
デベレブ(Sainte-Anne-de-Bellevue))より提供された;血清型4株JNR.7
/87はアンドリュー・カミリー(Andrew Camilli)(タフト大学、医学部、ボ
ストン)より提供された;Rx1株、2型株D39の非莢膜化誘導体、および3
型株A66とWU2はブリルズ(David E. Briles)(アラバマ大学、バーミン
ガム)より提供された;また、3型臨床分離株P4241はラヴァル(Laval)
大学施療センター、伝染病学センター(セントホイ(Sainte-Foy))より提供さ
れた。
イマー・セット、OCRR479−OCRR480、HAMJ160−OCRR
488およびHAMJ160−HAMJ186は、それぞれBVH−3、BVH
−11およびBVH−11−2遺伝子の増幅に用いたが、例外として、SP64
株からのBVH−11遺伝子ではHAMJ487およびOCRR488からなる
プライマー・セットを用いた。プライマー配列は下記に掲載する(表2)。PC
R産物はキアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット(キアゲン(QIAgen)、チャ
ッツウオース(Chatsworth)、CA)を用いてアガロースゲルから精製し、BglI
I−XbaIまたはBglII−HindIII(ファルマシア(Pharmacia)カナダ・インク
、バイデフルフ(Baie d'Urfe)、カナダ)で消化した。消化物はキアクイック(
QIAquick)PCR精製キット(キアゲン(QIAgen)、チャッツウオース(Chatsw
orth)、CA)を用いて精製した。PCR産物はBglII−XbaIまたはBglII−
HindIII pSL301ベクターに結合した。結合産物はシマニス(Simanis)の
方法(Hanahan, D. DNAクローニング、D.M. Glover (ed), pp. 109-134)に
従い、大腸菌株DH5α[Ф80 lacZ ΔM15 endA1 recA1 hsdR
17(rK−mK+)supE44 thi−1λ− gyrA96 relA1 Δ(lac
ZYA−argF)U169](ギブコ(Gibco)BRL、ゲイサースバーグ(Gait
hersburg)、MD)に形質転換した。
プラスミド(rpSL301)はキアゲン(QIAgen)キット(チャッツウオース
(Chatsworth)、CA)を用いて精製し、DNA挿入断片の配列決定を実施した
(タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット、ABI
、フォスター・シティ、CA)。図11および12は、それぞれBVH−3から
確立した共通配列と、BVH−11の推定アミノ酸配列を描出する。BVH−3
タンパク質配列を比較すると、すべての株について配列の同一性が99〜100
%であることが明らかとなるが、例外として、血清型9のSP63株からのBV
H−3(配列番号15および配列番号16)は肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)
SP64のBVH−3’タンパク質配列上残基244〜420に相当する177
個のアミノ酸を欠失している。さらなる血清型9株の配列を分析すると、BVH
−3分子は4株の内3株が同じ欠失を有し、この3株が肺炎連鎖球菌(S. pneum
oniae)血清型9クローンのメンバーであることを示唆している。
オチド配列を比較すると、これらヌクレオチド配列が非常によく似ていることが
判明した。予測されたBVH−11タンパク質配列を重ねて整列させ、コンピュ
ーター分析(マックベクター(MacVector)、クラスタル(Clustal)W1.4)
するとこれらの配列は834個のアミノ酸鎖上、75%が同一であり、82%が
相同性であると判明した。対ごとに整列すると、80〜100%一致することが
判明した(図13)。これらの配列は体制全体で非常によく似ていることを示し
た。これらタンパク質の一次配列における可変性は、該タンパク質のC−末端部
分の最終125アミノ酸に殆ど限定される。この領域が一つのドメインを構成す
る。このドメインを精査すると、配列が2群になることが判明した。図13から
最初の9種の配列が一つの群に属し、最後の4種の配列がもう一方の群に属する
。この13種のタンパク質のドメイン配列を比較すると、39%の同一性値が得
られる(マックベクター(MacVector)、クラスタル(Clustal)W1.4)。同
一群に属する配列を比較すると、同一性値は92%を超えて増大した。
析は、BVH−3およびBVH−11に関連があることを指摘した。ドットブロ
ットハイブリダイゼーション試験において、BHV−3またはBVH−11遺伝
子配列のいずれかからなるDNAプローブが、BVH−3およびBVH−11遺
伝子の両方にハイブリダイズし、故に、このことは、BVH−3およびBVH−
11遺伝子が、相同配列を持つことを指摘している。配列の比較によって、該O
RFおよびタンパク質は、それぞれ43および33%の同一性を有することが明
らかとなった。より詳しい試験によって、BVH−3におけるアミノ酸1ないし
225におよびBVH−11における1ないし228に対応する領域は、DNA
およびタンパク質レベルで、それぞれ73および75%の同一性を有することが
明らかとなった。これに対し、BVH−3からのアミノ酸226ないし1039
およびBVH−11からのアミノ酸229ないし840に対応する3’領域は、
DNAおよびタンパク質レベルで、それぞれ34および22%の同一性しかなか
った。そしてBVH−3およびBVH−11遺伝子の5’末端は、高度に保存さ
れた配列を含むようであり、一方、該遺伝子の残りの部分は、高度に分岐してい
た。これらの結果は、BHV−3およびBVH−11が、保存領域に存在する配
列によって仲介される類似の機能を有しており、一方、BVH−3およびBVH
−11特異的機能が、分岐領域における配列によって媒介されているようである
ことを示唆している。
、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるクローニング、および切断BVH−3お
よびBVH−11分子の発現を記載する。 遺伝子フラグメントを、改変されたオリゴヌクレオチドの組を使用してPCR
によって増幅し、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP64からのBVH−3(配列
番号1および配列番号11)、BVH−11(配列番号3および配列番号12)ま
たはBVH−11−2(配列番号13)遺伝子に渡るフラグメントを増幅した。各
プライマーは、5’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって消
化されたプラスミドベクターへの増幅産物の、方向性のインフレームのクローニ
ングが可能となった(表2および3)。PCR増幅産物を制限エンドヌクレアーゼ
によって消化し、pSL301(実施例1参照)、pCMV−GH(実施例2参照)
またはpET(Novagen, Madison, WI)発現ベクターのいずれかの線形化されたプ
ラスミド(同様に消化され、または矛盾しない粘着末端を生じる酵素で消化され
た)にライゲートした。組み換えpSL301および組み換えpCMV−GHプ
ラスミドを、pET発現ベクターにおけるインフレームのクローニングのために
、制限酵素で消化した。クローンを、切断BVH−3またはBVH−11分子の
発現のために、E. coli BL21(λDE3)またはAD494(λDE3)へ導入する前に、最初
に、E. coli DH5αにおいて安定化した。
換えタンパク質を、チオレドキシンおよびHis・TagとのN末端融合として
、またはHisタグとのC末端融合として発現させた。発現された組み換えタン
パク質を、His結合金属キレート化樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を使用して
、超音波処理したIPTG誘導E. coli培養物の遠心分離から得られた上精分画
から精製した。生じた遺伝子産物を、表3に列挙する。シグナル配列を含むN末
端領域に対応する遺伝子産物を、Lipidatedタンパク質またはリポタンパク質(L
−タンパク質)と命名する。シグナル配列を欠いたN末端領域に対応する遺伝子
産物を、シグナル配列を欠いたタンパク質として同定する(w/o ss)。
−11およびBVH−11−2タンパク質エピトープを特徴付けるMabsの使
用を記載する。 メスのBALB/cマウス(Charles River)を、15μgのQuilアジュバント(
Cedarlane Lanboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、肺炎連鎖球菌(肺炎
連鎖球菌(S. pneumoniae)) 株 SP64からの、BVH−3、BVH−11またはB
VH−11−2遺伝子産物によって皮下に免疫化した。1セットのマウス(融合
実験1)を第1日および第14日に25μgのアフィニティー精製チオレドキシ
ン−His・Tag−BVH−3M融合タンパク質で免疫化した。マウスの第二
の群(融合実験2)を、25μgのアフィニティー精製チオレドキシン−His・
Tag−BVH−11Mで3週間間隔で3回免疫化した。マウスの第3の群(融
合実験3)を、25μgのアフィニティー精製チオレドキシンHis・Tag−
BVH−11−2M融合タンパク質で第1日および第15日に免疫化した。
シン−His・Tag−BVH−11−B融合タンパク質で第1日に免疫化し、
第16日におよび第37日にPBS中の組み換えBVH−11Bで静脈内注射に
よって追加免疫化した。融合の3ないし4日前に、マウスを、25μgの、PB
S単独中に懸濁されたそれぞれの抗原で静脈内に注射した。ハイブリドーマを、
先にJ. Hamel et al. [J. Med. Microbiol., 23, pp163-170(1987)]によって記
載されたように、非分泌性SP2/0ミエローマ細胞と脾臓細胞の融合によって
生成した。ハイブリドーマの培養物上清を、まず、精製組換えタンパク質または
熱で殺した肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)細胞の懸濁の製剤でコートしたプレー
トを使用して、Hamel et al.(前掲)によって記載の方法に従い酵素結合イムノア
ッセイによってスクリーニングした。次に、抗原の変化によるELISA反応に
基づき選択された陽性のハイブリドーマを、限界希釈法によってクローニングし
、増幅し(expand)、凍結した。
、BVH−3およびBVH−11遺伝子産物に対する、ELISAまたはウェス
タンイムノブロッティングによって試験した。BVH−3およびBVH−11は
、6つのMabs(H3−1−F9、H3−1−D4、H3−1−H12、H1
1−1−E7、H11−1−H10およびH11−1.1−G11)との共通の
エピトープを有し、両方のタンパク質と反応性を示した(表4)。肺炎連鎖球菌(S
. pneumoniae) SP64からのBVH−11およびBVH−11−2分子は、BVH
−11およびBVH−11−2の組換えタンパク質の両方と反応性の、BVH−
3には存在しない、Mabs(3A1、13C11、10H10、1D8、10
G9、10A2、3E8、10D7、2H7および6H7)との共通のエピトー
プを有する(表5)。
遺伝子配列から演繹されたタンパク質配列と一致する。実際、BVH−3および
BVH−11分子と交差反応性のMabsは、保存領域に対応するBVH−3C
タンパク質を認識し、BVH−11およびBVH−11−2特異的Mabsは、
これらの分子の様々な部分に位置するエピトープと反応性であった。BVH−3
およびBVH−11、並びにBVH−11およびBVH−11−2を、Mabs
との反応性によって区別できる。
11遺伝子産物の同時発現を示す。 標準的ウェスタンブロット法を、BVH−3およびBVH−11遺伝子のどち
らが肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)において発現されたか調査するために使用し
た。肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP64およびSP63を、チョコレートアガープ
レート上で、終夜37℃で5%のCO2中で成長させ、バクテリアをPBS中に
懸濁し、56℃20分で熱で殺した。抗体の調製のために、肺炎連鎖球菌(S. pn
eumoniae)の懸濁を、SDSおよび2−メルカプトエタノールを含む試料バッフ
ァーで、100℃で5分間処理した。肺炎球菌性タンパク質抗体を、Laemmli[Na
ture, 227, pp. 680-685(1970)]の方法に従って、SDS−PAGE電気泳動に
よって分離した。SDS−PAGEの後、該タンパク質を、ゲルからニトロセル
ロースペーパーに、Towbin[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp. 4350-4354(1
979)]の方法によって電気泳動的に移し、マウス抗血清またはモノクローナル抗
体で探索した。
用する間接酵素イムノアッセイによって実施した。組み換えBVH−3に対して
産生された抗血清を、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)SP64抗原に対して試験した
とき、127kDaおよび99kDaの明白な分子量を有する二つの反応バンド
を検出した。Mabs H3−1−F9、H3−1−D4、H3−1−H12、
H11−1−E7、H11−1−H10およびH−11−1.1−G11をそれ
ぞれ免疫学的プローブとして使用したとき、同じ明白な分子量を有するバンドも
検出された。これに対して、BVH−3分子に特異的なMabsは、127kD
aのバンドのみを検出し、BVH−11に特異的なMabsは、99kDaのバ
ンドのみを検出し、故に、127および99kDaのバンドの同一性をBVH−
3およびBVH−11としてそれぞれ確認した。これらの試験は、BVH−3お
よびBVH−11タンパク質は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)に同時に存在す
る証拠を提供している。さらに、この結果は、BVH−3およびBVH−11が
、両方のタンパク質に共通するエピトープ、並びにいずれかのタンパク質に限ら
れるエピトープを有するという先の観察結果と矛盾しない。
およびBVH−11−2は、それぞれ、112.5kDa、92.4kDa、お
よび91.7kDaの予想された分子量を有する、1019、821および81
9アミノ酸のタンパク質である。配列から予想された分子量およびSDS−PA
GEに基づき算出された分子量の間に不一致があるが、BVH−3は、その高分
子量によってBVH−11から区別できる。さらに、肺炎連鎖球菌(S. pneumoni
ae)株 SP63からのBVH−3分子は、SDS−PAGEにおける112kDaの
明白な分子量を有し、これに対して、SP64 株のBVH−3は127kDaであ
る。このデータは、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株 SP63のBVH−3における
177アミノ酸残基に及ぶ欠失と矛盾しない。
射された、マウスの実験的な感染における、付与された防御を記載する。 7または8匹のメスのBALB/cマウス(Charles River)の群を、アフィニ
ティー精製チオレドキシン−His・Tag−BVH−3M融合タンパク質、ア
フィニティー精製チオレドキシン−His・Tag−BVH−11M融合タンパ
ク質または、コントロールとして、PBS中のQuilAアジュバント単独のいずれ
かで3週間間隔で3回皮下に免疫化した。
niae) WU2 株で静脈内に、またはP4241 株で鼻腔内にチャレンジした。肺炎連鎖
球菌(S. pneumoniae)チャレンジ接種菌の試料を、チョコレートアガープレート
上に置き、CFUを測定し、チャレンジ用量を確認した。該チャレンジ用量は、
およそ106CFUであった。死亡を、チャレンジ後14日の期間および第14
日に記録し、生存マウスを屠殺し、血液試料を肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)微
生物の存在について試験した。該生存データを表6および7に示す。
のマウスが、WU2での感染に対して生存したが、一方、アジュバント単独を与え
られたコントロールのマウスは、生存しなかった。1匹を除いた、組み換えBV
H−3MまたはBVH−11Mタンパク質で免疫化されたすべてのマウスが、P
4241での感染に対して生存したが、一方、アジュバント単独を与えられたコ
ントロールのマウスは、1匹しか生存しなかった。生存マウスからのすべての血
球培養物は、チャレンジ後の第14日において陰性であった。これらの結果は、
BVH−3MおよびBVH−11Mの両方が、マウスにおいて防御的な抗肺炎球
菌免疫応答を誘発することを明白に指摘している。これらのタンパク質が、肺炎
連鎖球菌(S. pneumoniae)分離菌の中で高度に保存されている事実は、BVH−
3およびBVH−11の不偏的なワクチン候補としての可能性を強調している。
実際、血清群6 肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) 株 SP64からのBVH−3および
BVH−11タンパク質は、様々な莢膜血清型株での肺炎球菌感染に対する防御
を誘発した。
炎、中耳炎、菌血症および肺炎に対して防御し得る。BVH−3およびBVH−
11は、致死の全身性および肺炎感染型に対して防御性があった。故に、ヒトに
おいて、BVH−3およびBVH11タンパク質に基づくワクチンが、莢膜血清
型に関係なく実質的にすべての肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)によって引き起こ
される広いスペクトルの疾患の発病率を減少させ得ることを示唆している。
炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の防御誘発分子であったことを明白に示している。
しかし、防御が、BVH−3およびBVH−11分子に共有されない特異的配列
によって仲介されることができるか否かは、知られていなかった。メスのBAL
B/Cマウス(Charles River)の群を、15μgのQuilAアジュバント(Cedarlane
Laboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、アフィニティー精製チオレドキ
シン−His・Tag−BVH−3AD、−BVH−3Bまたは−BVH−3C
融合タンパク質のいずれかによって、3週間間隔で3回、皮下に免疫化した。コ
ントロールのマウスを、PBS中のQuilAアジュバント単独、またはQuilAの存在
下、アフィニティー精製チオレドキシン−His・Tagもしくはチオレドキシ
ン−His・Tag−融合タンパク質(His−Thio)で免疫化した。
、NEW11、NEW14およびBVH−11Bと命名した切断タンパク質の組
の防御能を測定するために、メスのBALB/cマウス(Charles River)の群を
、15μgのQuialAアジュバントの存在下、25μgのアフィニティー精製Hi
s・Tag−融合タンパク質のいずれかで、3週間間隔で2回、皮下に免疫化し
た。最後の免疫化に続いて10ないし14日、マウスを毒性肺炎連鎖球菌(S. pn
eumoniae)でチャレンジした。我々の結果は、BVH−3B(アミノ酸512−1
039からなる切断BVH−3分子)が、マウス毒性株 WU2およびP4241に対する
防御を誘発したことを指摘している。
54−840、アミノ酸286−840およびアミノ酸286−713からなる
3つの切断BVH−11分子)は、WU2での実験的な静脈内チャレンジおよびP424
1での鼻腔内チャレンジに対する防御を誘発した。さらに、BVH−11−2分
子からのアミノ酸272−838およびアミノ酸227−699からなるNEW
10およびNEW14でのワクチン接種も、肺炎球菌株による死亡に対して防御
をもたらした。これらの結果は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) SP64 BVH−
11およびBVH−11−2タンパク質配列におけるアミノ酸286−713お
よびアミノ酸272−699からの428アミノ酸を含む領域が、それぞれ防御
的エピトープを含むことを指摘している。この領域は、13のBVH−11タン
パク質配列の間に全体的な91%同一性および94%相同性を有し、高度に保存
されている。
けるBVH−3のカルボキシル末端に対応するキメラ・ポリペプチドをエンコー
ドするキメラ遺伝子のクローニングおよび発現並びにキメラ・ポリペプチドによ
るワクチン接種の後に観察された付加的な防御を記載した。 BVH−3およびBVH−11は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)に同時に存
在する、血清的に別の分子であることは、前記で記載した研究から明白である。
マウスの免疫学的研究は、両方のタンパク質が、よいワクチン候補であることを
指摘している。これらのタンパク質は、血清型に関係なく、すべての肺炎球菌に
対して防御を提供する可能性を有する。二つのタンパク質は、エピトープおよび
配列を共有するとしても、それらは、異なる性質を有し、異なる生物学的機能を
提供し得る。故に、二つのタンパク質に対する免疫化は、それぞれによって個別
に分け与えられるものよりもより高いレベルの防御を提供し得る。これを試験す
るために、全長または切断BVH−3およびBVH−11を組み合わせまたは結
合して投与するいくつかの達成方法が、探求されることができる。ここに、我々
は、BVH−3−BVH−11融合遺伝子の遺伝子操作およびNEW12と称す
るタンパク質 (それぞれ配列番号76および配列番号58)、並びにNEW12
タンパク質のワクチンとしての可能な使用を記載する。
トを、改変されたオリゴヌクレオチドの組を使用してPCRによって増幅し、そ
れぞれ肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) 株 SP64 BVH−3およびBVH−11遺
伝子からの、ヌクレオチド1414ないし3117(配列番号1)およびヌクレオ
チド1060ないし2520(配列番号3)に渡るフラグメントを増幅した。使用
したプライマー、HAMJ278およびHAMJ279;HAMJ282および
HAMJ283は、5’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによっ
て増幅産物の消化されたpET21b(+)プラスミドベクター(表2)への直接的
なインフレームなクローニングが可能となった。PCR増幅産物を制限エンドヌ
クレアーゼによって消化し、同様に消化した線形化されたプラスミドpET21
b(+)ベクターにライゲートした。得られたプラスミド構築物を、ヌクレチド配
列分析によって確認した。NdeI−HindIII BVH−3 PCR産物
を含む組換えpET21b(+)プラスミドを、BVH−11遺伝子フラグメント
を含む組み換えpET21(+)ベクターから得られたHindIII−NotI
DNAフラグメントのインフレームのクローニングのために、制限酵素Hin
dIIIおよびNotIでの消化によって線形化した。キメラ肺炎球菌タンパク
質分子の発現のためにE.coli BL21(λDE3)に導入する前に、クローンを最初にE.
coli DH5αにおいて安定化した。NEW12と称する組換えキメラペプチドを
、His−タグとのC末端融合として発現させた。発現した組み換えNEW12
タンパク質を、His結合金属キレート化樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を使用
して、超音波処理IPTG誘導E. coli培養物の遠心分離から得られた上清分画
から精製した。
w5、New1およびNew10、またはNew1およびNew14の同時発現
の結果として、他のキメラ・ポリペプチドを構築することが可能である。該構築
物は、New1と、New4、New5、New10、BVH−11BまたはN
ew14の上流または下流へのものであることができる。BVH−3、BVH−
11またはBVH−11−2のいずれかの遺伝子の二つのフラグメントより多い
同時発現の結果として、他のキメラペプチドを構築することもできる。
ジュバントの存在下、25μgのアフィニティー精製His・Tag−融合NE
W1、BVH−11BまたはNEW12タンパク質のいずれかで、3週間間隔で
2回皮下に免疫化した。最後の免疫化に続いて10ないし14日、マウスを毒性
肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)でチャレンジした。前に示したように、それぞれ
BVH−3タンパク質からのアミノ酸472ないし1039およびBVH−11
タンパク質からのアミノ酸354−840を含む、NEW1およびBVH−11
B分子は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク質の一部に対応した。
較して、有意に防御を向上させることができるかどうか決定するために、チャレ
ンジ用量を、NEW1およびBVH−11B分子によって防御が期待されないよ
うに、調節した。興味深いことに、該キメラNEW12タンパク質は、マウス毒
性株WU2およびP4241に対する防御を誘発した。NEW12で免疫化した8匹のう
ち7匹のマウスが、チャレンジの10日後なお生存し、一方、NEW1、BVH−
11B、BVH−3Mまたはアジュバント単独で免疫化した32匹のマウスのう
ち28匹が、チャレンジ後5日までに死亡した。故に、NEW12でのマウスの
ワクチン接種は、WU2チャレンジに対する最高の程度の防御を提供した。これら
の結果は、キメラ・ポリペプチドでの免疫化およびあるいはBVH−3およびB
VH−11遺伝子産物の組み合わせが、BVH−3またはBVH−11抗原単独
の投与によって取得されたものに付加的な防御を提供することのできることを指
摘している。
よびBVH−11関連配列の同定を示す。 BVH−3、BVH−11およびBVH−11−2は、共通配列を共に有する
関連するタンパク質のファミリーであることを前記で示した。相同性の探索を、
これらの遺伝子の保存領域からのヌクレオチド配列で実施し、FASTAを使用
して、GenBankおよびEMBL配列と比較した。最も有意な相同性が、B群連鎖
球菌またはGBSとも称されるS. agalactiaeにおける未知の機能の算出された
92kDaのタンパク質(配列番号81)をコードする2.469kbの遺伝子と
の間に観察された。これらの遺伝子をBVH−71と命名した。GBSのものと
99.2%の同一性および99.5%の類似性を示すタンパク質も、A群連鎖球
菌またはGASとも称されるS. pyogenesにおいて同定した(配列番号83)。B
VH−71配列の5’領域(配列番号80および配列番号82)は、ヌクレオチド
1ないし717におよび、それぞれBVH−3(ヌクレオチド1ないし675)お
よびBVH−11(ヌクレオチド1ないし684)遺伝子の保存領域と58および
60%の同一性を示した。
た配列の最初の239アミノ酸は、それぞれ、BVH−3およびBVH−11の
最初の225および228アミノ酸と51および54%の同一性があった。構造
上の類似性に加えて、連鎖球菌のBVH−3、BVH−11およびBVH−71
タンパク質は、抗原性エピトープも共有している。97kDaのバンドが、BV
H−3およびBVH−11保存領域と反応性のあるMabs H11−1.1−
G11を使用して、GASまたはGBS全細胞のウェスタンブロットにおいて明
らかになった。同様に、GASおよびGBS組み換えBVH−71タンパク質を
ウェスタンイムノブロット分析において検出した。 これらの結果は、BVH−71、BVH−3およびBVH−11タンパク質が
、同様の機能を共有していることを指摘している。我々の結果は、BVH−71
タンパク質を、抗連鎖球菌のタンパク質ワクチン構成成分として使用できること
も示唆している。さらなる実施態様において、BVH−71タンパク質を、抗G
ASまたは抗GBSワクチンのタンパク質ワクチン構成成分として使用できる。
。
4。
6。
’末端に相当する;配列番号7。
8。
’末端に相当する;配列番号9。
番号10。
(バージョン6.5)からのプログラム・クラスタル(Clustal)Wを使用して、
WU2、RX1、JNR.7/87、SP64、P4241およびA66肺炎連
鎖球菌(S. pneumoniae)株から予測されるBVH−3オープンリーディングフ
レームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列の下に共通列
があるが、記号*および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類似であること
を示す。
(バージョン6.5)からのプログラム・クラスタル(Clustal)Wを使用して、
WU2、RX1、JNR.7/87、SP64、P4241、A66およびSP
63肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株から予測されるBVH−11オープンリ
ーディングフレームのアミノ酸配列を比較描出したものである。整列させた配列
の下に共通列があるが、記号*および・はそれぞれアミノ酸残基が同一または類
似であることを示す。
れるBVH−11タンパク質のアミノ酸配列を比較描出したものである。同一性
(I)および類似性(S)の度合いはマックベクター(MacVector)配列分析ソ
フトウエア(バージョン6.5)からのプログラム・クラスタル(Clustal)Wを
使用して決定した。
レオチド1777〜4896にオープンリーディングフレーム“ORF”);配
列番号11。
クレオチド45〜2567にORF);配列番号12。
(ヌクレオチド114〜2630にORF);配列番号13。
配列番号14。
列番号15。
る;配列番号16。
番号55。
列番号56。
る;配列番号57。
号58。
番号59。
列番号60。
列番号61。
アミノ酸配列である;配列番号62。
列番号63。
64。
65。
66。
67。
68。
69。
70。
71。
72。
;配列番号73。
号74。
号75。
。
号77。
号78。
号79。
列番号80。
る;配列番号81。
列番号82。
る;配列番号83。
Claims (32)
- 【請求項1】 配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、
77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択
される配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性を有するポ
リペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチド。 - 【請求項2】 当該ポリヌクレオチドが該第二のポリペプチドに少なくとも
95%の同一性を有するポリペプチドをエンコードする請求項1記載のポリヌク
レオチド。 - 【請求項3】 配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、
77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択
される配列を有するポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成し得るポ
リペプチドをエンコードする単離体ポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 請求項1記載のポリヌクレオチドに相補的である単離体ポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項5】 請求項3記載のポリヌクレオチドに相補的である単離体ポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項6】 当該ポリヌクレオチドがDNAである請求項1記載のポリヌ
クレオチド。 - 【請求項7】 当該ポリヌクレオチドがDNAである請求項3記載のポリヌ
クレオチド。 - 【請求項8】 当該ポリヌクレオチドがRNAである請求項1記載のポリヌ
クレオチド。 - 【請求項9】 当該ポリヌクレオチドがRNAである請求項3記載のポリヌ
クレオチド。 - 【請求項10】 請求項1記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターで
あって、当該DNAが発現制御領域に操作可能に結合しているベクター。 - 【請求項11】 請求項3記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターで
あって、当該DNAが発現制御領域に操作可能に結合しているベクター。 - 【請求項12】 請求項10記載のベクターを移入した宿主細胞。
- 【請求項13】 請求項11記載のベクターを移入した宿主細胞。
- 【請求項14】 ポリペプチドの製造法であって、当該ポリペプチドの発現
に適した条件下に請求項12記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。 - 【請求項15】 ポリペプチドの製造法であって、当該ポリペプチドの発現
に適した条件下に請求項13記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。 - 【請求項16】 配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75
、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選
択されるアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドに少なくとも70%の同一性
を有する単離体ポリペプチド。 - 【請求項17】 配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75
、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選
択される配列を有する第二のポリペプチドに対し結合特異性を有する抗体を生成
し得る単離体ポリペプチド。 - 【請求項18】 配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75
、77〜79、81、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選
択されるアミノ酸配列を有する単離体ポリペプチド。 - 【請求項19】 請求項18記載のポリペプチドであって、そのN−末端M
et残基が欠失している単離体ポリペプチド。 - 【請求項20】 請求項18記載のポリペプチドであって、その分泌アミノ
酸残基が欠失している単離体ポリペプチド。 - 【請求項21】 配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75
、77〜79、81、83から選択される1種またはそれ以上のポリペプチド、
またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチ
ドであって、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体がキ
メラ・ポリペプチドを形成するように結合しているキメラ・ポリペプチド。 - 【請求項22】 配列番号10、58、60、62、64、67、68、6
9、72、74、77から選択される1種またはそれ以上のポリペプチド、また
はそのフラグメント、類似体または誘導体を含んでなるキメラ・ポリペプチドで
あって、該ポリペプチドまたはそのフラグメント、類似体または誘導体がキメラ
・ポリペプチドを形成するように結合しているキメラ・ポリペプチド。 - 【請求項23】 式(I): A−(B)m−(C)n−D (I) ただし、 mは0または1である; nは0または1である; Aは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Bは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Cは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される;および Dは配列番号2、4、6、8、10、14、16、55〜75、77〜79、8
1、83またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; で示されるキメラ・ポリペプチド。 - 【請求項24】 式(I): A−(B)m−(C)n−D (I) ただし、 mは0または1である; nは0または1である; Aは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Bは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; Cは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される;および Dは配列番号10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、
77またはそのフラグメント、類似体または誘導体から選択される; で示されるキメラ・ポリペプチド。 - 【請求項25】 請求項16ないし24のいずれかに記載のポリペプチドお
よび医薬的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントを含んでなるワクチン
組成物。 - 【請求項26】 髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の感染に罹患する可能
性のある個体における髄膜炎、中耳炎、菌血症または肺炎の治療的または予防的
処置方法であって、請求項25に記載の組成物の治療量または予防量を当該個体
に投与することを特徴とする方法。 - 【請求項27】 連鎖球菌感染に罹患する可能性のある個体における連鎖球
菌による細菌感染の治療的または予防的処置方法であって、請求項25に記載の
組成物の治療量または予防量を当該個体に投与することを特徴とする方法。 - 【請求項28】 当該個体が哺乳動物である請求項26に記載の方法。
- 【請求項29】 当該個体がヒトである請求項27に記載の方法。
- 【請求項30】 当該細菌感染が肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)、A群連
鎖球菌(化膿菌、pyogenes)、B群連鎖球菌(GBSまたはアガラクチエ、agal
actiae)、ディスガラクチエ(dysgalactiae)、ユベリス(uberis)、ノカルデ
ィア(nocardia)またはスタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu
s)である請求項22に記載の方法。 - 【請求項31】 当該細菌感染が肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)によるも
のである請求項26に記載の方法。 - 【請求項32】 連鎖球菌感染症に罹患する可能性のあるまたは感染してい
る動物において、該組成物の治療量または予防量を当該動物に投与することを含
んでなる連鎖球菌感染症の予防的または治療的処置のための請求項25記載のワ
クチン組成物の使用。
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