KR20010104693A - 신규한 스트렙토코커스 항원 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스트렙토코커스 단백질 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기 단백질은 항원성이고 그러므로 동물에서의 스트렙토코커스 감염의 예방 또는 질병을 위한 유용한 백신 성분이다. 또한, 본 발명은 스트렙토코커스 박테리아 감염을 감지하는 진단 검정법 뿐 아니라, 단백질 항원을 제조하는 재조합 방법에 관한 것이다.
Description
S. 뉴모니애는 사람 특히 유아, 노인 및 면역력이 떨어진 사람에게 주요한 발병 요인이다. 상기 병원균은 전세계적으로 높은 발병율 및 사망율을 갖는 균혈증 (bacteraemia) /패혈증(septicaemia), 폐렴(pneumonia), 뇌막염(meningitis) 등의 침입성 질병의 환자로 부터 자주 검출된다. 심지어 적절한 항생제 치료가 병행되어도, 폐렴 구균(peumococcal)의 감염은 여전히 높은 사망율을 나타낸다. 비록 항미생물성 약물의 출현이 전반적인 폐렴 구균성 질병으로 인한 사망율을 감소시켰다 하더라도 저항성을 갖는 폐렴 구균성 미생물의 존재는 오늘날 세계적으로 주요 문제가 되고 있다. 효과적인 폐렴 구균 백신은S. 뉴모니애로 인한 발병율 및 사망율에 주요 효과를 가져야 한다. 또한, 상기 백신은 유아와 어린이의 중이염(otitis media)을 막는데에도 잠재적으로 유용하다.
폐렴 구균 백신을 개발하기 위한 노력은 일반적으로 폐렴 구균 외피 다당류에 면역 반응을 유발하는 것으로 집약될 수 있다. 80개 이상의 폐렴 구균 외피 혈청형(serotype)이 항원적으로 차이점을 가진다는 사실은 알려져왔다. 현재 입수 가능한 폐렴 구균 백신은 가장 빈번하게 질병을 유발하는 23 외피 다당류를 포함하는데, 몇몇 외피 다당류의 낮은 면역 유발력, 및 혈청형의 다양성 및 시간에 따른 혈청형 분포의 차이, 위치 영역 및 연령 그룹과 관련된 중요한 단점들을 가지고 있다. 특히, 모든 혈청형에 대하여 어린이들을 보호하기 위한 기존의 백신 및 현재 개발중인 외피 융합 백신은 효과가 낮아 다른S. 뉴모니애성분의 조사를 측정하였다. 비록 외피 다당류의 면역 유발능이 향상될 수 있다하더라도, 혈청형 특이성은 여전히 다당류-원류 백신의 주요 한계점일 것이다. 항원적으로 공통된 면역 유발 폐렴 구균 단백질 항원 단독 또는 부가적인 성분과 결합된 형태로의 사용은 단백질-원류의 폐렴 구균 백신의 효과 상승 가능성을 제공한다.
1998년 5월 7일자에 "스트렙토코커스 뉴모니애 항원 및 백신" 의 명칭으로 공개된 PCT 공개 번호 제WO98/18930호는 항원성을 갖는다고 주장된 특정 폴리펩타이드에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 상기 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 보고되지 않았다.
따라서, 스트렙토코커스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 성분으로써 사용될 수 있는 스트렙토코커스 항원에 대한 요구는 충족되지 않은 상태로 남아있는 실정이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 발현 조절 영역에 조작적으로 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 발현에 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 신규한 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 항원에 관한 것으로, 좀 더 자세하게는 치료 및/또는 예방을 위한 백신 성분으로 유용한 스트렙토코커스 뉴모니애(streptococcus pneumoniae) 병원균(pathogen)의 단백질 항원에 관한 것이다.
도 1은 서열번호 1로 표시되는 BVH-3 유전자의 DNA 서열이다.
도 2는 서열번호 2로 표시되는 BVH-3 단백질의 아미노산 서열이다.
도 3은 서열번호 3으로 표시되는 BVH-11 유전자의 DNA 서열이다.
도 4는 서열번호 4로 표시되는 BVH-11 단백질의 아미노산 서열이다.
도 5는 서열번호 5로 표시되는 BVH-28 유전자의 DNA 서열이다.
도 6은 서열번호 6으로 표시되는 BVH-28 단백질의 아미노산 서열이다.
도 7은 BVH-3의 5' 말단에 상응하는 서열번호 7로 표시되는 BVH-3A 유전자의 DNA 서열이다.
도 8은 서열번호 8로 표시되는 BVH-3A 단백질의 아미노산 서열이다.
도 9는 BVH-3의 3' 말단에 상응하는 서열번호 9로 표시되는 BVH-3B 유전자의 DNA 서열이다.
도 10은 서열번호 10으로 표시되는 BVH-3B 단백질의 아미노산 서열이다.
도 11a, b, c 및 d는 맥벡터 서열 분석 소프트웨어(버전 6.5; MacVector sequence analysis software)의 Clustal W 프로그램을 사용하여 WU2, RX1, JNR. 7/87, SP64, P4241 및 A66S. 뉴모니애균주의 BVH-3 ORF(Open Reading Frame)의 예측된 아미노산 서열을 비교한 것이다. 비교 결과 * 로 표시되는 공통 부분, . 로 표시되는 동일 부분 및 유사한 아미노산 잔기가 존재한다.
도 12a, b, c 및 d는 맥벡터 서열 분석 소프트웨어(버전 6.5)의 Clustal W 프로그램을 사용하여 WU2, RX1, JNR. 7/87, SP64, P4241 및 A66 및 SP63S. 뉴모니애균주의 BVH-11 ORF의 예측 아미노산 서열을 비교한 것이다. 비교 결과 * 로 표시되는 공통 부분, . 로 표시되는 동일 부분 및 유사한 아미노산 잔기가 존재한다.
도 13은 다양한S. 뉴모니애균주의 BVH-11 단백질의 예상된 아미노산 서열을 비교한 것이다. 동일성(I) 및 유사성(S)의 정도는 맥벡터 서열 분석 소프트웨어(버전 6.5)을 사용하여 결정되었다.
도 14a 및 b는 서열번호 11로 표시되는 완전한 BVH-3 유전자(뉴클레오타이드 1777 내지 4896의 ORF)를 포함하는 DNA 서열이다.
도 15는 서열번호 12로 표시되는 완전한 BVH-11 유전자(뉴클레오타이드 45 내지 2567의 ORF)를 포함하는 DNA 서열이다.
도 16은 서열번호 13으로 표시되는 완전한 BVH-11-2 유전자(뉴클레오타이드 114 내지 2630의 ORF)를 포함하는 DNA 서열이다.
도 17은 서열번호 14로 표시되는 BVH-11-2 단백질의 아미노산 서열이다.
도 18은 서열번호 15로 표시되는 SP63 BVH-3 유전자의 DNA 서열이다.
도 19는 서열번호 16으로 표시되는 SP63 BVH-3 단백질의 아미노산 서열이다.
도 20은 서열번호 55로 표시되는 BVH-3M 단백질의 아미노산 서열이다.
도 21은 서열번호 56으로 표시되는 BVH-3AD 단백질의 아미노산 서열이다.
도 22는 서열번호 57로 표시되는 L-BVH-3-AD 단백질의 아미노산 서열이다.
도 23은 서열번호 58로 표시되는 NEW12 단백질의 아미노산 서열이다.
도 24는 서열번호 59로 표시되는 BVH-3C 단백질의 아미노산 서열이다.
도 25는 서열번호 60으로 표시되는 BVH-11M 단백질의 아미노산 서열이다.
도 26은 서열번호 61로 표시되는 BVH-11A 단백질의 아미노산 서열이다.
도 27은 서열번호 62로 표시되는 BVH-11B(New13으로도 명명) 단백질의 아미노산 서열이다.
도 28은 서열번호 63으로 표시되는 BVH-11C 단백질의 아미노산 서열이다.
도 29는 서열번호 64로 표시되는 New1 단백질의 아미노산 서열이다.
도 30은 서열번호 65로 표시되는 New2 단백질의 아미노산 서열이다.
도 31은 서열번호 66으로 표시되는 New3 단백질의 아미노산 서열이다.
도 32는 서열번호 67로 표시되는 New4 단백질의 아미노산 서열이다.
도 33은 서열번호 68로 표시되는 New5 단백질의 아미노산 서열이다.
도 34는 서열번호 69로 표시되는 New6 단백질의 아미노산 서열이다.
도 35는 서열번호 70로 표시되는 New7 단백질의 아미노산 서열이다.
도 36은 서열번호 71로 표시되는 New8 단백질의 아미노산 서열이다.
도 37은 서열번호 72로 표시되는 New9 단백질의 아미노산 서열이다.
도 38은 서열번호 73으로 표시되는 BVH-11-2M 단백질의 아미노산 서열이다.
도 39는 서열번호 74로 표시되는 New10 단백질의 아미노산 서열이다.
도 40은 서열번호 75로 표시되는 New11 단백질의 아미노산 서열이다.
도 41a 및 b은 서열번호 76으로 표시되는 New12 유전자의 DNA 서열이다.
도 42는 서열번호 77로 표시되는 New14 단백질의 아미노산 서열이다.
도 43은 서열번호 78로 표시되는 New15 단백질의 아미노산 서열이다.
도 44는 서열번호 79로 표시되는 New16 단백질의 아미노산 서열이다.
도 45는 서열번호 80으로 표시되는 GBS BVH-71 유전자의 DNA 서열이다.
도 46은 서열번호 81로 표시되는 GBS BVH-71 단백질의 아미노산 서열이다.
도 47은 서열번호 82로 표시되는 GAS BVH-71 유전자의 DNA 서열이다.
도 48은 서열번호 83으로 표시되는 GAS BVH-71 단백질의 아미노산 서열이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 8, 10, 16, 55, 56, 57, 58, 59, 64, 65, 66, 78 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 8, 10, 16, 55, 56, 57, 59, 64, 65, 66, 78 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 4, 14, 58, 60, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 4, 14, 60, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
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한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10, 55 내지 75, 77, 78, 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 55 내지 75, 77, 78, 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 10, 14, 16 또는 이들의 절편,유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 14, 16 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 4 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 14 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 16 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 58 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 60 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 67 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 68 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 69 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 72 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 74 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 10, 14, 16 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 4 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 14 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 16 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10, 55 내지 75, 77, 78, 79 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 10, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 58 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 67 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 68 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 74 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 서열번호 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체 서열을 포함하는 아미노산 서열로 특정되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 또한 본 출원에 기술된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 또한 본 출원의 도면에 정의된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 또한 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택되고; 키메라성 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결된 상기 폴리펩타이드 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 제공된 둘 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택되고; 키메라성 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결된 상기 폴리펩타이드 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 제공된 둘 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택되고; 키메라성 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결된 상기 폴리펩타이드 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 제공된 둘 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 서열번호 10, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택되고; 키메라성 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결된 폴리펩타이드 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 제공된 둘 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 2 내지 5개의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 2 내지 4개의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 2 내지 3개의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 2개의 폴리펩타이드를 포함할 것이다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 하기 구조식 1로 표시되는 키메라성 폴리펩타이드를 제공한다.
(구조식 1)
상기 구조식 1에 있어서, m은 0 또는 1, n은 0 또는 1,
A는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체;
B는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체;
C는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체; 및
D는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체 서열로 부터 선택된다.
좀 더 구체적으로,
A는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체;
B는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체;
C는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체; 및
D는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체 서열로 부터 선택된다.
좀 더 구체적으로,
A는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체;
B는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체;
C는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체; 및
D는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편 또는 유사체 또는 유도체 서열로 부터 선택된다.
일실시예에 있어서, 본 발명의 키메라성 폴리펩타이드는 하기 실시예에 존재하는 폴리펩타이드를 단독 또는 결합체로 포함한다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 10, 58, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 10 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 58 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 67 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 68 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 74 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, A는 서열번호 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 10, 58, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 10 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 58 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 67 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 68 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 74 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, B는 서열번호 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 10, 58, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 10 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 58 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 67 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 68 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 74 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, C는 서열번호 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 10, 58, 62, 64, 67, 68, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 10 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 58 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 67 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 68 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 74 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, D는 서열번호 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, m은 0이다.
좀 더 구체적으로, n은 0이다.
좀 더 구체적으로, m 및 n은 0이다.
좀 더 구체적으로, m 및 n은 0이고, A는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이고, B는 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
좀 더 구체적으로, m 및 n은 0이고, A는 서열번호 62 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이고, B는 서열번호 64 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체이다.
본 발명의 견지에서, 폴리펩타이드를 코딩하는 모든 뉴클레오타이드 및 키메라성 폴리펩타이드는 본 발명의 범주내에 있다.
좀 더 구체적으로, 본 발명에 부합하는 상기 폴리펩타이드 또는 키메라성 폴리펩타이드는 항원이다.
좀 더 구체적으로, 본 발명에 부합하는 상기 폴리펩타이드 또는 키메라성 폴리펩타이드는 개개인에 면역 반응을 도출시킬 수 있다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 또한, 상기에 정의된 본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 키메라성 폴리펩타이드에 결합 특이성을 갖는 항체를 생성할 수 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
"결합 특이성을 가지는" 항체는 선택된 폴리펩타이드를 인식하고 결합하나 생물학적 샘플 내의 다른 물질들과는 연속적으로 인식하고 결합하지 않는, 자연적으로 선택된 펩타이드를 포함하는 항체이다. 특이적 결합은 선택된 폴리펩타이드가 항원으로 사용된 ELISA 검정을 수행하여 측정될 수 있다.
다르게 정의되지 않았다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명 해당 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 언급된 모든 공개 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고 문헌들은 모두 참고문헌으로 포함된다. 상충되는 경우 본 명세서의 정의에 따른다. 부가적으로 성가 물질, 방법, 및 실시예들은 단지 기술하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 내용을 제한하기 위한 것이 아니다.
본 명세서에 사용된 본 발명의 폴리펩타이드의 "절편", "유도체" 또는 "유사체"는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 공통되거나 또는 공통되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 공통된)로 치환되고, 정상이거나 변성된 폴리펩타이드를 포함한다. 일실시예에 있어서, 본 발명 폴리펩타이드의 유도체 및 유사체는 도면에 기술된 서열 또는 이들의 절편과 약 70%의 동일성을 가질 것이다. 즉, 상기 잔기의 70%는 동일하다. 좀 더 구체적으로, 폴리펩타이드는 75% 이상의 유사성을 가질 것이다. 좀 더 구체적으로, 폴리펩타이드는 80% 이상의 유사성을 가질 것이다. 좀 더 구체적으로, 폴리펩타이드는 85% 이상의 유사성을 가질 것이다. 좀 더 구체적으로, 폴리펩타이드는 90% 이상의 유사성을 가질 것이다. 좀 더 구체적으로, 폴리펩타이드는 95% 이상의 유사성을 가질 것이다. 좀 더 구체적으로, 폴리펩타이드는 99% 이상의 유사성을 가질 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명 폴리펩타이드의 유도체 및 유사체는 치환, 변성 또는 결실된 아미노산 잔기가 약 20개 이하, 바람직하게는 10개 미만일 것이다. 바람직한 치환은 공통된 잔기 즉, 소수성(hydrophobicity), 사이즈, 극성, 또는 기능기 등의 물리 화학적 특성을 공유하는 치환된 잔기로 당업 분야에서 알려진 것이다.
본 발명의 견지에 있어서, 본 발명의 풀리펩타이드는 폴리펩타이드 및 키메라성 폴리펩타이드를 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 폴리펩타이드의 생물학적 또는 약학적 특성을 변화시키는 다른 화합물, 예를 들어 반수명(half-life)을 증가시키는 PEG(polyethylene glycol); 정제를 용이하게 하기 위한 리더 또는 보조 아미노산 서열; 프리프로(prepro-) 및 프로(pro-) 서열; 및 (다)당류가 결합된 폴리펩타이드를 포함한다.
또한, 아미노산 영역이 다형적인 것으로 판명될 경우, 좀 더 효과적으로 다른 스트렙토코커스 균주의 다른 항원결정기와 유사한 하나 또는 그 이상의 특정 아미노산을 다양화하는 것이 바람직하다.
게다가, 본 발명의 폴리펩타이드는 안전성을 제공하고, 지지체 또는 다른 물질과의 연결 또는 결합을 위한 소수성을 증가시키기 위하여 말단 -NH2아실화(acylation; 예를 들어 암모니아 또는 메틸 아민을 사용한 아세틸화, 또는 티오글리콜산 아미드화(thioglycolic acid amidation), 말단 카르보시(carbosy) 아미드화)에 의해 변성될 수 있다.
또한, 본 발명에서 숙고된 것은 상기 폴리펩타이드 절편, 유사체 및 유도체의 이종 및 동종 폴리펩티드 다합체(multimer)이다. 상기 중합체는 예를들어 아비딘/바이오틴, 글루테르알데히드(gluteraldehyde) 또는 디메틸 수퍼이미데이트 (dimethyl superimidate) 등의 크로스-링커(cross-linker)와 크로스-링크된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 중합체는 또한, 둘 또는 그 이상의 직렬 또는 전회된 연속적인 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하며, 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 다전사적 mRNAs로부터 제조된다. 바람직하게는 본 발명 폴리펩타이드의 절편, 유사체 또는 유도체는 적어도 하나의 항원성 유발 영역 즉, 적어도 하나의 항원 결정기를 포함할 것이다.
항원성 유발중합체(즉, 합성 다합체)를 형성하기 위하여, 비샬로아세틸기(bishaloacetyl group), 니트로아릴할라이드(nitroarylhalides) 또는 그 유사체을 가지며, 상기 반응물이 티오기(thio group)에 특이적인 폴리펩타이드가 사용될 수 있다.
그러므로, 상기 다른 펩타이드의 두 머켑토 기(mercapto group) 사이의 결합은 단일 결합이거나 또는 적어도 둘, 일반적으로는 적어도 네 개, 그리고 16개를 넘지 않는 결합 그룹으로 구성되나, 일반적으로 탄소수 약 14개를 넘지는 않는다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 절편, 유사체 및 유도체는 출발 잔기로서 메티오닌(Met)을 포함하지는 않는다. 바람직하게 폴리펩타이드는 리더 또는 보조 서열(신호 서열)을 포함하지는 않을 것이다. 본 발명 폴리펩타이드의 신호 부분은 공지의 분자 생물학적 기술에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 중요한 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 배양으로부터 분리될 수 있으며, 성숙 단백질(mature protein)의 초기 잔기 및 성숙 폴리펩타이드의 서열을 결정하기 위하여 연속적으로 서열 분석될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명은 약학적으로 적합한 운반 희석제 또는 애주번트(adjuvant)로 이루어진 첨가물에 본 발명의 하나 또는 그 이상의 스트렙토코커스 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 적절한 애주번트는 오일 즉, 프루이드의 완전 또는 불완전 애주번트(Freund's complete or incomplete adjuvant); 염 즉, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, 실리카(silica), 카올린(kaolin), 탄소 폴리뉴클레오타이드 즉, 폴리 IC 및 폴리 AU이 포함된다. 바람직한 애주번트는 퀼A(QuilA) 및 Al하이드로겔(Alhydrogel). 본 발명의 백신은 주사제, 급격한 주입, 상인두 흡수(nasopharyngeal absorption), 피부 흡수(dermoabsorption)에 의해 비경구 투여될 수 있으며 또는 구강 또는 경구 투여될 수 있다. 또한, 약학적으로 적합한 운반체는 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid)를 포함한다.
본 발명의 백신 조성은 본 발명의 참고 문헌에 포함된 P. R. Murray (P. R. Murray, Ed, in chief, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover 및 R.H. Yolken.; Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. sixth edition, 1995, 1482p)에 의해 기술된 바와 같이 스트렙토코커스 감염 및/또는 스트렙토코커스 감염의 치료 또는 예방에 의해 매개되는 질병 및 증상에 사용된다. 일 실시예에서 본 발명의 백신 조성물은 뇌막염, 중이염, 균혈증 또는 폐렴의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 일 실시예에서 본 발명의 백신 조성물은 스트렙토코커스 감염의 치료 또는 예방 및/또는 스트렙토코커스 특히, 스타필로코커스 유레우스(S. aureus) 뿐 아니라,S. 뉴모니애, 그룹 A 스트렙토코커스(streptococcus;pyogenes), 그룹 B 스트렙토코커스(GBS 또는agalactiae), 디스갈락티애(dysgalactiae), 우베리스(uberis), 노카르디아(nocardia) 감염에 의해 매개되는 질병 및 증상의 치료 또는 예방을 위한 목적으로 사용된다. 좀 더 구체적으로, 상기 스트렙토코커스는S. 뉴모니애이다.
특정 실시예에 있어서, 백신은 유아, 노인 및 면역력이 결핍된 개체 등과 같이 스트렙토코커스 감염의 위험성이 있는 개체에게 투여될 수 있다.
본 발명에서 "개체"라는 용어는 포유류를 의미하며 좀 더 구체적으로 상기 포유류는 사람이다.
백신 조성은 바람직하게는 약 0.001 내지 100 ㎍/㎏(항원/체중), 좀 더 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎍/㎏(항원/체중), 가장 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎍/㎏(항원/체중)의 투여량으로 면역을 위해 투여시기 마다 약 1내지 6주의 간격을 두고 1 내지 3번 투여된다.
다른 측면에 의하면, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 특정되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 ORF를 포함하고, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 15, 76, 80, 82로 표시되는 것이다. 도면에 기재된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 폴리펩타이드를 여전히 코딩하는 코돈을 변성시킴으로써 변경될 수 있다는 사실은 고려되어야 한다. 또한, 본 발명은 서열들 사이에서 50%의 동일성을 갖는 본 명세서 상에서 전술된 폴리뉴클레오타이드 서열(또는 이들에 상보적인 서열)에 혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 더욱 제공한다. 일 실시예에서 서열들 사이의 동일성은 적어도 70%이다. 일 실시예에서 서열들 사이의 동일성은 적어도 75%이다. 일 실시예에서 서열들 사이의 동일성은 적어도 80%이다. 일 실시예에서 서열들 사이의 동일성은 적어도 85%이다. 일 실시예에서 서열들 사이의 동일성은 적어도 90%이다. 좀 더 구체적으로 폴리뉴클레오타이드는 적어도 95%의 동일성을 갖는 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 혼성화가 가능하다. 좀 더 구체적으로는 동일성은 97% 이상이다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 1, 3, 7, 9, 11, 12, 13, 15, 76, 80, 82로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하고, ORF를 포함하는 서열번호 1, 3, 9, 11, 12, 13, 15, 76, 80, 82로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하고, ORF를 포함하는 서열번호 1, 3, 9, 11, 12, 13, 15, 76로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하고, ORF를 포함하는 서열번호 1, 3, 7, 9, 11, 12, 13, 15, 76로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하고, ORF를 포함하는 서열번호 1, 7, 9, 11, 15, 76로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하고, ORF를 포함하는 서열번호 1, 9, 11, 15, 76로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하고, ORF를 포함하는 서열번호 1, 7, 9, 11로 표시된다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 15로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 12, 13, 76으로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3으로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13으로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
좀 더 구체적으로, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 76으로 표시되며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩한다.
당업자에 의해 쉽게 인식되는 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA 및 RNA 모두를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 출원 명세서 상에 기술된 상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체는 DNA 면역 실험에 사용될 수 있다. 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체는 생체내에서 항원성 폴리펩타이드를 제조함으로써 단사(injection)상에 복제가 가능하고 발현가능한 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 진핵세포에서 기능을 하는 CMV 프로모터의 조절하에 플라스미드 벡터로 삽입될 수 있다. 바람직하게 상기 벡터는 근육간 주사로 투여된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명은 숙주세포에서 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하고 상기 발현된 폴리펩타이드 산물을 회수하는 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 공정을 제공한다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 공지의 합성 화학 기술(synthetic chemical techniques) 즉, 전장 폴리펩타이드를 제조하기 위하여 접합된 올리고펩타이드의 용액상 또는 고체상 합성에 따라 제조될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 수득 및 정량 방법은 Sambrook 등에 의한 참고 문헌들을 따랐다(Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F.M. 등, John Wiley 및 Sons, Inc. 뉴욕; PCR Cloning Protocols, Molecular Cloning to Genetic Engineering, Edited by White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, P.490; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3rd Edition, 1993, 380 페이지; Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan J. E. 등, John Wiley & Sons Inc., New York)
재조합체 생산을 위하여, 숙주 세포는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터로형질전환되었으며, 그 다음으로 프로모터를 활성화시키기에 적합하도록 변형된 영양 배지상에서 배양하였고, 형질전환체를 선별하거나 또는 유전자를 증폭한다.
적합한 벡터는 선택된 숙주내에서 생존 및 복제가 가능한 것이며, 염색체성, 비-염색체성 및 합성 DNA 서열 예를 들어 박테리아 플라스미드, 파지(phage) DNA, 베큘로바이러스(baculovirus), 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 결합에 의해 유도된 벡터를 포함한다. 상기 폴리펩타이드 서열은 제한효소를 이용하여 벡터의 적절한 자리에 삽입될 수 있는데, 즉, 프로모터, 리보솜 결합 부위(공통 영역 또는 Shine-Dalgarno 서열), 및 선택적으로 작동인자(operator; 조절 요소)를 포함하는 발현 조절 영역에 조작적으로 연결된다. 주어진 숙주 및 공지의 분자생물학적 원리에 따라 제조된 벡터에 적합한 발현 조절 영역의 개체적 성분을 선택할 수 있다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F.M. 등, John Wiley and Sons. Inc. New York incorporated herein by reference). 적합한 프로모터는 LTR 또는 SV40 프로모터,E. Colilac, tac 또는 trp 프로모터 및 파지 람다(lambda) PL프로모터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 벡터는 선별 마커 즉, 앰피실린(ampicilin) 저항 유전자 뿐 아니라 복제 기점(origin)을 포함할 것이다. 적합한 박테리아 벡터는 pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10 파지 스크립트(phagescript), psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 및진핵세포용 벡터인 pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL를 포함한다. 숙주 세포는 박테리아 즉,E. Coli, 바실러스 썹틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces); 진균(fungal), 즉 아스파질러스 니거(Aspergillus niger), 아스파질러스 니둘린(Aspergillus nidulins); 효모 즉, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 진핵세포 즉, CHO, COS 일 수 있다.
배양을 통한 폴리펩타이드의 발현시, 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수확된 다음 물리적 또는 화학적 수단(발현된 폴리펩타이드가 배지로 분비되지 않았을 경우)에 의해 분쇄되었고, 결과적인 조추출물(crude extract)은 중요한 상기 폴리펩타이드를 보유하고 있다. 배양 배지 또는 분쇄액(lysate)으로부터 상기 폴리펩타이드의 정제는 폴리펩타이드의 특성에 따라 공지의 기술 즉, 황산 암모늄 (ammonium sulfate) 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 인산셀룰로오즈(phosphocellulose) 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 수산화 인회석(hydroxylapatite) 크로마토그래피 및 렉틴(lectin) 크로마토그래피에 의해 얻어질 수 있다. 최종 정제는 HPLC를 사용하여 얻을 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 리더 또는 분비 서열을 가지거나 또는 가지지 않은 상태로 발현된다. 전자의 경우 상기 리더 서열은 전사 후 공정에 의해 제거될 수 있으며(본 명세서에 참고문헌으로 기재된 미국특허 제4,431,739호, 미국특허 제4,425,437호, 및 미국특허 제4,338,397호 참조) 또는, 발현된 폴리펩타이드를 정제하기 위한 연속적인 공정을 통해 화학적으로 제거될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명의 상기 스트렙토코커스 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 특히S. 뉴모니애감염의 진단 테스트 시에 사용될 수 있다. 생물학적 시료에 있는 스트렙토코커스 미생물을 진단하기 위해서 여러가지 진단 방법이 가능한데, 예를들어 하기의 과정이 수행될 수 있다:
a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 생물학적 샘플과 본 발명의 스트렙토코커스 폴리펩타이드에 반응하는 항체 또는 이의 절편을 배양하여 혼합물을 만드는 단계; 및
c) 상기 혼합물 내에 특이적으로 결합된 항체 또는 결합 절편이 있는지를 확인하여 스트렙토코커스의 존재를 확인하는 단계.
또한, 상기 항체를 포함하고 있거나 포함하고 있다고 추정된 생물학적 시료에서 스트렙토코커스 항원에 특이적인 항체의 감지를 위한 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다:
a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 생물학적 샘플과 하나 또는 그 이상의 본 발명의 스트렙토코커스 폴리펩타이드 또는 이의 절편을 배양하여 혼합물을 만드는 단계; 및
c) 상기 혼합물 내에 특이적으로 결합된 항원 또는 결합 절편이 있는지를 확인하여 스트렙토코커스에 특이적인 항체의 존재를 확인하는 단계.
당업자는 상기 진단 테스트가 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사면역분석시험(radioimmunoassay) 또는 유액 응집시험(latex agglutinationassay) 등을 포함하는 면역적 방법을 다양한 형태로 수행될 수 있음을 인지할 것이고, 필수적으로 상기 단백질에 특이적인 항체가 미생물 내에 존재하는 지를 결정한다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열은 해당 박테리아를 함유하고 있다고 추정되는 생물학적 시료에 스트렙토코커스의 존재 유무를 감지하기 위하여 사용되는 DNA 소식자를 디자인하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 감지 방법은
a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 생물학적 샘플과 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 절편을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 하나 또는 그 이상의 DNA 소식자를 배양하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
c) 스트렙토코커스 박테리아의 존재를 감지하기 위하여 상기 혼합물 내에 특이적으로 결합한 DNA 소식자를 감지하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 상기 DNA 소식자는 스트렙토코커스 감염을 진단하는 방법으로서 예를들어 PCR을 사용하여 순환하는 스트렙토코커스 즉, 샘플 내S. 뉴모니애핵산을 감지하는데 사용될 수 있다. 상기 소식자는 전통적인 방법으로 합성될 수 있으며, 고체상에서 고정되거나 또는 식별 가능한 라벨로 라벨링될 수 있다. 본 발명을 위한 바람직한 DNA 소식자는 본 발명의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리펩타이드의 적어도 6개 지속적인 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 올리고머이다.
환자의 스트렙토코커스를 감지하는 다른 진단 방법은
a) 감지 가능한 라벨로 상기 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 절편과 반응하는 항체를 라벨링하는 단계;
b) 라벨링된 항체 또는 라벨링된 절편을 환자에 투여하는 단계; 및
c) 환자에서 특이적으로 결합된 라벨링된 항체 또는 라벨링된 절편을 감지하여 스트렙토코커스의 존재를 감지하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 관점은, 본 발명의 스트렙토코커스 폴리펩타이드를 진단을 위한 특이적인 항체의 제조를 위한 면역원 및 특히, 스트렙토코커스 감염의 치료를 위해 사용하는 용도에 관한 것이다.
적합한 항체는 적절한 스크리닝 방법 예를 들어, 테스트 모델에 있어서 스트렙토코커스 감염에 대하여 수동적으로 방어하는 특정 항체의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다. 동물모델의 일실시예는 본 명세서의 실시예에 기술된 마우스 모델이다. 상기 항체는 전체 항체 또는 이의 항원-결합 절편이 될 수 있고, 어떠한 면역글로블린(immunoglobulin) 종류도 가능하다. 상기 항체 또는 절편은 동물 기원, 상세하게는 포유류 기원 및 좀 더 상세하게는 설치류(murine), 랫트 또는 사람 기원이다. 상기 항체 또는 절편은 자연 항체 또는 이의 절편 또는 원한다면 재조합 항체 또는 항체 절편이다. 상기의 재조합 항체 또는 항체 절편 용어는 분자 생물학적 기술을 이용하여 제조된 항체 또는 항체 절편을 의미한다. 상기 항체 또는 항체 절편은 폴리클로날 또는 바람직하게는 모노클로날이다. 상기 항체 또는 항체 절편은스트렙토코커스 뉴모니애폴리펩타이드와 관련되는 항원결정기의 수에 특이적이나, 바람직하게는 하나이다.
범주를 제한하지 않으면서, 또한 본 발명은 BVH-3, BVH-11, BVH-11-2, BVH-28 및 BVH-71로 지정된 새로운 항원에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 BVH-3, BVH-11, BVH-11-2, BVH-28 및 BVH-71로 지정된 새로운 항원의 절편을 포함하는 절단된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 BVH-3, BVH-11, BVH-11-2, BVH-28 및 BVH-71로 지정된 새로운 항원의 절편을 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 항원들 사이의 관계는 요약하여 하기 참고표에 기재하였다.
참고표
| 종류 | 뉴클레오타이드 서열번호 | 폴리펩타이드 서열번호 |
| BVH-3 | ||
| BVH-3 | 1, 11 | 2 |
| BVH-3A | 7 | 8 |
| BVH-3B | 9 | 10 |
| BVH-3 SP63 | 15 | 16 |
| BVH-3M | 55 | |
| BVH-3AD | 56 | |
| L-BVH-3AD | 57 | |
| New12 | 76 | 58 |
| BVH-3 | 59 | |
| New1 | 64 | |
| New2 | 65 | |
| New3 | 66 | |
| New15 | 78 | |
| BVH-11 | ||
| BVH-11 | 3, 12 | 4 |
| BVH-11-2 | 13 | 14 |
| BVH-11M | 60 | |
| BVH-11A | 61 | |
| BVH-11B(New13) | 62 | |
| BVH-11C | 63 | |
| New4 | 67 | |
| New5 | 68 | |
| New6 | 69 | |
| New7 | 70 | |
| New8 | 71 | |
| New9 | 72 | |
| BVH-11-2M | 73 | |
| New10 | 74 | |
| New11 | 75 | |
| New12 | 76 | 58 |
| New14 | 77 | |
| New16 | 79 | |
| BVH-28 | ||
| BVH-28 | 5 | 6 |
| BVH-71 | ||
| GBS | 80 | 81 |
| GAS | 82 | 83 |
실시예 1
본 실시예는S. 뉴모니애유전자의 클로닝에 관하여 기술한다.
서열번호 1로 표시되는S. 뉴모니애유전자 BVH-3의 코딩 영역 및 서열번호 5로 표시되는S. 뉴모니애유전자 BVH-28의 코딩 영역은 제한효소 위치 Bgl II (AGATCT) 및 Xba I (TCTAGA)의 추가를 위해 첨가된 염기를 함유한 올리고를 사용하여 혈청군 6S. 뉴모니애균주 SP64의 게노믹 DNA로부터 PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, Scan Jose, CA)을 통해 확장되었다. PCR 산물은 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 아가로오즈 젤로부터 정제되었고, Bgl II-Xba I(Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe Canada)로 절단되었고, 페놀: 클로로포름으로 추출되고 에탄올로 침전시켰다. 수퍼링커 벡터 pSL301(Invitrogen, San Diego, CA)은 Bgl II 및 Xba I으로 절단되었고, 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 아가로오즈 겔로부터 정제하였다. 상기 Bgl II-Xba I 게노믹 DNA 절편은 Bgl II-Xba I pSL301 벡터에 접합되었다. 상기 접합된 산물은 Simanis (Hanahan, D. DNACloning, 1985, D.M. Glover (ed). pp. 109-135)의 방법에 따라E. Coli균주 DH5a [f80 lacZ DM15endA1recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44thi-11- gyrA96relA1 D(lacZYA-argF) U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 형질전환되었다. BVH-3 또는 BVH-28 유전자를 포함하는 재조합 pSL301 플라스미드(rpSL301)는 QIAgen 키트(Chatsworth, CA)를 사용하여 정제되었고, DNA 삽입물은 뉴클레오타이드 서열 분석(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA)에 의해 확인되었다. 재조합 rpSL301(rpSL301)은 제한효소 Bgl II (AGATCT) 및 Xho I (CTCGAG)로 절단하였다. 절단된 DNA 절편 Bgl II-Xho I은 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA))를 사용하여 정제되었다. 티오레독신(thioredoxin)-His 표지(tag) 서열을 함유하고 있는 pET-32c(+) 발현 벡터(Novagen, Madison, WI)는 Bam HI (GGATCC) 및 Xho I으로 절단하였고, 겔은 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 추출하였다. 상기 Bgl II-Xho I DNA 절편은 티오레독신-His 표지-BVH-3 또는 티오레독신-His 표지-BVH-28 융합 단백질의 코딩 서열을 제조하기 위하여 pET-32c(+) 벡터의 Bam HI-Xho I 부위에 접합시켰다. 상기 접합된 결과물은 Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed). pp. 109-135)의 방법에 따라E. Coli균주 DH5a [f80 lacZ DM15endA1recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44thi-11- gyrA96relA1 D(lacZYA-argF) U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 형질전환되었다. 재조합 pET-32c(+) 플라스미드는 QIAgen 키트(Chatsworth, CA)를 사용하여 정제되었고, 티오레독신-His 표지 및 DNA 삽입물의 융합 부분의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열분석(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA)에 의해 확인되었다.
실시예 2
본 실시예는 CMV 플라스미드 pCMV-GH에서S. 뉴모니애단백질 유전자의 클로닝에 관한 것이다.
S. 뉴모니애단백질의 DNA 코딩 영역은 플라스미드 벡터 pCMV-GH(Tang 등, Nature, 1992, 356: 152)에 있는 CMV(cytomegalavirus) 프로모터의 전사적 조절하에 있는 hGH(human growth hormone)의 하류(downstream)에 삽입되었다. 상기 CMV 프로모터는E. Coli세포에서 비기능적인 플라스미드이나, 진핵 세포에 플라스미드를 처리하였을 경우 활성을 갖는다. 또한, 상기 벡터는 엠피실린 저항 유전자를 포함한다.
서열번호 1로 표시되는 BVH-3 유전자의 코딩 영역 및 서열번호 5로 표시되는 BVH-28 유전자는 제한 효소 Bgl II (AGATCT) 및 Xba I (TCTAGA)를 사용하여 rpSL301로부터 얻었다(실시예 1 참조). 상기 절단된 결과물은 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 정제되었다. 융합 단백질을 제조하기 위하여 사람 성장 호르몬을 포함하는 상기 pCMV-GH 벡터(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)는 Bgl II 및 Xba I으로 절단하였고, 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 아가로오즈 겔로부터 정제하였다. 상기Bgl II-Xba I DNA 절편은 Bgl II-Xba I 으로 절단된 pCMV-GH 벡터에 접합시켜 CMV 프로모터에 의해 조절되는 hGH-BVH-3 또는 hGH-BVH-28 융합 단백질을 제조하였다. 상기 접합된 결과물은 Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed). pp. 109-135)의 방법에 따라E. Coli균주 DH5a [f80 lacZ DM15endA1recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44thi-11- gyrA96relA1 D(lacZYA-argF) U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 형질전환되었다. 상기 재조합 pCMV 플라스미드는 QIAgen 키트(Chatsworth, CA)를 사용하여 정제되었다.
서열번호 3으로 표시되는 BVH-11 유전자의 코딩 영역은 제한효소 위치 Bgl II (AGATCT) 및 Hind III (AAGCTT)의 추가에 의한 첨가된 염기를 함유한 올리고를 사용하여 혈청군 6S. 뉴모니애균주 SP64의 게노믹 DNA로부터 PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, Scan Jose, CA)을 통해 확장되었다. PCR 산물은 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 아가로오즈 젤로부터 정제되었고, 제한 효소들(Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe Canada)로 절단되었고, 페놀: 클로로포름으로 추출되고 에탄올로 침전시켰다. 상기 pCMV-GH 벡터(laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)는 Bgl II 및 Hind III로 절단되고, 키트(QIAquick gel extraction kit; QIAgen(Chatsworth, CA)를 사용하여 아가로오즈 겔로부터 정제하였다. 상기 Bgl II-Hind III DNA 절편은 Bgl II-Hind III pCMV-GH 벡터에 접합되어 CMV 프로모터의 조절을 받는 hGH-BVH-11 융합 단백질을 제조하였다. 상기 접합된 산물은 Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed). pp. 109-135)의 방법에 따라E. Coli균주 DH5a [f80 lacZ DM15endA1recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44thi-11- gyrA96relA1 D(lacZYA-argF) U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 형질전환되었다.
상기 재조합 pCMV 플라스미드는 QIAgen 키트(Chatsworth, CA)를 사용하여 정제되었고, DNA 삽입물의 뉴클레오타이드 서열은 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 3
본 실시예는S. 뉴모니애항원에 면역 반응을 일으키는 DNA의 용도에 관한 것이다.
암컷 BALB/c 마우스(Charles River, St-Constant, Quebec, Canada) 8마리 그룹은 과립백혈구-대식세포 콜로니-촉진 인자 (GM-CSF; granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)-발현 플라스미드 pCMV-GH-GM-CSF(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas) 50 ㎍과 함께 BVH-3, BVH-11 또는 BVH-28 유전자를 코딩하는 재조합 pCMV-GH 100 ㎍을 2주 또는 3주의 간격으로 50 ㎕씩 세 번에 근육주사하여 면역시켰다. 대조군으로는 pCMV-GH-GM-CSF 50 ㎍과 함께 pCMV-GH 100 ㎍을 주사한 마우스 그룹을 사용하였다. 혈액 샘플은 각 면역 전 및 세 번째 주사 다음 7일 후에 안구로부터 얻었으며, 혈청 항체 반응은 코팅 항원으로 티오레독신-His 표지-S. 뉴모니애융합 단백질을 사용한 ELISA로 결정되었다. BVH-3, BVH-11 또는 BVH-28S.뉴모니애단백질을 코딩하는 재조합 플라스미드 pCMV-GH를 사용한 DNA 면역 반응은 각각의 재조합 단백질에 대해 반응하는 항체를 유발한다. 상기 상호작용을 나타내는 항체의 타이터(titer)는 흡수 수치가 배경 수치보다 0.1 이상이 되도록 높은 혈청 희석 방법으로 정의한 결과 4×103이상이다.
실시예 4
본 실시예는 재조합S. 뉴모니애단백질의 제조 및 정제에 관한 것이다.
각각 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 5로 표시되는 BVH-3, BVH-11 또는 BVH-28 유전자를 포함하는 상기 재조합 pET 플라스미드는 전기천공법(Gene Pulser II apparatus, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada)을 사용하여E. Coli균주 AD494 (DE3)(Dara- leu7697 DlacX74 DphoAPvuIIphoR DmalF3 F'[lac+(lacIq) pro] trxB: :Kan)(Novagen, Madison, WI)으로 각각 형질전환 되었다. 상기E. Coli균주에 있어서, T7 RNA 폴리머라아제(1DE3 프로파지 상에 존재)에 의해 특이적으로 인식되는 상기 융합 단백질의 발현을 조절하는 T7 프로모터는 IPTG(isopropyl-β-d-thio-galactopyranoside)에 의해 증폭되는 lac 프로모터에 의해 조절된다. 상기 형질전환체 AD494(DE3)/rpET는 ㎖당 엠피실린(Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada) 100 ㎍이 포함된 LB 배지(peptone 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L) 상에 250 rpm으로 흔들어 주면서 37℃에서 A600값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 티오레독신-His 표지-BVH-3, 티오레독신-His 표지-BVH-11 또는 티오레독신-His 표지-BVH-28 융합 단백질의 생산을 증폭시키기 위하여, 상기 세포에 최종농도 1 mM로 IPTG를 첨가하고 추가적으로 2시간동안 배양하였다. 100 ㎖의 배지에서 증폭된 세포는 원심분리에 의해 분리되어, -70℃에서 냉동시켰다.
IPTG로 증폭된 AD494(DE3)/rpET의 가용성 세포질 부분로 부터 상기 융합 단백질의 정제는 His 결합 금속 킬레이트 레진 상에 이동되는 2가 양이온(Ni2+)에 결합되는 His 표지 서열(6개의 연속되는 히스티딘 레진)의 특성을 윈리로 하는 친화 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 간략하게는, IPTG에 의해 증폭된 100 ㎖의 배지로부터 얻은 응집된 세포는 PBS(Phosphate buffered saline) : 500 mM NaCl pH 7.1 용액에 재현탁되었고, 초음파 분쇄한 다음 끼꺼기를 제거하기 위하여 20,000 × g에서 20분 동안 회전시켰다. 상기 상층액은 여과시켰으며(0.22 ㎛ 기공크기 막), 미리 충전되고 킬레이트화 되어 사용할 준비가 되어있는 HiTrap(R)(Pharmacia Biotech, Baie d'Urfe Canada) 1 ㎖ 상에 충진시켰다. 상기 티오레독신-His 표지-S. 뉴모니애융합 단백질은 1M 이미다졸(imidazole)-500 mM NaCl-PBS(pH 7.1) 용액으로 용출되었다. 상기 샘플의 염 및 이미다졸은 PBS로 4℃에서 투석(dialysis)하여 제거하였다.E. Coli의 수용성 부분으로부터 얻어진 융합 단백질의 양은 MicroBCA(Pierce, Rockford, Illinois)로 측정되었다.
실시예 5
본 실시예는 면역에 의한 마우스의 치명적 폐렴 구균 감염에 따른 보호능에대하여 기술한다.
암컷 BALB/c 마우스(Charles River) 8마리 그룹은 QuilA 애주번트(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada) 15 ㎍이 첨가된 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-3 융합 단백질 25 ㎍을 3주 간격으로 3번 피하주사하여 면역시켰다. 대조군으로는 PBS 상의 QuilA 애주번트 만을 투여한 군을 사용하였다. 혈액 샘플은 각 면역화 과정 1일, 22일, 43일 전 및 3차 주사후 7일(50일째) 후에 안구 동(orbital sinus)으로부터 채취하였다. 일주일 후에 상기 마우스는 타입 3S. 뉴모니애균주 WU2를 대략 106CFU 투여하였다. 상기S. 뉴모니애투여 접종의 샘플은 CFU를 결정하고, 투여량을 결정하기 위하여 초콜렛 아가 플레이트상에 도말하였다. 사망은 14일 동안 기록되었으며, 투여 후 14일째에 생존하는 마우스는 사망시켰고, 혈액 샘플내S. 뉴모니애미생물의 존재 여부를 테스트하였다. 상기 생존 데이터는 하기 표 1에 나타내었다.
투여전 혈청은 표준적인 면역검정법으로S. 뉴모니애와 반응하는 항체의 존재 유무가 분석되었다. ELISA 및 면역블럿 분석은E. Coli내에 제조된 재조합S. 뉴모니애단백질과의 면역 반응이 재조합 및 자연의 폐렴 구균 단백질 모두와 반응하는 항체를 도출하였음을 나타내었다.
| 면역원 | 투여 14일 후의 생존 마우스 수: 사망 마우스 수 | 평균 사망일 |
| BVH-3 | 8:0 | 14일 이상 |
| 없음 | 0:8 | 1 |
BVH-3 재조합 단백질로 면역된 마우스는 감염에 대해 살아남은 반면, 애주번트만 단독으로 투여한 대조군 마우스는 모두 사망하였다. 마우스 두 그룹 사이의 현저한 생존율 차이를 나타내었다(p〈0.0001, log rank test for nonparametric analysis of survival curves; P=0.0002, Fisher's exact test). 생존한 마우스로 부터 얻은 모든 혈구 배양(hemoculture) 결과 투여 14일 후에 음성으로 나타났다.
실시예 6
본 실시예는 다양한S. 뉴모니애균주로부터 BVH-3 및 BVH-11 유전자의 클로닝 및 상기 유전자들의 분자적 공통성에 관한 것이다.
BVH-3또는BVH-11의 다른 영역 DNA 소식자로 분리된 다양한S. 뉴모니애염색체 DNA의 분자적 분석은 하나의BVH-3유전자 카피 및 두 개의BVH-11카피가 존재함을 드러낸다. 상기 두 개의 BVH-11 유전자 카피는 동일하지 않고 및 상기 유전자는 임의로BVH-11(서열번호 12; 뉴클레오타이드 114 내지 2630의 ORF) 및 BVH-11-2(서열번호 13; 뉴클레오타이드 114 내지 2630의 ORF)로 지정하였다
BVH-3 및 BVH-11 코딩 영역의 첫번째 아미노산은 또한 신호 서열로도 알려진 리더 서열의 특성을 가진다. 리포프로테인(lipoprotein) 변경/과정 부분의 상기 컨센서스(consensus) 신호 펩티다아제 절개 사이트 L-X-X-C는 상기 서열내에 존재한다.S. 뉴모니애SP64의 성숙 BVH-3, BVH-11 및 BVH-11-2 단백질은 각각 1019,821 및 819개의 아미노산을 갖는다. 성숙 BVH-3을 위한S. 뉴모니애유전자 코딩 영역인 BVH-3M(뉴클레오타이드 1837-4896; 서열번호 11), BVH-11M(뉴클레오타이드 102-2567; 서열번호 12) 및 BVH-11-2M(뉴클레오타이드 171-2630; 서열번호 13)은 6 또는 7S. 뉴모니애균주의 게노믹 DNA를 사용한 PCR로 확장하였다(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA). 혈청형 6S. 뉴모니애SP64 및 혈청형 9 SP63 진단 분리체(the laboratoire de la sante publique du quebec, Sainte-Anne-de-Bellevue; 혈청형 4 균주 JNR.7/87(Andrew Camilli, Tufts University School of Medicine, Boston; type 2 균주 D39의 비피낭성(nonencapsulate) 유도체, Rx1 균주 및 유형 3 균주 A66 및 WU2(David E. Briles, University of Alabama, Birmingham) 및 유형 3 진단적 분리체 P4241(centre cenytr de recherche en infectiologie du centre hospitalier de l'universite Laval, Sainte-Foy)은 각각의 공여자로부터 얻었다. 추가적인 제한 효소 부분을 위한 염기 부분을 함유하고 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 OCRR479-OCRR480의 세트; HAMJ160-OCRR488 및 HAMJ160-HAMJ186은 각각BVH-3, BVH-11및BVH-11-2유전자의 증폭을 위해 사용하였다. 단, 예외로 SP64 균주의 BVH-11 유전자는 HAMJ487 및 OCRR488로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 확장되었다. 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2a, b 및 c에 표시하였다. PCR 결과물은 QIAgen(chatsworth, CA)의 키트(QIAquick gel extraction kit)를 사용하여 아가로오즈 겔로부터 정제하였고, BglII-XbaI 또는 BglII-HindIII(pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe, Canada)로 절단하였다. 절단물은 QIAgen(chatsworth, CA)키트(QIAquick PCR purification kit)를 사용하여 세척하였다. 상기 PCR 결과물은 BglII-XbaI 또는 BglII-HindIII pSL301 벡터에 접합시켰다. 상기 접합된 결과물은 Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed). pp. 109-135)의 방법에 따라E. Coli균주 DH5a [φ80 lacZ DM15endA1recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44thi-1λ-gyrA96relA1 Δ(lacZYA-argF) U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 형질전환되었다. BVH-3, BVH-11 또는 BVH11-2를 포함하는 재조합 pSL301 플라스미드(rpSL301)은 QIAgen 키트(Chatsworth, CA)를 사용하여 정제하였고, DNA 삽입부분은 서열분석하였다(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA). 도 11a, b, c 및 d 및 12는 각각 BVH-3 및 BVH-11의 추론된 아미노산 서열로부터 얻은 공통 서열(consensus sequence)에 관해 도시하고 있다. BVH-3 단백질 서열의 비교 결과 모든 균주의 서열에서 99 내지 100%의 동일성을 나타내었으나, 단 예외로 혈청군 9 SP63 균주의 BVH-3(서열번호 15 및 서열번호 16)는S. 뉴모니애SP64의 BVH-3' 단백질 서열의 잔기 244 내지 420에 상응하는 177개 아미노산 부분이 결실되어 있다. 부가적인 혈청군 9 균주의 서열 분석 결과 BVH-3 분자가 4 균주를 제외한 균주 3에 동일한 결실을 가지고 있는 것을 확인하였으며, 따라서, 3 균주는S. 뉴모니애혈청군 9 클론의 멤버이다.
13 BVH-11 뉴클레오타이드 서열은 7S. 뉴모니애균주와 비교하였으며, 상기 뉴클레오타이드 서열이 매우 유사함을 확인할 수 있었다. 미리 예측된 BVH-11 단백질 서열 다합체 배열의 컴퓨터 분석(MacVector, Clustal W 1.4) 결과 상기 서열이 834 아미노산 길이에 있어서, 75% 동일성 및 82%의 유사성을 나타내었다. 복합 배열(Pairwise alignment)은 80 내지 100% 동일성을 나타낸다(도 13 참조). 상기 서열은 전체적 부분에서 높은 유사성을 나타낸다. 상기 단백질의 주요 서열에 있어서의 다양성은 거의 단백질 C-말단 부분의 마지막 125 아미노산을 제한한다. 상기 영역은 하나의 도메인을 구성한다. 상기 도메인의 유사성 검사 결과 두 그룹의 서열로 이루어져 있음을 확인하였다. 도 13의 첫번째 9 서열은 제1 그룹에 속하고, 마지막 4 서열은 다른 그룹에 속한다. 상기 도메인 서열 13 단백질을 비교하였고(MacVector, Clustal W 1.4), 동일성 수치는 39% 이었다. 동일 그룹에 속하는 서열을 비교하였을 경우 92% 이상까지 증가된 동일 수치를 나타내었다.
실시예 7
본 실시예는BVH-3및BVH-11유전자의 유사 부분에 관한 것이다.
BVH-3및BVH-11유전자 유래의 DNA 소식자를 사용한 분석 결과BVH-3및BVH-11이 연과되어 있음을 확인하였다. 닷 블럿 혼성화(dot blot hydridization) 결과,BVH-3또는BVH-11유전자 서열을 포함하는 DNA 소식자는 양쪽에 모두 혼성화되었고, 따라서BVH-3및BVH-11유전자가 유사 서열을 공유하고 있음을 확인하였다. 서열의 비교 결과 ORFs 및 단백질이 각각 43% 및 33%가 동일함을 확인하였다. 유사성 검사 결과는 BVH-3에서 아미노산 1 내지 225및 BVH-11에서 1 내지 228에 해당하는 영역이 각각 DNA 및 단백질 수준에 있어서, 73% 및 75%로 동일함을 확인하였다. 반대로 BVH-3 아미노산 226 내지 1039 및 BVH-11 아미노산 229-840에 상응하는 3' 영역은 DNA 및 단백질 수준에서 각각 단지 34% 및 22%만이 동일한하였다. 따라서, BVH-3 및 BVH-11 유전자의 5' 말단은 높은 비율의 공통 서열을 함유하고 있는 반면 상기 유전자들의 나머지 부분은 매우 다르다. 전술한 결과는 BVH-3 및 BVH-11이 공통 영역에 존재하는 서열에 의해 매개되는 동일한 기능을 공유할 수 있으며, 반면 BVH-3 및 BVH-11의 특이적 기능은 다른 영역에 존재하는 서열에 의해 매개될 수 있다는 것을 추측하게 한다.
실시예 8
본 실시예는 PCR을 통한 BVH-3, BVH-11 및 BVH-11-2 유전자의 클로닝 및 절단된 BVH-3 및 BVH-11 물질의 발현에 관해 기술한다.
유전자 절편은S. 뉴모니애균주 SP64 유래의 서열번호 1 및 서열번호 11로 표시되는 BVH-3, 서열번호 3 및 12로 표시되는 BVH-11 또는 서열번호 13으로 표시되는 BVH-11-2를 포괄하는 절편을 증폭하기 위하여 제작된 한쌍의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR로 확장되었다. 상기 프라이머 각각은 5' 말단에 제한 엔도뉴클라아제(endonuclease) 부위를 가지고 있으며, 따라서 절단된 플라스미드 벡터로 상기 증폭된 산물의 프레임내 방향성 클로닝을 가능하게 한다(표 2a, b 및 c, 및 표 3 참조). PCR-증폭된 산물은 제한 엔도뉴클레아제로 절단되었고, 동일한 효소로 절단되거나 상보적인 점착 말단(cohesive end)를 생성하는 효소로 절단된 선형화된 플라스미드 pSL301(실시예 1 참조), pCMV-GH(실시예 2 참조) 또는 pET(Novagen, Madison, WI) 발현 벡터에 접합시킨다. 재조합 pSL301 및 재조합 pCMV-GH 플라스미드는 pET 발현 벡터에 프레임내 삽입 클로닝을 위하여 제한 효소로 절단하였다. 클론은 절단된 BVH-3 또는 BVH-11 물질의 발현을 위해E. ColiBL21(λDE3) 또는AD494(λDE3)로 삽입하기 전에E. ColiDH5α에 안정화시켰다. 결과적인 플라스미드 구조물 각각은 뉴클레오타이드 서열분석으로 확인하였다. 상기 재조합 단백질은 N-말단에 티오레독신 및 His 표지 또는 C-말단에 His 표지를 가진 상태로 발현된다. 상기 발현된 재조합 단백질은 His-결합 금속 킬레이트화 레진(QIAgen, Chatsworth, CA)을 사용하여 초음파 분쇄된 IPTG-증폭E. Coli배양물의 원심분리로 얻어진 상층액 부분에서 정제되었다. 상기 유전자 결과물은 하기 표 3에 표시되었다. 신호 서열을 포함하는 N-말단 영역 유전자 결과물은 지질화된 단백질 또는 리포 단백질(L-단백질)로 지정되었다. 신호 서열이 결핍된 N-말단 영역에 상응하는 유전자 결과물은 신호 서열이 없는(w/o ss) 단백질로 명명되었다.
실시예 9
본 실시예는 모노클로날 항체(Mabs)의 분리 및 BVH-3, BVH-11 및 BVH-11-2 단백질 항원결정기를 특정짓는 모노클로날 항체의 용도에 관해 기술한다.
암컷 BALB/c 마우스(Charles River)는 QuilA 애주번트(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada) 15 ㎍을 첨가하고S. 뉴모니애균주 SP64로부터 BVH-3, BVH-11 또는 BVH-11-2 유전자 결과물과 함께 피하주사하여 면역시켰다. 마우스 제1군(융합 실험 1)은 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-3M 융합 단백질 25 ㎍을 1일 및 14일에 면역시켰다. 마우스 제2군(융합 실험 2)은 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-11M 융합 단백질 25 ㎍을 3주 간격으로 3번 면역시켰다. 제3군(융합 실험 3)은 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-11-2M 융합 단백질 25 ㎍을 1일 및 15일에 면역시켰다. 제4군(융합 실험 4)은 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-11B 융합 단백질 25 ㎍을 1일에 면역시키고 PBS에 녹인 재조합 BVH-11B를 16일 및 37일에 정맥주사하여 추가면역시켰다. 융합 3시간 또는 4시간 전에 PBS에 현탁된 각 항원 25 ㎍을 정맥주사하였다. 하이브리도마(hybridoma)는 J. Hamel 등에 의해 기술된 바와 같이 비분비 SP2/0 골수종(myeloma) 세포와 비장 세포를 융합하여 제조하였다(J. Hamel 등, J. Med. Microbiol., 23, pp163-170 (1987)). 하이브리도마의 배양 상층액은 J. Hamel 등에 의해 기술된 방법에 따라 정제된 재조합 단백질 또는 가열하여 비활성화시킨S. 뉴모니애세포의 상층액으로 코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA를 수행함으로써 1차적으로 탐색하였다. 다양한 항원을 사용한 ELISA 활성 측정에 근거하여 선택된 양성 하이브리도마는 제한적인 희석법에 의해 클론화되었고, 불린다음 냉동 보관하였다.
상기 하이브리도마는 모노클로날 항체에 의해 인식된 항원 결정기를 특정하기 위하여 BVH-3 및 BVH-11 유전자 결과물에 대해 ELISA 또는 웨스턴 면역블러팅으로 시험되었다. BVH-3 및 BVH-11는 양쪽 단백질의 활성을 나타내는(표 4 참조) 6개 모노클로날 항체(H3-1-F9, H3-1-D4, H3-1-H12, H11-1-E7, H11-1-H10 및 H11-1.1-G11)와 같은 항원 결정기를 공유하였다.S. 뉴모니애SP64 유래의 BVH-11 및 BVH-11-2 물질은 BVH-11 및 BVH-11-2, 재조합 단백질과 반응하는 모노클로날 항체(표 5참조)와 BVH-3 상에 존재하지 않는 항원결정기를 공유한다.
a상기 표에 기재된 모노클로날 항체는 재조합 BVH-3 분자와는 반응하지 않는다.
상기 표 4 및 표 5에 나타난 모노클로날 항체의 면역 반응성 연구로부터 얻어진 결과는 각각의 유전자 서열로부터 얻은 단백질 서열과 일치하였다. 실제로 BVH-3 및 BVH-11 분자와 상호작용하는 모노클로날 항체는 공통 영역에 상응하는 BVH-3C 단백질을 인식하며, BVH-11 및 BVH-11-2 특이적 모노클로날 항체는 상기 분자들의 가변 부분에 위치하는 헝워결정기와 반응한다. BVH-3 및 BVH-11, 및 BVH-11 및 BVH-11-2는 모노클로날 항체와 그들의 반응성에 의해 구별된다.
실시예 10
본 실시예는S. 뉴모니애로부터 얻은 BVH-3 및 BVH-11 유전자의 동시적 발현에 관해 기술한다.
BVH-3및BVH-11유전자가S. 뉴모니애에서 발현되는 지의 여부를 조사하기 위하여 표준적인 웨스턴 블럿 기술이 사용되었다.S. 뉴모니애균주 SP64 및 SP63은 쵸콜릿 아가 플레이트상에서 5% CO237℃에서 밤새도록 배양하였고, 박테리아는 PBS에 현탁하였으며, 20분간 56℃에서 가열하여 비활성화시켰다. 항원을 준비하기 위하여S. 뉴모니애의 현탁액은 100℃에서 5분간 SDS 및 2-머켑토에탄올(2-mercaptoethanol)이 담겨있는 샘플 버퍼로 처리하였다. 폐렴구균성 단백질 항원은 Laemmli의 방법(Laemmli, Nature, 227, pp. 680-685, 1970)에 따라 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다. SDS-PAGE 수행 후, Towbin의 방법(Towbin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp.4350-4354, 1979)에 따라, 상기 단백질을 겔에서 니트로셀룰로오즈 막으로 전기영동으로 전이시키고, 마우스 항혈청 또는 모노클로날 항체로 조사하였다. 항체에 반응하는 항원을 감지하기 위해서 접합된-항-마우스 면역글로블린 및 유색 물질을 사용하는 간접적인 효소-면역 검정을 수행하였다. 항혈청이 재조합 BVH-3를 증가시킬 시점은S. 뉴모니애SP64 항원에 대하여 측정되었는데, 분자량이 127 kDa 및 99 kDa인 선명한 두 개의 반응 밴드가 나타난다. 동일한 분자량을 갖는 밴드는 또한, 모노클로날 항체 H3-1-F9, H3-1-D4, H3-1-H12, H11-1-E7, H11-1-H10 및 H11-1.1-G11가 면역적인 소식자로서 개별적으로 사용될 때 감지된다. 반대로 BVH-3 분자에 특이적인 모노클로날 항체는 127 kDa 밴드만을 감지하고, BVH-11에 특이적인 모노클로날 항체는 99 kDa 밴드만을 감지하며, 따라서 127 및 99 kDa 밴드가 각각 BVH-3 및 BVH-11와 동일함을 확인할 수 있었다. 상기 연구는 BVH-3 및 BVH-11 단백질이 동시에S. 뉴모니애에 존재한다는 증거를 제공한다. 게다가, 상기 결과는 BVH-3 및 BVH-11가 양쪽 단백질에 공통적인 항원 결정기 및 공통적인 단백질을 배제하는 항원 결정기 모두를 소유하고 있다는 이전의 관찰과도 부합된다.S. 뉴모니애SP64에서, 성숙 BVH-3, BVH-11 및 BVH-11-2는 각각 1019, 821 및 819 아미노산의 단백질이며, 각각 112.5 kDa, 92.4 kDa 및 91.7 kDa의 예측된 분자량을 가지는 단백질이다. 비록, 서열로부터 유추된 분자량과 SDS-PAGE 상에서 측정된 분자량이 일치하지 않아도, BVH-3은 매우 높은 분자량을 가지므로 BVH-11과 구별될 수 있다. 게다가S. 뉴모니애균주 SP63 유래의 BVH-3 분자는 127 kDa인 SP64 균주의 BVH-3과 비교하여 SDS-PAGE 상에서 정확히 112 kDa의 분자량을 가진다. 상기 데이타는S. 뉴모니애균주 SP63 유래의 BVH-3에서 177 아미노산 부분이 결실된 것과 일치한다.
실시예 11
본 실시예는 재조합BVH-3또는BVH-11유전자 결과물 백신이 투여된 마우스를 실험적으로 감염시킨 후 나타나는 보호능에 관한 것이다.
7마리 또는 8마리로 이루어진 암컷 BALB/c 마우스(Charles River) 그룹은 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-3M 융합 단백질, 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-11M 융합 단백질, 또는 대조군으로 PBS에 녹인 QuilA 애주번트를 단독으로 사용하여 3주 간격으로 3번 피하주사하여 면역시켰다. 3번째 면역 후 12 내지 14일 후에, 상기 마우스는S. 뉴모니애WU2 균주를 정맥주사하거나 또는 p4241 균주를 비강 투여하였다. 상기S. 뉴모니애투여 접종의 샘플은 CFU를 결정하고 투여량을 검증하기 위하여 쵸콜릿 아가 플레이트에 도말하였다. 투여량은 약 106CFU이었다. 사망은 14일 동안 기록되었으며, 투여 14일 후에 살아남은 마우스는 사망시킨 다음S. 뉴모니애미생물의 존재 여부를 혈액 샘플로 테스트하였다. 상기 생존율 데이타는 하기 표 6 및 7에 나타내었다.
| 실험 | 면역원 | 생존수:사망수a | 평균 생존일 |
| 1 | BVH-3M없음 | 8:00:8 | 14일 이상1일 |
| 2 | BVH-3M없음 | 8:00:8 | 14일 이상1일 |
a생존 마우스의 수 : 투여 후 14일에 죽은 마우스 수
| 실험 | 면역원 | 생존수:사망수a | 평균 생존일 |
| 1 | BVH-3M없음 | 6:11:7 | 14일 이상4.5일 |
| 2 | BVH-3MBVH-11M없음 | 8:08:00:8 | 14일 이상14일 이상1일 |
a생존 마우스의 수 : 투여 후 14일에 죽은 마우스 수
재조합 BVH-3M 또는 BVH-11M 단백질로 면역된 모든 마우스는 WU2의 감염에 대해서 생존한 반면 애주번트를 투여한 대조군 마우스는 모두 사망하였다. 재조합 BVH-3M 또는 BVH-11M 단백질로 면역된 한 마리를 제외한 모든 마우스는 P4241의 감염에 대하여 생존한 반면 애주번트를 투여한 대조군 마우스는 한 마리만이 생존하였다. 생존한 마우스로 부터 얻은 모든 혈액 배양 결과 투여 14일 후에 음성으로 나타났다. 상기 결과는 BVH-3M 및 BVH-11M 모두가 마우스에 보호적인 항-폐렴 구균 면역 반응을 도출한다는 것을 명백하게 나타낸다. 상기 단백질이S. 뉴모니애분리체들 사이에서 매우 높게 공통적이라는 사실은 보편적인 백신 유력 물질로서 BVH-3 및 BVH-11의 효능을 강조하는 것이다. 실제로, 혈청군 6S. 뉴모니애균주 SP64로부터 얻은 상기 BVH-3 및 BVH-11 단백질은 다른 외피 혈청형의 균주에 의한 폐렴 구균 감염에 대하여 보호능을 나타낸다.
이상적으로, 폐렴 구균 질병을 막을 수 있는 백신은 뇌막염, 중이염, 박테리아 및 폐렴을 막을 수 있다. BVH-3 및 BVH-11은 치명적인 구조적- 및 폐렴 감염 모델에 대해 보호 효과를 가지며, 사람에게 있어서, BVH-3 및 BVH-11-단백질 기본의 백신은 외피 혈청형에 독립적으로 모든S. 뉴모니애에 의해 실질적으로 유발된 질병의 광범위한 스펙트럼의 경우를 감소시킬 수 있다.
표 6 및 7의 데이터는 BVH-3 및 BVH-11 모두가S. 뉴모니애의 보호-유발 물질이라는 것을 명백하게 나타낸다. 그러나, 알려지지는 않았지만 상기 보호 효과는 BVH-3 및 BVH-11 분자 상에 공유되지 않는 특이적 서열에 의해 매개될 수 있다. 암컷 BALB/c 마우스(Charles River) 군은 QuilA 애주번트(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada) 15 ㎍과 함께 친화 정제된 티오레독신-His 표지-BVH-3AD, -BVH-3B 또는 -BVH-3C 융합 단백질을 3주 간격으로 3번 피하주사하여 면역시켰다. 대조군 마우스는 PBS상에 있는 QuilA 애주번트 또는 QuilA와 함께 친화정제된 티오레독신-His 표지 또는 티오레독신-His 표지-융합 단백질(His-Thio)로 면역시켰다.
일련의 절단된 단백질 NEW4, NEW5, NEW6, NEW7, NEW8, NEW9, NEW10, NEW11, NEW14 및 BVH-11B의 보호능을 결정하기 위하여 암컷 BALB/c 마우스(Charles River)는 QuilA 애주번트 15 ㎍과 함께 친화 정제된 His 표지 융합 단백질 25 ㎍ 으로 3주 간격으로 2번 피하주사하여 면역시켰다. 마지막 면역 후 10 내지 14일 후, 상기 마우스에 독성S. 뉴모니애를 접종하였다. 본 발명자들에 의한 결과가 지적하는 바와 같이, BVH-3 분자의 아미노산 512-1039로 이루어지는 절단된 BVH-3 분자인 BVH-3B는 마우스 독성 균주 WU2 및 P4241에 대한 보호능을 나타내었다. 동일하게 각각 BVH-11 분자의 아미노산 354-840, 286-840 및 286-713으로 이루어진 BVH-11 분자의 절단형인 BVH-11B, NEW4 및 NEW5 분자는 정맥주사된 WU2 및 비강 투여된 P4241에 대해 보호능을 나타내었다. 또한, BVH-11-2 분자의 아미노산 272-838 및 아미노산 227-699로 이루어지는 NEW10 및 NEW14의 백신화는 폐렴구균 균주로 인한 사망에 대하여 보호능을 유발하였다. 상기 결과는 각각S. 뉴모니애SP64 BVH-11 및 BVH-11-2 단백질 서열 상의 아미노산 286-713 및 272-699에 걸쳐있는 428개의 아미노산을 포함하는 영역이 보호능을 갖는 항원결정기를 포함한다는 사실을 나타낸다. 상기 영역은 13개 BVH-11 단백질 서열들과 전체적으로는 91% 동일성 및 94% 유사성을 가지며 높은 비율의 공통서열을 갖는다.
a생존한 마우스의 수 : 투여 14일 후 사망한 마우스의 수
bWU2 투여량은 105 CFU
c14일 이상 생존한 마우스는 평균 값의 결정을 위해 생존 기간을 14일로 정하였다.
실시예 12
본 실시예는 BVH-11의 카르복시 말단 영역 C' 말단에 융합된 BVH-3 카르복시 말단 영역에 상응하는 키메라성 폴리펩타이드를 코딩하는 키메라성 유전자의 클로닝 및 발현, 및 상기 키메라성 폴리펩타이드의 백신화 이후에 관찰된 부가적인 보호능에 관하여 기술한다.
전술한 연구에 따르면 BVH-3 및 BVH-11은 혈청군적으로 다른 분자이고,S. 뉴모니애상에 동시에 존재하는 것이 명확하다. 마우스의 면역학적 연구 결과는 상기 두 단백질이 모두 좋은 백신 후보 물질이라는 것을 드러낸다. 이들 단백질은 혈청형에 관계없이 모든 폐렴구균에 대하여 보호능을 제공하는 잠재력을 가지고 있다. 심지어 상기 두 단백질이 항원 결정기 및 서열을 공유하여도, 상기 두 단백질은 다른 특성을 가지며 다른 생물학적 기능을 할 수 있다. 따라서, 상기 두 단백질의 면역은 각각 개별적인 면역에 의해 생성되는 것보다 높은 수준의 보호능을 제공할 수 있다. 이를 시험하기 위하여 전장 또는 절단된 BVH-3 및 BVH-11를 복합 또는 융합의 형태로 투여하는 여러 방법으로 실험하였다. 본 발명자들은 본 명세서에서 New-12라 명명된 BVH-3-BVH-11(서열번호 76 및 58로 각각 표시됨) 융합 유전자의 유전공학 및 상기 New-12 단백질의 백신으로서의 잠재적 용도에 관해 기술한다.
유전자의 3' 말단에 상응하는BVH-3및BVH-11유전자 절편은 각각S. 뉴모니애균주 SP64BVH-3및BVH-11유전자의 뉴클레오타이드 1414 내지 3117(서열번호 1) 및 뉴클레오타이드 1060 내지 2520 (서열번호 3) 부분의 절편은 증폭하기 위하여 제작된 여러쌍의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR로 증폭하였다. 사용한 프라이머 HAMJ278 및 HAMJ279; HAMJ282 및 HAMJ283은 5' 말단에 제한 엔도뉴클레아제를 가지며, 따라서 절단된 pET21b(+) 플라스미드 벡터에 증폭된 결과물의 방향성 원프레임 클로닝이 가능하다. PCR-증폭된 결과물은 제한효소로 절단되었고, 동일한 효소로 절단되어 선형화된 플라스미드 pET21b(+) 벡터에 접합시켰다. 결과적인 플라스미드 구조물은 뉴클레오타이드 서열 분석으로 확인되었다. NdeI-Hind III BVH-3 PCR 결과물을 포함하는 상기 재조합 pET21b(+) 플라스미드는BVH-11유전자 절편을 포함하는 재조합 pET21(+) 벡터로부터 얻은 Hind III-Not I DNA 절편의 프레임 내 클로닝을 위해 제한 효소 Hind III 및 Not I으로 절단되었다. 클론은 키메라성 폐렴 구균의 단백질 분자의 발현을 위해E. ColiBL21(λDE3)로 삽입되기 전에 우선E. ColiDH5α에서 안정화되었다. NEW12라 명명된 상기 재조합 키메라성 폴리펩타이드는 His 표지를 가지고 C-말단 융합의 형태로 발현된다. 상기 발현된 재조합 NEW12 단백질은 초음파 분쇄된 IPTG-증폭E. Coli배양액을 원심분리함으로써 얻어진 상층액 부분으로부터 His-결합 금속 킬레이트화 레진(QIAgen, Chatsworth, CA)을 사용하여 정제되었다.
전술한 내용과 동일한 과정에 따르면, 다른 키메라성 폴리펩타이드를 제조하는 것이 가능한데, 그 결과로는 New1 및 New4, New1 및 New5, New1 및 New10, 또는New1 및 New14의 동시 발현이 가능하다. 상기 제조물은 New1 상류(upstream) 또는 New4, New5, New10, BVH-11B 또는 New14의 하류(downstream)를 포함할 수 있다. BVH-3, BVH-11 또는 BVH-11-2 각 유전자의 두 개 이상의 절편의 동시발현의 결과를 위해 다른 키메라성 폴리펩타이드의 제작도 가능하다.
8마리의 암컷 BALB/c 마우스(Charles River)의 그룹은 QuilA 애주번트 15 ㎍과 친화 정제된 His 표지-융합 NEW1, BVH-11B 또는 NEW12 단백질 25 ㎍을 3주 간격으로 3번 피하주사하여 면역시켰다. 마지막 면역 후 10일 내지 14일 후, 상기 마우스에 독성S. 뉴모니애를 투여하였다. 전술한 바와 같이, 각각 BVH-3 단백질의 아미노산 472에서 1039 및 BVH-11 단백질 아미노산 354-840으로 구성되는 NEW1 및 BVH-11B 분자는 방어적인 면역 반응 도출능이 있는 단백질의 부분과 상응한다. 키메라성 폴리펩타이드가 개별적인 대응물에 대해 보여지는 효과와 비교하여 보호능을 현저하게 향상시키는 지를 결정하기 위하여 투여량은 보호능이 New1 및 BVH-11B 분자에서 기대되지 않는 수준으로 조정되었다. 흥미롭게도, 상기 키메라성 New12 단백질은 마우스에 독성을 나타내는 균주 WU2 및 P4241에 대한 보호능을 도출한다. New 12로 면역된 8마리의 마우스 중 7마리는 투여 후 10일 이후에도 여전히 생존하였으며, New 1, BVH-11B, BVH-3M 또는 애주번트 단독으로 면역된 32 마우스 중 28마리는 투여 후 5일까지 사망하였다. 따라서, NEW12를 사용한 마우스의 백신은 WU2 투여에 대하여 높은 수준의 보호능을 제공하였다. 상기 결과는 키메라성 폴리펩타이드 및 가능하게는BVH-3및BVH-11유전자 결과물을 결합한 면역은BVH-3또는BVH-11항원 단독 처리에 의해 얻어지는 것보다 부가적인 보호능을 제공한다.
실시예 13
본 실시예는S. 뉴모니애이외에 스트렙토코커스 종에 있어서 추가적인 BVH-3 및 BVH-11 관련 서열의 동정에 관하여 기술한다.
BVH-3, BVH-11 및 BVH-11-2이 공통의 서열을 공유하는 관련 단백질의 과라는 것은 이미 전술한 바 있다. 상기 유전자들의 공통적인 영역 뉴클레오타이드 서열을 가지고 동일성 조사를 수행하였으며, 진뱅크(GenBank) 및 FASTA를 이용하여 EMBL 서열과 비교하였다. 가장 현저한 유사성은 그룹 B 스트렙토코커스 또는 GBS라 명명되는S. 아갈락티애의 알려지지 않는 기능을 가진 계산된 서열번호 81로 표시되는 92-kDa 단백질에 해당하는 2.469 kb 유전자 코딩 부분에서 관찰되었다. 상기 유전자는 BVH-71이라 명명하였다. GBS 단백질과 99.2% 동일성 및 99.5% 유사성을 나타내는 단백질은 또한 그룹 A 스트렙토코커스 또는 GAS라 명명되는S. 피오젠(S. pyogenes)에서 동정되었다(서열번호 83). 서열번호 80 및 82로 표시되는 뉴클레오타이드 1 내지 717를 포함하는 BVH-71 서열의 5' 영역은 BVH-3(뉴클레오타이드 1내지 675) 및 BVH-11(뉴클레오타이드 1 내지 684)의 공통 영역과는 각각 58% 및 60% 동일성을 나타내었다. 상기 GBS 및 GAS BVH-71 ORF의 전사된 서열의 첫번째 239 아미노산은 BVH-3 및 BVH-11의 첫번째 225 및 228 아미노산에 각각 51% 및 54% 동일하다. 또한, 구조적 동일성에 있어서, 스트렙토코커스 BVH-3, BVH-11 및 BVH-71 단백질은 또한, 항원성 항원 결정기를 공유한다. 97 kDa 밴드는 BVH-3 및 BVH-11의 공통된 영역에 반응하는 모노클로날 항체 H11-1.1-G11를 사용하여 수행한 GAS 또는 GBS 전체 세포에 대한 웨스턴 블럿상에 나타났다. 동일하게, GAS 및 GBS 재조합 BVH-71 단백질은 웨스턴 면역 블럿 분석상에 감지되었다.
상기 결과는 BVH-71, BVH-3 및 BVH-11 단백질이 동일한 기능을 공유할 수 있다는 사실을 나타낸다. 또한, 본 발명자들의 결과는 BVH-71 단백질이 항-스트렙토코커스의 단백질 백신 성분으로 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 좀 더 구체적으로, 상기 BVH-71 단백질은 항-GAS 또는 항-GBS 백신의 단백질 백신 성분으로 사용될 수 있다.
Claims (32)
- 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 갖는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 제2의 폴리펩타이드와 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합 특이성을 갖는 항체 생성능이 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리형 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 분리형 폴리뉴클레오타이드.
- 제3항의 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 분리형 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- DNA가 발현 조절 영역에 조작적으로 결합된 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- DNA가 발현 조절 영역에 조작적으로 결합된 제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제10항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제11항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 상기 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서 제12항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 공정.
- 상기 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건하에서 제13항에 따른 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 공정.
- 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2의 폴리펩타이드와 적어도 70% 동일성을 갖는 분리형 폴리펩타이드.
- 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 서열을 갖는 제2의 폴리펩타이드에 결합 특이성을 갖는 항체 생성능을 갖는 분리형 폴리펩타이드.
- 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 분리형 폴리펩타이드.
- 제18항에 있어서, 상기 분리형 폴리펩타이드는 N-말단 Met 잔기가 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
- 제18항에 있어서, 상기 분리형 폴리펩타이드는 분비 아미노산 서열(secretory amino acid sequence)이 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
- 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체가 키메라성 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결되는 경우 상기 폴리펩타이드 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로 부터 선택된 두 개 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라성 폴리펩타이드.
- 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이들의 절편, 유사체 또는 유도체가 키메라성 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결되는 경우 상기 폴리펩타이드 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로 부터 선택된 두 개 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라성 폴리펩타이드.
- 구조식 1로 표시되는 키메라성 폴리펩타이드:(구조식 1)상기 식 1에 있어서,m은 0 또는 1,n은 0 또는 1,A는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체;B는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체;C는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체; 및D는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 55 내지 75, 77 내지 79, 81, 83 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로 부터 선택된다.
- 구조식 1로 표시되는 키메라성 폴리펩타이드:(구조식 1)상기 식 1에 있어서,m은 0 또는 1,n은 0 또는 1,A는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이의 절편,유사체 또는 유도체;B는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체;C는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체; 및D는 서열번호 10, 58, 60, 62, 64, 67, 68, 69, 72, 74, 77 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체로 부터 선택된다.
- 제16항 내지 24항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 약학적으로 수용 가능한 운반체, 희석제, 또는 애주번트를 포함하는 백신 조성물.
- 제25항에 따른 조성물의 치료량 또는 예방량을 뇌막염, 중이염, 박테리아 또는 폐렴에 감염되기 쉬운 개체에 투여하는 것을 포함하는 뇌막염, 중이염, 박테리아 또는 폐렴 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제25항에 따른 조성물의 치료량 또는 예방량을 스트렙토코커스가 감염되기 쉬운 개체에 투여하는 것을 포함하는 스트렙토코커스 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 개체는 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 개체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 박테리아는S. 뉴모니애, 그룹 A 스트렙토코커스(피오젠(pyogenes)), 그룹 B 스트렙토코커스(GBS 또는 아갈락티애(agalactiae)), 디스갈락티애(dysgalactiae), 우베리스(uberis), 노카르디아(nocardia) 또는 스타필로코커스 유레우스(Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 박테리아는S. 뉴모니애인 것을 특징으로 하는 방법,
- 상기 조성물의 예방량 또는 치료량을 스트렙토코커스에 감염되기 쉽거나 또는 감염된 동물에 투여하는 것을 포함하는 상기 동물에서 스트렙토코커스 감염을 예방하거나 또는 치료하기 위한 제25항에 따른 백신 조성물의 용도.
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