CN102223876A - 纳米乳剂治疗性组合物及其使用方法 - Google Patents

纳米乳剂治疗性组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗性纳米乳剂组合物及其使用方法。具体而言，本文所述的纳米乳剂用于治疗和/或预防感染(例如，呼吸道感染(例如，与囊性纤维化有关))、用于烧伤创面管理以及用于在施用了免疫原性组合物的受治者中产生有效免疫反应(例如，对伯克霍尔德杆菌属种的细节的免疫反应)的免疫原性组合物(例如，含有伯克霍尔德杆菌抗原)。此外，本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗和预防性药物)、工业和研究应用。

Description

纳米乳剂治疗性组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年9月26日提交的美国临时申请第60/100,559号的优先权，该美国临时申请的全部内容在此通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及治疗性纳米乳剂组合物及其使用方法。具体而言，本文所述的纳米乳剂组合物用于治疗和/或预防感染(例如，呼吸道感染(例如与囊性纤维化有关))，用于烧伤创面管理，以及用于免疫原性组合物(例如，包含伯克霍尔德杆菌抗原)，所述免疫原性组合物在施用了所述免疫原性组合物的受治者体内产生有效免疫反应(例如，抗伯克霍尔德杆菌属种的细菌)。此外，本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗性和预防性药物)、工业和研究应用。
背景技术
由伺机性和/或病原性细菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌)引起的细菌感染是全球发达和不发达地区的主要问题。例如，一些类型的个体易于发生呼吸道感染(例如，由细菌(例如，伺机性细菌)、病毒、真菌和/或寄生虫引起)，所述一些类型的个体包括免疫受损的、年老的、癌症化疗患者、患有哮喘的个体、患有基因遗传疾病(例如，囊性纤维化)的个体和病毒感染的个体(例如，感染了流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒和/或人免疫缺陷病毒)。类似地，在受治者身上存在的创面(例如，烧伤创面)为细菌生长和存活提供了理想的位置。
因为用于医疗、兽医和农业目的的常规药物抗生素的使用已增加，从而伴随出现了病原性细菌的抗生素抗性株。
需要开发抗菌治疗的可选的方案。例如，需要治疗或预防由对目前的抗细菌治疗形式不敏感的细菌菌株引起的细菌感染(例如，菌血症)的新组合物和方法。
发明内容
本发明涉及治疗或预防患有囊性纤维化(CF)的受治者的呼吸道感染的方法。所述方法包括将纳米乳剂施用于所述受治者，其中，所述受治者易受或具有一种或一种以上革兰氏阳性细菌种类或革兰氏阴性细菌种类感染。所述纳米乳剂包括水，至少一种有机溶剂，至少一种表面活性剂，和至少一种油。此外，所述纳米乳剂包括平均直径小于约1000nm的液滴。在本发明的一种实施方式中，所述呼吸道感染与存在于所述受治者的肺部内的细菌生物膜有关。
在本发明的另一实施方式中，描述了治疗或预防具有烧伤创面的受治者中的感染的方法。所述方法包括将纳米乳剂施用于所述受治者，其中，所述受治者易受或具有一种或一种以上革兰氏阳性细菌种类或革兰氏阴性细菌种类感染。所述纳米乳剂包括水，至少一种有机溶剂，至少一种表面活性剂和至少一种油。此外，所述纳米乳剂包括平均直径小于约1000nm的液滴。
对于涉及具有或易受一种或一种以上革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌感染的受治者的方法而言，所述细菌可以是任何已知的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。在本发明的另一实施方式中，所述细菌种类选自：葡萄球菌属、嗜血杆菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德杆菌属、不动细菌属、寡养单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属和变形杆菌属。所述细菌种类还可选自：绿脓杆菌、新洋葱伯克霍尔德杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形杆菌。
在本发明的又一实施方式中，描述了治疗或预防非CF受治者中的流感嗜血杆菌感染的方法。所述方法包括将纳米乳剂施用于具有流感嗜血杆菌感染或处于具有流感嗜血杆菌感染的风险中的受治者。所述纳米乳剂包括水、至少一种有机溶剂、至少一种表面活性剂和至少一种油。此外，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。
本文所述的所有方法还可包括在施用所述纳米乳剂之前、之中或之后施用一种或一种以上抗生素。在一种实施方式中，纳米乳剂的施用和至少一种抗生素的施用起协同作用。“协同作用”可通过部分抑菌浓度(FIC)指数，部分杀菌浓度(FBC)指数或其组合来定义。包括施用抗生素在内的方法涵盖使用任何抗生素。示范性的抗生素包括但不限于：多粘菌素抗生素(例如粘菌素)或任何氨基糖苷(例如托普霉素)。优选地，在本发明的使用抗生素的方法中，所述纳米乳剂与抗生素不表现出任何拮抗作用。
对于本文所述的所有方法而言，优选地，所述纳米乳剂表现出最小或无毒性或副作用。此外，优选地，所述纳米乳剂不表现出抗性。在适用于本文所述的所有方法的另一实施方式中，所述纳米乳剂的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)或其组合表明了所述纳米乳剂的抑菌活性或杀菌活性。
对于本文所述的所有方法而言，一种或一种以上细菌种类可对一种或一种以上抗生素表现出抗性。例如，所述细菌种类可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
在本发明的方法的一种实施方式中，所述纳米乳剂在人类受治者体内不被全身性吸收或非常少的纳米乳剂在人类受治者体内被全身性吸收。
在本发明的方法中，所述纳米乳剂可使用任何药学上可接受的方法来递送。例如，所述纳米乳剂可通过吸入递送、局部递送、局部递送至粘膜表面、通过雾化作用递送或通过任何它们的组合递送。
本发明还包括在本发明的方法中有用的组合物。示范性的组合物包括但不限于：包含(a)水；(b)乙醇或甘油；(c)氯化十六烷基吡啶(CPC)，或苯扎氯铵，或烷基二甲基氯化苄基铵(BTC 824)；(d)大豆油；和(e)泊罗沙姆407，吐温80或吐温20的纳米乳剂。在附加的实施方式中，所述纳米乳剂还可包含EDTA。
上述一般性描述和下面附图说明以及具体实施方式是示范性和解释性的并且意在对本发明要求保护的内容提供进一步的解释。根据下面对本发明的详细描述，其他目的、优点和新特性对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了由单独的20％纳米乳剂(NE)或由20％纳米乳剂(NE)和20mM EDTA一同在PBS中在10分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌。
图2显示了由单独的20％NE或由20％NE和20mM EDTA一同在PBS中在20分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌。
图3显示了由单独的20％NE或由20％NE和20mM EDTA一同在PBS中在40分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌。
图4显示了(A)由单独的20％NE或由20％NE和20mM EDTA一同在PBS中在40分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌；(B)由单独的20％NE或由20％NE和20mM EDTA一同在PBS中在60分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌；以及(C)由单独的20％NE或由20％NE和20mM EDTA一同在PBS中在60分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌。
图5显示了由单独的NE和NE与EDTA一同在高渗盐水(6％NaCl)中在15分钟和30分钟杀死洋葱伯克霍尔德杆菌。
图6显示在7％NaCl中在15分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌和绿脓杆菌。
图7显示在7％NaCl中在15分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌和绿脓杆菌(混合培养)。
图8显示了微量滴定连续稀释MIC分析。显示板上的数字说明了加至每个孔容积的P4075EC的浓度(μg/ml CPC)。加至每列中的孔中的细菌种类在左侧显示。这些菌株的MIC(从上至下)为≤15.6μg/ml，125μg/ml和31.2μg/ml。
图9显示了150种伯克霍尔德杆菌和非伯克霍尔德杆菌菌株的P4075EC的MIC分布。
图10显示了P4075EC活性的时间杀死研究和CF痰液对P4075EC活性的浓度依赖抑制作用。(A)将105CFU/ml B.multivorans ATCC17616暴露于接近MIC(62.5μg/ml)的各种浓度的P4075EC并且在所显示的时间来测定存活的细菌计数。(B)在测定存活的细菌计数之前，在存在三种浓度的CF痰液的条件下，将105CFU/ml B.multivorans ATCC17616暴露于各种浓度的P4075EC持续24小时。嵌入框中的数字和标记显示了所使用的P4075EC(μg/ml CPC)的浓度。
图11显示了P4075EC的体外活性。
图12显示了P4075EC抗生物膜细菌的体外活性和在存在CF痰液的情况下的体外活性。
图13显示了P4075EC对洋葱伯克霍尔德杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌单独的生物膜的影响。
图14显示了P4075EC对混合的生物膜的影响。
图15显示了P4075EC对混合的生物膜的影响。
图16显示了P4075EC对洋葱伯克霍尔德杆菌生物膜的漏出的集落的影响。
图17显示了在本发明的一种实施方式中P4075EC的连续两倍稀释。
图18显示了CF患者中呼吸道感染的年龄特异性流行程度。
图19A显示了部分抑菌浓度指数。
图19B显示了说明抗菌剂A(mg/mL)和抗菌剂B(mg/mL)的拮抗作用、无相互关系和协同作用的图。
图20A至图20D显示了电子显微图片。图20A显示了0分钟，没有处理的对照；图20B显示了处理后10分钟；图20C显示了处理后20分钟；以及图20D显示了处理后30分钟。
图21显示了局部施用纳米乳剂降低绿脓杆菌在烧伤创面中的生长。雄性Sprague-Dawley大鼠受到部分皮层烧伤。受伤后8小时，将动物与106CFU的绿脓杆菌一同孵育。在受伤后16和24小时，用局部盐水(对照)，安慰剂(W205GBA2ED不含苯扎氯铵)，W205GBA2ED(纳米乳剂)或磺胺米隆(醋酸磺胺米隆)来治疗动物。32小时处死动物，获得皮肤样本并对皮肤样本进行均化、平板种植和CFU计数。分散的点表示每个单独的动物的培养的CFU。每组的中值绘制为水平线。23个NB-201治疗动物中的12个中的病原体生长最小。基于阳性定量创面培养，具有烧伤的大部分对照动物(29/32)和安慰剂(9/12)动物有明显的伤口感染，较用W205GBA2ED治疗的动物的创面中存在明显较多的细菌。Kruskal-Wallis测试p＜0.0001，盐水和W205GBA2ED，安慰剂和W205GBA2ED以及盐水和磺胺米隆的Dunn多组比较测试p＜0.05。
图22显示了烧伤后纳米乳剂治疗减小了真皮促炎细胞因子的表达。分组为假烧伤、烧伤和用W205GBA2ED治疗烧伤(n＝8至10/组)。A)IL-1β(p＝0.02，单因素方差分析)，B)IL-6(p＝0.8)，C)TNF-α(p＝0.5)，D)CINC(p＝0.04)，E)CINC-3(p＝0.005)，以及F)髓过氧化物酶(p＝0.07)。当与未治疗的部分皮层烧伤的动物比较时，用纳米乳剂治疗的烧伤动物的IL-1β(1773±516vs.5625±1743pg/mL)和CINC-3(225±66vs.1589±527pg/mL)的水平降低。t-测试或Tukey多组比较测试*p＜0.05。
图23显示了烧伤感染绿脓杆菌后用纳米乳剂治疗减小了真皮促炎细胞因子的表达。所有动物都有烧伤并且分组为盐水、安慰剂W205GBA2ED和磺胺米隆(n＝10至30/组)。A)IL-1β(p＝0.001，单因素方差分析)，B)IL-6(p＝0.07)，C)TNF-α(p＝0.3)，D)CINC-1(p＝0.8)，E)CINC-3(p＝0.4)和F)髓过氧化物酶(p＝0.0001)。用纳米乳剂治疗的烧伤创面感染的动物的IL-1β(1007±157vs.3054±499pg/mL)和IL-6(244±51vs.485±73pg/mL)的水平降低。当与盐水和安慰剂比较时，纳米乳剂和磺胺米隆治疗组显示出降低的真皮嗜中性粒细胞螯合作用，其由髓过氧化物酶分析证明(W205GBA2ED：0.09±0.02，磺胺米隆：0.08±0.02，盐水：0.40±0.06，安慰剂：0.45±0.11μg/mL)。Tukey多组比较测试*p＜0.05。
图24显示烧伤上调真皮TGF-β表达并且在烧伤创面处用纳米乳剂治疗使创面中的TGF-β水平降低。在用纳米乳剂治疗的动物中测量烫伤后32小时烧伤创面中的抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的真皮水平，并且在暴露于细菌并用纳米乳剂或磺胺米隆治疗的动物中测量烧伤后32小时烧伤创面中的抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的真皮水平。A)IL-10(p＝0.4，单因素方差分析)，和B)TGF-β(p＝0.0001)。与假烧伤(624±55vs.232±17pg/mL)相比，部分皮层烧伤增加了真皮TGF-β的存在。与未治疗的烧伤组(404±43vs.624±55pg/mL)相比，用W205GBA2ED治疗感染的烧伤创面显著降低了TGF-β的真皮水平。磺胺米隆治疗不抑制感染的烧伤创面中的IL-10或TGF-β的水平。Tukey多组比较测试*p＜0.05。
图25显示了绿脓杆菌感染且用盐水或纳米乳剂治疗后的烧伤皮肤的横截面组织学。皮肤的视图均为烧伤后32小时。A)盐水(对照)治疗的动物(苏木精和曙红x40)的代表性部分。B)W205GBA2ED(纳米乳剂)治疗的动物(苏木精和曙红x40)的代表性剖面。
图26显示了伊文思蓝分析定量毛细血管渗漏和组织水肿。伊文思蓝是与血清白蛋白结合的染料并且其可定量测定血管渗透性。当与由盐水治疗的对照动物(1.26±0.05vs.1.93±0.24μg伊文思蓝/mg组织，n＝8/组)相比时，局部纳米乳剂治疗导致烧伤后毛细血管渗漏较少和创面的细菌接种较少。t-测试*p＝0.02。
图27显示了用TUNEL染色以检测毛囊细胞凋亡的荧光标记的部分皮层烧伤的皮肤的显微照片。在烧伤后12小时收集皮肤样本。在烧伤后0小时和8小时进行治疗。所有图像为40倍放大。
图28显示了部分皮层烧伤后的毛囊细胞凋亡的TUNEL分析。来自假烧伤，烧伤+盐水(对照)，烧伤+安慰剂(W205GBA2ED不含苯扎氯铵)和烧伤+W205GBA2ED的皮肤样本被切下用于荧光素标记的TUNEL分析。治疗在烧伤后0小时和8小时进行。在本实验中在烧伤的皮肤上没有接种细菌。烧伤后12小时收集的组织样本的烧伤的动物和治疗的动物中的毛囊凋亡的程度显著降低(p＝0.006，单因素方差分析)。假烧伤和烧伤+盐水，烧伤+盐水和烧伤+安慰剂，以及烧伤+盐水和烧伤+W205GBA2ED之间发现了差异(Tukey多组比较测试*p＜0.05)。
图29显示了OMP制剂的特性。A)琼脂凝胶电泳和溴化乙锭染色。第1行，DNA梯；第2行，高速离心分离之前完整细胞溶解产物(WCL)；第3行，以100,000x g离心之后的上清液(图1B，1C和1D的B行)；第4行，粗OMP制剂(图1B，1C和1D的C行)；第5行，去除内毒素(ET)的OMP片段(图1B，1C和1D的E行)。以体积方式负载银染色剂B)和OMP制剂的western印迹(C-D)。A行，负载6000x g离心后产生的上清液中的蛋白质；B行，来自100,000x g离心的等体积上清液；C行，粗OMP(100,000x g转的重悬颗粒片段)；D-J行，去除内毒素的OMP片段(内毒素柱连续流过片段)；K-N行，内毒素柱留滞片段(加入脱氧胆酸钠之后的柱中再生的连续流体)。C)用来自由去除内毒素的OMP-NE制剂免疫的小鼠的血清标记的western印迹。D)用来自PBS制剂中的OMP免疫的小鼠的血清标记的western印迹。
图30显示了抗体对新洋葱伯克霍尔德杆菌OMP的反应。A)在具有OMP制剂(含有或不含纳米乳剂)的免疫后血清中IgG反应的ELISA结果。血清抗-OMP IgG抗体浓度表示为单独的sera±SEM中的终点滴定量的平均值。*表示抗-OMP IgG滴定量中的统计学差异(p＜0.05)。B)施用含有或不含纳米乳剂的鼻部疫苗之后粘膜抗体sIgA和IgG抗OMP。sIgA和IgG在BAL溶液中测量。OD水平被标准化为样本中的总蛋白质含量。
图31显示了由鼻部OMP-NE疫苗诱导的细胞免疫反应的类型。A)分析来自用混合了NE(OMP-NE)或PBS(OMP-PBS)中的任一种的5ug OMP来免疫的小鼠的血清的抗体亚型分布。结果表示为特异性亚类IgG与全部IgG滴定量的比值。*表示IgG2b和IgG1亚型之间的统计学差异(p＜0.05)。B)用混合了NE(OMP-NE)或PBS(OMP-PBS)中的任一种的5ug来免疫的小鼠的脾细胞的细胞因子特性。数据表示为与OMP活化的和未活化的脾细胞相比的变化倍数±SEM并且标准化为未预防接种的小鼠中的反应。*表示OMP-NE和PBS组中的OMP之间的统计学差异。
图32显示了识别OMP制剂中蛋白质表位和LPS。第1行，蛋白质梯；第2行，粗OMP制剂；第3行，蛋白酶K消化的粗OMP制剂；第4行，去除内毒素的OMP；第5行，蛋白酶K消化的去除内毒素的OMP。western印迹用来自PBS中的OMP的血清或来自OMP-NE免疫的小鼠的血清来标记或用所说明的单克隆抗鼻疽假单胞菌LPS抗体来标记。
图33显示了血清中和分析。绘制新洋葱伯克霍尔德杆菌或B.multivorans的cfu的降低百分比随具有原血清的样本的变化。观察到用OMP-NE免疫的小鼠的血清与用PBS制剂中的OMP免疫的小鼠的血清在新洋葱伯克霍尔德杆菌中和活性方面有统计学差异(5ug OMP-NE的p＝9.9x 10-5，15ug OMP-NE的p＝0.03)。观察到用OMP-NE免疫的小鼠的血清和原小鼠的血清的B.multivorans交叉中和活性(p＝0.04)。*表示OMP-NE和PBS中的OMP在中和活性方面的统计学显著差异(p＜0.05)。**表示OMP-NE接种的小鼠和原小鼠在中和活性方面的统计学显著差异(p＜0.05)。
图34显示了肺和脾脏的定殖分析。A)相关肺组织和B)cfu相关的脾脏组织，cfu在5x 107cfu的新洋葱伯克霍尔德杆菌气管内挑战试验后六天来测定。
定义
为了有利于理解本发明，下面定义一些术语和词组：
本文使用的术语“微生物”是指任何种类或类型的微生物，包括但不限于：细菌、病毒、古细菌、真菌、原生生物、支原体、朊病毒和寄生生物。术语微生物包括存在于另一生物体中且其自身对另一生物体(例如包括人类在内的动物和植物)是致病性的那些生物体以及产生对另一生物体是致病性的药剂的那些生物体，而所述生物体其自身对其他生物体不是直接致病性的或感染性。
本文使用的术语“病原体”是指导致宿主中的疾病状态(例如，感染，败血症，等等)的生物剂。“病原体”包括但不限于：病毒、细菌、古细菌、真菌、原生生物、支原体、朊病毒和寄生生物。
术语“细菌”是指所有原核生物，包括在原核生物界中所有分类中的那些原核生物。该术语意在包括被认为是细菌的所有微生物，包括：支原体、衣原体、放线菌、链霉菌和立克次体。本术语的定义包括了细菌的所有形式，包括球菌、杆菌、螺旋体、原生质球形体、原生质体，等等。还包括在本术语内的是原核生物，所述原核生物是革兰氏阴性或革兰氏阳性。“革兰氏阴性”和“革兰氏阳性”是指用革兰氏染色方法的染色模式，这在本领域是众所周知的(参见例如，Finegold and Martin，Diagnostic Microbiology，6th Ed.，CV Mosby St.Louis，pp.13-15(1982))。“革兰氏阳性细菌”是保留了革兰氏染色中所使用的主要染料的细菌，所述革兰氏染色使得被染色的细胞在显微镜下通常表现出深蓝色至紫色。“革兰氏阴性细菌”没有保留革兰氏染色中所使用的主要染料，但是被复染剂染色。因此，革兰氏阴性细菌通常表现出红色。在一些实施方式中，细菌被连续培养。在一些实施方式中，不培养细菌并且细菌存在于它们的天然环境中(例如创面或感染位置)或从患者组织获得细菌(例如，通过活检)。细菌可表现出病理学生长或增殖。细菌的实例包括但不限于选自下列细菌属的细菌细胞，所述细菌属包括：沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱文菌属(Ewingella)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、动性球菌属(Planococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧球菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、邻单胞菌属(Plessiomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、支原体属(Mycoplasma)、尿素原体属(Ureaplasma)、立克次体(Rickettsia)、考克斯氏体(Coxiella)、罗长利马氏体菌属(Rochalimaea)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、气球菌属(Aerococcus)、兼性双球菌属(Gemella)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、足球菌属(Pedicoccus)、杆状菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、李氏杆菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、加德纳菌属(Gardnerella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弓形杆菌属(Arcobacter)、拟杆菌属(Wolinella)、螺杆菌属(Helicobacter)、无色菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、埃肯菌属(Eikenella)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄质菌属(Flavobacterium)、莫拉克氏菌属(Moraxella)、寡源杆菌属(Oligella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、威克氏菌属(Weeksella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、博得特氏菌属(Bordetella)、弗朗西斯氏菌属(Franciesella)、布鲁氏菌属(Brucella)、军团菌属(Legionella)、埃菲比体属(Afipia)、巴尔通氏体属(Bartonella)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、心杆菌属(Cardiobacterium)、链球杆菌属(Streptobacillus)、螺菌属(Spirillum)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、叠球菌属(Sarcinia)、粪球菌属(Coprococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、真细菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、罗思氏菌属(Rothia)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、类杆菌属(Bacteroides)、卟啉菌属(Porphyromonas)、普氏菌属(Prevotella)、梭菌属(Fusobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、纤毛菌属(Leptotrichia)、沃琳菌属(Wolinella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、诺卡氏菌属(Norcardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、拟诺卡氏菌属(Norcardiopsis)、链霉菌属(Streptomyces)、小多孢菌属(Micropolysporas)、高温放线菌属(Thermoactinomycetes)、分支杆菌属(Mycobacterium)、密螺旋体(Treponema)、包柔氏螺旋体(Borrelia)、钩端螺旋体(Leptospira)和衣原体(Chlamydiae)。
本文使用的术语“微生物(microorganism和microbe)”是指任何种类或类型的微生物，包括但不限于：细菌、古细菌、真菌、原生生物、衣原体和寄生生物。
本文使用的术语“真菌”是指诸如霉菌和酵母菌之类的真核生物体，包括双态性真菌。
除非本文另有说明，本文使用的术语“疾病”和“病理状况”互换使用，是指偏离了一类成员或一组成员(例如人类)的所认为的正常或平均状态，并且术语“疾病”和“病理状况”在不利于一类或一组成员中的大多数个体的条件下对受到影响的人有害。所述偏离正常或平均状态可表现为状态、征兆和/或症状(例如，腹泻、恶心、发烧、疼痛、水泡、疮、疹子、免疫抑制、炎症，等等)，所述状态、征兆和/或症状与受治者的正常状态的任何损伤或受治者的器官或组织的任何损伤有关，所述损伤中断或改变了正常功能的表现。疾病或病理状况可由与微生物接触导致或引起(例如，病原体或其他感染因素(例如病毒或细菌))，疾病或病理状况可对环境因素(例如，营养不良、工业危害和/或气候)产生响应，可对生物体的固有缺陷(例如，基因异常)或上述这些引起疾病或病理状况的因素和其他因素的结合产生响应。
“呼吸(respiratory和respiration)”是指通过身体系统(包括鼻子、咽喉、喉头、气管、支气管和肺)将氧吸入体内且将二氧化碳排出的过程。
“呼吸感染”和“肺部感染”是指呼吸道的感染(例如，细菌、病毒、真菌，等等)。人体内，呼吸道包括上呼吸道(例如，鼻子、咽喉或咽头和喉头)；气道(例如，喉或喉头、气管(windpipe或trachea)和支气管)；和肺部(例如，支气管、细支气管、肺泡小管、肺泡小囊和肺泡)。
“呼吸疾病”，“肺部疾病”，“呼吸失调”，“肺部失调”“呼吸病症”，“肺部病症”，“肺部综合症”和“呼吸综合症”是指涉及炎症并影响呼吸系统的组件的严重疾病中的任何一种，所述呼吸系统尤其包括气管、支气管和肺部。这些疾病的实例包括：急性肺泡性疾病、阻塞性呼吸疾病(例如，哮喘、支气管炎和慢性阻塞性肺病(称为COPD))，上气道疾病(例如，中耳炎和鼻炎/鼻窦炎)，间质性肺病，过敏症和呼吸道感染(例如，肺炎、卡氏肺囊虫肺炎(pneyumocystis carinii)和呼吸道合胞病毒(RSV))。
急性肺泡性疾病的具体实例包括：急性肺损伤(ALI)，急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，胎粪吸入综合症(MAS)和呼吸窘迫综合症(RDS)。ALI与直接或间接地损伤肺部肺泡的病症有关。ALI是炎症和与肺表面活性剂层的分解有关的肺渗透性增加的综合症。ALI最严重的症状是ARDS。导致ALI的原因很复杂，通常与一些重大手术、诱导肺部损伤的呼吸器(通常称为VILI)，吸入烟尘、肺炎和败血症有关。
本文使用的术语“受治者”是指用本发明的组合物治疗的生物体。这些生物体包括动物(家养的动物种类，野生动物)和人类。
本文使用的术语“灭活(inactivating和inactivation)”以及等同用语当用于微生物时是指杀死、消除、中和和/或降低微生物在宿主体内感染和/或引起病理学反应和/或疾病的能力。
本文使用的术语“融菌剂(fusigenic)”意在指代能够与微生物体(例如细菌或细菌孢子)的膜融合的乳剂。融菌剂乳剂的具体实例在本文中描述。
本文使用的术语“溶菌剂(lysogenic)”是指能够分解微生物体的膜(例如病毒(例如病毒包膜)或细菌、细菌孢子或细菌生物膜)的乳剂(例如，纳米乳剂)。在本发明优选的实施方式中，与融菌剂和溶菌剂中任一种单独存在相比较，在相同的组合物中存在融菌剂和溶菌剂产生提高的灭活效果。
本文使用的术语“纳米乳剂”包括分散体或液滴和其他脂质结构，当水不可混合的油相与水相混合时，所述脂质结构可由驱动非极性残基(即，长链烃)远离水且驱动极性头端朝向水来形成。这些其他脂质结构包括但不限于：单层、寡层(paucilamellar)和多层脂质囊泡、胶束和层状相。
本文使用的术语“接触”和“暴露”当用于纳米乳剂和活的微生物时，是指使一种或一种以上纳米乳剂与微生物(例如病原体)接触从而使得纳米乳剂杀死微生物或病原体(如果存在的话)和/或减缓微生物或病原体(如果存在的话)的生长。本发明不受用于杀死微生物和/或减缓微生物生长的纳米乳剂的量或类型的限制。发现用于本发明的多种纳米乳剂在本文和其他地方(例如在美国专利申请第20020045667号和第20040043041号以及美国专利第6,015,832号，第6,506,803号，第6,635,676号，和第6,559,189号中所描述的纳米乳剂，上述美国专利申请和美国专利的全部内容通过引用并入本文用于所有目的)被描述。本发明中涉及的纳米乳剂的比例和量包括但不限于本文所述的那些比例和量(例如，实施例1至4以及与其有关的附图和附图17)。
本文使用的“约”会被本领域普通技术人员理解并且根据其所使用的语境有一定程度的变化。如果在给定的语境中本领域普通技术人员对该术语的使用不清楚，“约”是指具体术语的正负10％。
术语“表面活性剂”是指具有极性头端和疏水尾端的任何分子，所述极性头端非常倾向于被水溶剂化，所述疏水尾端不容易被水溶剂化。术语“阳离子表面活性剂”是指具有阳离子头端的表面活性剂。术语“阴离子表面活性剂”是指具有阴离子头端的表面活性剂。
术语“亲油亲水平衡指数”和“HLB指数”是指将表面活性剂分子的化学结构和表面活性剂分子的表面活性相互关联的指数。HLB指数可通过如Meyers(Meyers，表面活性剂科学和技术(Surfactant Science and Technology)，VCH Publishers Inc.，New York，pp.231-245[1992]，通过引用并入本文)所述的多种经验公式来计算。本文使用的表面活性剂HLB指数是对应于McCutcheon’s第1卷：乳化剂和洗涤剂(北美版，1996，通过引用并入本文)中的表面活性剂的HLB指数。商售的表面活性剂的HLB指数为0至约70或更高。在水中具有高溶解度且具有增溶性质的亲水性表面活性剂在高值端，而在水中具有低溶解度并且在油中是水的良好增溶剂的表面活性剂在低值端。
本文使用的术语“相互作用促进剂(interaction enhancer)”是指在提高乳剂与微生物(例如，细菌(例如革兰氏阴性菌)的细胞壁)或病毒包膜的接触方面起作用的化合物。本文涉及的相互作用促进剂包括但不限于：螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(氨乙基醚)四乙酸(EGTA)等等)和一些生物学药剂(例如，牛血清白蛋白(BSA)等等)。
术语“缓冲液”或“缓冲剂”是指当加至溶液中时，使溶液抗pH变化的物质。
术语“还原剂”和“电子供体”是指向另一物质供给电子以还原所述另一物质的原子中的一个或一个以上的氧化状态的物质。
术语“单价盐”是指在溶液中，该盐中的金属(例如，Na，K或Li)具有1+净电荷的任何盐。
术语“二价盐”是指在溶液中，该盐中的金属(例如，Mg，Ca或Sr)具有2+净电荷的任何盐。
术语“螯合剂(chelator或chelating agent)”是指含具有适用于键合至金属离子的孤对电子的一个以上原子的任何物质。
术语“溶液”是指水性和非水性的混合物。
本文使用的术语“有效量”是指足以实现有益效果或期望的结果(例如，治疗和/或预防感染(例如，通过杀死细菌细胞和/或阻止细菌细胞生长))的组合物(例如含纳米乳剂的组合物)的量。有效量可以一种或一种以上给药方式，应用方式或剂量来施用并且无意限定具体的剂型或给药途径。
本文使用的术语“用于诱导免疫反应的组合物”是指当施用于受治者(例如一次，两次，三次或更多次(例如分为几个周、几个月或几年))时，刺激、产生和/或诱发受治者体内的免疫反应(例如，导致对能够引起疾病的微生物(例如病原体)总体或部分免疫性)的组合物。在本发明优选的实施方式中，所述组合物包括纳米乳剂和免疫原。在更优选的实施方式中，含有纳米乳剂和免疫原的组合物包括一种或一种以上其他化合物或药剂，包括但不限于：治疗剂、生理上可耐受的液体、凝胶、载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、水杨酸盐、类固醇、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗体、细胞因子、抗生素、粘合剂、填充剂、防腐剂、稳定剂、乳剂和/或缓冲剂。免疫反应可以是固有(例如，非特异性)免疫反应或获得性(例如，后天的)免疫反应(例如降低感染性、发病率或受治者的发病死亡率(例如由暴露于致病性微生物引起)或预防感染、发病或受治者的发病死亡(例如由暴露于致病性微生物引起))。因此，在一些优选的实施方式中，将含有纳米乳剂和免疫原的组合物作为疫苗施用于受治者(例如，以预防或缓解疾病(例如，通过向受治者提供抗疾病的全部或部分免疫性或全部或部分缓解(例如抑制)疾病的征兆、症状或病症))。
本文使用的术语“佐剂”是指可刺激免疫反应(例如，粘膜免疫反应)的任何物质。一些佐剂使得免疫系统的细胞活化(例如，佐剂可使得免疫细胞产生和分泌细胞因子)。可使得免疫系统的细胞活化的佐剂的实例包括但不限于：本文所述的纳米乳剂制剂；从Q皂树的树皮纯化得到的皂素，例如QS21(用HPLC分馏在第21峰处洗提的糖脂类，Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Worcester，Mass)；聚(二(羧基苯氧基)磷腈)(PCPP聚合物；病毒研究中心(Virus Research Institute)，USA)；诸如单磷酰基脂质A(MPL，Ribi免疫化学研究公司(Ribi ImmunoChem Research，Inc.)Hamilton，Mont)、胞壁酰二肽(MDP，Ribi)和苏氨酰基-胞壁酰二肽(t-MDP，Ribi)之类的脂多糖的衍生物；OM-174(与脂质A相关的葡萄糖胺二糖；OM制药SA，Meyrin，新西兰)；霍乱毒素(CT)和利士曼原虫延伸因子(纯化的利士曼原虫蛋白质；Corixa公司，西雅图，华盛顿)。传统的佐剂是本领域公知的并且包括例如磷酸铝或碱式盐(“铝”)。在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物与一种或一种以上佐剂一同施用(例如，以使免疫反应偏向于Th1和/或Th2型反应)。
本文使用的术语“诱导免疫反应的有效量”(例如用于诱导免疫反应的组合物的有效量)是指刺激、产生和/或诱发受治者体内的免疫反应所需的剂量水平(例如，当施用于受治者时)。有效量可以一种或一种以上给药方式(例如，通过相同或不同的途径)、应用形式或剂量来施用并且无意限定具体的剂型或给药途径。
本文使用的术语“在使所述受治者产生免疫反应的条件下”是指任何定性或定量诱导、产生和/或刺激免疫反应(例如，固有的或后天的)。
本文使用的术语“免疫反应”是指由受治者的免疫系统任何可检测的反应。例如，免疫反应包括但不限于：Toll受体活化中的改变(例如，增加)，淋巴因子(例如，细胞因子(例如Th1或Th2型细胞因子)或趋化因子)表达和/或分泌，巨噬细胞活化，树突状细胞活化，T细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)活化，NK细胞活化和/或B细胞活化(例如，产生和/或分泌抗体)。免疫反应的其他实例包括：将免疫原(例如，抗原(例如免疫原性多肽))与MHC分子结合并诱导细胞毒素T淋巴细胞(“CTL”)反应，诱导B细胞反应(例如产生抗体)和/或T辅助淋巴细胞反应，和/或延迟型过敏症(DTH)反应(例如，抗来自免疫原性多肽的抗原)，免疫系统细胞(例如，T细胞，B细胞(例如任何发展阶段(例如血浆细胞)))扩展(例如细胞群生长)和通过抗原表达细胞来增加抗原的处理和表达。免疫反应可以是对免疫原的反应，受治者的免疫系统将所述免疫原识别为异物(例如，来自微生物(例如病原体)的非自身抗原，或被识别为异物的自身抗原)。因此，应当理解的是，本文使用的“免疫反应”是指任何类型的免疫反应，包括但不限于：固有的免疫反应(例如Toll受体信号级联的活化)，细胞介导的免疫反应(例如由T细胞(例如抗原特异性T细胞)介导的反应和免疫系统的非特异性细胞介导的反应)以及体液免疫反应(例如由B细胞介导的反应(例如，通过将抗体产生和分泌至血浆、淋巴和/或组织体液内))。术语“免疫反应”意在包括受治者的免疫系统对抗体和/或免疫原产生反应的能力的所有方面(例如，对免疫原(例如病原体)的最初反应和由适应性免疫反应引起的后天(例如记忆)反应)。
本文使用的术语“免疫”是指在暴露于能够引起疾病的微生物(例如，病原体)之后预防疾病(例如，预防或缓解(例如，抑制)疾病的征兆、症状或病症)。免疫性可以是天生的(例如，非适应性的(例如，非后天的)免疫反应，其在先前未暴露于抗原的情况下存在)和/或后天的(例如，在暴露于抗原之后由B细胞和T细胞介导的免疫反应(例如，表现出对抗原的特异性和反应性提高))。
本文使用的术语“免疫原”和“抗原”互换使用，是指能够诱发受治者体内的免疫反应的药剂(例如，微生物(例如，细菌，病毒或真菌)和/或其部分或成分(例如蛋白抗原))。在优选的实施方式中，当与本发明的纳米乳剂联合施用时，免疫原诱发抗免疫原(例如微生物(例如，病原体或病原体产物))的免疫性。本文使用的术语伯克霍尔德抗原是指伯克霍尔德杆菌属的细菌的成分或产物，所述伯克霍尔德杆菌属的细菌当施用于受治者时诱发免疫反应。抗原可以是源自生物体(例如伯克霍尔德杆菌属的细菌)的成分或产物，包括但不限于：多肽、肽、蛋白质、核酸、膜片段和多糖。
本文使用的术语“提高的免疫性”是指与没有施用组合物的受治者的适应性免疫性水平和/或获得性免疫性水平相比较，在施用了组合物之后受治者对给定免疫原(例如，微生物(例如，病原体))的适应性免疫性和/或获得性免疫性的水平得以提高。
本文使用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样本或组合物中除去污染物或不想要的化合物。本文使用的术语“基本纯化的”是指从样本或组合物中除去70％至90％，高达100％的污染物或不想要的化合物。
本文使用的术语“给药(administration和administering)”是指将药物、前药或其他药剂或治疗方案(例如，本发明的组合物)给予生理学系统(例如，受治者或体内，体外或取自活体的细胞，组织和器官)的行为。
本文使用的术语“联合给药”是指将至少两种药剂(例如，纳米乳剂和一种或一种以上其他药学上可接受的物质(例如第二纳米乳剂))或治疗剂施用于受治者。在一些实施方式中，两种或两种以上的药剂或治疗剂的联合给药同时发生。在其他实施方式中，第一药剂/治疗剂在第二药剂/治疗剂之前施用。在一些实施方式中，联合给药可以通过相同或不同的给药途径。本领域技术人员理解的是所使用的各种药剂或治疗剂的剂型和/或给药途径可不同。联合给药的合适的剂量可容易地由本领域技术人员确定。在一些实施方式中，当联合施用药剂或治疗剂时，各个药剂或治疗剂以比单独施用的合适剂量更低的剂量来施用。因此，联合给药在如下实施方式中尤其理想：药剂或治疗剂的联合给药降低了潜在有害的(例如有毒的)药剂的需要剂量和/或当两种或两种以上药剂联合给药导致受治者对通过其他药剂的联合给药的药剂中的一种的有益效果敏感时。在其他实施方式中，联合给药优选地治疗和/或预防由一种以上类型的病原体(例如，细菌和/或病毒)引起的感染。
本文使用的术语“局部地”是指将本发明的组合物(例如，含纳米乳剂的组合物)施用于皮肤表面和/或粘膜细胞和组织(例如，肺泡、口腔、舌、咀嚼肌、阴道或鼻粘膜和其他组织和中空器官或体腔中的细胞)的表面。本文所述的组合物可使用任何药学上可接受的方法来应用，例如，鼻内、口腔、舌下、口服、直肠、眼部、肠胃外(静脉、皮内、肌肉内、皮下、脑池内、腹腔内)、肺部、叶鞘内、局部施用、局部施用、经粘膜施用、经气溶胶或经口腔或鼻喷雾剂型施用。进一步，本文所述的纳米乳剂疫苗可配制成任何药学上可接受的剂型，例如，液体分散体、凝胶、气溶胶、肺部气溶胶、鼻气溶胶、软膏、霜剂、半固体剂型和悬浮液。进一步，所述组合物可以是控制释放剂型、持续释放剂型、立即释放剂型或其任何组合。
本文使用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于宿主(例如动物或人类)时，基本不产生不良的过敏反应或免疫学反应的组合物。这些剂型包括浸蘸用剂型(dip)、喷雾剂、种子包衣剂(seed dressing)、干细胞注射剂、喷雾剂和雾化剂。本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包被剂、润湿剂(例如月桂基硫酸钠)、等渗和吸收延缓剂、崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)等等。载体、稳定剂和佐剂的实例已经被描述并且是本领域周知的(参见例如，Martin，Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th Ed.，Mack Publ.Co.，Easton，Pa.(1975)，通过引用并入本文)。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指本发明的组合物的任何盐(例如通过与酸或碱的反应得到)，所述盐在靶定的受治者体内是生理学上耐受的。本发明的组合物的“盐”可来自无机或有机的酸和碱。酸的实例包括但不限于：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲基苯磺酸、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲基磺酸、乙基磺酸、蚁酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、2-萘磺酸、苯磺酸，等等。诸如草酸之类的其他酸，虽然自身不是药学上可接受的，但是可在盐的制备中使用，其作为获得本发明的组合物及其药学上可接受的酸加成盐过程中的中间体。
碱的实例包括但不限于：碱金属(例如，钠)氢氧化物、碱土金属(例如，镁)氢氧化物，铵和通式NW4 +的化合物(其中W是C1-4烷基)，等等。
盐的实例包括但不限于：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫氢酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(flucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲基磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、扑酸盐(palmoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐，等等。盐的其他实例包括与诸如Na+，NH4+和NW4 +(其中W是C1-4烷基基团)之类的合适的阳离子化合的本发明的化合物的阴离子，等等。对于治疗应用而言，本发明的化合物的盐被认为是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可使用，例如，在制备或纯化药学上可接受的化合物中使用。
对于治疗应用而言，本发明的组合物的盐被认为是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可使用，例如，在制备或纯化药学上可接受的化合物中使用。
本文使用的术语“处于疾病风险”和“处于感染风险”是指受治者倾向于患有特定疾病和/或感染。这种倾向性可以是遗传的(例如，特定遗传趋势从而患上疾病，例如可遗传的疾病)或由于其他因素(例如，环境状况，暴露于存在于环境中的有害化合物，等等)。因此，本发明无意限定任何特定的风险(例如，受治者可简单地由暴露于其他带有传播性病原体的风险的人和与其他带有传播性病原体的风险的人相互接触而“处于疾病风险”)，本发明无意限定任何特定的疾病和/或感染。
本文使用的“鼻部给药”意思是通过鼻子施用进入鼻子或鼻窦通道或它们两者。所述给药可通过例如施用于鼻部或鼻窦通道的液滴、喷雾、气雾、涂层或其混合物来进行。
“肺部施用”和“肺部给药”是指将本发明的组合物施用于受治者的肺系统的任何方法。本发明不限于任何特定的给药方式。实际上，多种给药方式被认为对于包括本文所述的那些给药方式在内的肺部给药是有用的。
本文使用的术语“试剂盒”是指用于递送物质的任何递送体系。在本发明的纳米乳剂组合物的部分，这样的递送体系包括使组合物从一个位置至另一个位置的储存、运输或递送的体系和/或支持物质(例如使用所述物质的书面说明书，等等)。例如，试剂盒包括含有相关纳米乳剂和/或支持物质的一个或一个以上外壳(例如，盒子)。本文使用的术语“分开的试剂盒”是指包括两个或两个以上单独的容器的递送体系，所述容器的每一个含有总试剂盒组分的子部分。所述容器可被一同递送至期望的接受者或单独地递送至期望的接受者。例如，第一容器可包括含用于特定用途的纳米乳剂组合物，而第二容器包括第二药剂(例如，抗生素或喷雾施用器)。事实上，含有两个或两个以上单独的容器的任何递送体系可包括在术语“分开的试剂盒”内，所述容器中的每一个含有总试剂盒组分的子部分。相反，“组合试剂盒”是指在单一的容器(例如，在单一的盒子中包裹了每一个期望组分)中包括用于特定用途所需的组合物的所有组分的递送体系。术语“试剂盒”包括分开的试剂盒和组合试剂盒。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗肺部感染的组合物和方法。具体而言，本发明提供纳米乳剂组合物和使用所述纳米乳剂组合物治疗与生物膜(例如，在肺部感染中发现的)相关的细菌感染的方法。此外，本发明的组合物和方法用于临床(例如治疗药物和预防药物)，工业和研究应用。
多种致病性微生物通过贴附于位于消化道、口咽、呼吸道或生殖-泌尿道内的粘膜上皮细胞而引起感染。诸如流感病毒、百日咳博德特氏菌或霍乱弧菌之类的一些病原体保留在粘膜组织或在粘膜组织内，而诸如伤寒沙门氏菌或甲型肝炎病毒之类的其他病原体具有允许渗透进入更深层组织且全身扩散的机制。粘膜的特异性和非特异性防御机制提供了针对上述两种病原体的第一保护线。非特异性效应包括驻留型巨噬细胞、抗微生物肽、乳铁蛋白和溶菌酶、pH极限、胆汁酸、消化酶、粘液、上皮细胞脱落、冲刷机制(蠕动、睫毛状跳动、排尿，等等)和区域群落竞争。然而，成功的病原体通常具有进化方式以在其感染的位置存在非特异性防御的情况下存活并且所述感染的位置是分泌型免疫体系，其主要起预防由多种细菌和病毒病原体引起的疾病的作用，并且所述感染的位置可能是抗病原体的主要效应因子，所述病原体被限制在粘膜表面。对于全身扩散的生物体而言，局部和全身免疫反应对于最佳免疫是理想的。
如本文所述，当正常和/或健康的免疫体系因一种原因或另一原因未起适当作用时，一些微生物(例如细菌)能够滋长。囊性纤维化(CF)、哮喘、HIV感染、化疗和其他病症的宿主导致免疫反应功能障碍和/或减弱，所述免疫反应通常会起到预防和清除能够引起健康受治者体内的病理学的微生物的作用。
例如，绿脓杆菌是感染免疫受损的、年老的、癌症化疗患者和患有CF的个体的伺机性病原体。在CF肺疾病中，绿脓杆菌以粘稠的、脱水的、缺氧粘液形式陷入气道上皮细胞中。形态数据表明CF患者的气道内腔藏有绿脓杆菌生物膜，其被表征为球形微集落。
其他类型的微生物可导致另外的健康受治者中的病理学。例如，呼吸道被革兰氏阴性球杆菌(百日咳博德特氏菌)定殖导致百日咳(也称为pertussis)，这种百日咳是人类婴儿的发病率和死亡率的主要原因。博德特氏菌的两种其他紧密相关的分离株副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌也已在人体中发现。分子遗传分析显示这三种分离株太密切相关以致于不能分为单独的种类。(参见Gilchrist.M.J.R.，1991，″Bordetella″，in Manual of Clinical Microbiology，5th ed.，Balows，A.等人，eds.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。然而，百日咳博德特氏菌与支气管博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌在其所产生的毒素的性质方面不同，支气管博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌确实产生活性毒素(参见Hausman，S.Z.等人，1996，Infect.Immun.64：4020-4026)，并且有一些证据显示百日咳博德特氏菌生物体可转化为副百日咳博德特氏菌的表型(Gilchrist，M.J.R.，1991，″Bordetella″，in Manual of Clinical Microbiology，5th ed.，Balows，A.等人，eds.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。
因此，本发明提供组合物和方法用于治疗呼吸道感染。本发明的组合物和方法可用于治疗和/或预防由下列细菌中的一种或一种以上引起的呼吸道感染(例如，在囊性纤维化患者体内)，所述细菌为：假单胞菌(例如，绿脓假单胞菌、少动假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌和食酸假单胞菌)、葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、链球菌(包括肺炎链球菌)、大肠杆菌、克雷伯氏菌、肠杆菌属、沙雷氏菌、嗜血杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、类鼻疽伯克霍尔德杆菌、洋葱伯克霍尔德杆菌、唐菖蒲伯克霍尔德杆菌、B.multivorans、越南伯克霍尔德杆菌、结核分支杆菌、鸟分支杆菌复合物(MAC)(鸟分支杆菌和胞内分支杆菌)、堪萨斯分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、海分支杆菌、溃疡分支杆菌或偶发分支杆菌的复合物(偶发分支杆菌和龟分支杆菌)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管博德特氏菌。而且，本发明的组合物和方法用于治疗和/或预防宿主呼吸感染(例如上呼吸道(例如，鼻子、耳朵、鼻窦和咽喉)的呼吸感染和下呼吸道(例如，气管、支气管和肺)的呼吸感染)。可被治疗(例如，杀死和/或减缓生长(例如在受治者的呼吸道内))的微生物的各种实例在下面提供。
因此，在一些实施方式中，本发明提供含有纳米乳剂的组合物和肺部施用所述组合物以预防和/或治疗呼吸感染的方法。在一些实施方式中，所述纳米乳剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)。本发明不受所使用的EDTA的量的限制。在一些实施方式中，使用0.01mM至0.1mM，0.1mM至1.0mM，1.0mM至1.5mM，1.5mM至2.5mM，2.5mM至5.0mM，5.0mM至10.0mM，10mM至20mM，20mM至30mM或30mM至50mM的EDTA。然而，本发明不限于这种量的EDTA。在一些实施方式中，使用小于0.01mM或大于50mM的EDTA。在一些实施方式中，所述组合物与高渗盐(例如氯化钠)溶液(例如，6％至7％，1％至3％，3％至6％，0.1％至1％，或大于7％的盐溶液(例如NaCl溶液))联合施用。在一些实施方式中，所述组合物含有20％的纳米乳剂溶液。在一些实施方式中，所述组合物含有大于20％(例如，25％，30％或更多)的纳米乳剂溶液。在一些实施方式中，所述组合物含有少于20％(例如，15％，10％或更少)的纳米乳剂溶液。然而，本发明不限于这种量(例如，百分含量)的纳米乳剂。例如，在一些实施方式中，组合物含有少于10％的纳米乳剂。在一些实施方式中，组合物含有大于20％的纳米乳剂。在一些实施方式中，所述组合物含有10mM EDTA。在一些实施方式中，所述组合物含有20mM EDTA。在一些实施方式中，本发明的组合物含有本文所述的任何纳米乳剂。在一些实施方式中，含有用于处理细菌(例如存在于受治者的肺空间中(例如形成生物膜的细菌))的纳米乳剂组合物包含P4075EC。在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物包含W805EC。
单独使用纳米乳剂或与EDTA(10mM至20mM的EDTA)联合施用纳米乳剂能够实现在PBS中在60分钟内杀死106细菌(参见实施例2至实施例4)。在存在高渗盐水(例如6％至7％的NaCl)同时存在20Mm EDTA的情况下，纳米乳剂杀菌能力惊人地且显著地提高，实现在15分钟内完全杀死细菌。此外，在存在高渗盐水的情况下，含较低浓度的EDTA的纳米乳剂能够实现在30分钟内完全杀死细菌。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了纳米乳剂组合物可用于经过短时间段(例如，小于60分钟，小于30分钟或小于15分钟)杀死(例如，完全杀死)细菌。
本发明还说明了本发明的组合物能够根除细菌的混合群。而且，在本发明的实施方式的发展过程中进行了毒性研究，将纳米乳剂组合物表征为安全的并且对受治者不引起可检测的有害性(例如，没有组织学改变和/或可检测的病理学(参见，例如实施例1))。
如实施例3和实施例4所描述的，含有本发明的纳米乳剂的组合物能够处理(例如杀死和/或抑制生长)通常在健康人体中没有危害，但是伺机引起严重的且慢性呼吸道感染(例如含有囊性纤维化(CF)的个体)的细菌种类。这些细菌种类的不断感染导致炎症和进行性肺疾病，所述进行性肺疾病最终发展为肺衰竭，肺衰竭是CF患者死亡的主要原因。迄今为止，CF中的肺感染的有效治疗受到这些细菌种类表现出的对广谱抗菌剂的抗性的严重限制，所述细菌种类是人类感染中遇到的最多的耐药细菌中的细菌。CF患者中的感染位置是有效治疗的另一重要障碍。感染性细菌主要存在于咳痰的气道内腔、气道上皮细胞表面流体和支气管粘膜中(参考)。将抗菌剂递送至这种感染位置的全身性渗透通常是无效的。治疗进一步受细菌生物膜形成的阻碍，认为细菌生物膜的形式发生在感染的患者的气道内并且治疗进一步受表征CF呼吸道的异常粘液分泌物的阻碍。
虽然机制的理解不需要实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，在一些实施方式中，使用含有本发明的纳米乳剂的组合物杀死细菌和/或病毒的机制涉及乳剂与微生物脂质膜的融合，导致快速渗透性分解和细胞溶解(参见，例如，Hamouda and Baker，J Appl Microbiol.2000 Sep；89(3)：397-403)。此外，在一些实施方式中，静电吸引(例如，由CPC的阳离子表面电荷提供)克服了LPS介导的革兰氏阴性菌对中性和阴性洗涤剂的抗性(参见，例如，Hamouda and Baker，J Appl Microbiol.2000 Sep；89(3)：397-403)。在一些实施方式中，含有纳米乳剂(例如，P4075EC(例如，抗革兰氏阴性菌和/或抗革兰氏阳性菌))的组合物的杀菌活性通过加入EDTA来提高。虽然机制的理解不需要实践本发明，并且本发明不限于任何特定的作用机制，在一些实施方式中，EDTA螯合稳定LPS外膜的二价阳离子，从而有利于与阳离子乳剂的相互作用，有利于导致膜透化作用和溶解的相互作用以及提高大分子跨膜扩散的相互作用(参见，例如，Rabinovich-Guilatt等人，J Drug Target.2004；12(9-10)：623-33，Vaara，Microbiol Rev.1992 Sep；56(3)：395-411)。
在本发明的实施方式发展的过程中进行的实验证实了P4075EC在使用PARI LC Plus喷雾器在7％盐水中雾化后是稳定的。在7％盐水中雾化的P4075EC的单一剂量的吸入动物耐受良好。因此，在一些实施方式中，本发明提供了含P4075EC和高渗盐水的组合物和使用所述组合物(例如，通过吸入(例如溶液雾化之后))来治疗一种或一种以上类型的肺部细菌感染的方法(例如，处理细菌和/或细菌膜(例如，具有对常规治疗的抗性)而不增加CF患者已有的高治疗负担)。
例如，本发明的实施方式的发展过程中进行的实验说明了含纳米乳剂(例如，P4075EC和盐水溶液)的组合物有效处理(例如，杀死和/或抑制生长)洋葱伯克霍尔德杆菌复合物(Bcc)内的细菌种类(参见，例如，实施例3)。洋葱伯克霍尔德杆菌感染对抗菌治疗有特别的抵抗性并且与CF的发病率和致死率的增加有关。Bcc感染也被许多CF护理中心认为是肺移植的绝对禁忌症。含纳米乳剂(例如，P4075EC和盐水溶液)的组合物有效处理(例如，杀死和/或抑制生长)B.multivorans和新洋葱伯克霍尔德杆菌，所述B.multivorans和新洋葱伯克霍尔德杆菌是CF中大多数Bcc感染的主要原因(参见，例如，Reik J Clin Microbiol.2005 Jun；43(6)：2926-8)。含纳米乳剂(例如，P4075EC和盐水溶液)的组合物有效处理(例如，杀死和/或抑制生长)唐菖蒲伯克霍尔德杆菌，所述唐菖蒲伯克霍尔德杆菌虽然不是Bcc成员，但是从CF患者中越来越多地回收得到所述唐菖蒲伯克霍尔德杆菌。同样，如实施例3所示，含有纳米乳剂(例如，P4075EC)的组合物有效处理(例如，杀死和/或抑制生长)不动细菌属，虽然目前没有从CF患者中频繁地回收得到不动细菌属，但是不动细菌属表现出是这种患者群中新出现的病原体。实施例3所测试的大部分分离株从患有CF的人的呼吸道标本的培养物中回收得到。样本还包括五个先前所述的称为流行病谱系的每一个的代表性分离株，五个流行病谱系中的每一个以被识别为多重感染CF患者。这些包括新洋葱伯克霍尔德杆菌ET12(Johnson等人，J Clin Microbiol 1994；32：924-30)、PHDC(Chen等人，J Pediatr 2001；139：643-9)和中西部(Coenye and LiPuma，J.Infect.Dis.185：1454-1462)谱系以及B.multivorans OHBM谱系(Biddick等人，FEMS Microbiol Lett 2003；228：57-62)和B.dolosa SLC6谱系(Biddick等人，FEMS Microbiol Lett 2003；228：57-62)。含纳米乳剂(例如，P4075EC和盐水溶液)的组合物有效处理(例如，杀死和/或抑制生长)这些不同细菌种类中的每一类。而且，含有纳米乳剂(例如，P4075EC)的组合物有效处理(例如，杀死和/或抑制生长)菌株，所述菌株在先前的敏感性测试中发现为多抗药性(例如，定义为对在三分之二的抗生素种类(内酰胺(包括碳青霉稀类)、氨基糖苷和喹诺酮)中所测试的所有抗生素有抗性)并且为泛耐药性菌株(参见实施例3)。对所有分离株进行基因分型分析以确认每个被处理的样本是不同的菌株。
如实施例3所示，P4075EC表现出针对所测试的菌株的非常良好的活性。除了两个新洋葱伯克霍尔德杆菌菌株之外，测试板中的所有菌株被浓度≤125μg/ml的P4075EC抑制或被起始物质的1∶16的稀释液抑制；59％的菌株被浓度≤31.2μg/ml的P4075EC的1∶64的稀释液抑制。多耐药性或泛耐药性菌株未显示出对P4075EC的敏感性降低，分别表现出MIC90为125μg/ml和62.5μg/ml。总体上，伯克霍尔德杆菌属种相对于其他检测的种类倾向于对P4075EC的敏感性略微较小。需要最高MIC的18种菌株中的16种是伯克霍尔德杆菌。相反，具有最低测试MIC(15.6μg/ml)的38种菌株中的33种是非伯克霍尔德杆菌。在所检测的10种伯克霍尔德杆菌属中没有观察到在P4075EC活性方面的显著差异，虽然需要最高MIC(250μg/ml和500μg/ml)的两种菌株均是新洋葱伯克霍尔德杆菌。在非伯克霍尔德菌属中，青枯菌菌株是最敏感的(MIC90≤15.6μg/ml)，而不动杆菌属菌株敏感性相对较小(MIC90＝125μg/ml)。在34种菌株的子集中没有发现对P4075EC耐受的迹象，测定了34种菌株的MIC和MBC。P4075EC杀死浮游生长的细菌是时间和浓度依赖性的，在16倍MIC浓度条件下，30分钟内实现完全杀死。因此，本发明提供了将细菌相对短暂的暴露于P4075EC可用于实现使存活的细菌对数减少。因此，含有本发明的纳米乳剂(例如，P4075EC)的组合物可单独或与其他抗菌剂联合使用以杀死细菌和/或抑制细菌生长。
本发明的实施方式的发展过程中所进行的实验评估了P4075EC针对在体外生长为生物膜的细菌的活性。如实施例3中所描述的，为了提供P4075EC活性的严格测试，使用了体外形成生物膜的相对严格的限定。测试了符合限定条件的12种菌株。如实施例3所示，所述菌株代表了几种种类并且基于标准MIC/MBC测试所述菌株代表了对P4075EC的敏感性范围。虽然，对于每种测试的菌株而言，P4075EC的MBIC和MBEC相对于各自的MIC和MBC增大(相对于MIC，MBIC的中值增加了4倍)，但是当细菌生长为生物膜时，所有12种菌株都被P4075EC抑制或杀死。仅仅单独一种菌株需要未稀释的P4075EC(2000μg/ml)用于根除存活的生物膜细菌。以分光光度计法评估了用结晶紫染色的形成生物膜的菌株中的相对生物量并且没有发现生物量与MBIC/MBEC之间的关系。事实上，虽然在12种测试的菌株中唐菖蒲伯克霍尔德杆菌菌株AU10529产生最大生物量，但是P4075EC对这种菌株的MBIC和MBEC相对较低(MBIC和MBEC均为62.5μg/ml)。相反，新洋葱伯克霍尔德杆菌菌株J2315产生相对少的生物量，但是所需P4075EC的MBEC为1000μg/ml。
报道了像生物膜一样的CF痰液对抗菌药物的活性(参见，例如，Hunt等人，Antimicrob Agents Chemother.1995 Jan；39(1)：34-9)的拮抗作用。含有干重为2％至3％的痰液的、诸如粘蛋白之类的糖蛋白和高分子量DNA以高含量存在，从而产生特别粘稠的痰液，其提供物理屏障来防止细菌。此外，这些大分子结合并螯合抗生素而小阳离子分子和pH降低的CF痰液阻断了药物渗透进入细菌并且降低药物的生物活性。提高药物剂量以克服这些障碍的方法受到药物毒性的限制。为了评估痰液对P4075EC的抗菌活性的影响，在存在CF痰液的条件下对12种形成生物膜的菌株重复进行了标准浮游敏感性测试。使用来自15位CF患者的痰液混合物以避免患者之间在大分子、高分子量DNA组合物和离子条件方面的变化，以及机械剪切仅仅用于最小化原始微环境的变化(参见，例如，Grebski等人，Chest.2001 May；119(5)：1521-5)。悬浮于含有43％痰液的培养基(在测试系统中达到最大痰液浓度)中的P4075EC的抗细菌的活性随杀菌剂浓度而减小，所述杀菌剂浓度为各自的不含痰液的浮游MBC的2倍至32倍。痰液-MBC等于(12分之6)或在由细菌生长形成的生物膜获得的MBEC的一倍稀释浓度(12分之6)之内。类似地，虽然P4075EC的活性受到CF痰液和生物膜生长的拮抗作用，但在两种测试条件下P4075EC对测试的所有菌株仍为杀菌性的(参见图10)。
因此，在一些实施方式中，本发明提供含有纳米乳剂(例如P4075EC)的组合物和将所述组合物用于由与CF相关的伺机性病原体引起的感染的抗菌治疗的方法。具体而言，本发明的纳米乳剂组合物是快速杀菌剂并且对不论浮游生长的细菌或作为生物膜生长的细菌或存在CF痰液的情况下的细菌是活性的。而且，含有本发明的纳米乳剂的组合物特别稳定，在中和后没有变化且广泛抗菌。重要的是，迄今为止，没有观察到所检测的任何细菌种类对本发明的纳米乳剂组合物产生抗性。因此，本发明提供了P4075EC可有效地用作吸入用抗菌剂。
本发明不限于治疗留在肺部空间(例如，在患有CF的受治者体内)中的细菌生物膜。实际上，含有本发明的纳米乳剂的组合物可用作治疗剂和/或抗菌剂(例如，杀死在任何医疗和/或工业环境中的细菌生物膜和/或抑制在任何医疗和/或工业环境中的细菌生物膜的生长)。
存在能够形成生物膜的多种细菌。例如，粘附于植入的医疗设备或受损伤的组织的细菌通常将其自身包在蛋白质和多糖的水合基质中以形成生物膜。由于与生物膜有关的器官对抗菌剂的抗性增加并且感染与患者体内具有留置医疗设备或受损组织的这些器官有关，生物膜成为了公共健康的一个严重问题。在生物膜中生长的细菌的抗生素抗性促进了感染持续以及感染的慢性本质，所述感染是例如与植入的医疗设备有关的那些感染。生物膜中抗性机制与目前熟悉的将固有抗性给予单独的细菌细胞的质粒、转位子和突变不同。在生物膜中，抗性似乎基于多细胞策略。
生物膜是附着于表面的微生物的复合群落或与界面或受损组织相关的微生物的复合群落。虽然现代微生物学的重点是研究纯培养物，浮游(自由游动)细菌，但是，目前广泛意识到在自然、临床和工业环境中最多的细菌仍然与作为生物膜的表面有关。而且，这些微生物群落通常由多种种类构成，所述多种种类彼此相互作用并且与它们的环境相互作用。生物膜结构的确定，尤其是相对于彼此微生物集落(细胞簇)的空间排布的确定对于这些复合群落的作用具有深远的意义。
生物膜基质是动态环境，其中，微生物细胞组成表现出达到自动平衡并且最优地被安排为利用所有可利用的营养素。因此，所述基质表现出很大的微不均一性，在基质中可存在多种微环境。认为生物膜的形成是两步骤方法，其中，细菌细胞附着于表面，随后在多层细菌簇中细菌细胞基于细菌积累而生长。虽然表多糖提供了基质骨架，但是在生物膜中可发现各种酶活性，其中一些大大影响结构完整性和稳定性。
更加具体而言，在第一形成阶段中，假设宿主质粒的纤维蛋白原和纤连蛋白覆盖了医疗植入物或受损的组织的表面并且由连续表达的微生物表面组分来识别，所述微生物表面组分介导细菌开始粘附于生物物质的表面或受损组织的表面。在第二步骤中，位于细菌细胞中的特异性基因，称为细胞内粘附(ica)位点，激活细菌细胞彼此粘附，形成生物膜的第二层。ica位点导致囊状多糖操纵子表达，反过来所述囊状多糖操纵子通过糖聚-N-琥珀酰基葡糖胺(PNSG)(1，6-键合的葡糖胺聚糖)来激活多糖细胞间粘附(PIA)。所述多糖层的生成产生了生物膜，当用电子显微镜观察时，其外表粘滑。
金黄色葡萄球菌是高致病性人病原体。金黄色葡萄球菌和负性凝固酵素葡萄球菌已合并为与在植入的医疗设备和受损的组织上形成生物膜有关的主要院内感染病原体。这些生物体在人皮肤和粘膜正常携带的菌群之中，这使得这些生物体在侵入性手术或延长住院期间和之后成为普遍的并发症。因为健康和生病的人身上都携带细菌，葡萄球菌被认为是通过打开伤口和生物材料植入物侵入患者的伺机性病原体。
与金黄色葡萄球菌相关的生物膜感染是发病率和致死率的主要原因，尤其在诸如医院、疗养院和治疗室之类的环境中。处于风险中的患者包括婴儿、老年人、免疫受损患者、免疫抑制患者以及患有需要频繁住院的慢性病症的那些患者。具有血管内和其他植入的修复术设备的患者处于甚至更大的葡萄球菌感染的风险中，因为免疫系统受损并且引入了异物，这提供了受损的组织和/或起到了用于形成生物膜的表面的作用。这样的感染可以是慢性隐含的(如果不是致命的话)。
引起生物膜对抗生素抗性的原因包括一些抗菌剂无法渗透生物膜的所有层，一些生物膜细胞生长速度慢使得它们对需要活性细菌生长的抗菌剂的敏感性较低以及嵌入生物膜的细菌细胞表达的基因模式，所述表达的基因模式与在浮游(自由游动)状态所表达的基因不同。与生物膜相关的细菌的这些差异使得有效杀死浮游细菌的抗菌剂在杀死与生物膜相关的细菌方面无效。通常，处理生物膜(例如与导尿管设备或修复术设备有关)的唯一的方法是除去受污染的设备，这可能需要额外的手术并且对患者还有风险。
因此，本文使用的生物膜是指具有细胞外基质的微生物聚集体，所述细胞外基质促进粘合至表面，在表面定殖和在表面聚集生长，所述表面例如组织或器官的内部或外部。生物膜可由细菌、真菌、酵母、原生动物和其他微生物构成。细菌生物膜通常表现出对抗生素的高抗性，通常高达未在生物膜中生长的相同细菌的抗性的1000倍。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用于处理(例如，杀死和/或抑制生长)和/或预防受治者身体上和/或体内(例如，肺部系统内，内部器官或组织(例如，膀胱、肾、心脏、中耳、鼻窦、关节、眼)上，外部组织(例如皮肤)上，和/或诸如牙齿、舌头、口腔黏膜或牙床之类的口腔表面)的生物膜。本发明的组合物和方法可用于治疗与生物膜有关的病症，例如软组织感染，慢性鼻窦炎、心内膜炎、骨髓炎、尿道感染、慢性细菌性阴道炎、牙菌斑或口臭、修复术设备和/或导管的感染，细菌性角膜炎或前列腺炎。
如实施例3和实施例4所述，本发明的组合物可用于处理(例如，杀死和/或抑制生长)任何一种或一种以上革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌种类。事实上，本发明的组合物和方法可用于杀死多种细菌种类和/或抑制多种细菌种类的生长，所述细菌种类包括但不限于：金黄色葡萄球菌、诸如表皮葡萄球菌之类的凝固酵素负性葡萄球菌、化脓链球菌(A组)、链球菌种类(草绿色组)、无乳链球菌(B组)、牛链球菌、链球菌(厌氧种类)、肺炎链球菌、肠球菌种类、炭疽芽孢杆菌、白喉杆菌、棒状杆菌属种类(其为白喉菌，需氧和厌氧)、单核增生性李斯特菌、破伤风芽孢梭菌和艰难梭菌、大肠杆菌、肠杆菌种类、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、沙雷氏菌属(Serratia)、空肠弯曲菌、奈瑟氏球菌、粘膜炎布兰汉氏球菌和巴斯德氏菌。
本发明的组合物和方法可用于处理(例如，杀死和/或抑制生长)能够形成生物膜的生物体，所述生物体包括但不限于：皮肤真菌(例如，诸如犬小孢子菌之类的小孢子菌属物种、诸如深红色毛癣菌和须毛癣菌之类的毛癣菌属物种)、酵母(例如白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和其他念珠菌属物种包括药物抗性念珠菌属物种)、絮状表皮癣菌、糠秕马拉色菌(糠秕孢子菌、椭圆糠秕孢子菌)、新生隐球菌、烟曲霉菌和其他曲霉菌物种、接合菌类(根霉(Rizopus)、白霉)、透明丝孢霉(镰刀霉物种)、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、粗球孢子菌、申氏孢子丝菌和芽生菌。
因此，在一些实施方式中，本发明提供治疗具有生物膜的受治者(例如，具有留置的修复术设备或导管的受治者，其中所述留置的修复术设备或导管与生物膜接触或其中所述受治者患有感染(例如，呼吸感染)，生物膜存在于所述受治者体内)的方法，所述方法包括在下列条件下将含有纳米乳剂(例如，P4075EC)的组合物施用于所述受治者，所述条件为使生物膜变化和/或杀死存在于所述生物膜内的细菌和/或抑制存在于所述生物膜内的细菌生长。在一些实施方式中，改变所述生物膜包括根除所述生物膜。在一些实施方式中，改变所述生物膜包括杀死形成生物膜所涉及的细菌。在一些实施方式中，所述细菌包括金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，抗生素抗性细菌(例如，耐甲氧西林、耐万古霉素，等等)，和/或本文所述的其他类型的细菌。在一些实施方式中，含有纳米乳剂(例如，P4075EC)的组合物与一种或一种以上抗菌剂联合施用。在一些实施方式中，所述抗菌剂选自下组，包括但不限于：抗生素、抗体、抗菌酶、肽和含羊毛硫氨酸的分子。在一些实施方式中，所述抗生素干扰或抑制细胞壁合成。在一些实施方式中，所述抗生素选自下组，包括但不限于：β-内酰胺、头孢菌素、糖肽、氨基糖苷、磺胺、大环内酯物、叶酸、多肽及其组合。在一些实施方式中，所述抗生素干扰蛋白质合成(例如，配糖、四环素和链阳性菌素)。本发明不受施用的含有纳米乳剂的组合物的剂量数的限制。在一些实施方式中，在不同的日子施用多种剂量。在一些实施方式中，在同一天施用多种剂量。在一些实施方式中，连续施用含有本文所述的纳米乳剂的组合物。在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物的联合给药使得施用较低剂量的抗菌剂，所施用的抗菌剂的剂量低于含有纳米乳剂的组合物的非联合给药所施用的剂量。在一些实施方式中，含有本文所述的纳米乳剂的组合物使用喷雾器来施用。在一些实施方式中，给药是肌肉内给药、皮下给药、局部给药、直接施用于感染位置、直接施用于留置的修复术设备(例如分流器、支架、用于组织结构的支架、喂食管、泪小管栓塞、人工关节、心脏起搏器、人工瓣膜，等等)或导管。在一些实施方式中，给药是通过导管直接施用。
本发明不受所处理的微生物的类型的限制。事实上，使用本发明的组合物和方法可处理(例如，杀死(例如，完全杀死))受治者体内的多种微生物病原体和/或预防和/或降低受治者体内的多种微生物病原体的生长，所述微生物病原体包括但不限于：本文所述的细菌、病毒和真菌。
本发明还提供用于处理(例如杀死和/或抑制生长)生物体的组合物和方法，所述生物体(例如，不动细菌属物种)迄今为止表现出对广谱抗生素具有抗性。
不动细菌属物种通常被认为对健康个体是非致病性的。然而，几种细菌种类持续存在于医院环境中并且在免疫受损的患者中导致严重、威胁生命的感染(参见，例如，Gerischer U(editor).(2008).Acinetobacter Molecular Biology，1st ed.，Caister Academic Press)。如所记录的，这些生物体的抗生素抗性谱以及它们的生存能力使得它们通过在高度发达国家和另外的地方经常爆发来威胁医院。感染发生在免疫受损的个体中，并且鲍曼不动杆菌菌株是人体样本中第二普遍分离的非发酵细菌。在院内感染中频繁地分离不动杆菌并且不动杆菌尤其在加强护理单元中普遍流行，其中偶发病例和传染病以及地方病是常见的。鲍曼不动杆菌是院内肺炎尤其是晚发性呼吸机相关肺炎的常见病因。鲍曼不动杆菌可导致各种其他感染，包括皮肤和伤口感染、菌血症和髓膜炎。洛菲氏不动杆菌也是导致髓膜炎的主要原因。鲍曼不动杆菌可在人类皮肤或干燥的表面存活持续几个星期。
自伊拉克战争开始，超过700美国士兵已感染了鲍曼不动杆菌或被鲍曼不动杆菌定殖。在Walter Reed Army Medical Center in Washington，D.C.经过了严重疾病治疗的四位居民感染了鲍曼不动杆菌并且死亡。在Landstuhl Regional Medical Center(在德国的美国陆军医院)，经过治疗的另一居民，一位63岁的德国女性感染了在设备中感染部队的相同的鲍曼不动杆菌菌株并且也死亡。
不动杆菌物种对许多种类的抗生素有固有抗性，所述抗生素包括青霉素、氯霉素以及常见的氨基糖苷。对氟喹诺酮的抗性已在治疗过程中被报道并且这也已导致对由活性药物外排介导的其他种类药物的抗性增加。CDC已报道了不动杆菌菌株对抗生素抗性的显著增加并且碳氢霉烯被认为是最后一种治疗方法和/或黄金标准。对碳氢霉烯的抗性的增加留下了非常少的治疗选择，虽然已有报道一些成功使用多粘菌素B。不动杆菌物种不常见，其中，不动杆菌物种对舒巴坦敏感；舒巴坦最常用于抑制细菌β-内酰胺酶，但是这是舒巴坦自身的抗菌性质的实例。
因此，在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用于处理(例如，杀死和/或抑制生长)不动杆菌物种的细菌(例如，单独或与其他处理联合(例如，碳氢霉烯、多粘菌素B和/或舒巴坦))。
囊性纤维化
由于缺陷跨膜蛋白(称为CFTR)负责电解质，平衡囊性纤维化(CF)是引起严重肺部损伤的威胁生命的疾病。粘稠的粘液形成肺中的管栓塞、导管栓塞和通路栓塞。这种环境对于伺机性细菌建立生物膜群落从而导致呼吸感染是理想的。全身给药抗生素可降低恶化的频率和严重性；然而，细菌从未从气道和肺中完全根除。使用雾状抗生素，但是抗药性的出现和/或不同抗性种类的定殖是主要考虑因素。囊性纤维化(CF)导致固有呼吸防御机制功能障碍，为病原性细菌种类和许多伺机性细菌种类的定殖提供了环境，所述病原性细菌例如，金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌，所述伺机性细菌例如绿脓杆菌、氧化木糖无色杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、青枯菌属、Pandoraea属和洋葱伯克霍尔德杆菌复合物(Bcc)种类(参见，例如，LiPuma等人，(2009)Antimicrob Agents Chemother 53，249-255)。Bcc包括一组至少17个系统演化相关的腐生革兰氏阴性杆菌，其中大多数可形成生物膜(参见，例如，Al Bakri等人，2004，Journal of Applied Microbiology 96，455-463；Eberl and Tummler，2004，International Journal of Medical Microbiology 294，123-131；LiPuma等人，(2009)Antimicrob Agents Chemother 53，249-255；and Tomlin等人，2004，Journal of Microbiological Methods 57，95-106)。它们特别难以处理并且与CF患者的发病率和死亡率的提高有关。它们也是人类感染中所遇到的对抗菌剂最有抗性的细菌种类(参见，例如，LiPuma et al，2005，Curr Opin Pulm Med 11，528-533；LiPuma等人，(2009)Antimicrob Agents Chemother 53，249-255)。一旦出现，感染和相关炎症就很难根除，从而导致进行性肺部疾病，以肺衰竭和死亡结束(参见，例如，LiPuma等人，(2009)Antimicrob Agents Chemother 53，249-255；Saiman and Seigel，2003，Infect Control Hosp Epidemiol 24，S6-S52)。
本发明涉及新的广谱抗菌纳米乳剂(NE)及其应用。NE通过与病原体的膜相互作用来杀死病原体。该物理接触杀死机制大大降低了任何有关抗性的影响。NE由药学上批准的安全成分来配制。
在下面实施例8中，评估了对CF患者中的四种属的问题细菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)：假单胞菌属、伯克霍尔德杆菌属、不动杆菌属和寡养单胞菌属。实施例8还描述了评估NE和其他抗菌剂之间潜在的协同作用。在实施例8中评估的绿脓杆菌、新洋葱伯克霍尔德杆菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌是与囊性纤维化患者的急剧恶化有关的重要呼吸道病原体。本发明一方面，根据最小抑菌浓度(MIC)和/或最小杀菌浓度(MBC)(两者均和传统使用的抗菌药剂进行比较)来限定纳米乳剂的活性。
实施例8中所述的结果说明测试的NE对绿脓杆菌的MIC90/MBC90值为8/64μg/ml、测试的NE对新洋葱伯克霍尔德杆菌的MIC90/MBC90值为64/＞514μg/ml、测试的NE对鲍曼不动杆菌的MIC90/MBC90值为8/64μg/ml和测试的NE对嗜麦芽寡养单胞菌的MIC90/MBC90值为8/32μg/ml。粘菌素对绿脓杆菌、新洋葱伯克霍尔德杆菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌的MIC90/MBC90值分别为2/8、32/＞32、1/＞16和＞32/＞32。头孢平、亚胺培南、左氧氟沙星和托普霉素对所有菌株的MIC90/MBC90值分别为32/＞32、32/＞32、16/16和＞32/＞32μg/ml。这些结果与治疗CF所使用的诸如粘菌素、头孢平、亚胺培南、左氧氟沙星和托普霉素之类的常规药物显著不同，并且所述常规药物可表现出明显的副作用并且增加剂量有潜在的毒性，NE是完全无毒的。
下面实施例8还评估了协同作用数据。具体而言，还评估了当与另一抗菌剂联合时的部分抑菌浓度(FIC)指数和当与另一抗菌剂联合时的部分杀菌浓度(FBC)指数。计算FIC和FBC来判断联合纳米乳剂的协同作用、拮抗作用或无相互作用。为了确定上述三种作用，测试了十种伯克霍尔德杆菌、寡养单胞菌菌株和十种不动杆菌菌株以确定当P4075EC+EDTA与粘菌素或托普霉素中的任一种联合时MIC的变化，粘菌素和托普霉素是在CF患者的肺部使用的两种传统抗菌剂以治疗慢性肺部感染。结果显示与粘菌素联合的NE(P4075EC+EDTA)对90％(根据FIC)和70％(根据FBC)寡养单胞菌菌株为协同作用，而当与托普霉素联合时无相互作用，仅仅20％(根据FIC)和0％(根据FBC)为协同作用。对于不动杆菌菌株而言，发现P4075EC+EDTA和粘菌素联合无相互作用，仅仅在20％(根据FIC)和0％(根据FBC)的不动杆菌菌株中为协同作用，同样当与托普霉素联合时，仅仅在10％(根据FIC)和10％(FBC)的不动杆菌菌株中为协同作用。对于伯克霍尔德杆菌而言，发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合无相互作用，仅仅在30％(根据FIC)和10％(根据FBC)的伯克霍尔德杆菌中为协同作用，但是，当与托普霉素联合时，在50％(根据FIC)和20％(根据FBC)的伯克霍尔德杆菌中为协同作用。
最后，实施例8产生了短时间-杀死曲线以产生在使用电子显微镜来显示伯克霍尔德杆菌菌株的物理接触杀死作用机制中待使用的样本。时间-杀死使得从未处理的起始时间点至30分钟时间点细菌的cfu/ml总共降低4.44log。在每10分钟的时间点具有如下1至2log的降低：从未处理时间点至10分钟时间点降低1.40log，从10分钟时间点至20分钟时间点降低1.91log，从20分钟时间点至30分钟时间点降低1.13log。参见图20A至20D。
本文的数据，例如实施例8中所描述的数据，说明诸如所测试的P4075EC之类的纳米乳剂对多抗药性菌株有效，所述多抗药性菌株包括伯克霍尔德杆菌和寡养单胞菌的抗粘菌素分离株。没有描述在假单胞菌种中脂质A变体对P4075EC的MIC/MBC的影响。没有发现两种主要抗生素粘菌素和托普霉素的拮抗作用迹象并且在寡养单胞菌的情况下，协同作用是明显的。这是有价值的，因为患有CF的患者的治疗不应当为了使用纳米乳剂而需要搁置的正常抗生素治疗方案，这会使他们的治疗计划复杂。SEM图像说明了接触杀死机制，在这种接触杀死的情况下革兰氏阴性菌具有坚硬的外膜。进一步研究正在进行以研究用于治疗囊性纤维化患者中的肺部感染的P4075EC的雾化作用。
当通过管理营养素和粘膜分泌使得在保留CF患者肺部生理学功能中取得治疗进展时，在预防和管理Bcc感染的干预治疗方面几乎没有进展。例如，目前，没有获得针对Bcc的有效疫苗。部分由于缺乏识别的保护性抗原和缺乏有效的粘膜佐剂，限制了Bcc粘膜疫苗的研制(参见，例如，Davis，2001，Advanced Drug Delivery Reviews 51，21-42)。
如下面实施例10所示，本发明提供含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原(例如，伯克霍尔德杆菌外膜蛋白质(OMP))的免疫原性组合物，当将所述组合物施用于受治者时，所述组合物在受治者中诱导对伯克霍尔德杆菌属(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌、B.multivorans或与呼吸感染有关的其他种类)的细菌的免疫性(例如，保护性免疫)。在一些实施方式中，本发明提供伯克霍尔德杆菌属的细菌(参见，例如，实施例10，表25)的所有或部分OMP(例如，分离的OMP、纯化的OMP和/或重组的OMP)，所述OMP用于含有纳米乳剂的免疫原性组合物中(例如，用于施用于受治者(例如，在受治者中诱导对伯克霍尔德杆菌属的细菌的免疫性))。如实施例10所示，本发明提供了当施用于受治者时含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌OMP的免疫原性组合物诱导粘膜和全身抗OMP抗体。如实施例10所示，本发明还提供了当施用于受治者时含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌的特定菌株(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌)的OMP的免疫原性组合物诱导粘膜和全身抗OMP抗体，所述抗体中和产生OMP的特定种类的细菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌)并且交叉中和来自一种或一种以上其他细菌种类(例如，伯克霍尔德杆菌属的细菌)的细菌。
实施例10说明了用OMP-NE进行单一鼻部免疫产生了很强的免疫反应，所述免疫反应由快速诱导抗原特异性T细胞响应和分泌抗体响应来表征，如通过诱导IFN-γ、IL-2和粘膜sIgA和IgG所记录的，并且实施例10说明了可随后加强所述免疫反应。用OMP-NE免疫的小鼠当与未免疫的对照进行比较时表现出肺部K56-1集落形成单元(cfu)显著降低。在OMP-NE免疫的小鼠中肺部细菌清除显著提高，其表现出与未免疫的组比较时脾脏中的新洋葱伯克霍尔德杆菌生物体较少。因此，本发明提供了粘膜OMP-NE给药产生保护免疫性并且降低了受治者发生败血症的可能性。
实施例10还提供了识别17KDa OmpA样蛋白的数据以及与暴露于蛋白质有关的免疫反应。17KDa脂蛋白片段更好地由包含在OMP-NE免疫的小鼠的血清内的抗体来识别(参见，例如，实施例10，图29C)。因此，本发明提供了含有包含在17KDa OmpA样蛋白内的表位的免疫原性组合物在施用了免疫原性组合物的受治者体内产生保护性抗体(例如，抗一种或一种以上伯克霍尔德杆菌种类)。
观察到OMP-NE与PBS中的OMP的响应显著不同。例如，在不存在纳米乳剂的情况下用OMP免疫导致IgG相对高的滴定度，但是仍然比用OMP-NE免疫原性组合物诱导的IgG的滴定度低(13至30倍)。在不存在纳米乳剂的情况下用OMP免疫对加强免疫作用没有反应。用OMP和纳米乳剂诱导的反应主要针对包含在制剂内的特定蛋白质，然而，在不存在纳米乳剂的情况下，OMP表现出已诱发对固有内毒素内含物的免疫反应。
因此，本发明提供用于刺激免疫反应的方法和组合物。具体而言，本发明提供了用于诱导免疫反应(例如，固有和/或适应性免疫反应(例如，针对伯克霍尔德杆菌属的细菌种类(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌、B.multivorans，等等)产生宿主免疫性))的免疫原性纳米乳剂组合物及其使用方法。此外，发现本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗药物和预防药物(例如，疫苗))和研究应用。
在一些实施方式中，本发明提供纳米乳剂佐剂和含有所述纳米乳剂佐剂的组合物(例如，疫苗)用于刺激对伯克霍尔德杆菌属的细菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌，B.multivorans，等等)的免疫反应(例如，免疫性)。在一些实施方式中，本发明提供纳米乳剂佐剂组合物，当施用于受治者(例如，人类或其他哺乳动物受治者)时，所述组合物刺激和/或诱发免疫反应(例如，固有免疫反应和/或适应性/获得性免疫反应)。在一些实施方式中，本发明提供含有一种或多种伯克霍尔德杆菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌，B.multivorans，等等)抗原(例如，伯克霍尔德杆菌组分分离和/或纯化和/或重组的伯克霍尔德杆菌蛋白质(例如，OMP))的纳米乳剂佐剂组合物。本发明不限于任何特定的纳米乳剂或伯克霍尔德杆菌抗原。示范性的免疫原性组合物(例如，疫苗组合物)和施用所述组合物的方法在下面更详细地描述。
在一些实施方式中，本发明提供含有纳米乳剂和一种或一种以上伯克霍尔德杆菌抗原(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌抗原)的免疫原性组合物。在一些实施方式中，本发明提供在受治者体内诱导针对伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)的免疫反应的方法，所述方法包括：提供受治者和含有纳米乳剂和免疫原的免疫原性组合物，其中，所述免疫原包括伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原，以及将所述组合物在使所述受治者产生伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)特异性免疫反应的条件下施用于受治者。本发明不受所选择的本发明的组合物的给药途径的限制。在一些优选的实施方式中，施用免疫原性组合物包括使受治者的粘膜表面与组合物接触。在一些实施方式中，粘膜表面包括鼻粘膜。在一些实施方式中，诱导的免疫反应诱导对受治者体内的伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)的免疫性。
在本发明的实施方式的发展过程中进行了实验以确定含有纳米乳剂(NE)和伯克霍尔德杆菌抗原的组合物是否可用于在受治者体内产生免疫反应。用与纳米乳剂混合的全细胞肺炎链球菌抗原(WCPAg)进行鼻腔免疫并且表现出诱导受治者体内的IgG反应以及根除上呼吸道定殖的肺炎链球菌的能力。
具体而言，如实施例10所述，本发明提供含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原(例如伯克霍尔德杆菌外膜蛋白质(OMP))的免疫原性组合物，当施用于受治者时，所述组合物在受治者体内诱导针对来自伯克霍尔德杆菌属的细菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌、B.multivorans或与呼吸道感染相关的其他种类)的免疫性(例如，保护性免疫)。因此，在一些实施方式中，本发明提供将含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原(例如，OMP抗原(例如，含有选自SEQ ID NO.1-16的氨基酸序列的17KDa蛋白质))的组合物施用于(例如，鼻腔施用)受治者以在受治者体内产生对伯克霍尔德杆菌的免疫性，从而保护受治者不受伯克霍尔德杆菌感染(例如，与呼吸道感染有关)。
本发明不受在免疫原性组合物和使用本发明的组合物的方法中所采用的伯克霍尔德杆菌属的细菌种类的限制。在一些实施方式中，所述细菌是病原体。在一些实施方式中，所述病原体是引起呼吸道感染或引起与呼吸有关的感染的伯克霍尔德杆菌属种。发现多种伯克霍尔德杆菌属种用于本发明的方法和组合物，所述伯克霍尔德杆菌属种包括但不限于：新洋葱伯克霍尔德杆菌、B.dolosa、B.multivorans、B.ambifaria、越南伯克霍尔德杆菌、B.ubonensis、B.thailandensis、B.graminis、B.oklahomensis、类鼻疽伯克霍尔德杆菌、B.xenovorans、B.phytofirmans、B.phymatum、R.metallidurans、富氧罗尔斯通氏菌、茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)。
在一些实施方式中，伯克霍尔德杆菌属的细菌是洋葱伯克霍尔德杆菌。在一些实施方式中，含有纳米乳剂和Omp-A样蛋白质的免疫原性组合物包括来自伯克霍尔德杆菌属的Omp-A样蛋白质，所述伯克霍尔德杆菌属包括但不限于：新洋葱伯克霍尔德杆菌、B.dolosa、B.multivorans、B.ambifaria、越南伯克霍尔德杆菌、B.ubonensis、B.thailandensis、B.graminis、B.oklahomensis、类鼻疽伯克霍尔德杆菌、B.xenovorans、B.phytofirmans、B.phymatum、R.metallidurans、富氧罗尔斯通氏菌、茄科罗尔斯通氏菌。在一些实施方式中，含有纳米乳剂和Omp-A样蛋白的免疫原性组合物包含含有SEQ ID NO.1-16中所识别的氨基酸序列的Omp-A样蛋白质(例如，分离的、纯化的和/或重组的Omp-A样蛋白)。在一些实施方式中，含有纳米乳剂和Omp-A样蛋白的免疫原性组合物包含含有氨基酸序列为SEQ ID NO.1的Omp-A样蛋白质(例如，分离的、纯化的和/或重组的Omp-A样蛋白)。
在一些实施方式中，含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原的免疫原性组合物包含抗原(例如，多糖、蛋白质、杀死的全细胞(例如共轭或非共轭的抗原))，其中，所述抗原源自伯克霍尔德杆菌的多种血清型(例如，至少2种、3种、5种、7种、10种、15种、20种或更多)。所使用的伯克霍尔德杆菌的数量可以为2种不同的血清型至约20种不同的血清型。在一些实施方式中，含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原的免疫原性组合物可包括来自每种已知的和/或分离的伯克霍尔德杆菌血清型的伯克霍尔德杆菌抗原(例如，全细胞、多糖、Omp-A蛋白质、其他蛋白质，等等)。
在一些实施方式中，含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原的免疫原性组合物包括一种、两种或更多种不同类型的载体蛋白质(例如，作为蛋白质载体、糖类载体，等等)。例如，在一种实施方式中，两种或两种以上不同的糖类或蛋白质可共轭至相同的载体蛋白质，或共轭至载体蛋白质的相同的分子或共轭至相同的载体蛋白质的不同分子中的任一种。载体蛋白质可以是TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtBE或PhtDE融合体(尤其是WO 01/98334和WO 03/54007中所描述的那些)、去除毒素的肺炎链球菌溶血素和蛋白质D。在一些实施方式中，存在于含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原的组合物中的载体蛋白质是聚组氨酸三联体家族(Pht)蛋白的成员、片段或其融合蛋白质。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可具有与WO 00/37105或WO 00/39299(例如，PhtD具有WO 00/37105的SEQ ID NO：4的氨基酸序列1-838或21-838)中公开的氨基酸序列有80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE的全长或2、3或4片段构成。融合蛋白的实例是PhtA/B，PhtA/D，PhtA/E，PhtB/A，PhtB/D，PhtB/E.PhtD/A.PhtD/B，PhtD/E，PhtE/A，PhtE/B和PhtE/D，其中，所述蛋白质在N-端与首次提到的蛋白质连接(参见，例如WO 01/98334)。载体可包括组氨酸三联体母体和/或盘绕的螺旋区域。组氨酸三联体母体是多肽的蛋白质，其具有HxxHxH序列，其中，H是组氨酸，x是非组氨酸的氨基酸。盘绕的螺旋区域是由“螺旋”算法(Lupus，A等人，(1991)Science 252；1162-1164)所预测的区域。
可用于本发明的载体蛋白的实例是DT(白喉类毒素)，TT(破伤风类毒素)或TT的C片段，DT CRM197(DT突变体)，其他DT点突变体，例如，CRM176，CRM228，CRM 45(Uchida等人，J.Biol.Chem.218；3838-3844，1973)；CRM9，CRM45，CRM102，CRM 103和CRM107以及其他由Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins，Ed：Frankel，Maecel Dekker Inc，1992所描述的其他突变体；Asp的Glu-148的缺失或突变体，Gln或Ser和/或Gly的Ala158以及其他在美国专利第4,709,017号或美国专利第4,950,740号中所公开的突变体；至少一种或一种以上残基Lys516，Lys526，Phe530和/或Lys534的突变体以及其他在美国专利5,917,017号或美国专利第6,455,673号中公开的突变体；或美国专利第5,843,711号中公开的片段，包括以一些方式去除毒素的ply在内的肺炎球菌肺炎链球菌溶血素(Kuo等人(1995)Infect Immun 63；2706-13)，例如dPLY-GMBS(WO 04081515，PCT/EP2005/010258)或dPLY-甲醛，包括PhtA，PhtB，PhtD，PhtE在内的PhtX和Pht蛋白的融合体，例如PhtDE融合体，PhtBE融合体(WO 01/98334和WO 03/54007)(PhtA-E在下面更加详细描述)，OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白质—通常从脑膜炎奈瑟氏菌血清组B中提取—EP0372501)，PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌)，PD(流感嗜血杆菌蛋白D--参见，例如，EP0594610B)或其免疫学上功能等同体，合成的肽(EP0378881，EP0427347)，热休克蛋白(WO93/17712，WO94/03208)，百日咳蛋白(WO98/58668，EP0471177)，细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素(WO91/01146)，含有来自各种病原体衍生抗原的多人类CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)Infect Immun 72；4884-7)，肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)，铁摄取蛋白(WO01/72337)，艰难梭菌的毒素A或B(WO00/61761)。
抗体的产生
含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原的免疫原性组合物可用于免疫诸如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴或人类之类的哺乳动物从而产生多克隆抗体。如果需要的话，伯克霍尔德杆菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原可共轭至载体蛋白质，所述载体蛋白例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、锁孔血蓝蛋白或本文所述的其他载体。基于宿主的种类，可使用各种佐剂来提高免疫学反应。这样的佐剂包括但不限于：弗氏佐剂、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)和表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚阴离子、肽、本文所述的纳米乳剂、锁孔血蓝蛋白和二硝基酚)。在用于人类的佐剂中，BCG(杆菌卡介苗)和短小棒状杆菌尤其有用。
特异性结合至伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原的单克隆抗体可使用任何技术来制备，所述技术通过培养物中的连续的细胞系来生成抗体分子。这些技术包括但不限于：杂交瘤细胞技术、人B细胞杂交瘤细胞技术和EBV杂交瘤细胞技术(参见，例如，Kohler等人，Nature 256，495 497，1985；Kozbor等人，J.Immunol.Methods 81，3142，1985；Cote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.80，2026 2030，1983；Cole等人，Mol.Cell.Biol.62，109 120，1984)。
此外，可使用为生成“嵌合抗体”发展的技术，所述技术是将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因从而获得具有合适的抗原特异性和生物活性的分子(参见，例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81，68516855，1984；Neuberger等人，Nature 312，604 608，1984；Takeda等人，Nature 314，452 454，1985)。单克隆抗体和其他抗体也可以是“人源化的”以防止当治疗使用时固定患者对抗体的免疫反应。这些抗体可以是在序列方面类似于人类抗体足以直接用于治疗或可需要改变几个关键的残基。啮齿动物抗体与人抗体序列之间的序列差别可通过替换与人序列不同的残基，通过个体残基的位点定向突变形成或通过刺激(grating)整体互补决定区的来最小化。
可选地，人源化抗体可使用如下所述的重组技术来生成。特异性结合至特定抗原的抗体可含有抗原结合位点，所述位点部分或全部人源化，如美国专利第5,565,322号中所公开的。
可选地，所描述的用于生成单链抗体的技术可以是生成特异性结合至特定抗原的单链抗体的本领域已知的适用方法。具有相关特异性但具有不同的个体基因型的组合物的抗体可通过随机组合的免疫球蛋白文库的链改组来产生(参见，例如，Burton，Proc.Natl.Acad.Sci.88，11120 23，1991)。
单链抗体也可使用DNA扩增法来构建，例如PCR，使用杂交瘤细胞cDNA作为模板(参见，例如，Thirion等人，1996，Eur.J.Cancer Prev.5，507-11)。单链抗体可以是单特异性或双特异性并且可以是二价或四价。在例如Coloma & Morrison，1997，Nat.Biotechnol.15，159-63中教导了构建四价、双特异性单链抗体。在例如Mallender & Voss，1994，J.Biol.Chem.269，199-206中教导了可构建二价、双特异性单链抗体。
如下所述，编码单链抗体的核苷酸序列可使用手动或自动的核苷酸合成来构建，使用标准重组DNA方法将所述核苷酸序列克隆至表达构建体内并引入细胞以表达编码序列。可选地，单链抗体可使用例如丝状噬菌体技术直接生成(参见，例如，Verhaar等人，1995，Int.J.Cancer 61，497-501；Nicholls等人，1993，J.Immunol.Meth.165，81-91)。
特异性结合至特定抗原的抗体也可通过体内诱导生成淋巴细胞群来生成或通过屏蔽免疫球蛋白文库或文献中所公开的高特异性结合反应物部分来生成(参见，例如，Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.86，3833 3837，1989；Winter等人，Nature 349，293 299，1991)。
嵌合抗体可如WO 93/03151公开的内容来构建。也可制备源自免疫球蛋白且为多价和多特异性的结合蛋白，例如WO 94/13804中所述的“双体”。抗体可通过本领域熟知的方法来纯化。例如，抗体可通过穿过结合了相关抗原的柱子来亲和纯化。然后，结合的抗体可通过使用具有高盐浓度的缓冲液从柱子中洗脱。
烧伤创面管理
目前的烧伤创面管理涉及早期清创术和非存活皮肤的重建，所述重建与向部分皮层的烧伤创面提供支持性护理和局部抗菌敷料的更换相结合。现代烧伤创面护理的目标是为表皮更新提供最优的环境。皮肤完整性的恢复通过保留的毛囊中的角化细胞的再生长或从非烧伤区域获得的部分皮层的皮肤移植物的转移来发生。在表皮更新期间，重要的是避免对皮肤的进一步损伤、停止烧伤创面发展并且最小化诸如创面感染之类的继发性并发症。早期清除全层皮肤的烧伤焦痂、立即移植皮肤以及保持敞开的治疗方法或局部抗菌剂对部分皮层的烧伤创面区域的治疗是最小化烧伤创面定殖以及侵入性烧伤感染的最有效的方法(参见，例如，Bessey，Wound care.In Herndon DN，ed：Total Burn Care 3rd edition.Philadelphia，PA：Elsevier Inc.，2007，pp 127-135)。普遍使用的局部抗菌剂包括磺胺嘧啶银盐(SILVADENE)、醋酸磺胺米隆(SULFAMYLON)和胶体银渗透的敷料(ACTICOAT，SLVERLON)。这些药剂中的每一个具有潜在的限制，例如，不同的渗透焦痂的能力，抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的效力不均匀以及对宿主免疫细胞的潜在毒性(参见，例如，Steinstraesser等人，Antimicrob Agents Chemother 46(6)：1837-1844，2002)。
因此，本发明提供用于治疗烧伤创面的纳米乳剂组合物以及使用所述组合物的方法。例如，如实施例9所示，本发明提供纳米乳剂组合物和使用所述组合物的方法以降低、缓解和/或预防烧伤创面中的细菌生长。本发明还提供在烧伤后降低创面炎症的纳米乳剂组合物。虽然，理解本发明的作用机制不需要实践本发明，并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，烧伤后施用于创面的纳米乳剂组合物能够更深地渗透且均匀地进入烧伤创面(例如，从而降低和/或抑制创面位置的细菌生长和/或炎症)。如实施例9所示，本发明提供降低、抑制和/或除去烧伤创面中的细菌生长的方法，所述方法包括提供烧伤创面和纳米乳剂以及将纳米乳剂在降低、抑制和/或除去细菌生长的条件下施用于烧伤创面。在一些实施方式中，本文所述的纳米乳剂组合物与一种或一种以上抗菌药物联合施用于烧伤创面以最小化烧伤创面位置的细菌生长。本发明不限于任何特定的抗菌药物。事实上，本领域技术人员已知的抑制细菌生长的任何抗菌药物可与本文所述的纳米乳剂联合使用。
除了局部效应之外，已知严重的真皮烧伤诱导全身炎症反应综合症(SIRS)，其导致末梢器官功能障碍的高风险(参见，例如，Barton等人，J Burn Care Rehabil 18(1)：1-9，1997)。提高的血管渗透性和全身毛细血管渗漏作为烧伤后SIRS的结果造成血浆渗漏进入全身的间质组织。这种组织水肿和血管内血容量降低引起宿主不期望的临床问题，例如，休克、肺部功能障碍、腹部或下肢腔室综合症以及心力衰竭。
如实施例9所示，本文所述的纳米乳剂组合物可施用于烧伤创面以治疗(例如，降低、缓解和/或预防)烧伤创面位置的炎症、组织水肿和/或血管内血容量降低。在一些实施方式中，烧伤创面位置的炎症、组织水肿和/或血管内血容量降低的减轻降低了休克、肺部功能障碍、腹部或下肢腔室综合症和/或心力衰竭的发生。在一些实施方式中，本文所述的纳米乳剂与一种或一种以上抗炎药物联合使用(例如，联合给药)以最小化早期烧伤创面炎症和组织水肿。本发明不限于任何特定的抗炎药物。事实上，最小化早期烧伤创面炎症和组织水肿的任何抗炎药物可与本文所述的纳米乳剂联合使用。
在一些实施方式中，将本发明的纳米乳剂(例如，W205GBA2ED)施用于烧伤创面以预防、缓解和/或根除部分皮层烧伤创面中的细菌(例如，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌或其他细菌)生长。实施例9显示了微生物感染降低伴随着产生较低水平的局部真皮促炎症细胞因子和减少的嗜中性粒细胞螯合进入烧伤创面的现象。烧伤创面中细胞生长和炎症的降低也在早期烫伤时间段后产生较少的毛细血管渗漏。在烧伤时间段后立即具有的临床上降低毛细血管渗漏和组织水肿的能力使得对大体积结晶状液体复苏的需求较少并且降低了与生理容量超负荷、肺功能障碍和腹部腔室综合症有关的后遗症。
由烫伤而受损的皮肤失去了保护宿主不受感染的能力，所述感染由物理屏障功能的损失和由烫伤引起的继发性免疫抑制引起。而且，在烧伤后TGF-β和IL-10的产量的增加可导致免疫抑制(参见，例如，Lyons等人，Arch Surg 134(12)：1317-1323，1999；Varedi等人，Shock 16(5)：380-382，2001)。已确立了用抗TGF-β来治理烧伤的动物可提高绿脓杆菌的局部和全身清除(参见，例如，Huang等人，J Burn Care Res 27(5)：682-687，2006)。TGF-β的抑制也导致细菌挑战实验后存活率增加。如实施例9所示，观察到在部分皮层烧伤后的皮肤内TGF-β显著提高但是IL-10没有提高。然而，将纳米乳剂(例如，10％W205GBA2ED)局部施用于接种了细菌的烧伤创面导致当与未处理的烧伤创面相比较时TGF-β的水平降低。
在烧伤创面中发生细菌感染可延迟或甚至逆转组织愈合的过程(参见，例如，Steinstraesser等人，Crit Care Med 29(7)：1431-1437，2001)。局部抗菌治疗用于减少烧伤创面中的微生物载荷并且降低感染风险。目前局部药剂包括硝酸银(AgNO3)、磺胺嘧啶银盐、醋酸磺胺米隆和纳米晶体浸透的银敷料。硝酸银因为接触染色而产生的问题和有限的抗真菌活性而使其使用受到限制。磺胺嘧啶银盐是局部烧伤抗菌治疗的主要支柱。它是针对绿脓杆菌和其他革兰氏阴性肠道菌的杀菌剂。一些生物体已出现了对磺胺嘧啶银盐的抗性(参见，例如，Silver等人，J Ind Microbiol Biotechnol 33(7)：627-634，2006)。所述药剂具有有限的抗真菌活性，但是可与制真菌素联合使用。磺胺嘧啶银盐没有真正的渗透烧伤焦痂的能力并且有时导致白血球减少症，磺胺嘧啶银盐需要转换成其他局部药剂。醋酸磺胺米隆的使用受到如下事实的限制：醋酸磺胺米隆对选择的生物体是抑菌的，它具有有限的抗革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)的活性，并且由于醋酸磺胺米隆代谢成为碳酸酐酶抑制剂，其在大表面面积上的使用可导致代谢性酸中毒。纳米晶体银敷料具有目前可获得的药剂中最广的抗烧伤创面病原体的活性。它们具有最适度的渗透焦痂的能力并且可留在原来的地方持续许多天(参见，例如，Church等人，Clin Microbiol Rev 19(2)：403-434，2006)。激活的p38MAPK的抑制剂SB202190可大大降低在烧伤创面中产生的真皮炎症(参见，例如，Arbabi等人，Shock.26(2)：201-209，2006)。烫伤引起真皮炎症以及促凋亡细胞信号转导。
如实施例9所示，纳米乳剂(例如，W205GBA2ED)的局部施用导致烧伤皮肤的真皮中的毛囊细胞凋亡降低。因此，在一些实施方式中，本发明提供纳米乳剂组合物，所述组合物当施用于烧伤创面时可用于降低“停滞区(zone of stasis)”中部分皮层烧伤创面向全部皮层烧伤区域的转化。
没有吸入损伤迹象的患者中，烧伤创面自身是引发全身炎症反应的主要原因，所述全身炎症反应通过产生促炎症细胞因子和嗜中性粒细胞进入烧伤创面的螯合作用来引发(参见，例如，Hansbrough等人，J Surg Res 61(1)：17-22，1996；Piccolo等人，Inflammation 23(4)：371-385，1999；Till等人，J Clin Invest 69(5)：1126-1135，1982)。p38 MAPK抑制剂的局部施用可控制真皮水平的炎症的起源，导致较低的促炎症介导物含量，降低嗜中性粒细胞的螯合作用和微血管损伤以及烧伤创面毛囊细胞中较少的上皮细胞凋亡(参见，例如，Ipaktchi等人，Shock.26(2)：201-209，2006)。在啮齿动物模型中，部分皮层烧伤之后，炎症的真皮起源的控制也降低了细菌生长并且缓解了全身炎症反应，从而导致较少的急性肺损伤和心脏功能障碍。因此，在一些实施方式中，本发明的纳米乳剂单独或与抗炎和/或抗菌剂联合用于(例如，施用)降低局部真皮炎症和烧伤创面(例如，早期烧伤创面、部分皮层创面、全皮层创面或其他烧伤创面)中的感染风险。本发明不受用于与本文所述的纳米乳剂联合给药的抗炎和/或抗菌剂的类型的限制。事实上，可使用多种抗炎剂和/或抗菌剂，包括但不限于：硝酸盐(AgNO3)、磺胺嘧啶银盐、醋酸磺胺米隆、纳米晶体浸透的银敷料、p38MARK抑制剂(例如，SB 202190)或本文所述的其他抗炎或抗菌剂。
在一些实施方式中，当将本发明的纳米乳剂施用于烧伤创面时，所述纳米乳剂可以多种方法来施用(例如，施用于受治者(例如，施用于烧伤或创面表面))，所述方法包括但不限于：直接使用或悬浮于溶液(例如，胶体溶液)并施用于表面(例如，含有细菌(例如病原体细菌)的表面或易受细菌侵入影响的表面)；使用喷雾器喷到表面上；与纤连蛋白胶混合并施用于(例如，喷到)表面上(例如，皮肤烧伤或创面)；浸透至创面敷料上或绷带上并将绷带施用于表面(例如，感染或烧伤创面)；通过控制释放机制来施用；或浸透无细胞的生物基质的一面或两面，然后将其置于表面上(例如，皮肤烧伤或创面)，从而保护创面和移植界面。在一些实施方式中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含(a)含有纳米乳剂(例如，W205GBA2ED)的组合物；和(b)一种或一种以上其他药剂(例如，抗生素)。其他类型的抗生素的实例包括但不限于：阿美西林、阿姆地诺西林、氨丁卡霉素、阿莫西林、双霉素、两性霉素B、氨比西林、阿扎胞苷、重氮丝氨酸、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、巴卡西林、崔西杆菌素、苄基青霉噻唑酰多聚赖氨酸、争光霉素、杀念珠菌素、卷曲霉素、羧苄青霉素、氯氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢孟多、唑啉头孢菌素、头孢地尼、头孢平、头孢克肟、头孢甲肟、头孢美唑、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、氨噻肟头孢菌素、头孢替坦、头孢替安、头孢西丁、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢罗齐、头孢磺啶、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢三嗪、头孢呋辛、氰乙酰头孢菌素、头孢氨苄、氨基苯乙酰头孢菌素、头孢噻啶、头孢噻吩、吡硫头孢菌素、环己烯胺头孢菌素、氯霉素、氯四环素、西司他丁、肉桂霉素、环丙沙星、克拉霉素、克拉维酸、氯林可霉素、氯碘羟喹、邻氯青霉素、粘菌素M、粘菌素、环青霉素、环丝氨酸、环孢霉素、环-(亮氨酸-Pro)、更生霉素、达贝万星(dalbavancin)、达福普汀、达托霉素、道诺霉素、地美环素、地托比星、双氯青霉素、二双青链霉素、地红霉素、链霉素、强力霉素、表柔比星、红霉素、喹诺酮、氟氯青霉素、磷霉素、夫西地酸、吉米沙星、庆大霉素、短杆菌肽、灰黄霉素、海他西林、去甲氧柔红霉素、亚胺培南、依色加南(iseganan)、伊维菌素、卡那霉素、天冬霉素、利奈唑胺、林可霉素、氯拉卡比、爪蟾抗菌肽、甲氯环素、美罗培南、甲稀土霉素、甲氧苯青霉素、美洛西林、二甲胺四环素、丝裂霉素、默诺菌素(moenomycin)、拉氧头孢、莫西沙星、麦克酚酸、乙氧萘胺青霉素、游霉素、新霉素、乙基烯梭霉素、尼菲霉素、呋喃妥英、新生霉素、竹桃霉素、奥利万星、唑青霉素、氧四环素、巴龙霉素、青霉胺、青霉素G、青霉素V、苯氧乙基青霉素、氧哌嗪青霉素、光辉霉素、多粘菌素B、原始霉素、奎奴普丁、利福布丁、利福平、利福霉素、罗利环素、西苏霉素、壮观霉素(spectrinomycin)、链霉素、链佐星、舒巴坦、舒他西林、他克莫司、他唑巴坦、替考拉宁、泰利霉素、四环素、替卡西林、替加环素、托普霉素、醋竹桃霉素、衣霉素、短杆菌素(tyrthricin)、万古霉素、阿糖腺苷、紫霉素、维及霉素、BMS-284,756、L-749,345、ER-35,786、S-4661、L-786,392、MC-02479、Pep5、RP 59500和TD-6424。在一些实施方式中，两种或两种以上联合药剂(例如，含有纳米乳剂和抗生素的组合物)可一同使用或顺序使用。在一些实施方式中，抗生素可包括细菌素、A型羊毛硫抗生素、B型羊毛硫抗生素、脂硫霉素、胞质霉素、alanoylcholines、喹诺酮(quinolines)、扁枝衣菌素(eveminomycins)、替加环素、碳青霉稀、头孢菌素、链霉杀阳菌素、恶唑烷酮、四环素、环噻唑烷(cyclothialidines)、双恶唑霉素(bioxalomycins)、阳离子肽和/或抗菌肽。在一些实施方式中，所述组合物包括溶葡萄球菌素。
本发明不受所使用(例如，用于呼吸给药、施用于烧伤创面和/或在诱导保护性免疫反应的免疫原性组合物中使用)的纳米乳剂的类型的限制。事实上，认为多种纳米乳剂组合物在本发明中有用。
例如，在一些实施方式中，纳米乳剂包括(i)水相；(ii)油相；和至少一种额外的化合物。在本发明的一些实施方式中，这些额外的化合物与组合物的水相或油相中的任一种混合。在其他实施方式中，这些额外的化合物与预先乳化的油相和水相的组合物混合。在一些实施方式中，一种或一种以上额外的化合物在使用之前立即与存在的乳剂组合物混合。在其他实施方式中，一种或一种以上额外的化合物在组合物即时使用之前与存在的乳剂组合物混合。
适用于本发明的纳米乳剂的额外的化合物包括但不限于：一种或一种以上有机物，更加具体而言，有机磷酸盐溶剂、表面活性剂和洗涤剂、含阳离子卤素的化合物、发芽促进剂(germination enhancer)、相互作用促进剂、食品添加剂(例如，调味剂、甜味剂、填充剂，等等)和药学上可接受的化合物。认为在本发明的组合物中使用的各种化合物的一些示范性的实施方式在下面说明。除非另有描述，本发明所述的纳米乳剂是未稀释的形式。
存储稳定性和施用本发明的纳米乳剂之后的稳定性
存储稳定性
本发明的纳米乳剂可在约40℃和约75％的相对湿度条件下稳定持续一段时间，所述一段时间为至少约1个月、至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约2年、至少约2.5年或至少约3年。
在本发明另一实施方式中，本发明的纳米乳剂可在25℃和约60％的相对湿度条件下稳定持续一段时间，所述一段时间为至少约1个月、至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约2年、至少约2.5年、或至少约3年、至少约3.5年、至少约4年、至少约4.5年或至少约5年。
进一步，本发明的纳米乳剂可在约4℃条件下稳定持续一段时间，所述一段时间为至少约1个月、至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约2年、至少约2.5年、至少约3年、至少约3.5年、至少约4年、至少约4.5年、至少约5年、至少约5.5年、至少约6年、至少约6.5年或至少约7年。
施用后的稳定性
本发明的纳米乳剂在施用后是稳定的，令人惊讶地是，所述纳米乳剂在施用后未损失它们的物理结构。施用根据本发明的纳米乳剂之后皮肤表面的微观检查证实了本发明的纳米乳剂的物理完整性。该物理完整性可导致观察到本发明的纳米乳剂的期望的吸收。
纳米乳剂
本文定义的术语“纳米乳剂”是指分散体或液滴或任何其他脂质结构。本发明中预见的典型的脂质结构包括但不限于：单层、寡层和多层脂质囊泡、胶束和层状相。
本发明的纳米乳剂含有液滴，所述液滴的平均直径小于约1,000nm、小于约950nm、小于约900nm、小于约850nm、小于约800nm、小于约750nm、小于约700nm、小于约650nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm或它们的任何组合。在一种实施方式中，所述液滴的平均直径为大于约125nm和小于或等于约300nm。在不同的实施方式中，所述液滴的平均直径为大于约50nm或大于约70nm以及小于或等于约125nm。在本发明的其他实施方式中，所述纳米乳剂的液滴的平均直径为约300nm至约600nm；或者所述纳米乳剂的液滴的平均直径为约150nm至约400nm。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂具有窄的MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)值范围。在另一实施方式中，所述纳米乳剂的MIC和MBC相差小于或等于四倍，这意味着所述纳米乳剂是杀菌性的。此外，所述纳米乳剂的MIC和MBC相差可以大于四倍，这意味着所述纳米乳剂是抑菌性的。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂包括：(a)水相；(b)约1％的油至约80％的油；(c)约0.1％的有机溶剂至约50％的有机溶剂；(d)约0.001％的表面活性剂或洗涤剂至约10％的表面活性剂或洗涤剂；(e)约0.0005％的螯合剂至约1.0％的螯合剂；或(e)它们的任何组合。在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂包括：(a)约10％的油至约80％的油；(b)约1％的有机溶剂至约50％的有机溶剂；(c)以约0.1％至约10％的量存在的至少一种非离子型表面活性剂；(d)以约0.01％至约3％的量存在的至少一种阳离子药剂；或它们的任何组合。
在另一实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂是氯化十六烷基吡啶(CPC)或苯扎氯铵中的任一种或烷基二甲基苄基氯化铵(BTC 824)或它们的任何组合。所述阳离子表面活性剂在所述纳米乳剂中的浓度为小于约5.0％且大于约0.001％，或者进一步地，所述阳离子表面活性剂在所述纳米乳剂中的浓度为小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％、小于约0.10％、大于约0.001％、大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％以及大于约0.010％。
在附加的实施方式中，所述纳米乳剂包含非离子型表面活性剂，并且诸如聚山梨醇酯之类的非离子型表面活性剂的浓度为约0.01％至约10.0％或约0.1％至约3％。
在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂：(a)包含至少一种阳离子表面活性剂；(b)包含阳离子表面活性剂，其为氯化十六烷基吡啶或苯扎氯铵中的任一种或烷基二甲基苄基氯化铵(BTC 824)或它们的组合；(c)包含阳离子表面活性剂并且其中，所述阳离子表面活性剂的浓度为小于约5.0％且大于约0.001％；(d)包含阳离子表面活性剂并且其中，所述阳离子表面活性剂的浓度选自：小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％、小于约0.10％、大于约0.001％、大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％，以及大于约0.010％；或(e)它们的任何组合。在又一实施方式中，(a)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂；(b)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中所述非阳离子表面活性剂是非离子型表面活性剂；(c)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中所述非阳离子表面活性剂是聚山梨酸酯非离子型表面活性剂；(d)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中所述非阳离子表面活性剂是非离子型表面活性剂，并且所述非离子型表面活性剂的浓度为约0.05％至约10％、约0.05％至约7.0％、约0.1％至约7％或约0.5％至约5％；(e)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子型表面活性剂，其中所述阳离子表面活性剂的浓度为约0.05％至约2％或约0.01％至约2％；或(f)它们的任何组合。
在其他实施方式中，所述纳米乳剂包含：(a)水；(b)乙醇或甘油(丙三醇)或它们的任何组合；(c)氯化十六烷基吡啶(CPC)或苯扎氯铵中的任一种或烷基二甲基苄基氯化铵(BTC 824)或它们的任何组合；(c)大豆油；和(e)泊洛沙姆407，吐温80或吐温20。所述纳米乳剂还可包含EDTA。
存在于所述纳米乳剂中的组分的这些量涉及治疗性纳米乳剂而不是体外待测试的纳米乳剂。这是重要的，因为体外测试的纳米乳剂中的油、有机溶剂、表面活性剂或洗涤剂以及螯合剂(如果有的话)的浓度通常比期望用于治疗使用(例如，局部使用)的纳米乳剂中存在油、有机溶剂、表面活性剂或洗涤剂以及螯合剂(如果有的话)的浓度更低。这是因为体外研究不需要纳米乳剂液滴横穿皮肤。对于局部、气溶胶、皮内等使用而言，组分的浓度必须较高以使得纳米乳剂产生治疗性。然而，体外测试的纳米乳剂中使用的每个组分的相对量可适用于待治疗上使用的纳米乳剂，因此，体外量可被扩大以制备治疗性组合物并且体外数据可预见局部应用的成功。
1.水相
水相可包含任何类型的水相，包括但不限于：水(例如，H2O，蒸馏水，自来水)和溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)。在一些实施方式中，水相包含pH值为约4至10的水，优选地pH值为约6至8。所述水可以是去离子的(下文“DiH2O”)。在一些实施方式中，所述水相包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述水相还可以是无菌盐水或无热原水。
2.有机溶剂
本发明的纳米乳剂中的有机溶剂包括但不限于：C1-C12醇类、二醇、三醇、二烷基磷酸酯、诸如三-n-丁基磷酸酯之类的三烷基磷酸酯、其半合成衍生物及其组合。在本发明的一个方面，所述有机溶剂是选自非极性溶剂、极性溶剂、质子溶剂或非质子溶剂的醇类。
用于纳米乳剂的合适的有机溶剂包括但不限于：乙醇、甲醇、异丙醇、甘油、中链甘油三酯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸、正丁醇、丁二醇、香料醇类、异丙醇、正丙醇、甲酸、丙二醇、甘油、山梨醇、工业用甲醇变性酒精、三乙酰甘油酯、己烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、1，4-二氧杂环、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酸、其半合成衍生物，以及其任何组合。
3.油相
本发明的纳米乳剂中的油可以是任何化妆品或药学上可接受的油。所述油可以是挥发性的或非挥发性的，可以选自：动物油、植物油、天然油、合成油、烃类油、硅树脂油、其半合成的衍生物及其组合。
合适的油包括但不限于：矿物油、角鲨烯油、香味油、硅油、精油、水不溶的维生素、异丙基硬脂酸酯、硬脂酸丁酯、辛基棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、十三烷醇山嵛酯、二异丙基己二酸酯、癸二酸二辛酯、薄荷基氨基苯甲酸酯、十六烷基碘苯腈辛酸酯、辛基水杨酸酯、十四烷酸异丙酯、新戊二醇二癸酸酯鲸蜡醇、Ceraphyls
Figure BPA00001374059100501
癸基油酸酯、二异丙基己二酸酯、C12-15烷基乳酸酯、十六烷基乳酸酯、月桂基乳酸酯、异硬脂醇新戊酸酯、十四烷基乳酸酯、异鲸蜡醇硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二醇硬脂酰硬脂酸酯、烃类油、异链烷烃、流体石蜡、异构十二烷、矿脂、摩洛哥坚果油、加拿大芥花油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈坚果油、花生油、松籽油、罂粟籽油、南瓜子油、米糠油、红花油、茶油、块菌油、植物油、杏(仁)油、希蒙德木油(加州希蒙得木种子油)、葡萄籽油、夏威夷果油、麦芽油、杏仁油、菜籽油、葫芦油、大豆油、芝麻油、榛子油、玉米油、向日葵油、大麻籽油、白檀香油(bois oil)、库奎(kuki)坚果仁油、鳄梨油、核桃油、鱼油、刺柏子油、多香果油、桧油、籽油、杏仁籽油、茴香籽油、芹菜籽油、枯茗籽油、肉豆蔻籽油、叶油、罗勒叶油、月桂叶油、肉桂叶油、荔枝草叶油、桉树叶油、柠檬草叶油、白千层叶油、奥杜那干酪叶油、广藿香叶油、薄荷叶油、松叶油、迷迭香叶油、绿薄荷叶油、茶树叶油、百里香叶油、鹿蹄草叶油、花油、春黄菊油、鼠尾草油、丁香油、天竺葵花油、牛膝草花油、茉莉花油、熏衣草花油、松红梅花油、墨角兰(Marhoram)花油、橙花油、玫瑰花油、依兰树花油、栲皮油、肉桂皮油、桂皮油、黄樟树皮油、桐油、樟木油、柏木油、玫瑰木油、檀香油、地下茎(姜)桐油、松香油、兰丹油、没药油、果皮油、香柠檬果皮油、葡萄柚果皮油、柠檬果皮油、石灰果皮油、橙皮油、柑桔皮油、根油、缬草油、油酸、亚油酸、油醇、异硬脂醇、其半合成衍生物和其任何组合。
所述油可以进一步包含硅树脂成分，例如，挥发性的硅树脂成分，所述挥发性的硅树脂成分可以是硅树脂成分中的溶胶油，或可以与其他硅树脂和非硅树脂、挥发性的和非挥发性油结合。合适的硅树脂成分包括但不限于：甲基苯基聚硅氧烷、西甲硅氧烷、二甲基硅氧烷、苯基三甲基硅氧烷(或其有机改性的形式)、聚硅氧烷的烷基衍生物、十六烷基二甲硅氧烷、月桂基三甲硅氧烷、聚硅氧烷的羟基化的衍生物，例如，聚二甲基硅氧烷醇、挥发性硅树脂油、环状和线性的硅树脂、环甲硅氧烷、环甲硅氧烷的衍生物、六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、挥发性的线性二甲聚硅氧烷、异十六烷、异二十烷、异二十四烷、聚异丁烯、异辛烷、异十二烷、其半合成衍生物和其组合。
挥发性油可以是有机溶剂，或者挥发性油可以是除有机溶剂之外还存在的挥发性油。合适的挥发性的油包括但不限于：萜烯、单萜、倍半萜、排气剂、甘菊环烃、薄荷醇、樟脑、侧柏酮、百里香酚、橙花醇、芳樟醇、苎烯、香叶醇、紫苏子醇、橙花叔醇、法呢醇、依兰烯、没药醇、法呢烯、驱蛔萜、土荆芥油、香茅醛、柠檬醛、香茅醇、母菊奥、蓍草、愈创烯、甘菊、其半合成衍生物或其组合。
本发明的一个方面，硅树脂成分中的挥发性油不同于油相中的油。
4.表面活性剂/洗涤剂
本发明的纳米乳剂中的表面活性剂或洗涤剂可以是药学上可接受的离子型表面活性剂、药学上可接受的非离子表面活性剂、药学上可接受的阳离子表面活性剂、药学上可接受的阴离子表面活性剂、或药学上可接受的两性离子表面活性剂。
示范性的有用的表面活性剂在Applied Surfactants：Principles and Applications.Tharwat F.Tadros，Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，Weinheim ISBN：3-527-30629-3中描述，通过引用将其特别地并入本文。
进一步，所述表面活性剂可以是药学上可接受的离子型聚合物表面活性剂、药学上可接受的非离子聚合物表面活性剂、药学上可接受的阳离子聚合物表面活性剂、药学上可接受的阴离子聚合物表面活性剂或药学上可接受的两性离子聚合物表面活性剂。聚合物表面活性剂的实例包括但不限于，具有多个(至少一个)聚环氧乙烷(PEO)侧链的聚(甲基丙烯酸甲酯)主干的接枝共聚物，聚羟基硬脂酸、烷氧基化的烷基酚甲醛缩合物、具有脂肪酸疏水物的聚亚烷基二醇修饰的聚酯、聚酯、其半合成衍生物或其组合。
表面活性剂(surface active agent或surfactant)是两亲性分子，其由连接至极性或离子型亲水性部分的非极性疏水性部分组成，所述非极性疏水性部分通常是含有8至18个碳原子的直链或支链烃或氟碳化合物链。所述亲水性部分可以是非离子型、离子型或两性离子型。在水相环境中烃链与水分子微弱地相互作用，而极性或离子型头部基团通过偶极或离子偶极相互作用与水分子强烈地相互作用。根据亲水基团的性质，表面活性剂被分成阴离子型、阳离子型、两性离子型、非离子型和聚合物表面活性剂。
合适的表面活性剂包括，但不限于：包含9到10个乙二醇单元的乙氧基化的壬基酚、包含8个乙二醇单元的乙氧基化的十一醇、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化氢化蓖麻油、月桂基硫酸钠、环氧乙烷和环氧丙烷的两嵌段共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷和环氧丙烷的四功能嵌段共聚物、甘油基单酯、甘油基癸酸酯、甘油基辛酸酯、甘油基椰油酸酯、甘油基芥酸酯、甘油基羟基硬脂酸酯、甘油基异硬脂酸酯、甘油基羊毛脂酸酯、甘油基月桂酸酯、甘油基亚油酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基油酸酯、甘油基PABA、甘油基棕榈酸酯、甘油基蓖麻醇酸酯、甘油基硬脂酸酯、甘油基巯基乙酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二油酸脂、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、甘油基倍半油酸酯、甘油基硬脂酸酯乳酸酯、聚氧乙烯十六烷基/硬脂酰基醚、聚氧乙烯胆固醇醚、聚氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚、类固醇、胆固醇、β谷固醇、没药醇、醇的脂肪酸酯、十四烷酸异丙酯、脂肪-异丙基n-丁酸酯、异丙基n-己酸酯、异丙基n-癸酸酯、异丙基棕榈酸酯、辛基十二基肉豆蔻酸酯、烷氧基化的醇类、烷氧基化的酸、烷氧基化的酰胺、烷氧基化的糖类衍生物、天然油和蜡的烷氧基化的衍生物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、壬苯醇醚-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6可可酰胺、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪醚、甘油基二酯、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚和聚氧乙烯月桂基醚、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、其半合成衍生物或其混合物。
其他合适的表面活性剂包括但不限于：非离子的脂质，例如，甘油基月桂酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、其半合成衍生物和其混合物。
在其他实施方式中，所述表面活性剂是具有约2个至约100个聚氧乙烯头部基团的聚氧乙烯脂肪醚、或具有R5--(OCH2 CH2)y-OH结构的烷氧基化的醇类，其中R5是具有约6个至约22个碳原子的分支或不分支的烷基基团，y为约4至约100，优选地，为约10至约100。优选地，所述烷氧基化的醇类是R5是月桂基基团且y的平均值为23的物质。
在不同的实施方式中，所述表面活性剂是烷氧基化的醇类，其是羊毛脂醇的乙氧基化的衍生物。优选地，羊毛脂醇的乙氧基衍生物是羊毛脂醇醚-10(laneth-10)，其是平均乙氧基化值为10的羊毛脂醇的聚乙二醇醚。
非离子型表面活性剂包括但不限于：乙氧基化的表面活性剂、乙氧基化的醇类、乙氧基化的烷基酚、乙氧基化的脂肪酸、乙氧基化的单烷醇酰胺(monoalkaolamide)、乙氧基山梨糖醇酐酯、乙氧基化脂肪氨基、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、二(聚乙二醇二[咪唑羰基])、壬苯醇醚-9、二(聚乙二醇二[咪唑羰基])、Brij
Figure BPA00001374059100541
35、Brij
Figure BPA00001374059100542
56、Brij72、Brij76、Brij
Figure BPA00001374059100545
92V、Brij
Figure BPA00001374059100546
97、Brij
Figure BPA00001374059100547
58P、CremophorEL、十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、n-癸基α-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、n-十二烷基α-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十二烷基醚、七乙二醇单十四烷基醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树皮的皂角苷、Span
Figure BPA00001374059100549
20、Span
Figure BPA000013740591005410
40、Span
Figure BPA000013740591005411
60、Span
Figure BPA000013740591005412
65、Span
Figure BPA000013740591005413
80、Span
Figure BPA000013740591005414
85、Tergitol 15-S-12、Tergitol 15-S-30、Tergitol 15-S-5、Tergitol 15-S-7、Tergitol 15-S-9、Tergitol NP-10、Tergitol NP-4、Tergitol NP-40、Tergitol NP-7、Tergitol NP-9、Tergitol、Tergitol TMN-10、Tergitol TMN-6、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、TritonX-114、Triton
Figure BPA000013740591005416
X-165、Triton
Figure BPA000013740591005417
X-305、Triton
Figure BPA000013740591005418
X-405、Triton
Figure BPA000013740591005419
X-45、Triton
Figure BPA000013740591005420
X-705-70、TWEEN
Figure BPA000013740591005421
20、TWEEN
Figure BPA000013740591005422
21、TWEEN
Figure BPA000013740591005423
40、TWEEN
Figure BPA000013740591005424
60、TWEEN
Figure BPA000013740591005425
61、TWEEN
Figure BPA000013740591005426
65、TWEEN
Figure BPA000013740591005427
80、TWEEN
Figure BPA000013740591005428
81、TWEEN
Figure BPA000013740591005429
85、泰洛沙泊、n-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、其半合成衍生物或其组合。
此外，所述非离子表面活性剂可以是泊洛沙姆。泊洛沙姆是由聚氧乙烯嵌段其后连接聚氧丙烯嵌段其后连接聚氧乙烯嵌段构成的聚合物。基于与聚合物相关的数字，聚氧乙烯和聚氧化丙烯的平均单元数不同。例如，最小的聚合物，泊洛沙姆101，由平均2个单元的聚氧乙烯嵌段、平均16个单元的聚氧化丙烯嵌段、以及平均2个单元的聚氧乙烯嵌段组成。泊洛沙姆从无色液体和膏剂到白色的固体。在化妆品和个人护理产品中，泊洛沙姆用于皮肤洗涤剂、沐浴产品、香波、护发素、嗽口水、眼睛卸状物和其它皮肤和头发产品制剂。泊洛沙姆的实施包括但不限于：泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯。
合适的阳离子表面活性剂包括但不限于：季铵化合物、烷基三甲基氯化铵化合物、二烷基二甲基氯化铵化合物、阳离子的含卤素化合物，例如，氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基二十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、Girard试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、N，N’，N’-聚氧乙烯(10)-N-牛羊脂-1，3-二氨基丙烷、溴苄嘧棕胺、三甲基(十四烷基)溴化铵、1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇、1-癸基铵、N-癸基-N，N-二甲基-氯化物、二癸基二甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)甲酚)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉氯化物、烷基二(2-羟乙基)苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)、烷基二甲基3，4-二氯苯甲基氯化铵(55％C14，23％C12，20％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(41％C14，28％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(47％C12，18％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(55％C16，20％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(58％C14，28％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(60％C14，25％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C11，23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C12、23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(65％C12，25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12，24％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12、25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(90％C14、5％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(93％C14、4％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(95％C16、5％C18)、烷基二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-18)、二烷基的二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)、烷基二甲基乙基溴化铵(混合的烷基和烯基基团，如在大豆油的脂肪酸中一样)、烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基苯甲基氯化铵(60％C14)、烷基二甲基异丙基苯甲基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、3％C18)、烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)、烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)、烷基二甲基(乙基苯甲基)氯化铵(C12-18)、二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基甲基苯甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基二(2-羟乙基)辛基氯化氢铵、十二烷基二甲基苯甲基氯化铵、十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基苯甲基氯化铵、十七基羟基乙基咪唑啉氯化物、六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪、Myristalkonium氯化物(和)Quat RNIUM 14、N，N-二甲基-2-羟基丙基氯化铵聚合物、n-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苯甲基氯化铵、氧基二乙烯基二(烷基二甲基氯化铵)、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵、三甲氧基甲硅烷基季铵盐、三甲基十二烷基苯甲基氯化铵、其半合成衍生物和其组合。
示范性的含卤素的阳离子化合物包括，但不限于：十六烷基吡啶卤化物、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化膦、十二烷基三甲基卤化铵，或十四烷基三甲基卤化铵。在一些特定的实施方式中，合适的含卤素的阳离子化合物包括，但不限于：氯化十六烷基吡啶(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、溴化十六烷吡啶(CPB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化膦、十二烷基三甲基溴化铵和十四烷基三甲基溴化铵。在特别优选的实施方式中，所述含卤素的阳离子化合物是CPC，虽然本发明的组合物不限于具有特定的含阳离子的化合物制剂。
合适的阴离子表面活性剂包括但不限于：羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、牛或绵羊胆汁、去氢胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨去氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、合成的甘氨胆酸钠盐水合物，合成的甘氨去氧胆酸一水合物、甘氨去氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、N-十二烷基肌氨酸钠盐、N-十二烷基肌氨酸溶液、N-十二烷基肌氨酸溶液、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、卢戈(Lugol)溶液、4型硫酸四癸钠(Niaproof4)、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷基磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、络胆酸钠、去氧胆酸钠、去氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、牛磺去氧胆酸钠盐一水合物、牛磺猪去氧胆酸钠盐水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺熊去氧胆酸钠盐、Trizma
Figure BPA00001374059100571
十二烷基硫酸酯、TWEEN
Figure BPA00001374059100572
80、熊去氧胆酸、其半合成衍生物和其组合。
合适的两性离子表面活性剂包括但不限于：N-烷基甜菜碱、月桂基氨基丙基二甲基甜菜碱、烷基二甲基甘氨酸盐、N-烷基氨基丙酸酯、最小值98％(TLC)的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、最小值98％(TLC)的CHAPS(SigmaUltra)、最小值98％(TLC)的用于电泳的CHAPS、3-[-(3-胆酰胺丙基)-二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)、最小值98％的CHAPSO、用于电泳的CHAPSO(SigmaUltra)、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐(SigmaUltra)、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基辛基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐，其半合成衍生物和其组合。
在一些实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，其可以是氯化十六烷基吡啶。在本发明的其他实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂的浓度是小于约5.0％和大于约0.001％。在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂包含阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂的浓度选自：小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％或小于约0.10％。进一步，所述纳米乳剂中阳离子试剂的浓度是大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％、大于约0.010％或大于约0.001％。在一种实施方式中，所述纳米乳剂中阳离子试剂的浓度是小于约5.0％且大于约0.001％。
在本发明的另一实施方式中，所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂。所述非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂，例如，聚山梨酸酯(Tween)，例如，聚山梨酸酯80或聚山梨酸酯20。在一种实施方式中，所述非离子表面活性剂的浓度为约0.05％至约7.0％，或所述非离子表面活性剂的浓度为约0.5％至约4％。在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂包含与非离子表面活性剂结合的、浓度为约0.01％至约2％的阳离子表面活性剂。
5.其他成分
适于在本发明的纳米乳剂中使用的其他化合物包括但不限于一种或一种以上溶剂，例如，有机磷酸盐式溶剂、填充剂、着色剂、药学上可接受的赋形剂、防腐剂、pH调节剂、缓冲剂、螯合剂，等等。所述其他化合物可以混合到预先乳化的纳米乳剂中，或所述其他化合物可以添加到待乳化的原始混合物中。在这些实施方式的一些中，一种或一种以上其他化合物在使用所述纳米乳剂组合物之前立即混合到已有的纳米乳剂组合物中。
本发明的纳米乳剂中合适的防腐剂包括但不限于：氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、苯甲醇、氯己定、咪唑基脲、苯酚、山梨酸钾、苯甲酸、溴硝丙二醇、氯甲酚、对羟苯甲酸酯、苯氧乙醇、山梨酸、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟茴醚、丁基化羟基甲苯、抗坏血酸钠、焦亚硫酸钠、柠檬酸、依地酸，其半合成衍生物和其组合。其他合适的防腐剂包括，但不限于：苯甲醇、氯己定(二(p-氯苯基二胍)己烷)、氯苯甘醚(3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇)、Kathon CG(甲基和甲基氯异噻唑啉酮)、对羟苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基羟基苯甲酸酯)、苯氧乙醇(2-苯氧乙醇)、山梨酸(山梨酸钾、山梨酸)、Phenonip(苯氧乙醇、甲基、乙基、丁基、丙基对羟苯甲酸酯)、Phenoroc(苯氧乙醇0.73％，对羟基苯甲酸甲酯0.2％，对羟苯甲酸丙酯0.07％)、Liquipar油(异丙基、异丁基、丁基对羟基苯甲酸酯)、Liquipar PE(70％苯氧乙醇，30％liquipar油)、Nipaguard MPA(苯甲醇(70％)、甲基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipaguard MPS(丙二醇、甲基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipasept(甲基、乙基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipastat(甲基、丁基、乙基和丙基对羟苯甲酸酯)、Elestab 388(丙二醇中的苯氧乙醇加氯苯甘醚和对羟基苯甲酸甲酯)和Killitol(7.5％氯苯甘醚和7.5％对羟基苯甲酸甲酯)。
纳米乳剂可以进一步包含至少一种pH值调节剂。本发明的纳米乳剂中合适的pH值调节剂包括但不限于：二乙醇胺、乳酸、单乙醇胺、三乙醇胺、氢氧化钠、磷酸钠，其半合成衍生物和其组合。
此外，所述纳米乳剂可包含螯合剂。在本发明的一种实施方式中，所述螯合剂的量为约0.0005％到约1.0％。螯合剂的实例包括但不限于：肌醇六磷酸、多聚磷酸、柠檬酸、葡糖酸、乙酸、乳酸、乙撑二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)和二巯丙醇，并且优选的螯合剂是乙二胺四乙酸。
所述纳米乳剂可以包含缓冲剂，例如，药学上可接受的缓冲剂。缓冲剂的实例包括但不限于：2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(≥99.5％(NT))，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(≥99.0％(GC))，L-(+)-酒石酸(≥99.5％(T))，ACES(≥99.5％(T))，ADA(≥99.0％(T))，乙酸(≥99.5％(GC/T))，用于萤光的乙酸(≥99.5％(GC/T))，用于分子生物学的乙酸铵溶液(H2O中约5M)，用于萤光的乙酸铵(≥99.0％(根据干物质计算，T))，碳酸氢铵(≥99.5％(T))，柠檬酸二铵(≥99.0％(T))，甲酸铵溶液(H2O中10M)，甲酸铵(≥99.0％(根据干物质计算，NT))，草酸铵一水合物(≥99.5％(室温))，磷酸氢二铵溶液(H2O中2.5M)，磷酸氢二铵(≥99.0％(T))，磷酸二氢铵溶液(H2O中2.5M)，磷酸二氢铵(≥99.5％(T))，磷酸氢钠铵四水合物(≥99.5％(NT))，用于分子生物学的硫酸铵溶液(H2O中3.2M)，酒石酸二铵溶液(H2O中2M(20℃无色溶液))，酒石酸二铵(≥99.5％(T))，用于分子生物学的BES缓冲盐水(2×浓缩)，BES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的BES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的BICINE缓冲溶液(H2O中1M)，BICINE(≥99.5％(T))，BIS-TRIS(≥99.0％(NT))，碳酸氢盐缓冲溶液(Na2CO3＞0.1M，NaHCO3＞0.2M)，硼酸(≥99.5％(T))，用于分子生物学的硼酸(≥99.5％(T))，CAPS(≥99.0％(TLC))，CHES(≥99.5％(T))，乙酸钙水合物(≥99.0％(根据干物质计算，KT))，碳酸钙沉淀(≥99.0％(KT))，柠檬酸三钙四水合物(≥98.0％(根据干物质计算，KT))，用于分子生物学的柠檬酸盐浓缩溶液(H2O中1M)，无水柠檬酸(≥99.5％(T))，用于萤光的无水柠檬酸(≥99.5％(T))，二乙醇胺(≥99.5％(GC))，EPPS(≥99.0％(T))，用于分子生物学的乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(≥99.0％(T))，甲酸溶液(H2O中1.0M)，Gly-Gly-Gly(≥99.0％(NT))，Gly-Gly(≥99.5％(NT))，甘氨酸(≥99.0％(NT))，用于萤光的甘氨酸(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的甘氨酸(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的HEPES缓冲盐水(2倍浓缩)，HEPES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的HEPES(≥99.5％(T))，咪唑缓冲溶液(H2O中1M)，咪唑(≥99.5％(GC))，用于萤光的咪唑(≥99.5％(GC))，用于分子生物学的咪唑(≥99.5％(GC))，脂蛋白重折叠缓冲液，醋酸锂二水合物(≥99.0％(NT))，柠檬酸三锂四水合物(≥99.5％(NT))，MES水合物(≥99.5％(T))，用于萤光的MES一水合物(≥99.5％(T))，用于分子生物学的MES溶液(H2O中0.5M)，MOPS(≥99.5％(T))，用于萤光的MOPS(≥99.5％(T))，用于分子生物学的MOPS(≥99.5％(T))，用于分子生物学的乙酸镁溶液(H2O中约1M)，乙酸镁四水合物(≥99.0％(KT))，柠檬酸三镁九水合物(≥98.0％(根据干物质计算，KT))，甲酸镁溶液(H2O中0.5M)，磷酸氢二镁三水合物(≥98.0％(KT))，用于原位杂交的中和溶液，用于分子生物学的草酸二水合物(≥99.5％(RT))，PIPES(≥99.5％(T))，用于分子生物学的PIPES(≥99.5％(T))，磷酸盐缓冲盐水(溶液(高压灭菌的))，磷酸盐缓冲盐水(Western印迹中过氧化物酶共轭物的洗涤缓冲液，10倍浓缩)，无水哌嗪(≥99.0％(T))，D-酒石酸氢钾(≥99.0％(T))，用于分子生物学的乙酸钾溶液，用于分子生物学的乙酸钾溶液(H2O中5M)，用于分子生物学的乙酸钾溶液(H2O中约1M)，乙酸钾(≥99.0％(NT))，用于萤光的乙酸钾(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的乙酸钾(≥99.0％(NT))，碳酸氢钾(≥99.5％(T))，无水碳酸钾(≥99.0％(T))，氯化钾(≥99.5％(AT))，柠檬酸氢钾(≥99.0％(干物质，NT))，柠檬酸三钾溶液(H2O中1M)，甲酸钾溶液(H2O中14M)，甲酸钾(≥99.5％(NT))，草酸钾一水合物(≥99.0％(RT))，无水磷酸氢二钾(≥99.0％(T))，用于萤光的无水磷酸氢二钾(≥99.0％(T))，用于分子生物学的无水磷酸氢二钾(≥99.0％(T))，无水磷酸二氢钾(≥99.5％(T))，用于分子生物学的无水磷酸二氢钾(≥99.5％(T))，磷酸三钾一水合物(≥95％(T))，邻苯二甲酸氢钾(≥99.5％(T))，酒石酸钠钾溶液(H2O中1.5M)，酒石酸钠钾四水合物(≥99.5％(NT))，四硼酸钾四水合物(≥99.0％(T))，四草酸钾二水合物(≥99.5％(RT))，丙酸溶液(H2O中1.0M)，用于分子生物学的STE缓冲溶液(pH 7.8)，用于分子生物学的STET缓冲溶液(pH 8.0)，5，5-二乙基巴比土酸钠(≥99.5％(NT))，用于分子生物学的乙酸钠溶液(H2O中约3M)，乙酸钠三水合物(≥99.5％(NT))，无水乙酸钠(≥99.0％(NT))，用于萤光的无水乙酸钠(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的无水乙酸钠(≥99.0％(NT))，碳酸氢钠(≥99.5％(T))，酒石酸氢钠一水合物(≥99.0％(T))，碳酸钠十水合物(≥99.5％(T))，无水碳酸钠(≥99.5％(根据干物质计算，T))，无水柠檬酸二氢钠(≥99.5％(T))，柠檬酸三钠二水合物(≥99.0％(NT))，用于萤光的柠檬酸三钠二水合物(≥99.0％(NT))，用于分子生物学的柠檬酸三钠二水合物(≥99.5％(NT))，甲酸钠溶液(H2O中8M)，草酸钠(≥99.5％(RT))，磷酸氢二钠二水合物(≥99.0％(T))，用于萤光的磷酸氢二钠二水合物(≥99.0％(T))，用于分子生物学的磷酸氢二钠二水合物(≥99.0％(T))，磷酸氢二钠十水合物(≥99.0％(T))，磷酸氢二钠溶液(H2O中0.5M)，无水磷酸氢二钠(≥99.5％(T))，用于分子生物学的磷酸氢二钠(≥99.5％(T))，磷酸二氢钠二水合物(≥99.0％(T))，用于分子生物学的磷酸二氢钠二水合物(≥99.0％(T))，用于分子生物学的磷酸二氢钠一水合物(≥99.5％(T))，磷酸二氢钠溶液(H2O中5M)，焦磷酸二氢二钠(≥99.0％(T))，焦磷酸四钠十水合物(≥99.5％(T))，酒石酸二钠二水合物(≥99.0％(NT))，酒石酸二钠溶液(H2O中1.5M(20℃无色溶液))，四硼酸钠十水合物(≥99.5％(T))，TAPS(≥99.5％(T))，TES(≥99.5％(根据干物质计算，T))，用于分子生物学的TM缓冲溶液(pH 7.4)，用于分子生物学的TNT缓冲溶液(pH 8.0)，TRIS甘氨酸缓冲溶液(10倍浓缩)，用于分子生物学的TRIS乙酸-EDTA缓冲溶液，TRIS缓冲盐水(10倍浓缩)，用于电泳的TRIS甘氨酸SDS缓冲溶液(10倍浓缩)，用于分子生物学的浓缩的TRIS磷酸-EDTA缓冲溶液(10倍浓缩)，Tricine(≥99.5％(NT))，三乙醇胺(≥99.5％(GC))，三乙胺(≥99.5％(GC))，三乙基乙酸铵缓冲液(挥发性的缓冲液，H2O中约1.0M)，三乙基磷酸铵溶液(挥发性的缓冲液，H2O中约1.0M)，三甲基醋酸铵溶液(挥发性的缓冲液，H2O中约1.0M)，三甲基磷酸铵溶液(挥发性的缓冲液，H2O中约1M)，用于分子生物学的浓缩的Tris-EDTA缓冲溶液(100倍浓缩)，用于分子生物学的Tris-EDTA缓冲溶液(pH 7.4)，用于分子生物学的Tris-EDTA缓冲溶液(pH 8.0)，Trizma乙酸盐(≥99.0％(NT))，Trizma
Figure BPA00001374059100622
碱(≥99.8％(T))，Trizma
Figure BPA00001374059100623
碱(≥99.8％(T))，用于萤光的Trizma
Figure BPA00001374059100624
碱(≥99.8％(T))，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA00001374059100625
碱(≥99.8％(T))，Trizma碳酸盐(≥98.5％(T))，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA00001374059100627
盐酸盐缓冲溶液(pH 7.2)，用于分子生物学的Trizma盐酸盐缓冲溶液(pH 7.4)，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA00001374059100629
盐酸盐缓冲溶液(pH 7.6)，用于分子生物学的Trizma盐酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，Trizma盐酸盐(≥99.0％(AT))，用于萤光的Trizma
Figure BPA000013740591006212
盐酸盐(≥99.0％(AT))，用于分子生物学的Trizma
Figure BPA000013740591006213
盐酸盐(≥99.0％(AT))和Trizma
Figure BPA000013740591006214
马来酸盐(≥99.5％(NT))。
所述纳米乳剂可以包含一种或一种以上乳化剂来帮助形成乳剂。乳化剂包括在油/水界面处聚集以形成防止两个邻近液滴的直接接触的连续膜的化合物。本发明的一些实施方式特征在于可以容易地用水将纳米乳剂稀释到期望的浓度而不损害它们的抗病毒性质。
6.掺入本发明的纳米乳剂中的活性剂
在本发明的附加的实施方式中，纳米乳剂包含其他活性剂，例如抗生素或缓和剂(例如用于烧伤创面治疗)。加入其他药剂可改善纳米乳剂的治疗效果。在所述纳米乳剂中或所述纳米乳剂自身具有抗菌活性并且不需要与其他活性剂结合以获得治疗效果。适用于治疗细菌感染的任何抗菌剂(或抗生素)可掺入本发明的局部纳米乳剂中。
这些抗生素的实例包括但不限于：氨基糖苷、安莎霉素、碳头孢烯、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽、大环内酯物、单菌霉素、青霉素、多肽、多粘菌素、喹诺酮、磺胺、四环素以及其他(例如，胂凡纳明、氯霉素、氯林可霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑胺、甲硝哒唑、莫匹罗星、呋喃妥英、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平(美国称为Rifampin)、甲砜氯霉素、磺甲硝咪唑、氨苯砜以及氨苯吩嗪)。
这些种类的抗生素的实例包括但不限于：氨丁卡霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、链霉素、托普霉素、巴龙霉素、格尔德霉素、除莠霉素、氯拉卡比、厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁、倍能、头孢羟氨苄、唑啉头孢菌素、头孢噻吩或先锋霉素I、头孢氨苄、氯氨苄青霉素、头孢孟多、头孢西丁、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、胺噻肟头孢菌素、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢三嗪、头孢平、头孢比普(Ceftobiprole)、替考拉宁、万古霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、壮观霉素、噻肟单酰胺菌素、阿莫西林、氨比西林、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、唑青霉素、青霉素、氧哌嗪青霉素、替卡西林、崔西杆菌素、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷沙星、帕氟沙星、替马氟沙星、磺胺米隆、磺胺柯衣定(古老的)、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺二甲异唑(Sulfanilimide)(古老的)、硫氮磺胺吡啶、磺胺异恶唑(Sulfisoxazole)、甲氧苄氨嘧啶、甲氧苄氨嘧啶-磺胺异恶唑(复方磺胺甲恶唑)(TMP-SMX)、地美环素、强力霉素、二甲胺四环素、氧四环素以及四环素。
掺入本发明的纳米乳剂中的缓和剂的实例包括但不限于：薄荷醇、樟脑、苯酚、尿囊素、苯佐卡因、皮质类固醇、苯酚、氧化锌、樟脑、普莫卡因、二甲聚硅氧烷、美拉地酯、奥西诺酯、新水杨酯、氧苯酮、达克罗宁、醇类(例如，苯甲醇)、矿物油、丙二醇、二氧化钛、硝酸银(AgNO3)、磺胺嘧啶银盐、醋酸磺胺米隆、纳米晶体浸透的银敷料、p38MAPK抑制剂以及硬脂酸镁。
D.药物组合物
本发明的纳米乳剂可配制成药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的纳米乳剂和合适的药学上可接受的赋形剂用于使用常规的药学给药方法施用于人类受治者。这样的赋形剂是本领域公知的。
术语“治疗有效量”，是指任何量的纳米乳剂，所述任何量通过杀死微生物或抑制微生物的生长，使得微生物失去致病性或其任何组合来有效处理微生物。
示范性的剂型可包括但不限于：贴片、软膏剂、霜剂、乳剂、液体、洗剂、凝胶、生物粘附性凝胶、气雾剂、膏剂、泡沫、防晒剂、胶囊、微囊或物体或载体的形式，例如，绷带、插入物、注射器样敷涂器、阴道栓剂、粉剂、滑石粉或其他固体。
药物组合物可配制成立即释放、持续释放、控制释放、延迟释放或其任何组合。在一些实施方式中，所述剂型可包括用于提高纳米乳剂通过角质层渗透进入表皮或真皮(即，用于治疗烧伤创面的方法)的渗透促进剂。合适的渗透促进剂包括但不限于诸如乙醇之类的醇类、甘油三酯和芦荟组合物。渗透促进剂的量可以为基于剂型重量的约0.5％到约40％。
在适当的时候，例如当治疗烧伤创面时，本发明的纳米乳剂可通过使用电泳递送/电泳来应用和/或递送。这些包括使用电流在内的透皮给药方法是本领域熟知的。
在本发明的另一实施方式中，纳米乳剂的最小全身吸收在局部给药之后发生。这样的最小全身吸收可通过检测存在于受治者的血浆中纳米乳剂中的一种或一种以上表面活性剂的浓度小于10ng/mL、小于8ng/mL、小于5ng/mL、小于4ng/mL、小于3ng/mL或小于2ng/mL来确定。例如，通过测量经过治疗的人类受治者的血浆中表面活性剂(例如阳离子表面活性剂)的量可以监测没有全身性吸收。血浆中表面活性剂的量等于或小于约10ng/ml确认了没有全身性吸收。
药物组合物可单次施用或可多次施用。药物组合物可施用持续至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天，每周一次、每周至少两次、每天至少一次、每天至少两次、每天多次、每周多次两周一次、每月至少一次或其任何组合。
局部或皮内给药之后，所述纳米乳剂可以被封闭或半封闭。所述封闭或半封闭可以通过将绷带、聚烯烃薄膜、衣物、不可渗透隔挡物或半不可渗透隔挡物覆盖到局部制剂上来进行。
示范性的纳米乳剂
下面描述了几种示范性的纳米乳剂，虽然本发明的方法不限于这些纳米乳剂的使用。组分以及每种组分的量可如本文其他纳米乳剂的制剂中所述的组分和量而变化。(“CPC”是指氯化十六烷基吡啶，它是存在于所述纳米乳剂中的阳离子表面活性剂)。组合物为重量百分比(w/w％)，除非另有说明。
Figure BPA00001374059100651
Figure BPA00001374059100661
下列纳米乳剂的平均粒径(液滴尺寸)为约300nm至约600nm：W205ECED，P4075EC，W205GBA2，W805EC，和W205GBA2ED。W205ECEDL2，上述纳米乳剂经过了高压过程，其平均粒径(液滴尺寸)为约150nm至约400nm。上表中列出的制剂是“净(neat)”或“浓缩”制剂，意味着可将期望用于治疗用途的制剂如所期望的稀释。
生产方法
本发明的纳米乳剂可利用典型的乳剂形成技术来形成。参见，例如美国专利申请第2004/0043041号。也参见美国专利第6,015,832号、第6,506,803号、第6,559,189号、第6,635,676号和美国专利公开第20040043041号，所有上述专利文献通过引用特别地并入本文。此外，在美国专利第5,103,497号和第4，895,452号(通过引用并入本文)中描述了制备乳剂的方法。在示范性的方法中，在相对高的剪切力(例如，使用高水压和机械力)下使油与水相混合，从而获得含有油液滴的纳米乳剂，所述油液滴的平均直接小于约1000nm。本发明的一些实施方式采用了具有油相的纳米乳剂，所述油相包含诸如乙醇之类的醇类。所述油和水相可以利用任何装置混合，所述装置能够产生足以形成乳剂的剪切力，例如French Presses或高剪切力混合器(例如，FDA批准的高剪切力混合器可从例如Admix，Inc.，Manchester，N.H.获得)。生产这些乳剂的方法在美国专利第5,103,497号和第4,895,452号中描述，通过引用将上述美国专利并入本文。
在示范性的实施方式中，本发明的方法中使用的纳米乳剂包含分散在水性连续相(例如水)中的油性不连续相的液滴。本发明的纳米乳剂是稳定的，甚至在长期保存之后不分解。本发明的一些纳米乳剂当吞咽、吸入或与受治者的皮肤接触时是无毒的和安全的。
本发明的组合物可大量生产并且在各种温度条件下稳定许多个月。所述纳米乳剂可具有从半固体霜剂到稀薄洗剂的质地并且可用手局部施用以及可喷到表面上或可被雾化。
如上所述，至少一部分乳剂可以是脂质结构的形式，所述脂质结构包括但不限于：单层、多层和寡层脂质囊泡、胶束和层状相。
本发明认为所描述的纳米乳剂的许多变化将在本发明的方法中有用。为了确定候选纳米乳剂是否适用于本发明，分析了三种指标。使用本文所述的方法和标准，可容易地测试候选乳剂以确定它们是否合适。首先，利用本文描述的方法来制备期望的成分，确定是否可以形成纳米乳剂。如果不能形成纳米乳剂，候选物被排除。第二，候选纳米乳剂应当形成稳定的乳剂。如果纳米乳剂维持在乳剂形式持续一段足以使其预期使用的时间段，那么纳米乳剂是稳定的。例如，对于要保存、装运等等的纳米乳剂而言，期望的是所述纳米乳剂保持在乳剂形式中持续数月到数年。相对不稳定的典型的纳米乳剂将在一天内失去它们的形式。第三，候选纳米乳剂应当具有用于其预期用途的效力。例如，本发明的乳剂应当在体外杀死微生物或使微生物失去能力。为了确定特定候选纳米乳剂对于期望的微生物的适用性，将所述纳米乳剂在具有合适的对照样本(例如，诸如水之类的阴性对照)的平行试验中暴露于微生物持续一段时间或一段以上的时间段，并且确定所述纳米乳剂是否杀死微生物或使微生物失去能力以及杀死微生物的程度或使微生物失去能力的程度。
本发明的纳米乳剂可以许多不同类型的容器和递送体系来提供。例如，在本发明的一些实施方式中，所述纳米乳剂以液体、洗剂、霜剂或其他固体或半固体形式提供。本发明的纳米乳剂可掺入水凝胶剂型中。
所述纳米乳剂可以任何合适的容器来递送(例如，递送至受治者或顾客)。可以使用提供所述纳米乳剂的一个或一个以上单次使用剂量或多次使用剂量的合适的容器，用于期望的应用。在本发明的一些实施方式中，所述纳米乳剂以悬浮液或液体形式提供。这些纳米乳剂可以包括喷雾瓶(例如，加压喷雾瓶、喷雾器)在内的任何合适的容器来递送。
示范性的使用方法
如贯穿本申请的更加详细的内容中所述，本发明涉及治疗和/或预防患有囊性纤维化(CF)的受治者的呼吸道感染的方法。一般而言，所述方法包括将纳米乳剂施用于受治者，其中所述纳米乳剂包含：(i)水；(ii)至少一种有机溶剂；(iii)至少一种表面活性剂；和(iv)至少一种油；并且其中，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。在本发明的一种实施方式中，所述受治者易受感染或具有感染，所述感染由一种或一种以上细菌种类引起，所述细菌种类选自：葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)和变形杆菌属(Proteus spp.)。所述纳米乳剂可使用任何药学上可接受的方法来递送，吸入是有用的给药方法中的一个实例。
在又一实施方式中，本发明涉及治疗或预防具有烧伤创面的受治者的感染的方法，其中：(a)所述方法包括将纳米乳剂施用于所述受治者；和(b)所述纳米乳剂包含：(i)水；(ii)至少一种有机溶剂；(iii)至少一种表面活性剂；和(iv)至少一种油；并且其中，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。在本发明的一种实施方式中，所述受治者易受感染或具有感染，所述感染由一种或一种以上革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌引起。在另一实施方式中，所述细菌种类选自：葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)和变形杆菌属(Proteus spp.)。所述纳米乳剂可使用任何药学上可接受的方法来递送，吸入、喷雾和局部施用于粘膜表面是有用的给药方法中的一个实例。
在又一实施方式中，本发明涉及治疗或预防受治者中的流感嗜血杆菌感染的方法，其中：(a)所述方法包括将纳米乳剂施用于患有流感嗜血杆菌感染或处于患有流感嗜血杆菌感染的风险中的受治者；(b)所述纳米乳剂包含：(i)水；(ii)至少一种有机溶剂；(iii)至少一种表面活性剂；和(iv)至少一种油；并且(c)其中，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。所述纳米乳剂可使用任何药学上可接受的方法来递送，吸入、喷雾和局部施用于粘膜表面是有用的给药方法中的一个实例。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米乳剂表现出最小或无毒性或副作用。优选地，所述纳米乳剂对细菌不表现出抗性。这种实施方式用于本文所述的所有方法。
如果所述方法涉及呼吸道感染，那么在一种实施方式中，所述呼吸道感染可与细菌生物膜有关，例如存在于受治者的肺中的生物膜。
本发明的所有方法还可包括在施用所述纳米乳剂之前、之中或之后施用一种或一种以上抗生素。在又一实施方式中，一种或一种以上抗生素可掺入纳米乳剂中。在本发明的又一实施方式中，所述纳米乳剂与抗生素未表现出任何拮抗作用。
在本发明的一种实施方式中，纳米乳剂的施用和至少一种抗生素的施用起协同作用，所述协同作用由部分抑菌浓度(FIC)指数、部分杀菌浓度(FBC)指数或其组合来限定。该实施方式用于本文所述的所有方法。这些抗生素的实例包括但不限于：多粘菌素(粘菌素)和氨基糖苷(托普霉素)。
在又一实施方式中，本发明的方法可用于治疗或预防由一种或一种以上细菌种类引起的感染，所述细菌种类选自：绿脓杆菌、新洋葱伯克霍尔德杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形杆菌。所有其他革兰氏阳性或革兰氏阴性菌也包括在本发明的方法内。
在一种实施方式中，纳米乳剂的最小抑菌浓度(MIC)，最小杀菌浓度(MBC)或其组合表示了纳米乳剂的抑菌或杀菌活性。该实施方式用于本文所述的所有方法。
在本发明的另一实施方式中，一种或一种以上细菌可对一种或一种以上抗生素表现出抗性。例如，所述细菌可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRAS)。该实施方式用于本文所述的所有方法。
本发明不受施用了本发明的组合物的受治者的类型的限制。可将本发明的组合物施用于上文所述的每个受治者(例如，易受呼吸道感染影响)。此外，本发明的组合物和方法在治疗其他呼吸道疾病和失调方面有用，所述其他呼吸道疾病和失调例如急性支气管炎、支气管扩张、肺炎(包括呼吸机相关的肺炎、医院性肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎、分支杆菌肺炎、真菌肺炎、嗜酸性肺炎和卡氏肺囊虫肺炎)、肺结核、囊性纤维化(CF)、放射性肺炎肺气肿和与炎症有关的呼吸道感染，所述炎症由吸烟、肺水肿、尘肺病、结节病、硅肺病、石棉沉滞病、铍中毒，煤矿工人的肺尘埃沉滞病(CWP)、棉屑沉滞病、诸如先天性肺部纤维化之类的间质性肺病(ILD)、与胶原血管疾病有关的ILD、全身性红斑狼疮、风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病。并且所述肺炎是由诸如流感之类的另一疾病引起的或是诸如流感之类的另一疾病的继发性疾病。
本发明不受含有本发明的纳米乳剂的组合物的特定剂型的限制。事实上，含有本发明的纳米乳剂的组合物可包含除所述纳米乳剂之外的一种或一种以上不同的药剂。这些药剂或辅助因素包括但不限于：佐剂、表面活性剂、添加剂、缓冲剂、增溶剂、螯合剂、油类、盐类、治疗剂、药物、生物活性剂、抗菌剂和抗微生物的药剂(例如，抗生素、抗病毒剂，等等)。在一些实施方式中，含有本发明的纳米乳剂的组合物包含提高所述纳米乳剂杀死微生物(例如，位于呼吸道中)的能力的药剂和/或辅助因素。在一些优选的实施方式中，一种或一种以上辅助因素或药剂的存在降低了杀死微生物和/或抑制微生物生长所需的纳米乳剂的量。本发明不受在本发明的治疗剂中使用的辅助因素或药剂的类型的限制。
在一些实施方式中，在纳米乳剂组合物中使用的辅助因素或药剂是生物活性剂。例如，在一些实施方式中，所述生物活性剂可以是在细胞(例如表达CFTR的细胞)中有用的生物活性剂。本文使用的生物活性剂包括诊断剂，例如放射性标记物和荧光标记物。生物活性剂还包括影响细胞(例如表达CFTR的细胞)代谢的分子，所述分子包括肽、核酸和其他天然和合成的药物分子。生物活性剂包括但不限于：肾上腺素剂；肾上腺皮质类固醇；肾上腺皮质抑制剂；酒精遏制物(alcohol deterrent)；醛固酮拮抗剂；氨基酸；氨解毒剂；合成代谢剂；兴奋剂；止痛剂；雄性激素；辅助麻醉剂(anesthesia，adjunct to)；麻醉剂；降食欲剂；拮抗剂；垂体前叶抑制剂；驱虫剂；粉刺剂；抗肾上腺素剂；抗过敏剂；抗变形虫剂；抗雄激素剂；抗贫血剂；抗心绞痛剂；抗焦虑剂；抗关节炎剂；抗哮喘剂；抗动脉粥样硬化剂；抗菌剂；抗胆石剂；抗胆结石剂(anticholelithogenic)；抗胆碱能剂；抗凝血剂；抗球虫剂(anticoccidal)；抗痉挛剂；抗抑郁剂；抗糖尿病剂；止泻剂；抗利尿剂；解毒剂；止吐剂；抗癫痫剂；抗雌激素剂；抗纤维蛋白溶解剂；抗真菌剂；抗青光眼剂；抗血友病剂；止血剂；抗组胺剂；降血脂剂；降多脂蛋白剂(antihyperlipoproteinemic)；抗高血压剂；抗低血压剂；抗感染剂；局部抗感染剂；抗炎剂；抗角质化剂；抗疟疾剂；抗菌剂；抗偏头痛剂；抗有丝分裂剂；抗霉菌剂；止恶心剂；抗肿瘤剂；抗中性白细胞减少剂；抗强迫症(antiobessional)剂；抗寄生虫剂；抗帕金森病药剂；抗蠕动剂；抗肺囊虫剂；抗扩增剂；抗前列腺肥大剂；抗原生动物药剂；止痒剂；抗精神病药剂；抗风湿剂；抗吸血虫剂；抗皮脂溢剂；抗分泌剂；止痉挛剂；抗血栓形成剂；止咳剂；抗溃疡剂；抗尿石病药剂；抗病毒剂；食欲抑制剂；良性前列腺增生治疗剂；血糖调节剂；骨吸收抑制剂；支气管扩张剂；碳酸酐酶抑制剂；心脏抑制剂；心脏防护剂；强心剂；心血管药剂；利胆剂；胆碱能剂；胆碱能激动剂；胆碱酯酶失活剂；球虫抑制剂；认知佐剂；认知促进剂；镇静剂；辅助诊断药剂；利尿剂；多巴胺能药剂；体外杀寄生虫药剂；催吐剂；酶抑制剂；雌激素；纤蛋白溶解药剂；荧光剂；氧自由基清除剂；胃肠蠕动效应剂；糖皮质激素；性腺刺激原则；毛发生长刺激剂；止血剂；组胺H2受体拮抗剂；激素；降血胆固醇剂；降血糖剂；降血脂剂；降血压剂；显像剂；免疫剂；免疫调节剂；免疫调节剂；免疫刺激剂；免疫抑制剂；辅助治疗阳痿药剂；抑制剂；角质分离剂；LHRH激动剂；肝脏疾病治疗剂；黄体溶解素；记忆佐剂；心理性能促进剂；心情调节剂；粘液溶解剂；粘膜保护剂；散瞳剂；减轻鼻部充血药剂；神经肌肉阻断剂；神经保护剂；NMDA拮抗剂；非激素固醇衍生物；催产素；血纤维蛋白溶原激活剂；血小板活化因子拮抗剂；血小板聚集抑制剂；中风后和头部创伤后治疗剂；增效剂；孕酮；前列腺素；前列腺生长抑制剂；促甲状腺激素原(prothyrotropin)；治疗精神异常药剂；肺部表面；放射性药剂；调节剂；弛缓剂；再分配药剂；灭疥癣药剂；硬化剂；镇静剂；镇静催眠剂；选择性腺苷酸A1拮抗剂；血清素拮抗剂；血清素抑制剂；血清素受体拮抗剂；类固醇；刺激剂；抑制剂；多发性硬化症状；配合剂；甲状腺激素；甲状腺抑制剂；拟甲状腺剂；镇定剂；肌萎缩性侧索硬化症药剂；脑缺血药剂；佩吉特氏病药剂；不稳定心绞痛药剂；排尿酸剂；血管收缩剂；血管扩张剂；外伤用药剂；创面治愈药剂；黄嘌呤氧化酶抑制剂。
作为抗菌剂有用的分子可通过本发明的方法和组合物来递送，从而缓解或消除呼吸道感染。用于与含有本发明的纳米乳剂的组合物联合给药的抗生素包括但不限于杀菌剂和/或抑菌剂(例如，抑制细菌的繁殖或抑制感染性生物体存活所需要的细菌组分的合成)的药剂或药物，所述抗生素包括但不限于：阿美西林、阿姆地诺西林、氨丁卡霉素、阿莫西林、双霉素、两性霉素B、氨比西林、阿扎胞苷、重氮丝氨酸、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、巴卡西林、崔西杆菌素、苄基青霉噻唑酰多聚赖氨酸、争光霉素、杀念珠菌素、卷曲霉素、羧苄青霉素、氯氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢孟多、唑啉头孢菌素、头孢地尼、头孢平、头孢克肟、头孢甲肟、头孢美唑、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、氨噻肟头孢菌素、头孢替坦、头孢替安、头孢西丁、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢罗齐、头孢磺啶、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢三嗪、头孢呋辛、氰乙酰头孢菌素、头孢氨苄、氨基苯乙酰头孢菌素、头孢噻啶、头孢噻吩、吡硫头孢菌素、环己烯胺头孢菌素、氯霉素、氯四环素、西司他丁、肉桂霉素、环丙沙星、克拉霉素、克拉维酸、氯林可霉素、氯碘羟喹、邻氯青霉素、粘菌素M、粘菌素、环青霉素、环丝氨酸、环孢霉素、环-(亮氨酸-Pro)、更生霉素、达贝万星(dalbavancin)、达福普汀、达托霉素、道诺霉素、地美环素、地托比星、双氯青霉素、二双青链霉素、地红霉素、链霉素、强力霉素、表柔比星、红霉素、喹诺酮、氟氯青霉素、磷霉素、夫西地酸、吉米沙星、庆大霉素、短杆菌肽、灰黄霉素、海他西林、去甲氧柔红霉素、亚胺培南、依色加南(iseganan)、伊维菌素、卡那霉素、天冬霉素、利奈唑胺、林可霉素、氯拉卡比、爪蟾抗菌肽、甲氯环素、美罗培南、甲稀土霉素、甲氧苯青霉素、美洛西林、二甲胺四环素、丝裂霉素、默诺菌素(moenomycin)、拉氧头孢、莫西沙星、麦克酚酸、乙氧萘胺青霉素、游霉素、新霉素、乙基烯梭霉素、尼菲霉素、呋喃妥英、新生霉素、竹桃霉素、奥利万星、唑青霉素、氧四环素、巴龙霉素、青霉胺、青霉素G、青霉素V、苯氧乙基青霉素、氧哌嗪青霉素、光辉霉素、多粘菌素B、原始霉素、奎奴普丁、利福布丁、利福平、利福霉素、罗利环素、西苏霉素、壮观霉素(spectrinomycin)、链霉素、链佐星、舒巴坦、舒他西林、他克莫司、他唑巴坦、替考拉宁、泰利霉素、四环素、替卡西林、替加环素、托普霉素、醋竹桃霉素、衣霉素、短杆菌素(tyrthricin)、万古霉素、阿糖腺苷、紫霉素、维及霉素、BMS-284,756、L-749,345、ER-35,786、S-4661、L-786,392、MC-02479、Pep5、RP 59500和TD-6424。
在一些实施方式中，含有本发明的纳米乳剂的组合物包含一种或一种以上粘膜粘附剂(参见，例如，美国专利申请第20050281843号，其通过引用并入本文)。本发明不受所使用的粘膜粘附剂的类型的限制。事实上，认为多种粘膜粘附剂在本发明中有用，所述粘膜粘附剂包括但不限于：聚丙烯酸的交联衍生物(例如，聚羧乙烯(carbopol)和聚卡波非)，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrollidone)、多糖(例如，藻酸盐和壳聚糖)、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛蛋白和羧甲基纤维素。虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，当使用粘膜粘附剂与未使用粘膜粘附剂条件下暴露于纳米乳剂的持续时间段和/或量比较时，由于暴露于纳米乳剂的持续时间段和/或量增加，粘膜粘附剂的使用(例如，在含有纳米乳剂的组合物中使用)促进杀死微生物和/或抑制微生物的生长(例如，暴露于本发明的组合物)。
在一些实施方式中，本发明的组合物可包括无菌水性制剂。可接受的载体和溶剂包括但不限于：水、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。对于这种目的而言，任何温和的不挥发性矿物油或非矿物油可被使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸之类的脂肪酸用于可注射制剂。在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa中可发现适用于粘膜、肺部、皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内或通过其他途径给药的载体剂型。
含有本发明的纳米乳剂的组合物可在治疗上使用(例如，杀死已有的感染和/或缓解已有的感染的发展)或用作预防剂(例如，预防微生物的生长和/或定殖(例如，预防疾病的征兆或症状))。含有本发明的纳米乳剂的组合物可通过多种不同的递送途径和方法施用于受治者。
例如，本发明的组合物可通过多种方法施用于受治者(例如，粘膜或通过肺部途径)，所述方法包括但不限于：悬浮于溶液并施用于表面；悬浮于溶液并使用喷雾器喷至表面；与粘膜粘附剂混合并施用于(例如，喷或擦拭)表面(例如，粘膜表面或肺部表面)；置于或浸透至鼻部和/或肺部涂药器并使用；通过控制释放机制施用；使用喷雾器施用；雾化，作为脂质体施用或施用于聚合物上。
在一些实施方式中，本发明的组合物通过粘膜施用(例如，使用标准方法；参见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，19th edition，1995(例如，用于粘膜递送技术，包括鼻腔内和肺部技术)以及European Publication No.517,565 and Illum等人，J.Controlled Rel.，1994，29：133-141(例如，用于鼻腔内给药技术)，上述参考文献的全部内容通过引用并入本文)。本发明不受给药途径的限制。
鼻腔内和肺部给药方法是本领域熟知的，包括将纳米乳剂的液滴或喷雾形式施用至待治疗的受治者的鼻咽。在一些实施方式中，提供了含有纳米乳剂的雾化的或气雾的组合物。诸如耐胃酸胶囊之类的用于口服给药的肠溶剂型，用于直肠或阴道给药的栓剂也可形成本发明的一部分。本发明的组合物还可通过口服给药。在这些情况下，含有纳米乳剂的组合物可包含药学上可接受的赋形剂和/或包括碱性缓冲液或肠溶胶囊。用于鼻部递送的剂型可包括具有葡聚糖或环糊精以及皂素作为佐剂的那些剂型。
在优选的实施方式中，本发明的纳米乳剂通过肺部递送途径和/或方法来施用。在一些实施方式中，将含有纳米乳剂的水溶液轻轻地且完全地混合以形成溶液。所述溶液是无菌的，并将所述溶液过滤(例如，通过0.2微米的过滤器)至无菌密封容器中。在无菌条件下，使所述溶液流过合适的微孔以产生液滴(例如，0.1微米至10微米)。
使用多种不同涂药器中的任何一种来施用颗粒。合适的制备和给药方法在下面的美国专利中描述：INHALE(现在是NEKTAR)第6,592,904号；第6,518,239号；第6,423,344号；第6,294,204号；第6,051,256号和第5,997,848号；以及美国专利第5,985,309号；修订37,053；Edwards(MIT，AIR)等人的美国专利第6,436,443号；第6,447,753号；第6,503,480号；和第6,635,283号，上述美国专利中的每一个通过引用并入本文。
因此，在一些实施方式中，本发明的组合物通过肺部递送来施用。例如，本发明的组合物可通过吸入递送至受治者(例如，人类)的肺部(参见，例如，Adjei，等人Pharmaceutical Research 1990；7：565-569；Adjei，等人Int.J.Pharmaceutics 1990；63：135-144；Braquet，等人J.Cardiovascular Pharmacology 1989 143-146；Hubbard，等人(1989)Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212；Smith，等人J.Clin.Invest.1989；84：1145-1146；Oswein，等人″Aerosolization of Proteins″，1990；Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado；Debs，等人J.Immunol.1988；140：3482-3488；以及Platz等人的美国专利第5,284,656号，上述参考文献中的每一个通过引用并入本文)。用于肺部递送药物的方法和组合物的全身作用在下列美国专利中描述：Wong等人的美国专利第5,451,569号；Licalsi等人的美国专利第6,651,655号，上述美国专利通过引用并入本文。在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物通过一种以上的途径或方式施用于受治者(例如，通过肺部途径和粘膜途径施用)。
进一步地，为了实践本发明的应用，为肺部和/或鼻部粘膜递送药剂设计的各种机械设备是期望的，包括但不限于：喷雾器、计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些是本领域技术人员熟悉的。适用于实践本发明的商业上可获得的设备中的一些特定的实例是ULRTAVENT喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，Mo.)、ACORN II喷雾器(Marquest Medical Products，Englewood，Colo.)、VENTOLIN计量剂量吸入器(Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.)、SPINHALER粉末吸入器(Fisons Corp.，Bedford，Mass.)。所有这些设备需要使用适于分散治疗剂的剂型。通常，每种剂型对所使用的设备是特异性的，并且可包括使用除了常用的稀释剂、佐剂、表面活性剂、载体和/或其他在治疗方面有用的药剂之外的合适的推进剂材料。而且，脂质体、微囊或微球、包合物或其他类型的载体的使用是期望的。
因此，在一些实施方式中，含有本发明的纳米乳剂的组合物可用于通过下列施用含有纳米乳剂的组合物的方法来预防和/或治疗易受疾病影响或患有疾病的受治者，所述施用含有纳米乳剂的组合物的方法为通过粘膜、肌肉内、腹膜内、皮肤内、经皮、肺部、静脉内、皮下或本文所述的其他给药途径来施用。纳米乳剂的全身给药方法和/或纳米乳剂与药剂联合给药的方法可包括常规的注射器和针头或为导入递送设计的设备(参见，例如，WO 99/27961，通过引用并入本文)或无针压力液体喷射设备(参见，例如，美国专利第4,596,556号；美国专利第5,993,412号，这两个美国专利中的每一个通过引用并入本文)或透皮贴剂(参见，例如，WO 97/48440；WO 98/28037，这两个专利中的每一个通过引用并入本文)。在一些实施方式中，本发明提供用于全身给药、用本发明的纳米乳剂预填充的递送设备。
如上所述，本发明不受本发明的组合物所施用的受治者的类型的限制。事实上，认为各种各样的受治者受益于本发明的组合物的施用。在优选的实施方式中，所述受治者是人类。在一些实施方式中，人类受治者是任何年龄(例如，成人、儿童、婴儿，等等)，他们已暴露于微生物或可能暴露于微生物。在一些实施方式中，所述人类受治者是更加可能受到直接暴露于致病性微生物的受治者或是在暴露于病原体之后更加可能表现出疾病的征兆或症状的受治者(例如，患有CF或哮喘的受治者，部队中的受治者、政府职员、频繁的旅行者、在学校或日托所工作或参与的人、卫生保健工作者、老年人、免疫受损的人和紧急服务的工作人员(例如，警察、消防员，EMT工作人员))。在一些实施方式中，可将本发明的组合物施用于普通公众的全部成员或任何一个成员(例如，预防疾病的发生或传播)。例如，在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用于治疗一组人群(例如，区域、城市、州和/或国家的人群)他们自身的健康(例如，预防或治疗疾病)和/或预防或降低疾病从动物(例如，鸟类、牛、羊、猪，等等)向人类传播的风险。在一些实施方式中，所述受治者是非人类哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、马、绵羊或其他家畜；或小鼠、大鼠、兔子或其他动物)。在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用于研究环境中(例如，具有研究动物)。
含有本发明的纳米乳剂的组合物作为治疗剂或预防微生物感染的预防剂可被施用(例如，施用于受治者(例如，通过肺部和/或粘膜途径)于微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌(例如，位于受治者的呼吸系统上或内和/或位于烧伤创面上或内))))。因此，在一些实施方式中，本发明提供了改变微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌))生长的方法，所述方法包括将含有纳米乳剂的组合物施用于微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌))。在一些实施方式中，将含有纳米乳剂的组合物施用于微生物(例如，细菌(例如伺机性和/或病原性细菌))来杀死微生物。在一些实施方式中，将含有纳米乳剂的组合物施用于微生物(例如，细菌(例如伺机性和/或病原性细菌))来抑制微生物的生长。期望的是含有纳米乳剂的组合物可通过多种递送途径和/或机制施用于微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌(例如，位于呼吸道内)))。
此外，本发明的组合物可包含在药物组合物中常见的其他辅助组分。因此，例如，所述组合物可包含额外的、相容的、药学上的活性物质，例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂或可包含在物理上配制本发明的组合物的各种剂型方面有用的额外的物质，例如，染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加这些物质时，优选地这些物质不过度地干扰本发明的组合物的组分的生物活性。所述剂型可以是无菌的并且如果需要的话，可与辅剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质，等等)相混合，所述辅剂不与所述纳米乳剂有害地相互作用。在一些实施方式中，本发明的纳米乳剂组合物以药学上可接受的盐的形式来施用。当所使用的盐应当为药学上可接受的时，非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐。这些盐包括但不限于从下列酸制备的得到的那些盐，所述酸为：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、p-对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。这些盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如，羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
合适的缓冲剂包括但不限于：醋酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)和磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂可包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物与一种或一种以上抗生素联合给药。例如，一种或一种以上抗生素可在含有纳米乳剂的组合物的给药之前和/或之后施用。本发明不受联合给药的抗生素的类型的限制。事实上，多种抗生素可联合给药，包括但不限于：β-内酰胺抗生素、青霉素(例如，天然青霉素、氨基青霉素、耐青霉素酶青霉素、羧基青霉素、脲基青霉素)头孢菌素(第一代、第二代和第三代头孢菌素)以及其他β-内酰胺(例如，亚胺培南、单菌霉素)、β-内酰胺酶抑制剂、万古霉素、氨基糖苷和壮观霉素、四环素、氯霉素、红霉素、林可霉素、氯林可霉素、利福平、甲硝哒唑、多粘菌素、强力霉素、喹诺酮(例如，环丙沙星)、磺胺、甲氧苄氨嘧啶和喹啉。
目前，各种各样的抗菌剂适用于治疗细菌、真菌和病毒感染。关于在这些药物的常见种类及其作用机制方面的全面论述，本领域技术人员参考Goodman & Gilman′s″The Pharmacological Basis of Therapeutics″Eds.Hardman等人，9th Edition，Pub.McGraw Hill，chapters 43 through 50，1996(通过引用并入本文)。一般而言，这些药剂包括抑制细胞壁合成的药剂(例如，青霉素、头孢菌素、环丝氨酸、万古霉素、崔西杆菌素)；和咪唑抗真菌剂(例如，咪康唑、甲酮康唑和克霉唑)；直接起破坏微生物的细胞膜作用的药剂(例如，诸如多粘菌素之类的洗涤剂和粘菌素M和抗真菌剂制霉菌素以及两性霉素B)；影响核糖体的亚单元以抑制蛋白质合成的药剂(例如，氯霉素、四环素、红霉素和氯林可霉素)；改变蛋白质合成并导致细胞死亡的药剂(例如，氨基糖苷)；影响核酸代谢的药剂(例如，利福霉素和喹诺酮)；和抗代谢药剂(例如，甲氧苄氨嘧啶和磺胺)；诸如叠氮胸腺、更昔洛韦、阿糖腺苷、和阿昔洛韦之类的核酸类似物，其起到抑制DNA合成必需的病毒酶的作用。可使用抗菌剂的各种组合。
本发明还包括涉及含纳米乳剂的组合物与一种或一种以上其他活性剂和/或抗感染剂联合给药的方法。在联合给药步骤中，所述药剂可同时或顺序施用。在一种实施方式中，本文所述的组合物可在其他活性剂之前施用。药物剂型和给药模式可以是本文所述的那些药物剂型和给药模式中的任何一种。此外，两种或两种以上联合给药的药剂各自可使用不同的模式(例如，途径)或不同的剂型。待联合给药的其他药剂(例如，抗生素、第二类型的纳米乳剂，等等)可以是本领域熟知的药剂，包括但不限于目前临床使用的那些药剂。
在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物可通过一种以上的途径施用于受治者。例如，受治者可受益于接受粘膜给药(例如，鼻腔给药或其他本文所述的粘膜途径)，此外，受治者可受益于接受一种或一种以上其他给药途径(例如，肺部给药(例如，通过喷雾器、吸入器或其本文所述的方法))。
其他递送体系可包括随时间逐步释放(time-release)、延迟释放或持续释放递送体系。这些体系可避免组合物的重复给药、增加受治者和医师的方便性。可获得许多类型的释放递送体系并且对本领域普通技术人员而言是已知的。它们包括基于聚合物的体系，例如，聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的上述聚合物的微胶囊在例如美国专利第5,075,109号中描述，其通过引用并入本文。递送体系还包括非聚合物体系：包括诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸之类的固醇和诸如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯之类的中性脂肪在内的脂质；水凝胶释放体系；sylastic体系；基于肽的体系；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合的植入物，等等。具体的实例包括但不限于：(a)侵蚀体系，其中本发明的药剂包括在基质内的形状中，例如美国专利第4,452,775号，第4,675,189号，和第5,736,152号中所描述的，这些美国专利中的每一个通过引用并入本文，以及(b)扩散体系，其中活性组分以控制的速度从聚合物渗透出来，例如美国专利第3,854,480号，第5,133,974号和第5,407,686号所描述的，这些美国专利中的每一个通过引用并入本文。此外，基于泵的硬件递送体系可被使用，其中一些适于移植。
在优选的实施方式中，含有本发明的纳米乳剂的组合物包含合适量的纳米乳剂，当施用于受治者时以在受治者体内杀死微生物和/或减缓微生物(例如，病原性微生物(例如，病原性细菌、病毒，等等))的生长。本发明不受所使用的纳米乳剂的量的限制。在一些优选的实施方式中，含有纳米乳剂的组合物中的纳米乳剂的量被选择为根据杀死微生物和/或减缓微生物生长而不产生显著的有害副作用的量。所述量会基于所使用的特定纳米乳剂而不同并且基于下列因素可随受治者而变化，所述因素包括但不限于：受治者的种类、受治者的年龄和受治者的一般情况(例如，健康)以及给药模式。用于测定施用于受治者以杀死微生物和/或减缓微生物的生长(例如，病原性微生物(例如，病原性细菌、病毒，等等))的纳米乳剂的合适的量的步骤可使用本领域普通技术人员已知的方法容易地确定。
在一些实施方式中，期望的是每个剂量(例如，含有纳米乳剂的组合物的剂量(例如，施用于受治者以杀死微生物和/或减缓微生物生长))包括10％至40％的纳米乳剂，在一些实施方式中，包括20％的纳米乳剂，在一些实施方式中，小于20％(例如，15％，10％，8％，5％或更少的纳米乳剂)以及在一些实施方式中，大于20％的纳米乳剂(例如，25％，30％，35％，40％或更多的纳米乳剂)。用于具体给药(例如，杀死微生物和/或减缓微生物的生长)的最优的量可使用涉及观察微生物生长和/或死亡以及受治者体内的其他反应的标准研究由本领域技术人员来确定。
在一些实施方式中，期望的是每个剂量(含有纳米乳剂的组合物的剂量(例如，施用于受治者以杀死微生物和/或减缓微生物的生长))为按纳米乳剂重量计0.001％至40％或更多(例如，0.001％至10％，0.5％至5％，1％至3％，2％，6％，10％，15％，20％，30％，40％或更多)。
类似地，本发明不受纳米乳剂施用于受治者(例如，杀死微生物和/或减缓微生物的生长)的持续时间段的限制。在一些实施方式中，每天施用纳米乳剂一次或一次以上(例如，两次、三次、四次或更多次)。在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物每天施用一次或一次以上直至感染被根除或微生物的生长和/或存在已降低至期望的水平。在一些实施方式中，含有本发明的纳米乳剂的组合物被配制成浓缩剂型，所述浓缩剂型在施用于受治者之前可稀释。例如，可将浓缩的组合物的稀释液施用于受治者，从而使受治者接受本文提供的特定剂量中的任何一种或一种以上。在一些实施方式中，可制备浓缩的组合物的稀释液，从而将含有存在于浓缩组合物中的0.5％至50％的纳米乳剂的组合物施用于(例如，以单剂量)受治者。认为浓缩组合物在环境(setting)中有用，在所述环境中可将本发明的组合物施用于大量受治者(例如，医院)。在一些实施方式中，含有本发明的纳米乳剂的组合物(例如，浓缩组合物)在室温下稳定持续大于一周，在一些实施方式中持续大于两周，在一些实施方式中持续大于3周，在一些实施方式中持续大于4周，在一些实施方式中持续大于5周，在一些实施方式中持续大于6周。
剂量单元随各种因素成比例地增加或减少，所述因素包括但不限于：受治者的体重、年龄、健康状况。此外，剂量单元可在随后的给药中增加或减少。
在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物在杀死微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌))的条件下施用于受治者。在一些实施方式中，含有纳米乳剂的组合物在阻止和/或减缓微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌))生长的条件下施用于受治者。在一些实施方式中，大于90％(例如，大于95％，98％，99％，所有可检测的)的微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌))被杀死。在一些实施方式中，存在的微生物(例如，细菌(例如，伺机性和/或病原性细菌))的减少大于2log(例如，大于3log，4log，5log或更多)。在一些实施方式中，在1小时或更短(例如，45分钟，30分钟，15分钟，或更短)时间内观察到减少和/或杀死。在一些实施方式中，在6小时或更短(例如，5小时，4小时，3小时，2小时或小于1小时)时间内观察到减少和/或杀死。在一些实施方式中，在开始治疗后2天或更短(例如，小于24小时，小于20小时，小于18小时或更小)时间内观察到减少和/或杀死。在一些实施方式中，在3天或更短时间，4天或更短时间，5天或更短时间内观察到减少和/或杀死。
使用含有本发明的纳米乳剂的组合物，其中已知感染性质和/或致病剂(例如，引起呼吸道感染的征兆、症状或指示)以及其中未知感染性质和/或致病剂(例如，新出现的疾病(例如，全国大比例流行的疾病(例如，流感或其他爆发的疾病)))。例如，本发明预见了本发明的组合物在治疗或预防与急性感染和/或仍待识别的致病剂(例如，从患病的人中分离和/或培养的，但没有感染和/或致病剂的遗传、生物化学或其他特征)有关的感染。
认为本发明的组合物和方法会用于各种环境，包括研究环境。例如，本发明的组合物和方法也用于免疫系统的研究中(例如，表征适应性免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，粘膜或全身免疫性)))。本发明提供的组合物和方法的应用包括人类和非人类受治者和来自那些受治者的样本，还包括使用这些受治者的研究应用。本发明的组合物和方法在研究和优化纳米乳剂、免疫原和其他组分方面也有用并且用于筛选新组分。因此，无意将本发明限定于任何特定的受治者和/或应用环境。
剂型可在为研究肺部、粘膜和其他递送途径所研制的许多动物模型中体内测试。显而易见的是，本发明的组合物用于预防和/或治疗由病毒、细菌、寄生虫和真菌引起的各种疾病和感染。如上所述，所述组合物不仅可用于预防和治疗，所述组合物还可用于制备抗体(多克隆和单克隆，用于诊断目的)以及用于感兴趣的抗原的免疫纯化。
在一些实施方式中，本发明提供包含了含有纳米乳剂的组合物的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒还提供用于施用所述组合物的设备。本发明不受所述试剂盒中所包括的设备的类型的限制。在一些实施方式中，所述设备被配置为用于本发明的组合物的肺部给药(例如，鼻腔吸入器或鼻腔喷雾剂)。在一些实施方式中，试剂盒包括浓缩形式(例如，可在施用于受治者之前稀释)的含有纳米乳剂的组合物。
在一些实施方式中，所有试剂盒组分可存在于单个容器(例如，小瓶或管)中。在一些实施方式中，每个试剂盒组分可位于单个容器(例如，小瓶或管)中。在一些实施方式中，一种或一种以上试剂盒组分和相同的试剂盒的其他组分一同位于单个容器(例如，小瓶或管)中，所述相同的试剂盒的其他组分位于分开的容器(例如，小瓶或管)中。在一些实施方式中，试剂盒包括缓冲剂。在一些实施方式中，试剂盒包括使用说明。
免疫原性组合物的治疗和预防应用
本发明提供免疫原性纳米乳剂组合物和使用该组合物诱导免疫反应(例如，固有和/或适应性免疫反应(例如，用于产生针对伯克霍尔德杆菌属的细菌种类(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌，B.multivorans，等等)的宿主免疫性))的方法。此外，发现本发明的组合物和方法用于临床(例如，治疗和预防药物(例如，疫苗))和研究应用。
如实施例10所示，本发明的免疫原性组合物(例如，含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原)诱导(例如，当施用于受治者时)全身和粘膜免疫性。因此，在一些优选的实施方式中，将含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌抗原的组合物施用于受治者导致防止暴露于(例如，粘膜和/或呼吸暴露)伯克霍尔德杆菌。虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是粘膜给药(例如，接种疫苗)提供了防止伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)感染(例如，在粘膜表面开始)。虽然，迄今为止已证实了难以刺激分泌IgA反应和防止病原体在粘膜表面侵入(参见，例如，Mestecky et al，Mucosal Immunology.3ed edn.(Academic Press，San Diego，2005))，在一些实施方式中，本发明提供用于在受治者体内刺激对病原体(例如，伯克霍尔德杆菌的病原体种类、嗜血杆菌的病原体种类、葡萄球菌的病原体种类或其他细菌属的病原体种类)的粘膜免疫性(例如，保护性IgA响应)的组合物和方法。
在一些实施方式中，本发明提供含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌(例如，新洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原(例如，含有氨基酸序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NOS 2-16的免疫原性多肽)的组合物以用作粘膜疫苗。在一些实施方式中，用NE和杀死的伯克霍尔德杆菌属(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌(例如，使用纳米乳剂、醇类(例如，乙醇)或其他方法杀死的))的完全细胞细菌、伯克霍尔德杆菌的分离的、纯化的和/或重组的蛋白和/或糖化物组分(例如，蛋白质/肽(例如，伯克霍尔德杆菌衍生的蛋白质，活病毒载体衍生的蛋白质，重组蛋白，重组变性蛋白/抗原，小的肽碎片蛋白/抗原))来生成含有纳米乳剂(NE)和伯克霍尔德杆菌抗原的免疫原性组合物。
在一些优选的实施方式中，本发明提供用于产生免疫反应的组合物，所述组合物包括NE和免疫原(例如，纯化的、分离的或合成的伯克霍尔德杆菌蛋白或衍生物、变体或其类似物；或伯克霍尔德杆菌种类中的一种或一种以上(例如，B.multivorans(例如，杀死的和/或灭活的全细胞细菌)))。当施用于受治者时，本发明的组合物刺激针对受治者中的免疫原的免疫反应。虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，免疫反应的产生(例如，由施用含纳米乳剂的组合物和免疫原所引起)向受治者提供全部或部分免疫性(例如，与伯克霍尔德杆菌感染(例如，链球菌感染咽喉炎、髓膜炎、细菌性肺炎、心内膜炎、丹毒和/或坏死性筋膜炎)有关的疾病的征兆、症状或病症)。不受任何具体理论的限制，在暴露于本发明的免疫原性组合物之后对疾病的防御和/或免疫性(例如，受治者的免疫系统的能够预防或缓解(例如，抑制)疾病的征兆、症状或病症)是由适应性(例如，获得性)免疫反应(例如，在暴露于含本发明的免疫原的NE之后由B细胞和T细胞介导的免疫反应(例如免疫反应表现出针对伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)的提高的特异性和反应性))引起。因此，在一些实施方式中，本发明的组合物和方法以预防和治疗的方式用于预防或缓解与伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)有关的征兆、症状或病症。
在一些实施方式中，含有免疫原(例如，伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原)的NE单独施用。在一些实施方式中，含有NE和免疫原(例如，伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)抗原)的组合物包括一种或一种以上其他药剂(例如，药学上可接受的载体，佐剂，赋形剂，等等)。在一些实施方式中，用于刺激本发明的免疫反应的组合物以诱导体液免疫反应的方式来施用。在一些实施方式中，用于刺激本发明的免疫反应的组合物以诱导细胞(例如，细胞毒素T淋巴细胞)免疫反应而非体液反应的方式来施用。在一些实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物诱导细胞和液体免疫反应两者。
本发明不受在含有NE和免疫原的组合物中使用的伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)的同型、菌株或种类的限制。事实上，每个伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)家族成员单独或与另一家族成员结合可用于产生含有本发明的NE和免疫原(例如，用于产生免疫反应)的组合物。本文描述了伯克霍尔德杆菌的示范性的种类。
在一些实施方式中，使用的伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)种类是改性(例如，转基因的(例如，通过天然选择改性或使用重组基因技术改性))的种类，其显示出更大的致病能力(例如，导致更严重的伯克霍尔德杆菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)诱导的疾病(例如，包括加强的和/或更严重的呼吸道感染，等等))。在一些实施方式中，在本发明的免疫反应性组合物中使用的伯克霍尔德杆菌属中的任何一种或一种以上成员包括但不限于：新洋葱伯克霍尔德杆菌、B.dolosa、B.multivorans、B.ambifaria、越南伯克霍尔德杆菌、B.ubonensis、B.thailandensis、B.graminis、B.oklahomensis、类鼻疽伯克霍尔德杆菌、B.xenovorans、B.phytofirmans、B.phymatum、R.metallidurans、富氧罗尔斯通氏菌、茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)。
本发明不受所使用的伯克霍尔德杆菌菌株的限制。事实上，认为各种伯克霍尔德杆菌菌株在本发明中有用，包括但不限于：经典菌株、弱菌株、非复制菌株、改性菌株(例如，转基因菌株或机械改性菌株(例如，变得毒性更强或更弱))，或其他连续稀释的伯克霍尔德杆菌菌株。含有NE和免疫原的组合物可包括新洋葱伯克霍尔德杆菌和/或其他类型的伯克霍尔德杆菌(例如，B.multivorans)中的一种或一种以上菌株。此外，含有NE和免疫原的组合物可包括除了伯克霍尔德杆菌中的一种或一种以上菌株之外的非伯克霍尔德杆菌免疫原中的一种或一种以上菌株。
在一些实施方式中，所述免疫原可包含一种或一种以上源自病原体(例如，伯克霍尔德杆菌)的抗原。例如，在一些实施方式中，所述免疫原是纯化的、重组的、合成的或其他分离的蛋白质(例如，加至NE中以产生免疫原性组合物)。类似地，所述免疫原性蛋白可以是来自病原体的蛋白质的衍生物、类似物或另外的改性(例如，共轭的)形式。
本发明不受含有本发明的NE和免疫原的组合物的特定剂型的限制。事实上，含有本发明的NE和免疫原的组合物可包括除NE和免疫原之外的一种或一种以上不同的药剂。这些药剂或辅助因素包括但不限于：佐剂、表面活性剂、添加剂、缓冲剂、增溶剂、螯合剂、油类、盐类、治疗剂、药物、生物活性剂、抗菌剂和抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂，等等)。在一些实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物包括提高免疫原诱导免疫反应的能力的药剂和/或辅助因素(例如，佐剂)。在一些优选的实施方式中，一种或一种以上辅助因素或药剂的存在降低了诱导免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护性免疫))所需的免疫原的量。在一些实施方式中，一种或一种以上辅助因素或药剂的存在可用于使免疫反应倾向于细胞(例如，T细胞)或体液(例如，抗体介导的)免疫反应。本发明不受本发明的治疗剂中所使用的辅助因素或药剂的类型的限制。
一般而言，佐剂在Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach，edited by Powell and Newman，Plenum Press，New York，1995中描述。本发明不受所使用的(例如，在含有NE和免疫原的组合物中使用(例如，药物组合物))佐剂的类型的限制。例如，在一些实施方式中，合适的佐剂包括诸如氢氧化铝胶(alum)或磷酸铝之类的铝盐。在一些实施方式中，佐剂可以是钙、铁或锌的盐或可以是酰化酪氨酸或酰化糖类的不溶悬浮液，阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈。
在一些实施方式中，优选的是含有本发明的NE和免疫原的组合物包括一种或一种以上诱导Th1型反应的佐剂。然而，在其他实施方式中，优选的是，含有本发明的NE和免疫原的组合物包括一种或一种以上诱导Th2型反应的佐剂。
一般而言，抗原的免疫反应通过抗原与免疫体系的细胞相互作用来产生。免疫反应广义上可分为两类：体液和细胞介导的免疫反应(例如，通常通过抗体和细胞蛋白保护效应机制来分别表征)。反应的这些类别已被称为Th1-型反应(细胞介导的反应)和Th2-型免疫反应(体液反应)。
刺激免疫反应可由细胞或免疫体系的组分对干预的直接或间接反应而引起(例如，暴露于免疫原)。免疫反应可以多种方式来测量，包括免疫体系的细胞(例如，B细胞、T细胞、树突细胞、APC、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞，等等)的活化、增殖或分化；上调或下调标记物或细胞因子的表达；刺激IgA、IgM或IgG滴定度；脾肿大(包括脾细胞结构增大)；各种器官中的增生和混合的细胞浸润。根据免疫刺激可评估的免疫体系的其他反应、细胞和组分是本领域已知的。
虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，本发明的组合物和方法诱导细胞因子的表达和分泌(例如，通过巨噬细胞、树突细胞和CD4+T细胞)。特定细胞因子的表达的调节可局部或全身发生。已知细胞因子分布型(cytokine profile)可决定免疫反应中T细胞调节和效应子功能。在一些实施方式中，可诱导Th1-型细胞因子并且因此，本发明的免疫刺激组合物可刺激包括细胞毒素T-细胞在内的Th1-型抗原特异性免疫反应(例如，从而避免不想要的Th2-型免疫反应(例如，产生加强疾病的严重性所涉及的Th2型细胞因子(例如IL-3)(例如，IL-13诱导粘膜形成)))。
细胞因子在指导T细胞反应中发挥作用。辅助(CD4+)T细胞通过作用于其他免疫体系细胞的可溶因子的产量来协调哺乳动物的免疫反应，所述其他免疫体系细胞包括B细胞和T细胞。大多数成熟的CD4+T辅助细胞表达两种细胞因子分布型中的一种：Th1或Th2。Th1-型CD4+T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF和高水平的TNF-α。Th2细胞表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平的TNF-α。Th1型细胞因子促进细胞介导的免疫性和体液免疫性，所述体液免疫性通过免疫球蛋白的类型在小鼠中转换为IgG2a和在人类中转换为IgG1来表征。Th1反应也可与迟发型的过敏症和自身免疫疾病有关。Th2型细胞因子主要诱导体液免疫性并且诱导类型转换为IgG1和IgE。与Th1反应有关的抗体同型通常具有中和和使细菌易于被吞噬细胞吞噬的能力，然而那些与Th2反应有关的抗体同型与过敏反应更加相关。
一些因素已表现出影响免疫反应倾向于Th1型反应或Th2型反应中的任一种。最典型的调节子是细胞因子。IL-12和IFN-γ是阳性Th1调节子和阴性Th2调节子。IL-12提高IFN-γ产量，并且IFN-γ为IL-12提供阳性反馈。IL-4和IL-10看起来对Th2细胞因子分布型的建立是重要的并且对下调Th1细胞因子产量是重要的。
因此，在优选的实施方式中，本发明提供刺激受治者中的Th1-型免疫反应的方法，所述方法包括将含有NE和免疫原的组合物施用于受治者。然而，在其他实施方式中，本发明提供刺激受治者中Th2-型免疫反应的方法(例如，如果期望平衡T细胞介导的反应)，所述方法包括将含有NE和免疫原的组合物施用于受治者。在进一步优选的实施方式中，可使用佐剂(例如，可与本发明的组合物联合施用)来使免疫反应倾向于Th1型或Th2型免疫反应中的任一种。例如，诱导Th2或弱化Th1反应的佐剂包括但不限于：氢氧化铝胶、皂素和SB-As4。诱导Th1反应的佐剂包括但不限于：MPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-γ和SB-AS2。
几种其他类型的Th1型免疫原可用于(例如，作为佐剂)本发明的组合物和方法。这些包括但不限于下列。在一些实施方式中，使用单磷酰基脂质A(例如，具体而言，3-de-O-酰化的单磷酰基脂质A(3D-MPL))。3D-MPL是熟知的佐剂，由Ribi Immunochem，Montana来制造。化学上，通常以3-de-O-酰化的单磷酰基脂质A和4酰化链、5酰化链或6酰化链中的任一种的混合物来提供。在一些实施方式中，使用双磷酰基脂质A及其3-O-脱酰化变体。这些免疫原中的每一个可通过GB2122204B中所描述的方法来制备和纯化，其通过引用并入本文。已描述了其他纯化的和合成的脂多糖(参见，例如，美国专利第6,005,099号和EP0729473；Hilgers等人，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)：392-6；Hilgers等人，1987，Immunology，60(1)：141-6；和EP 0 549 074；它们中的每一个通过引用并入本文)。在一些实施方式中，3D-MPL用于特定剂型的形式(例如，直径的最小粒径小于0.2μm，在EP0689454中描述，其通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，皂素用作本发明的组合物中的免疫原(例如，Th1-型佐剂)。皂素是熟知的佐剂(参见，例如，Lacaille-Dubois and Wagner(1996)Phytomedicine vol 2 pp 363-386)。皂素的实例包括Quil A(源自南美皂皮树的树皮)及其片段(参见，例如，美国专利第5,057,540号，Kensil，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；和EP 0 362 279，它们中的每一个通过引用并入本文)。还认为溶血性皂素QS7、QS17和QS21(Quil A的HPLC纯化的部分；参见，例如，Kensil等人(1991).J.Immunology 146,431-437，美国专利第5,057,540号；WO 96/33739；WO 96/11711和EP 0 362 279，它们中的每一个通过引用并入本文)在本发明中有用。还认为QS21和聚山梨酸或环糊精有用(参见，例如，WO99/10008，其通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫原性寡核苷酸在本发明中用作佐剂。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸生物序列的缩写。本领域已知当通过全身途径和粘膜途径给药时，CpG作为佐剂(参见，例如，WO 96/02555，EP 468520，Davis等人，J.Immunol，1998，160(2)：870-876；McCluskie and Davis，J.Immunol.，1998，161(9)：4463-6；美国专利申请第20050238660号，它们中的每一个通过引用并入本文)。例如，在一些实施方式中，免疫刺激性序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶；其中，CG生物序列未被甲基化。
虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，一种或一种以上CpG寡核苷酸的存在活化包括天然杀伤细胞(其产生IFN-γ)和巨噬细胞在内的各种免疫子集。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸被配制为本发明的组合物用于诱导免疫反应。在一些实施方式中，CpG的自由溶液与抗原一同联合施用(例如，存在于NE溶液中(参见，例如，WO96/02555；其通过引用并入本文))。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸共价共轭至抗原(参见，例如，WO98/16247，其通过引用并入本文)或用诸如氢氧化铝之类的载体来配制(参见，例如，Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.AcadSci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。
在一些实施方式中，诸如完全弗氏(Complete Freunds)佐剂和不完全弗氏(Incomplete Freunds)佐剂之类的佐剂、细胞因子(例如，白介素(例如，IL-2、IFN-γ、IL-4，等等)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子，等等)、诸如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，尤其是LT-K63(其中在63位赖氨酸被野生型氨基酸取代)、LT-R72(其中在72位精氨酸被野生型氨基酸取代)、CT-S109(其中在109位丝氨酸被野生型氨基酸取代)和PT-K9/G129(其中在9位赖氨酸被野生型氨基酸取代并且在129位甘氨酸被取代)之类的细菌ADP-核糖化毒素的去毒素突变体(参见，例如，WO93/13202和WO92/19265，它们中的每一个通过引用并入本文)和其他免疫原性物质(例如，提高本发明的组合物的有效性的物质)与含有本发明的NE和免疫原的组合物一同使用。
在本发明中使用的佐剂的其他实例包括聚(二(羧基苯氧基)磷腈)(PCPP聚合物；病毒研究所，USA)；诸如单磷酰基脂质A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)、胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)之类的脂多糖的衍生物；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，Switzerland)以及利士曼原虫延伸因子(纯化的利士曼原虫蛋白；Corixa Corporation，Seattle，Wash.)。
佐剂可加至含有NE和免疫原的组合物中或者佐剂可在与含有NE和免疫原的组合物结合或联合给药之前用载体来配制，所述载体例如脂质体或金属盐(例如，铝盐(例如，氢氧化铝))。
在一些实施方式中，含有NE和免疫原的组合物包括单一的佐剂。在其他实施方式中，含有NE和免疫原的组合物包含两种或两种以上佐剂(参见，例如，WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241和WO 94/00153，它们中的每一个通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物包含一种或一种以上粘膜粘附剂(参见，例如，美国专利申请第20050281843号，其通过引用并入本文)。本发明不受所使用的粘膜粘附剂的类型的限制。事实上，认为多种粘膜粘附剂在本发明中有用，包括但不限于：聚丙烯酸的交联衍生物(例如，聚羧乙烯和聚卡波非)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(例如，藻酸盐和壳聚糖)、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛蛋白和羧甲基纤维素。虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，与未使用粘膜粘附剂的情况下暴露于免疫原的持续时间段和/或量进行比较，当使用粘膜粘附剂时，由于受治者经历的暴露于免疫原的持续时间段和/或量增加，粘膜粘附剂的使用(例如，在含有NE和免疫原的组合物中)促进了诱导受治者的免疫反应(例如，施用了本发明的组合物)。
在一些实施方式中，本发明的组合物可包含无菌水性制剂。可接受的载体和溶剂包括但不限于：水、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油类通常用作溶剂或分散介质。就该目的而言，可使用任何温和的不挥发性矿物油或非矿物油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸之类的脂肪酸在可注射制剂中使用。适于粘膜、皮下、肌肉内、腹腔内、静脉给药或通过其他途径给药的载体剂型可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa中发现。
含有本发明的NE和免疫原的组合物可在治疗上使用(例如，提高免疫反应)或用作预防(例如，用于免疫(例如，预防疾病的征兆或症状))。含有本发明的NE和免疫原的组合物可通过多种不同的递送途径和方法施用于受治者。
例如，本发明的免疫原性组合物可通过多种方法施用于受治者(例如，通过粘膜(例如，鼻腔粘膜、阴道粘膜，等等))，所述多种方法包括但不限于：悬浮于溶液中并施用于表面；悬浮于溶液中并使用喷雾器喷至表面；与粘膜粘附剂混合并施用于(例如，喷或擦拭)表面(例如，粘膜表面)；置于或浸透粘膜和/或阴道涂药器并施用；通过控制释放机制来施用；作为脂质体来施用；或施用在聚合物上。
在一些优选的实施方式中，本文所述的免疫原性组合物通过粘膜施用(例如，使用标准技术；参见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，19th edition，1995(例如，粘膜递送技术，包括鼻腔内、肺部、阴道和直肠递送技术)以及EP517565和Illum等人，J.Controlled Rel.，1994，29：133-141(例如，鼻腔内给药技术)，它们中的每一个通过引用并入本文)。可选地，本文所述的免疫原性组合物使用标准技术通过皮肤给药或透皮给药(参见，例如，Remington：The Science arid Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，19th edition，1995)。本发明不受给药途径的限制。
诸如鼻腔内接种疫苗之类的粘膜接种疫苗可不仅诱导鼻腔粘膜内的粘膜免疫性而且诱导诸如生殖器粘膜之类的远离粘膜的位置的粘膜免疫性(参见，例如，Mestecky，Journal of Clinical Immunology，7：265-276，1987)。除了诱导粘膜免疫反应之外，粘膜接种疫苗也诱导全身免疫性(参见，例如，实施例10)。在一些实施方式中，非肠胃外给药(例如，疫苗的粘膜给药)提供有效且方便的方式以加强全身免疫性(例如，由肠胃外或粘膜接种疫苗诱导的(例如，在多种加强方式用于维持旺盛的全身免疫性的情况下))。
在一些实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物以通过粘膜途径施用本发明的组合物的方式(例如，口服/消化道或鼻部途径)可用于保护或治疗易患疾病的受治者或患有疾病的受治者。可选的粘膜途径包括阴道内和直肠内途径。在本发明优选的实施方式中，使用鼻部途径给药，本文称为“鼻内给药”或“鼻内接种疫苗”。鼻内接种疫苗的方法是本领域熟知的，包括将疫苗的液滴或喷雾形式施用于待免疫的受治者的鼻咽内。在一些实施方式中，提供雾状的或气雾化的含有NE和免疫原的组合物。诸如用于口服给药的耐胃酸胶囊之类的肠溶剂型、用于直肠或阴道给药的栓剂也是本发明的部分形式。本发明的免疫原性组合物也可通过口服途径给药。在这些情况下，含有NE和免疫原的组合物可包含药学上可接受的赋形剂和/或包括碱性缓冲液或肠溶胶囊。鼻部递送剂型可包括具有葡聚糖或环糊精和皂素作为佐剂的那些剂型。
本文所述的免疫原性组合物也可通过阴道途径来施用。在这种情况下，含有NE和免疫原的组合物可包含药学上可接受的赋形剂和/或乳化剂，聚合物(例如，聚羧乙烯(CARBOPOL))和其他已知的阴道霜剂和栓剂的稳定剂。在一些实施方式中，本发明的组合物通过直肠途径来施用。在这种情况下，含有NE和免疫原的组合物可包含赋形剂和/或蜡和本领域已知的用于形成直肠栓剂的聚合物。
在一些实施方式中，初始接种疫苗和加强接种疫苗选择相同的给药途径(例如，粘膜给药)。在一些实施方式中，使用多种给药途径(例如，同时或可选地，顺序地)以刺激免疫反应(例如，使用本文所述的免疫原性组合物)。
例如，在一些实施方式中，将含有NE和免疫原的组合物在初始接种疫苗或加强接种疫苗方案中施用于受治者的粘膜表面。可选地，在一些实施方式中，在初始接种疫苗或加强接种疫苗方案中全身施用含有NE和免疫原的组合物。在一些实施方式中，在通过粘膜给药的初始接种疫苗方案中和通过全身给药加强接种疫苗方案中将含有NE和免疫原的组合物施用于受治者。在一些实施方式中，在通过全身给药的初始接种疫苗方案中和通过粘膜给药加强接种疫苗方案中将含有NE和免疫原的组合物施用于受治者。全身给药途径的实例包括但不限于：肠胃外、肌肉内、皮内、透皮、皮下、腹膜内或静脉给药。含有NE和免疫原的组合物可用于预防和治疗目的。
在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物通过肺部递送来施用。例如，本文所述的免疫原性组合物可通过吸入递送至受治者(例如，人类)的肺部(例如，从而横跨肺上皮细胞系至血流(参见，例如，Adjei，等人Pharmaceutical Research 1990；7：565-569；Adjei，等人Int.J.Pharmaceutics 1990；63：135-144；Braquet，等人J.Cardiovascular Pharmacology 1989 143-146；Hubbard，等人(1989)Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212；Smith，等人J.Clin.Invest.1989；84：1145-1146；Oswein，等人″Aerosolization of Proteins″，1990；Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado；Debs，等人J.Immunol.1988；140：3482-3488；和Platz，et al的美国专利第5,284,656号，上述文献中的每一个通过引用并入本文。用于全身起效的药物的肺部递送的方法和组合物在Wong等人的美国专利第5,451,569号中描述，其通过引用并入本文；还参见Licalsi等人的美国专利第6,651,655号，其通过引用并入本文))。进一步认为在本文所述的免疫原性组合物的递送实践中使用了各种为本文所述的药剂的肺部和/或鼻粘膜递送设计的机械设备。
因此，在一些实施方式中，根据含有NE和免疫原的组合物的施用方法，在诱导受治者体内的免疫原特异性免疫反应的条件下，本文所述的免疫原性组合物可用于保护和/或治疗易患疾病的受治者或患有疾病的受治者，所述施用方法为通过粘膜、肌肉内、腹腔内、皮内、透皮、肺部、静脉、皮下途径或本文所述的其他给药途径。疫苗制剂的全身给药方法可包括常规注射器和针或为固体疫苗的导入递送设计的设备(参见，例如，WO99/27961，其通过引用并入本文)或无针压力液体喷射设备(参见，例如，美国专利第4,596,556号，美国专利第5,993,412号，它们中的每一个通过引用并入本文)或透皮贴剂(参见，例如，WO 97/48440；WO 98/28037，它们中的每一个通过引用并入本文)。本发明也可用于提高应用于皮肤的抗原的免疫原性(透皮或经皮递送，参见，例如，WO 98/20734；WO 98/28037，它们中的每一个通过引用并入本文)。因此，在一些实施方式中，本发明提供用于全身给药的递送设备，其预填充了本发明的疫苗组合物。
本发明不受施用(例如，为了刺激免疫反应(例如为了产生保护性免疫性(例如，粘膜免疫性和/或全身免疫性)))了本发明的组合物的受治者的类型的限制。事实上，认为各种各样的受治者受益于施用了本发明的组合物。在优选的实施方式中，所述受治者是人类。在一些实施方式中，人类受治者是任何年龄(例如，成年人、儿童、婴儿，等等)，其已经或可能即将暴露于微生物(例如，伯克霍尔德杆菌属的细菌)。在一些实施方式中，所述任何受治者是更加可能患上伺机性感染的受治者(例如，患有CF的受治者或免疫抑制的受治者(例如，具有人类免疫缺陷病毒的受治者))。在一些实施方式中，所述受治者是非人类哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、马、绵羊或其他家畜；或小鼠、大鼠、兔或其他动物)。在一些实施方式中，本发明的组合物和方法在研究环境(例如，具有研究性动物)中使用。在一些实施方式中，本发明提供通过将安全且有效量的本发明的组合物(例如，小儿科疫苗)施用于婴儿来诱发婴儿(例如，约0至2岁)体内的免疫反应(例如，保护性免疫反应)的方法。本发明的其他实施方式包括提供本发明的免疫原性伯克霍尔德杆菌纳米乳剂组合物在医药方面使用和本发明的伯克霍尔德杆菌纳米乳剂在制备用于预防(或治疗)由伯克霍尔德杆菌引起的疾病的药物中的应用。在又一实施方式中，本发明提供通过施用安全的且有效量的本发明的免疫原性组合物来诱发老年人群(例如，50岁或大于50岁的受治者，典型地大于55岁以及更加普遍地大于60岁)中的免疫反应(例如，保护性免疫反应)。
本文所述的免疫原性组合物可被配制成通过任何途径给药，所述途径例如粘膜、口部、局部、肠胃外或其他本文所述的途径。所述组合物可为一种或一种以上不同的形式，包括但不限于：片剂、胶囊、粉末、细粒、锭剂、泡沫、霜剂或液体制剂。
局部剂型可表示为例如，软膏、霜剂或洗剂、泡沫和气溶胶并且可含有合适的常规添加剂，所述添加剂例如防腐剂、溶剂(例如，辅助渗透)和软膏和霜剂中的软化剂。
局部剂型还可包括促进活性成分渗透通过皮肤的药剂。示范性的药剂包括N-(羟乙基)吡咯烷酮的二元组合物和细胞包膜无序化合物，与亚砜或氧化膦结合的糖酯以及蔗糖单油酸酯，癸基甲基亚砜和醇。
提高皮肤渗透的其他示范性物质包括表面活性剂或润湿剂，包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(聚山梨酸80)；失水山梨醇单油酸酯(司盘80(Span 80))；p-异辛基聚氧乙烯-苯酚聚合物(Triton WR-1330)；聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯(吐温85)；琥珀酸二辛酯钠和肌氨酸钠(Sarcosyl NL-97)以及其他药学上可接受表面活性剂。
在本发明的一些实施方式中，组合物还可包括一种或一种以上醇类、含锌化合物、软化剂、润湿剂、增稠剂和/或凝胶化剂、中和剂以及表面活性剂。剂型中使用的水优选为去离子水，其具有中性pH。局部剂型中的其他添加剂包括但不限于：硅树脂液体、染料、香味剂、pH调节剂和维生素。
局部剂型还可包括相容性常规载体，例如，霜剂或软膏基质和用于洗剂的乙醇或油醇。这些载体可为所述剂型的约1％至约98％。所述软膏基质可包含一种或一种以上凡士林、矿物油、纯白地蜡、羊毛脂醇、泛酰醇、甘油、没药醇、可可脂，等等。
此外，本文所述的免疫原性组合物可含有通常在药物组合物中发现的其他辅助化合物。因此，例如，所述组合物可含有额外的、相容的、药学上的活性物质，例如，止痒药(antipuritics)、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂或者所述组合物可包含在物理上配制本发明的组合物的各种剂型中有用的其他物质，例如，染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、防晒剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，这些物质优选地不过度地干扰本文所述的免疫原性组合物的生物活性。所述剂型可以是无菌的并且如果期望的话，所述剂型可与辅剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质，等等)混合，所述辅剂与所述剂型中的NE和免疫原不发生有害的相互作用。在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物以药学上可接受的盐的形式来施用。当使用的盐应当是药学上可接受的时，非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐。这些盐包括但不限于从下列酸制备的盐，所述酸为：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、p-甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。这些盐还可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如，羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
合适的缓冲剂包括但不限于：醋酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂可包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)；硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
在一些实施方式中，含有NE和免疫原的组合物可与一种或一种以上抗生素联合给药。例如，一种或一种以上抗生素可在含有NE和免疫原的组合物给药前和/或给药后施用。本发明不受联合给药的抗生素的类型的限制。事实上，多种抗生素可联合给药，包括但不限于：□-内酰胺抗生素，青霉素(例如，天然青霉素，氨基青霉素，耐青霉素酶青霉素，羧基青霉素，脲基青霉素)，头孢菌素(第一代，第二代和第三代头孢菌素)和其他□-内酰胺(例如，亚胺培南、单内酰环类)，β-内酰胺酶抑制剂，万古霉素，氨基糖苷和壮观霉素，四环素，氯霉素，红霉素，林可霉素，氯林可霉素，利福平，甲硝哒唑，多粘菌素，强力霉素，喹诺酮(例如，环丙沙星)，磺胺，甲氧苄氨嘧啶和喹啉。
目前有大量抗菌剂适用于治疗细菌、真菌和病毒感染。对于这些药物的常见种类及其作用机制方面的全面论述，本领域技术人员参考Goodman & Gilman′s″The Pharmacological Basis of Therapeutics″Eds.Hardman等人，9th Edition，Pub.McGraw Hill，chapters 43 through 50，1996(通过引用并入本文)。一般而言，这些药剂包括抑制细胞壁合成的药剂(例如，青霉素、头孢菌素、环丝氨酸、万古霉素、崔西杆菌素)和咪唑抗真菌剂(例如，咪康唑、酮康唑和克霉唑)；直接起分解微生物的细胞膜的作用的药剂(例如，诸如多粘菌素和粘菌素M之类的洗涤剂和抗真菌制霉菌素和两性霉素B)；影响核糖体子集以抑制蛋白质合成的药剂(例如，氯霉素、四环素、红霉素和氯林可霉素)；改变蛋白质合成并导致细胞死亡的药剂(例如，氨基糖苷)；影响核酸代谢的药剂(例如，利福霉素和喹诺酮)；抗代谢物(例如，甲氧苄氨嘧啶和磺胺)；以及诸如齐多夫定、苷昔洛韦、阿糖腺苷和阿昔洛韦之类的核酸类似物，其起抑制DNA合成必需的病毒酶的作用。可使用抗菌剂的各种组合。
本发明还包括涉及含有NE和免疫原的组合物与一种或一种以上其他活性剂和/或免疫刺激剂(例如，含有NE和不同的免疫原的组合物、抗生素、抗氧化剂，等等)的联合给药的方法。事实上，本发明的附加方面提供改进现有技术的免疫刺激方法(例如，免疫方法)和/或由本发明的组合物联合给药的药物组合物。在联合给药步骤中，药剂可同时施用或顺序施用。在一种实施方式中，本文所述的组合物在其他活性剂之前施用。药物剂型和给药模式可以是本文所述的任何剂型和模式。此外，两种或两种以上联合给药的药剂中的每一个可使用不同的模式(例如，途径)或不同的剂型来施用。待联合给药的其他药剂(例如，抗生素、佐剂，等等)可以是本领域熟知的药剂中的任何一种，包括但不限于：目前在临床使用的那些药剂。
在一些实施方式中，通过一种以上的途径将含有NE和免疫原的组合物施用于受治者。例如，会受益于对致病性微生物的保护性免疫反应(例如，免疫性)的受治者可受益于接受粘膜给药(例如，鼻腔给药或其他本文所述的粘膜途径)并且此外，可受益于接受一种或一种以上其他给药途径(例如，肠胃外或肺部给药(例如，通过喷雾器、吸入器或其他本文所述的方法))。在一些优选实施方式中，通过粘膜途径给药足以诱导对免疫原或产生免疫原的微生物的粘膜和全身免疫性。在其他实施方式中，通过粘膜途径给药用于提供粘膜和全身免疫性。因此，虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，认为通过多种给药途径(例如，免疫(例如，含有本发明的NE和免疫原的组合物的粘膜和气道或肠胃外给药))施用了本发明的组合物的受治者对免疫原的免疫反应比通过仅仅一种途径施用组合物的受治者对免疫原的免疫反应更强。
其他递送体系可包括时间-释放、延迟释放或持续释放递送体系。这些体系可避免组合物的重复给药，增加患者和医师的方便性。可获得许多类型的释放递送体系并且本领域普通技术人员已知那些释放递送体系。它们包括基于聚合物的体系，例如，聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的上述聚合物的微囊在例如美国专利第5,075,109号中描述，其通过引用并入本文。递送体系也包括非聚合物体系：包括诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸之类的固醇或诸如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯之类的中性脂肪在内的脂质；水凝胶释放体系；sylastic体系；基于肽的体系；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合植入物，等等。特定的实例包括但不限于：(a)侵蚀体系，其中本发明的药剂包含在基质内的形式中，例如，美国专利第4,452,775号、第4,675,189号和第5,736,152号中所述描述的那些，上述美国专利中的每一个通过引用并入本文和(b)扩散体系，其中活性成分以控制的速度从聚合物中渗透出来，例如美国专利第3,854,480号，第5,133,974号和第5,407,686号，上述美国专利中的每一个通过引用并入本文。此外，基于泵的硬件递送体系也可被使用，其中一些适于移植。
在优选的实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物包含合适量的免疫原，当施用于受治者时，诱导受治者体内的免疫反应。在优选的实施方式中，所述免疫反应足以提供针对暴露于免疫原或产生所述免疫原的微生物(例如，伯克霍尔德杆菌属的细菌)之后的受治者保护(例如，免疫保护)。本发明不受所使用的免疫原的量的限制。在一些优选的实施方式中，含有NE和免疫原的组合物中的免疫原(例如，伯克霍尔德杆菌细菌(例如，洋葱伯克霍尔德杆菌)或其一种或一种以上组分部分)的量(例如，用作免疫剂量)选择为诱导免疫保护反应而不引起明显的有害副作用的量。基于所使用的特定的免疫原或其组合，所述量将会变化并且可基于下列因素随受治者而变化，所述因素包括但不限于：受治者的种类、年龄和基本情况(例如，健康)以及给药模式。
在一些实施方式中，每次剂量(例如，含有NE和免疫原的组合物的剂量(例如，施用于受治者以诱导免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护免疫性))))包括约0.05μg至5000μg免疫原(例如，重组和/或纯化的伯克霍尔德杆菌OMP蛋白质)。在一些实施方式中，每次剂量(例如，含有NE和免疫原的组合物的剂量(例如，施用于受治者以诱导免疫反应(例如，保护性免疫反应(例如，保护免疫性))))包括约0.05μg至5000μg免疫原(例如，重组和/或纯化的伯克霍尔德杆菌OMP蛋白质)并且包括约0.05μg至5000μg另一免疫原(例如，重组和/或纯化的蛋白质、佐剂(例如，霍乱毒素)，等等)。在一些实施方式中，每次剂量将包括1μg至500μg免疫原，在一些实施方式中，每次剂量将包括350μg至750μg免疫原，在一些实施方式中，每次剂量将包括50μg至200μg免疫原，在一些实施方式中，每次剂量将包括25μg至75μg免疫原(例如，重组和/或纯化的蛋白质(例如，伯克霍尔德杆菌抗原))。在一些实施方式中，每次剂量包括足以产生免疫反应的免疫原的量。剂量中免疫原的有效量不需要被量化，只要当施用于受治者时免疫原的量在受治者体内产生免疫反应。
在一些实施方式中，预见到每次剂量(例如，含有NE和免疫原的组合物的剂量(例如，施用于受治者以诱导免疫反应))为按免疫原(例如，中和的细菌或重组和/或纯化的蛋白)重量计0.001％至15％或更多(例如，0.001-10％，0.5-5％，1-3％，2％，6％，10％，15％或更多)。在一些实施方式中，起始或最初给药剂量包括比随后的加强剂量更多的免疫原。
在一些实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物被配制为浓缩剂型，其可在施用于受治者之前稀释。例如，浓缩组合物的稀释液可施用于受治者，从而使得受治者接受任何一种或一种以上本文提供的特定剂量。在一些实施方式中，可制备浓缩的组合物的稀释液，从而向受治者施用(例如，以单一剂量)含有存在于浓缩组合物中的0.5％至50％NE和免疫原的组合物。在一些优选的实施方式中，以单一剂量向受治者施用含有存在于浓缩组合物中的1％NE和免疫原的组合物。认为浓缩组合物在环境中有用，在所述环境中，可将本发明的组合物施用于大量受治者(例如，门诊、医院、学校免疫，等等)。在一些实施方式中，含有本发明的NE和免疫原的组合物(例如，浓缩组合物)在室温下稳定持续超过1周，在一些实施方式中，持续超过2周，在一些实施方式中，持续超过3周，在一些实施方式中，持续超过3周，在一些实施方式中，持续超过4周，在一些实施方式中，持续超过5周，在一些实施方式中，持续超过6周。
一般而言，本发明的乳剂组合物将含有至少0.001％至100％，优选地0.01％至90％的乳剂/ml液体组合物。预期剂型可含有约0.001％、约0.0025％、约0.005％、约0.0075％、约0.01％、约0.025％、约0.05％、约0.075％、约0.1％、约0.25％、约0.5％、约1.0％、约2.5％、约5％、约7.5％、约10％、约12.5％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约98％的乳剂/ml液体组合物。应当理解的是，上面列举的任何两个数字之间的范围特别地被认为包括在本发明的边界和界限内。剂量的一些变化将必须基于特定的病原体和被免疫的受治者的情况而发生。
在一些实施方式中，在本发明的组合物的起始给药之后(例如，起始接种疫苗)，受治者在第一次、第二次、第三次、第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次和/或超过十次给药之后可接受一次或一次以上加强给药(例如，约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约10周、约3个月、约4个月、约6个月、约9个月、约1年、约2年、约3年、约5年、约10年)。虽然机制的理解不必需实践本发明并且本发明不限于任何特定的作用机制，但是在一些实施方式中，以加强剂量再引入免疫原能够加强受治者的全身免疫性。所述加强可以是给予初始免疫反应的相同剂型或可以是含有免疫原的不同剂型。给药方案也将(至少部分)按照受治者的需要以及基于从业者的判断来确定。
剂量单元可基于各种因素成比例地增加或降低，所述因素包括但不限于受治者的体重、年龄、健康情况。此外，剂量单元可在随后给药中增加或减少(例如，加强给药)。
认为本发明的组合物和方法会用于各种环境，包括研究环境。例如，本发明的组合物和方法也用于免疫体系的研究(例如，适应性免疫反应的表征(例如，保护性免疫反应(例如，粘膜或全身免疫性)))。本文提供的组合物和方法的用途包括人类和非人类受治者以及那些受治者的样本并且还包括使用这些受治者的研究应用。本发明的组合物和方法也在研究和优化纳米乳剂、免疫原和其他组分以及筛选新组分方面有用。因此，无意将本发明限于任何特定的受治者和/或应用环境。
所述剂型可在许多为研究粘膜和其他递送途径所研制的动物模型体内测试。显而易见的是，本发明的组合物用于预防和/或治疗由病毒、细菌、寄生虫和真菌引起的各种各样的疾病和感染并且用于诱发对各种抗原的免疫反应。如上所述，所述组合物不仅可用于预防或治疗，还可用于制备抗体(多克隆和单克隆(例如，用于诊断目的))以及感兴趣的抗原的免疫纯化。如果期望的是多克隆抗体，所选择的哺乳动物(例如，小鼠、兔子、山羊、马，等等)可用本发明的组合物来免疫。所述动物通常在2至6周后用一次或一次以上抗原给药来加强。然后，多克隆抗血清可从免疫的动物获得并且根据已知的步骤来使用(参见，例如，Jurgens等人，J.Chrom.1985，348：363-370)
在一些实施方式中，本发明提供包含含有NE和免疫原的组合物的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒还提供用于施用所述组合物的设备。本发明不受试剂盒中包括的设备的类型的限制。在一些实施方式中，所述设备被配制为用于本发明的组合物的鼻腔给药(例如，鼻腔涂药器(例如，注射器)或鼻腔吸入器或鼻腔喷雾器)。在一些实施方式中，试剂和包含含有浓缩形式的NE和免疫原的组合物(例如，可在施用于受治者之前稀释)。
在一些实施方式中，所有试剂盒组分可存在于单一容器(例如，小瓶或管)中。在一些实施方式中，每个试剂盒组分可位于单一容器(例如，小瓶或管)中。在一些实施方式中，一种或一种以上试剂盒组分和相同的试剂盒的其他组分一同位于单个容器(例如，小瓶或管)中，所述相同的试剂盒的其他组分位于分开的容器(例如，小瓶或管)中。在一些实施方式中，试剂盒包含缓冲液。在一些实施方式中，所述试剂盒包含使用说明。
实验
提供下面实施例来说明并且进一步具体说明特定的优选实施方式和本发明的方面，并且下面的实施例不构成对本发明范围的限制。
实施例1
体内毒性研究
测试本发明的纳米乳剂组合物来确定将所述组合物肺部施用于受治者是否诱发任何组织学变化和/或病理学。
将含有20％纳米乳剂(W805EC)和0.1％EDTA的溶液通过喷雾器来施用。使用具有PARILC喷雾器(Midlothian，VA)和压缩机的常用的小鼠唯一鼻雾化腔室。使用0.9％的NaCl溶液作为对照。使用喷雾器将雾化的纳米乳剂+EDTA或NaCl溶液施用于小鼠持续10分钟。给药后24小时，处死小鼠并评估物理性质和组织学。
检测之后，没有组织学变化说明雾化的纳米乳剂给药后没有毒性。物理结果正常。
实施例2
使用纳米乳剂组合物和在呼吸道中发现的细菌的杀伤分析
确定含有单独的纳米乳剂(W805EC)的组合物或与EDTA结合和/或存在高渗盐溶液的纳米乳剂(W805EC)的组合物是否能够减缓在呼吸道中发现的细菌的生长或杀死所述细菌。
在6ml阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(MHB)中开始对来自-80℃冷冻的细菌原代的洋葱伯克霍尔德杆菌或绿脓杆菌进行过夜培养。所述培养在37℃的震荡孵育器中进行孵育。第二天，通过用新鲜的MHB以1∶4逆向稀释过夜的培养物使细菌进入对数增长阶段。将逆向稀释的培养液在震荡孵育器中在37℃条件下孵育直至OD600达到0.40至0.45。将1ml培养液在3500rpm至4000rpm条件下离心分离持续15分钟。将细菌小粒重悬浮于1ml无菌2X PBS，12％或14％盐水中。对相同的溶液进行合适的稀释以在50μl中得到期望的细菌数(0.5OD600大约等于109细菌)。将起始细菌悬浮液的稀释液置于Luria Bertani(LB)琼脂平板上以估计起始细菌计数。用无菌milliQ水来制备期望的最终纳米乳剂的两倍浓度和具有EDTA的纳米乳剂浓度。50ml纳米乳剂与50μl细菌混合并且涡旋震荡以混合反应。在37℃孵育混合物持续期望的时间间隔。孵育之后，用500μl 1X PBS稀释反应并涡旋震荡以混合内含物。内含物以4000rpm离心持续15分钟以使细菌成小粒状并分离纳米乳剂。除去含有纳米乳剂的上清液并在1X PBS中重悬细菌小粒。将未稀释的重悬的细菌小粒或重悬的细菌小粒的稀释液置于LB琼脂平板上用于集落计数。从起始数的比例来计算细菌的杀死指数。
进行下列杀死分析：
在PBS中由20％单独的纳米乳剂(NE)或与20mM EDTA结合的20％的纳米乳剂在10分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌(参见图1)；
在PBS中由20％单独的NE或与20mM EDTA结合的20％的NE在20分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌(参见图2)；
在PBS中由20％单独的NE或与20mM EDTA结合的20％的NE在40分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌(参见图3)；
在PBS中由20％单独的NE或与20mM EDTA结合的20％的NE在40分钟或60分钟内杀死洋葱伯克霍尔德杆菌(参见图4)；
在高渗盐水(6％NaCl)中由单独的NE或与EDTA结合的NE在15和30分钟杀死洋葱伯克霍尔德杆菌(参见图5)；
在15分钟内在7％NaCl中杀死洋葱伯克霍尔德杆菌和绿脓杆菌(参见图6)；
在15分钟内在7％NaCl中杀死洋葱伯克霍尔德杆菌(参见图7)。
单独的纳米乳剂或与EDTA结合的纳米乳剂(例如，10-20mM EDTA)能够达到在PBS中在60分钟内完全杀死106细菌。在存在高渗盐水(例如，6％至7％的NaCl)同时存在20mM EDTA的情况下，纳米乳剂的杀死能力显著提高，达到在15分钟内完全杀死。在存在高渗盐水的情况下，含有低浓度EDTA的纳米乳剂也能够在30分钟内完全杀死细菌。因此，本发明提供了含有EDTA的纳米乳剂可用于经过短时间(例如，＜60分钟)杀死细菌(例如，完全杀死)。而且，本发明提供了具有高渗盐水和EDTA的纳米乳剂可用于经过甚至更短的时间(例如，＜30分钟，＜15分钟)来杀死细菌并且EDTA和高渗盐水溶液的浓度改变纳米乳剂能够根除细菌的速度。本发明还说明了本发明的组合物能够根除细菌的混合种群。
实施例3
纳米乳剂杀死包括多药物抗性的菌株在内的囊性纤维化(CF)相关的细菌材料和方法
细菌菌株和培养条件。分析150个分离株，包括75个伯克霍尔德杆菌分离株和75个属于其他CF相关种类的分离株，其中包括绿脓杆菌、氧化木糖无色杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、不动杆菌属种、潘多拉菌(Pandoraea)属种(P.apista，P.pnomenusa，P.pulmonicola，P.norimburgensis，和P.sputorum)和青枯菌属种(R.mannitolilytica和R.pickettii)。从洋葱伯克霍尔德杆菌研究实验室和储藏处(BcRLR，University of Michigan，Ann Arbor，MI)获得145个分离株。在1997年9月至2007年10月从142个个体中回收得到这些分离株并且交给在美国的62个CF治疗中心的BcRLR用于分析。剩下的5个菌株包括环境分离株B.multivorans ATCC 17616(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)、P.norimburgensis LMG 18379T(BCCM/LMG Bacteria Collection，Laboratorium voor Micrbiologie Gent，Universiteit Gent，Ghent，Belgium)和B.pyrrocinia HI3642(BcRLR collection)，以及临床型菌株新洋葱伯克霍尔德杆菌LMG 16656T(aka J2315)和P.pulmonicola LMG 18106T。147个临床分离株中的134个(91％)来自于患有CF的人；这些菌株中的114个(78％)来自痰液培养物，剩下的来自咽拭子(n＝17)，气管内吸出术/气管吸痰术(n＝5)，血液(n＝5)，支气管灌洗(n＝3)以及分别来自上颌窦、腹腔和喉头盖中的每一个。基于在有关微生物实验室进行的敏感性测试，150个分离株中的49个(33％)被界定为多抗药性(对三分之二抗生素种类中测试的所有抗生素有抗性：包括碳青霉烯、氨基糖苷和喹诺酮在内的内酰胺；参见，例如，Taccetti等人，Eur J Epidemiol.1999 Jan；15(1)：85-8)；这些中的20个(41％)是泛耐药性。剩余的分离株中的72个(48％)对至少一种抗生素敏感并且敏感性测试结果不适用于29个分离株(19％)。在BcRLR，所有分离株通过多相分析使用所描述的表型和基因型分析被鉴定为物种水平(参见，例如，Reik等人，J Clin Microbiol.2005 Jun；43(6)：2926-8)。不动杆菌属是例外，由于缺乏明确的物种特异性分析，其仅仅被鉴定为属级水平。使用前面描述的BOX AIR引物也对所有的分离株进行重复的非基因元素-PCR(rep-PRC)分类(参见，例如，Coenye等人，J Clin Microbiol.2002 Sep；40(9)：3300-7)以确定测试样板中所包括的150个分离株在基因型上是不同的。将细菌在-80℃条件下保存在脱脂牛奶或具有15％甘油的Lauria-Bertani(LB)肉汤中并且在37℃条件下在Mueller-Hinton(MH)琼脂上复苏冷冻的原代细菌。
纳米乳剂。本文所述的纳米乳剂P4075EC由NANOBIO公司(Ann Arbor，MI)制造。P4075EC液滴的平均颗粒直径为400nm。在制造P4075EC中使用的表面活性剂和食品物质是由FDA“通常认为是安全的(GRAS)”并且根据良好生产规范(GMP)制造。CPC的浓度用作替代根据经验使用的P4075EC的量。P4075EC在40℃条件下稳定持续不少于12个月。
敏感性测试。因为P4075EC是透明的，该化合物对测试细菌的MIC通过使用改良的临床和实验室标准化研究所(CLSI)批准的微量滴定连续稀释法来测定(参见，例如，Clinical and Laboratory Standards Institute.2006.Approved standard M7-A7，seventh edition.Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne，PA)。在补充了7％NaCl和20mM EDTA的MH肉汤中P4075EC被稀释至浓度为2mg/ml(CPC)。该制剂的连续两倍稀释液在未补充的MH肉汤中制备并等分至96孔平底微量滴定板内(100μl/孔)。在MH琼脂上过夜生长的细菌被悬浮于MH肉汤中至0.5McFarland浊度标准(在625nm的吸光率为0.08-0.13)，在MH肉汤中再进行1∶100稀释并加至P4075EC连续稀释孔中(5μl/孔)。包括具有细菌而没有P4075EC的孔以及具有P4075EC稀释液而没有细菌的孔在内的合适的对照包括在每个平板中。短暂地震荡微量滴定板并从含有细菌而没有P4075EC的孔中取出1μl，在1mlMH肉汤中稀释，平板接种在MH琼脂(100μl)上并在37℃条件下孵育24小时至48小时以测定起始接种体的细菌浓度。然后，将微量滴定板在37℃下孵育，不震荡。为了测定MBC，在过夜生长之后从每个孔取出10μl，滴在MH琼脂上并在37℃下孵育。24小时后进行集落计数，将MBC记录为P4075EC浓度并且与起始接种体相比其CFU/ml降低了3log。为了确定MIC，将10μl刃天青(resazurin)(R&D SYSTEMS，Minneapolis，MN)加至每个孔中并短暂地震荡微量滴定板，用箔覆盖微量滴定板并在37℃下孵育，不震荡。第二天目测检查孔，将MIC记录为P4075EC维持蓝色的最低浓度。MIC结果进一步通过560nm激发/590nm发射的荧光分光光度计上记录的荧光来定量。
生物膜生长和敏感性测试。为了识别形成生物膜的分离株，使细菌在大豆胰蛋白酶肉汤中过夜生长，调节至0.5McFarland浊度标准并在MH肉汤中再进行1∶10稀释，将100μl一式三份接种在96孔平底微量滴定板的内部孔内。包括不含细菌的阴性对照孔。为了使蒸发最小化，剩下的孔用MH肉汤填充并且将平板用塑料膜包裹，之后在37℃下孵育48小时，不震荡。用磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH7.4)轻轻地洗涤孔两次，在37℃下干燥2小时，然后用1％结晶紫在水中染色15分钟。用PBS洗涤染色的孔3次，并且通过加入无水甲醇将结晶紫溶解。在室温孵育5分钟后，将溶解的结晶紫转移至新的微量滴定板，并在分光光度计中在590nm进行扫描。形成生物膜的分离株被界定为3个孔的平均吸光度大于阴性对照孔的平均吸光度加3标准偏差的分离株(参见，例如，Stepanovic等人，J Microbiol Methods.2000 Apr；40(2)：175-9)。
对于生物膜敏感性测试而言，如上所述，通过结晶紫测试显示出产生生物膜的分离株以一式三份生长48小时。用PBS轻轻地洗涤孔两次，之后加入P4075EC，如游离MIC测试中所描述的，进行连续稀释。在37℃下过夜孵育之后，用PBS再次洗涤孔两次，并将100μl的10％刃天青的MH肉汤加至孔中。将平板包在塑料中，并用箔覆盖，在37℃再过夜孵育，不震荡。第二天目测检查平板，将最小生物膜抑制浓度(MBIC)记录为平板中孔为蓝色的P4075EC的最低浓度。为了计算最小生物膜根除浓度(MBEC)，通过震荡微量滴定板将生物膜重悬于用于MBIC测试的相同的孔中，然后用吸管头刮擦孔的侧面。从每个孔中取出10μL，点在MH琼脂平板上并在37℃孵育。过夜生长之后，将MBEC记录为未引起生长的最低P4075EC浓度(参见，例如，Tomlin等人，Can J Microbiol.2001 Oct；47(10)：949-54)。为了确定起始接种体浓度并量化生物膜生长培养物中的活细菌，从0.5McFarland接种的培养物的10倍连续稀释液来进行集落计数并从具有用于MBEC计数的重悬的生物膜的未处理的阳性对照孔来进行集落计数。
痰液制备。从University of Michigan Health System clinical microbiology laboratory获得在常规护理过程中收集CF患者咳出的痰液并储存在-80℃下。将来自15位患者的等体积的痰液合并，使用TISSUE MISER均化器(FISHER SCIENTIFIC，Pittsburg，PA)在室温下以最大速度进行机械剪切5分钟，然后在80℃水浴中孵育20分钟。将处理过的痰液分为10ml的等份，将每等份中的100μl置于MH琼脂上并在37℃下孵育48小时以确保无菌。将等份储存在-80℃。
结果。
浮游细菌的敏感性。由于P4075EC是透明白色的，对标准CLSI-批准的微量滴定连续稀释方法进行改良以包括加入作为细菌生存能力的指示剂的刃天青。P4075EC在浓度为15.6μg/ml至2000μg/ml下测试。MIC被定义为颜色不发生从蓝色至粉色的变化的P4075EC的最低浓度(参见图8)。与对照孔相比，该目测检查点与荧光分析进行比较表现出63％的MIC孔具有≤1％的未处理的对照孔的代谢活性；91％具有≤5％的代谢活性，并且，96％具有≤10％的代谢活性。MIC的结果示于图11。所有菌株被所测试的P4075EC的浓度抑制。150个菌株的整个样板的MIC50为31.2μg/ml；MIC90为125μg/ml。38个菌株(25％)被所测试的P4075EC的最低浓度抑制(15.6μg/ml)，并且仅仅一个菌株需要250μg/ml和500μg/ml的浓度来抑制。P4075EC对非伯克霍尔德杆菌菌株的活性比对伯克霍尔德杆菌菌株(MIC50为62.5μg/ml；MIC90为125μg/ml)的活性略微更高(MIC50为31.2μg/ml；MIC90为62.5μg/ml)(参见图9)。在所测试的10种伯克霍尔德杆菌种类之间进行活性比较。没有发现P4075EC对多抗药性的伯克霍尔德杆菌菌株与对一种或一种以上抗生素敏感的菌株在活性方面有差异。
为了估算P4075EC对浮游细菌的杀菌活性，测定包括22种伯克霍尔德杆菌和12种非伯克霍尔德杆菌在内的34种菌株的子集的MBC。所有的MBC包括在菌株的这种子集的各MIC的1倍稀释液中，除了新洋葱伯克霍尔德杆菌的MIC为250μg/ml并且MBC为2000μg/ml。B.multivorans ATCC 17616的时间-杀死研究表明时间和浓度依赖性杀死，P4075EC浓度为两倍MIC条件下在90分钟内细菌的生存能力下降99％，并且P4075EC浓度为8倍MIC条件下30分钟内完全杀死(参见图10A)。
在生物膜中生长的细菌的敏感性。为了进一步评价P4075EC的活性，测试了生长为生物膜的细菌的敏感性。结晶紫染色从测试样板筛选的25种菌株中识别了12种形成生物膜的菌株。12种菌株中的9种(75％)表现出对P4075EC敏感性降低，定义为当生长为生物膜时，相对于MIC，MBIC增加了至少4倍(参见图12)。在这种情况下，相对于P4075EC对菌株的各自的MIC，MBIC的中值增加了8倍。没有观察到生物膜细菌的P4075EC的耐受性的证据；12种菌株中的10种菌株的MBEC与各自的MBIC相同。
CF痰液中的细菌敏感性。还测试了12种形成生物膜的菌株在存在CF痰液的条件下对P4075EC的敏感性以模拟更加接近CF肺部的微环境。P4075EC对全部12种菌株(浮游条件下生长)的MBC在存在43％的痰液(在微量滴定分析中能够达到的最高痰液浓度)的条件下相对于标准条件下各自的MBC增加(参见图12)。然而，所有菌株在存在痰液的条件下保持对P4075EC的敏感性。CF痰液以浓度依赖的方式抑制了P4075EC对浮游细菌的活性(参见图10B)。
实施例4
杀死单独的细菌生物膜和混合的细菌生物膜的纳米乳剂
测试了含有纳米乳剂P4075EC、7％盐水和20mM EDTA的组合物杀死存在于生物膜中的细菌的能力(单独的或混合的)。
生物膜的生长。在聚碳酸酯膜上的细菌生物膜根据Current Protocols in Microbiology(John Wiley & Sons，Inc.，NJ，USA)中描述的步骤来形成。使用灭菌镊子通过将所述膜暴露于UV光每侧持续10分钟来对聚碳酸酯膜进行灭菌或者通过121℃蒸汽灭菌持续20分钟来对聚碳酸酯膜进行灭菌。将灭菌膜置于琼脂培养基的表面并且将光面朝上。感兴趣的细菌菌株过夜培养，用肉汤培养基稀释至OD600为0.05并将0.5μl稀释的培养物置于琼脂平板培养基上的聚碳酸酯膜的光面上。具有膜的平板在37℃下孵育24小时，之后将所述膜转移至新的琼脂培养基再孵育24小时形成生物膜。
生物膜细菌的杀菌分析。在1.5ml eppendorf管中，37℃条件下，将具有生物膜的聚碳酸酯膜浸入250μl具有20mM EDTA和7％氯化钠(NaCl)的20％P4075EC中持续3小时。7％的NaCl作为阴性对照。孵育之后，将所述膜转移至含有10ml无菌PBS的15ml无菌聚丙烯管中。将无菌PBS中的1ml PBS加至eppendorf反应管中，涡旋震荡并在3500rpm条件下离心旋转15分钟。离心之后，将含有NE的上清液取出并将细菌小粒重悬于它们各自的15ml管中，收集所述管中的聚碳酸酯膜。然后以最大速度涡旋震荡15ml管3分钟以使膜中的细菌进入PBS中。将100ml未稀释和稀释处理的样品以及对照样品置于LB琼脂平板上用于集落计数。
如图13至图16所示，具有7％盐水和20mM EDTA的20％P4075EC有效杀死存在于含有单一细菌菌株的生物膜中的细菌(参见，例如，图13)、存在于含有多种细菌菌株的生物膜中的细菌(参见，例如，图14-15)以及存在于由第一轮杀死处理中逃脱了的细菌所产生的生物膜中的细菌(参见，例如，图16)，达到细菌数降低了4log至9log。
实施例5
本实施例描述了各种纳米乳剂制剂对各种革兰氏阴性病原体的效力，所述革兰氏阴性病原体与CF、创面、烧伤以及烧伤患者或其他环境有关。
如上所述，CF被表征为慢性呼吸道感染，所述慢性呼吸道感染早期开始于身体中患有金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌感染并且之后由绿脓杆菌的粘液状菌株定殖。在CF肺部疾病中，早期洋葱伯克霍尔德杆菌的定殖与CF患者的不良预后有关。吸入用托普霉素通常处方用于患者以预防细菌感染的恶化。随着时间，患者可变得对托普霉素治疗/预防没有反应。对已知的抗生素没有交叉抗性的新的吸入用局部药剂作为吸入用托普霉素的替代物是有价值的。
评估了几种局部纳米乳剂对革兰氏阴性分离株的微生物活性，所述革兰氏阴性分离株包括绿脓杆菌和洋葱伯克霍尔德杆菌。所有3种乳剂在存在诸如EDTA之类的外部膜渗透剂的条件下快速杀死细菌。评估了纳米乳剂对35种革兰氏阴性分离株中的23种的杀菌活性，并且所有纳米乳剂(85％-95％)为杀菌性的。因此，这些新的纳米乳剂中的一种或一种以上可用于预防慢性肺部感染的恶化。
方法：使用CLSI标准方法来测定MIC和MBC。在存在5mM EDTA(已知的纳米乳剂活性的促进剂)的条件下测定纳米乳剂的MIC。加入阿尔玛蓝用于测定在较高浓度下透明的纳米乳剂的MIC，所述阿尔玛蓝是响应代谢活性产生比色变化的氧化还原指示剂。
乳剂的制造：纳米乳剂W205EC、P4075EC和W205GBA2ED是水包油乳剂，所述纳米乳剂由通常认为是安全的(GRAS)成分以及已证明人类口服使用安全的作为活性成分的阳离子洗涤剂(氯化十六烷基吡啶(CPC)和苯扎氯铵(BA))来制造。由高度纯化的油、乙醇、非离子型表面活性剂和水来形成乳剂。纳米乳剂W205EC的液滴平均尺寸为180nm、纳米乳剂P4075EC和W205GBA2ED的液滴平均尺寸为350nm，所述液滴尺寸使用Malver Zetasizer Nano3600(Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，UK)通过动态光散射来测量。W205EC和P4075EC制剂如上所述。W205GBA2ED(v/v％)是蒸馏水(18.93％)、吐温20(5％)、甘油(8％)、大豆油(64％)、BTC 824 50％(4％)(Stepan，Northfield，Illinois)和EDTA(0.0745％)。所述制剂可在水中稀释(例如，60％ W205GBA2ED，40％水)以提供60％W205GBA2ED。该物质可用10mM EDTA稀释至10％制剂(例如，76g水/24g 100mM EDTA/20g 60％W205GBA2ED)。因此，在一些实施方式中，提供含有油、水、甘油、表面活性剂和BTC(n-烷基二甲基苄基氯化铵)和/或EDTA的制剂。
分离株的来源。临床分离株的来源是过去两年由JMI实验室收集的血流或皮肤和软组织分离株。
MIC和MBC测定。在阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤中通过M7-A7的微量稀释法(2006)来评估W205EC±0，5，10，15和20mM EDTA的MIC。测定了在存在5mM EDTA的条件下纳米乳剂W205EC、P4075EC和W205GBA2ED对革兰氏阴性分离株的样板的MIC。EDTA用于渗透革兰氏阴性分离株的包膜，帮助纳米液滴融入细胞膜，导致细胞溶解。加入阿尔玛蓝来分析接种后2小时的样板用于改进的MIC端点检测。通过将MIC孔中的整个肉汤内含物和每个所选择的生物体的MIC以上的四种两倍稀释液中的整个肉汤内含物平板种植于血液琼脂生长培养基上来评价所有纳米乳剂和比较化合物(夫西地酸)的MBC值。对起始接种物进行定量集落计数。杀死≥99％的起始测试接种物的抗菌剂的最低浓度被定义为MBC端点。参见，表2、表3和表4。
Figure BPA00001374059101091
*EDTA单独抑制这些菌株
Figure BPA00001374059101101
表4(第一页)
Figure BPA00001374059101102
Figure BPA00001374059101111
表4(第二页)
Figure BPA00001374059101112
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Figure BPA00001374059101122
结果：所有3种纳米乳剂对革兰氏阴性分离株(EDTA单独分别抑制鲍曼不动杆菌中的3种菌株和嗜麦芽寡养单胞菌中的5种菌株)具有活性。这包括对对比剂有抗性的分离株。23种分离株表现出MBC；W205EC、P4075EC和W205GBA2ED分别对85％、95％和90％的分离株是杀菌性的。没有观察到任何纳米乳剂对任何已知的抗生素的交叉抗性。
结论：纳米乳剂对包括多抗药性分离株在内的革兰氏阴性物种具有广泛活性。记录的MIC在可实现局部施用于皮肤或粘膜组织的浓度范围内。纳米乳剂中的一种或一种以上可用于囊性纤维化患者中的慢性肺部感染的预防和/或治疗。
实施例6
本实施例的目的是测定根据本发明的纳米乳剂是否对流感嗜血杆菌分离株具有活性。流感嗜血杆菌是囊性纤维化患者急性恶化以及非CF普通个体的上呼吸道和下呼吸道感染所涉及的重要呼吸道病原体。
本实施例测定了三种示范性的纳米乳剂(W205EC、P4075EC和W205GBA2)和对比药物对流感嗜血杆菌的临床分离株的最小抑菌浓度。如下面更加详细的描述，结果显示P4075EC和W205EC具有类似的1.88μg/ml至3.75μg/ml的MIC范围。W205GBA2的MIC范围为8μg/ml至16μg/ml。向每个含有纳米乳剂的孔中加入1mM EDTA对MIC没有影响。EDTA浓度高于1mM抑制细菌生长，可能阳离子浓度降低至低于支持生长的阳离子浓度的水平。获得了三种纳米乳剂+1mM EDTA对七种菌株的MBC数据。MBC在各自的MIC的4倍的范围内，这与对流感嗜血杆菌分离株具有杀菌活性的每种纳米乳剂一致。
A.材料和方法
药物的来源。浓度为5000μg/ml(原液浓度)的W205EC(编号x1151)是临床试验材料(NB-001)的合并样品，在Patheon，Mississauga，Ontario，Canada制造。P4075EC(编号X1138)和W205GBA2(编号X1103)在NanoBio公司制造。对比化合物阿奇霉素、氨比西林、头孢平和氯林可霉素购自美国药物处方药典(United State Pharmacopeia)，分类号分别为1046056，1033000，1097636，1136002。四环素购自Fluka Biochmika，分类号为87128。乳剂通过将水不可混合的油相与水相混合来生产。基本配方在下面表5中显示并且代表了纯乳剂，将该乳剂再稀释至期望的百分含量(％)。除非另有说明，组合物为w/w％。
Figure BPA00001374059101141
细菌菌株的来源。从Case Western Reserve University，Cleveland，Ohio获得流感嗜血杆菌的临床分离株。从American Type Culture Collection获得质量对照分离株ATCC 49247。
敏感性分析。使用临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility and Testing；Seventeenth Informational Supplement.CLSI document MI00-S17(ISBN 1-56238-625-5).CLSI，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，PA 19087-1988，2007)公布的指南评价流感嗜血杆菌分离株对5种商售的抗生素和3种纳米乳剂制剂的敏感性。测试的药物浓度的范围如下：阿奇霉素0.25μg/ml至128μg/ml，氨比西林0.063μg/ml至32μg/ml，头孢平0.063μg/ml至32μg/ml，氯林可霉素0.125μg/ml至64μg/ml，四环素0.125μg/ml至64μg/ml，P4075EC 0.12μg/ml至60μg/ml氯化十六烷基吡啶，W205EC 0.12μg/ml至60μg/ml氯化十六烷基吡啶，W205GBA2 0.125μg/ml至64μg/ml苯扎氯铵。因为纳米乳剂不是单一组分，MIC/MBC表达为阳离子表面活性剂的浓度；W205EC和P4075EC两者含有氯化十六烷基吡啶(CPC)作为阳离子表面活性剂，而W205GBA2含有苯扎氯铵(BA)作为阳离子表面活性剂。还用相同的纳米乳剂浓度范围+1mM至5mM EDTA来测试分离株以观察是否后者改善纳米乳剂的活性。单独测试EDTA浓度以确定EDTA阳离子的螯合作用足以抑制细菌生长而不依赖于纳米乳剂。
在每种药物的10种连续浓度中当第一次完全澄清时目测确定最小抑菌浓度(MIC)。对于纳米乳剂而言，因为其本身是透明的，所以MIC被测定为观察到从最小浓度至最大浓度的连续稀释液中具有一些澄清的第一个孔的浓度。通过将已确定的MIC中的10μl和高于MIC的4个孔平板种植于巧克力血液琼脂培养基上来评价纳米乳剂+1mM EDTA对7种临床菌株和ATCC 49257分离株的MBC。杀死≥99.9％起始测试的接种体的抗菌剂的最低浓度被定义为MBC。如果MBC/MIC比值≤4，化合物或纳米乳剂被定义为杀菌性的。
结果：MIC和MBC的数据示于表6至表7。P4075EC，W205EC和W205GBA2在存在或不存在1mM EDTA的条件下同样有效抗菌。这些化合物的MIC90值分别为3.75μg/ml，3.75μg/ml，16μg/ml(表6)。根据MIC90，大多数分离株对阿奇霉素、头孢平、四环素和氨比西林敏感，但是对氯林可霉素和氨比西林有抗性。
MBC值在每个测试的分离株的各自的MIC的四倍范围内；因此每种纳米乳剂对流感嗜血杆菌是杀菌性的，P4075EC，W205EC和W205GBA2的MBC的范围分别为1.88μg/ml至7.5μg/ml，1.88μg/ml至7.5μg/ml和8μg/ml至16μg/ml。
结论：P4075EC和W205EC表现出对流感嗜血杆菌的临床分离株同样有效。根据MIC90和MBC值，苯扎氯铵制剂(W205GBA2)的活性比其他纳米乳剂的活性小两倍至四倍。在这些生长条件下，浓度为≥2mM的EDTA抑制流感嗜血杆菌的生长。EDTA的加入不是改善任何纳米乳剂的活性所必需的。
表6.流感嗜血杆菌临床分离株对纳米乳剂和对照抗生素的敏感性。
Figure BPA00001374059101161
表7.纳米乳剂对流感嗜血杆菌临床分离株的杀菌性
对于下面表8而言，对比剂药物浓度以μg/ml为单位，W205EC和P4075EC以μg氯化十六烷基吡啶(CPC)/ml为单位并且W205GBA2以μg苯扎氯铵(BA)/ml为单位。NC为阴性对照，GC为生长对照。图表描述了96孔微量滴定平板的孔。列为I，J，K和J的列是用于评估具有不同EDTA浓度的纳米乳剂的部分平板列。对于每种临床菌株和对照菌株而言，下面的图表用于跟踪MIC和MBC数据。如果孔太透明而不能读取MIC()，那么依赖MBC提供MIC。在表8中，亮色高亮标记的列含有MBC平板计数。第二个数字是用于测定MBC的微量滴定平板中10μl样品的平板计数。MBC被定义为接种体减少≥3log。较暗的高亮标记对应于MIC。
表8.具有EDTA的纳米乳剂对流感嗜血杆菌的MIC(第1页)
Figure BPA00001374059101181
Figure BPA00001374059101191
表8(续第2页)
表8(续第3页)
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表8(续第4页)
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Figure BPA00001374059101222
表8(续第5页)
Figure BPA00001374059101231
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表8(续第6页)
Figure BPA00001374059101241
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表8(续第7页)
Figure BPA00001374059101251
表8(续第8页)
Figure BPA00001374059101262
表8(续第9页)
Figure BPA00001374059101271
表8(续第10页)
Figure BPA00001374059101281
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表8(续第11页)
Figure BPA00001374059101291
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表8(续第12页)
Figure BPA00001374059101301
Figure BPA00001374059101302
表8(续第13页)
Figure BPA00001374059101311
表8(续第14页)
实施例7
本研究的目的是确定根据本发明的四种纳米乳剂(NE)的MIC和MBC以及NE与常规抗生素比较对MRSA的性能。MRSA是导致年轻的囊性纤维化患者中的肺部感染的微生物中的一种并且也是包括烧伤创面感染在内的皮肤和软组织感染中所涉及的。因为MRSA的不同的致病机制，由MRSA引起的感染可以是致命的。
本实施例的目的是评估用于感染性疾病的局部治疗的根据本发明的四种纳米乳剂。测试的纳米乳剂为W805EC，W205ECEDL2，W205GBA2ED和P4075EC。本实施例测定了四种纳米乳剂和对比药物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的29种临床分离株的最小抑菌浓度。
下面显示的结果说明纳米乳剂的MIC的范围分别为0.5-2(W805EC)，0.5-4(W205ECEDL2)，1-4(W205GBA2ED)，1-4μg/ml(P4075EC)。也收集了最小杀菌浓度(MBC)数据，MBC的范围分别为0.5-16(W805EC)，1-＞32(W205ECEDL2)，2-16(W205GBA2ED)和1-＞16μg/ml(P4075EC)。
A.方法和材料。
药物和分离株的来源。将下列十二种对比化合物与四种纳米乳剂进行比较，所述十二中对比化合物为：氯林可霉素(USP#1136002)，强力霉素(USP#1226003)，红霉素(Sigma #E0774)，左氧氟沙星(Sigma #28266)，醋酸磺胺米隆(USP #1373008)，莫匹罗星(Sigma #M7694)，磺胺嘧啶银盐(USP #61260)，万古霉素(Sigma #V1764)，苯唑西林(Sigma #28221)，磺胺甲恶唑(USP #1631001)，甲氧苄氨嘧啶(USP #1692505)，以及硝酸银(VWR #VW3462-0)。四种纳米乳剂是(a)W805EC，(b)W205ECEDL2，(c)W205GBA2ED和(d)P4075EC。参见表10，表10提供了药物样板模板(沿着板增加稀释度)。通过将水不可混合的油相与水相混合来生产乳剂。对W205ECEDL2制剂进行微流体化(microfluidized)。基本配方示于下面表9并且表9代表了纯乳剂，所述乳剂进一步稀释至期望的百分含量(％)。除非另有说明，组合物是w/w％。
Figure BPA00001374059101331
表10.药物样板模板
Figure BPA00001374059101341
细菌菌株的来源。从University of Dentistry and Medicine of New Jersey获得了MRSA的29种临床分离株。从American Type Culture Collection获得质量对照分离株ATCC 29213。下表11提供了每种菌株的表型/基因型。
表11.MRSA分离株的表型和基因型
Figure BPA00001374059101351
敏感性分析。使用临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standard Institute，“Antimicrobial Susceptibility and Testing；Seventeenth Informational Supplement.CLSI document M100-S17(ISBN 1-56238-625-5)，CLSI，Wayne，PA)公布的指南测试MRSA对12种传统抗菌剂和四种纳米乳剂制剂的敏感性。药物浓度范围如下：氯林可霉素(64-0.125μg/ml)，强力霉素(128-0.25μg/ml)，红霉素(128-0.25μg/ml)，左氧氟沙星(64-0.125μg/ml)，醋酸磺胺米隆(128-0.25μg/ml)，莫匹罗星(64-0.125μg/ml)，磺胺嘧啶银盐(128-0.25μg/ml)，万古霉素(64-0.125μg/m)，苯唑西林(16-0.03125μg/ml)，磺胺甲恶唑(32-0.0625μg/ml)，甲氧苄氨嘧啶(64-125μg/ml)，硝酸银(0.01-.00002％)，W805EC(32-0.0625μg/ml)，W205ECEDL2(32-0.0625μg/ml)，W205GBA2ED(64-0.125μg/ml)以及P4075EC(32-0.0625μg/ml)。
在每种药物的10种连续浓度中当第一次完全澄清时目测确定最小抑菌浓度(MIC)。对于纳米乳剂而言，因为它们本身是透明的，MIC被称为从最小浓度到最大浓度中第一次明确观察到具有一些澄清。评价了测试的所有抗菌剂的最小杀菌浓度(MBC)值。杀死99.9％起始测试的接种物的抗菌剂的最低浓度被定义为MBC。如果MBC/MIC比值约为4，那么化合物或纳米乳剂被定义为杀菌性的。
B.结果
MIC和MBC的数据在表11和表12中示出。所有四种纳米乳剂对MRSA的临床分离株是有效的，注意到对群体获得性MRSA(IV型SCCmec)或医院相关的MRSA(I-Ill型SCCmec)的活性没有差异。而且，纳米乳剂没有表现出对任何已知的抗生素有交叉抗性。P4075EC，W205ECEDL2和W805EC的MIC90值为2μg/ml。W205GBA2ED的MIC90为4μg/ml。MIC90值说明了MRSA的这种集合对口服抗生素强力霉素(MIC90＝4μg/ml)，磺胺甲恶唑(MIC90＝4μg/ml)，甲氧苄氨嘧啶(MIC90＝0.5μg/ml)和万古霉素(MIC90＝1μg/ml)敏感。分离株一般对口服抗生素左氧氟沙星(MIC90＝32μg/ml)，氯林可霉素(MIC90＝＞64μg/ml)和红霉素(MIC90＝＞128μg/ml)有抗性。用于治疗烧伤创面感染的局部抗生素磺胺嘧啶银盐和硝酸银的MIC90值分别为32μg/ml和0.00063％。醋酸磺胺米隆(磺胺米隆)是另一种局部治疗烧伤创面感染的抗生素，但是它对MRSA具有均一的惰性(MIC90＝＞128μg/ml)。莫匹罗星局部治疗皮肤和软组织感染并且还用于根除MRSA的载体(carriage)；31％的分离株对这种抗生素有抗性。
所有纳米乳剂的MBC90在各自的MIC90值的四倍的范围内，这说明纳米乳剂对约90％的分离株是杀菌性的。在其他12中抗生素中，仅仅万古霉素是杀菌性的。
表12.MRSA对纳米乳剂和对比化合物的敏感性：MIC分析
Figure BPA00001374059101381
表13.MRSA对纳米乳剂和对比化合物的敏感性：MBC分析
Figure BPA00001374059101391
C.结论
W805EC，W205ECEDL2，W205GBA2ED和P4075EC表现出对MRSA的临床分离株同样有效，MIC90值为2μg/ml或4μg/ml。此外，基于MBC90/MIC90的比值，四种纳米乳剂为杀菌性的。如所预见的，MRSA是多抗药性的，强调了需要治疗MRSA感染的新药剂。因为根据本发明的纳米乳剂也对诸如绿脓杆菌和伯克霍尔德杆菌属之类的各种革兰氏阴性病原体具有活性(LiPuma等人，“In vitro activities of a novel nanoemulsion against Burkholderia and other multidrug-resistant cystic fibrosis-associated bacterial species，”Antimicrob.Agents Chemother.，53：249-255(2009))，所述纳米乳剂在囊性纤维化患者的吸入治疗/维持方面有用。此外，所述纳米乳剂在治疗烧伤创面以预防/治疗本文所述的病原体的感染方面有用。
实施例8
本实施例的目的是测定示范性的纳米乳剂(P4075EC)以及平行的对比药物对患有囊性纤维化(CF)的患者中的绿脓杆菌、新洋葱伯克霍尔德杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌的临床分离株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
MIC和MBC的结果总结：P4075EC+EDTA的MIC范围分别为＜4-16，＜4-64，2-8，＜1-16μg CPC/ml。向含有纳米乳剂的每个孔中加入5mM EDTA改善对假单胞菌属和伯克霍尔德杆菌属的MIC并且向含有纳米乳剂的每个孔中加入1mM EDTA来改善不动杆菌属和寡养单胞菌属的MIC。获得了纳米乳剂+EDTA对20种假单胞菌属、10种伯克霍尔德杆菌属、10种不动杆菌属和11种寡养单胞菌属的MBC。对于测试的三种细菌属而言，数据表明了杀菌活性。对寡养单胞菌属的MBC在各自的MIC的4倍范围内，与纳米乳剂具有杀菌活性一致。
协同作用结果的总结：除了标准化MIC和MBC测定之外，进行棋盘协同研究以评估P4075EC+EDTA与通常用于治疗囊性纤维化患者的传统杀菌剂的协同或拮抗作用的效力。测定部分抑菌浓度(FIC)指数和部分杀菌浓度(FBC)指数以判断两种药物组合是否是协同的、拮抗的或彼此无相互作用。当P4075EC+EDTA与粘菌素或托普霉素(用于治疗CF患者的肺部的慢性肺感染的两种传统抗菌剂)中的任一种联合时，对10种伯克霍尔德杆菌菌株、10种寡养单胞菌菌株和10种不动杆菌菌株进行测定以确定MIC的变化。发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合对90％(根据FIC)和70％(根据FBC)的寡养单胞菌菌株是协同作用，但是当与托普霉素联合时，无相互作用，仅仅对20％(根据FIC)和0％(根据FBC)是协同作用。对于不动杆菌菌株而言，发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合时，无相互作用，仅仅对20％(根据FIC)和0％(根据FBC)是协同作用，并且当与托普霉素联合时，仅仅对10％(根据FIC)和10％协同(根据FBC)是协同作用。对于伯克霍尔德杆菌菌株而言，发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合时，无相互作用，仅仅对30％(根据FIC)和10％(根据FBC)是协同作用，但是当与托普霉素联合时，对50％(根据FIC)和20％(根据FBC)是协同作用。
A.材料和方法
本实施例测试了从CF患者分离的多抗药性革兰氏阴性菌。使用CLSI指南和标准方法M7-A7和M100-S17测定了MIC和MBC。基于菌属，在存在1mM或5mM EDTA(NE活性的渗透促进剂)的条件下测定MIC。寡养单胞菌属和不动杆菌属具有纳米乳剂+1mM EDTA。假单胞菌属和伯克霍尔德杆菌属具有纳米乳剂+5mM EDTA。这是标准MIC和MBC测定和下面待描述的棋盘协同工作和时间杀死研究过程的情况。加入响应代谢活性产生比色变化的氧化还原指示剂阿尔玛蓝用于测定NE(P4075EC)的MIC，因为在较高浓度NE为透明。
通过使用采集的MIC和MBC数据，具有P4075EC+EDTA和粘菌素的组合或P4075EC+EDTA和托普霉素的组合的微量滴定板来进行棋盘协同研究。
部分抑菌浓度(FIC)指数(参见，例如，图19)测定了当与另一药物联合时的单一药物的MIC与单独的该药物的MIC的比值。当药物联合时，MIC减小导致比值小于1。
X＝联合时的药物的MIC/单独的药物的MIC
计算了药物A和药物B的比值。将分数加在一起。将总和与如下范围进行比较：
协同作用：两种药物的FIC之和＜0.5；
无相互作用：两种药物的FIC之和＞0.5至＜4；
拮抗作用：两种药物的FIC之和＞4。
在图19A中，D列代表用于选择联合的两种药物的侧翼区浓度的先前测定的MIC。在图19B中，X和Y轴上的水平的斜线标记表示单独的每种药物的典型MIC浓度。
经过了包括未处理的对照的0分钟在内的10分钟、20分钟、30分钟的短暂的时间曲线进行了时间杀死研究，该研究在电子显微镜下进行固定样本拍照。
B.分离株的来源
评价了46种分离株，所有分离株来自University of Maryland-Baltimore School of Dentistry。接受的分离株如下：20种假单胞菌、11种伯克霍尔德杆菌、10种不动杆菌和5种寡养单胞菌。绿脓杆菌分离株已定义了已在许多CF患者中记录的脂质A变体。寡养单胞菌的10种额外的分离株来自第二来源(Eurofins，Virginia)。这10种分离株在列表的最后并且写明了获取这10种分离株的样本个体的年龄。分离株在下表14中予以总结。
Figure BPA00001374059101431
Figure BPA00001374059101451
C.药物来源
在药物样板中使用的药物及其来源在下表中予以总结。
表15：在药物样板中使用的药物
  成分   制造商   编号#
  头孢平   USP   H0G278
  粘菌素   USP   G-1
  亚胺培南   USP   H0E040
  左氧氟沙星   Sigma   1333515
  头孢他啶   USP   H
  托普霉素   USP   L0E077
  头孢西丁(Ceftoxin)   USP   J0E038
  哌拉西林   USP   H
  P407-5EC   NanoBio   X1138和X1180
P4075EC的组合物在下表16中提供。通过将水不可混溶的油相与水相混合来生产乳剂。基本配方如下并表示纯乳剂，所述纯乳剂进一步稀释至期望的百分含量(％)。
表16
编号#A0499
纯P4075EC
  成分   w/w％
  无菌蒸馏水   23.49
  CPC   1.068
 泊罗沙姆407   5.92
 乙醇   6.73
 大豆油   62.79
D.药物制剂的浓度
药物制剂浓度在下表17和表18中描述。具体而言，表17提供关于96孔药物样板制剂的细节，表18提供关于96孔棋盘协同平板的细节。
Figure BPA00001374059101461
Figure BPA00001374059101472
Figure BPA00001374059101481
Figure BPA00001374059101482
E.MIC和MBC的测定
在96孔微量滴定板中，在35℃孵育20小时后观察接种的孔。在每列中，各列从左至右药物浓度从高到低，每个孔的浓度是其左边相邻孔的浓度的1/2。该系列中，第一次出现澄清的孔被称为MIC。这是根据肉汤浊度转变的抑制细菌生长的药物浓度。因为纳米乳剂本身的浊度，将阿尔玛蓝(CellTiter Blue，Promega)以20μL至100μL培养液体积的速度加入含有纳米乳剂的列中。将平板放入孵育箱中持续1小时，第一个蓝色的孔被称为MIC(在较低浓度的纳米乳剂条件下具有细菌生长的孔转变为粉色)。每个孔中的起始接种体通常为2x105cfu/mL至7x105cfu/mL。通过对在建立微量滴定平板时用于接种微量滴定平板的接种体进行采样，测定每个测试平板的起始接种体的具体浓度。细菌的确切浓度用于测定每个测试平板的样板中每种药物的MBC。MBC被定义为使细菌数降低了99.9％的药物浓度。MIC是标志，该标志用于从MIC加左边的四个孔开始采样10μL/孔并放置于琼脂平板上(一个样品/平板)。将琼脂平板在35℃下孵育24小时并进行集落计数。将得到的集落计数与接种体起始浓度进行比较以确定哪个孔(哪个药物浓度)导致cfu/ml下降3log。
F.棋盘协同作用研究
每个孔中的起始接种体通常为2x105cfu/mL至7x105cfu/mL。通过对在建立微量滴定平板时用于接种微量滴定平板的接种体进行采样，测定每个测试平板的起始接种体的具体浓度。细菌的确切浓度用于测定每个测试平板的样板中每种药物的MBC。MBC被定义为使细菌数降低了99.9％的药物浓度，该浓度为细菌原始浓度降低了3log。MIC是标志，该标志用于从MIC加直至右边的栏11的所有孔开始采样10μL/孔并放置于琼脂平板上(一个样品/平板)。将琼脂平板在35℃下孵育24小时并进行集落计数。得到的集落计数与接种体起始浓度比较以确定哪个孔(哪个药物浓度)导致cfu/ml下降3log。
在96孔微量滴定板中，在35℃下孵育20小时后观察接种的孔。在每列中，各列从左至右药物浓度从高到低，每个孔的浓度使其左边相邻孔的浓度的1/2。通常，但不是总是，所述列含有纳米乳剂，药物A。在栏中上下起伏的是药物B，药物B是在测试中联合的第二药物，其从A至G分别从高到低。第H列不含第二药物，该列作为药物A的对照。第1栏不含任何药物A，使得第1栏可为药物B的对照。通常，在该系列中在各列中从右至左第一个澄清的孔称为MIC。这是根据肉汤浊度转变的抑制细菌生长的药物浓度，由于使用了阿尔玛蓝以发现代谢活性，在通过从蓝色变为粉色来指示的情况下来定义MIC。向每个孔中加入20μL来自Promega的CellTiter Blue。那是原始培养液体积的20％。
标注每列具有MIC的孔和具有MBC的孔。标注了两种药物联合的MIC的所有孔与药物A和药物B单独起作用的MIC浓度进行比较。例如，含有2μg/mL的药物A和8μg/mL的药物B的孔当联合时可具有的A的浓度为1μg/mL，当单独起作用时，所述孔可具有的A的浓度为2μg/mL除以16μg/mL。这得到比值0.125。进一步地，在该实施例中，8μg/mL的药物B当单独起作用时除以32μg/mL。药物B结合与单独起作用的比值为0.25。在该实施例中，药物A的FIC指数为0.125，药物B的FIC指数为0.25，在该实施例中总和为0.325。协同作用的定义为总和等于0.5或更小。无相互作用是大于0.5至小于或等于4。拮抗作用是大于4。参见，例如，图19详细举例说明。
G.时间-杀死研究
制备伯克霍尔德杆菌NB 29@O.D.0.14-0.20的细菌悬浮液。在盐水管中，将500μL盐水和500μL细菌悬浮液混合T0(未处理的对照)，然后逐个地与具有5mM CaCl2的TA(Trypton-Azolectin)肉汤混合并如下所述来进行平板种植。在处理管中，逐个地将细菌悬浮液加至处理混合物中(64μg/mL CPC的2xP4075EC和10mM EDTA)并在10分钟、20分钟和30分钟后在每个时间点取出400μL并与400μL具有5mM CaCl2的TA肉汤混合。接下来，取出100μL以在盐水中连续稀释1/10至10-8。然后，在该系列中，从每个稀释液管中取出100μL并以一式三份平板种植。将这些种植物在35℃条件下孵育过夜并在每个时间点计数以确定cfu/mL。同时，将未处理和处理的细菌样本加至中和的TA溶液中，在每个各自的时间点将450μL样品加至113μL戊二醛中。
H.扫描电子显微镜(SEM)
对于扫描电子显微镜(SEM)而言，将pH7.4的Sorenson缓冲液中的113μl的戊二醛的10％的水溶液与450μL细菌悬浮液混合，所述细菌悬浮液经过暴露于纳米乳剂。将混合物涡旋震荡并置于4℃持续18小时。表19提供了固定样品和对样品进行染色用于扫描电子显微镜的步骤。
表19：固定样品以及对样品染色用于SEM的方法
步骤
1 将样品固定在2.5％戊二醛的pH 7.4的Sorenson缓冲液中，然后在每个步骤时，在旋转搅拌器上搅拌
2 将样品冲洗两次持续15分钟，每次在0.1 Sorenson缓冲液中
3 将样品固定在1.0％OsO4的Sorensen缓冲液中
4 将样品冲洗两次持续5分钟，每次在0.1M Sorenson缓冲液中
5 样品脱水15分钟，每次脱水在下列溶液中的每一个中：30％EtOH，50％EtOH，70％EtOH，90％EtOH，100％EtOH，100％EtOH
6 将样品进入六甲基二硅氮烷(HMDS)中，15分钟更换一次六甲基二硅氮烷
7 在第四次更换HMDS之后，取出样品，用刚好能覆盖组织的HMDS来替换样品。让样品在通风橱中蒸发过夜。
8 使用胶体石墨和硝化纤维素胶泥的混合物将样品安装在SEM桩上，
9 将样品置于真空干燥器中过夜
10 使用“Polaron”喷溅镀膜机将金喷溅涂覆在样品上
11 在“Amray 1910 FE”扫描电子显微镜上检查样品并使用“Xstream”成像软件进行数码成像
I.结果
a.MIC和MBC数据
P4075EC的MIC90/MBC90值为8/64μg/mL(绿脓杆菌)、64/＞514μg/mL(新洋葱伯克霍尔德杆菌)、8/64μg/mL(鲍曼不动杆菌)和8/32μg/mL(嗜麦芽寡养单胞菌)。粘菌素的MIC90/MBC90值分别为2/8μg/mL(绿脓杆菌)、＞32/＞32μg/mL(新洋葱伯克霍尔德杆菌)、1/＞16μg/mL(鲍曼不动杆菌)和＞32/＞32μg/mL(嗜麦芽寡养单胞菌)。头孢平、亚胺培南、左氧氟沙星和托普霉素对所有菌株的MIC90/MBC90值分别为≥32/＞32、≥32/＞32、16/16和＞32/＞32μg/mL。
b.协同数据
测试了10种伯克霍尔德杆菌和寡养单胞菌菌株以及10种不动杆菌菌株以确定当P4075EC+EDTA与粘菌素或托普霉素(在治疗CF患者肺部的慢性肺部感染中使用的两种传统药物)中的任一个联合时，MIC的移动。发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合对90％(根据FIC)和70％(根据FBC)的寡养单胞菌菌株是协同作用，但是当与托普霉素结合时，无相互作用，仅仅对20％(根据FIC)和0％(根据FBC)为协同作用。对于不动杆菌菌株而言，发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合时，无相互作用，仅仅对20％(根据FIC)和0％(根据FBC)为协同作用，并且与托普霉素联合时，仅仅对10％(根据FIC)和10％(根据FBC)为协同作用。对于伯克霍尔德杆菌菌株而言，发现P4075EC+EDTA与粘菌素联合时，无相互作用，仅仅对30％(根据FIC)和10％(根据FBC)为协同作用，但是当与托普霉素联合时，对50％(根据FIC)和20％(根据FBC)为协同作用。
c.时间-杀死研究
时间-杀死导致从未处理的开始时间点至30分钟时间点cfu/ml总共降低了4.44log。每10分钟时间点具有1log至2log的降低，如下：从未处理至10分钟时间点降低了1.40log，从10分钟时间点至20分钟时间点降低了1.91log并且从20分钟时间点至30分钟时间点降低了1.13log。参见图20A至图20D。
Figure BPA00001374059101531
Figure BPA00001374059101541
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Figure BPA00001374059101641
Figure BPA00001374059101661
J.总结
本实施例说明了诸如所测试的P4075EC之类的纳米乳剂对多抗药性的菌株有效，所述菌株包括伯克霍尔德杆菌和寡养单胞菌的耐粘菌素分离株。未描述假单胞菌属种中的脂质A变体对P4075EC的MIC/MBC的影响。没有观察到两种主要的抗生素(粘菌素和托普霉素)的拮抗作用的迹象，寡养单胞菌的情况下观察到协同作用是明显的。这是有价值的，因为治疗患有CF的患者不需要为了使用纳米乳剂而暂停他们的普通抗生素治疗方案，这使得治疗方案复杂。SEM图像表明接触杀死机制，在这种情况下革兰氏阴性菌具有坚硬的外膜。
实施例9
局部纳米乳剂治疗降低了细菌创面感染和烧伤后的炎症
材料和方法
试剂。除非另有说明，所有试剂购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)。
动物。在所有试验中使用重量大约为250g至300g的、雄性特异性无病原体Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)。将大鼠关在标准笼子中，并在用于试验之前，让大鼠习惯它们周围的新环境持续7天。保持12小时光照周期并且在整个研究过程中无限制地提供标准大鼠饲料和水。根据用于护理和使用动物的国家研究所的健康指南来进行试验。从University of Michigan Animal Care and Use Committee获得批准的试验规程。
烧伤模型。腹膜内(ip)注射40mg/kg戊巴比妥钠(Nembutal；Abbott Laboratories，North Chicago，IL)来麻醉动物。紧紧夹住背部毛并使用Nair脱毛霜(Church & Dwight Inc.，Princeton，NJ)来除毛，使得完全并均匀地除去毛。将每只大鼠置于隔热的、定制的模具中，每只大鼠暴露超过全身表面积20％的背部区域。使用Meeh’s公式来确定烧伤表面积作为全身表面积的分数：身体表面积(cm2)＝9.46x(动物重量g)2/3(参见Gilpin，Burns 22(8)：607-611，1996)。通过将大鼠暴露的皮肤置于60℃的水浴中持续27秒来达到部分皮层烫伤烧伤。假烧伤动物接受相同的治疗，除了将其浸入室温(21℃至24℃)的水中。用干的无菌且浸泡了0.9％无菌NaCl的纱布对烧伤创面进行擦洗-清创。以4mL林格氏乳酸盐/％总身体表面积烧伤/kg体重来使每只动物苏醒。腹膜内给予一半体积的这种液体并将一半体积的这种液体在烧伤之后立即皮下给予。不覆盖烧伤损伤的皮肤以使其风干。干燥后，应用无菌TELFA(Kendall Co.，Tyco Healthcare Group LP，Mansfield，MA)和TEGADERM HP(3M Health Care，St Paul，MN)的封闭性敷料来预防创面污染。在试验过程中，将每只大鼠单独关起来并且每只大鼠在烧伤时和在16小时皮下接受0.01mg/kg的丁丙诺菲用于烧伤后控制疼痛。
局部创面治疗。从NanoBio公司(Ann Arbor，MI)获得W205GBA2ED的纳米乳剂原液。该纳米乳剂通过用本文所述的表面活性剂和醇乳化超精炼的大豆油和水来制造。得到的液滴的平均颗粒直径为350nm。通过用4.88mL无菌盐水稀释1mL 60％的原液制剂并加入120μL 1M的乙二胺四乙酸(EDTA)来制备试验溶液，得到最终浓度10％的W205GBA2ED和20mM EDTA。以与制备W205GBA2ED相同的方法来制备安慰剂纳米乳剂化合物(W205GBA2ED安慰剂)，但是制剂中省略了苯扎氯铵。5％磺胺米隆(UDL Laboratories，Inc.，Rockford，IL)溶液通过将50g醋酸磺胺米隆粉末与1L 0.9％的无菌盐水混合来制备。所使用的对照试剂是0.9％的无菌盐水。试验组由假烧伤、烧伤、烧伤+W205GBA2ED、烧伤+细菌+盐水、烧伤+细菌+安慰剂、烧伤+细菌+W205GBA2ED和烧伤+细菌+磺胺米隆构成。烧伤损伤之后16小时用吸入的异氟烷来麻醉动物。除去封闭性敷料和TELFA。使用喷雾瓶将纳米乳剂(W205GBA2ED)、安慰剂、磺胺米隆或无菌盐水以均匀的方式施用于烧伤创面。假烧伤组或烧伤组中的动物没有接受局部治疗，但是在麻醉下更换敷料。然后，用TELFA和TEGADERM封闭性敷料缓解烧伤创面。这种治疗和敷料的更换在烧伤后24小时重复。
细菌培养物和接种。人类烧伤患者中的绿脓杆菌分离株先前由密歇根大学病理学系提供。这种细菌分离株对局部药剂磺胺嘧啶银盐和磺胺米隆敏感。通过将在40mL大豆胰蛋白酶肉汤(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中融解等份的细菌接种体(0.5mL，在-80℃下储存于50％脱脂牛奶中)来制备细菌接种体并在37℃、以275rpm持续震荡条件下生长过夜。将得到的固定相培养物样品转移至35mL新鲜大豆胰蛋白酶肉汤中并孵育2.5小时以达到log阶段。将该次培养物转移至50mL圆锥形聚苯乙烯管中并在4℃、880g条件下离心10分钟。用0.9％无菌盐水洗涤细菌小粒并将细菌小粒重悬于10mL冰冷的盐水中。在620nm测量悬浮液的光密度并使用公式OD620x 2.5x 108来计算细菌浓度(集落形成单元(CFU)/mL)。用0.9％无菌盐水稀释细菌悬浮液，最终浓度为1x 106CFU/100μL。烧伤8小时后，用吸入异氟烷来麻醉动物。然后，向大鼠局部施用以均匀的方式滴至一张TELFA上的1x 106CFU的log阶段的绿脓杆菌的100μL无菌盐水，随后用TEGADERM封闭性敷料覆盖。
收集组织。烫伤后32小时宰杀动物并使用无菌技术收集皮肤组织样本。皮肤样本立即使用或在液氮中冷冻。
定量细菌创面感染。将100mg离体皮肤组织片在1mL 0.9NaCl中机械均化。然后，再用9mL无菌盐水稀释均化物。进行连续稀释并将皮肤均化物置于血液琼脂平板上一式三份(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在37℃下孵育培养平板24小时并进行CFU计数。
皮肤细胞因子分析(ELISA)。在由50mLPBS和蛋白酶抑制剂(Complete X，Roche，Indianapolis，IN)以及50μL Triton X(Roche)构成的1mL冰冷的细胞溶解缓冲液中对100mg背部皮肤样本进行均化。在3000g条件下对均化物进行离心持续5分钟并将上清液收集且冷冻保存在-80℃下，待用。使用R&D体系，Inc.(Minneapolis，MN)中的抗体和试剂，通过三明治酶联免疫吸附分析(ELISA)来测量大鼠IL1-β、IL-6、TNF-α、CINC-1、CINC-3、IL-10和TGF-β。根据试剂盒说明书在96孔微平板(Immunoplate Maxisorb，Nunc，Neptune，NJ)中进行分析并使用微平板读数器(Biotek Instruments，Winooski，VT)在450nm处伴随540nm波长校正读取样品。使用平板读数器软件和7点标准曲线来测定细胞因子浓度。调整先前的稀释度结果并表达为pg/mL。
检测嗜中性粒细胞的螯合作用(髓过氧化物酶分析)。在由115mM磷酸二氢钾(Sigma Aldrich，Milwaukee，WI)构成的1mL冰冷的磷酸钾缓冲液中对100mg皮肤组织进行机械均化。在4℃、3000g条件下对均化物进行离心持续10分钟，除去上清液并将小粒重悬于由磷酸氢二钾、十六烷基三甲基溴化铵和醋酸(Sigma Aldrich，Milwaukee，WI)构成的1mL C-TAB缓冲液中。在冰上对悬浮液进行超声处理(Branson Sonifier 250，Danbury，CT)持续40秒。在4℃、3000g条件下对均化物进行离心持续10分钟，并收集上清液。将上清液在60℃水浴中孵育2小时(Shaker Bath，2568；Forma Scientific，Marietta，OH)。将储存于-80℃直至立即需要或分析。
将20μL标准物(Calbiochem，Gibbstown，NJ)或样品加至96孔免疫吸附微平板(NUNC，Rochester，NY)中，随后向每个孔中加入由3，3’，5，5’-四甲基联苯胺/N，N-二甲基甲酰胺构成的、溶于115mM磷酸钾缓冲液(Fischer Scientific，Pittsburgh，PA)中的155μL 20mM TMB/DMF。在孔中混合样品，之后向每个孔中快速加入20μL 3mM H2O2。通过加入50μL/孔的0.061mg/mL过氧化氢酶(Roche，Indianapolis，IN)来立即停止反应。在620nm使用微平板读数器读取平板。使用线性标准曲线来计算髓过氧化物酶(MPO)浓度并调整髓过氧化物酶(MPO)浓度的先前稀释度。最终浓度表达为μg/mL。
测定真皮毛细血管渗漏和组织水肿(伊文思蓝)。在收集组织之前90分钟麻醉动物。在烫伤后30.5小时向烧伤的动物腹膜内注射50mg/kg体重的10％的伊文思蓝(Merck KgaA，Darmstadt，Germany)。在收集组织的时间点，通过下腔静脉切口对动物进行抽血。通过将20G血管造影术导管(angiocatheter)插入左心室顶端，穿过主动脉瓣并进入升主动脉来冲洗依文思蓝。总共血液体积(7.46mL/100g体重)四倍的、具有100单位/mL肝素的0.9NaCl用于通过灌注泵以恒定的流速来冲洗脉管系统以及进行给药。到灌注阶段的末期，右心房中的洗出液已变得澄清。收集背部皮肤样本并将100mg样本置于聚乙烯管中的4mL 99.5％的甲酰胺中。在室温下将管置于振荡器上持续48小时用于萃取伊文思蓝。收集上清液并在620nm在微平板读数器上读取吸光度。通过甲酰胺标准曲线中的伊文思蓝计算浓度。结果表达为mg伊文思蓝/mg皮肤组织。
组织学。在10％缓冲福尔马林中固定皮肤样本并植入石蜡中。将8μm厚的部分粘附于载玻片上，去掉石蜡并用苏木精和曙红染色以评价形态变化。
检测毛囊细胞凋亡(TUNEL分析)。麻醉动物，并使动物产生20％部分皮层烫伤烧伤创面或假损伤。治疗组由假损伤、烧伤+盐水、烧伤+安慰剂和烧伤+W205GBA2ED组成。在烧伤后0小时和8小时进行治疗和更换敷料。在该实验中没有产生细菌感染。在烫伤后12小时和24小时从整个烧伤创面的三个位置取全层皮肤样本用于测定毛囊细胞凋亡。4个动物/治疗组/时间样本。
使用末端去氧核苷酸转移酶dUTP原位末端标记(TUNEL)分析(ApopTag，CHEMICON International，Inc，Temecula，CA)，使用DNA链断裂的荧光标记物原位检测凋亡。将每个动物的三个新鲜皮肤样本置于用最佳切割温度复合物(Sakura Finetek，U.S.A.，Inc.，Torrance，CA)填充的一次性乙烯基接切片小杯(vinyl cryomolds)中，并在-80℃下冷冻，待用。在低温恒温器中，将冷冻的植入皮肤样本切成4mm厚的连续切片，并收集在Superfrost Plus玻璃载玻片上(Fisher Scientific，Pittsburgh，PN)。根据制造商的说明书，在4℃，将皮肤样品部分固定在PBS中的1％的仲甲醛中过夜用于间接免疫荧光。用PBS洗涤2次后，将皮肤样本部分在-20℃条件下后固定在2∶1的乙醇∶乙酸溶液中持续5分钟。再用PBS洗涤两次之后，在平衡缓冲液中孵育皮肤样本部分5分钟。然后，将皮肤样本部分在37℃在潮湿的腔室中用末端去氧核苷酸转移酶孵育1小时。在终止/冲洗缓冲液中，通过冲洗皮肤样本部分来停止反应。在室温下，在潮湿的腔室中，用抗异羟基洋地黄毒苷荧光素(荧光素异硫氰酸酯，FITC)孵育皮肤样本部分30分钟并在PBS中冲洗3次。抽吸之后，用水洗涤皮肤样本部分一次并使用ProLong Gold Antifade(Molecular Probes，Inc，Eugene，OR)来应用盖玻片，其中包括4′6-二脒基-2-苯基吲哚二氢氯化物(DAPI)复染色。
TUNEL分析载玻片进行单盲分组，在显微镜下识别在随机选择的高倍视野中的合适的毛囊细胞。用于分析的合适的毛囊是以中等径向或中等冠状平面切割的那些毛囊。从存在于载玻片上的三个皮肤样本中选取总共3至6个毛囊。在标记以控制荧光褪色之后的相等时间，在固定的图像采集环境和40倍放大条件下用Olympus BX-51荧光显微镜数码采集荧光标记的TUNEL载玻片。对每个毛囊进行选择并使用DAPI激发/发射通道，通过使存在的复染色的细胞核显像进行第一次数码采集。然后，分析每个毛囊，改变激发/滤过通道以使得荧光标记的TUNEL阳性细胞显像，再次进行数码图像采集。在采集的图像内，通过数字来界定感兴趣的区域(ROI)，设置为包括仅仅毛囊细胞并排除了亮色发荧光的毛干和周围细胞(NIH Image J software，NIH，Bethesda，Md)。对TUNEL阳性细胞的荧光进行定量，标准化为ROI尺寸并表达为像素/面积分数，控制ROI尺寸之间的差异。
统计方法。使用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Software，La Jolla，CA)进行统计分析和绘图。除非另有说明，结果表达为平均值±SEM。使用非配对双尾Student的t测试和/或单向方差分析(ANOVA)来分析连续变量，随后，进行Tukeys测试后比较。具有Dunn多步比较的Kruskal-Wallis测试用于评估具有非参数分布的数据的中值的差异。使用Fisher精密测试来比较离散变量。统计学显著性定义为p值＜0.05。
局部施用纳米乳剂降低了烧伤创面中的绿脓杆菌的生长
当与盐水处理的对照组相比时，用纳米乳剂处理的动物的细菌/g皮肤组织的CFU的平均数(6.5x104vs.7.9x107，p＝0.07)和中值(0vs.4.4x106，p＜0.05)降低(参见图21)。发现与用W205GBA2ED安慰剂处理的动物相比，用W205GBA2ED处理的动物的皮肤细菌计数有类似的降低(平均：6.5x104vs.5.5x106，p＝0.02)。当对临床组织样本上的创面培养物进行定量时，通常认为阳性结果是生物体的生长大于1x105CFU/g组织(参见，例如，Neal等人，J Burn Care Rehabil 2：35-39，1981；Taddonio等人，Burns Incl Therm Inj 14(3)：180-184，1988；Uppal等人，Burns 33(4)：460-463，2007)。使用这些标准，对照组中32只动物中的29只表现出阳性定量创面培养物的现象，在纳米乳剂组中23只动物中仅仅3只表明了这种水平的创面感染的证据(91％vs.13％，p＜0.0001，参见下表24)。当与盐水对照组相比时，磺胺米隆处理的动物也表现出创面细菌水平的平均值显著降低(3x104vs.4.4x106，p＜0.05)。当与盐水处理的动物相比时，用纳米乳剂或磺胺米隆处理使烧伤创面中培养的假单胞菌的水平产生类似的降低。然而，安慰剂与磺胺米隆之间没有统计学上的显著差异，而与W205GBA2ED安慰剂比较，W205GBA2ED组具有差异。
表24.定量创面培养结果
Figure BPA00001374059101741
*p＜0.05vs.盐水对照，Fishers精密测试
烧伤之后纳米乳剂处理降低真皮促炎细胞因子水平
与假损伤动物相比，损伤后32小时获得的皮肤均化物中，导致部分皮层烧伤的烫伤产生IL-1β和细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化剂-3(CINC-3)的不同的真皮水平(参见图22A和图22E)。在烧伤后16小时和24小时，在不存在细菌感染的情况下，用W205GBA2ED处理使这两种炎症介导物的真皮水平降低到基线(假烧伤)水平。在没有建立细菌创面感染的实验中，没有发现通过髓过氧化物酶分析测量的嗜中性粒细胞螯合作用的差异，虽然在烧伤的皮肤中大鼠CXC趋化因子CINC-3上升。发现所有三组(假烧伤、烧伤和烧伤+W205GBA2ED)的CINC-1不同(p＝0.04，ANOVA)，然而，没有研究各组之间的值的统计学显著性。
烧伤创面用绿脓杆菌感染后纳米乳剂处理降低了真皮细胞因子水平并导致嗜中性粒细胞螯合作用降低
纳米乳剂处理组的皮肤均化物的IL-1β和IL-6的水平与在盐水处理的动物中测量的水平相比显著降低(参见图23A和图23B)。没有观察到两个实验组的动物的TNF-α水平在统计学上有显著差异(参见图22C和22D)。当与对照比较时，用磺胺米隆处理感染的烧伤创面没有导致测量的促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、CINC-1或CINC-3)的真皮水平的任何显著改变。烧伤后32小时发现用W205GBA2ED或磺胺米隆处理降低了髓过氧化物酶的水平。因此，在一些实施方式中，在部分皮层烧伤创面中，用纳米乳剂和/或抗菌剂处理降低了嗜中性粒细胞螯合作用的水平。
烧伤导致抗炎细胞因子TGF-β的水平上升，但是当与假烧伤动物相比时IL-10的水平没有上升(参见图24)。与在单独的烧伤创面中发现的水平相比，W205GBA2ED处理降低了存在于感染的烧伤创面中的TGF-β的量。因此，在一些实施方式中，本发明提供了W205GBA2ED可用于降低急性烧伤创面真皮炎症，并且在进一步的实施方式中，W205GBA2ED可用于降低由烫伤产生的最终免疫抑制。
在盐水对照动物的皮肤的组织学检查方面，损失了表皮下区域中的大多数表皮和弥散性细胞浸润，延伸进入由渗入的白血球和水肿液分离的胶原纤维中的较低的真皮结缔组织中(参见图25A)。在较大的力量下，胶原束之间的细胞浸润构成几乎整个嗜中性粒细胞。水肿液导致胶原纤维分离。在图25B中，皮肤烫伤后，应用绿脓杆菌，之后将纳米乳剂局部施用于烧伤区域。表皮的角质层分离并且一些角质已经损失。几乎没有检测到真皮内存在的嗜中性粒细胞和粘附于小静脉壁的嗜中性粒细胞，所述小静脉壁已经纵向分离(在显微照片的中心)。该显微照片的变化远不及图25A中所看到的变化。
毛细血管渗漏和组织水肿的定量
烧伤创面与毛细血管渗漏的显著水平有关。这可导致血管内体积耗尽并且需要大量静脉内晶体液给药。为了评价用纳米乳剂治疗是否降低毛细血管渗漏并减少炎症，伊文思蓝用于测量血管渗透性。该染色剂被血流过滤出来并进入皮肤组织的量的定量测量说明了纳米乳剂治疗的动物具有较少的烧伤后毛细血管渗漏的迹象并且组织水肿小于用盐水处理的对照(参见图26)。
用纳米乳剂处理降低烧伤诱导的毛囊凋亡
烫伤后，在毛囊细胞中发生真皮细胞凋亡。使用荧光标记的TUNEL分析，用盐水处理的烧伤创面显示出强烈的FITC-TUNEL阳性细胞的迹象，表现出绿色(参见图27)。DAPI核染色使用了细胞染色蓝色使冠状分离的毛囊和径向分离的毛囊得以识别。FITC-TUNEL阳性细胞表现出绿色并且代表凋亡的细胞。在合并的图像中，来自烧伤+盐水处理动物的载玻片中凋亡的毛囊细胞明显并且在烧伤+W205GBA2ED处理的动物中这些变化消失。在感兴趣的毛囊区域中的TUNEL阳性细胞的像素计数允许对通过用局部纳米乳剂治疗的毛囊细胞凋亡的降低进行定量(参见图28)。当与假烧伤动物比较时，盐水处理的对照动物的TUNEL阳性细胞的量增加。烫伤后12小时收集的组织中，W205GBA2ED和安慰剂处理导致部分皮层烧伤后毛囊细胞凋亡降低。在烧伤后24小时收集的真皮皮肤中这种差异不明显。因此，在一些实施方式中，本发明提供在烧伤后早期降低毛囊中凋亡细胞死亡的方法，所述方法包括烧伤后早期将纳米乳剂(例如，W205GBA2ED)施用于烧伤创面。
实施例10
含有纳米乳剂和伯克霍尔德杆菌免疫原的免疫原性组合物和在受治者中诱导对伯克霍尔德杆菌的保护免疫性的方法
材料和方法
新洋葱伯克霍尔德杆菌菌株K56-2原代保存物和培养物。新洋葱伯克霍尔德杆菌菌株K56-2由Pam Sokol博士(University of Calgary)慷慨提供。K56-2是临床分离株并且已用于伯克霍尔德杆菌分子微生物学和基因组研究(参见，例如，Goldberg，2007 Burkholderia Molecular Microbiology and Genomics.Gent，Belgium：Taylor & Francis)。K56-2代表了可传播的且有毒的新洋葱伯克霍尔德杆菌ET12谱系(参见，例如，Johnson等人，1994，J Clin Microbiol 32，924-930；Saijan等人，2008，Infect Immun 76，5447-5455)。Burkholderia multivorans ATCC 17616用于交叉菌株中和分析。K56-2和ATCC 17616菌株储存于-80℃具有15％甘油的Luria-Bertani肉汤中，并且在37℃下，在脑心浸液琼脂上过夜从冷冻的原代中复苏。
新洋葱伯克霍尔德杆菌外膜蛋白(OMP)制剂。将脑心浸液培养基中的K56-2的过夜培养物在3500rpm下离心20分钟。用PBS(pH 7.4)洗涤细胞小粒几次，重悬于PBS(pH 8.0)中的1mM EDTA中，然后在室温下孵育30分钟。孵育后，使用高压使细菌穿过26-gauge针(Becton Dickinson)若干次。实现细胞溶解并加入Triton X-100(Sigma)至最终浓度为2％并在室温下孵育10分钟。使用多次超声处理(每次1分钟)的方法来进行机械分离。然后，将超声处理的细胞溶解物在6000x g(Bechman Optima XL-100k离心器，25℃)下离心两次持续10分钟，每次离心旋转后保留上清液。在第二次离心后，在4℃、100,000x g条件下，将上清液离心1小时。得到的小粒重悬于无内毒素的PBS中。根据制造商的说明书，用去除了内毒素的柱(Pierce)纯化粗OMP制剂(去除内毒素的OMP)。流过部分储存于-80℃，待用。
OMP分析。OMP制剂中所包含的蛋白质使用BCA分析(Pierce)来定量。如先前所描述的(参见，例如，Makidon等人，2008，PLoS ONE 3，e2954)，根据已建立的规程进行Western印迹和银染色。为了进行内毒素污染定量，使用LAL Kinetic-QCL(Lonza)进行OMP分析。在去除内毒素的OMP制剂中检测到内毒素为1.93内毒素单元/mg。通过琼脂糖-EtBr凝胶电泳来检查DNA污染物的除去并在UV表中进行合并(参见图29A)。在粗OMP或去除内毒素的OMP制剂中没有检测到寡聚核苷酸污染物。
OMP序列和确认。
样品制备。通过SDS-PAGE来分离蛋白质样本(参见图29B)。切除western印迹中(参见图29C)用最高密度(约17KDa)免疫染色的蛋白质带并进行胶内酶切。胶内酶切根据Rosenfeld等人和Hellman等人的规程(参见，例如，Hellman等人，1995，Analytical Biochemistry 224，451-455；Rosenfeld等人，1992，Analytical Biochemistry 203，173-179)，在密歇根大学的Protein Structure Facility进行。平行分析了含有5ρmol牛血清白蛋白(BSA)的凝胶切片作为阳性对照。
质谱。在装配有纳米喷雾源(Waters Inc.)的Q-tof第一质谱(Waters Inc)上进行HPLC-电喷雾电离(ESI)串联质谱(MS/MS)。将质谱校准为质量精确度在3ppm之内。使用具有Atlantis C18柱(Waters，内径100-mm，长度100-mm，粒度3-mm)的Waters UPLC系统进行在线校准HPLC。在装载至Atlantis柱上之前使用在线捕集柱(Waters，对称C18，内径180-mm，长度20-mm，粒度5-mm)除去消化液中的盐分。数据依赖串联质谱法用于识别肽，其中使用全扫描谱(全谱扫描)，之后全谱扫描中的所有离子的碰撞诱导的解离(CID)质谱与峰密度上升大于20计数/秒。在V+模式中，在具有锁定质量校正(lockmass correction，Gu-Fibrinopeptide B，(M+H)2+：785.8426)和充电状态峰选择(2+、3+和4+)的50-2000Da的质量范围内获得全谱扫描。通过充电状态识别，用碰撞能量控制获得MS/MS扫描持续5秒。
数据分析和生物信息学。使用Mass Lynx软件(4.1版本)获得串联质谱。使用Protein Lynx Global Server软件4.25版本(Waters Inc.)对原始数据文件进行处理用于锁定质量校正、噪音降低、集中、分离同位素(deisotoping)。使用Protein Lynx Global Server和Mascot(Matrix Science Inc.，Boston，MA)搜索引擎，Swiss Prot和NCBI数据库，以及从Sanger研究所网页上下载的新洋葱伯克霍尔德杆菌数据库对含有碎片质谱的产生的峰列表文件进行数据库检索。
制备基于OMP的纳米乳剂(OMP-NE)的疫苗。由NanoBio公司(Ann Arbor，MI)提供纳米乳剂(W805EC：5体积％的吐温80，8体积％的乙醇，1体积的CPC，64体积％的大豆油和22体积％的DiH2O)，液滴的颗粒直径为200nm至400nm。OMP-NE制剂通过将去除内毒素的OMP制剂(参见图29B，图标F)与浓缩的NE剧烈混合使用PBS作为稀释剂来制备。对于鼻内免疫而言，OMP-NE被配制为含有在20％(v/v)NE中混合的0.25μg/μL或0.75μg/μLOMP。
动物和免疫步骤。从Charles River实验室购买无病原体、非近亲繁殖的CD-1小鼠(雌性，6-8周)。根据实验室动物护理美国协会认证(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)的标准把小鼠关起来。这些小鼠的使用由使用和护理动物的密歇根大学委员会(University of Michigan University Committee on Use and Care of Animals(UCUCA))批准。用任一OMP-NE疫苗的两种给药方式分别免疫小鼠(n＝10/组)四周。使用IMPAC6麻醉递送体系在用异氟烷麻醉的小鼠中进行鼻内(i.n.)免疫。将麻醉的小鼠保持在仰卧位并使用微量加样器的枪头缓慢地向鼻孔施用20μL(10μL/鼻孔)OMP-NE疫苗。用15μg含有NE的OMP、15μgPBS中的OMP、5μg含有NE的OMP或5μg PBS中的OMP中的任一种来免疫小鼠。
静脉切开术、支气管肺泡灌洗和脾细胞收集。在整个研究过程中，每21天，从隐静脉采集血液。安乐死之后立即通过心脏穿刺来获得最终的样本。在凝结之后，在3500rpm(15分钟)下，通过离心进行全血样本分离。血清样本储存在-20℃下，待分析。如所描述的(参见Makidon等人，2008，PLoS ONE 3，e2954)，支气管肺泡灌洗(BAL)液在安乐死之后立即从小鼠中获得。体外细胞因子反应的测量使用免疫的小鼠的脾脏来测定。机械破碎脾脏以获得PBS中的脾细胞的单细胞悬浮液。用ACK缓冲液(150mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA)溶解红血球并通过在PBS中洗涤细胞悬浮液两次来除去红血球。然后，将脾细胞重悬于补充了2％FBS，200nM L-谷氨酸和青霉素/链霉素(100U/mL和100mg/mL)的RPMI 1640培养基中。
酶联免疫吸附分析(ELISA)。通过ELISA测定针对去除内毒素的OMP的血清IgG和粘膜分泌IgA(sIgA)。在涂覆缓冲液(Sigma)中制备OMP为15μg/mL，并且将100μL/孔应用至Polysorb平板(Nunc)用于4℃过夜孵育。在0.1％BSA/PBS中连续稀释血清。然后，将稀释或未稀释的BAL中的任一种加至平板用于在4℃过夜孵育。孵育16小时后，洗涤平板并在0.1％BSA/PBS中以1∶2000或1∶1000添加碱性磷酸酶共轭的抗小鼠IgG(H&L)、IgG1、IgG2a、IgG2b、sIgA(链特异性)(Rockland Immunochemicals，Inc)抗体。根据原始动物水平，在OD405和最终滴定度读取平板。将sIgA的水平标准化至总蛋白质含量。
由血清IgG识别的抗原的分析。除了western印迹分析之外，使用ELISA测量血清中的血清脂蛋白特异性IgG抗体和脂多糖特异性IgG抗体。简言之，用0.05μg/孔的粗OMP制剂、去除内毒素的OMP或LPS(List Biological Laboratories)涂覆96孔Polysorb分析平板(Nunc)。在首次接种疫苗后，从用OMP+NE免疫8周的小鼠中采集血清。在0.1％的BSA/PBS中连续稀释血清，然后，加至涂覆的孔中。如上文所述，进行ELISA步骤。为了评估基于疫苗的OMP中含有的蛋白质和LPS的免疫原性贡献，使用溶于100μl粗OMP制剂或去除内毒素的OMP制剂中的250μgPCR级重组蛋白酶K(Roche)进行酶蛋白消化。用OMP制剂在室温下孵育蛋白酶K持续16小时。使用银染色的SDS-PAGE来确认蛋白消化。使用OMP-NE或PBS中的OMP免疫的小鼠中的血清标记的western印迹分析或使用抗鼻疽假单胞菌LPS抗体(GeneTex)标记的western印迹分析评估LPS和OMP-蛋白特异性表位。
细胞因子表达的分析。将新鲜分离的小鼠脾细胞以4x 106细胞/mL(RPMI 1640，2％FBS)接种在24孔平板上并用OMP(15μg/mL)或PHA-P促细胞分裂剂(2μg/mL)孵育72小时作为对照。根据制造商的说明书，收集细胞培养物上清液并使用LUMINEX多因子分析小珠(multi-analyte profiling beads(LUMINEX Corporation，Austin，TX))分析存在的细胞因子。
测量血清抗体中和作用。使用首次i.n.接种疫苗之后6周的小鼠中采集的血清来分析新洋葱伯克霍尔德杆菌菌株K56-2和B.multivorans菌株ATCC 17616抗体补充中和作用活性。在微量培养平板中(Nunc)，将25μL血清(顺序稀释1x，2x，3x，4x，或5x)加至含有1x103 K56-2的25μL溶液中或含补充了MH培养基的B.multivorans的25μL溶液中。在37℃下孵育平板48小时。对照包括具有25μL无菌1x PBS的25μL血清和含有1x 103细菌的50μL MH培养基。孵育之后，将孔混合并将10μL溶液置于在聚苯乙烯培养平板(Fisherbrand)上的伯克霍尔德杆菌选择性琼脂(BCSA)培养基中(参见，Henry等人，1997，J Clin Microbiol 35，614-619)，然后在37℃下孵育72小时，之后手工进行集落形成单元(cfu)计数。
肺部细菌挑战试验。在首次接种疫苗之后10周，使用所述的洋葱伯克霍尔德杆菌感染的慢性肺部模型的改良版本(参见Bertot等人，2007，Infect Immun 75，2740-2752；Chu等人，2002 Infect Immun 70，2715-2720；Chu等人，2004，Infect Immun 72，6142-6147)，在免疫的小鼠(n＝5/组)或未接种疫苗的对照小鼠(n＝10/组)中进行细菌挑战试验研究。简言之，在麻醉的小鼠中，将悬浮于85μLPBS的5x107K56-2通过延伸至主干支气管的分叉的反式气管导管来灌注。小鼠维持6天的时间。在挑战试验研究之前，小鼠被非手术植入程序可控的温度应答器(IPTT-3000，Bio Medic Data Systems，Inc.)用于手持便携的扫描器(DAS-6002，Bio Medic Data Systems，Inc.)的非侵入性皮下温度测量。生活分析包括通过评估下列标准来检测每个动物的临床状态，所述标准为：体重、体温、食物消耗和活动性。安乐死之后在无菌环境中立即采集肺部组织和脾脏并且将每个器官置于单独的含有1mL 1x PBS(Mediatec Inc.)的容器中。然后，使用Tissue TEAROR(Biospec Products Inc.)在冰上均化组织持续50秒。均化物的连续稀释液(1∶102至1∶108)置于分离的BCSA平板上。然后，将所有平板在37℃下孵育72小时，之后手工cfu计数。安乐死之后立即将全血收集在含有EDTA的管中(BD)。根据制造商的推荐，由密歇根大学的Animal Diagnostic Laboratory，使用HEMAVETH 950血液分析器(Drew Scientific，Inc.)对抗凝结的血液进行处理以测定总外周淋巴细胞和单核淋巴细胞。
统计学。抗体终点滴定结果表达为平均值±平均值(SEM)的标准误差或±标准偏差(SD)。统计学显著性通过ANOVA(方差分析)使用Student t和Fisher精密双尾测试来确定。对于细菌挑战试验研究而言，定殖的分布大大倾斜，因此对数据进行转换(自然对数转换)用于数据标准化。使用具有双侧p-值的独立样本测试，将对应于肺部和脾脏中的标准化的细菌平均值进行比较。认为p＜0.05是统计学上显著的。所有分析用95％置信界限来进行。
免疫反应性蛋白的识别
通过银染色剂(参见图29B)和western印迹法(参见图29C和图29D)识别免疫反应性OMP蛋白。在这两种情况下，主要反应性带记录在62、45、17和10KDa；然而，与用PBS中的OMP制剂(参见图29D)免疫的小鼠的相同血清稀释液标记的印迹法相比较，基于NE的疫苗(参见图29C)免疫的小鼠的血清标记的带的密度高得多。
具有最高密度的带位于约17KDa(参见图29C)。为了识别，将17KDa带从凝胶中分离并通过MALDI-TOF分析来识别。蛋白质被识别为洋葱伯克霍尔德杆菌外膜脂蛋白A(OmpA)，分子量(MW)为16.936KDa(参见，例如，Ortega等人，2005 J Bacteriol 187，1324-1333；Plesa等人，2004，J Med Microbiol 53，389-398)。使用国家中心的生物技术信息(NCBI)的蛋白质BLAST的序列分析确认了这些蛋白质存在于与伯克霍尔德杆菌种类密切相关的其他细菌种类中(参见下表25)。在多种伯克霍尔德杆菌菌株和雷尔民生物体中识别了高度同源性的蛋白(87.9％序列同源性)，并且OmpA家族残基中大量保存的氨基酸存在于17KDa蛋白质序列中(参见表25)。因此，本发明从洋葱伯克霍尔德杆菌中识别并提供免疫反应性OMP蛋白并从表现出与从洋葱伯克霍尔德杆菌中识别的免疫反应性OMP蛋白质高度同源性的伯克霍尔德杆菌相关菌株中识别并提供蛋白质(例如，用于含有纳米乳剂的免疫原性组合物(例如施用于受治者以在受治者中对含有纳米乳剂和免疫反应性OMP蛋白质或同族体的免疫原性组合物产生特异性免疫反应))。
表25.OmpA-样蛋白质家族的蛋白质序列组合
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用OMP-NE鼻内免疫诱导抗OMP特异性抗体
通过OMP鼻部疫苗诱导的对OMP的体液免疫反应在CD-1小鼠内被体内表征。在首次接种疫苗之后，具有5μg或15μg OMP制剂+NE(OMP-NE)的任一种的鼻内接种疫苗导致OMP特异性IgG抗体的高血清滴定度，所述血清滴定度在6周时分别为2.8x 105和5.1x 105(参见图30A)。没有佐剂的OMP是免疫原性的并且在首次i.n.免疫之后六周导致血清抗-OMP IgG滴定度为1.9x 104和3.8x 104。然而，在加强之后的所有时间点，用NE作为佐剂的治疗组的反应显著高于(13至30倍)没有佐剂的组(p＜0.05)。进一步地，在第二次疫苗接种之后，用PBS中的OMP免疫的小鼠不显示出显著的加强效果(参见图30A)。
为了进一步表征OMP-NE疫苗，评估了在支气管分泌物中OMP-NE组合物诱发特异性抗体产量的能力。粘膜抗体产量对于防止伯克霍尔德杆菌定殖是重要的，因为，认为分泌物抗体在防止粘膜呼吸病原体方面起关键效应(参见，例如，Nelson等人，1993，J Med Microbiol 39，39-47)。评估了用5μgOMP-NE或5μg PBS中的OMP免疫的动物的支气管肺泡灌洗(BAL)液中的粘膜免疫反应。在用OMP-NE或无NE佐剂的OMP免疫的小鼠中检测了BAL中的抗OMP抗体的可比较的水平(参见图30B)。
OMP-NE免疫产生平衡的Th1/Th2细胞反应
进行血清IgG子集分析以确定细胞反应的T辅助型倾向。IgG子集分布形式说明了相对于Th2型IgG1子集抗体，用OMP-NE i.n.免疫产生高水平的Th1型IgG2b(p＝0.048)(参见图31A)。比较而言，用PBS中的OMP免疫产生类似水平的IgG1和IgG2b抗体(参见图31A)。
在用OMP-NE首次免疫接种之后6周获得的脾细胞中表征OMP特异性细胞反应。用去除内毒素的OMP刺激细胞，然后，评估特异性细胞因子产量。在从OMP-NE免疫的小鼠中采集的脾细胞中，Th1细胞因子IFN-γ和IL-2产量相对于未免疫的小鼠的脾细胞分别增加了22.1倍和18.6倍(p＝0.01和0.003)(参见图31B)。在用PBS中的OMP免疫的小鼠的脾细胞中同样诱导IFN-γ。在OMP-NE和OMP免疫的小鼠中以相等量最低限度地诱导Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10(增加≤5.22倍)。脾细胞因子表达模式和IgG子集分布模式结果说明平衡的Th1/Th2对应于OMP-NE免疫接种。
指导抗体反应倾向于OMP脂蛋白和LPS
先前已记录了LPS本质上与伯克霍尔德杆菌属OMP制剂有关(参见，例如，Bertot等人，2007，Infect Immun 75，2740-2752)。为了研究免疫反应的特异性并评估在新洋葱伯克霍尔德杆菌OMP制剂中内毒素提高免疫的可能性，使用ELISA，用粗OMP、去除内毒素的OMP或LPS来分析OMP-NE免疫的小鼠中的血清。最高IgG反应性是针对去除内毒素的OMP制剂和粗OMP制剂。统计学分析说明在去除内毒素的OMP中的反应显著高于LPS(OD405＝2.37±0.11(p＝0.001))中的反应并且粗OMP中的反应显著高于LPS(OD405＝1.49±0.14(p＝0.01))中的反应。然而，血清还含有显著高水平的IgG抗LPS抗体(OD405＝0.59±0.05)。
为了明确OMP制剂中内毒素的作用，用蛋白酶K进行粗OMP和去除内毒素的OMP制剂的蛋白水解消化。通过western印迹分析来确定免疫原性表位，将用PBS中的OMP免疫的小鼠产生的血清抗体与用OMP-NE免疫的小鼠中的血清抗体进行比较(参见图32)。结果清楚地说明主要指导抗体反应倾向于OMP制剂中所包含的62KDa和17KDa蛋白质。这通过蛋白质水解消化的OMP制剂中完全不存在蛋白质带来证实(参见图32OMP-NE血清western印迹)。进一步地，当OMP制剂用商用单克隆抗LPS抗体标记时，LPS被检测为OMP制剂的固有部分。然而，蛋白水解消化减弱了LPS检测，但没有完全减弱。总而言之，本发明提供了用OMP-NE鼻部免疫提高特异性抗OMP蛋白质的抗体的产量(参见图32)。
用OMP-NE鼻内免疫接种导致交叉保护中和血清抗体
新洋葱伯克霍尔德杆菌中和抗体使用集落减小分析(colony reduction assay)来测定。用5μg OMP-NE或15μgOMP-NE鼻内免疫的小鼠产生血清中和抗体，相对于未免疫的小鼠中的血清，所述血清中和抗体分别抑制92.5％或98.3％的新洋葱伯克霍尔德杆菌集落(参见图33)。用缺乏佐剂的OMP免疫的小鼠也表现出相对高水平的抑制，导致cfu减小33.3％和46.7％(分别对于5μg和15μg OMP-PBS)。统计分析表明与用单独的OMP制剂免疫的小鼠中的血清相比较，新洋葱伯克霍尔德杆菌生长显著受到源自OMP-NE的血清的抑制(参见图33)。
为了评估OMP-NE是否可从其他细菌菌株产生交叉反应保护，将用15μg OMP-NE免疫的小鼠中的血清与B.multivorans一同孵育。选择B.multivorans是因为它是Bcc生物体感染的CF患者中培养的最常见的分离株(参见，例如，Baldwin等人，2008，J Clin Microbiol 46，290-295)。源自分别用OMP-NE和无佐剂的OMP预防接种的小鼠的血清分别抑制80.1％和49.8％的B.multivorans的生长，这说明在用OMP-NE或PBS中的OMP免疫之后产生明显的交叉保护抗体。用OMP-NE免疫预防肺部新洋葱伯克霍尔德杆菌挑战并降低败血症的发生率
鼻内免疫的保护效果在肺感染模型中进一步进行体内测试。评估了在小鼠的气管内接种后6天肺部组织中新洋葱伯克霍尔德杆菌的清除率，所述小鼠用OMP-NE或无佐剂的OMP进行鼻内免疫。相对于未预防接种的小鼠，用15μgOMP-NE预防接种导致肺部清除速度显著较高(p＝9.2x 10-3)(参见图34A)。第六天，相对于在未预防接种的小鼠中平均肺部细菌负载为1.28x 106±3.36x106cfu/肺部，在用15μgOMP-NE预防接种的小鼠中平均肺部细菌负载为22.5±26.2cfu，这说明细菌负载降低了超过5-log。
评估用新洋葱伯克霍尔德杆菌接种肺部之后脾脏的定殖作为评价败血症的平均值(参见图34B)。用15μgOMP-NE预防接种显著降低了单独的小鼠的肺部挑战试验之后6天的脾脏中的细菌发生率，该发生率从未预防接种的小鼠中的3.54x 103±6.97x 103cfu/脾脏的平均值降低至预防接种的小鼠中的2.5±5cfu/脾脏(p＝0.0307)。
用OMP-NE鼻内免疫缓解了新洋葱伯克霍尔德杆菌感染后的全身性疾病
第6天，相对于用OMP-NE或无佐剂的OMP免疫的小鼠中的温度调节损失，在未预防接种的小鼠中新洋葱伯克霍尔德杆菌感染导致较大的温度调节损失。在用新洋葱伯克霍尔德杆菌感染后6天未预防接种的小鼠中的平均体温(35.4℃±0.7)较用15μgOMP-NE预防接种的小鼠(36.8℃±0.31，p＝0.008)、5μgOMP-NE预防接种的小鼠(37.1℃±0.42，p＝0.008)或无佐剂的5μgOMP预防接种的小鼠(36.8℃±0.61，p＝0.01)的平均体温显著较低。
在宰杀未预防接种的小鼠时确定的未预防接种的小鼠中的总外周白细胞计数显著高于用15μg OMP-NE(p＝0.047)、5μgOMP-NE(p＝0.026)或15μgPBS中的OMP(p＝0.032)预防接种的小鼠中观察到的总外周白细胞计数。未预防接种的小鼠(76.0％)中的多形核白细胞与总外周白细胞的比值也显著高于用15μg OMP-NE(47.7％，p＝0.02)、5μg OMP-NE(45.6％，p＝0.024)或15μg PBS中的OMP(48.7％，p＝0.04)预防接种的小鼠中的多形核白细胞与总外周白细胞的比值(参见下表26)。与上述(参见图39B)脾脏定殖结果结合，本发明提供了用OMP-NE免疫导致新洋葱伯克霍尔德杆菌感染之后全身性疾病显著降低。
表26.多形核白细胞与总外周白细胞的比值
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上面说明书中涉及的所有公开出版物和专利通过引用并入本文。本发明描述的组合物和方法的各种改变和变化在不背离本发明的范围和实质的情况下对于本领域技术人员而言是显而易见的。虽然本发明已与特定的优选实施方式结合来描述，但是应当理解的是要求保护的本发明不应当不恰当地限于这些特定的实施方式。事实上，对于本领域技术人员而言是显而易见的对本发明所描述的模式进行的各种变化意在本发明的范围内。

Claims (32)

1.一种治疗或预防患有囊性纤维化(CF)的受治者中的呼吸道感染的方法，其中：
(a)所述方法包括将纳米乳剂施用于所述受治者；
(b)所述受治者易受或具有一种或一种以上革兰氏阳性或革兰氏阴性菌种感染；
(c)所述纳米乳剂包含：
(i)水；
(ii)至少一种有机溶剂；
(iii)至少一种表面活性剂；和
(iv)至少一种油；以及
(d)其中，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。
2.一种治疗或预防具有烧伤创面的受治者中的感染的方法，其中：
(a)所述方法包括将纳米乳剂施用于所述受治者；
(b)所述受治者易受或具有一种或一种以上革兰氏阳性或革兰氏阴性菌种感染；
(c)所述纳米乳剂包含：
(i)水；
(ii)至少一种有机溶剂；
(iii)至少一种表面活性剂；和
(iv)至少一种油；以及
(d)其中，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。
3.一种治疗或预防受治者中的流感嗜血杆菌感染的方法，其中：
(a)所述方法包括将纳米乳剂施用于患有流感嗜血杆菌感染的受治者或处于患上流感嗜血杆菌感染风险中的受治者；
(b)所述纳米乳剂包含：
(i)水；
(ii)至少一种有机溶剂；
(iii)至少一种表面活性剂；和
(iv)至少一种油；以及
(c)其中，所述纳米乳剂包含平均直径小于约1000nm的液滴。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述呼吸道感染与所述受治者的肺中存在的细菌生物膜有关。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，所述方法还包括将一种或一种以上抗生素在施用所述纳米乳剂之前、之中或之后施用。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述纳米乳剂的施用与至少一种抗生素的施用起协同作用，该协同作用由部分抑菌浓度(FIC)指数、部分杀菌浓度(FBC)指数或其组合来定义。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中，所述抗生素是任何抗生素，例如，多粘菌素抗生素(例如，粘菌素)或任何氨基糖苷(例如，托普霉素)。
8.如权利要求5、6或7任一项所述的方法，其中所述纳米乳剂与抗生素未表现出任何拮抗作用。
9.如权利要求1、2或4-8任一项所述的方法，其中，所述细菌种类选自：葡萄球菌属、嗜血杆菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德杆菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、大肠杆菌属、克雷伯氏菌属和变性杆菌属。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述受治者易受或具有选自下列细菌种类中的一种或一种以上细菌种类感染，所述细菌种类选自：绿脓杆菌、新洋葱伯克霍尔德杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形杆菌。
11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂表现出最小或无毒性或副作用。
12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)或其组合表明所述纳米乳剂的抑菌或杀菌活性。
13.如权利要求1-12任一项所述的方法，其中，一种或一种以上细菌种类可对一种或一种以上抗生素表现出抗性。
14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中，所述细菌种类是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
15.如权利要求1-14任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂未表现出抗性。
16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂包含：
(a)水；
(b)乙醇或甘油；
(c)氯化十六烷基吡啶(CPC)，或苯扎氯铵或烷基二甲基苄基氯化铵(BTC 824)；
(d)大豆油；和
(e)泊罗沙姆407、吐温80或吐温20。
17.如权利要求1-16任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂还包含EDTA。
18.如权利要求1-17任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂通过吸入递送、局部递送、局部递送至粘膜表面、通过喷雾作用递送或它们的任何组合。
19.如权利要求1-18任一项所述的方法，其中：
(a)所述纳米乳剂液滴的平均直径选自：小于约950nm、小于约900nm、小于约850nm、小于约800nm、小于约750nm、小于约700nm、小于约650nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、大于约50nm、大于约70nm、大于约125nm以及它们的任何组合；
(b)所述纳米乳剂液滴的平均直径大于约125nm且小于约300nm；
(c)所述纳米乳剂液滴的平均直径为约300nm至约600nm；或
(d)所述纳米乳剂液滴的平均直径为约150nm至约400nm。
20.如权利要求1-19任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂包含：
(a)水相；
(b)约1％的油至约80％的油，或约5％的油至约80％的油；
(c)约0.1％的有机溶剂至约50％的有机溶剂，或约0.1％的有机溶剂至约10％的有机溶剂；
(d)以约0.001％表面活性剂至约10％的表面活性剂的量存在的至少一种表面活性剂；
(e)以约0.1％至约10％的量存在的至少一种非离子型表面活性剂；
(f)以约0.01％至约3％的量存在的至少一种阳离子表面活性剂；
(g)约0.0005％至约1％的螯合剂；或
(h)它们的任何组合。
21.如权利要求1-20任一项所述的方法，其中：
(a)所述纳米乳剂具有窄的MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)值范围；
(b)所述纳米乳剂的MIC和MBC相差小于或等于4倍，这意味着所述纳米乳剂是杀菌性的；
(c)所述纳米乳剂的MIC和MBC相差大于4倍，这意味着所述纳米乳剂是抑菌性的；
(d)它们的任何组合。
22.如权利要求1-21任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂是稳定的：
(a)在约40℃、约75％的相对湿度条件下，稳定持续一段时间，所述一段时间选自：约1个月、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约2.5年和约3年；
(b)在约25℃、约60％的相对湿度条件下，稳定持续一段时间，所述一段时间选自：约1个月、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年和约5年；
(c)在约4℃条件下，稳定持续一段时间，所述一段时间选自：约1个月、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年、约5年、约5.5年、约6年、约6.5年和约7年；或
(d)它们的任何组合。
23.如权利要求1-22任一项所述的方法，其中，所述有机溶剂：
(a)选自：C1-C12醇、二元醇、三元醇、二烷基磷酸盐、三烷基磷酸盐及其组合；
(b)选自：非极性溶剂、极性溶剂、质子溶剂、非质子溶剂、其半合成衍生物及其组合；
(c)选自：三-正丁基磷酸盐、乙醇、甲醇、异丙醇、甘油、中链甘油三酯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、醋酸、正丁醇、丁二醇、香料醇、异丙醇、正丙醇、甲酸、丙二醇、甘油、山梨醇、工业甲基化酒精、三醋精、己烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、1，4-二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酸、其半合成衍生物及其任何组合；以及
(d)它们的任何组合。
24.如权利要求1-23任一项所述的方法，其中，所述油是：
(a)任何化妆品或药学上可接受的油；
(b)非挥发性；
(c)选自：动物油、植物油、天然油、合成油、烃类油、硅油和其半合成衍生物；
(d)选自：矿物油、角鲨烯油、香味油、硅油、精油、水不溶的维生素、异丙基硬脂酸酯、硬脂酸丁酯、辛基棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、十三烷酸山嵛酯、二异丙基己二酸酯、癸二酸二辛酯、薄荷基氨基苯甲酸酯、十六烷基辛酸酯、辛基水杨酸酯、十四烷酸异丙酯、新戊二醇二癸酸酯鲸蜡醇、Ceraphyls癸基油酸酯、二异丙基己二酸酯、C12-15烷基乳酸酯、十六烷基乳酸酯、月桂基乳酸酯、异硬脂醇新戊酸酯、十四烷基乳酸酯、异鲸蜡醇硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二醇硬脂酰硬脂酸酯、烃类油、异链烷烃、流体石蜡、异十二烷、矿脂、摩洛哥坚果油、油菜油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉花子油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈坚果油、花生油、松籽油、罂粟籽油、南瓜子油、米糠油、红花油、茶油、块菌油、植物油、杏(仁)油、希蒙德木油(加州希蒙得木种子油)、葡萄籽油、夏威夷果油、麦芽油、杏仁油、菜籽油、葫芦油、大豆油、芝麻油、榛子油、玉米油、向日葵油、大麻籽油、白檀香油、kuki坚果仁油、鳄梨油、核桃油、鱼油、刺柏子油、多香果油、桧油、籽油、杏仁籽油、茴香子油、芹菜子油、枯茗籽油、肉豆蔻籽油、叶油、罗勒叶油、月桂叶油、肉桂叶油、荔枝草叶油、桉树叶油、柠檬草叶油、白千层叶油、奥杜那干酪叶油、广藿香叶油、薄荷叶油、松叶油、迷迭香叶油、绿薄荷叶油、茶树叶油、百里香叶油、鹿蹄草叶油、花油、春黄菊油、鼠尾草油、丁香油、天竺葵花油、牛膝草花油、茉莉花油、熏衣草花油、松红梅花油、Marhoram花油、橙花油、玫瑰油、依兰树花油、栲皮油、肉桂皮油、桂皮油、黄樟树皮油、桐油、樟木油、柏木油、玫瑰木油、檀香油、地下茎(姜)桐油、松香油、兰丹油、没药油、果皮油、香柠檬果皮油、葡萄柚果皮油、柠檬皮油、石灰果皮油、橙皮油、柑桔皮油、根油、缬草油、油酸、亚油酸、油醇、异硬脂醇、其半合成衍生物及其组合；或
(d)它们的任何组合。
25.如权利要求1-24任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂包含挥发性油并且其中：
(a)所述挥发性油是有机溶剂；
(b)除了有机溶剂之外还存在所述挥发性油；
(c)所述挥发性油是萜烯、单萜、倍半萜、排气剂、甘菊环烃、其半合成衍生物或其组合；
(d)所述挥发性油选自：萜烯、单萜、倍半萜、排气剂、甘菊环烃、薄荷醇、樟脑、侧柏酮、麝香草酚、橙花醇、芳樟醇、苎烯、香叶醇、紫苏子醇、橙花叔醇、法呢醇、依兰烯、没药醇、法呢烯、驱蛔萜、土荆芥油、香茅醛、柠檬醛、香茅醇、母菊奥、蓍草、愈创烯、甘菊、其半合成衍生物和其组合；或
(e)所述纳米乳剂包含硅树脂成分并且存在于所述硅树脂成分中的挥发性油与油相中的油不同；
(f)所述纳米乳剂包含硅树脂成分并且所述硅树脂成分包含至少一种挥发性硅树脂油，其中，所述挥发性硅树脂油可以是硅树脂成分中的溶胶油或者所述挥发性的硅树脂油可与其他硅树脂和非硅树脂油结合，其中所述其他油可以是挥发性的或非挥发性的；
(g)所述纳米乳剂包含硅树脂成分，所述硅树脂成分选自：甲基苯基聚硅氧烷、西甲硅氧烷、二甲基硅氧烷、苯基三甲基硅氧烷(或其有机改性的形式)、聚合硅氧烷的烷基衍生物、十六烷基二甲硅氧烷、月桂基三甲硅氧烷、聚硅氧烷的羟基化的衍生物，例如，二甲硅醇、挥发性硅氧烷油、环状和线性的硅氧烷、环甲硅氧烷、环甲硅氧烷的衍生物、六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、挥发性的线性二甲聚硅氧烷、异十六烷、异二十烷、异二十四烷、聚异丁烯、异辛烷、异十二烷、其半合成衍生物和其组合；或
(h)它们的任何组合。
26.如权利要求1-25任一项所述的方法，所述方法还包括：
(a)螯合剂；
(b)至少一种防腐剂；
(c)至少一种pH调节剂；
(d)至少一种缓冲剂；
(e)至少一种抗生素；或
(f)它们的任何组合。
27.如权利要求26所述的方法，其中：
(a)所述螯合剂(i)以约0.0005％至约1.0％的量存在；(ii)选自：乙撑二胺、乙二胺四乙酸和二巯丙醇；(iii)是乙二胺四乙酸；(iv)或其任何组合；
(b)所述防腐剂选自：氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、苯甲醇、氯己定、咪唑基脲、苯酚、山梨酸钾、苯甲酸、溴硝丙二醇、氯甲酚、对羟苯甲酸酯、苯氧乙醇、山梨酸、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟茴醚、丁基化羟基甲苯、抗坏血酸钠、二(p-氯苯基二胍)己烷、3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇、甲基和甲基氯异噻唑啉酮、焦亚硫酸钠、柠檬酸、依地酸、氯苯甘醚(3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1，2-二醇)、Kathon CG(甲基和甲基氯异噻唑啉酮)、对羟基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基对羟基苯甲酸酯)、苯氧乙醇(2-苯氧乙醇)、Phenonip(苯氧乙醇、甲基、乙基、丁基、丙基对羟基苯甲酸酯)、Phenoroc(0.73％苯氧乙醇，0.2％对羟基苯甲酸甲酯，0.07％对羟基苯甲酸丙酯)、Liquipar Oil(异丙基、异丁基、丁基对羟基苯甲酸酯)、Liquipar PE(70％苯氧乙醇，30％liquipar oil)、Nipaguard MPA(苯甲醇(70％)、甲基&丙基对羟基苯甲酸酯)、Nipaguard MPS(丙二醇、甲基&丙基对羟基苯甲酸酯)、Nipasept(甲基、乙基和丙基对羟苯甲酸酯)、Nipastat(甲基、丁基、乙基和丙基对羟基苯甲酸酯)、Elestab 388(丙二醇中的苯氧乙醇加氯苯甘醚和对羟基苯甲酸甲酯)、Killitol(7.5％氯苯甘醚和7.5％对羟基苯酸甲酯)、其半合成衍生物及其组合；
(c)所述pH值调节剂选自：二乙醇胺、乳酸、单乙醇胺、三乙醇胺、氢氧化钠、磷酸钠，其半合成衍生物和其组合；
(d)所述缓冲液选自：2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、L-(+)-酒石酸、ACES、ADA、乙酸、乙酸铵溶液、碳酸氢铵、柠檬酸二铵、甲酸铵、草酸铵一水合物、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢钠铵四水合物、硫酸铵溶液、酒石酸二铵、BES缓冲盐水、BES、BICINE、BIS-TRIS、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸、CAPS、CHES、乙酸钙水合物、碳酸钙、柠檬酸三钙四水合物、柠檬酸盐浓缩溶液、含水的柠檬酸、二乙醇胺、EPPS、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物、甲酸溶液、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly、甘氨酸、HEPES、咪唑、脂蛋白重折叠缓冲液、醋酸锂二水合物、柠檬酸三锂四水合物、MES水合物、MES一水合物、MES溶液、MOPS、乙酸镁溶液、乙酸镁四水合物、非水合柠檬酸三镁、甲酸镁溶液、磷酸氢二镁三水合物、草酸二水合物、PIPES、磷酸盐缓冲盐水、哌嗪、D-酒石酸氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸二氢钾、柠檬酸三钾溶液、甲酸钾、草酸钾一水合物、磷酸氢二钾、用于分子生物学的无水的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾一水合物、邻苯二甲酸氢钾、酒石酸钠钾、酒石酸钠钾四水合物、四硼酸钾四水合物、四草酸钾二水合物、丙酸、STE缓冲液、STET缓冲液、5，5-二乙基巴比土酸钠、乙酸钠、乙酸钠三水合物、碳酸氢钠、酒石酸氢钠一水合物、碳酸钠十水合物、碳酸钠、柠檬酸二氢钠、柠檬酸三钠二水合物、甲酸钠溶液、草酸钠、磷酸氢二钠二水合物、磷酸氢二钠十水合物、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠二水合物、磷酸二氢钠一水合物、磷酸二氢钠溶液、焦磷酸二氢二钠、焦磷酸四钠十水合物、酒石酸二钠二水合物、酒石酸二钠溶液、四硼酸钠十水合物、TAPS、TES、TM缓冲溶液、TNT缓冲溶液、TRIS甘氨酸缓冲液、TRIS乙酸盐-EDTA缓冲溶液、TRIS缓冲盐水、TRIS甘氨酸SDS缓冲溶液、TRIS磷酸盐-EDTA缓冲溶液、Tricine、三乙醇胺、三乙胺、三乙基乙酸铵缓冲液、三乙基磷酸铵溶液、三甲基醋酸铵溶液、三甲基磷酸铵溶液、Tris-EDTA缓冲溶液、Trizma
Figure FPA00001374059000091
乙酸盐、Trizma碱、Trizma
Figure FPA00001374059000093
碳酸盐、Trizma
Figure FPA00001374059000094
盐酸盐、Trizma
Figure FPA00001374059000095
马来酸盐或其任何组合；
(e)所述抗生素选自：氨基糖苷类、安莎霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢霉素类、糖肽类、大环内酯类、单菌霉素类、青霉素类、多肽类、多粘菌素类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类和抗生素的新种类；或
(f)它们的任何组合。
28.如权利要求1-27任一项所述的方法，其中：
(a)所述表面活性剂选自：包含9到10个乙二醇单元的乙氧基化的壬基酚、包含8个乙二醇单元的乙氧基化的十一醇、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化的氢化蓖麻油、月桂基硫酸钠、环氧乙烷和环氧丙烷的二嵌段共聚物、环氧乙烷烯-环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷和环氧丙烷的四功能嵌段共聚物、甘油基单酯、甘油基癸酸酯、甘油基辛酸酯、甘油基椰油酸酯、甘油芥酸酯、甘油基羟基硬脂酸酯、甘油基异硬脂酸酯、甘油基羊毛脂酸酯、甘油基月桂酸酯、甘油基亚油酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基油酸酯、甘油基PABA、甘油基棕榈酸酯、甘油基蓖麻醇酸酯、甘油基硬脂酸酯、甘油基巯基乙酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二油酸脂、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、甘油基倍半油酸酯、甘油基硬脂酸酯乳酸酯、聚氧乙烯十六烷基/硬脂酰基醚、聚氧乙烯胆固醇醚、聚氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚、类固醇、胆固醇、β谷固醇、没药醇、醇的脂肪酸酯、十四烷酸异丙酯、脂肪-异丙基n-丁酸酯、异丙基n-己酸酯、异丙基n-癸酸酯、异丙基棕榈酸酯、辛基十二基肉豆蔻酸酯、烷氧基化的醇类、烷氧基化的酸、烷氧基化的酰胺、烷氧基化的糖类衍生物、天然油和蜡的烷氧基化的衍生物、聚氧乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物、壬苯醇醚-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6可可酰胺、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪醚、甘油基二酯、聚氧乙烯硬脂酰基醚、聚氧乙烯十四烷基醚和聚氧乙烯月桂基醚、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、甘油基二硬脂酸酯、其半合成衍生物和其混合物；
(b)所述表面活性剂是非离子脂质，选自：甘油基月桂酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、其半合成衍生物和其混合物；
(c)所述表面活性剂是聚氧乙烯脂肪醚，所述聚氧乙烯脂肪醚具有约2个到约100个基团的聚氧乙烯头部基团；
(d)所述表面活性剂是具有如下式I所示的结构的烷氧基化的醇：
R5--(OCH2CH2)y--OH     式I
其中R5是具有约6到约22个碳原子的分支或不分支的烷基基团，y为约4至约100，优选地为约10至约100；
(e)所述表面活性剂是烷氧基化的醇，所述烷氧基化的醇是羊毛脂醇的乙氧基化的衍生物；
(f)所述表面活性剂是非离子型，并且选自：壬苯醇醚-9、乙氧基化的表面活性剂、乙氧基化的醇类、乙氧基化的烷基酚、乙氧基化的脂肪酸、乙氧基化的单烷醇酰胺、乙氧基山梨糖醇酐酯、乙氧基化脂肪氨基、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、二(聚乙二醇二[咪唑羰基])、Brij
Figure FPA00001374059000111
35、Brij
Figure FPA00001374059000112
56、Brij
Figure FPA00001374059000113
72、Brij
Figure FPA00001374059000114
76、Brij
Figure FPA00001374059000115
92V、Brij
Figure FPA00001374059000116
97、Brij
Figure FPA00001374059000117
58P、CremophorEL、十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、n-癸基α-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、n-十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、n-十二烷基α-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十四烷基醚、七乙二醇单十二烷基醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树皮的皂角苷、Span
Figure FPA00001374059000119
20、Span40、Span
Figure FPA000013740590001111
60、Span
Figure FPA000013740590001112
65、Span80、Span
Figure FPA000013740590001114
85、Tergitol、Tergitol 15-S-12型、Tergitol15-S-30型、Tergitol 15-S-5型、Tergitol 15-S-7型、Tergitol15-S-9型、Tergitol NP-10型、Tergitol NP-4型、Tergitol NP-40型、Tergitol NP-7型、Tergitol NP-9型、Tergitol TMN-10型、Tergitol TMN-6型、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、Triton X-114、Triton X-165、Triton X-305、Triton X-405、Triton X-45、Triton X-705-70、TWEEN
Figure FPA000013740590001115
20、TWEEN
Figure FPA000013740590001116
21、TWEEN
Figure FPA000013740590001117
40、TWEEN
Figure FPA000013740590001118
60、TWEEN
Figure FPA000013740590001119
61、TWEEN
Figure FPA00001374059000121
65、TWEEN
Figure FPA00001374059000122
80、TWEEN
Figure FPA00001374059000123
81、TWEEN
Figure FPA00001374059000124
85、泰洛沙泊、N-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407、泊洛沙姆105苯甲酸盐、泊洛沙姆182、二苯甲酸酯、其半合成衍生物和其组合；
(g)所述表面活性剂是阳离子型，选自：季铵化合物、烷基三甲基氯化铵化合物、二烷基二甲基氯化铵化合物、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、氯化十六烷基吡啶、二甲基二十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、Girard′s试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、N，N′，N′-聚氧乙烯(10)-N-牛羊脂-1，3-二氨基丙烷、溴苄嘧棕胺、三甲基(十四烷基)溴化铵、1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇、1-癸基铵、N-癸基-N，N-二甲基-氯化物、二癸基二甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)甲酚)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、2-(2-(p-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苯甲基氯化铵、烷基1或3苯甲基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉氯化物、烷基二(2-羟乙基)苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)、烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(55％C14，23％C12，20％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(100％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(41％C14，28％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(47％C12，18％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(55％C16，20％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(58％C14，28％C16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(60％C14，25％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C11，23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(61％C12、23％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(65％C12，25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12，24％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(67％C12、25％C14)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(90％C14、5％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(93％C14、4％C12)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(95％C16、5％C18)、烷基二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-16)、烷基二甲基苯甲基氯化铵(C12-18)、二烷基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基二甲基苯甲基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)、烷基二甲基乙基溴化铵(混合的烷基和烯基基团，如在大豆油的脂肪酸中一样)、烷基二甲基乙基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C14)、烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、3％C18)、烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)、烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)、烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵(C12-18)、二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基甲基苯甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基二(2-羟乙基)辛基氯化氢铵、十二烷基二甲基苯甲基氯化铵、十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基苯甲基氯化铵、十七基羟基乙基咪唑啉氯化物、六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪、Myristalkonium氯化物(和)Quat RNIUM 14、N，N-二甲基-2-羟基丙基铵氯化物聚合物、n-十四烷基二甲基苯甲基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苯甲基氯化铵、氧基二乙烯基二(烷基二甲基氯化铵)、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵、三甲氧基甲硅烷基季铵盐、三甲基十二烷基苄基氯化铵、其半合成衍生物和其组合；
(h)所述表面活性剂是阴离子型，选自：羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、牛或绵羊胆汁、去氢胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨鹅去氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、合成的甘氨胆酸钠盐水合物、合成的甘氨去氧胆酸一水合物、甘氨去氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸酸乙酯、N-十二烷基肌氨酸钠盐、N-十二烷基肌氨酸溶液、十二烷基硫酸锂、Lugol溶液、4型Niaproof 4、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷基磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、络胆酸钠、去氧胆酸钠、去氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、牛磺去氧胆酸钠盐一水合物、牛磺猪去氧胆酸钠盐水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺熊去氧胆酸钠盐、Trizma
Figure FPA00001374059000141
十二烷基硫酸盐、熊去氧胆酸、其半合成衍生物和其组合；
(i)所述表面活性剂是两性离子型，选自：N-烷基甜菜碱、月桂基氨基丙基二甲基甜菜碱、烷基二甲基氨基乙酸、N-烷基氨基丙酸酯、CHAPS(最小值98％)、CHAPSO(最小98％)、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基辛基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐、其半合成衍生物和其组合；
(i)所述表面活性剂是聚合的，所述聚合表面活性剂选自：具有至少一个聚环氧乙烷(PEO)侧链的聚(甲基丙烯酸甲酯)主干的接枝共聚物、聚羟基硬脂酸、烷氧基化的烷基酚甲醛缩合物、具有脂肪酸疏水物的聚亚烷基二醇修饰的聚酯、聚酯、其半合成衍生物和其组合；或
(k)其任何组合。
29.如权利要求1-28任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂：
(a)包含至少一种阳离子表面活性剂；
(b)包含阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂为氯化十六烷基吡啶或苯扎氯铵或烷基二甲基苄基氯化铵(BTC 824)，或其组合；
(c)包含阳离子表面活性剂，其中，所述阳离子表面活性剂的浓度为小于约5.0％且大于0.001％；
(d)包含阳离子表面活性剂，其中，所述阳离子表面活性剂的浓度选自：小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％、小于约0.10％、大于约0.001％、大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％和大于约0.010％；或
(e)其任何组合。
30.如权利要求1-29任一项所述的方法，其中：
(a)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂；
(b)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中，所述非阳离子表面活性剂是非离子型表面活性剂；
(c)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中，所述非阳离子表面活性剂是聚山梨酸酯非离子型表面活性剂；
(d)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中，所述非阳离子表面活性剂是非离子型表面活性剂，并且所述非离子型表面活性剂的浓度为约0.05％至约10％、约0.05％至约7.0％、约0.1％至约7％或约0.5％至约4％。
(e)所述纳米乳剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子型表面活性剂，其中，所述阳离子表面活性剂的浓度为约0.05％至约3％或约0.01％至约3％；或
(f)它们的任何组合。
31.如权利要求1-30任一项所述的方法，其中，所述水存在于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
32.如权利要求1-31任一项所述的方法，其中，所述纳米乳剂在人类受治者中不被全身吸收，或几乎非常少的纳米乳剂在人类受治者中被全身吸收。
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