CN106924730A - 猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法 - Google Patents
猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，包括以下重量份数的原料组成：表面活性剂10~20份，助表面活性剂10~20份，油相10~20份，水相30~40份，本发明在纳米乳佐剂配方（表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相）的基础上，将水相常用的蒸馏水改为具有多种药理活性及显著免疫调节作用的芦荟胶，同时加入可诱导强烈免疫反应、调控Th1和Th2两种免疫应答类型的CpG寡聚脱氧核苷酸，不仅弥补了油乳佐剂、铝胶佐剂仅能刺激Th2型免疫反应的缺点，同时还提高了佐剂的免疫效力。
Description
技术领域
本发明属于兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法。
背景技术
纳米乳是一种液-液分散体系，是由表面活性剂、助表面活性剂、油相及水相构成的半透明或透明乳液，亦是一类各向同性、纳米级粒径的胶体分散体系。纳米乳可分为三种类型：Ⅰ型油包水型纳米乳（W/O 型），纳米颗粒内部为水相，由外部表面活性剂等组成的外膜包裹，分散于油相中；Ⅱ型水包油型纳米乳（O/W 型），纳米颗粒内部为油相，由外部表面活性剂等组成的外膜包裹，分散于水相中；Ⅲ型为双连续型纳米乳（W/O/W或O/W/O型），是一种过渡状态，其形成的油相颗粒水相包裹，同时也可与其它油滴连接形成油连续相，包裹介于油相中的水滴。
纳米乳佐剂具有其他佐剂不可比拟的优势，纳米乳由于其粒径较小，通过黏膜部位摄取时，能够穿过黏膜下表层，而粒径大的则定位于黏膜上表层，并且粒径小的乳粒的转化率显著高于粒径大的。纳米乳载体系统可以保护DNA 免受核酸酶降解，并且由于其所具有的生物降解性与生物相容性，还可避免发生载体效应。此外，纳米乳颗粒不仅是树突状细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞的首选吞噬目标，而且纳米乳颗粒能通过黏膜免疫，直接作用于抗原递呈细胞或定植到黏膜表面的微皱，增强抗原提呈细胞对抗原的吞噬和加工递呈作用，从而提升抗原诱导效率，提高免疫作用。除此之外，纳米乳颗粒具有较强地抗溶解能力，可控制抗原缓慢释放，延长抗原在体内的作用时间，从而提高抗体的产生。
而现有的纳米乳佐剂大多采用铝盐、油乳等疫苗佐剂，在使用时存在较多的副作用，如：导致严重的接种反应、形成无菌性化脓损害，产生外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死等问题，同时油乳佐剂、铝胶佐剂仅能刺激Th2型免疫反应，免疫效力低。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中存在的不足而提供的一种安全性好，稳定性高，免疫效应强的一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10~20份
助表面活性剂 10~20份
油相 10~20份
水相 30~40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为1~2:1~2；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1~2:1~2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为3~5:1~2。
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 10份
油相 10份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为1:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:1；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为3:1。
所述的油相为白油，白油与表面活性剂、助表面活性剂的质量比为1:1:1。
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的制备方法，其特征在于具有以下步骤：
步骤1）、取所述份量的表面活性剂、助表面活性剂、油相按质量比为1:1:1是比例混合均匀，然后缓慢加入无菌灭活猪伪狂犬病毒抗原，制备得到W/O乳剂；
步骤2）、将芦荟胶缓慢加入到步骤1）中制得的W/O乳剂中，使用恒温磁力搅拌器不断搅拌，直到W/O乳剂呈半透明状，然后缓慢加入CPG寡聚脱氧核苷酸，加入CPG寡聚脱氧核苷酸的同时进行搅拌，直至W/O乳剂呈透明状；最终制得所述的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗。
芦荟含有丰富的营养成分，含大量B族维生素、氨基酸、微量元素及大量糖类、蒽醌类等生物活性物质，具有抗菌、抗紫外线辐射、抗病毒、抗氧化、提高机体免疫机能等功能。芦荟对机体的免疫调节活性来自于大分子的糖和糖蛋白，这些大分子的糖的免疫调节活性与巨噬细胞的活化有关，它能刺激巨噬细胞产生产生细胞因子IL-6和TNF-α，与IFN-γ一起作用促使NO释放，促进表面抗原的表达。芦荟胶含有多阴离子分子，对细胞免疫和体液免疫有辅助活性，可增强感染伤口局部免疫反应。因此，芦荟作为免疫增强剂、新型免疫佐剂，在提高生产性能、增强畜禽免疫功能、防治畜禽疾病等方面具有广阔的发展前景。
CpG寡聚脱氧核苷酸是含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸序列。CpG基序是具有较强免疫活性的以非甲基化的CpG为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为5，-Pur-Pur-CG-Pyr-Pyr-3，，也称为免疫刺激序列。CpG寡聚脱氧核苷酸能在动物体内诱生强烈的免疫反应，主要包括激活NK细胞和巨噬细胞；刺激B淋巴细胞增殖，分化及产生免疫球蛋白；诱导分泌IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ等多种细胞因子；诱导抗抗体诱生的细胞凋亡。所以，它在诱导机体非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型（Th1和Th2型）等方面发挥重要作用。非脊椎动物微生物，包括细菌、线虫、软体动物、酵母、昆虫和原虫的DNA中存在非甲基化的CpG二核苷酸，且其出现频率较高，平均每16对二核苷酸出现一次；而在脊椎动物DNA中，多数CpG位点均已甲基化（甲基化程度达80%），非甲基化CpG出现频率较低，每50~60对二核苷酸出现一次（称为CpG抑制）。试验表明，人工涉及合成含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸（称为CpG-ODN）和细菌DNA均具有免疫刺激作用，具有优良的佐剂特性。
本发明具有以下优点：
1、本发明将芦荟胶应用到疫苗佐剂中，与其他化学佐剂相比，纯天然的芦荟具有不良反应少、毒副作用小、多效性等特点，同时还具有显著地免疫调节作用，本发明将芦荟胶制备成纳米佐剂用于猪伪狂犬病毒灭活苗，较传统的佐剂更安全、更稳定，同时猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗可显著促进机体的体液免疫和细胞免疫。
2、本发明在纳米乳佐剂配方（表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相）的基础上，将水相常用的蒸馏水改为具有多种药理活性及显著免疫调节作用的芦荟胶，同时加入可诱导强烈免疫反应、调控Th1和Th2两种免疫应答类型的CpG 寡聚脱氧核苷酸，不仅弥补了油乳佐剂、铝胶佐剂仅能刺激Th2型免疫反应的缺点，同时还提高了佐剂的免疫效力。
附图说明
图1为不同佐剂的猪伪狂犬病毒灭活苗体液免疫检测结果。
图2为不同佐剂的猪伪狂犬病毒灭活苗细胞免疫检测结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗处方的筛选
（1）表面活性剂的筛选
表面活性剂既含有亲水基团，又含有亲油基团，因此大部分是两亲性分子，并且表面活性剂的亲水亲油性质可用HLB值表示。本发明待选的表面活性剂有tween-20、tween-80、span-20、span-80、聚氧乙烯蓖麻油（EL-40）、PEG-400等，将适量待选的表面活性剂分别与一定量的油相白油混合，恒温磁力搅拌器不断搅拌，同时缓慢加入超纯水并不断搅拌，开始时体系粘度较低，由于含水量小于含油量，形成油包水（W/O）型纳米乳，但是随着水量的增加，体系粘度突然增加，表面活性剂形成层状结构，体系出现液晶态，继续滴加蒸馏水，体系又会突然由粘变稀，此时 W/O 型纳米乳发生转相，形成即形成水包油（O/W）型纳米乳，O/W型可用超纯水无限稀释直至乳液呈透明状，此时，记录所加入超纯水的量。将所得表面活性剂、白油、超纯水的量绘制成三元相图，最终选出的最佳表面活性剂为EL-40和PEG-400。
为增加纳米乳的表面张力及稳定性，本发明拟通过采用混合表面活性剂，即将选出的两种表面活性剂按照1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1、3:2的比例，依据绘制的伪三元相图及混合表面活性剂的HLB计算公式，选出的最佳混合表面活性剂比例。
混合表面活性剂HLB值=（Wa×HLBa+Wb×HLBb）/（Wa+Wb）
Wa、Wb分别代表两种表面活性剂的质量百分比，HLBa、HLBb分别代表两种表面活性剂的HLB值。
（2）助表面活性剂的筛选
为调节表面活性剂的HLB值及促使胶束的形成，本发明将选择短链醇如丙二醇、正丁醇作为助表面活性剂。在制备纳米乳佐剂时，将表面活性剂EL-40和PEG-400混合均匀后，分别与丙二醇、正丁醇及其混合溶液按照1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1、3:2的比例混合均匀，然后加入一定量的白油，恒温磁力搅拌器不断搅拌，同时缓慢滴加超纯水，边加边搅拌，直至乳液成透明状。根据表面活性剂、助表面活性剂、白油、超纯水的量绘制伪三元相图，确定表面活性剂的种类及比例。
（3）油相的筛选
本发明将选好的表面活性剂和助表面活性剂混合后，将其与白油分别按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例混合均匀，并缓慢加入超纯水，边滴边搅拌，直至乳液呈透明状。
（4）水相的筛选
本发明将选好的表面活性剂、助表面活性剂及油相混匀后，然后分别按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例缓慢加入芦荟胶，边加边搅拌，当乳液呈半透明状时停止加入。此时，将CPG寡聚脱氧核苷酸继续按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例缓慢加入到之前的芦荟胶乳液中，直至乳液呈透明状。
筛选结果：
（1）表面活性剂的筛选结果
当EL-40和PEG-400的比例为1:1时，载乳量较多，所形成的乳区较大。因此确定表面活性剂EL-40和PEG-400的质量比km=1:1时为最佳配比。
（2）助表面活性剂的筛选结果
表面活性剂与混合表面活性剂丙二醇和正丁醇的质量比km=1：1时，所形成的纳米乳稳定性好，久置不易分层，为纳米乳佐剂的最适配比。
（3）油相的筛选
由加水滴定法绘制的伪三元相图结果可知，当表面活性剂、助表面活性剂、油相的质量比km= 1:1:1时，为最佳的纳米乳佐剂配方，形成的纳米乳能在较大范围内被水稀释而仍能保持水包油的状态不被破坏。
（4）水相的筛选结果
经加水滴定法确定的芦荟胶纳米乳佐剂的最终质量比为：表面活性剂（EL-40、PEG-400）：助表面活性剂（丙二醇、正丁醇）：油相（白油）：水相（芦荟胶、CPG寡聚脱氧核苷酸）=1:1:1:4。
猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的制备方法
（1）猪伪狂犬病毒抗原的纯化
取少量伪狂犬病毒感染猪病料，制成病料悬液，与DMEM基础培养液以1:5比例接种至单层的PK-15细胞，37℃孵育1.5 h，换细胞培养维持液培养18 h后，按Tischer法加入适量300mmol /L D-氨基葡萄糖于相同条件下处理30 min，弃去D-氨基葡萄糖，PBS轻洗2次，换含2%胎牛血清的细胞培养维持液继续培养48 h，收获病毒。0.2%甲醛37℃灭活48h，经无菌检验和灭活检验。
（2）猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的制备
步骤1）、取所述份量的表面活性剂、助表面活性剂、油相按质量比为1:1:1是比例混合均匀，然后缓慢加入无菌灭活猪伪狂犬病毒抗原，制备得到W/O乳剂；
步骤2）、将芦荟胶缓慢加入到步骤1）中制得的W/O乳剂中，使用恒温磁力搅拌器不断搅拌，直到W/O乳剂呈半透明状，然后缓慢加入CPG寡聚脱氧核苷酸，加入CPG寡聚脱氧核苷酸的同时进行搅拌，直至W/O乳剂呈透明状；最终制得所述的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗。
实施例2、猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的质量评价
（1）根据水溶性染料亚甲基蓝和油溶性染料苏丹红在纳米乳中扩散快慢来判断疫苗的类型。亚甲基蓝呈蓝色，易在水相中扩散；苏丹红呈红色，易在油相中扩散；在猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗中，若蓝色染料扩散比红色染料快则为O/W 型纳米乳灭活苗，反之则为 W/O 型纳米乳灭活苗，若两者扩散速度一样则为双连续型纳米乳灭活苗。
（2）黏度测定：用1ml玻璃吸管，（下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm），在25℃环境中吸取猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，测定三次，取平均值。
（3）稳定性检测：吸取制备的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗于10ml离心管中，以3000r/min离心30分钟，观察是否有水相析出。
（4）猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗粒径分析：用BT-9300S 型激光粒度分布仪检测所制备的芦荟胶纳米乳佐剂粒径。
猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗质量评价结果
（1）乳剂类型检测结果
将亚甲基蓝燃料及苏丹红染料同时滴加在两杯猪伪狂犬芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗中发现，两种染料的扩散速度相近，因此判断本发明的制备为双连续相 W/O/W型纳米乳佐剂。
（2）黏度测定结果
用玻璃吸管吸取猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所用时间，平行检测3次，测得猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗黏度平均值为4.6s。
（3）稳定性测定结果
用离心机以3000r/min的速度离心猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗30分钟，上层并未有水相析出，说明本发明制备的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗比较稳定、不易破乳。
（4）纳米乳粒径检测结果
经激光粒度分析仪测得猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗粒径为0.056μm。
实施例3、猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的安全性检测
（1）肌肉刺激性检测
分别于家兔左、右侧股四头肌内无菌注射1mL猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗和1mL氯化钠注射液，同时设猪伪狂犬白油佐剂灭活苗对照组。注射猪伪狂犬病毒白油佐剂灭活苗后48 h，观察注射部位股四头肌的刺激反应。猪伪狂犬病毒白油佐剂灭活苗的制备方法为：将94%白油和6%司盘80混合后加1%~2%硬脂酸铝，灭菌后，加入无菌灭活的猪伪狂犬病毒液和4%吐温80，25℃以下乳化30min即得猪伪狂犬病毒白油佐剂灭活苗。
（2）热原检测
将1 mL 38.0℃预热的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗在无菌条件下沿家兔耳缘静脉缓慢注入，空白对照组注射1 mL生理盐水，同时设猪伪狂犬白油佐剂灭活苗对照组，每组3只家兔。在注射后每隔半小时测一次体温，测定 6 次，用 6 次体温中的最高值减去正常体温，即为体温的升高值。根据体温的升高值来检查疫苗热原是否合格。
（3）毒性试验
将1 mL猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗分点注入28~50日龄易感猪双侧耳根后，同时设猪伪狂犬白油佐剂灭活苗对照组，连续观察10日，观察试验猪有无毒性反应。
猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的安全性检测结果
（1）肌肉刺激性检测结果发现，猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗组家兔注射部位无明显的变化，而猪伪狂犬白油佐剂灭活苗组家兔的注射部位肌肉出现重度充血、红肿现象。说明白油佐剂具有较大的肌肉刺激性。
（2）热原检测结果显示，两组试验家兔的体温都有所升高，但猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗组家兔的平均体温升高值为0.3℃，而猪伪狂犬白油佐剂灭活苗组家兔的平均体温升高值为0.7℃，超过《中国药典》规定的0.6℃，所以热原检查结果不合格，如表1所示。
表1 热原检测结果
（3）毒性检测实验结果表明，猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗和猪伪狂犬白油佐剂灭活苗均对试验猪无明显的毒性。
实施例4、猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的体液免疫实验
12只28日龄试验仔猪经ELISA检测PRV抗原、抗体均为阴性。平均分为猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗和猪伪狂犬病毒白油佐剂灭活苗组2组。每组每头猪颈部肌肉注射疫苗1mL，在接种后的0、 7、 14、 21、 28、 35、 42、 49、 56、 63d，进行耳静脉采血，分离血清，ELISA法检测血清内猪伪狂犬病毒抗体滴度。
猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗体液免疫检测结果如图1所示，以芦荟胶纳米乳为佐剂的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，在接种后的第4周达到抗体效价高峰，抗体高峰维持时间较长；而猪伪狂犬白油佐剂灭活苗在接种后的第5周达到抗体高峰，且高峰时的抗体效价明显低于猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗组，抗体效价高峰维持时间短，抗体下降快。说明猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗能显著促进机体的体液免疫。
实施例5、猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的细胞免疫试验
12只28日龄试验仔猪经ELISA检测PRV抗原、抗体均为阴性。平均分为猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗和猪伪狂犬病毒白油佐剂灭活苗组2组。每组每头猪颈部肌肉注射疫苗1mL，在首免后的 7、 14、21、 28采取外周抗凝血，分离外周血淋巴细胞，经刀豆蛋白ConA进行诱导刺激后，MTT法检测猪外周淋巴细胞转化率。
猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的细胞免疫检测结果
如图2 所示，猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗免疫猪的淋巴细胞转化率明显高于白油佐剂灭活苗，且在14d时达到高峰，淋巴细胞转化维持时间较长。说明猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗可显著促进机体的细胞免疫。
实施例6、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 10份
油相 10份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为1: 2；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为3:1。
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的制备方法，其特征在于具有以下步骤：
步骤1）、取所述份量的表面活性剂、助表面活性剂、油相按质量比为1:1:1是比例混合均匀，然后缓慢加入无菌灭活猪伪狂犬病毒抗原，制备得到W/O乳剂；
步骤2）、将芦荟胶缓慢加入到步骤1）中制得的W/O乳剂中，使用恒温磁力搅拌器不断搅拌，直到W/O乳剂呈半透明状，然后缓慢加入CPG寡聚脱氧核苷酸，加入CPG寡聚脱氧核苷酸的同时进行搅拌，直至W/O乳剂呈透明状；最终制得所述的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗。
以下实施例中猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的制备方法与实施例6相同，不再赘述。
实施例7、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 20份
油相 20份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例8、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 20份
油相 20份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为3:2。
实施例9、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 10份
油相 20份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例10、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 20份
油相 10份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例11、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 20份
油相 20份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例12、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 10份
油相 10份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例13、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 20份
油相 10份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例14、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 10份
油相 20份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例15、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 10份
油相 10份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例16、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 10份
油相 20份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例17、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 20份
油相 10份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例18、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 20份
油相 20份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例19、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 10份
油相 10份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
实施例20、
一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 20份
助表面活性剂 10份
油相 20份
水相 30份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为2:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为5:2。
Claims (4)
1.一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10~20份
助表面活性剂 10~20份
油相 10~20份
水相 30~40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为1~2:1~2；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1~2:1~2；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为3~5:1~2。
2.一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：
表面活性剂 10份
助表面活性剂 10份
油相 10份
水相 40份
所述的表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油EL-40和PEG-400的质量比为1:1；
所述助表面活性剂为丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的质量比为1:1；
所述的水相为芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸的混合物，所述的芦荟胶和CPG寡聚脱氧核苷酸其质量比为3:1。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗，其特征在于：所述的油相为白油，白油与表面活性剂、助表面活性剂的质量比为1:1:1。
4.一种猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗的制备方法，其特征在于具有以下步骤：
步骤1）、取所述份量的表面活性剂、助表面活性剂、油相按质量比为1:1:1是比例混合均匀，然后缓慢加入无菌灭活猪伪狂犬病毒抗原，制备得到W/O乳剂；
步骤2）、将芦荟胶缓慢加入到步骤1）中制得的W/O乳剂中，使用恒温磁力搅拌器不断搅拌，直到W/O乳剂呈半透明状，然后缓慢加入CPG寡聚脱氧核苷酸，加入CPG寡聚脱氧核苷酸的同时进行搅拌，直至W/O乳剂呈透明状；最终制得所述的猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗。
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Date of cancellation: 20211011 Granted publication date: 20191108 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006651 |
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Denomination of invention: Porcine pseudorabies virus aloe gel nano emulsion adjuvant inactivated vaccine and its preparation method Effective date of registration: 20211013 Granted publication date: 20191108 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2021980010624 |
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Date of cancellation: 20220915 Granted publication date: 20191108 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2021980010624 |
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Denomination of invention: Porcine pseudorabies virus aloe vera gel nanoemulsion adjuvant inactivated vaccine and preparation method thereof Effective date of registration: 20220916 Granted publication date: 20191108 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2022980015417 |
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Date of cancellation: 20230918 Granted publication date: 20191108 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2022980015417 |
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Denomination of invention: Porcine pseudorabies virus aloe vera gel nanoemulsion adjuvant inactivated vaccine and its preparation method Effective date of registration: 20230921 Granted publication date: 20191108 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2023980057629 |