CN105727284B - 一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和用途 - Google Patents

一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和用途。本发明的双相纳米乳佐剂由表面活性剂、助表面活性剂以及油相组成，其中，所述的表面活性剂选自Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯、Span80中的一种或两种以上的组合；所述的助表面活性剂选自聚丙醇、PEG 400或二者的组合；所述的油相选自麦芽油、液体石蜡、花生油中的一种或两种以上的组合。研究表明本发明的一种新型水包油包水型双相纳米乳佐剂，具有安全性高、副作用小、缓释能力强等特点。由本发明的双相纳米乳佐剂制备而成的疫苗，其稳定性、免疫效力及安全性均优于传统206佐剂所制备的疫苗。因此，本发明为提高防控猪牛家畜口蹄疫疫病的水平和效率提供了新的技术手段。

Description

一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及一种疫苗纳米乳佐剂及其制备方法和用途，特别涉及一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和用途，本发明属于兽医学领域。
背景技术
纳米科技是20世纪80年代末期诞生并正在迅速崛起的新兴边缘学科，由于纳米微粒具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等特点，能产生许多不同于常规物态所具有的新奇特性，显示出非常广阔的应用前景。因此，应用纳米技术和材料开发靶向、控释药物，已经成为现代生物制品学的研究热点。近年来，纳米材料在医学免疫领域，特别在疫苗佐剂方面受到了极大的重视，与传统油佐剂、氢氧化铝佐剂相比，纳米化佐剂与抗原物质结合具有更大的结合表面积，可在同等体积下容纳更多的抗原，并借助其在水相中的均匀性，可使抗原更不易被降解破坏，提高了接种抗原的利用率。其次，由于纳米佐剂的均质性优于传统佐剂，可将具有抗原递呈能力的巨噬细胞、树突状细胞等集中在一定区域，使包裹、吸附或结合有抗原表位的纳米微粒更有效地被抗原递呈细胞吞噬、加工、递呈，在短时间内激活免疫应答，显著提高机体免疫反应的水平。在副作用方面，因纳米微粒的利用率极高，使其使用剂量及其副作用显著降低。更重要的是由于纳米佐剂是将抗原包裹于纳米粒子内部或吸附在其表面，或通过化学连接作用与纳米粒子结合，从而可持久地释放被包裹的抗原，其控制释放效果更为理想。
我国在兽类疫苗生产佐剂使用方面，最常用的是矿物油佐剂蒙特耐得(Montnanide)ISA 206，因为它的如下优越性：第一内溶成分比较特殊，在与水相的混和乳化中不需再添加其他乳化剂即可与水相结合成稳定的乳剂；第二在油水相混和乳化过程中对硬件设备要求较低。但随着疫苗质量标准的不断提高，其缺点不断突显，在动物体内不能被代谢，毒性较大，注射到动物体内会在注射部位局部形成小结、肉芽肿，有些动物甚至会形成无菌性化脓性炎症反应，而且不能实现隔离、保护、控制释放、靶向释放等多种功能的作用，因此本发明针对上述问题将纳米科技和W/O/W技术相结合研制获得一种新型佐剂，主要目的是研究一种稳定性良好、安全性高、成本低且易产业化生产的新型纳米乳佐剂来替代传统佐剂，为提高防控猪牛等家畜口蹄疫疾病的水平和效率提供新的技术手段。
发明内容
面对当前养殖业特别是猪、牛等家畜口蹄疫疫病暴发和流行以及疫苗免疫持续期短，过敏反应等难以控制的严峻形势，本发明提出了一种适用于猪牛口蹄疫疫苗的新型水包油包水型(W/O/W)双相纳米乳佐剂，其具有安全性高、疫苗副作用小，抗原缓释能力强等特点，本发明的提出为提高防控猪牛等家畜口蹄疫疫病的水平和效率提供了新的技术手段。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1、纳米乳佐剂配方的筛选
通过绘制伪三元相图及正交试验设计，筛选出空白纳米乳配方。
2、口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的制备
在15～25℃条件下，按照筛选的空白纳米乳配方，用该佐剂与口蹄疫灭活抗原乳化配制疫苗。
3、口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的质量评价
(1)微观形态：在透射电镜下观察口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的微观形态。
(2)粒径分布：用激光粒度分析仪测定其平均粒径及强度粒径分布。
(3)黏度测定：
方法一：取出1ml玻璃吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，在25℃环境中吸取纳米乳剂1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，测定三次，取平均值。
方法二：转子型黏度计法：动力黏度η(Pas)＝κ(T/ω)，其中κ表示已知黏度的标准液测得的旋转式黏度计常数，T为扭力矩，ω为角速度。
(4)离心检测：吸取口蹄疫纳米乳佐剂疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心30min，观察是否有水相析出及分层现象出现。
(5)稳定性检测：取3批制备好的口蹄疫纳米乳佐剂疫苗分别在4℃放置1年、20℃放置6个月、37℃放置1个月，观察纳米乳佐剂疫苗的外观。
4、安全性试验
5、纳米乳佐剂疫苗对小鼠的免疫效力试验
6、纳米乳佐剂疫苗对猪的免疫效力试验
7、纳米乳佐剂疫苗对牛的免疫效力试验
8、该纳米乳疫苗1000L体系的工艺放大
在上述研究的基础上，本发明最终筛选得到了一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂，所述的双相纳米乳佐剂由表面活性剂、助表面活性剂以及油相组成；
其中，所述的表面活性剂选自Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯、Span80中的一种或两种以上的组合；
其中，所述的助表面活性剂选自聚丙醇、PEG 400或二者的组合；
其中，所述的油相选自麦芽油、液体石蜡、花生油中的一种或两种以上的组合；
其中，所述的表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1-4，表面活性剂与助表面活性剂的混合物与油相的质量比为1-10:0.1-10。
在本发明中，优选的，所述的表面活性剂为Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的混合物，其中Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的质量比为3:1-3:1:1；所述的助表面活性剂为聚丙醇以及PEG400的混合物，其中聚丙醇以及PEG 400的质量比为1:1；所述的油相为液体石蜡。
在本发明中，优选的，所述的表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1-4，所述的表面活性剂与助表面活性剂的混合物与油相的质量比为3-5:5-7。
在本发明中，优选的，所述的表面活性剂为Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的混合物，其中Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的质量比为3:2:1:1；所述的助表面活性剂为聚丙醇以及PEG 400的混合物，其中聚丙醇以及PEG 400的质量比为1:1；所述的油相为液体石蜡，其中，表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1，表面活性剂和助表面活性剂混合物与油相的质量比为4:6。
进一步的，本发明还提出了所述的双相纳米乳佐剂在制备猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗中的用途。
再进一步的，本发明还提出了一种猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗及其制备方法，所述的纳米乳佐剂疫苗含有本发明所述的双相纳米乳佐剂以及口蹄疫病毒抗原液，其由以下步骤制备得到：
(1)将本发明任一项所述的双相纳米乳佐剂采用121℃高温高压灭菌30min，冷却；
(2)在300-400rpm的转速下，将口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步骤(1)的佐剂中；
(3)15-25℃下，乳化15-25min即得。
其中，优选的，口蹄疫病毒抗原液与双相纳米乳佐剂的质量百分比分别为45％和55％。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明的纳米乳佐剂是呈乳白色、澄清、透明均一，流动性良好，稳定性良好的新型水包油包水型双相纳米乳佐剂；
2、本发明采用的油相为液体石蜡，提高了纳米乳的增溶性，增大了纳米乳形成的区域；
3、本发明的纳米乳佐剂对易水解药物能够起到保护作用，并具有缓释作用；
4、本发明的纳米乳佐剂粒径小、分散性好、比表面积大，更易于体内吸收；
5、由本发明的双相纳米乳佐剂制备而成的疫苗，其稳定性、免疫效力及安全性均优于传统206佐剂所制备的疫苗。
附图说明
图1为各种表面活性剂的三元相图；
图2为不同因素对纳米乳形成的影响；
图2a为混合表面活性剂E-聚丙醇-麦芽油-水体系的伪三元相图，Km＝7:1；
图2b为混合表面活性剂E-PEG400-液体石蜡-水体系的伪三元相图，Km＝7:3；
图2c为混合表面活性剂E-混合表面活性剂c-麦芽油-水体系的伪三元相图，Km＝7:4；
图2d为混合表面活性剂F-聚丙醇-花生油-水体系的伪三元相图，Km＝7:3；
图2e为混合表面活性剂F-PEG400-麦芽油-水体系的伪三元相图，Km＝7:4；
图2f为混合表面活性剂F-混合表面活性剂c-液体石蜡-水体系的伪三元相图，Km＝7:1；
图2g为混合表面活性剂G-聚丙醇-液体石蜡-水体系的伪三元相图，Km＝7:4；
图2h为混合表面活性剂G-PEG400-花生油-水体系的伪三元相图，Km＝7:1；
图2i为混合表面活性剂G-混合表面活性剂c-麦芽油-水体系的伪三元相图，Km＝7:3；
图3为透射电镜下纳米乳的微观形态图；
图4为纳米乳佐剂和206佐剂的粒径分布比较图；
图5为纳米乳佐剂和206佐剂疫苗免疫小鼠的抗体效价评价图；
图6为纳米乳佐剂和206佐剂疫苗小鼠细胞免疫CD3+含量随时间变化结果；
图7为纳米乳佐剂和206佐剂疫苗小鼠细胞免疫CD4+含量随时间变化结果；
图8为纳米乳佐剂和206佐剂疫苗小鼠细胞免疫CD8+含量随时间变化结果；
图9为纳米乳佐剂和206佐剂疫苗免疫猪的抗体效价评价图；
图10为纳米乳佐剂和206佐剂疫苗免疫牛的抗体效价评价图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1双相纳米乳佐剂配方的筛选
1、试验方法
双相纳米乳设计的关键在于选择合适的作为表面活性剂、油相、助表面活性剂的成份及其组成比例。本发明采用加水滴定法绘制伪三元相图来筛选双相纳米乳配方：
(1)表面活性剂
表面活性剂是纳米乳形成所必需的关键物质，其主要作用在于降低界面张力，形成界面吸附膜，促使纳米乳的形成。本发明发明人在对药剂学中使用的表面活性剂进行初步分析的基础上，选择了以下表面活性剂作为候选表面活性剂：Tween80(A)、油酸聚氧乙烯酯(B)、聚氧乙烯双油酸酯(C)和Span80(D)及其混合物(质量比分别为3:3:1:1(E)，3:2:1:1(F)，3:1:1:1(G))，通过进一步具体实验分别考察上述表面活性剂及其混合物对W/O/W型双相纳米乳形成的影响。
(2)油相
本发明发明人选用了注射用麦芽油、液体石蜡及花生油作为候选油相，分别命名为α，β，γ。
(3)助表面活性剂
本发明发明人在对上述复合表面活性剂分析的基础上，为提高双相纳米乳的增溶性，增大双相纳米乳形成的区域，选择聚丙醇、PEG 400及二者的混合物作为候选助表面活性剂，共设三个组合，分别为聚丙醇(a)、PEG 400(b)及二者的混合物c(a:b质量比＝1:1)。
(4)空白纳米乳配方的确定
15-25℃条件下，试验采用L9(34)正交实验设计，将(1)中选择的最优组合表面活性剂E、F、G，三种助表面活性剂a、b、c，三种油麦芽油(α)、液体石蜡(β)、花生油(γ)，Km值(表面活性剂与助表面活性剂的质量比，分别为7:1(X)，7:3(Y)，7:4(Z)作为考察因素，以形成的微乳区的大小为评价指标。分别以表面活性剂和助表面活性剂混合物(S/Cos)、油相(O)、水相(W)作为相图的3个顶点绘制伪三元相图，图中每一条边表示相应两组分的比例关系，任一点表示各组分的质量百分含量，从而确定空白双相纳米乳佐剂配方。水平及正交实验方案见表1、表2。
按每组设计的表面活性剂/助表面活性剂的比例将二者混合，然后与油相分别按照9.9:0.1、9:1、8:2、7.5:2.5、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9(质量比)比例混合，然后边搅拌边逐滴加入蒸馏水，直至形成透明、澄清的纳米乳。在滴加过程中，会出现黏度较大的状态，用偏光显微镜观察有无丁达尔现象，发亮的为液晶，不发亮的为凝胶。但当继续滴加水到某一点时，体系的黏度突然变小，流动性极好，即形成澄清、透明的纳米乳。记录当体系由混浊变澄清或由澄清变混浊时的临界点水量，本试验以纳米乳区大小为筛选标准，选择纳米乳区最大的相图，即每组选择其载水量最大的作为选择标准，从而确定出最佳的纳米乳配方。
2、结果
2.1表面活性剂的筛选
常温条件下，以液体石蜡为油相，分别考察了表面活性剂对纳米乳形成的影响。图1表示各种表面活性剂的三元相图。
由图1可见，混合型表面活性剂能够增溶更多的水相，其最大增溶水量均大于20％，所以认为以上三种比例是复合表面活性剂的较优比例，作为其筛选对象。
2.2空白纳米乳配方的筛选
2.2.1正交试验设计
表1 因子水平表
表2 L9(34)正交试验设计与结果分析
注：表2中只示出了每组中载水量最大，体系最稳定时的表面活性剂/助表面活性剂的混合物(简称“混表”)与油相的质量比。
2.2.2不同因素对纳米乳形成的影响
通过绘制伪三元相图及正交试验设计，实验结果如表2及图2所示，从该结果中可以看出：第6组试验其微乳区最大，即纳米乳载水量最大，体系也最稳定。因此，空白纳米乳的最佳配方为FcXβ组合(混表:油相＝4:6)，其组成为：表面活性剂为Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的混合物(Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的质量比为3:2:1:1)，助表面活性剂为PEG400和聚丙醇的混合物(PEG400和聚丙醇的质量比为1:1)，油相为液体石蜡，其中，表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1(X)，表面活性剂和助表面活性剂混合物与油相的质量比为4:6。
实施例2口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的制备及免疫效力分析
1、口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的制备
根据实施例1筛选得到的最佳空白纳米乳配方，以口蹄疫灭活抗原作为水相，来制备口蹄疫纳米乳疫苗，具体方法如下：
(1)按照筛选得到的最佳双相纳米乳佐剂配方配制纳米乳佐剂，采用121℃高温高压灭菌30min，冷却；
其中，最佳的配方为：表面活性剂为Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的混合物(Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的质量比为3:2:1:1)，助表面活性剂为PEG400和聚丙醇的混合物(PEG400和聚丙醇的质量比为1:1)，油相为液体石蜡，其中，表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1，表面活性剂和助表面活性剂混合物与油相的质量比为4:6。
(2)按照重量百分比计，将55％的双相纳米乳佐剂与45％的FMDV抗原混合来制备口蹄疫纳米乳佐剂疫苗。
具体操作为：在300-400rpm的转速下，将口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步骤(1)的佐剂中。
(3)15-25℃下，乳化15-25min即得。
2、206佐剂疫苗的制备
(1)按照重量百分比计，将55％的206佐剂与45％的FMDV抗原混合来制备口蹄疫纳米乳佐剂疫苗。
具体操作为：在300-400rpm的转速下，将口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步骤(1)的206佐剂中。
(3)15-25℃下，乳化15-25min即得。
3、口蹄疫纳米乳佐剂疫苗质量评价
(1)剂型判断：制备的乳液3000r/min离心30分钟后仍维持澄清、透明、均一的外观，未见分层现象，颜色和澄清度均无变化。稀释试验显示，该乳液在水面上部分自我稀释，并使水呈现出乳白色外观，表明制备的纳米乳佐剂疫苗为W/O/W型。
(2)外观性状：口蹄疫纳米乳与空白双相纳米乳均呈乳白色，二者均澄清、均一，在烧杯中晃动无挂壁现象，流动性良好。
(3)形态观察：采用透射电镜观察口蹄疫双相纳米乳的形态。取口蹄疫纳米乳10ml，用蒸馏水200倍稀释后，将稀释液滴加1滴到铜网上，自然晾干，取质量分数2.0％磷钨酸溶液(pH值7.4)滴在其上负染15min后在透射电镜下观察口蹄疫双相纳米乳呈规则的圆形，大小均匀，分散性良好，见图3。
(4)粒径分布：将适量口蹄疫纳米乳用蒸馏水稀释至40％，用激光粒度分析仪测定其平均粒径及强度粒径分布，双相纳米乳平均粒径为90nm，粒径范围在68nm～116nm之间，基本呈正态分布，见图4。
(5)黏度测定：
方法一：取出1ml玻璃吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，在25℃下吸取双相纳米乳剂1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，测定三次，取平均值为3.9秒，在疫苗黏度允许的范围之内(<8s·0.4ml-1)。
方法二：转子型黏度计法：动力黏度η(Pas)＝κ(T/ω)，κ其中表示已知黏度的标准液测得的旋转式黏度计常数，T为扭力矩，ω为角速度。
(6)稳定性考察：各取3批制备好的口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗分别在4℃放置1年、20℃放置6个月，37℃放置1个月，乳剂外观均保持澄清透明液体，无絮状、分层、破乳等现象；3000r/min离心30min后，仍为澄清透明均一液体，表明其稳定性良好。
4、安全性试验
(1)用体重350-450g的豚鼠4只，两只皮下注射本发明的纳米佐剂疫苗各2.0ml，另外两只皮下注射206佐剂疫苗各2.0ml；用体重18-22g的小白鼠10只，5只皮下注射纳米佐剂双相疫苗0.5ml，另外5只皮下注射206佐剂疫苗各0.5ml。连续观察7日，试验组均未出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。
(2)用30-40日龄的健康易感猪(经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体)4头，两头两侧耳根后分别分点肌肉注射2头份双相纳米佐剂疫苗，另外两头注射2头份206佐剂疫苗，逐日观察14日。试验组均未出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。
(3)用6月龄的健康牛4头，每两头牛舌上表面皮内分20个点分别注射双相纳米佐剂疫苗和206佐剂疫苗各2.0ml，每点0.1ml，逐日观察4日。之后，每两头牛肌肉分别对应注射双相纳米乳佐剂疫苗和206佐剂疫苗各6.0ml，继续逐日观察6日，试验组均未出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。
5、该口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗对小鼠的免疫效力试验
(1)小鼠体液免疫试验
用体重20g左右的BALB/C小鼠20只，其中10只皮下注射本发明的纳米佐剂疫苗各0.5ml，另外10只皮下注射206佐剂疫苗各0.5ml，分别在7天、14天、21天、28天静脉采血，其血清进行液相阻断ELISA试验，通过测定抗体滴度判断该疫苗的体液免疫抗体消长情况，通过测定21天后，双相纳米乳佐剂疫苗免疫的10只小鼠均出现明显抗体，以1:64为完全保护，8/10小鼠达到完全保护，且双相纳米乳佐剂疫苗免疫的小鼠抗体效价高于206佐剂疫苗免疫的小鼠，见图5。
(2)小鼠的细胞免疫试验
用体重20g左右的BALB/C小鼠20只，其中10只皮下注射本发明的纳米乳佐剂疫苗各0.5ml，另外10只皮下注射206佐剂疫苗各0.5ml，28天后摘取小鼠眼球采集外周血，对外周血淋巴细胞进行流式细胞检测，探讨上述疫苗对T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+亚群的影响，其中前者免疫小鼠细胞中CD3+为54.35％，CD4+为21.28％，CD8+为23.56％，均维持较高的细胞水平；而后者免疫小鼠细胞中CD3+为47.69％，CD4+为27.14％，CD8+为15.72％，相比前者细胞水平低，见图6，图7，图8。
6、该口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗对猪的免疫效力试验
(1)体液免疫试验
用体重40kg左右的健康易感架子猪(经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体)15头，分为3组，每组5头。将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每个剂量组分别于耳根后肌肉注射本发明的纳米乳佐剂疫苗和206佐剂疫苗各5头猪，分别在免疫后7天、14天、21天、28天采集静脉血，其血清进行液相阻断ELISA试验，判定抗体水平(图9)。接种28天后，连同条件相同的对照猪2头，每头猪耳根后肌肉注射1000ID50的猪口蹄疫O型病毒强毒。连续观察10日。对照猪均应至少一蹄出现水泡病变或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。根据免疫猪的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50。
结果：经计算，双相纳米乳佐剂疫苗的PD50为12.96，206佐剂疫苗的PD50为10.84。
(2)细胞免疫试验
用本发明的纳米乳佐剂疫苗和206佐剂疫苗分别免疫试验猪，分别在7天、14天、21天、28天采集试验猪外周抗凝血，对外周血淋巴细胞进行流式细胞检测，结果显示，CD3+T淋巴细胞含量、CD4+T淋巴细胞含量以及CD8+T淋巴细胞含量均随时间呈上升趋势，且维持较高的含量，见表3-5。
表3：免疫试验猪CD3+淋巴细胞的变化
表4：免疫试验猪CD4+淋巴细胞的变化
表5：免疫试验猪CD8+淋巴细胞的变化
注：其中A组为双相纳米乳佐剂疫苗组淋巴细胞平均数，B组为206佐剂疫苗对照组淋巴细胞平均数。
7、该口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗对牛的免疫效力试验
(1)体液免疫试验
用6月龄的健康易感牛30头，分为3组，每组10头。将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每个剂量组分别于颈部肌肉注射双相纳米乳佐剂疫苗和206佐剂疫苗各5头牛，分别在免疫后7天、14天、21天、28天采集静脉血，其血清进行液相阻断ELISA试验，判定抗体水平(图10)。接种28天后，连同条件相同的对照牛2头，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射注射1000ID50的牛口蹄疫O型病毒强毒。连续观察10日。对照牛均应3个以上蹄出现水泡病变。免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保护。根据免疫牛的保护数，根据免疫牛的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50。
结果：经计算，双相纳米乳佐剂疫苗的PD50为12.96，206佐剂疫苗的PD50为10.84。
(2)细胞免疫试验
筛选的一组双相纳米乳佐剂疫苗和206佐剂疫苗分别免疫试验牛，分别在7天、14天、21天、28天采集试验牛外周抗凝血，对外周血淋巴细胞进行流式细胞检测，结果显示，CD3+T淋巴细胞含量、CD4+T淋巴细胞含量以及CD8+T淋巴细胞含量均随时间呈上升趋势，且维持较高的含量，见表6-8。
表6：免疫试验牛CD3+淋巴细胞的变化
表7：免疫试验牛CD4+淋巴细胞的变化
表8：免疫试验牛CD8+淋巴细胞的变化
注：其中A组为纳米乳佐剂疫苗组淋巴细胞平均数，B组为206佐剂疫苗对照组淋巴细胞平均数。
8、该口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗1000L体系的工艺放大
15-25℃下条件下，按照所筛选的配方以流速为10-20kg/min，剪切速度为300-400r/min，剪切15-25min规模化制备新型口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗，通过质量评价和安全试验及免疫试验验证等，结果发现跟小规模试验生产的口蹄疫双相纳米乳佐剂疫苗具有同样的效果。

Claims (8)

1.一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂，其特征在于，所述的双相纳米乳佐剂由表面活性剂、助表面活性剂以及油相组成；
其中，所述的表面活性剂为Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的混合物， Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的质量比为3:1-3:1:1；
其中，所述的助表面活性剂为聚丙醇以及PEG 400的混合物，聚丙醇以及PEG 400的质量比为1:1；
其中，所述的油相为液体石蜡；
其中，所述的表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1-4，表面活性剂与助表面活性剂的混合物与油相的质量比为1-10:0.1-10。
2.如权利要求1所述的双相纳米乳佐剂，其特征在于，所述的表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1-4，所述的表面活性剂与助表面活性剂的混合物与油相的质量比为3-5:5-7。
3.如权利要求1或2所述的双相纳米乳佐剂，其特征在于，所述的表面活性剂为Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的混合物，其中Tween80、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及Span80的质量比为3:2:1:1；所述的助表面活性剂为聚丙醇以及PEG 400的混合物，其中聚丙醇以及PEG 400的质量比为1:1；所述的油相为液体石蜡，其中，表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1，表面活性剂和助表面活性剂混合物与油相的质量比为4:6。
4.权利要求1-3任一项所述的双相纳米乳佐剂在制备猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗中的用途。
5.一种猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗，其特征在于含有权利要求1-3任一项所述的双相纳米乳佐剂以及口蹄疫病毒抗原液。
6.如权利要求5所述的猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗，其特征在于口蹄疫病毒抗原液与双相纳米乳佐剂的质量百分比分别为45%和55%。
7.一种制备权利要求5或6所述的猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将权利要求1-3任一项所述的双相纳米乳佐剂采用121℃高温高压灭菌30min，冷却；
（2）在300-400rpm的转速下，将口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步骤（1）的佐剂中；
（3）15-25℃下，乳化15-25min即得。
8.权利要求5或6所述的猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗在制备预防猪牛口蹄疫药物中的用途。
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