CN103784953A - 作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳，其特征在于含有：(1)角鲨烯或角鲨烷；(2)乳化剂；和(3)注射用辅料；所述的乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、油酸、油酸钠中的一种或其以任何比例组成的混合物。本发明也公开所述水包油型亚微乳的制备方法。本发明的水包油型亚微乳佐剂能减少疫苗用量，降低不良反应，且可经受热压灭菌，在2-8℃或室温下均能长期保存，安全性与稳定性优于现有的O/W型亚微乳佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法。
背景技术
佐剂是指与抗原同时或预先使用，本身并无抗原性，但能非特异性增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，从而增强免疫应答的物质。1925年，Ramon首次对此进行了系统研究，证实除抗原本身外，疫苗中加入的各种成分也是引起免疫应答的重要因素，发现金属盐类、淀粉、油脂、维生素等均能增强人体对白喉类毒素的免疫应答。
佐剂的作用机理尚未完全阐明，一般认为主要通过以下机制发挥作用：(1)靶向性。通过使抗原靶向至淋巴细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞(APC)，提高APC对抗原的捕获能力；(2)缓释性。通过“贮库”效应缓慢释放抗原，使APC对抗原充分加工处理形成抗原肽-MHC分子复合物，免疫效应持久。
长期以来，传统疫苗由于其免疫原性较强，佐剂的研究和应用局限于较小的范围，如吸附白喉疫苗、吸附百日咳疫苗、吸附破伤风疫苗。随着现代生物技术的发展，DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等新型疫苗的研究取得了长足发展。新型疫苗具有生产成本低、安全性高、特异性强等优点，但缺点是免疫原性普遍较弱，导致机体产生的免疫应答水平较低。因此，需要加入适当的佐剂才能提高对机体的免疫保护水平。目前在欧盟、加拿大、澳大利亚等国家与地区，疫苗佐剂已被广泛使用，通过佐剂提高疫苗的免疫原性已成为疫苗开发的一个关键领域。
目前，应用最广泛的佐剂仍然是铝佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝等。自1926年Glenny首次使用铝盐粘附白喉类毒素至今，经过几十年的使用，虽然铝佐剂的有效性和安全性得到了人们的公认，但铝佐剂也有许多不足之处。如主要诱导产生体液免疫应答，诱导细胞免疫应答的能力较弱，抗体以IgG1型为主。不同批次之间产品差异较大，质量难以控制。会引起局部不良反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿。
其它已经批准上市的佐剂中，MF59和AS03均为水包油型(O/W型)亚微乳，AS04则由氢氧化铝和3-O-脱酰单磷酸类脂A(3-O-deacylatedmonophosphoryl lipid A，3D-MPL)组成。此外，尚有AF03和W805EC两种O/W型亚微乳佐剂处于临床试验中。意大利于1997年率先批准含MF59佐剂的流感亚单位疫苗复立达
上市，该佐剂能同时刺激产生体液免疫应答与细胞免疫应答，从而提高对65岁以上老年人的免疫保护水平。2009年欧盟批准含AS03佐剂的的H1N1疫苗
上市，含AS04佐剂的人乳头瘤状病毒(HPV)疫苗
也于当年在美国上市。
专利文献WO9014837、EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2公开了MF59的处方、制备方法及其用途。该佐剂含4.0％～5.0％角鲨烯、0.5％吐温80、0.5％司盘85，平均粒径约为160nm。处方中所含的脂溶性表面活性剂司盘85和水溶性表面活性吐温80，可使乳化剂的HLB值调节至适当水平。但MF59只能采用过滤除菌，如果采用终端热压灭菌，则会导致亚微乳分层，因而整个生产过程对无菌操作要求苛刻。此外，吐温80具有溶血作用，会导致组胺释放，容易引起过敏反应。
专利文献US2007141078A1、US2010189741A1、US2010183667A1公开了AS03的处方、制备方法及其用途。单个剂量的AS03含角鲨烯10.68mg、DL-α-生育酚11.86mg，吐温804.85mg，平均粒径为150～155nm。2009～2010年甲型H1N1流行期间，欧洲多个国家报告
疫苗接种者出现神经系统不良反应，主要表现为嗜睡和睡眠过度。根据芬兰国家健康与福利研究所公布的一份调查报告显示，4～19岁青少年在接种了疫苗后患嗜睡症的风险比同年龄组未接种疫苗的青少年高出9倍。嗜睡症是一种睡眠失调现象，患者会感到极端疲倦，昏昏欲睡，往往会在毫无预警的情况下睡着，甚至是在活动中途突然入睡。
专利文献US2007014805A1、US2007191314A1、EP2080522A1公开了AF03的处方及其制备方法。该佐剂含2.5％角鲨烯、约0.48％鲸蜡硬脂醇聚醚-12(Ceteareth-12)、约0.37％司盘80，此外尚含一种Toll样蛋白受体4(TLR-4)激动剂，其中90％的乳滴粒径≤200nm。其制备方法是先制备成W/O型亚微乳，然后加热至50～65℃经历相转变，冷却后而得O/W型亚微乳。制备工艺复杂，质量较难控制。此外，所含的表面活性剂Ceteareth-12具有一定毒性，一般仅用于局部外用制剂中。
专利文献US2009304799A1、US2012003277A1公开了W805EC的处方、制备方法及其用途。该佐剂含64％大豆油、8％乙醇、5％吐温80、1％十六烷基氯化吡啶(CPC)，平均粒径约为400nm。由于处方中乙醇和吐温80含量较高，不适于注射给药，目前仅局限于作为鼻粘膜免疫疫苗的佐剂。
国内现有如下亚微乳佐剂专利：
专利文献CN201010247976.0公开了一种含角鲨烯、聚醚、聚氧乙烯蓖麻油的亚微乳佐剂，但聚氧乙烯蓖麻油在注射给药中具有较大毒性，易引起变态反应、中毒性肾损伤、神经毒性、心脏血管毒性等。
专利文献CN200910193930.2公开了一种水包油型复方疫苗佐剂，但其中的蜂胶组成复杂，含多种不明成分，且制备过程需要用到70％乙醇，易造成溶剂残留，仅适用于兽用疫苗。
专利文献CN02144678.4与CN201010103495.2公开的均为一种纳米乳佐剂，粒径在10～100nm之间。前者在制备过程中流感疫苗需经历高速搅拌与纳米对撞过程，容易导致抗原效价降低甚至失活。后者所采用的油相肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、聚氧乙烯蓖麻油在注射给药中具有较大毒性。
发明内容
本发明旨在提供一种新型水包油型亚微乳佐剂，其安全性与稳定性优于已上市佐剂，且制备工艺操作性强，易于工业化生产，适应不同临床应用需求。该佐剂可作为灭活疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的佐剂，能提高免疫应答，降低疫苗用量。
因此，一方面，本发明提供一种作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳，其特征在于含有：
(1)角鲨烯或角鲨烷；
(2)乳化剂；和
(3)注射用辅料；
所述的乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(Solutol HS15)、油酸、油酸钠中的一种或其以任何比例组成的混合物。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述角鲨烯或角鲨烷的用量为1.0％-20％(w/v)，优选为2.0％-10％(w/v)，更优选为3.0％-6.0％(w/v)。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述乳化剂的用量为0.05％-10％(w/v)，优选为0.1％-8％(w/v)，更优选为0.2％-1.0％(w/v)。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述注射用辅料选自pH调节剂、等渗调节剂或注射用水。
所述pH调节剂选自盐酸、醋酸、甘氨酸、柠檬酸、磷酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾或其它可接受的酸碱。其用量通常为0-2％(w/v)。
所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇、木糖醇中的一种或其以任何比例组成的混合物。其用量通常为0.5％-10％(w/v)，优选为0.8％-8％(w/v)。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述水包油型亚微乳的粒径为100-500nm，优选为100-300nm，更优选为150-200nm。
另一方面，本发明提供作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳的方法，包括以下步骤：
(1)制备油相：
在惰性气体环境下，将脂溶性乳化剂加入角鲨烯或角鲨烷中，至搅拌均匀作为油相；
(2)制备水相：
在惰性气体环境下，将水溶性乳化剂、pH调节剂、等渗调节剂或其它可接受的辅料加入注射用水中，搅拌均匀作为水相；
(3)制备初乳：
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切得初乳，用pH调节剂调节初乳的pH值至5.0-10.0，定容；
(4)制备水包油型亚微乳：
在惰性气体环境下，将初乳转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至500nm或以下，除菌，灌装，或灌装后热压灭菌，即得作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳。
根据本发明的一个优选的实施方式，上述制备过程中，(4)中所述除菌采用0.22μm滤膜过滤来进行。
根据本发明的一个特别优选的实施方式，本发明所述水包油型亚微乳根据图1所述流程进行制备。
本发明的水包油型亚微乳作为疫苗佐剂提供多种应用方法，包括但不限于：(1)独立包装，即本发明的水包油型亚微乳在临用前与疫苗混匀后直接使用；(2)组合包装，即本发明的水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；(3)冻干疫苗产品，即本发明的水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前复融。
本发明的水包油型亚微乳，粒径为100-500nm，优选为100-300nm，更优选为150-200nm，粒径分布窄。作为疫苗佐剂，可使抗原靶向至淋巴细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞(APC)，提高APC对抗原的捕获能力，使APC对抗原充分加工处理形成抗原肽-MHC分子复合物。
本发明的实验例4对比了本发明的佐剂与MF59佐剂的灭菌条件，实验例5对比了本发明的佐剂与MF59佐剂的溶血性，实验例7对比了本发明的佐剂与MF59佐剂提高流感疫苗免疫效果的作用。结果表明，本佐剂的作用优于MF59佐剂，且稳定性与安全性更优。
本发明的水包油型亚微乳，稳定性良好，在2-8℃与20-25℃下均能长期保存。与MF59、AS03只能采用过滤除菌不同，该佐剂既能采用过滤除菌，也能经受终端热压灭菌，有助于灵活调整制备工艺，以适应工业化生产的需要。
本发明的水包油型亚微乳，可作为灭活疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的免疫佐剂，包括但不限于季节性与大流行流感疫苗(包括H1、H2、H3、H5、H7、H9、B亚型以及HA、NA、M1、M2亚单位抗原)、人乳头瘤状病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗等。
附图说明
图1是本发明特别优选的水包油型亚微乳佐剂的制备工艺流程；
图2A是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂的粒径；
图2B是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂的粒径分布；
图3A是MF59佐剂与实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂热压灭菌后的外观；
图3B是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂灭菌后的粒径；
图3C是实施例1制得的水包油型亚微乳佐剂灭菌后的粒径分布；
具体实施方式
本发明可以通过以下实施例实现，但不限于以下实施例中的组成、方法、步骤。应该理解，所列举的实施例并不代表本发明的全部应用范畴，而是为了使科研工作者更好地理解这项发明。还应该理解，所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。
实施例1：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH约0.1ml，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例2：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH约0.1ml，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例3：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯10g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L KOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例4：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯200g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)100g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油30g，磷酸氢二钠5g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例5：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例6：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯100g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)80g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例7：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯30g，黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)2.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，柠檬酸0.8g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例8：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例9：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)10.0g，油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.3ml，1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例10：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)10.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取山梨醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例11：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)15g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例12：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯120g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)35g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取木糖醇46g，甘氨酸5g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例13：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯150g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)60g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例14：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷10g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取山梨醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.6ml，1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例15：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷200g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)100g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至9.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例16：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷20g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘露醇50g，甘氨酸3g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至8.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例17：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷100g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)80g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至7.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例18：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷30g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)2.0g，油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取葡萄糖50g，柠檬酸1.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例19：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例20：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例21：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷60g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)10g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例22：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷130g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)25g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油40g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例23：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷170g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)50g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，磷酸二氢钾2.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L KOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例24：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯10g，大豆卵磷脂0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例25：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯200g，大豆卵磷脂100g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取葡萄糖50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例26：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，大豆卵磷脂1.0g，油酸0.3g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约1.0ml，1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例27：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯100g，大豆卵磷脂80g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.2g，磷酸氢二钾2.0g，甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L KOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例28：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例29：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，大豆卵磷脂6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例30：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯150g，大豆卵磷脂60g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例31：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯10g，氢化蛋黄卵磷脂0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.3ml，1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例32：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯200g，氢化蛋黄卵磷脂100g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取葡萄糖50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例33：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，氢化蛋黄卵磷脂1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例34：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯100g，氢化蛋黄卵磷脂80g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取山梨醇50g，甘氨酸4.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例35：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯30g，氢化蛋黄卵磷脂2.0g，油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH约0.1ml，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例36：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，氢化蛋黄卵磷脂4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例37：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，氢化蛋黄卵磷脂10.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.3g，磷酸二氢钠2.0g，甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例38：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯140g，氢化蛋黄卵磷脂40g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例39：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷10g，氢化大豆卵磷脂0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取葡萄糖50g，甘氨酸2.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例40：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷200g，氢化大豆卵磷脂100g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取氯化钠10.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例41：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷20g，氢化大豆卵磷脂1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例42：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷100g，氢化大豆卵磷脂80g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘露醇50g，柠檬酸0.8g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例43：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷40g，氢化大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例44：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷60g，氢化大豆卵磷脂6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例45：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷70g，氢化大豆卵磷脂12g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取木糖醇46g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例46：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷150g，氢化大豆卵磷脂50g，搅拌混合均匀，作为油相。称取山梨醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例47：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯45g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取Solutol HS152.0g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例48：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯55g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取Solutol HS151.0g，甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例49：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯70g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)10g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取Solutol HS150.5g，甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例50：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例51：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.2g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例52：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)10g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.2g，甘油20g，柠檬酸1.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例53：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)30g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.5g，甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例54：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)4.0g，油酸0.3g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例55：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)5.0g，油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例56：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯60g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)10g，油酸0.2g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，甘氨酸2.0g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例57：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯80g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)30g，油酸0.5g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘露醇50g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例58：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，作为油相。
称取Solutol HS155.0g，油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入醋酸约0.6ml，1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例59：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，作为油相。
称取Solutol HS156.0g，油酸钠0.2g，甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L NaOH约0.2ml，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，过滤除菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例60：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯20g，角鲨烷25g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例61：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)4.0g，氢化蛋黄卵磷脂1.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例62：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.3g，甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例63：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯40g，氢化大豆卵磷脂4.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取Solutol HS152.0g，甘油25g，甘氨酸3.5g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例64：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯25g，角鲨烷25g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例65：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烷60g，大豆卵磷脂6.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取Solutol HS151.0g，甘油30g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例66：水包油型亚微乳的制备
在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，大豆卵磷脂5.0g，搅拌混合均匀，作为油相。
称取油酸钠0.2g，甘油20g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。加入1mol/L盐酸、1mol/L NaOH适量，调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，热压灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
实施例67：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例2制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例1制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例1制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例68：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例20制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例18制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例18制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例69：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例28制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例26制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例26制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例70：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例36制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例34制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例34制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例71：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例43制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例41制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例41制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例72：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例48制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例46制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例46制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例73：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例51制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例74：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例55制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例49制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例75：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例60制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例54制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例54制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例76：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例64制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例58制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例58制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
实施例77：水包油型亚微乳佐剂与疫苗组合物的制备
将适量疫苗加入到实施例66制备的佐剂中，直接使用；或将适量疫苗加入到实施例60制备的佐剂中，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；或将适量疫苗加入到实施例60制备的佐剂中，灌封、冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前以生理盐水复融。
下述实验例进一步阐明本发明的技术效果，但所列举的实验例并不代表本发明的全部应用范畴。
实验例1：水包油型亚微乳佐剂粒径与粒径分布测定
将实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂以注射用水作适当稀释，采用Malvern Nano-ZS90动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径及粒径分布。
结果(图2A、2B)显示，本发明实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂平均粒径为184.2nm，多分散性系数(PdI)为0.087，粒径小且粒径分布窄。
实验例2：水包油型亚微乳佐剂与MF59佐剂的ζ电位测定
乳滴之间的静电斥力是亚微乳保持稳定的主要原因，静电斥力可通过ζ电位表征。通常认为，ζ电位绝对值大于30mV时，亚微乳稳定性较佳。
将实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂以注射用水作适当稀释，采用Malvern Nano-ZS90动态光散射粒径电位测定仪测定其ζ电位。
根据专利文献WO9014837、EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2所述，通过以下方法制备MF59佐剂：(1)将0.5％司盘85(Span85)与5.0％角鲨烯搅拌混合均匀，作为油相；将0.5％吐温80(Tween80)加至适量柠檬酸缓冲液中，搅拌混合均匀，作为水相。(2)将油相加至水相中，10000转/分钟(rpm)剪切5min，形成初乳。将初乳转至高压乳匀机中，12000psi乳匀5次。过滤除去大粒子后，灌装，0.22μm过滤除菌，即得。
取上述MF59佐剂，同法测定其ζ电位。
结果显示，本发明实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂ζ电位为-38.9mV，MF59佐剂的ζ电位为-25.7mV，表明本发明的O/W亚-微乳佐剂稳定性显著优于MF59佐剂。
实验例3：水包油型亚微乳佐剂、MF59佐剂的长期稳定性
将实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂、实施例2制备的水包油型亚微乳佐剂、MF59佐剂分别于2-8℃与20-25℃下放置1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样，观察外观，测定粒径。结果见下表：
水包油型亚微乳佐剂(实施例1)
水包油型亚微乳佐剂(实施例2)
MF59佐剂
实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂在2-8℃与20-25℃下放置24个月，无变色分层现象，粒径大小基本不变；实施例2制备的水包油型亚微乳佐剂在2-8℃与20-25℃下放置24个月，无变色分层现象，粒径仅有略微增大，表明本发明的水包油型亚微乳佐剂性质稳定，有效期至少24个月。MF59佐剂在2-8℃与20-25℃下放置24个月后粒径均有较明显增大，稳定性不如本发明的水包油型亚微乳佐剂。
实验例4：水包油型亚微乳佐剂与MF59佐剂灭菌条件比较
将MF59佐剂与实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂于117℃灭菌30min，观察灭菌后外观变化，并测定粒径及粒径分布的变化。
结果显示，MF59佐剂灭菌后分出现分层(图3A左)，表明该佐剂不能采用热压灭菌，只能采用0.22μm过滤除菌。本发明的水包油型亚微乳佐剂灭菌后，无分层现象(图3A右)，平均粒径为184.5nm，PdI值为0.093，粒径及粒径分布基本不变，见图3B、3C。表明本发明的水包油型亚微乳佐剂既能采用过滤除菌，也能经受终端热压灭菌，有助于降低无菌操作工艺的成本，并能灵活调整制备工艺，以适应工业化生产的需要。
实验例5：水包油型亚微乳佐剂与MF59佐剂溶血性试验
按照《中国药典》(2010年版)二部附录XI L“溶血与凝聚检查法”项下进行操作，采用常规体外试管法，观察MF59佐剂与实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂的溶血性。结果显示，MF59佐剂的溶血性高于实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂。
溶血会导致红细胞破裂，并释放出血红素。血红素在398nm附近有最大吸收，通过比较不同佐剂与阳性对照中血红素的含量，可进一步计算出佐剂的溶血百分率。
溶血百分率(％)＝(供试品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％
MF59佐剂的溶血百分率为10.25％，本发明实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂的溶血百分率3.84％，表明本发明的水包油型亚微乳佐剂溶血性更低，临床用药时安全性更高。
实验例6：水包油型亚微乳佐剂对流感疫苗的佐剂作用
1.1疫苗配制
疫苗溶液：流感裂解疫苗(B/Brisbane/60/2008)，血凝素(HA)浓度为300μg/ml。
佐剂溶液：实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂。
以pH7.4PBS将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。将水包油型亚微乳佐剂与以pH7.4PBS作适当稀释后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组。
1.2动物免疫方案
将42只雌性BALB/c小鼠随机分为7组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：低剂量疫苗免疫组，单纯给予流感疫苗，0.1μg HA/只；
第2组：低剂量疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，0.1μg HA/只；
第3组：中剂量疫苗免疫组，单纯给予流感疫苗，0.3μg HA/只；
第4组：中剂量疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，0.3μg HA/只；
第5组：高剂量疫苗免疫组，单纯给予流感疫苗，1.0μg HA/只；
第6组：高剂量疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，1.0μg HA/只；
第7组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水。
1.3免疫效果检测
免疫后第14天、28天，小鼠眼眶取血，分离血清，进行如下试验。
1.3.1血凝抑制(HI)试验
流感疫苗抗原中的血凝素(HA)能与人或动物(如马、鸡、豚鼠)的红细胞发生凝集，称为血凝现象。如果血清中产生相应的抗体，则会抑制这种现象，以此为原理的试验称为血凝抑制试验。通过测定免疫后血清的血凝抑制滴度，可以反应机体对流感病毒的保护水平。结果见下表：
1.3.1间接ELISA检测血清IgG水平
体液免疫主要刺激产生IgG1亚型抗体，细胞免疫主要刺激产生IgG2a亚型抗体。本发明的水包油型亚微乳佐剂能同时诱导较强的体液免疫应答与细胞免疫应答，通过测定血清中的总IgG滴度，可以反应机体产生的抗体水平。结果见下表：
1.4统计分析
不同剂量组间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p＜0.05。从统计分析可知，对于0.1μg、0.3μg、1.0μg各剂量组，疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组与单纯疫苗免疫组相比，HI滴度与总IgG滴度均显著提高(p＜0.05)，表明本发明的水包油型亚微乳佐剂能同时诱导产生较强的体液免疫应答与细胞免疫应答。0.1μg疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组与1.0μg单纯疫苗免疫组相比，HI滴度与总IgG滴度均无显著性差异(p＞0.05)，表明本发明的水包油型亚微乳佐剂能通过提高免疫应答而降低疫苗用量。
实验例7：Al(OH)3佐剂、MF59佐剂以及本发明的水包油型亚微乳佐剂对流感疫苗的佐剂作用比较
1.1疫苗配制
疫苗溶液：流感裂解疫苗(B/Brisbane/60/2008)，血凝素(HA)浓度为300μg/ml。
佐剂溶液：Al(OH)3佐剂、MF59佐剂、实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂。
以pH7.4PBS将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。将Al(OH)3佐剂、MF59佐剂以及实施例6制备的水包油型亚微乳佐剂与以pH7.4PBS作适当稀释后的疫苗溶液等体积混合，分别作为疫苗+Al(OH)3佐剂组、疫苗+MF59佐剂组、疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组。
1.2动物免疫方案
将30只雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予流感疫苗，0.3μg HA/只；
第2组：疫苗+A1(OH)3佐剂免疫组，0.3μgHA/只；
第3组：疫苗+MF59佐剂免疫组，0.3μg HA/只；
第4组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，0.3μgHA/只；
第5组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水。
1.3免疫效果检测
免疫后第14天、28天，小鼠眼眶取血，分离血清。通过HI试验，测定血清中的血凝抑制滴度。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
1.4统计分析
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p＜0.05。从统计分析可知，水包油型亚微乳佐剂提高流感疫苗免疫应答水平的作用稍优于MF59佐剂，均高于Al(OH)3佐剂。且本发明的水包油型亚微乳佐剂不含吐温80与司盘85，安全性更好，且稳定性更高，既能采用过滤除菌，也能经受终端热压灭菌，有助于灵活调整制备工艺，以适应工业化生产的需要。
实验例8：不同油相水包油型亚微乳佐剂对流感疫苗的佐剂作用比较
1.1处方
分别以角鲨烯、角鲨烷、大豆油、中链甘油三酯(MCT)、大豆油-MCT(1∶1)作为油相，处方如下：
处方1(本发明实施例1的处方)：(1)在惰性气体环境下，称取角鲨烯50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相；(2)称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
处方2(本发明实施例20的处方)：(1)在惰性气体环境下，称取角鲨烷50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相；(2)称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
处方3：(1)在惰性气体环境下，称取大豆油50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相；(2)称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
处方4：(1)在惰性气体环境下，称取MCT50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相；(2)称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
处方5：(1)在惰性气体环境下，称取大豆油-MCT(1∶1)50g，蛋黄卵磷脂(含80％磷脂酰胆碱)6.0g，搅拌混合均匀，作为油相；(2)称取油酸钠0.3g，甘油25g，加入适量注射用水，搅拌混合均匀，作为水相。
1.2工艺
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切，形成初乳。调节初乳pH值至5.0-10.0，以注射用水定容至1000ml。转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至合格，过滤后，灌装，灭菌，冷却后即得亚微乳疫苗佐剂。
1.3疫苗配制
疫苗溶液：流感裂解疫苗(B/Brisbane/60/2008)，血凝素(HA)浓度为300μg/ml。
佐剂溶液：上述处方1-5制备的水包油型亚微乳佐剂。
以pH7.4PBS将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。将上述处方1-5制备的水包油型亚微乳佐剂与以pH7.4PBS作适当稀释后的疫苗溶液等体积混合，分别作为疫苗+水包油型亚微乳佐剂(角鲨烯)免疫组、疫苗+水包油型亚微乳佐剂(角鲨烷)免疫组、疫苗+水包油型亚微乳佐剂(大豆油)免疫组、疫苗+水包油型亚微乳佐剂(MCT)免疫组、疫苗+水包油型亚微乳佐剂(大豆油-MCT)免疫组。
1.4动物免疫方案
将42只雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予流感疫苗，0.3μg HA/只；
第2组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂(角鲨烯)免疫组，0.3μg HA/只；
第3组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂(角鲨烷)免疫组，0.3μg HA/只；
第4组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂(大豆油)免疫组，0.3μg HA/只；
第5组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂(MCT)免疫组，0.3μg HA/只；
第6组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂(大豆油-MCT)免疫组，0.3μg HA/只；
第7组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水。
1.5免疫效果检测
免疫后第14天、28天，小鼠眼眶取血，分离血清。通过HI试验，测定血清中的血凝抑制滴度。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
1.6统计分析
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p＜0.05。从统计分析可知，以角鲨烯或角鲨烷作为油相时，HI滴度与总IgG滴度更高，表明角鲨烯和角鲨烷更适合作为水包油型亚微乳佐剂的油相。
实验例9：水包油型亚微乳佐剂对灭活脊髓灰质炎疫苗的佐剂作用
1.1疫苗配制
疫苗溶液：Sabin II型灭活脊髓灰质炎疫苗。
佐剂溶液：实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂。
以pH7.0PBS将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。将水包油型亚微乳佐剂与以pH7.0PBS作适当稀释后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组。
1.2动物免疫方案
将18只雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予灭活脊髓灰质炎疫苗，1.0μg/只；
第2组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，1.0μg/只；
第3组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水。
1.3免疫效果检测
免疫后第28天，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
1.4统计分析
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p＜0.05。从数据分析可知，水包油型亚微乳佐剂能使抗体滴度增加约3倍，显著高于单纯疫苗免疫组，表明本发明的水包油型亚微乳佐剂能明显提高灭活脊髓灰质炎疫苗的免疫效果。
实验例10：水包油型亚微乳佐剂对狂犬疫苗的佐剂作用
1.1疫苗配制
疫苗溶液：人用狂犬疫苗(地肾鼠细胞)，效价为3.5IU/ml。
佐剂溶液：实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂。
以生理盐水将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单独疫苗免疫组，将水包油型亚微乳佐剂与以生理盐水作适当稀释后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组。
1.2动物免疫方案
将42只雌性BALB/c小鼠随机分为7组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组I，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0天免疫1次；
第2组：疫苗免疫组II，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3天各免疫1次；
第3组：疫苗免疫组III，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3、7天各免疫1次；
第4组：疫苗免疫组IV，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3、7、14天各免疫1次；
第5组：疫苗免疫组V，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3、7、14、28天各免疫1次；
第6组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，0.25IU/只，第0天免疫1次；
第7组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水，第0天免疫1次。
1.3免疫效果检测
初次免疫后第4、8、12、16周，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：566
1.4统计分析
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p＜0.05。从数据分析可知，在免疫后初期(4-8周)，疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组的抗体滴度虽然低于疫苗免疫组V，但高于疫苗免疫组I-IV。在免疫后中后期(8-16周)，疫苗免疫组I-IV的抗体滴度先下降，然后上升至较低水平；而疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组与疫苗免疫组V的抗体滴度先下降，然后上升并维持在一个较高的水平。研究结果表明，本发明的水包油型亚微乳佐剂能显著提高狂犬疫苗的免疫应答，在免疫后中后期的抗体滴度与传统免疫方法(5针法)基本相当，但可减少免疫次数。
实验例11：水包油型亚微乳佐剂对乙型肝炎疫苗的佐剂作用
1.1疫苗配制
疫苗溶液：重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)。
佐剂溶液：实施例1制备的水包油型亚微乳佐剂。
以生理盐水将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。将水包油型亚微乳佐剂与以生理盐水作适当稀释后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组。
1.2动物免疫方案
将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予乙型肝炎疫苗，5.0μg HBsAg/只，第0、1、6月各免疫1次；
第2组：疫苗+Al(OH)3佐剂免疫组，5.0μg HBsAg/只，第0、1、6月各免疫1次；
第3组：疫苗+水包油型亚微乳佐剂免疫组，5.0μg HBsAg/只，第0、1、6月各免疫1次；
第4组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水，第0、1、6月各免疫1次。
1.3免疫效果检测
初次免疫后第4、8、16、24、32周，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
1.4统计分析
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p＜0.05。从数据分析可知，单纯给予乙型肝炎疫苗时，产生的IgG滴度较低，加入佐剂后，IgG滴度显著提高，且水包油型亚微乳佐剂高于Al(OH)3佐剂。
Claims (12)
1.作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳，其特征在于含有：
(1)角鲨烯或角鲨烷；
(2)乳化剂；和
(3)注射用辅料；
所述的乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、油酸、油酸钠中的一种或其以任何比例组成的混合物。
2.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述角鲨烯或角鲨烷的用量为1.0％-20％(w/v)，优选为2.0％-10％(w/v)，更优选为3.0％-6.0％(w/v)。
3.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述乳化剂的用量为0.05％-10％(w/v)，优选为0.1％-8％(w/v)，更优选为0.2％-1.0％(w/v)。
4.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述注射用辅料选自pH调节剂、等渗调节剂、注射用水或其它可接受的辅料。
5.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述pH调节剂选自盐酸、醋酸、甘氨酸、柠檬酸、磷酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾或其它可接受的酸碱。
6.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述pH调节剂的用量为0-2％(w/v)。
7.如权利要求1所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇、木糖醇中的一种或其以任何比例组成的混合物。
8.如权利要求7所述的水包油型亚微乳，其特征在于所述等渗调节剂的用量为0.5％-10％(w/v)，优选为0.8％-8％(w/v)。
9.如权利要求1-8任一项所述的水包油型亚微乳，其特征在于其粒径为100-500nm，优选为100-300nm，更优选为150-200nm。
10.制备权利要求1-9任一项所述的作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳的方法，包括以下步骤：
(1)制备油相：
在惰性气体环境下，将脂溶性乳化剂加入角鲨烯或角鲨烷中，至搅拌均匀作为油相；
(2)制备水相：
在惰性气体环境下，将水溶性乳化剂、pH调节剂、等渗调节剂或其它可接受的辅料加入注射用水中，搅拌均匀作为水相；
(3)制备初乳：
在惰性气体环境下，将油相和水相混合，持续高速剪切得初乳，用pH调节剂调节初乳的pH值至5.0-10.0，定容；
(4)制备水包油型亚微乳：
在惰性气体环境下，将初乳转至高压均质机均质，至乳滴粒径降低至500nm或以下，除菌，灌装，或灌装后热压灭菌，即得作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳。
11.如权利要求10所述的方法，其中(4)中所述除菌步骤采用0.22μm滤膜过滤来进行。
12.使用权利要求1-9任一项所述的作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳的方法，所述方法包括：
(1)所述水包油型亚微乳在使用前与疫苗混匀；
(2)所述水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，贮藏于2-8℃，直至临床使用；和
(3)所述水包油型亚微乳与疫苗混匀后，灌封，冻干，贮藏于2-8℃，临床使用前复融。
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