CN101217977A - 热致可逆的免疫佐剂乳液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水包油乳液佐剂,至少含有角鲨烯、水性溶剂、属于聚氧乙烯烷基醚的非离子表面活性剂和热致可逆的疏水性非离子表面活性剂,在该佐剂中,油滴体积分布的90%的粒度小于200nm。本发明还涉及制备免疫原性组合物的方法,其中将至少一种疫苗抗原与水包油乳液混合。本发明特征在于该水包油乳液通过温度变化的转相方法来获得。
Description
本发明涉及疫苗领域;更具体地说,本发明涉及包括乳液佐剂的疫苗领域。
现有技术中有许多含有一种或多种佐剂的疫苗。US专利6 299 884尤其公开了包括水包油乳液的佐剂制剂,其中油滴的粒度为100-1000nm。该乳液用高压均化器(微流化仪microfluidiseur)获得,在生产过程中,使用高机械能,以获得足以减小油滴粒度的剪切力。根据该教导,虽然所获得的液滴的粒度范围的最小值为100nm,但平均值要大得多,最好也不过是在170nm的范围内,更通常在500nm的范围内。
希望可以获得可替代该专利中提出的佐剂的制剂,该制剂可以通过更简单的方法(不需要任何特定的剪切技术)得到,该方法是低能量方法,同时可再现和完全可靠;另外,该佐剂制剂必须能够有效辅佐疫苗,尤其可以提高所获得的免疫应答或降低抗原的存在剂量,同时不表现对其完全安全给药有害的毒性迹象。
为了实现该目标,本发明的主题是水包油乳液佐剂,特征在于它至少包括下列组分:
-角鲨烯,
-水性溶剂,
-属于聚氧乙烯烷基醚的亲水性非离子表面活性剂,
-疏水性非离子表面活性剂,
其中该佐剂是热致可逆的,并且按容积计的油滴总数的90%具有小于200nm的粒度。
根据本发明,这种乳液可以用转相温度方法来获得,从工业的观点来看,该方法提供了很大的优点。这种方法提供了制药工业所需的所有安全和盈利保证。另外,用该方法可以获得单分散乳液,其液滴尺寸是非常小的,这使得这样获得的乳液尤其稳定和便于用截止阈值为200nm的除菌过滤器过滤。根据一个特定的特征,按容积计的油滴总数的90%(或d90)具有小于160nm,甚至小于150nm的粒度。
根据本发明的一个特定实施方案,本发明的乳液还包括醛醇;这使得可以在低于不含任何醛醇的相同组合物所需的温度的温度下获得转相,从而可以降低生产成本以及乳液成分热致变性的风险。
根据一个特别有利的实施方案,本发明的疏水性非离子表面活性剂是脱水山梨醇酯或二缩甘露醇酯。这种表面活性剂具有能够完全安全的用于注射液的优点。
根据本发明的一个特定实施方案,该乳液还包括烷基聚糖苷和冷冻保护剂如糖,尤其十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖。
因此,还可以获得可冻干乳液,在冻干和重构后恢复其性能,尤其粒度性能,即,冻干和重构的乳液仍然是单分散的,由总数的90%(按容积计)具有小于200nm的粒度的油滴组成。这种性能在疫苗领域中是特别重要的,因为由于稳定性(某些抗原或某些佐剂)的原因,疫苗有时必须以冻干形式保存。
本发明的一个主题也是制备免疫原性组合物的方法,根据该方法,将至少一种疫苗抗原与水包油乳液混合,特征在于,该水包油乳液用转相温度方法获得。
根据一个实施方案,本发明的方法包括至少一个通过冷却油包水倒相乳液制备水包油乳液的步骤,该乳液至少包括:
-角鲨烯,
-水性溶剂,
-属于聚氧乙烯烷基醚的亲水性非离子表面活性剂,
-疏水性非离子表面活性剂。
利用从工业的观点来看非常有利的这种方法,获得了即使在很低的抗原剂量下也非常有效的稳定性免疫原性组合物。
另外,利用该制备方法,乳液的全部油滴被测定为具有同样的极小的粒度;事实上,当测量粒度性能(粒度和粒度分布)时,可以发现,该乳液是单分散乳液,具有高斯型分布曲线,该曲线是非常窄的,集中于一低值,通常大约80-90nm。
根据本发明的方法的一个具体实施方案,油包水倒相乳液通过下列步骤制备:将角鲨烯、水性溶剂、属于聚氧乙烯烷基醚的非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂混合,首先获得水包油粗乳液,然后将该乳液加热到至少转相温度,以获得倒相乳液。以这种方式实施该方法具有限制乳液的各种成分接触高温的时间的优点。
根据另一个实施方案,本发明的方法包括下列步骤:
-首先将包括水性溶剂和聚氧乙烯烷基醚的水相和其次将包括角鲨烯和疏水性表面活性剂的油相单独加热到至少等于转相温度的温度,然后
-将该2个相混合,以获得油包水倒相乳液。
根据本发明的一个特定实施方案,水性和油相各自在混合之前单独加热到低于转相温度的温度。然后将该2个相混合,以便获得油包水乳液;然后将整个乳液加热到至少等于转相温度的温度,以获得油包水倒相乳液。
根据一个特定实施方案,本发明的制备方法还包括冻干步骤。因此,本发明的方法可用于制备包括因为稳定性的原因而必须以冻干形式保存的抗原的免疫原性组合物。
在阅读了以下的说明后,将会了解到本发明的许多其它优点。
对于本发明的说明书来说,本专利申请中提到的参数d50和d90是与容积有关的值;d50值表示按容积计的液滴总数的50%的值。
对于本发明来说,术语“水包油乳液”用来表示油相在水相中的分散体,该水相可以由水或盐水溶液组成,并任选进行了缓冲。根据本发明的一个特定实施方案,乳液的水相由缓冲液,例如Dulbecco磷酸盐缓冲液(D-PBS,不含钙或镁)组成。术语“乳液佐剂”用来表示免疫佐剂乳液,即,与在没有该乳液的情况下获得的应答相比,能够改进在给予抗原期间诱发的免疫系统的应答的乳液;该免疫系统应答可以反映在抗体的产生或某些细胞,尤其抗原提呈细胞(例如树突状细胞)、T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活上。该细胞激活可以通过细胞表面存在的激活标志物或细胞因子的释放来证实。由佐剂乳液诱发的免疫应答的改进可以是量上的改变,即,增强了诱发的应答,或者是质的改变,即,获得了不同性质或不同方向的应答,或者获得了另外的应答。术语“佐剂乳液”还用来表示对于相同的诱发应答可以减少所需的抗原给药量的乳液。
对于本发明来说,术语“免疫原性组合物”用来表示包括至少一种抗原并且可以给药于人或动物以便获得免疫系统应答的组合物。该应答可以是体液应答(抗体产生)或者细胞应答(免疫细胞的增殖和/或激活)。该免疫原性组合物可以是用于预防目的或治疗目的或二者的组合物。根据本发明获得的免疫原性组合物可以经由疫苗正常使用或推荐使用的任何途径给药:胃肠外或粘膜途径,并且可以制成各种形式,尤其液体或冻干形式。它可以用注射器或肌内、皮下或皮内注射用无针头注射器或鼻喷入法给药。
对于本发明来说,术语“抗原”用来表示可在疫苗中使用的任何抗原,不论它包括整个微生物还是亚单位抗原,也不论它的性质如何;该抗原事实上可以是肽,蛋白,糖蛋白,多糖,糖脂,脂肽等。根据本发明的佐剂乳液尤其适合于病毒抗原;实际上,用人巨细胞病毒、人类免疫缺陷性病毒和流感病毒抗原已经获得特别好的结果。至于流感病毒抗原,可以使用来源于单一病毒株的抗原或来源于多个病毒株的抗原混合物。可采用来源于用卵或细胞常规培养的病毒。利用本发明,已经发现,不论是单株还是多株混合物,均可以获得令人满意的免疫系统应答,同时,显著减少了疫苗剂中存在的抗原量。这在制备针对流行性感冒的疫苗的情况下具有特别重大的价值,因为在该情况下必须要在很短的时间内生产出大量的疫苗剂。
根据本发明,水包油乳液包括角鲨烯,它是最初来源于鲨鱼肝脏的油;该油的实验化学式为C30H50,包括6个双键;该油是可代谢的,具备可允许用于注射药品的品质。还有从橄榄油中提取的植物来源的角鲨烯。使用动物来源的由Fluka公司提供的角鲨烯尤其获得了好的结果。用于制备浓缩乳液的角鲨烯的量有利地为5-45%;该浓缩乳液随后在制备免疫原性组合物的期间被稀释,以制备角鲨烯量为0.5-5%的免疫剂量。该稀释可以通过将根据本发明的佐剂乳液与包含抗原的悬浮液简单混合来进行。
根据本发明,该乳液包括非离子亲水性表面活性剂,它的亲水性/亲油性平衡值或HLB大于或等于10,属于聚氧乙烯烷基醚(PAE)的化学族,还称为聚氧乙烯化脂肪醇醚,或正烷基聚氧乙烯二醇醚。这些非离子表面活性剂通过脂肪醇和环氧乙烷之间的化学缩合来获得。它们具有CH3(CH2)x-(O-CH2-CH2)n-OH类化学式,其中n表示氧化乙烯单元的数目,通常是10-60,x+1是碳数,取决于所使用的脂肪醇。一般,这些产品是具有类似长度的烃型链的聚合物的混合物。根据本发明的乳液通常包括单一亲水性PAE。几种PAE的混合物也是适合的,只要总HLB值≥10。适用于本发明主题的聚氧乙烯化脂肪醇醚在环境温度下可以为液态或固态。在固态化合物中,优选直接溶于水相或不需要过度加热的那些。
只要氧化乙烯单元的数目足够,月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、油醇和/或硬脂醇的聚氧乙烯化醚特别适合于本发明的主题。它们尤其可以在下列商品名的产品系列中找到:ICI America’s Inc.公司出售的产品Brij,Cognis公司出售的产品Eumulgin,或SEPPIC公司出售的产品Simulsol。
根据本发明的一种特别优选的乳液含有选自下列组中的聚氧乙烯烷基醚作为非离子亲水性表面活性剂:ceteareth-12(以EumulginB1的商品名出售),ceteareth-20(EumulginB2),steareth-21(EumulginS21),ceteth-20(Simulsol58或Brij58),ceteth-10(Brij56),steareth-10(Brij76),steareth-20(Brij78),oleth-10(Brij96或Brij97)和oleth-20(Brij98或Brij99)。分配给每一化学名称的数字对应于化学式中的氧化乙烯单元的数目。
用产品Brij56已经获得了良好的结果。由于其半合成来源而特别适合和优选的化合物是由Cognis公司供应的商品名为EumulginTMB1的聚氧乙烯(12)鲸蜡/硬脂醚。该化合物是CH3(CH2)15-(O-CH2-CH2)12-OH和CH3(CH2)17-(O-CH2-CH2)12-OH的混合物。
根据本发明,该佐剂乳液还包括疏水性非离子表面活性剂;它必须是能够用于制药工业的表面活性剂;在这方面适合的表面活性剂中,可以提到脱水山梨醇酯和二缩甘露醇酯;脱水山梨醇酯通过脂肪酸与山梨醇的偏酯及其单酸酐和二酸酐的混合物的反应来获得;这可以包括单酯、二酯或三酯,或甚至混合物;它们是疏水性表面活性剂,为此,总亲水性亲油性平衡值(HLB)小于9,优选小于6。它们尤其可以在ICI AmericasInc.公司以Span的商品名出售或Cognis公司以DehymulsTM的商品名出售或ICI公司以ArlacelTM的商品名出售的表面活性剂系列中找到;作为尤其适合的表面活性剂的实例,可以提到以Dehymuls SMOTM或Span80的商品名出售的脱水山梨醇单油酸酯。在由二缩甘露醇酯组成的表面活性剂中,可以提到由Sigma公司出售的二缩甘露醇单油酸酯或Seppic公司以Montanide 80TM的商品名出售的二缩甘露醇单油酸酯。
通过在现有技术中提出用于制备乳液的所有表面活性剂中选择这些特定表面活性剂,现已发现,可以有利地采用转相方法制备水包油佐剂乳液。
为此,有利地选择所使用的角鲨烯和每一种表面活性剂的量,以便混合物,其相位图包括零平均曲率相(微乳液或层状相类型),因为它的界面张力是极低的。在使用角鲨烯的情况下,已经发现,当所使用的各种表面活性剂的总HLB值为8.5-10,更尤其8.6-9.6时,所获得的乳液是稳定的和单分散的,油滴具有非常小的尺寸(d90小于200nm)。为了确定乳液组合物中相应的亲水性和疏水性表面活性剂的浓度,可以使用下式:
HLBm=(HLBe×M)+HLBpae(1-M),其中
HLBm对应于该混合物的HLB,优选为8.5-10,更尤其8.6-9.6,
HLBe对应于疏水性表面活性剂的HLB,
M对应于由疏水性表面活性剂和聚氧乙烯烷基醚(PAE)组成的混合物中的疏水性表面活性剂的质量百分率,
HLBpae对应于PAE的HLB。
已经注意到,通过使用5-45%的角鲨烯浓度,可有利地获得转相温度低于95℃的乳液。对于这种乳液,可以使用浓度为0.9-9%的聚氧乙烯烷基醚和浓度为0.7-7%的疏水性非离子表面活性剂;该乳液的剩余物由水性溶剂组成。
根据本发明的一个特定实施方案,该免疫原性组合物还包括醛醇,尤其例如甘油,赤藓醇,木糖醇,山梨醇或甘露醇。用Roquette Frères公司出售的甘露醇尤其获得了良好的结果。该制备方法中使用的醛醇的量可以是1-10%,更尤其2-7%。
根据本发明的一个特定实施方案,佐剂乳液还包括冷冻保护剂,它使得可以冻干所获得的乳液;在冷冻保护剂中,糖是特别优选的,尤其是蔗糖。另外,根据本发明的乳液可以包括烷基聚糖苷,它是具有糖帽的表面活性剂;它尤其可以是癸基-D-半乳糖苷糖醛酸钠,或根据一个优选实施方案,是可从Roche公司获得的十二烷基-β-麦芽糖苷。
利用通过改变温度获得的转相制备根据本发明的乳液的方法,可以容易并可再现地获得非常均匀的油滴尺寸:d90值(按容积计)小于200nm,优选小于150nm,甚至接近100nm,而d50值小于100nm,或甚至90nm。根据本发明的方法制备的大多数乳液可以获得大约80nm的d50值与大约100nm的d90值(用Coulter LS230测定)。因此可以将所获得的乳液除菌过滤,只要该乳液被充分稀释。
这种液滴尺寸均匀且很微细的乳液是长期稳定的。因此可以发现,根据本发明制备和在4℃下储藏的乳液在2年后保持了单分散分布,具有90nm的d50值和116nm的d90值,这证明该乳液是非常稳定的。
液滴的尺寸可以通过各种方式来测定,尤其通过激光衍射粒度法来测定,例如LS系列的Beckman Coulter设备(尤其LS230)或Mastersizer系列的Malvern设备(尤其Mastersizer 2000)。这些设备的测量基于以下原理:当用激光束照射样品时,分析随角度(大、中和小角检测器)而变的由颗粒散射的光的强度。该分析通过根据所用材料的粒度和性质选择的数学模型来进行。在测量亚微颗粒的尺寸的情况下,考虑到样品的折射指数(这里是角鲨烯的1.495)和及其介质的折射指数(这里是水的1.332),有必要应用特定光学模型(Mie理论);还需要能够检测由极细颗粒发射的弱强度,这要求优化分析:
-用于大角偏振强度差示散射测量的附加检测元件(出自Coulter的PIDS系统,允许从40nm测量),
-结合2个波长(蓝光和红光)的检测系统,出自Malvern。较短波长的蓝光源与宽角度散射和反向检测器的联合增强了亚微范围的分析的性能水平。
根据所使用的设备,测量可以随所使用的设备的组件和所使用的数据处理软件而稍有变化。因此,根据本发明的同一乳液用该2种设备分析,获得了下列结果:
-使用LS230,具有以下参数:IR颗粒=1.495;IR介质=1.332;吸收值=0;d50=80-90nm和d90=120-130nm;
-使用Mastersizer 2000,具有以下参数:IR颗粒=1.495;IR介质=1.332;吸收值=0;模糊=4-7%;“通用”光学模型;d50=90-100nm和d90=140-150nm。
根据本发明的方法可以按以下方式进行:通过将水相(缓冲液,任选添加有醛醇,包括聚氧乙烯烷基醚)引入到油相(角鲨烯和疏水性非离子表面活性剂)中;或者相反通过将油相引入到水相中来制备浓缩的粗水包油乳液。那么获得了未校准的水包油乳液,快速显示了不稳定性。将该乳液搅拌并加热,直到获得转相,即,获得了油包水乳液。转相或倒相可以通过电导分析法来监视。事实上,在温度升高的过程中,电导率增加,直到发生转相为止;此时,可观察到相对急剧的电导率下降。跟随电导率发生曲线曲率的改变的温度反映了从一种类型的乳液过渡到另一种类型的乳液;它就是转相温度。实际上,该温度是一个温度范围而非一个非常精确的点值;事实上,可以认为该温度是被确定在±1或2度范围内的温度,其中整个乳液经历了转相现象。一旦达到该转相温度,因此一旦存在油包水乳液,停止加热,将该混合物冷却。冷却可以被动进行,通过简单让乳液自动返回到环境温度,或者更主动地通过将该乳液浸渍在例如冰浴中来进行。当温度通过转相温度时,油包水乳液将再次发生倒转,从而再次获得水包油乳液,其中这次油滴的尺寸是非常均匀的和细小的;所得乳液那么是非常稳定的。它可以原样储存,等候用包括疫苗抗原的溶液稀释。该乳液是热致可逆的,这意味着,如果又将它升高到转相温度以上的温度,它将再次变成油包水乳液。要指出的是,对于同一乳液,用于跟踪电导率的曲线是可叠合的,不管所经历的热致倒转的次数如何,并且所获得的乳液总是具有相同的粒度分布。
根据本发明,有利的是,选择乳液的配方,使得具有低于95℃,更尤其45-80℃,还更尤其50-65℃的转相温度。该温度范围是有利的,因为如果将该乳液在相对高的温度(≈37℃)下储存,乳液没有状态改变的危险。此外,在制备热致可逆的乳液的方法中,各组分的加热不是太严格的,所以这有助于保持各组分的结构完整性。当该乳液的转相温度很高时,尤其当它高于或大约80℃时,可以通过向该乳液的组合物添加醛醇而有效降低,该醛醇正常选自山梨醇、甘露醇、甘油、木糖醇或赤藓醇。当醛醇以1-10%(w/w)的浓度范围,尤其以2-7%(w/w)的浓度范围使用时,乳液的转相温度降低大约10℃。还可以通过用缓冲盐水水相代替仅仅由水组成的水相来降低该乳液的转相温度。正常使用Tris缓冲液,或磷酸盐缓冲液,例如PBS,或不含Ca2+和Mg2+的DulbeccoPBS缓冲液。
还存在刚才所述方法的替代方法。具体地说,如刚才所述,可以将水相和油相二者混合,以便获得粗乳液,然后加热和冷却。另外,已经制备的2个相可以单独加热到稍高于转相温度的温度,之后混合,从而获得油包水倒相乳液,再冷却到获得水包油亚微乳液。还可以在混合之前轻微加热每一个相,获得水包油乳液,然后将该乳液加热到转相,之后冷却。
所有这些操作可以在用于间歇制备法的单独容器内进行,但还可以采用在线方法。
在线制备乳液的方法尤其可以包括用恒温静态混合器在热条件下将预先单独制备的水相和油相二者混合,随后用在静态混合器的出口连接的致冷换热器在线冷却,然后在适当的容器(烧瓶或反应器)内最终回收根据本发明的乳液。使用由一系列的混合元件组成的静态混合器很成功,该混合元件由相对于它们被引入的管轴倾斜的交叉叶片组成。混合所需的能量由输送流体的泵提供,该混合不用任何活动部件,凭借该混合物的各个成分的分开、转移和连续合并通过所述混合元件来进行。
在线生产方法按下列方式进行:在两个烧瓶或反应器内单独制备水相(包括聚氧乙烯烷基醚的缓冲液)和油相(角鲨烯和疏水性非离子表面活性剂)。将该两个相在搅拌下加热到稍高于转相温度的温度。然后用2个泵将该两个相引入到恒温静态混合器内,并且调节流速以获得根据本发明的乳液的组成。在该两个相在静态混合器内通过的期间获得了油包水倒相乳液。随后通过让该倒相乳液在线经过在静态混合器的出口连接的致冷换热器而将它冷却。该油包水乳液然后通过致冷换热器而倒转,获得水包油乳液,在烧瓶或反应器内收集,它的特性与通过间歇方法获得的乳液相同。
根据本发明的佐剂乳液然后用于制备免疫原性组合物。一个简单的实施方案包括将含有至少一种疫苗抗原的溶液与根据刚才所述的实施方案之一获得的乳液混合。所得免疫原性组合物为水包油乳液形式,或当角鲨烯的量占免疫原性组合物总质量的至少5质量%时,为热致可逆的水包油乳液的形式。另外,可以在制备乳液之前将抗原与水相或与油相混合。以这种方式实施该方法当然意味着所述抗原是与热致倒转方法相容的抗原。抗原的溶液还可以含有无机盐或一种或多种缓冲剂以及正常用于疫苗的任何其它化合物,例如稳定剂,防腐剂或任选的其它佐剂。
为了制备可冻干的乳液,首先如刚才所述制备浓缩的液体乳液,但优先选择水而非缓冲液作为水相,然后该乳液用包括醛醇、糖和烷基聚糖苷的溶液,例如包括甘露醇、蔗糖和十二烷基麦芽糖苷的溶液稀释。然后将所得乳液分割为数个样品(例如0.5ml),并经历冻干周期,这可以按下列方式进行:
-在+4℃下加样,
-在-45℃的设定温度下冷冻大约2小时,
-在0℃的设定温度下初次干燥14-19小时,
-在+25℃的设定温度下二次干燥3小时30分钟。
所得乳液然后可以保存到用于制备免疫原性组合物为止,即,直到它与包括疫苗抗原的组合物合并为止。制备免疫原性组合物的该步骤可以通过用包括抗原的水溶液溶解该冻干的乳液来进行。这样获得的免疫原性组合物随后可以在液态下保存,或者可以进行进一步冻干周期,以便以冻干物的形式保存,如果抗原的性质允许这样做的话。
另外,可以用包括疫苗抗原以及醛醇、糖和烷基聚糖苷的水溶液直接稀释该浓缩乳液,随后让所得组合物进行冻干。这种实施方式当然意味着抗原是与冻干方法相容的抗原。
以下实施例说明了本发明的各个实施方案。
实施例1:根.据本发明的佐剂乳液的制备
在烧杯内将3.71g的EumulginTMB1和33.9g的甘露醇在PBS缓冲液中的10%溶液混合,该混合物在大约30℃下通过搅拌而被均化。
在另一容器内,将2.89g的DehymulsTMSMO和19.5g的角鲨烯磁力搅拌。
当在每一容器内获得均相时,将水相引入到在搅拌的同时保持在30℃的油相中。
当引入完成后,将所获得的粗乳液加热,直到温度达到58-60℃为止,同时,保持搅拌。然后停止加热,但保持搅拌,直到温度达到环境温度为止。
然后获得了水包油乳液,油滴的尺寸集中于大约80nm(使用LS230测定),它的质量组成如下所示:
-32.5%的角鲨烯,
-6.18%的聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醚,
-4.82%的脱水山梨醇单油酸酯,
-6%的甘露醇。
实施例2:抗AIDS疫苗组合物
制备包括去毒TAT III B蛋白作为抗原的疫苗组合物。TAT蛋白通过在碱性介质中使用碘乙酰胺在下列条件下的烷基化反应来去毒:碘乙酰胺的微摩尔数=200×TAT的微摩尔数+DTT的微摩尔数。该去毒蛋白及其制备方法在专利申请WO99/33346中有详细说明,在该申请中,它被标识为羧甲基化TAT。该重组TAT抗原在溶液中在50mM Tris缓冲液pH7.5的存在下在-70℃下保存。
由浓缩溶液制备所要给药的疫苗组合物,以获得具有下列定量组成的200μl的免疫剂量:
-仅含有抗原的组合物:在50mM Tris缓冲液中的20μg的TAT,100mM NaCl,pH7.5;
-根据本发明的组合物:
·20μg的TAT,
·5mg的角鲨烯,
·0.75mg的DehymulsTMSMO,
·0.94mg的EumulginTMB1,
·0.91mg的甘露醇。
设两组,每组六只8周龄雌性BALB/c小鼠,皮下注射所制备的组合物之一,比例为每只鼠200μl的一个剂量;在D0和D21给予注射。在D14时从眼球后静脉窦(retroorbital sinus)取血样来评价初次应答,在D34时取血样评价再次应答。特异性IgG1和IgG2a滴度通过标准ELISA分析法来测定。在D37时处死小鼠;取它们的脾脏,分离脾细胞。
所获得的关于体液应答的结果在下表中总结,其中IgG滴度以任意ELISA单位(log10)表示。对于每一组小鼠,表中所给出的值是每一只小鼠获得的值的几何平均滴度。
疫苗组合物 | D14时的IgG1 | D14时的IgG2a | D34时的IgG1 | D34时的IgG2a | D34时的IgG1/IgG2a比 |
Tat | 2.6 | 1.2 | 4.4 | 3.0 | 25 |
Tat+PIT | 3.5 | 2.5 | 5.7 | 5.0 | 5 |
所得结果显示,根据本发明的乳液可以总体上提高体液免疫,并且还倾向于促进1型T辅助细胞应答,因为IgG2a应答增加超过了IgG1应答。
关于细胞应答,通过ELISPOT分析法可以证明,在用重组TAT蛋白重新刺激所取出的脾细胞后,来源于用根据本发明的制剂免疫的小鼠的脾细胞的产γ-干扰素的细胞数明显增加(486点/106细胞比仅含抗原的制剂的39点/106细胞)。类似地,培养基上清中的细胞因子的分析显示,γ-干扰素(5028pg/ml对1940pg/ml)和白介素5(5365pg/ml对2394pg/ml)分泌均更高。
实施例3:抗人巨细胞病毒感染的疫苗组合物的制备
制备包括由巨细胞病毒(CMV)Towne株的包膜糖蛋白(称为gB)获得的重组蛋白作为疫苗抗原的疫苗组合物,它的核苷酸和蛋白序列在专利USP 5,834,307中有描述。该重组蛋白通过用含有修饰gB基因的称为pPRgB27clv4的质粒转染的重组CHO系产生。具体地说,为了促进CHO系产生该重组蛋白,gB基因预先通过删除编码对应于缬氨酸677和精氨酸752之间的氨基酸序列的gB蛋白跨膜区的基因部分以及通过引入3个点突变,使得存在于天然gB中的分裂部位被消除来进行修饰。事实上,通过该重组CHO系生产的重组蛋白对应于缺乏分裂部位和跨膜区的截短gB蛋白,称为gBdTM。
质粒pPRgB27clv4的构建和重组CHO系产生截短gB蛋白(gBdTM)的方法在US 6,100,064中有描述。截短gB蛋白用采用Rasmussen L.等人所述的单克隆抗体15D8(J.Virol.(1985)55:274-280)的免疫亲和色谱柱纯化。
由这样获得并保持在磷酸盐缓冲液中的含有0.975mg/ml的gB抗原的原料组合物,制备具有下列组成的如实施例1所述浓缩的根据本发明的乳液以及通过微流化获得的现有技术的乳液,50μl剂量的免疫组合物,:
-20μg的gB,在pH6的柠檬酸盐缓冲液中(仅含gB的组),
-20μg的gB;1.075mg的角鲨烯;0.133mg的MontaneTMVG85和0.125mg的TweenTM80,在pH6的柠檬酸盐缓冲液中(含有现有技术乳液的组),
-20μg的gB;1.25mg的角鲨烯;0.185mg的DehymulsTMSMO;0.235mg的EumulginTMB1和0.230mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中(含有本发明乳液的组)。
设三组,每组十只8周龄雌性Outbred OF1小鼠,在D0和D21时用上述组合物之一皮下接种两次(每一组小鼠两次给予相同的组合物)。在D20和D34时从眼球后静脉窦采血样,用于测定gB抗原特异性的IgG1和IgG2a型抗体的浓度。
用ELISA分析法检测;所得结果在下表中给出,按ELISA滴度的log10表示。所给出的值是每一组小鼠的平均值。
每组的情况 | D20 | D34 | D34时的IgG1/IgG2a比 | ||
IgG1 | IgG2a | IgG1 | IgG2a | ||
仅含gB | 2.474 | 2.094 | 3.801 | 2.941 | 137 |
gB+现有技术乳液 | 4.063 | 2.980 | 5.493 | 4.185 | 143 |
gB+根据本发明的乳液 | 4.615 | 3.914 | 5.615 | 4.854 | 14 |
这些结果显示了根据本发明的乳液的效力,即可以诱发更大量的抗体,包括IgG1型和IgG2a型的抗体,另外,与根据现有技术的乳液比较,获得了抗人巨细胞病毒的疫苗的所需的结果,也就是说,使免疫应答朝向TH1应答(它的指标是IgG2a滴度),同时保持了充分的TH2-型应答(它的指标是IgG1滴度)。
实施例4:抗流感疫苗组合物
流感病毒抗原可以根据专利申请WO96/05294的实施例中所述的方法来获得,只是所使用的病毒株是A/新喀里多尼亚(New Caledonia)H1N1株。
使用该抗原制剂、实施例1中获得的根据本发明的浓缩乳液和以A100H Rehydra的名称由REHEIS提供的铝的悬浮液,制备50μl免疫剂,该剂具有以下所示的组成,其中抗原的量按血球凝集素HA的重量来表示:
-PBS缓冲液中的1μg的HA,
-或PBS缓冲液中的5μg的HA,
-或1μg HA和60μg的氢氧化铝,
-或1μg的HA;1.25mg的角鲨烯;0.185mg的DehymulsTMSMO;0.235mg的EumulginTMB;0.21mg的甘露醇;整个混合物在PBS缓冲液中。
设8组,每组5只八周龄雌性BALB/c小鼠,D0时给予根据下列方案制备的组合物:
-一组皮下注射含有1μgHA的组合物,
-一组皮内注射含有1μgHA的相同组合物,
-一组皮下注射含有5μgHA的组合物,
-一组皮内注射含有5μgHA的相同组合物,
-一组皮下注射含有1μgHA和60μg铝的组合物,
-一组皮内注射含有1μgHA和60μg铝的相同组合物,
-一组皮下注射含有1μgHA和根据本发明的乳液的组合物,
-一组皮内注射含有1μg HA和根据本发明的乳液的组合物,
在D14、D28、D41、D56和D105时从每一只小鼠采血样。免疫小鼠的血清首先用ELISA技术分析,以评价所诱发的抗三价疫苗的流感病毒株A/H1N1的总抗体含量(抗体滴度表示为任意ELISA单位的log10值,检测阈为1.3log10),其次用HAI(血球凝集抑制)技术来分析,以便测定它们的抗流感病毒株A/H1N1的功能抗体的含量。抗体滴度表示为算术值稀释度倒数,检测阈为5。
所得结果在下表中提供,其中所给出的值表示每一组小鼠的滴度的平均值。
ELISA滴度:
小鼠组 | 免疫途径 | D14 | D28 | D41 | D56 | D105 |
HA 1μg | 皮下 | 2.838 | 3.288 | 3.556 | 3.581 | 3.535 |
HA 5μg | 皮下 | 3.203 | 3.642 | 3.836 | 3.732 | 3.844 |
HA 1μg+A100H | 皮下 | 2.860 | 3.363 | 3.843 | 3.951 | 3.982 |
HA 1μg+乳液 | 皮下 | 4.043 | 4.511 | 4.753 | 4.723 | 4.681 |
HA 1μg | 皮内 | 2.174 | 2.814 | 3.143 | 3.075 | 2.735 |
HA 5μg | 皮内 | 2.839 | 3.297 | 3.496 | 3.549 | 3.479 |
HA 1μg+A100H | 皮内 | 2.654 | 3.004 | 3.137 | 3.020 | 2.724 |
HA 1μg+乳液 | 皮内 | 4.134 | 4.692 | 4.895 | 4.911 | 4.823 |
HAI滴度:
小鼠组 | 免疫途径 | D14 | D28 | D41 | D56 | D105 |
HA 1μg | 皮下 | 5 | 6 | 5 | 40 | 23 |
HA 5μg | 皮下 | 5 | 9 | 20 | ||
HA 1μg+A100H | 皮下 | 5 | 15 | 23 | 121 | 160 |
HA 1μg+乳液 | 皮下 | 6 | 160 | 368 | 422 | 485 |
HA 1μg | 皮内 | 5 | 5 | 5 | 23 | 8 |
HA 5μg | 皮内 | 5 | 8 | 10 | ||
HA 1μg+A100H | 皮内 | 5 | 5 | 5 | 26 | 7 |
HA 1μg+乳液 | 皮内 | 7 | 557 | 1640 | 1557 | 1844 |
这些结果显示了本发明的优点;具体地说,属于现有技术中广泛使用的公知佐剂的氢氧化铝没能以与本发明的制剂相同的快速和相同的强度提高流感抗原的免疫原性;还注意到,根据本发明的组合物是特别有效的,无论是皮下还是皮内给药。
实施例5:抗流感疫苗组合物
目的是在所牵涉的疫苗是含有3个流感病毒株作为抗原并且皮内给药的抗流感疫苗的情况下在小鼠中评价本发明降低疫苗抗原量的优点。
为此,实施例1的浓缩乳液用PBS缓冲液稀释,以获得5%角鲨烯乳液,进一步用包括抗原的组合物对半稀释。
以专利申请WO 96/05294中所述的方式获得的包括来源于3个不同病毒株的流感病毒的组合物实际上可以获得,该三个株在该情况下是A/新喀里多尼亚(H1N1)株,A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株。这种三价疫苗组合物通常用于流感疫苗,对应于在2004年流感流行期在北半球出售的疫苗。每一种病毒株的抗原量通过它们的血清凝集素HA的量来评价。所制备的免疫剂量具有50μl的体积,组成如下所示:
-0.33μg的每一病毒株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-1.31μg的每一病毒株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-5.25μg的每一病毒株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-10.5μg的每一病毒株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-21μg的每一病毒株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-0.33μg的每一病毒株的HA;1.25mg的角鲨烯;0.185mg的DehymulsTMSMO;0.235mg的EumulginTMB1和0.230mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-1.31μg的每一病毒株的HA;1.25mg的角鲨烯;0.185mg的DehymulsTMSMO;0.235mg的EumulginTMB1和0.230mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-5.25μg的每一病毒株的HA;1.25mg的角鲨烯;0.185mg的DehymulsTMSMO;0.235mg的EumulginTMB1和0.230mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中。
设8组,每组十只6-8周龄雌性BALB/c小鼠,皮内(耳朵的内表面)给予所制备的组合物之一,每组一种组合物。
免疫后三周,采集血样,通过ELISA分析所诱发的每一组的抗每一病毒株的IgGs;每一组还进行抗每一病毒株的血球凝集素抑制试验。
所得结果在下表中以每一组的平均值的方式提供。ELISA结果表示为任意单位的log10,HAI结果是稀释度倒数的平均算术滴度。
性质组成 | H1N1 | H3N2 | B | |||
ELISA | HAI | ELISA | HAI | ELISA | HAI | |
0.33μgHA | 3.51 | 35 | 4.38 | 243 | 4.28 | 25 |
1.31μgHA | 3.96 | 65 | 4.74 | 640 | 4.35 | 32 |
5.25μgHA | 4.16 | 92 | 5.05 | 970 | 4.62 | 53 |
10.5μgHA | 4.38 | 197 | 5.18 | 1810 | 4.71 | 130 |
21μgHA | 4.63 | 260 | 5.37 | 2389 | 4.98 | 184 |
0.33μgHA+乳液 | 4.27 | 226 | 5.20 | 2389 | 4.91 | 149 |
1.31μgHA+乳液 | 4.46 | 279 | 5.37 | 3880 | 4.95 | 171 |
5.25μgHA+乳液 | 4.68 | 394 | 5.58 | 5487 | 5.12 | 22 |
这些结果证明了本发明减少抗原量的优点;具体地说,利用根据本发明的乳液,在诱发相同的免疫应答的情况下,可以显著减少免疫剂量中存在的抗原量。
实施例6:抗非初次接触(non-naive)人群流感的三价疫苗组合物
目的是测试本发明的乳液在给药于身体已经与流感病毒抗原接触的个体的流感疫苗的情况下的效力,这种情况很常见,要么个体已经与流感病毒接触,要么因为它们预先用流感疫苗免疫。
根据C.W.Potter在Vaccine,2003,21:940-5中所公开的信息,可以使用用三价疫苗肌内预先免疫的BALB/c小鼠作为进行该试验的动物模型。
因此制备仅含有PBS缓冲液,或在pH7.4的PBS缓冲液中含有2004年流行期的三价疫苗,即含有A/新喀里多尼亚(H1N1)株、A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株的疫苗的50μl的免疫制剂,按5μg的每一病毒株的HA的比例使用。设成6组,每一组7只BALB/c小鼠;3个组用仅含有缓冲液的制剂肌内免疫,另3组用三价疫苗肌内接种。还由实施例1的浓缩乳液和包括上述3个2004年流行期病毒株的疫苗组合物制备30μl的免疫制剂,这些免疫制剂具有下列组成:
-仅含PBS缓冲液,
-0.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.3μg的每一病毒株的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTMSMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中。
这样制备的每一种组合物用于在D34时皮内免疫(在耳朵的内表面)预先仅接受PBS缓冲液的小鼠组和已经接受三价疫苗剂的小鼠组。
在D56时,采集每一小鼠的血样,用血球凝集素抑制试验滴定所产生的抗H1N1株(A/新喀里多尼亚)的抗体。
所得结果在下表中总结,代表按照相同免疫程序接种的每一组小鼠所获得的平均值。
小鼠组编号 | 用于im初次诱导的剂量的性质 | 用于id强化的剂量的性质 | 针对H1N1株的HAI滴度 |
A | PBS | PBS | 5 |
B | PBS | 含有0.3μgHA/株的三价疫苗 | 59 |
C | PBS | 含有0.3μgHA/株+乳液的三价疫苗 | 320 |
D | 含有5μgHA/株的三价疫苗 | PBS | 145 |
E | 含有5μgHA/株的三价疫苗 | 含有0.3μgHA/株的三价疫苗 | 476 |
F | 含有5μgHA/株的三价疫苗 | 含有0.3μgHA/株+乳液的三价疫苗 | 861 |
这些结果表明了本发明的优点,即使对于非初次接触所给予的抗原的那些个体。事实上,与C.W.Potter使用该模型时的观察结果相反,这里已经发现,根据本发明的乳液可以显著提高所诱发的应答,不论是用未接触的小鼠还是用已经用流感疫苗接种的小鼠,而C.W.Potter在使用Iscoms免疫预先感染或预先接种了流感抗原的的小鼠时仅仅能表明Iscoms的弱佐剂效应。
实施例7:含有低剂量抗原的抗流感的三价疫苗组合物
由实施例1的浓缩乳液和包括3个2004年流行期病毒株(A/新喀里多尼亚(H1N1)株、A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株)的疫苗组合物制备30μl的免疫制剂,这些免疫制剂具有下列组成:
-0.1μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.4μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-1.6μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-6.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.1μg的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTMSMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中,
-0.4μg的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTMSMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中,
设成6组,每一组8只八周龄雌性BALB/c小鼠,在D0时皮内(耳朵的内表面)给予30μl剂量的下述组合物之一(每一组一种组合物)。在每一组中,在D29时,对一半小鼠再次皮内给予与第一剂量相同性质的第二剂量。在D22和D43时采集血样,以便测定所诱发的抗体的量。
通过ELISA分析在D22和D43时所诱导的针对所有给药病毒株:H1N1、H3N2和B的抗体的滴度,并且通过HAI在D22和D43时分析仅针对H1N1株的抗体的滴度。所得结果在下表中总结,其中所表示的滴度是每一组小鼠的平均值。关于D43的结果,在同一组内单独测定接受了2个剂量的疫苗和仅接受一个剂量的小鼠的平均值。
疫苗组合物 | D22时的H1N1ELISA滴度 | D22时的H3N2ELISA滴度 | D22时的B ELISA | D22时的H1N1HAI滴度 | D43时的H1N1HAI滴度 | |
强化小鼠 | 非强化小鼠 | |||||
0.1μgHA | 3.467 | 4.131 | 4.063 | 57 | 95 | 80 |
0.4μgHA | 3.816 | 4.527 | 4.313 | 73 | 226 | 80 |
1.6μgHA | 4.069 | 4.831 | 4.750 | 147 | 1280 | 135 |
6.3μgHA | 4.534 | 5.298 | 4.947 | 320 | 1522 | 320 |
0.1μgHA+乳液 | 4.200 | 5.015 | 4.807 | 207 | 2153 | 538 |
0.4μgHA+乳液 | 4.612 | 5.482 | 5.001 | 453 | 2560 | 640 |
疫苗组合物 | D43时的H1N1 ELISA滴度 | D43时的H3N2 ELISA滴度 | D43时的B ELISA滴度 | |||
强化小鼠 | 非强化小鼠 | 强化小鼠 | 非强化小鼠 | 强化小鼠 | 非强化小鼠 | |
0.1μgHA | 3.833 | 3.425 | 4.782 | 4.174 | 4.479 | 3.911 |
0.4μgHA | 4.385 | 3.599 | 5.250 | 4.354 | 5.053 | 4.079 |
1.6μgHA | 4.906 | 3.876 | 5.526 | 4.779 | 5.458 | 4.487 |
6.3μgHA | 5.287 | 4.176 | 6.073 | 5.033 | 5.678 | 4.773 |
0.1μgHA+乳液 | 5.210 | 4.523 | 5.990 | 5.264 | 5.723 | 4.943 |
0.4μgHA+乳液 | 5.394 | 4.790 | 6.171 | 5.640 | 5.962 | 5.144 |
这些结果表明,利用根据本发明的乳液,即使用低剂量的抗原,也可获得非常显著的体液应答。因此,可以看出,最好的结果是用0.4μg的每一种病毒株的HA和根据本发明的乳液获得的那些;非常令人惊讶的是,这些结果比单独用6.3μg的HA的剂量所获得的那些要好得多。另外,可以看出,即使没有给予强化剂量的个体,免疫系统持续诱发抗体,而给予无佐剂疫苗抗原的个体则不是这样。
实施例8:抗流感的三价疫苗组合物
由实施例1的浓缩乳液和包括3个2004年流行期病毒株(A/新喀里多尼亚(H1N1)株、A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株)的疫苗组合物制备30μl的免疫制剂,这些免疫制剂具有下列组成:
-0.1μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.4μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-1.6μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-6.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.1μg的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTMSMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中,
-0.4μg的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTM SMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中,
设成6组,每一组8只八周龄雌性C57BL/6J小鼠,在D0时皮内(耳朵的内表面)给予30μl剂量的上述组合物之一(每一组一种组合物)。
在D23时采集血样,以便测定所诱发的抗体的量。
通过ELISA和HAI分析所诱导的针对所有给药病毒株:H1N1、H3N2和B的抗体的滴度。所得结果在下表中总结,其中所表示的滴度是每一组小鼠的平均值。
组合物 | ELISAH1N1 | ELISAH3N2 | ELISA B | HAI H1N1 | HAI H3N2 | HAI B |
0.1μgHA | 2.924 | 3.506 | 3.920 | 26 | 174 | 95 |
0.4μgHA | 3.673 | 4.227 | 4.431 | 135 | 269 | 147 |
1.6μgHA | 3.948 | 4.593 | 4.786 | 160 | 381 | 190 |
6.3μgHA | 4.446 | 5.106 | 5.190 | 587 | 1174 | 453 |
0.1μgHA+乳液 | 4.456 | 5.192 | 5.064 | 349 | 1974 | 320 |
0.4μgHA+乳液 | 4.659 | 5.337 | 5.174 | 761 | 2348 | 494 |
再次,所获得的结果表明了根据本发明的乳液的巨大优点,利用该乳液,可以显著减少抗原量。具体地说,总之,可以认为,仅用0.1μg的用根据本发明的乳液辅佐的HA,就可获得与6.3μg的HA一样好的结果。
实施例9:包括根据本发明或现有技术的乳液的抗流感三价疫苗组合
物
由实施例1的浓缩乳液和包括3个2004年流行期病毒株(A/新喀里多尼亚(H1N1)株、A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株)的疫苗组合物制备30μl的免疫制剂,这些免疫制剂具有下列组成:
-0.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-6.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.3μg的HA;0.21mg的角鲨烯;0.031mg的DehymulsTMSMO;0.040mg的EumulginTMB1和0.039mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中(0.7%乳液),
-0.3μg的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTMSMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH 7.4的PBS缓冲液中(2.5%的乳液),
-0.3μg的HA;0.645mg的角鲨烯;0.075mg的TweenTM80;0.075mg的SpanTM85(通过微流化获得的现有技术的乳液)。
设有5组,每组8只8周龄的雌性BALB/c小鼠,在D0时皮内(耳朵的内表面)给予30μ1剂量的上述组合物之一(每一组一种组合物)。
为了评价所诱导的抗体量,在D21时采集血样,用HAI(血球凝集素抑制)测定所述血样的抗A/H1N1株、A/H3N2株和B株的活性。
所得每一组小鼠的结果在下表中提供。
所测试的组合物 | 抗H1N1的HAI | 抗H3N2的HAI | 抗B的HAI |
0.3μgHA | 26 | 174 | 8 |
6.3μgHA | 247 | 905 | 73 |
0.3μgHA+0.7%本发明乳液 | 95 | 640 | 37 |
0.3μgHA+2.5%本发明乳液 | 269 | 1974 | 73 |
0.3μgHA+现有技术乳液 | 135 | 987 | 57 |
这些结果表明,用根据本发明通过包括利用温度变化转相的非常简单的制备方法获得的乳液,获得了与使用极高剪切速率获得的现有技术乳液同样好,甚至稍微更好的佐剂。
实施例10:含有不同浓度的根据本发明的乳液的抗流感三价疫苗组
合物
由实施例1的浓缩乳液和包括3个2004年流行期病毒株(A/新喀里多尼亚(H1N1)株、A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株)的疫苗组合物制备30μl的免疫制剂,这些免疫制剂具有下列组成:
-0.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-6.3μg的每一病毒株的HA,在PBS缓冲液中,
-0.3μg的每一病毒株的HA;0.12mg的角鲨烯;0.018mg的DehymulsTMSMO;0.023mg的EumulginTMB1和0.022mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中(0.4%乳液),
-0.3μg的HA;0.229mg的角鲨烯;0.044mg的DehymulsTMSMO;0.057mg的EumulginTMB1和0.055mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中(1%的乳液),
-0.3μg的HA;0.75mg的角鲨烯;0.11mg的DehymulsTMSMO;0.143mg的EumulginTMB1和0.138mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中(2.5%的乳液)。
设有5组,每组8只8周龄的雌性BALB/c小鼠,在D0时皮内(耳朵的内表面)给予30μl剂量的上述组合物之一(每一组一种组合物)。
为了评价所诱导的抗体量,在D21时采集血样,用ELISA(血球凝集素抑制)测定这些血样的抗H1N1抗体、抗H3N2抗体和抗B抗体,以及用HAI(血球凝集素抑制)测定所述血样的抗A/H1N1株、A/H3N2株和B株的活性。
所得结果在下表中以每一组小鼠的平均值的形式提供;ELISA结果按任意ELISA单位的log10表示,HAI结果是稀释度的倒数的平均算术滴度。
所测试的组合物 | 抗-H1N1 | 抗-H3N2 | 抗-B | |||
ELISA | HAI | ELISA | HAI | ELISA | HAI | |
0.3μg HA | 3.864 | 67 | 4.594 | 320 | 4.406 | 31 |
6.3μg HA | 4.478 | 269 | 5.041 | 1660 | 5.053 | 135 |
0.3μg HA+0.4%本发明乳液 | 4.053 | 108 | 4.827 | 525 | 4.545 | 54 |
0.3μg HA+1.0%本发明乳液 | 4.312 | 269 | 5.074 | 1174 | 4.733 | 123 |
0.3μg HA+2.5%本发明乳液 | 4.425 | 293 | 5.200 | 1974 | 4.840 | 123 |
这些结果再次证明,无论所评价的病毒株怎样,根据本发明的乳液均可以用极低剂量的抗原获得非常显著的免疫系统应答。
实施例11:冻干组合物的制备
本方法如实施例1那样进行,但使用水代替缓冲液;所得乳液随后用含有甘露醇、蔗糖和十二烷基麦芽糖苷的水溶液稀释,以便获得最终组成如下的乳液:
-5%的角鲨烯,
-0.95%的聚氧乙烯鲸蜡硬脂醚,
-0.75%的脱水山梨醇单油酸酯,
-3%的甘露醇,
-2%的十二烷基麦芽糖苷,
-6%的蔗糖。
将该乳液冻干,在4℃下保存3个月;然后,在重构后,发现它的性能得到保持,尤其它的单分散乳液质量,d50和d90值接近冻干前测定的值。
该乳液能够用包括疫苗抗原的溶液按50/50稀释,以获得疫苗组合物。
实施例12:根据本发明的乳液和存在于乳液中的表面活性剂的辅佐
效应的比较
目的是评价根据本发明的乳液的辅佐活性,与存在于乳液中的表面活性剂EumulginTMB1的辅佐活性比较。
为此,使用流感抗原测试小鼠。
为此,流感抗原按照专利申请WO 96/05294的实施例中所述的方法获得,只是所使用的病毒株是A/新喀里多尼亚H1N1株。还可以获得包括2004年流行期的3个病毒株(A/新喀里多尼亚(H1N1)株,A/Wyoming(H3N2)株和B/Jiangsu株)的疫苗组合物。
由实施例1中所述的根据本发明获得的浓缩乳液、EumulginTMB1和流感病毒抗原组合物制备100μl免疫制剂,这些免疫制剂具有下列组成:
-1μg的H1N1株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-5μg的H1N1株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-1μg的H1N1株的HA;2.5mg的角鲨烯;0.37mg的DehymulsTMSMO;0.48mg的EumulginTMB1和0.46mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-1μg的H1N1株的HA和0.48mg的EumulginTMB1,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-0.33μg的每一病毒株的HA;在pH7.4的PBS缓冲液中;
-1.66μg的每一病毒株的HA,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-0.33μg的每一病毒株的HA;2.5mg的角鲨烯;0.37mg的DehymulsTMSMO;0.48mg的EumulginTMB1和0.46mg的甘露醇,在pH7.4的PBS缓冲液中;
-0.33μg的每一病毒株的HA和0.48mg的EumulginTMB1,在pH7.4的PBS缓冲液中。
设8组,每组8只雌性BALB/c小鼠,在D0通过单次肌内注射免疫。在D21和D35采集血样,通过ELISA分析法评价所诱发的针对A/H1N1流感病毒株或三价疫苗病毒株的每一种的总抗体的含量。下表中所示的抗体滴度按任意ELISA单位的log10值表示,检测阈为1.3log10。
D21时的滴度 | D35时的滴度 | |||||
免疫制剂组合物 | H1N1 | H3N2 | B | H1N1 | H3N2 | B |
1μg的H1N1 | 2.745 | 2.848 | ||||
5μg的H1N1 | 3.057 | 3.139 | ||||
1μg H1N1+本发明乳液 | 4.002 | 4.128 | ||||
1μg H1N1+EumulginTMB1 | 3.019 | 3.119 | ||||
含1μg总HA的三价疫苗 | 3.111 | 3.718 | 3.706 | 3.218 | 4.147 | 3.935 |
含5μg总HA的三价疫苗 | 3.692 | 4.386 | 3.975 | 3.776 | 4.632 | 4.225 |
含1μg总HA+本发明乳液的三价疫苗 | 4.252 | 5.002 | 4.596 | 4.186 | 5.214 | 4.897 |
含1μg总HA+EumulginTMB1的三价疫苗 | 3.146 | 3.712 | 3.950 | 3.241 | 4.177 | 4.242 |
本试验中获得的结果证明了已经在前面的试验中获得的结果,即,根据本发明的乳液可以大大减少引起相同的免疫系统应答所需的抗原的剂量;事实上,与没有佐剂、使用5μg剂量的HA相比,用根据本发明的乳液和仅仅1μg的HA获得了更好的应答
还发现,所用表面活性剂在单独使用时实际上没有表现任何辅佐效应,而根据本发明的乳液本身产生了针对所测试的全部病毒株的高辅佐效应。
Claims (31)
1.水包油乳液佐剂,特征在于它至少包括下列组分:
-角鲨烯,
-水性溶剂,
-属于聚氧乙烯烷基醚的非离子表面活性剂,
-疏水性非离子表面活性剂,
其中该佐剂是热致可逆的,并且按容积计的油滴总数的90%具有小于200nm的粒度。
2.如前一权利要求所述的乳液,其特征在于按容积计的油滴总数的90%具有小于160nm的粒度。
3.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于按容积计的油滴总数的90%具有小于150nm的粒度。
4.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于按容积计的油滴总数的50%具有小于100nm的粒度。
5.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于按容积计的油滴总数的50%具有小于90nm的粒度。
6.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于它还包括至少一种醛醇。
7.如权利要求1所述的乳液,其特征在于疏水性非离子表面活性剂包括脱水山梨醇酯或二缩甘露醇酯。
8.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于聚氧乙烯烷基醚是聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醚。
9.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于所述醛醇选自甘油、赤藓醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
10.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于疏水性非离子表面活性剂是脱水山梨醇单油酸酯。
11.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于,角鲨烯的量为5-45%。
12.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于,聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂的量是0.9-9%。
13.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于疏水性非离子表面活性剂的量是0.7-7%。
14.如前述权利要求的任一项所述的乳液佐剂,其特征在于它包括:
·32.5%的角鲨烯,
·6.18%的聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醚,
·4.82%的脱水山梨醇单油酸酯,
·6%的甘露醇。
15.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于,它还包括烷基聚糖苷。
16.如前述权利要求的任一项所述的乳液,其特征在于它还包括冷冻保护剂。
17.如前述权利要求的任一项所述的乳液用于制备肌内给药的免疫原性组合物的用途。
18.如权利要求1-16的任一项所述的乳液用于制备皮内给药的免疫原性组合物的用途。
19.如权利要求1-16的任一项所述的乳液用于制备皮下给药的免疫原性组合物的用途。
20.如权利要求1-16的任一项所述的乳液用于制备抗流感的免疫原性组合物的用途。
21.如权利要求1-16的任一项所述的乳液用于制备抗AIDS的免疫原性组合物的用途。
22.如权利要求1-16的任一项所述的乳液用于制备抗人巨细胞病毒病变的免疫原性组合物的用途。
23.制备免疫原性组合物的方法,该方法包括将至少一种疫苗抗原与水包油乳液混合,特征在于该水包油乳液通过转相温度法获得。
24.根据前一权利要求所述的方法,其特征在于,它包括至少一个通过冷却油包水倒相乳液制备水包油乳液的步骤,所述油包水倒相乳液至少包括:
-角鲨烯,
-水性溶剂,
-属于聚氧乙烯烷基醚的亲水性非离子表面活性剂,
-疏水性非离子表面活性剂。
25.如前一权利要求所述的方法,其特征在于,该油包水倒相乳液通过下列步骤获得:将角鲨烯、水性溶剂、属于聚氧乙烯烷基醚的非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂混合,首先获得水包油粗乳液,然后将该乳液加热到至少转相温度,从而获得倒相乳液。
26.如权利要求24所述的方法,其中:
-将包括水性溶剂和属于聚氧乙烯烷基醚的水相和包括角鲨烯和疏水性表面活性剂的油相单独加热到至少等于转相温度的温度,然后,
-将该2个相混合,获得油包水倒相乳液。
27.如权利要求24所述的方法,其中:
-将包括水性溶剂和属于聚氧乙烯烷基醚的表面活性剂的水相和包括角鲨烯和疏水性表面活性剂的油相单独加热到低于该乳液的转相温度的温度,
-然后将该2个相混合,以便获得水包油乳液,
-然后将该水包油乳液加热到至少等于转相温度的温度,从而获得油包水倒相乳液。
28.如权利要求23-37的任一项所述的方法,其特征在于,转相温度为45-80℃。
29.如前一权利要求所述的方法,其特征在于,转相温度为50-65℃。
30.如权利要求23-29的任一项所述的方法,其特征在于,它还包括至少一个冻干步骤。
31.免疫原性组合物,其特征在于,它通过如权利要求23-30的任一项所述的方法来获得。
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Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
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CN103784953A (zh) * | 2012-10-26 | 2014-05-14 | 上海医药工业研究院 | 作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法 |
CN105251002A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-20 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种水包油型纳米乳佐剂及其mrsa纳米乳佐剂疫苗和制备方法 |
CN105267962A (zh) * | 2014-06-18 | 2016-01-27 | 潘皓 | 纳米乳疫苗辅剂 |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20070116650A (ko) | 2005-03-23 | 2007-12-10 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 조성물 |
AR054822A1 (es) * | 2005-07-07 | 2007-07-18 | Sanofi Pasteur | Emulsion inmuno adyuvante |
US11707520B2 (en) | 2005-11-03 | 2023-07-25 | Seqirus UK Limited | Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture |
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AU2011213757B2 (en) * | 2005-11-04 | 2013-07-25 | Seqirus UK Limited | Influenza vaccine with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant |
AU2006310163B2 (en) * | 2005-11-04 | 2011-09-15 | Seqirus UK Limited | Influenza vaccine with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant |
WO2008009309A1 (en) | 2006-07-17 | 2008-01-24 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Influenza vaccine |
GB0622282D0 (en) | 2006-11-08 | 2006-12-20 | Novartis Ag | Quality control methods |
PE20090146A1 (es) | 2007-04-20 | 2009-03-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Composicion inmunogenica contra el virus influenza |
JP2010530362A (ja) * | 2007-05-31 | 2010-09-09 | アカデミシュ ジーケンハウス ライデン ハー.オー.デー.エン. ルムク | 皮内hpvペプチドワクチン接種 |
US8506966B2 (en) | 2008-02-22 | 2013-08-13 | Novartis Ag | Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use |
JP5689687B2 (ja) | 2008-03-05 | 2015-03-25 | サノフィ・パスツールSanofipasteur | アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法 |
AU2009276304B2 (en) | 2008-08-01 | 2012-10-11 | Gamma Vaccines Pty Limited | Influenza vaccines |
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GB201009673D0 (en) * | 2010-06-10 | 2010-07-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
US9944680B2 (en) | 2010-12-03 | 2018-04-17 | Sandfi Pasteur Limited | Composition for immunization against Streptococcus pneumoniae |
CA2825403C (en) | 2011-01-27 | 2023-02-21 | Gamma Vaccines Pty Limited | Vaccines comprising a combination of gamma irradiated influenza virus and a further immunogen |
EP2578974A1 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-10 | Sanofi Pasteur Sa | Process line for the production of freeze-dried particles |
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WO2013184900A2 (en) | 2012-06-06 | 2013-12-12 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Immunogenic compositions and related methods |
MX2015000446A (es) | 2012-07-24 | 2015-03-12 | Sanofi Pasteur | Composiciones de vacuna para la prevencion contra la infeccion por el virus del dengue. |
MY168959A (en) | 2012-07-24 | 2019-01-28 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions for the prevention of dengue virus infection |
JP6441219B2 (ja) | 2012-08-06 | 2018-12-19 | ピットニー・ファーマシューティカルズ・ピーティーワイ・リミテッド | mTOR経路関連疾患を治療するための化合物 |
BR112015012515B1 (pt) | 2012-11-30 | 2023-04-11 | Sanofi Pasteur | Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola |
US11369666B2 (en) | 2012-12-17 | 2022-06-28 | Newsouth Innovations Pty Limited | Treatment of diseases involving mucin |
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EP3016968B1 (en) | 2013-07-01 | 2019-06-26 | Newsouth Innovations Pty Limited | Diagnosis and treatment of autoimmune diseases |
US10533800B2 (en) | 2014-07-21 | 2020-01-14 | Sanofi Pasteur Sa | Liquid feeding device for the generation of droplets |
JP6903046B2 (ja) | 2015-03-26 | 2021-07-14 | ジーピーエヌ ワクチン プロプライアタリー リミティド | 連鎖球菌ワクチン |
WO2017137085A1 (en) | 2016-02-11 | 2017-08-17 | Sanofi Pasteur | Meningitidis vaccines comprising subtilinases |
WO2017162741A1 (en) * | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Intervet International B.V. | A combination vaccine against pcv2 virus and mycoplasma hyopneumoniae infection |
TWI656882B (zh) * | 2016-08-10 | 2019-04-21 | 南韓商賽特瑞恩股份有限公司 | 穩定的液體抗流感病毒抗體醫藥調配物 |
SG11201908280SA (en) | 2017-03-30 | 2019-10-30 | Univ Queensland | "chimeric molecules and uses thereof" |
WO2021231729A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Sanofi | Adjuvanted stabilized stem hemagglutinin nanoparticles and methods of using the same to induce broadly neutralizing antibodies against influenza |
MX2023002339A (es) | 2020-08-24 | 2023-03-22 | Sanofi Pasteur Inc | Vacunas contra infecciones por sars-cov-2. |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6100064A (en) | 1984-04-06 | 2000-08-08 | Chiron Corporation | Secreted viral proteins useful for vaccines and diagnostics |
JP2607712B2 (ja) | 1988-01-29 | 1997-05-07 | カイロン コーポレイション | 組換えcmv中和タンパク |
HU212924B (en) | 1989-05-25 | 1996-12-30 | Chiron Corp | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
FR2723740B1 (fr) | 1994-08-16 | 1996-11-08 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
FR2773156B1 (fr) | 1997-12-26 | 2000-03-31 | Biovacs Inc | Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida |
US6299848B1 (en) * | 1998-09-25 | 2001-10-09 | Hamon Research-Cottrell | Process for removing sulfur dioxide out of a gas |
KR100922031B1 (ko) * | 1999-04-19 | 2009-10-19 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 백신 |
US20030129251A1 (en) * | 2000-03-10 | 2003-07-10 | Gary Van Nest | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US6995209B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-02-07 | Madash Llc | Thermally reversible water in oil in water emulsions |
AR054822A1 (es) * | 2005-07-07 | 2007-07-18 | Sanofi Pasteur | Emulsion inmuno adyuvante |
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-
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101428145B (zh) * | 2007-11-05 | 2013-01-02 | 北京生泰尔生物科技有限公司 | 新型疫苗佐剂 |
CN103784953A (zh) * | 2012-10-26 | 2014-05-14 | 上海医药工业研究院 | 作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法 |
CN105267962A (zh) * | 2014-06-18 | 2016-01-27 | 潘皓 | 纳米乳疫苗辅剂 |
CN105267963A (zh) * | 2014-06-18 | 2016-01-27 | 潘皓 | 纳米乳疫苗辅剂的制备方法 |
CN105288614A (zh) * | 2014-06-18 | 2016-02-03 | 潘皓 | 一种疫苗组合物及其制备方法 |
CN105251002A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-20 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种水包油型纳米乳佐剂及其mrsa纳米乳佐剂疫苗和制备方法 |
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Lodaya | Self-Emulsifying Adjuvant Systems Containing Alpha-Tocopherol for Subunit Vaccines | |
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