JP6286445B2 - がんの治療のためのワクチン及びワクチン有効性を増強するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、がんの治療及び予防に関する。本発明は、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化成分を含むワクチンに関する。更に、本発明はまた、がん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料からワクチンを産生する方法と、対象におけるがんの治療又は予防のための前記ワクチンの使用に関する。本発明はまた、ワクチン、特に、自家ワクチンを産生する方法に関する。

本発明はまた、間葉系幹細胞の治療的使用と、間葉系幹細胞を対象に投与する工程を含む治療及び/又は予防方法に関する。本発明はまた、ワクチンの有効性を増強する方法と、がんの治療及び予防のための方法と、斯かる方法における使用に適した組成物及びキットに関する。

関連出願の相互参照
本願は、参照によりその各々の内容が本明細書に組み込まれる、2012年12月24日に出願された標題「Vaccines for treatment of cancer」のオーストラリア仮特許出願第2012905667号と、2012年12月24日に出願された標題「Vaccine booster」のオーストラリア仮特許出願第2012905669号と、2013年4月11日に出願された標題「Vaccines for the treatment or prevention cancer」のオーストラリア特許出願第2013203806号と、2013年9月18日に出願された標題「Vaccines for the treatment or prevention of cancer」のオーストラリア仮特許出願第2013903592号の利益を主張するものである。

大部分のがん細胞は、免疫細胞浸潤物及び炎症の存在によって明らかとなる免疫応答を誘発する。しかし、この応答は、がん細胞の防御戦略を克服するほど十分には強くない。がん細胞に対する免疫応答を促進するために取られるアプローチは、対象の免疫細胞、特に、その樹状細胞を刺激してin vitroでがん細胞特異的抗原を認識させ、次に、それらを対象に注射して戻すことを含む。

免疫系と腫瘍との間の分子及び細胞相互作用は複雑であり、この相互作用における正常細胞、組織及びケモカイン/サイトカイン応答の重要性が認識されるようになったのは、比較的ごく最近のことである。血管、結合組織、ストローマ及び細胞外マトリックスは全て腫瘍成長を支持することにおいて役割を担っており、免疫系によって供給される炎症性環境により成長が更に刺激される。

腫瘍と免疫系との間の複雑な相互作用の理解が不足していることから、がん免疫療法の開発が妨げられてきた。精製された腫瘍抗原及びより複雑な腫瘍抗原混合物の使用を伴うアプローチは、腫瘍に対する適切な免疫応答を刺激することができなかった。その理由は不明であるが、腫瘍の遺伝的不安定性及び「正常な」外観を提示すること又は阻害剤を放出することにより免疫系を逃れる腫瘍の能力を挙げることができる。腫瘍は、標的化抗原の量を低下させることにより、免疫系から抗原をマスクすることにより、或いはもはや認識されることのない突然変異バージョンの抗原を発現することにより、免疫応答に対処することができる。斯かる防御的戦略は、免疫系を弱体化させ、腫瘍の成長を停止させ、退縮を引き起こすために要求されるレベルでの有効な免疫応答の維持を困難なものとする。

間葉系幹細胞(MSC)は、出生後、多能性(multipotent)成体幹細胞である。間葉系幹細胞(MSC)は、体内の多くの組織に存在し、組織修復及び再生における重要な役割を果たしている。治療目的のために、MSCは、一般的に、骨髄、臍帯血及び脂肪組織から回収される。多くの状況において、その細胞は、組織培養によって使用前に増やされる。脂肪組織には非常に多数のMSCが存在するため、多くの適用において、組織培養により細胞を増やす必要がないという、MSCの供給源としての特有の利点を脂肪組織は有する。

MSCは現在、変形性関節症、MS、関節リウマチ、腎疾患及び心疾患を含む様々な疾患の治療のための治療剤として研究されている。

PCT/AU2012/001140(WO2013/040649) 欧州特許第1216053号 米国特許第6,372,223号 欧州特許第0399843号 米国特許第7,029,678号 WO2007/006939

Gimble, J.、Katz, A., & Bunnell, B.(2007). Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res、100(9)、1249〜1260. doi:100/9/1249 [pii]10.1161/01.RES.0000265074.83288.09; Soleimani, M., & Nadri, S. (2009). A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols、4(1)、102〜106. doi:10.1038/nprot.2008.221 A. Gennaro(編)、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、(1990)、Mack Publishing Co.社、Easton、Pennsylvania Remington's Pharmaceutical Science、第15版、Mack Publishing Company社、Easton、Pa. Gilmanら(編)、(1990)、「Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics」、Pergamon Press社

がんの治療又は予防を補助するようがん対象の免疫系を方向づけることができれば、相当な利益があるであろう。

本発明者らは、驚くべきことに、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドと組み合わせた、がん細胞及びがん細胞に関連する正常細胞の可溶化成分に基づくワクチンが、がん細胞に対する免疫応答の誘発において効率的であることを見出した。

従って、本発明の第1の態様において、がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、ワクチンが、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含み、方法が、少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドを産生する工程を含む方法が提供される。

本発明の特定の実施形態において、生体試料は、ワクチンを与えるよう企図される対象由来の生体試料である。一実施形態において、生体試料は、ワクチンを与えるよう企図される対象と同じ種の異なる個体由来の生体試料である。

第1の態様の一実施形態において、イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)からなる群から選択される。別の実施形態において、生体試料は、0.1〜10%(w/v)の濃度のイオン性界面活性剤に曝露される。好ましい実施形態において、イオン性界面活性剤はSDSである。更に好ましい実施形態において、生体試料は、0.5〜1.5%(w/v)の濃度のSDSに曝露される。

第1の態様の別の実施形態において、還元剤は、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエタノールアミン(mercaptoethanolamine)、システイン-HCl、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、トリブチルホスフィン(TBP)及びヨードアセトアミドからなる群から選択される。更なる実施形態において、生体試料は、1mM〜500mMの濃度の還元剤に曝露される。好ましい実施形態において、還元剤は、TCEP又はDTTである。より好ましい実施形態において、生体試料は、1mM〜100mMの濃度のTCEP又はDTTに曝露される。

第1の態様の特定の実施形態において、生体試料は、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドへの曝露に先立ち、イオン性界面活性剤に曝露される。

他の実施形態において、生体試料は、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドへの曝露に先立ち、イオン性界面活性剤及び還元剤に曝露される。

第1の態様の一実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、細菌レクチン又はアドヘシンである。別の実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、RGD又はRGD様モチーフを有するポリペプチドである。好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。特定の好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジンである。

第1の態様の特定の実施形態において、本方法は、前記可溶化生体試料をビオチンに曝露する工程を更に含む。好ましい実施形態において、試料をビオチンに曝露する工程は、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに試料が曝露される前に行われる。

別の実施形態において、本方法は、生体試料をアルキル化試薬に曝露する工程を更に含む。

第1の態様の一実施形態において、可溶化生体試料は、可溶性画分及び不溶性画分へと区分化される。

第1の態様の特定の実施形態において、本方法は、前記可溶化生体試料又は可溶化生体試料の可溶性画分を溶媒沈殿し、続いて得られた沈殿物を適した液体に再懸濁する工程を更に含む。一実施形態において、溶媒は、極性有機溶媒である。好ましい実施形態において、極性有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノール、プロパノール及びDMFからなる群から選択される。更に好ましい実施形態において、極性有機溶媒はアセトンである。

本発明の第2の態様において、がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、
少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、適した液体におけるイオン性界面活性剤に曝露して、可溶性物質及び不溶性物質を含む可溶化生体試料を産生する工程と、
可溶化生体試料の可溶性及び不溶性物質を区分化して、可溶性画分及び不溶性画分を産生する工程と、
可溶性画分を還元剤に曝露する工程と、
可溶性画分を、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露する工程と、
可溶性画分の溶媒沈殿を行う工程と、
沈殿物を適した液体に再懸濁する工程と
を含む方法が提供される。

本発明の第3の態様において、がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、
a.少なくとも1個の(at one least)がん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、適した液体におけるイオン性界面活性剤及び還元剤に曝露して、可溶性物質及び不溶性物質を含む可溶化生体試料を産生する工程と、
b.可溶化生体試料の可溶性及び不溶性物質を区分化して、可溶性画分及び不溶性画分を産生する工程と、
c.可溶性画分を、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露する工程と、
d.可溶性画分の溶媒沈殿を行う工程と、
e.沈殿物を適した液体に再懸濁する工程と
を含む方法が提供される。

第2及び第3の態様の特定の実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、細菌レクチン又はアドヘシンである。他の実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、RGD又はRGD様モチーフを有するポリペプチドである。第2及び第3の態様の好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。特定の好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドはストレプトアビジンである。

更なる実施形態において、本方法は、可溶性画分の前記溶媒沈殿を行う前に、前記可溶性画分をビオチンに曝露する工程を更に含む。好ましい実施形態において、本方法は、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドへの曝露の前に、可溶性画分をビオチンに曝露する工程を更に含む。好ましい実施形態において、本方法は、還元剤への曝露前に、可溶性画分をビオチンに曝露する工程を更に含む。

他の実施形態において、本方法は、可溶性画分の前記溶媒沈殿を行う前に、前記可溶性画分をアルキル化試薬に曝露する工程を更に含む。

本発明はまた、本明細書に記載されている方法のいずれかによって作製されるワクチンを提供する。

本発明の第4の態様において、対象におけるがんの治療又は予防のためのワクチンであって、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含むワクチンが提供される。

本発明の第5の態様において、対象におけるがんの治療又は予防のためのワクチンであって、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化、還元及びアルキル化された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含むワクチンが提供される。

本発明の第4及び第5の態様の特定の実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞は、前記対象由来のがん細胞又はがん関連細胞である。

他の実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、細菌レクチン又はアドヘシンである。更なる実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、RGD又はRGD様モチーフを有するポリペプチドである。好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。特定の好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジンである。

第4及び第5の態様の特定の実施形態において、ワクチンは、ビオチンを更に含む。好ましい実施形態において、ワクチンは、ビオチン及びストレプトアビジンを含み、生体試料又はその画分は、ストレプトアビジンへの曝露前に、ビオチンに曝露されている。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、医師若しくは医師の監督下に置かれた人物又はそれらの組み合わせによって行われる。

本発明の第6の態様において、本明細書に記載されているワクチンのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療又は予防のための医薬組成物が提供される。

好ましい実施形態において、本医薬組成物は、対象におけるがんの治療又は予防のために用いられる。

本発明の第7の態様において、対象におけるがんの治療又は予防の方法であって、有効量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含む方法が提供される。

本発明の第8の態様において、対象におけるがんの治療又は予防のための医薬の製造のための、少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞の可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む組成物の使用が提供される。

本発明の特定の実施形態において、生体試料は、ワクチン、医薬又は治療のレシピエントとなることが企図される対象由来の生検試料である。

本発明の第9の態様において、ヒト対象におけるがんの治療又は予防のための方法であって、前記対象から少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を得る工程と、生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含むワクチンを産生する工程と、治療的有効量の前記ワクチンを前記対象に投与する工程とを含み、前記方法の全工程が、前記方法を通して前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医によって又はその監督下で行われる方法が提供される。

第9の態様の特定の実施形態において、治療又は予防のための方法は、前記ワクチンを前記患者に投与する複数の工程を含む、治療又は予防の過程である。本発明の治療方法の実施形態において、ワクチンは、患者に2回又は3回又は4回又は5回又は6回又は7回以上投与される。一実施形態において、その後の用量は、以前の用量の約1〜約4週間後に患者に投与される。

更なる実施形態において、本方法の1つ又は複数の工程は、前記医師の監督下に置かれた人物によって実行される。一実施形態において、本方法の集合的工程は、複数の人間によって行われる。一実施形態において、本方法の集合的工程は、複数の場所で行われる。一実施形態において、前記対象から生体試料を得る工程は、前記曝露工程とは異なる場所で実行される。

他の実施形態において、ヒト対象におけるがんの治療又は予防のための方法は、前記ワクチンの産生のための、本明細書に記載されている追加的な工程を更に含む。

本明細書に記載されている通り、驚くべきことに、MSCを用いて、ワクチンの治療的有効性を増強できることも判明した。本発明者らは、驚くべきことに、MSCを用いて、がん細胞の進行を阻害できることも見出した。

本発明の第10の態様において、対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、前記対象に、前記疾患又は障害に特異的な治療的有効量のワクチンと、間葉系幹細胞を含む組成物とを投与する工程を含む方法が提供される。

一実施形態において、MCSは、脂肪組織又は骨髄を起源にもつ。一実施形態において、MSCは、ワクチン及び組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつ。好ましい実施形態において、MSCは、ワクチン及び組成物を与えるよう企図される対象と同じ種の異なる個体を起源にもつ。更に好ましい実施形態において、MSCは、ワクチンを与えるよう企図される対象とは異なる種を起源にもつ。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象と異種である。

一実施形態において、ワクチンは、動物用ワクチンである。一実施形態において、ワクチンは、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ又はウマの疾患の治療又は予防における使用のためのワクチンである。一実施形態において、ワクチンは、ヒトの疾患の治療又は予防における使用のためのワクチンである。

好ましい実施形態において、ワクチンは抗がんワクチンである。一実施形態において、抗がんワクチンは、本明細書に記載されている方法によって産生される。一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分を含む。一実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分を含む抗がんワクチンは、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドを更に含む。一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化、還元及びアルキル化された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む。一実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞は、ワクチン及び組成物を与えるよう企図される対象に由来する。一実施形態において、投与は、腫瘍の部位又はその付近において為される。一実施形態において、投与は、腫瘍の部位から離れた部位に為される。

一実施形態において、MSCは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもち、抗がんワクチンは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつがん細胞又はがん関連細胞から調製される。

一実施形態において、ワクチン及び組成物は、対象に同時に投与される。一実施形態において、ワクチン及びMSCを含む組成物の1種又は複数は、対象に複数回投与される。一実施形態において、対象へのワクチン及びMSCを含む組成物の投与は、同じ部位又はその付近において為される。

本発明の第11の態様において、ワクチンの治療的有効性の増強に用いる際の、MSCを含む組成物が提供される。

本発明の第12の態様において、対象におけるがんの治療又は予防に用いる際の、MSCを含む組成物が提供される。

本発明の第13の態様において、抗がんワクチンの治療的有効性の増強に用いる際の、MSCを含む組成物が提供される。

本発明の第14の態様において、ワクチン及びMSCを含む組成物が提供される。

一実施形態において、ワクチンは、動物用ワクチンである。一実施形態において、ワクチンは、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ又はウマの疾患の治療又は予防における使用のためのワクチンである。一実施形態において、ワクチンは、ヒトの疾患の治療又は予防における使用のためのワクチンである。

一実施形態において、ワクチンは、抗がんワクチンである。

一実施形態において、抗がんワクチンは、本明細書に記載されている方法によって産生される。一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分を含む。一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む。一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化、還元及びアルキル化された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む。一実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。特定の好ましい実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジンである。一実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞は、組成物を与えるよう企図される対象に由来する。

一実施形態において、MCSは、脂肪組織又は骨髄を起源にもつ。一実施形態において、MSCは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつ。一実施形態において、抗がんワクチンは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつがん細胞又はがん関連細胞から調製される。一実施形態において、MSCは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもち、抗がんワクチンは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつがん細胞又はがん関連細胞から調製される。好ましい実施形態において、MSCは、組成物を与えるよう企図される対象と同じ種の異なる個体を起源にもつ。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象と同種である。更に好ましい実施形態において、MSCは、ワクチンを与えるよう企図される対象とは異なる種を起源にもつ。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象と異種である。

本発明の第15の態様において、対象におけるがんの治療又は予防のための方法であって、前記対象にMSCを含む組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一実施形態において、本方法は、前記対象に抗がんワクチンを投与する工程を更に含む。一実施形態において、抗がんワクチンは、本明細書に記載されている方法によって産生される。

一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分を含む。一実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分を含む抗がんワクチンは、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドを更に含む。一実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化、還元及びアルキル化された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む。一実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞は、組成物を与えるよう企図される対象に由来する。一実施形態において、MSCは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつ。一実施形態において、MSCは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもち、抗がんワクチンは、組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつがん細胞又はがん関連細胞から調製される。一実施形態において、MCSは、脂肪組織又は骨髄を起源にもつ。

一実施形態において、ワクチン及び組成物は、対象に同時に投与される。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象と同種である。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象と異種である。

本発明の第16の態様において、ヒト対象におけるがんの治療又は予防のための方法であって、
- 前記対象から少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を得る工程と、生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む抗がんワクチンを産生する工程と、治療的有効量の前記ワクチンを前記対象に投与する工程と、
- 前記対象からMSCを含む生体試料を得て、生体試料からMSCを単離し、MSCを含む組成物を調製する工程と、MSCを含む治療的有効量の前記組成物を前記対象に投与する工程と
- を含み、前記方法の全工程が、前記方法を通して前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医によって又はその監督下で行われる
方法が提供される。

本発明の第17の態様において、ヒト対象におけるワクチンの有効性を増強するための方法であって、
- 治療的有効量のワクチンを前記対象に投与する工程と、
- 前記対象からMSCを含む生体試料を得て、生体試料からMSCを単離し、MSCを含む組成物を調製する工程と、MSCを含む治療的有効量の前記組成物を前記対象に投与する工程と
- を含み、前記方法の全工程が、前記方法を通して前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医によって又はその監督下で行われる
方法が提供される。

実施形態が、必要に応じて本発明のあらゆる態様に関係することが理解されよう。

定義
本明細書を通して、文脈がそれ以外を決定していなければ、「単数(a)」又は「1個」の要素への言及は、複数形を除外しない。

用語「治療」その他は、本明細書の文脈において、また、がんの治療に特に関連して、がんに関連する症状の軽減並びにがんの退縮及び寛解のいずれかを含む。ある特定の実施形態において、治療は、少なくとも一時的に、がんの増殖又は転移を遅くする、遅延させる又は停止する、細胞株の分化を予防する、或いは1種又は複数の腫瘍の進行を反転するであろう。治療は、がんを治癒することができる、或いは罹患を遅延させることができる。従って、本発明の文脈において、単語「治療」又はその派生は、がんに関連する治療適用に関して用いられる場合、治療されているがんに関連する疼痛の軽減、治療されているがんの重症度の軽減、治療されているがんの1種又は複数の症状における改善、治療されている対象の全体的な福祉における改善等、治療法のあらゆる側面を含む。単語「治療」又はその派生語の使用は、「治療」されている対象が、上述の利益のうちいずれか1種又は複数を経験し得ることを意味すると理解されよう。

用語「予防」その他は、本明細書の文脈において、また、がんの予防に特に関連して、がんの寛解の後の、前記がんに関連する症状の全て又は一部の再発の予防と共に、例えば、がんの転移による、1種又は複数のがんの形成の予防を指す。予防は、1種又は複数のがんによる罹患を予防することができる、或いは1種又は複数のがんによる罹患を遅延させることができる。

用語「治療」その他は、本明細書の文脈において、疾患又は障害に関連する症状の軽減のいずれかを含む。「疾患」又は「障害」とは、対象の身体に影響を与えるいずれかの異常状態を意味し、これにより、対象は、異常状態を治療又は予防するための医療介入から恩恵を受け得る。ある特定の実施形態において、治療は、疾患又は障害の進行を遅くする、遅延させる又は停止するであろう。治療は、疾患又は障害を治癒することができる、或いは罹患を遅延させることができる。従って、本発明の文脈において、単語「治療」又はその派生は、治療適用に関して用いられる場合、治療されている疾患又は障害に関連する疼痛の軽減、治療されている疾患又は障害の重症度の軽減、治療されている疾患又は障害の1種又は複数の症状における改善、治療されている対象の全体的な福祉における改善等、治療法のあらゆる側面を含む。単語「治療」又はその派生語の使用は、「治療」されている対象が、治療の治療効果の結果としての上述の利益のうちいずれか1種又は複数を経験し得ることを意味すると理解されよう。

用語「予防」その他は、本明細書の文脈において、疾患若しくは障害に関連する症状の全て若しくは一部の予防、及び/又は疾患若しくは障害に関連する症状の全て若しくは一部の再発の予防を指す。予防は、疾患又は障害による罹患を予防又は遅延させることができる。

本明細書の文脈において、用語「を含んでいる(comprising)」は、含んでいる(including)ことを意味するが、必ずしもそれのみを含んでいる訳ではない。更に、「を含む(comprise)」及び「を含み(comprises)」等、単語「を含んでいる(comprising)」の変化形は、それに対応して変動する意義を有する。従って、用語「を含んでいる(comprising)」及びその変化形は、追加的な整数又は特色が、組成物、方法等に場合によって存在し得るように、排他的ではなく包括的な意義において用いられ、整数Aを含む、又は整数A及びBを含む等と記載される。

本明細書の文脈において、用語「約」は、当業者(skilled addressee)がその値に関連付けるであろう通常の許容範囲を示すものと理解されよう。

本明細書の文脈において、パラメータの範囲が記述されている場合、パラメータが、記述の範囲内のあらゆる値を含み、該範囲の記述されたエンドポイントを包括し、記述されたより広い範囲内から選択され得る部分範囲を含むことが理解されよう。

本明細書の文脈において、用語「複数」は、1よりも大きいいずれかの数を意味する。

本明細書の文脈において、「ワクチン」は、対象における抗体産生の刺激に用いられるいずれかの物質であって、該物質の1種又は複数の成分が対象の免疫系によって免疫原性及び/又は抗原性として認識される物質を意味する。間葉系幹細胞の使用の文脈において、本明細書に言及されているワクチンが、抗がんワクチンに制限されないことを理解されたい。

初期ワクチン治験の結果を示す図である。A)対照ラット(アジュバントのみ、灰色線、n=5)及びワクチン前接種のラット(黒線、n=3)における腫瘍成長。ゼロ日目にラットの側腹部におよそ1×10⁶個の9L腫瘍細胞を曝露した。B)同じラットの生存曲線、実線は対照(n=5)で破線はワクチン処置(n=3)。 ワクチン投薬治験及び腫瘍再曝露治験の結果を示す図である。A)対照ラット(n=8、実線)対単一ワクチン接種用量を与えたラット(n=8、破線)の生存。B)対照ラット(n=8、実線)対2ワクチン接種を与えたラット(n=9、破線)の生存。C)対照ラット(n=8、実線)対3ワクチン接種用量を与えたラット(n=9、破線)の生存。D)対照ラット(n=8、実線)対2ワクチン接種用量S.C.を与えたラット(n=8、破線)の生存。E)対照ラット(n=8、実線)対側腹部に腫瘍細胞を再曝露したラット(n=4)の生存。F)対照ラット(n=8、実線)対脳に腫瘍を再曝露したラット(n=5)の生存。 A)腫瘍曝露21日後の、対照、単一ワクチン用量又は2用量処置したラットにおけるインターフェロン-γレベル。B)腫瘍処置21日後の、対照、単一ワクチン用量又は2用量処置ラットにおけるIL-4レベル。*=p<0.05。 初期ワクチンのタンパク質組成の予備的解析から得られる結果を示す図である。A)ワクチンのみにおけるストレプトアビジンに対するワクチン接種したラット血清反応性(腫瘍タンパク質に対する血清反応性なし)。B)典型的なラットワクチンの銀染色したSDS-PAGEゲルプロファイル。 ワクチン成分治験に含まれるラットの生存率を示す図である。4種のワクチン接種群の生存時間(日数)及び有意に延長された生存を比較する。対照群(n=5)は、38.4±2.9の生存時間を有していた。 還元タンパク質に連結された低用量ストレプトアビジンのワクチンが、生存を延ばし、寛解、ストレプトアビジン抗体及びTNF-αの産生を誘導することを示す図である。4種の異なるワクチン型及びアジュバント対照のパラメータを比較した:R-ライセート:ストレプトアビジンなしの還元ライセート;ワクチン(50):50μgストレプトアビジンと連結された還元ライセート;ワクチン(100):100μgストレプトアビジンと連結された還元ライセート;Strept:50μgストレプトアビジン単独。A.生存時間;B.経時的パーセンテージ生存としてプロットされた生存曲線;C.血清ストレプトアビジン抗体レベル、0日目は生着日である(ELISAにより測定);D.生着後21日目の血清TNF-αレベル;E.生着後21日目の血清ICAM1レベル。ELISAにより測定されたTNF-α及びICAM1。*:P<0.05;**:P<0.001。 A)ワクチン接種後/腫瘍曝露前及び腫瘍曝露21日後のC反応性タンパク質レベル。B)エンドポイントにおけるCINC-1血清レベル。*=p<0.05。 ワクチン接種及びワクチン未接種ラットにより行われるフローサイトメトリーによる血液アッセイの結果を示す図である。対照ラット(黒バー;アジュバントのみ、n=6)及びワクチン処置ラット(白バー、n=6)における血液解析:ワクチン接種後及び腫瘍曝露前に腫瘍前サンプルポイントを設定した。腫瘍曝露21日後に腫瘍後サンプリングを行った。あらゆる処置に先立ち全ラットを採血して、全細胞型のベースライン対照レベルを得た(黒線、n=12)。 ワクチン未接種対象と比較した、SDS抽出腫瘍タンパク質、還元剤及びストレプトアビジンにより調製された自家ワクチンを用いたラットワクチン治験について達成された結果を示す図である。 イヌ自家ワクチンのタンパク質プロファイルを示す図である。A)典型的なイヌ個別化自家ワクチンの銀染色したSDS-PAGEゲル。B)ワクチンにおけるストレプトアビジン結合。C)イヌワクチンにおけるビオチン結合。 自家ワクチンのフェーズIイヌ臨床治験が、安全性及び有効性を実証する(n=25)ことを示すグラフである。個々の症例(y軸)が記載されており(ワクチン接種時における診断及び疾患負荷)、月数で表す生存時間(x軸)に対してプロットされる。予想される生存時間は、患者ノート(patient note)又はイヌ及びネコの腫瘍学に関するイギリス小動物獣医師会マニュアル(British Small Animal Vet Association Manual of Canine and Feline Oncology)(2011)から得た。**カルボプラチンとワクチンを与えたイヌ;^、^^、^^^ - 切除術3、4、8ヶ月(それぞれ)後に与えたワクチン接種;BAC:気管支肺胞癌(Broncoalvelolar carcinoma);G:グレード;HG:高グレード;S:ステージ;COPD:ミトキサントロン(Mitozantrone)、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びシクロホスファミドの化学療法;CHOP:シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン(Hydroxydaunorubicin)(ドキソルビシン)、オンコビン(ビンクリスチン)及びプレドニゾンの化学療法。 対照ラット、ワクチン接種ラット及びワクチンプラス脂肪由来細胞を与えたラットの平均腫瘍サイズを示す図である。ワクチンプラス脂肪由来細胞を与えたラットは、対照及びワクチン接種のみを与えたラットと比較して、腫瘍サイズの劇的な低下を示した。 、対照ラット、ワクチン接種ラット及びワクチンプラス脂肪由来細胞を与えたラットの平均生存時間を示す図である。 対照ラットの平均腫瘍サイズ、並びにワクチン接種及びD0イヌ脂肪由来細胞を与えたラットの個々のラットの腫瘍サイズを示す図である。 対照ラットの平均腫瘍サイズ、並びにワクチン接種及びD4イヌ脂肪由来細胞を与えたラットの個々のラットの腫瘍サイズを示す図である。 対照ラットの平均腫瘍サイズ、並びに腫瘍誘導後にワクチン接種及びD4イヌ脂肪由来細胞を与えたラットの個々のラットの腫瘍サイズを示す図である。 脂肪組織由来幹細胞の投与あり又はなしにおける、がんワクチンで免疫化したラットにおけるストレプトアビジンに対する抗体応答を示す図である。

抗がんワクチン
本発明者らは、驚くべきことに、可溶化及び還元された自己及び非自己(heterologous)タンパク質、ポリペプチド及び細胞成分の異種性混合物を含むワクチンが、がん患者におけるがん細胞に対し増強された免疫応答を生じ得ることを見出した。本発明を用いて、がんの治療又は予防のためのこのようなワクチン及び医薬組成物を産生することができる。斯かるワクチンは、本明細書において抗がんワクチン又はがんワクチンと概して称され、この用語法は互換的に用いられている。治療又は予防が企図されているがんは、本明細書に言及されているがん等、いかなるがんであってもよい。

従って、本発明は、がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、ワクチンが、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含み、方法が、少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドを産生する工程を含む方法を提供する。

ワクチンは、1種又は数種のがんに対する抗体の産生の刺激に用いられるいかなる物質であってもよく、これにより、該物質は、対象の免疫系によって免疫原性及び/又は抗原性として認識される。

がん細胞は、肉腫、癌腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び循環腫瘍細胞(CTC)等が挙げられるがこれらに限定されない、固形腫瘍又は血液(液体)がんとして存在するいかなるがんに由来しうる。例えば、癌腫は、膀胱、乳房、脳、結腸、中皮腫、腎臓、肝臓、小細胞肺がん、非小細胞肺がんを含む肺、頭頸部、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、前立腺又は皮膚の癌腫であってよい。

更に別の非限定例として、リンパ腫は、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキット(Burkett)リンパ腫又は胃、乳房若しくは脳の節外性リンパ腫であってよい。

肉腫は、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、中皮肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍、又はメラノーマ、セミノーマ、奇形腫、骨肉腫、色素性乾皮症(xenoderoma pigmentosum)、ケラトアカントーマ(keratoctanthoma)、甲状腺濾胞性がん及びカポジ肉腫を含む他の腫瘍であってよい。

骨髄腫は、例えば、プラズマ細胞骨髄腫又はケーラー病(Kahler's disease)又は多発性骨髄腫となり得る。他の例において、白血病は、骨髄性白血病、顆粒球性白血病、リンパ性白血病、リンパ球性白血病又はリンパ芽球性白血病、真性多血症又は赤血病であってよい。

生体試料は、組織、組織液、血液、血液成分、骨髄、尿及び糞便を含む排泄物並びに粘液を含む分泌液等が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む対象由来のいかなる試料であってよい。生体試料は、2種類以上となり得る。例えば、生体試料は、組織試料及び血液試料で構成され得る。生体試料は、対象のある一部位由来の組織試料及び対象の別の一部位由来の組織試料を含み得る。生体試料は、異なる時点で対象から採取された2種類以上の試料を含み得る。例えば、生体試料は、2回の別々の機会に対象から採取された2種の血液試料を含み得る。

好ましい実施形態において、生体試料は、既知の又は疑われるがん又は腫瘍の生検を含む。少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料は、例えば、腫瘍試料であってよい。生体試料は、典型的には、がん細胞及び非がん細胞、並びに例えば、血漿、細胞外マトリックス、酵素、成長因子及びサイトカイン等の非細胞成分を含むであろう。

生体試料は、例えば、医師又は医療専門家により、医師の臨床ケア中の対象から収集することができる。医師は、独立的に医業に関する法律(law to practice medicine)の下に登録、認可又は認定されたいかなる人物であってよい。医療専門家は、独立的に又は医師の監督の下で、対象から生体試料を収集することを許可、認可、登録又は認定されたいかなる人物であってよい。例えば、医療専門家は、登録又は登記された看護師又は医師のアシスタント又は臨床アシスタントであってよい。例えば、医師に臨床ケアされているがんを有する対象に通常行われるであろうルーチンの外来患者手順において、生体試料を収集することができることが理解されよう。

特定の実施形態において、本発明の方法は、医師若しくは医師の監督下に置かれた人物又はこれらの組み合わせによって行われる。医師の監督下に置かれた人物は、例えば、医療専門家、薬剤師、臨床、医学又は病理学研究室の技術者又は科学者であってよい。本発明の方法が、いずれかの研究室において、医師若しくは医師の監督下に置かれた人物又はこれらの組み合わせによって行うことができることを理解されよう。

生体試料は、本明細書に言及されているいずれかのがん等、がん由来の少なくとも1個のがん細胞を含有することができる。がん細胞は、これらの種類のがんのうち1種又は複数に由来し得る。例えば、血液試料は、B細胞リンパ腫細胞であるがん細胞と共に、メラノーマ細胞であるがん細胞を含有し得る。更に、組織試料は、線維肉腫細胞であるがん細胞と共に、脂肪肉腫細胞であるがん細胞を含有し得る。

本発明のワクチンは、例えば通常、本明細書に言及されているいずれかのがん転移から発達し得るがんの発症を予防又は遅延又は減速させることができる。本発明のワクチンは、治療後の本明細書に言及されているいずれかのがんの再発を予防又は遅延又は減速させることもできる。

がん関連細胞は、がん細胞に近いために生体試料に含まれるいずれかの非がん細胞であってよい。がん関連細胞は、血管、結合組織、神経、筋肉、脳組織、ストローマ、関連臓器由来の組織及び脂肪組織等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの近位非がん性組織に由来し得る。がん関連細胞は、白血球細胞、赤血球細胞、プラズマ細胞、線維芽細胞又は幹細胞等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの非がん細胞であってよい。

本発明の一実施形態において、生体試料は、前記生体試料を用いて産生されるワクチンの企図されるレシピエントである対象に由来する。この文脈において、ワクチンは、自家と称され得る。

生体試料の可溶化は、いずれかの適切な手段、典型的には、化学的、機械的及び/又は物理的手段による、液相における生体試料の破壊を意味するものと理解される。生体試料の破壊として、組織試料の崩壊、組織試料からの細胞の解離、細胞の脱凝集、細胞膜の透過処理、細胞溶解、膜の融解並びにタンパク質及びポリペプチドの変性、並びにジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、疎水結合及びファンデルワールス等が挙げられるがこれらに限定されない分子間及び分子内相互作用の破壊が挙げられるがこれらに限定されない。

生体試料の破壊、従って、可溶化は、凍結/融解サイクル、かき混ぜ、ボルテックス、剪断(sheering)、切断、粉砕、ホモジナイズ、圧力又は音波力によって補助され得る。例えば、イオン性界面活性剤及び還元剤への曝露による生体試料の可溶化は、材料をシリンジ及び針に通すことによって、乳鉢及び乳棒で材料を粉砕することによって、ホモジナイザー、フレンチプレス、ソニケーター又はロータリー装置によって補助され得る。

当業者であれば、可溶化生体試料が、典型的には、可溶性物質及び不溶性物質を含むであろうことを理解するであろう。不溶性物質は、1000rpm(又は同等)以上を超えるスピードで可溶化生体試料が遠心分離されるとペレットを形成するいずれかの物質であってよい。可溶化生体試料は、例えば、10%〜99%(w/w)可溶性物質を含むことができる。例えば、可溶化生体試料は、およそ20%(w/w)可溶性物質及びおよそ80%(w/w)不溶性物質を含むことができる、或いは可溶化生体試料は、およそ60%(w/w)可溶性物質及びおよそ40%(w/w)不溶性物質を含むことができる。好ましい状況において、可溶化生体試料の少なくとも50%(w/w)が可溶性物質となるであろう。当業者であれば、可溶化生体試料における不溶性物質及び可溶性物質の量が、生体試料の種類、イオン性界面活性剤及び還元剤の量並びにイオン性界面活性剤及び還元剤の種類を含む多数の因子に依存することも理解するであろう。例えば、組織試料に由来する可溶化生体試料は、同じ容量の血液試料に由来する可溶化生体試料よりも多く不溶性物質を含みうる。更に、弱イオン性界面活性剤に曝露される生体試料は、生体試料を強イオン性界面活性剤に曝露することにより産生される可溶化生体試料よりも多く不溶性物質を有する可溶化生体試料を産生しうる。

生体試料は、いずれかの適した液体に可溶化することができる。液体は、水又は溶液又は塩溶液又は緩衝溶液であってよい。液体は、リン酸緩衝食塩水(PBS)又はトリス緩衝食塩水(TBS)等が挙げられるがこれらに限定されない、緩衝塩溶液であってよい。

本発明の方法において、生体試料は、イオン性界面活性剤に曝露される。本明細書において、イオン性界面活性剤は、組織及び細胞の成分の可溶化に役立つ、荷電極性頭部を有する両親媒性分子を意味するものと理解される。イオン性界面活性剤として、アルキル-アリール-スルホネート類、長鎖アルコール-サルフェート類、オレフィン-サルフェート類及び-スルホネート類、アルファオレフィン-サルフェート類及び-スルホネート類、硫酸化モノグリセリド類、硫酸化エーテル類、スルホサクシネート類、アルカン-スルホネート類、リン酸-エステル類並びにアルキルイセチオネート(alkyl isethionate)類が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の一実施形態において、生体試料は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)からなる群から選択されるイオン性界面活性剤に曝露される。

生体試料は、0.1%(w/v)〜10%(w/v)の間の濃度等、可溶化達成の補助に適切ないずれかの濃度のイオン性界面活性剤に曝露することができる。例えば、イオン性界面活性剤の濃度は、0.1〜1%、0.5〜2%、1%〜5%、2.5〜7.5%又は5〜10%(w/v)の範囲内であってよい。当業者であれば、生体試料の可溶化に必要とされるイオン性界面活性剤の種類及びイオン性界面活性剤の最終濃度が、生体試料の量、選ばれた適した液体、界面活性剤の溶解性プロファイル、生体試料の種類及び補助剤の使用又は可溶化を補助する方法を含む複数の因子によって影響されることを理解するであろう。例えば、腫瘍組織及び腫瘍関連結合組織を含む組織試料である生体試料の可溶化は、腫瘍関連結合組織なしの腫瘍組織を含む組織試料である生体試料の可溶化よりも高濃度のイオン性界面活性剤を必要とし得る。或いは、相対的に大容量における少量の生体試料の可溶化は、相対的に小容量における大量の生体試料の可溶化よりも低濃度のイオン性界面活性剤を必要とし得る。更に、SDS等、強い界面活性剤による生体試料の可溶化は、ラウロイルサルコシンナトリウム等、より弱い界面活性剤による生体試料の可溶化よりも低濃度のイオン性界面活性剤を必要とし得る。

本発明の好ましい実施形態において、生体試料は、0.1%(w/v)〜10%(w/v)の濃度のSDSに曝露される。本発明の更に好ましい実施形態において、SDSの濃度は、0.5%(w/v)〜1.5%(w/v)の範囲内である。例えば、SDSの濃度は、0.1〜0.5%、0.5〜1%、0.5〜0.75%、0.75%〜1.25又は1%〜1.5%(w/v)の範囲内であってよい。

本発明の方法は、生体試料を還元剤に曝露する工程を含む。本発明の文脈における還元剤は、タンパク質及びポリペプチド内及び間のジスルフィド結合を還元することができる化合物を意味するものと理解される。当業者であれば、還元剤への生体試料の曝露が、典型的には、還元されたジスルフィド結合を有するタンパク質及びポリペプチドと共に、還元されなかったジスルフィド結合を有するタンパク質及びポリペプチドを含む生体試料をもたらすであろうことを理解できよう。生体試料は、例えば、生体試料がイオン性界面活性剤に曝露されるのと同時に、或いは生体試料がイオン性界面活性剤に曝露された後に、還元剤に曝露され得る。

本発明の一実施形態において、還元剤は、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエタノールアミン、システイン-HCl、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、トリブチルホスフィン(TBP)及びヨードアセトアミドからなる群から選択される。本発明の一実施形態において、還元剤はTCEPである。別の実施形態において、還元剤はDTTである。

一実施形態において、生体試料は、1mM〜500mMの範囲の濃度の還元剤に曝露される。例えば、濃度は、1mM〜10mM、5mM〜20mM、10mM〜50mM、25mM〜100mM、75mM〜250mM、200mM〜300mM又は250mM〜500mMであってよい。当業者であれば、生体試料の可溶化に用いられる還元剤の種類及び還元剤の濃度が、典型的には、生体試料の種類、生体試料の量、選ばれた適した液体の緩衝強度及びpH並びに還元剤の強度を含む複数の因子に依存するであろうことを理解できよう。例えば、TCEP等、強い還元剤による生体試料の可溶化は、DTT等、より弱い還元剤による生体試料の可溶化よりも低濃度の還元剤を必要とし得る。更に、ジスルフィド豊富結合組織を含む組織試料である生体試料の可溶化は、ジスルフィド結合が少ない赤血球細胞を含む血液試料である生体試料の可溶化よりも高濃度の還元剤を必要とし得る。

一実施形態において、生体試料は、その上、アルキル化剤に曝露される。還元剤に先に曝露されたタンパク質及びポリペプチドを含む生体試料をアルキル化剤に曝露すると、アルキル基の付加により、タンパク質及びポリペプチドにおける還元されたシステイン残基の一部又は全てを修飾することができる。この操作は、システイン残基の一部又は全ての酸化状態を維持することができ、例えば、システイン残基が他のシステイン残基とジスルフィド結合を形成又は再形成するのを防ぐことができる。本発明の方法において用いることができるアルキル化試薬の非限定例は、ヨードアセトアミド、アクリルアミド、4-ビニルピリジン、N-エチルマレイミド(ethylmalemide)及びこれらの誘導体である。当業者であれば、用いられるアルキル化剤の種類及び濃度が、典型的には、用いられる還元剤に依存すると共に、用いられる還元剤の種類及び還元剤の濃度を決定する際に考慮されるものと同じ複数の因子に依存するであろうことを理解できよう。例えば、還元剤に曝露された生体試料は、生体試料における還元剤の濃度よりも1モル濃度過剰の濃度のアルキル化剤に曝露することができる。別の例において、5mMの濃度の還元剤TCEPに曝露された生体試料は、次に、10mの濃度のヨードアセトアミドに曝露することができる一方、DTTはアルキル化剤と反応することが公知であるため、5mMの濃度の還元剤DTTに曝露された生体試料は、次に、15mMのより高濃度のヨードアセトアミドに曝露することができる。

本発明の一実施形態において、本方法は、可溶化生体試料をビオチンに曝露する工程を更に含む。当業者であれば、ビオチン化のための方法を承知するであろう。好ましい実施形態において、ビオチン化は、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドへの曝露前に行われる。

ビオチンは、合成されてもよい又は生物から抽出されてもよい。ビオチンは、可溶化生体試料のタンパク質、炭水化物及び脂質に結合すると考えられる。理論に制約されることは望まないが、ビオチンは、RGD及びRGD様モチーフに結合するため、この操作は、RGD又はRGD様モチーフを有するポリペプチドと、可溶化生体試料のタンパク質、炭水化物及び脂質との間の結合の増加をもたらし得る。これは、対象の免疫系に対する、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化成分のタンパク質、炭水化物及び脂質の提示を補助することができ、これにより免疫応答を増強することができる。

これに加えて又はこれに代えて、可溶化生体試料のタンパク質、炭水化物及び/又は脂質にビオチンを共有結合させる試薬を用いることができる。この目的に適した試薬の非限定例は、N-ヒドロキシスクシンイミドビオチンである。ビオチン化タンパク質、炭水化物及び/又は脂質は、そのビオチン結合部位を介してストレプトアビジンに結合することができる。よって、可溶化生体試料のタンパク質、炭水化物及び/又は脂質がストレプトアビジンに結合するには少なくとも2つの仕方があり、RGD様部位を介する、及び/又はストレプトアビジンにおけるビオチン結合部位を介することができる。本発明の方法は、生体試料を哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露する工程も含む。

非哺乳類ポリペプチドは、非哺乳類生物に由来するいずれかの外来性ポリペプチドであってよい。当業者であれば、この場合、外来性ポリペプチドが、対象から採取される際に生体試料に存在しないいずれかのポリペプチドであることを理解できよう。非哺乳類生物は、例えば、鳥類、爬虫類、魚類、両生類、細菌、酵母、ウイルス又は真菌等が挙げられるがこれらに限定されない、真核生物又は原核生物であってよい。この文脈において、「非哺乳類生物に由来する」とは、ポリペプチドが、非哺乳類生物から抽出された天然起源のポリペプチドであることを要求しないことが理解されるであろう。ポリペプチドは、合成、組換え又は生物から抽出され得る。ポリペプチドは、天然起源のポリペプチドのバリアント、例えば、哺乳類タンパク質結合能力を有するその断片又は配列バリアント等であってよい。

ポリペプチドは、例えば、10〜1000アミノ酸等、いずれかの適切な長さのものであってよい。例えば、ポリペプチドは、10〜100アミノ酸、50〜500アミノ酸、25〜150アミノ酸、250〜750アミノ酸、500〜100アミノ酸、400〜800アミノ酸、500〜750アミノ酸、750〜900アミノ酸又は850〜1000アミノ酸を含むことができる。

多くの非哺乳類生物は、哺乳類タンパク質に結合することができるポリペプチドを発現する。細胞内において、このようなポリペプチドは、例えば、細胞-細胞付着、細胞接着、ドッキング及び/又は連絡のための受容体として利用することができる。非哺乳類ポリペプチドは、例えば、分子間相互作用により非特異的に、或いは特異的結合モチーフ及び/又は特異的受容体-リガンド相互作用に頼る機序により特異的に哺乳類タンパク質に結合することができる。

特に、微生物は、哺乳類タンパク質に結合することができる細胞表面ポリペプチドを呈する。これらのポリペプチドのカテゴリーの非限定例は、レクチン、アドヘシン及び赤血球凝集素である。これらのポリペプチドは、哺乳類細胞に関連するリガンドへの付着のための受容体として機能することができる。本発明の一実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、細菌レクチン又はアドヘシンである。

本発明の一実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、トリペプチド、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)モチーフ又はRGD様モチーフを有するポリペプチドである。RGD様モチーフは、トリペプチド、アルギニン-チロシン-アスパラギン酸(RYD)モチーフであってよい。説明に役立つ例として、RGD及びRGD様モチーフは、多くの原核生物及び真核生物接着関連タンパク質において見出される。本発明の別の実施形態において、RGD又はRGD様モチーフを有するポリペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。ストレプトアビジン、アビジン及びニュートラアビジンは、それぞれ少なくとも、高い親和性でビオチンと結合することが一般的に公知である、非常に類似の特性を有する。ニュートラアビジンは、アビジンの脱グリコシルバージョンであるが、アビジン又はストレプトアビジンと互換的に用いることができる。本明細書に例証される好ましい実施形態において、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジンである。

本発明の方法の一実施形態において、生体試料は、還元剤及び哺乳類ポリペプチドに結合することができる非哺乳類ポリペプチドへの生体試料の曝露に先立ち、イオン性界面活性剤に曝露される。

本発明の方法の別の実施形態において、生体試料は、哺乳類ポリペプチドに結合することができる非哺乳類ポリペプチドへの生体試料の曝露に先立ち、イオン性界面活性剤及び還元剤に曝露される。

更に好ましい実施形態において、本発明の方法は、可溶化生体試料の溶媒沈殿を更に含む。溶媒沈殿は、適切な容量の溶媒を試料に添加する工程を含む。典型的な溶媒沈殿において、およそ1〜10容量の溶媒が試料に添加される。「容量」とは、溶媒沈殿の対象である試料の容量に等しい容量を意味する。例えば、試料が500μlである場合、2容量は1000μlになる。溶媒を添加した後に、最終容量は1500μlになる。溶媒沈殿工程は、1〜2容量、1〜4容量、2.5容量、2〜6容量、5容量、4〜8容量、7.5容量又は5〜10容量を添加する工程を含むことができる。

本発明の一実施形態において、溶媒は、極性有機溶媒である。更なる実施形態において、溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノール、プロパノール及びジメチルホルムアミド(DMF)からなる群から選択される。一実施形態において、溶媒はアセトンである。当業者であれば、添加すべき溶媒の種類及び容量が、典型的には、溶媒特性、沈殿すべき物質の濃度及び物質が存在する液体及び溶媒の揮発性を含む複数の因子によって決定されることを理解できよう。タンパク質、炭水化物及び脂質の不均一な混合物への溶媒の添加は、疎水性領域の曝露により、これら分子の一部又は全てに不溶性凝集物を形成させることができる。この不溶性物質を沈殿物として回収し、沈殿物をいずれかの適した液体に再懸濁することができる。遠心分離、濾過又は沈降等、いずれかの適切な方法により、沈殿物を回収することができる。溶媒沈殿を行うことにより、タンパク質及び炭水化物を免疫系に対し更により異質に見せて、その結果得られるワクチンの免疫原性が増強され得ることが仮定される。これは、医薬への製剤化に先立ちワクチンを濃縮し、ワクチンから界面活性剤及び還元剤を除去する単純な手段も提供する。

本発明の一実施形態において、本方法は、溶媒沈殿に先立ついずれかの時点で、可溶化生体試料を可溶性画分及び不溶性画分に区分化する工程を更に含む。不溶性画分は、廃棄されうる。例えば、可溶化生体試料が、還元剤への生体試料の曝露に先立ち区分化される場合、可溶性画分のみが、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露されることが必要とされる。

当業者であれば、可溶性及び不溶性画分を区分化するためのいかなる適切な方法を用いてもよいことを理解できよう。例えば、可溶性及び不溶性画分は、遠心分離、濾過又は沈降によって区分化することができる。区分化された画分は、物理的障壁によって分離することができる、或いは同じ容器に存在させることができる。例えば、可溶化生体試料を遠心分離して、不溶性画分を含むペレット及び可溶性画分を含む液相を産生することができるが、画分は、可溶化生体試料を遠心分離した同じ容器に存在していてよい。可溶性画分を別の容器に移して、物理的障壁によって画分を分離させることができる。

本発明の方法は、典型的には、そのいずれか又は全てが免疫応答を誘発し得る、変性した、部分的に変性した及び変性していないタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸を含むことができる異種性組成物をもたらす。異種性混合物は、がん細胞並びに例えば非がん血液細胞及び非がん性組織由来の細胞等のがん関連細胞由来のタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸を含有することができる。理論に制約されることは望まないが、本発明の方法が、免疫系にとって異質に見え、免疫応答を誘発する、修飾されたタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸を有する可溶化生体試料をもたらすことが仮定される。

本発明者らは、本発明の方法の間に、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに生体試料を曝露することが、ワクチンの有効性に役立つと考えるが、その理由として、該ポリペプチドが外来性であり、対象の免疫系によって異質と認識され、免疫応答を刺激することが挙げられる。そこで、この操作が、免疫系に対するがん細胞又はがん関連細胞の成分の提示を容易にすると共に、成分を免疫系に対しより異質に見せるよう補助して、免疫応答を増強し得ることが示唆される。

本発明の特定の実施形態は、がんの治療又は予防のためのワクチンを産生する方法であって、少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、適した液体におけるイオン性界面活性剤に曝露して、可溶性物質及び不溶性物質を含む可溶化生体試料を産生する工程と、続いて可溶化生体試料の可溶性及び不溶性物質を区分化して、可溶性画分及び不溶性画分を産生する工程とを含む方法を提供する。得られた可溶性画分は、還元剤に曝露され、次に哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露される。この混合物は、溶媒沈殿され、沈殿物は、適した液体に再懸濁される。本方法の一実施形態において、非哺乳類ポリペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。代替的実施形態において、可溶化された生物学的画分の区分化は、生体試料がイオン性界面活性剤及び還元剤に曝露された後に行われる。更なる実施形態において、本方法は、溶媒沈殿に先立ち可溶性画分をビオチンに曝露する工程も含む。更に別の実施形態において、本方法は、溶媒沈殿に先立ち可溶性画分をアルキル化剤に曝露する工程も含む。

本発明の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、製造され医療行為に用いられる製品のオーストラリア保健省薬品・医薬品行政局(Australian Therapeutic Goods Administration)(TGA)による規制からの除外のための要件を満たす、ヒト起源の治療製品の生産を可能にする。TGAは、オーストラリア政府保健高齢化省(Australian government Department of Health and Human Aging)の一部であり、医薬及び医療機器の規制を担う。関連する条項の下において、ヒト細胞及び組織又はそれらから製造される医薬製品は、オーストラリア医薬製品登録(Australian Register of Therapeutic Goods)(ARTG)への包接の要件と、TGA立法のコンプライアンスから除外され得る。この条項は、州(State)又は内域(internal Territory)の法律によって登録された医師による臨床ケア及び治療中の患者から収集され、該医師又は該医師の専門的監督下の人物によって製造された、同じ医師又は同じ医師の専門的監督下の人物による該患者の単一の徴候の単一の治療過程における治療適用のための、ヒト細胞及び組織に適用される。よって、関連する条項は、製品が自家使用のみを目的とすることを要求する。

これらの要件と一致して、本発明は、ヒト対象におけるがんの治療又は予防のための方法であって、前記対象から少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を得る工程と、生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含むワクチンを産生する工程と、治療的有効量の前記ワクチンを前記対象に投与する工程とを含み、前記方法の全工程が、前記方法を通して前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医によって又はその監督下で行われる方法を提供する。

一実施形態において、治療又は予防のための方法は、前記ワクチンを前記患者に投与する複数の工程を含む治療又は予防の過程である。

更なる実施形態において、本方法の1つ又は複数の工程は、前記医師の監督下に置かれた人物によって実行される。一実施形態において、本方法の集合的工程は、複数の人間によって行われる。

一実施形態において、本方法の集合的工程は、複数の場所で行われる。一実施形態において、前記対象から生体試料を得る工程は、前記曝露工程とは異なる場所で実行される。

他の実施形態において、ヒト対象におけるがんの治療又は予防のための方法は、前記ワクチンの産生又は前記ワクチンを含む医薬組成物の産生のための、本明細書に記載されている追加的な工程を更に含む。

ワクチンブースター
本発明者らは、驚くべきことに、間葉系幹細胞を含む組成物の投与が、一部の医薬組成物、特に、ワクチンの治療的有効性を増強し得ることを見出した。

従って、本発明は、対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、前記対象に、前記疾患又は障害に特異的な治療的有効量のワクチンと、間葉系幹細胞を含む組成物とを投与する工程を含む方法を提供する。

間葉系幹細胞(MSC)は、骨髄、骨格筋、皮膚、結合組織及び脂肪組織等が挙げられるがこれらに限定されない、MSCが存在するいずれかの組織を起源にもつことができる。起源にもつとは、本発明の方法又は組成物における使用のためのMSCが単離される組織型を意味する。特定の実施形態において、MCSは、骨髄又は脂肪組織を起源にもつことができる。別の実施形態において、MSCは、ワクチン及びMSCを含む組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつ。該文脈において、MSCを含む組成物は、自家として記載することができる。後述する通り、しかし、MSCは、特に本発明の方法及び組成物の目的のために組織から単離することができる、或いはMSCは、本発明の方法又は組成物とは無関係な手順において、組織供給源から以前に単離されていてよいことが理解できるであろう。適した組織からのMSCの単離又はMSCを含む組成物の調製は、本発明の方法の実行の工程を構成してもしなくてもよい。別の実施形態において、MSCは、MSCを含む組成物を与えるよう企図される対象と同じ種の異なる個体を起源にもつ。該文脈において、MSCを含む組成物は、非自己又は同種として記載することができる。好ましい実施形態において、MSCは、MSCを含む組成物を与えるよう企図される対象とは異なる種を起源にもつ。該文脈において、MSCを含む組成物は、異種として記載することができる。

MSCを含む組成物は、上述等、MSCが見出される組織を含む生体試料から初めに単離されたMSCを含むことができる。MSCを生体試料から単離し、次に、当業者に公知の適切な方法に従って取り扱い、維持し、貯蔵することができる。単離、取り扱い、維持及び貯蔵の適切な方法が、多分化能を保持するMSCをもたらす方法であることが理解されよう。MSCは、例えば、生体試料から単離された直後に、本発明の方法において用いることができる。或いは、MSCは、使用前に凍結及び/又は細胞培養における継代の1つ又は複数のステージを経ることができる。例えば、生体試料から単離されたMSCは、本方法における使用前に1回細胞培養において継代することができる、或いは生体試料からMSCを単離し、次に凍結し使用前に解凍することができる、或いは単離されたMSCを凍結し、解凍し、次に使用前に細胞培養において1回継代することができる。例えば、生体試料からMSCを単離し、細胞培養において継代し、次に凍結し解凍し、次に使用前に細胞培養において1又は複数回継代することができる。別の例において、生体試料からMCSを単離し、使用前に細胞培養において1又は複数回継代することができる。継代は、細胞培養培地におけるMSCの成長に関与し、多くの場合、増やす、コロニー増大、分割と称されることが理解されよう。

生体組織からMSCを単離するための方法は、MSCをin vitro培養するための方法が本技術分野において公知であるのと同様に、本技術分野において公知であり、本技術分野において、例えば、Gimble, J.、Katz, A., & Bunnell, B.(2007). Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res、100(9)、1249〜1260. doi:100/9/1249 [pii]10.1161/01.RES.0000265074.83288.09;Soleimani, M., & Nadri, S. (2009). A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols、4(1)、102〜106. doi:10.1038/nprot.2008.221に記載されている。

生体試料からMSCを単離するための方法は、MSCのみで構成された試料を産生できないことが理解されよう。MSCを含む組成物は、MSCではない細胞と共に非細胞成分を含むことができる。このような非細胞成分及び非MSCは、例えば、MSCが単離された生体試料に起源にもつことができる、或いは、例えば、MSCの取り扱い、維持、培養及び貯蔵の際に用いた緩衝液、溶液又は培地に起源をもつことができる。MSCではない細胞は、例えば、結合組織、血液、骨髄、脂肪組織、血管、神経組織、筋肉組織及び/又はストローマ組織に由来し得る。細胞は、例えば、MSCが単離された生体試料に存在した脂肪細胞となり得る。ある特定の実施形態において、MSCを含む組成物は、脂肪細胞を更に含む。非細胞成分は、例えば、組織液、細胞培養培地、血漿成分、細胞外マトリックス、酵素、成長因子及びサイトカインとなり得る。非細胞成分は、例えば、MSCの継代の際に用いた血清の成分となり得る。

本発明の方法における使用のための組成物の調製に適した方法は、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる、標題「Therapeutic methods and compositions」、特許出願番号PCT/AU2012/001140の、2012年9月21日に出願され、WO2013/040649として公開された特許出願にも記載されている。

本明細書に記載されている通り、MSCの投与又は使用は、いずれかの疾患又は障害の治療又は予防に有用ないずれかのワクチンの治療的有効性を増強し得る。

治療的有効性とは、ワクチンの所望の効果を生じるワクチンの能力を意味する。一般に、ワクチンの所望の効果は、疾患又は障害の治療又は予防である。

本明細書に記載されている通り、本発明者らは、対象がワクチン及びMSCを投与されると、増強された治療的有効性を得ることができることを見出した。従って、対象は、本方法によって、例えばワクチン単独よりも有益な効果を経験することができる。本明細書に記載されている通り、治療又は予防のいずれかの側面は、本発明の方法によって増強され得る。

本発明の特定の実施形態において、ワクチンは、抗がんワクチンである。抗がんワクチンは、がんである疾患又は障害の治療又は予防に有用ないずれかのワクチンである。

がんである疾患又は障害の文脈において、治療が、がんに関連する症状の軽減と共にがん退縮又は寛解を含むことが理解されよう。治療は、少なくとも一時的に、がんの増殖若しくは転移を遅くする、遅延若しくは停止する、細胞株の分化を予防する、又は1種若しくは複数の腫瘍の進行を反転することができる。治療は、治療後のいずれかのがんの再発を予防又は遅延又は減速することができる。

がんである疾患又は障害の文脈において、予防が、前記がんの寛解後のがんに関連する症状の全て又は一部の再発の予防と共に、例えば、がんの転移による1種又は複数のがんの形成の予防を指すことも理解されよう。予防は、1種又は複数のがんによる罹患を予防する、或いは1種又は複数のがんによる罹患を遅延させることができる。

本発明の特定の実施形態において、抗がんワクチンは、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分を含む。本発明の特定の実施形態において、抗がんワクチンは、本明細書に記載されているワクチンのいずれかであってよい、或いは本明細書に記載されている方法に従って作製することができる。

がん細胞又はがん関連細胞は、対象から得られるいずれかの生体試料に由来し得る。生体試料は、以前に言及されたがんのいずれかに由来する少なくとも1個のがん細胞を含有し得る。

本発明の特定の実施形態において、がん細胞又はがん関連細胞は、ワクチン及びMSCを含む組成物を与えるよう企図される対象に由来する。該文脈において、ワクチンは、自家として記載することができる。

本発明の方法の特定の実施形態において、対象に投与されるワクチン及びMSCを含む組成物の両方が自家である。一実施形態において、ワクチンはレシピエント対象に対し自家であり、MSCは、レシピエント対象と同じ種の異なる個体を起源にもつという点において同種である。一実施形態において、ワクチンはレシピエント対象に対して自家であり、MSCは、レシピエント対象とは異なる種を起源にもつという点において異種である。

本発明の方法において、ワクチン及びMSCを含む組成物は、対象の治療の間に同時に又は異なる時点で又はいずれかの時点で、対象に投与することができる。ワクチン及びMSCを含む組成物は、同じ又は異なる投与経路を介して投与することができる。ワクチン及びMSCを含む組成物は、別々に又は単一の混合物として投与することができる。例えば、ワクチン及びMSCを含む組成物を一体に混合し、注射により単一の組成物として投与することができる。別の例において、ワクチンは、注射によるMSCを含む組成物の投与に先立ち、経口投与することができる。更に別の例において、ワクチンは、対象の身体の特定の部位に注射により投与することができ、MSCを含む組成物は、直後に同じ部位に又はその付近に、注射により投与される。

ワクチンが抗がんワクチンである実施形態において、ワクチン及び/又はMSCを含む組成物は、腫瘍内に直接的に或いはその近傍に、注射により投与することができる。

本発明の方法において、ワクチン及びMSCを含む組成物の一方又は両方は、対象に1又は複数回投与することができる。ワクチンは、例えば、MSCを含む組成物が対象に投与される回数と同じ回数、又はMSCを含む組成物が対象に投与される回数よりも少ない回数、又はMSCを含む組成物が対象に投与される回数よりも多い回数で、対象に投与することができる。例えば、MSCを含む組成物は、ワクチンが投与されるたびに、対象に投与することができる。別の例において、MSCを含む組成物は、ワクチンが投与されるときに投与することができ、その後、ワクチン接種後に所定の間隔で1又は複数回対象に投与される。更に別の例において、ワクチンの適切な投与が、2、3回以上のワクチン接種等、一連の投与に関与する場合、MSCを含む組成物は、第1のワクチン投与時に対象に投与することができるが、第2及び第3のワクチン接種時には投与されない。

本発明の実施形態において、ワクチン及び/又はMSCを含む組成物の投与は、腫瘍の部位から離れていても、或いは腫瘍の部位に近くてもよい。好ましい実施形態において、細胞及びワクチンは、可能な限り互いに近くに投与されるであろう。他の実施形態は、一方が他方の内側にあるパターンにおけるこれらの送達を含む。例えば、細胞は、円形を為す多数のスポットで投与することができ、ワクチンは、この円形内に投与することができる。

本発明の実施形態において、腫瘍が完全に消失するまで又は満足のいく結果が他の仕方で達成されるまで、高頻度用量の細胞を投与することができる。

本発明の方法の特定の実施形態において、ワクチン及びMSCを含む組成物は、対象に同時に投与される。「同時」とは、互いに6時間以内を意味する。この場合、ワクチンは、MSCを含む組成物の投与の最大6時間前又は後に対象に投与することができる。例えば、ワクチンを対象に投与し、続いて5分後にMSCを含む組成物を対象に投与することができる。別の例において、MSCを含む組成物は、対象にワクチンを投与する3時間前に対象に投与することができる。

本発明は、ワクチン及びMSCを含む組成物も提供する。

本発明の更なる態様において、組成物は、抗がんワクチンであるワクチンを含む。ワクチンは、本明細書に記載されている抗がんワクチンのいずれかであってよい。

更なる態様において、本発明は、本発明の方法における使用のためのキットであって、MSCを含む組成物の調製のための1種の薬剤と、ワクチンの治療的有効性を増強する方法又はがんの治療若しくは予防のための方法におけるキット又はキットの成分の使用のための説明書とを含むキットも提供する。

一実施形態において、キットは、少なくとも1種のワクチンを更に含む。別の実施形態において、キットは、本明細書に記載されている抗がんワクチンのいずれかの1つの調製のための少なくとも1種の薬剤を更に含む。

更なる実施形態において、キットは、疾患又は障害に特異的なワクチンと、MSCを含む組成物とを含む。好ましい実施形態において、疾患又は障害に特異的なワクチン、及びMSCを含む組成物は、別々の容器に収容される。

本発明は、対象におけるがんの治療又は予防のための方法であって、前記対象にMSCを含む組成物を投与する工程を含む方法も提供する。がんの治療又は予防のための方法において用いられるMSCを含む組成物は、本明細書に記載されているMSCを含む組成物のいずれかであってよい。

特定の実施形態において、本方法は、前記対象に抗がんワクチンを投与する工程を更に含む。抗がんワクチンは、本明細書に記載されている抗がんワクチンのいずれかであってよい。

特定の実施形態において、抗がんワクチンは、MSCを含む組成物を与えるよう企図される対象由来のがん細胞及びがん関連細胞の成分を含む。

がんの治療又は予防のための方法の特定の実施形態において、MCSは、骨髄又は脂肪組織を起源にもつことができる。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象と同じ種の異なる個体を起源にもつという点においてレシピエント対象と同種である。一実施形態において、MSCは、レシピエント対象とは異なる種を起源にもつという点において、レシピエント対象と異種である。

別の実施形態において、MSCは、ワクチン及びMSCを含む組成物を与えるよう企図される対象を起源にもつ。

本明細書に記載されている通り、抗がんワクチンは、レシピエント対象に対し自家であってよい。それに代えて又はそれに加えて、MSCを含む組成物におけるMSCは、レシピエント対象に対し自家であってよい。特定の実施形態において、抗がんワクチン及びMSCの両方は、レシピエント対象に対し自家であり、この対象は、治療の過程を1名の医師にプライマリケアされている。

本発明において用いられる生体試料のいずれかは、例えば、医師又は医療専門家により、医師の臨床ケア中の対象から収集することができる。医師は、独立に医業に関する法律の下に登録、認可又は認定されたいずれかの人物であってよい。医療専門家は、独立的に、或いは医師の監督下で対象から生体試料を収集することを許可、認可、登録又は認定されたいずれかの人物であってよい。例えば、医療専門家は、登録又は登記された看護師又は医師のアシスタント又は臨床アシスタントであってよい。例えば、医師の臨床ケア中のがんの対象に対して通常行われるであろうルーチンの外来患者手順において、生体試料を収集することができることが理解されよう。

本発明の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、製造され医療行為に用いられる製品のオーストラリア保健省薬品・医薬品行政局(TGA)による規制からの除外のための要件を満たす、ヒト起源の治療製品の生産を可能にする。TGAは、オーストラリア政府保健高齢化省の一部であり、医薬及び医療機器の規制を担う。関連する条項の下に、ヒト細胞及び組織又はそれらから製造される医薬製品は、オーストラリア医薬製品登録(ARTG)における包接の要件と、TGA立法のコンプライアンスから除外され得る。条項は、州又は内域の法律の下に登録された医師の臨床ケア及び治療中の患者から収集され、該医師又は該医師の専門的監督下の人物によって製造された、同じ医師又は同じ医師の専門的監督下の人物による該患者の単一の徴候の単一の治療過程における治療適用のための、ヒト細胞及び組織に適用される。よって、関連する条項は、製品が自家使用のみを目的とすることを要求する。

これらの要件と一致して、本発明は、ヒト対象におけるがんの治療又は予防のための方法であって、前記対象から少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を得る工程と、生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む抗がんワクチンを産生する工程と、治療的有効量の前記ワクチンを前記対象に投与する工程と、前記対象からMSCを含む生体試料を得て、生体試料からMSCを単離し、MSCを含む組成物を調製する工程と、MSCを含む治療的有効量の前記組成物を前記対象に投与する工程とを含み、前記方法の全工程が、前記方法を通して前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医によって又はその監督下で行われる方法を提供する。

本発明は、ヒト対象におけるワクチンの有効性を増強するための方法であって、治療的有効量のワクチンを前記対象に投与する工程と、前記対象からMSCを含む生体試料を得て、生体試料からMSCを単離し、MSCを含む組成物を調製する工程と、MSCを含む治療的有効量の前記組成物を前記対象に投与する工程とを含み、前記方法の全工程が、前記方法を通して前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医によって又はその監督下で行われる方法も提供する。

特定の実施形態において、本方法の1つ又は複数の工程は、前記医師の監督下に置かれた人物によって実行される。一実施形態において、本方法の集合的工程は、複数の人間によって行われる。

一実施形態において、本方法の集合的工程は、前記方法を通して、その全員が、前記対象の臨床ケアに対し主要な責任を有する登録医の監督下に置かれた、複数の人間によって行われる。

一実施形態において、本方法の集合的工程は、複数の場所で行われる。一実施形態において、前記対象から生体試料を得る工程は、前記投与工程の1つ又は複数とは異なる場所で実行される。

組成物、ワクチン及び医薬
本発明は、先に記述された方法のいずれかによって産生される、がんの治療又は予防のためのワクチンを提供する。本ワクチンは、がんの治療又は予防のための他の医薬の製造に用いることもできる。別の実施形態において、本発明は、本発明のワクチンを含む医薬組成物も提供する。

がんの治療又は予防のためのワクチンに関する本発明の態様において、本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、少なくとも、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含む。

本明細書に記載されている通り、本発明者らは、驚くべきことに、間葉系幹細胞(MSC)を含む組成物の投与が、医薬組成物、特に、ワクチンの治療効果を増強し得ることも見出した。従って、本発明は、本明細書において、ワクチンの治療的有効性を増強するための、MSCを含む組成物の使用も提供する。好ましい実施形態において、ワクチンは、抗がんワクチンである。ワクチンの治療的有効性を増強するため又はがんの治療若しくは予防のため等の、MSCの治療的使用に関連する本発明の態様において、本発明の組成物は、少なくともMSCを含む。

本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤及び/又は希釈剤を更に含むことができる。医薬組成物、ワクチン及び医薬を調製するために、不活性な薬学的に許容される担体は、固体又は液体のいずれかであってよい。液状製剤は、溶液、懸濁液及びエマルション、例えば、水又は非経口的注射用の水-プロピレングリコール溶液を含む。経口又は注射投与のいずれかのための液状製剤へと使用直前に変換されることが企図される固形製剤も含まれる。斯かる液状は、溶液、懸濁液及びエマルションを含む。様々な組成物のための薬学的に許容される担体及び製造方法の例は、A. Gennaro(編)、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、(1990)、Mack Publishing Co.社、Easton、Pennsylvaniaに見出すことができる。

担体、希釈剤、賦形剤及びアジュバントは、組成物、ワクチン又は医薬の他の構成成分との適合性の観点から「許容され」なければならず、一般に、その対象にとって有害ではない。薬学的に許容される担体又は希釈剤の非限定例は、鉱質除去又は蒸留された水;生理食塩水溶液;ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油等、植物ベースの油;ゴマ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油又はココナツ油等;メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサン(polysolpoxane)等、ポリシロキサンを含むシリコーンオイル;揮発性シリコーン;流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアラン(squalane)等、鉱物油;メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピル(hydroxylpropyl)メチルセルロース等、セルロース誘導体;低級アルカノール、例えば、エタノール又はイソプロパノール;低級アラルカノール(aralkanol);低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール又はグリセリン;パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル等、脂肪酸エステル;ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrolidone);寒天;トラガカントゴム又はアカシアゴム及びワセリンである。典型的には、担体は、組成物、ワクチン又は医薬の約10%〜約99.9重量%を構成するであろう。

本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、注射による投与(例えば、皮下、筋肉内又は静脈内注射を含む非経口的投与)又は経口投与(例えば、カプセル、錠剤、カプレット(caplet)及びエリキシル剤等)に適した形態であってよい。注射用溶液又は懸濁液としての投与のために、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は担体は、リンゲル溶液、等張性生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール及び1,2プロピレングリコールを含むことができる。非経口的に投与可能(administrable)な医薬組成物、ワクチン及び医薬を調製するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science、第15版、Mack Publishing Company社、Easton、Pa.により詳細に記載されている。

経口投与のために、適した担体、希釈剤、賦形剤及びアジュバントの数例として、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン及びレシチンが挙げられる。加えて、これらの経口製剤は、適した香味料及び着色料を含有することができる。カプセル形態で用いる場合、カプセルは、崩壊を遅延させるモノステアリン酸グリセリル(glyceryl monostearate)又はステアリン酸グリセリル等、化合物でコーティングすることができる。アジュバントは、典型的に、軟化薬、乳化剤、増粘剤、保存料、殺菌剤及び緩衝剤を含む。

経口投与のための固形は、ヒト医学及び獣医学の薬務において許容される結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味料、コーティング剤、保存料、潤滑剤及び/又は時間遅延剤を含有することができる。適した結合剤は、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース又はポリエチレングリコールを含む。適した甘味料は、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム又はサッカリンを含む。適した崩壊剤は、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸又は寒天を含む。適した希釈剤は、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム又はリン酸二カルシウムを含む。適した香味料は、ペパーミント油、ウィンターグリーン、サクランボ、オレンジ又はラズベリー風味の油を含む。適したコーティング剤は、アクリル酸及び/又はメタクリル酸及び/又はそれらのエステルのポリマー又はコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラック或いはグルテンを含む。適した保存料は、安息香酸ナトリウム、ビタミンE、アルファ-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン又は亜硫酸水素ナトリウムを含む。適した潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム又はタルクを含む。適した時間遅延剤は、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを含む。

経口投与のための液状は、上述の薬剤に加えて、液体担体を含有することができる。適した液体担体は、水、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ココナツ油等の油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド又はこれらの混合物を含む。

経口投与のための懸濁液は、分散剤及び/又は懸濁剤を更に含むことができる。適した懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム又はアセチルアルコールを含む。適した分散剤は、レシチン、ステアリン酸等、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ又はジ-オレイン酸塩、-ステアリン酸塩又は-ラウリン酸塩、ポリオキシエチレンソルビタンモノ又はジ-オレイン酸塩、-ステアリン酸塩又は-ラウリン酸塩その他を含む。

アジュバント又は生物学的応答修飾因子等、補助的活性構成成分を、本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬に取り込むこともできる。

いずれかの適したアジュバントが、本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬に含まれてよい。例えば、アルミニウムに基づくアジュバントを利用することができる。適したアルミニウムに基づくアジュバントとして、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。利用することができるアルミニウムに基づくアジュバントの他の具体例は、欧州特許第1216053号及び米国特許第6,372,223号に記載されている。他の適したアジュバントは、フロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories社、Detroit、Mich.);Merckアジュバント65(Merck and Company社、Inc.、Rahway、N.J.);AS-2(SmithKline Beecham社、Philadelphia、Pa.);水酸化アルミニウムゲル(alum)又はリン酸アルミニウム等、アルミニウム塩;カルシウム、鉄又は亜鉛の塩;アシル化チロシンの不溶性懸濁液;アシル化糖;カチオン性又はアニオン性に誘導体化された多糖;ポリホスファゼン;生分解性マイクロスフェア;モノホスホリルリピドA及びquil A;欧州特許第0399843号、米国特許第7,029,678号及びPCT公開番号WO2007/006939に記載されているものを含む水中油型エマルション;及び/又は、GM-CSF又はインターロイキン-2、-7若しくは-12、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、モノホスホリルリピドA(MPL)、コレラ毒素(CT)若しくはその構成サブユニット、熱不安定性エンテロトキシン(LT)若しくはその構成サブユニット、リポ多糖(LPS)及びその誘導体(例えば、モノホスホリルリピドA及び3-脱アシル化モノホスホリルリピドA)等のtoll様受容体リガンドアジュバント、ムラミルジペプチド(MDP)並びに呼吸器多核体ウイルス(RSV)のFタンパク質等、追加的なサイトカインを含む。

投薬量及び投与経路
本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、注射及び経口等が挙げられるがこれらに限定されない、標準経路によって対象に投与することができる。一部の実施形態において、これらは、単独で又は他の追加的な治療剤と組み合わせて対象に投与することができる。斯かる実施形態において、投与は、同時的又は連続的であってよい。

本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、筋肉内、皮下及び/又は皮内注射により送達することもできる。これらは、リンパ節付近の注射により又は腫瘍への直接的な注射により送達することができる。

一般に、本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、投与経路及び対象の身体的特徴(健康状態を含む)と適合性の様式で、所望の効果が誘導されるような(即ち、治療的に有効な、免疫原性となる及び/又は保護的な)仕方で投与することができる。例えば、適切な投薬量は、対象の身体的特徴(例えば、年齢、体重、性別)、組成物、ワクチン又は医薬が単一の薬剤として又はアジュバント療法として用いられているか、治療されているがん又は他の疾患、障害若しくは状態の進行(即ち、病理的状態)、及び当業者には容易に明らかな他の因子等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の因子に依存し得る。

組成物、ワクチン及び医薬の適切な投薬量を決定する際の様々な概論は、例えば、Gennaroら(編)、(1990)、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.社、Easton, Pennsylvania、USA; and Gilmanら(編)、(1990)、「Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics」、Pergamon Press社に記載されている。

典型的には、治療適用において、治療は、対象が罹患する状態の持続期間において為され得る。更に、当業者であれば、治療されている病状又は状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに治療されている特定の対象の性質により、個々の投薬量の最適量及び間隔を決定できることが明らかとなろう。最適投薬量は、従来技法を用いて決定することができる。

本発明の一部の実施形態は、複数の別々の用量における医薬組成物、ワクチン又は医薬の投与に関与し得る。従って、本明細書に記載されている治療のための方法は、例えば、規定の期間に亘る対象への複数の別々の用量の投与を包含する。従って、一部の実施形態において、本方法は、初回刺激用量を投与する工程を含み、これに続いてブースター用量を投与することができる。ブースターは、再ワクチン接種目的であってよい。様々な実施形態において、医薬組成物、ワクチン又は医薬は、少なくとも1回、2回、3回以上投与される。

本発明の医薬組成物、ワクチン及び医薬は、疾患、障害又は状態のための他の治療のうち1種又は複数と組み合わせても(共に又は連続的に投与される)有用となり得る。例えば、治療されている状態ががんである場合、本明細書に記載されている本発明の組成物、ワクチン及び方法は、放射線療法、及び/又は細胞分裂阻害剤、細胞傷害性薬剤[例えば、DNA相互作用薬剤(シスプラチン又はドキソルビシン等)等が挙げられるがこれらに限定されない];タキサン(例えば、タキソテール、タキソール);トポイソメラーゼIl阻害剤(エトポシド等);トポイソメラーゼI阻害剤[イリノテカン(又はCPT-11)、カンプトスター(camptostar)又はトポテカン等];チューブリン相互作用薬剤(パクリタキセル、ドセタキセル又はエポチロン等);ホルモン剤(タモキシフェン等);チミジル酸(thymidilate)シンターゼ阻害剤(5-フルオロウラシル等);抗代謝剤[メトトレキサート(methoxtrexate)等];アルキル化剤[テモゾロミド{TEMODAR(商標)、Schering-Plough Corporation社製、Kenilworth、New Jersey}、シクロホスファミド等];ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤[SARASAR(商標){4-[2-[4-[(11R)-3,10-ジブロモ-8-クロロ-6,11-ジヒドロ-5H-ベンゾ[5,6]シクロヘプタ[1,2-b]ピリジン-11-イル-]-1-ピペリジニル]-2-オキソエチル(oxoehtyl)]-1-ピペリジンカルボキサミド、又はSCH 66336、Schering-Plough Corporation社製、Kenilworth、New Jersey}、ティピファニブ(tipifamib){Zamestra(登録商標)又はR115777、Janssen Pharmaceuticals社製}、L778.123{ファルネシル(famesyl)タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、Merck & Company社製、Whitehouse Station、New Jersey}、BMS 214662(ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals社製、Princeton、New Jersey)等];シグナル伝達阻害剤[イレッサ(lressa)(Astra Zeneca Pharmaceuticals社製、England)、タルセバ(EGFRキナーゼ阻害剤)、EGFRに対する抗体(例えば、C225)、GLEEVEC(商標)(C-ablキナーゼ阻害剤、Novartis Pharmaceuticals社製、East Hanover、New Jersey)等];例えば、イントロン(Schering-Plough Corporation製)、Peg-イントロン(lntron)(Schering-Plough Corporation社製)等、インターフェロン;ホルモン療法組み合わせ;アロマターゼ組み合わせ;ara-C、アドリアマイシン、シトキサン及びゲムシタビンからなる群から選択される1種又は複数の抗がん剤等、抗がん治療のうち1種又は複数と組み合わせて(共に又は連続的に投与される)有用となり得る。

対象
対象は、それに対して治療方法又はワクチン産生若しくは投与のいずれかが行われるいずれかの個体である。対象は、本明細書において、患者とも称され得る。典型的には、対象は、医師又は獣医師に臨床ケアされている。

典型的には、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化成分を含むワクチンに関係する本発明の態様において、或いはがんの治療法における間葉系幹細胞の使用に関係する本発明の態様において、ヒトが医師に臨床ケアされている場合、或いは非ヒトが獣医師に臨床ケアされている場合、対象は、がんを有する個体である。対象は、がん細胞を含む生体試料を得た個体と同じ個体であってよい。

典型的には、ワクチンの治療効果を増強するための間葉系幹細胞の使用に関係する本発明の態様において、対象は、ワクチンによって治療又は予防することができる疾患若しくは障害を有する個体である又は疾患又は障害のリスクがある。典型的には、がん細胞の進行を阻害するための間葉系幹細胞の使用に関係する本発明の態様において、対象は、がんを有する個体である。本発明の組成物を投与するべき対象は、MSCが起源にもつ個体と同じ個体であってよい、或いはMSCが起源にもつ個体と同じ種の異なる個体となり得る、或いは異なる種の個体であってよい。典型的には、対象は、医師又は獣医師に臨床ケアされている。

対象又は個体の言及が、ヒト又はヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類、齧歯類の分類のメンバー、特に、ヒツジ、ウシ、ウマ及びイヌ等の分類の飼い慣らされたメンバー等が挙げられるがこれらに限定されない、社会的、経済的又は研究的に重要ないずれかの種の個体等の非ヒトを意味するように、対象は、ヒト又は非ヒトであってよい。

当業者であれば、広範に記載されている本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特異的な実施形態に開示されている本発明に対し、多数の変更及び/又は修正を行うことができることが認められよう。従って、本実施形態は、あらゆる観点において、例示的であって制限的ではないものと考慮するべきである。

次に、特異的な実施例に関連して本発明を記載するが、この実施例は、決して限定的に解釈するべきではない。

(実施例1)
予備的ワクチン治験及び投薬試験
材料と方法
細胞培養
10%(v/v)ウシ胎仔血清及び0.03%(w/v)L-グルタミンを補充した基本培地イーグル(BME)において、およそ90%コンフルエントになるまでラット神経膠腫細胞(9L)の細胞を培養した。細胞をPBSにおいて洗浄し、トリプシン処理し、フラスコから収集した。次に、細胞を無血清BMEで1回洗浄し、計数し、ラットへの注射のため1ml当たり10×10⁶個の細胞の濃度となるよう再懸濁した。

ワクチン産生のための腫瘍の誘導及びビオチン灌流
ラット側腹部の皮膚の下に、1×10⁶個の9L神経膠腫細胞(100μl)を注射し、腫瘍を確立させた。腫瘍がおよそ1cm³に達したら、次の方法に従ってラットにビオチンを灌流した。

ラットを麻酔し、眠ったらテープで固定し(taped down)、腹部及び胸部を剪毛した。心臓が目に見えるよう胸骨の下で切開を行い、0.5mlのヘパリンを心臓に直接注射して、凝血を予防した。次に、尖っていない灌流針を心臓右心房に挿入し、心臓の下の主な血液供給をクランプし、カット(cut below)した。生理食塩水をラットに20分間ポンピングして通した。その後、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.6を含有する60mlの緩衝液をラットにポンピングし、続いてPBSに溶解した20mgのビオチン-ss(Thermo社)をポンピングして通した。ビオチン-PBSを通過させたら、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH 7.6を含有する更に60mlの緩衝液をラットに流し通した。次に、ビオチン灌流した腫瘍を動物から除去し、後にワクチン調製に用いた。

ドナーラットにおける腫瘍の誘導
初期ドナーラット側腹部の皮膚の下に、1×10⁶個の9L神経膠腫細胞を注射し、腫瘍を確立させた。腫瘍がおよそ0.5cm³のサイズに達したら、ラットを安楽死させ、腫瘍を無菌的に除去した。次に、腫瘍を細かく刻んで、およそ1mm×1mmのサイズの腫瘍の小片を得た。ラットの埋め込みの用意ができるまで、これらの腫瘍片を無血清BME培地において氷上に維持した。

ワクチン治験におけるラットの再曝露
側腹部再曝露実験のために、ラットを麻酔し、側腹部に1×10⁶個の9L神経膠腫細胞を注射した。

脳再曝露実験のために、ドナーラットから腫瘍を回収し、小さくおよそ1mm片にカットし、使用するまで無血清BMEにおいて低温で貯蔵した。ラットの脳の左側に小さな穴を穿孔し、腫瘍の小片を植え込み、骨ろうで封着した。

ラットの回復をモニターし、腫瘍植え込み部位をキシロカインで処置した。脳腫瘍植え込み片を有するラットを窮迫の徴候に関して毎日モニターした。

初期ワクチン治験
灌流した腫瘍1グラム毎にホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤(Roche社)を有する40mlの0.05Mトリス、0.15M NaCl及び1%SDS緩衝液(pH7.6)において可溶化させた。次に、腫瘍ライセートを10,000rpmで30分間室温にてスピンダウンした。上清を収集し、ペレットを廃棄した。次に、上清を前平衡化したストレプトアビジン(トリス-NACL-SDS)カラム(Thermo scientific社)上に2部上清:1部カラムで流し、1時間インキュベートした。カラムを5×カラム緩衝液で洗浄し、続いて50mM DTTを有する1カラム容量のトリス-Nacl-SDS緩衝液で溶出させた(1時間インキュベート)。2mlの溶出したワクチンタンパク質を20mlの氷冷アセトンで一晩沈殿させ、一晩-20℃でインキュベートした。翌日、試料を10,000rpmで30分間スピンダウンし、上清を廃棄した。ペレットを乾燥させ、200μlの無菌PBSに再懸濁した。

ラット毎に個々のワクチンとして各200μlのバッチを用い、フロイント不完全アジュバントと1:1混合した。ワクチン又はFIAとPBSを腹腔内に(i.p)与えたラットに、続いて3週間後にブースターショットを与えた。次に、ラットを側腹部において1×10⁶個の9L細胞に曝露し、これをゼロ日目と命名した。動物の腫瘍をノギス(calipur)により1週間に3回測定した。式(幅²×長さ)/2=cm³により腫瘍サイズを測定した。

ワクチン投薬治験
初期ワクチン治験と同じ方法によりワクチンを調製した。対照群のラット(n=8)に、PBS/FIA i.p.の2ワクチン接種を与えた。ワクチン群のラットには、1(n=8)、2(n=9)又は3(n=9)用量のワクチンi.p.のいずれかを与えた。第4のワクチン群のラット(n=8)には、2用量のワクチンを皮下に与えた。最後のワクチン接種の2週間後に、全群を側腹部において1×10⁶個の9L神経膠腫細胞に曝露した。

腫瘍再曝露治験
ワクチン投薬治験を生存した群1又は2(上述)のラット(N=9総計)を、2群に分割した。未処置対照(n=10)と共に、群1(N=4)を側腹部において1×10⁶個の9L神経膠腫細胞に再曝露した。未処置対照(n=6)と共に、群2(n=5)の脳に腫瘍の小片を与えた。

生存率及び生存時間の計算
結果の解析に関して、治癒したラットは、腫瘍が消散及び消失したラットであった。群毎の治癒した数により治癒率を規定した(例えば、6/10=60%)。

安楽死の日に生存率を規定した。倫理的理由のため、腫瘍が13.5cm³のおよそのサイズに達したら、ラットを安楽死させた。群毎に平均生存時間(日数)を計算した。「治癒した」又は「寛解した」ラットを100日間の値に割り当てる。生存曲線をプロットして、群間の有意性を測定した。

結果
初期ワクチン治験は、2用量の9L神経膠腫ワクチン又はアジュバントで処置したラットを含み、ワクチンの安全性及び有効性を決定した。ラットは、ワクチン接種部位における軽微な腫脹以外にワクチン接種に対する有害作用を示さなかった。ワクチン処置群における3匹のラットのうち2匹は、腫瘍を発症したが、そのうち1匹は経時的に消散し、生着後58日目までに消失した(図1A)。100日間を超えて生存した後に、2匹のラットを「寛解した」又は「治癒した」と考慮し、獲得免疫実験における再曝露のために維持した(図2E及び図2F)。対照的に、対照アジュバントワクチン接種ラットにおいて、倫理的エンドポイントまでの平均腫瘍進行時間は、35日間であった(図1B)。全体的に見て、アジュバント単独と比較して、ワクチン接種群において有意な生存利点が存在した(P<0.05)。

初期ワクチン治験の成功後に、投薬試験を行って、1、2又は3ショット(i.p.)いずれのワクチンが最適であるかを調べた。寛解率は、1又は3用量と比較して、2用量を与えたラットにおいて最高であった(図2)。2及び3用量は両者共に、対照と比較して有意な延長された生存時間を生じたが、単一用量はこれを生じなかった。2用量のワクチンs.c.と比較した2用量のワクチンi.p間に平均生存時間の延長はなかったため、いずれのワクチン接種経路を用いてもよい。

ワクチン投薬治験において寛解したラット(n=9)を2群に分割し、脳(n=-4)又は側腹部(n=5)のいずれかにおいて再曝露した(図2E及び図2F)。これらのラットは全て、脳及び側腹部の両方において曝露されると、腫瘍進行に対し完全免疫を示し、獲得免疫と、免疫系が血液脳関門を越えて作用し得ることを示唆した。

サイトカイン解析も行い、結果を図3に提示する。本図は、対照(アジュバント対照)と比較したワクチン接種ラットにおけるインターフェロン-γの上方制御(A)を示す一方、図3(B)は、対照と比較したワクチン接種ラットにおけるIL-4の有意な下方制御を示す。1又は2ワクチン接種を与えたラットにおいて、インターフェロン-γ又はIL-4レベルに有意差はなかった。

サイトカインINF-γは、抗腫瘍応答の重大な意味を持つ免疫系成分である。INF-γは、リンパ球と共に、腫瘍発症から保護するのみならず、「がん免疫編集(immunoediting)」プロセスとして提示するために腫瘍の免疫原性表現型の形を変える(sculpt)補助も行う。総合すると、サイトカイン結果は、ワクチンが、特異的且つ有効な免疫抗腫瘍応答を惹起することを示唆する。本明細書に記載されている通り、治癒したラットにおいて、インターフェロンγレベルは、腫瘍が消散すると再度低下する。

ワクチンの予備的解析
用いたワクチン及び初期ワクチン治験においてラットから収集した血清を、SDS-PAGE及びウエスタンブロッティングにより解析した。ワクチン接種ラット由来の血清を用いたワクチンのウエスタンブロット解析が、50〜75Kdaの間に共通の5又は6本のバンドを産生したことが示され、これらはストレプトアビジンの断片であることが後に判明した(図4A)。ワクチンを作製するために異なるカラムを用いた実験は、変動量のストレプトアビジンがカラムについて回る(leeching off)ことを実証した。

ストレプトアビジンカラムを用いて未灌流腫瘍ライセートの試料を精製して、図4Bに見られる複雑なバンドパターンを産生した。この結果は、ストレプトアビジンが、ワクチンタンパク質を選択し得、恐らくは腫瘍タンパク質におけるRYD又はRGD部位によってそのように為し得ることを示唆した。腫瘍抽出緩衝液において最大10%SDSを用いた追加的な実験は、ストレプトアビジンカラムを用いて未灌流腫瘍ライセートを精製した場合に、依然として類似の複雑なワクチンプロファイルを生じ、腫瘍タンパク質及びストレプトアビジンの間の高レベルの親和性を示唆し、更なる解析の動機づけとなった。

(実施例2)
ワクチン成分治験
材料と方法
調製及びワクチン接種 - ストレプトアビジン(50μg)のみのワクチン(ストレプトアビジン)
1%SDS(w/v)、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.6を含有する緩衝液に300μgストレプトアビジン(Calbiochem社)を可溶化することにより、ストレプトアビジンワクチンを調製した。可溶性ストレプトアビジンを1mlアセトンにより-20℃で一晩沈殿させた。翌日、試料を10,000rpmで30分間スピンして、沈殿物をペレットにした。次に、6匹のラットのワクチン接種のために、沈殿したストレプトアビジンを600μlのPBSに再懸濁し、600μlのFIA(Sigma社)と混合した(ワクチン接種当たり0.2ml)。

調製及びワクチン接種 - 還元された腫瘍タンパク質ワクチン(R-ライセート)
6種の異なる誘導された9L神経膠腫腫瘍のセクションを収集し、秤量し(1グラム)、1%SDS(w/v)、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.6及びプロテアーゼ阻害剤(Roche社)を含有する40mlの緩衝液においてホモジナイズした。腫瘍ライセートを10,000rpmで30分間スピンダウンし、可溶性腫瘍ライセートを収集した。20mM TCEP(Sigma社)を2時間添加することにより、このライセート2mlにおけるタンパク質を還元し、続いて40mlのアセトンを添加して一晩-20℃でインキュベートすることにより沈殿させた。翌日、試料を10,000rpmで30分間スピンダウンしてタンパク質を沈殿させた。6匹のラットのワクチン接種のために、沈殿物を1.2mlのPBSに再懸濁し、1.2mlのFIA(Sigma社)と混合した(ワクチン接種当たり0.3ml)。

調製及びワクチン接種 - 還元された腫瘍タンパク質+ストレプトアビジン(50μg)ワクチン(ワクチン(50))
上述の還元された腫瘍タンパク質ワクチンの通りに調製された2mlの腫瘍ライセートを、300μgのストレプトアビジン(Calbiochem社)と混合し、更に2時間インキュベートし、その後、40mlのアセトンにより-20℃で一晩沈殿させた。翌日、試料を10,000rpmで30分間スピンダウンして、タンパク質を沈殿させた。次に、6匹のラットのワクチン接種のために、沈殿物を1.2mlのPBSに再懸濁し、1.2mlのFIA(Sigma社)と混合した(ワクチン接種毎に0.3ml)。

ワクチン(100)
2mlの還元ライセートに600μgのストレプトアビジンを添加したこと以外は上述と同じ方法により、高ストレプトアビジン用量ワクチン[還元された腫瘍タンパク質+ストレプトアビジン(100μg)ワクチン]を作製した。

対照
対照ラットに、300μl用量でFIA/PBSを与えた(n=5)。3週間後に全群に二次ワクチン接種を与えた。

ストレプトアビジンELISA
ワクチン成分治験に関与するラットから収集された血清のストレプトアビジンに対する反応性を、ELISAにより測定した。0.1M NaHC0₃に溶解した10μg/mlの濃度のストレプトアビジン(Calbiochem社)を、ELISAプレート(NUNC社)に一晩4℃でコーティングした。翌日、PBSに溶解した3%BSAにおいて1時間37℃でプレートをブロッキングした。ラット血清を1%BSA/PBSにおいて1:1000希釈し、プレートにおいて37℃で1時間インキュベートした。次に、プレートをPBS/0.05%tweenで4回洗浄し、1%BSA/PBSにおいて1:2000希釈したヤギ抗ラット-HRP抗体(Sigma社)でプレートを1時間37℃でインキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質を10分間添加し、その後停止した。480nmにおける吸光度を読み取った。

サイトカイン解析
2種の広範なスクリーニング方法を用いて、ワクチン成分治験においてラットから収集した血清のサイトカイン解析を最初に行った。広範囲のサイトカインをサンプリングする初期ラット血清スクリーニングのために、ラットサイトカインバイオプレックス(bioplex)(Biorad社)及びラットプロテオームプロファイラー(profiler)(商標)アレイ(R and D systems社)を製造者(manufactures)の説明書に従って用いた。また、製造者の説明書に従って、ラットC反応性タンパク質(BD社)、CINC-2(R and D systems社)、ICAM(R and D systems社)、IL-4(R and D systems社)、TNF-α(R and D Systems社)、INF-γ(Bender systems社)のELISAを用いてラット血清試料をスクリーニングした。

フローサイトメトリー血液アッセイ
ワクチン成分治験におけるラットの末梢血におけるナチュラルキラー(NK)、CD4+、CD8+T細胞、B細胞、リンパ球、好中球及び単球レベルのレベルを評価するために、フローサイトメトリーアッセイを開発した。被験ラットから血液の試料を収集して、凝血を予防するために0.5ml EDTAチューブに入れた。検査ごとに、25μlの血液をTrucount(商標)チューブ(BD Pharmingen社)に添加し、次にラットT/B/NK細胞カクテル(BD Pharmingen社)、ラットCD8a PE、ラットCD4(ドメイン1)FITC及びラットCD45 PE/Cy7(Biolegend社)で15分間室温にて染色した。次に、10mMトリス及び塩化アンモニウム緩衝液(pH7.4)を用いて試料を溶解した。次のゲーティング(gating)戦略を用いて複数の細胞集団を解析した。全細胞サブセットをCD45陽性としてゲーティングし、単球、好中球及びリンパ球をFSC v SSCにより解析した。T4(CD4)細胞CD45/CD3/CD4陽性、T8(CD8)細胞CD45/CD3/CD8陽性、NK細胞(CD45+/CD3-/CD161a+)及びB細胞CD3+/CD45+/CD45RA+。

1μl当たりの細胞数を次の通りに計算した。

結果(ワクチン成分試験)
ワクチン成分治験において、FIA/PBSで処置した対照ラットは、9L細胞に曝露した後に平均38日間生存した。図5及びTable 1(表1)から分かる通り、還元された腫瘍タンパク質ワクチン(R-ライセート)群の平均生存時間は、43日間であった。これは、対照ラットよりもほんの5日間多いだけであったが、生存の観点から有意であった。ストレプトアビジン(50μg)のみのワクチン群は、対照ラットよりも平均15日間長く生存し、曲線において有意に延長された生存を示した[図5及びTable 1(表1)]。還元された腫瘍タンパク質+ストレプトアビジン(50μg)[ワクチン(50)]は、6匹のラットのうち2匹において寛解を誘導した。この群における平均生存時間は、対照ラットの2倍であり、次善の群(ストレプトアビジンのみ)よりも平均25日間長い生存時間であった。

還元された腫瘍タンパク質+ストレプトアビジン[ワクチン(100)]においてストレプトアビジンの用量を増加させたところ(100μg)、平均生存時間を劇的に減少させ、いかなる寛解も無効にした。

ワクチン成分治験から収集したストレプトアビジン反応性及びサイトカイン解析データの概要を図6、図7及びTable 1(表1)に示す。ストレプトアビジンに対する血清抗体は、還元された腫瘍タンパク質ワクチン(R-ライセート)群のいずれにおいても明らかではなかった(図6Cを参照)。興味深いことに、ストレプトアビジン単独をワクチン接種したラットは、腫瘍曝露後にストレプトアビジン反応性の僅かな増加を示した(図5Cを参照)。

特に、ストレプトアビジン(50μg)のみのワクチン群は、対照と比較してサイトカイン、IL-1β、IL-13、TNF-α、MIP-3a及びVEGFの上方制御を示したが、この群においてM-CSFは下方制御された[Table 1(表1)]。ワクチン(50)群由来の治癒したラットにおいて(n=2)、TNF-αは、エンドポイントにおいて対照と比較して上方制御されたが[Table 1(表1)]、IFN-γ及びMIP-3aは、対照と比較して下方制御された。逆に、寛解していないこの同じ群由来のラットは、対照よりも有意に低いエンドポイントレベルを有していた[P<0.05、Table 1(表1)]。サイトカインICAMは、対照と比較してワクチン(50)において有意に下方制御された(図6E)。CINC-1は、いずれの群においても有意に上昇しなかった(図7B)。

全体的に見て、ワクチン成分治験の21日目に収集した血清試料におけるサイトカイン解析は、対照群及び還元された腫瘍タンパク質(R-ライセート)群の間に有意差を示さなかった[図6D及び図6E及び図7B及びTable 1(表1)]。

一般に、C反応性タンパク質レベルは、腫瘍曝露後に全群において増加したが、群間にレベルの有意差はなかった(図7A)。ワクチン処置ラットにおけるTNF-αレベルは、腫瘍曝露3週間後にワクチン処置群のみにおいて有意に増加した(図6D)。

マルチカラーフローサイトメトリーアッセイを開発して、少量の末梢血試料における複数の末梢血細胞型を解析した。アッセイは、血液1マイクロリットル当たりのNK、CD4、CD8、B細胞、リンパ球、単球及び好中球の数を検出した。二次ワクチン接種の1週間後(腫瘍前)及び腫瘍曝露3週間後(後)に、アジュバントのみ及び還元された腫瘍タンパク質+ストレプトアビジンワクチン処置ラットの血液を検査した(図8を参照)。アジュバント処置及びワクチン処置群の両方において、腫瘍曝露前及び後にNK細胞レベルの有意差が観察された。CD4細胞は、対照と比較して、腫瘍曝露前及び後の両方でワクチン処置ラットにおいて有意に増加したが、両群のCD4レベルは、腫瘍曝露後に有意に下落した(図8)。CD8レベルは、腫瘍曝露21日後に両群において低下したが、アジュバントのみ群において有意に低下した(図8)。B細胞は、腫瘍曝露前に両群においてベースラインレベルと比較して上昇を示したが、腫瘍曝露後に有意に下落した。B細胞レベルは、ワクチン処置ラットにおいて正常ベースラインレベルに戻り(21日目)、腫瘍に対する応答が細胞媒介性であった可能性を示す。ワクチン接種は、単球レベルにスパイクを引き起こし、これは再度、ワクチン処置ラットにおいて正常レベルに減少したが、対照群においては上昇を維持した(図8)。好中球/リンパ球比(NLR)は、ワクチン接種後にベースラインレベルであったが、腫瘍曝露後に対照において有意に増加し、但しワクチン処置ラットにおいては増加しなかった。

(実施例3)
自家ワクチン調製
材料と方法
可溶化生体試料の調製
外科的に除去された腫瘍組織の新鮮で健康な小片(各0.1g)を、1%SDS(v/w)、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.6を含有する緩衝液においてホモジナイズし、続いて遠心分離により清澄化した。0.1gの腫瘍毎に、4mlの緩衝液を添加した。

腫瘍タンパク質抽出物の1ml画分を、1%SDS緩衝液に溶解した20mM TCEP又は50mM DTTにより1時間還元した。次に、それぞれに150μgのストレプトアビジンを添加し、その後、穏やかに混合しつつ2時間インキュベートした。

ワクチン調製
インキュベーション後に、腫瘍タンパク質-ストレプトアビジン混合物を5〜10容量の氷冷アセトンにより-20℃で一晩沈殿させた。次に、これらの混合物を10,000×gで30分間遠心分離し、その後、アセトンをデカントして、ペレットを風乾させた。

乾燥ペレットを600μlの無菌PBSに再懸濁し、600μlのFIAと混合し、19G針を用いて乳化させた。ワクチン製剤を3つの等用量に分け、対象の皮下に単一用量で0及び3週間目にワクチン接種し、続いて対照、ワクチン未接種対象と比較して生存を評価した。

結果
ワクチン接種対象は、67日間の増加した生存平均長を示したが、対照群は、38日間の生存平均長を実証した(図9)。

(実施例4)
自家ワクチンによるイヌ安全性治験
材料と方法
腫瘍の生検又は腫瘍の完全除去のいずれかにより、がん細胞を含む新鮮腫瘍試料を得た。腫瘍試料を処理するまで-20℃で凍結した。処理当日に、腫瘍試料を秤量した。0.1グラムの腫瘍毎に、プロテアーゼ阻害剤(Roche社)に加えて1%SDS(v/w)、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.6を含有する4mlの緩衝液を添加した。次に、組織試料をホモジナイズし、篩を通して濾過して、より大型の線維性物質を除去した。

得られたライセートを10,000rpmで15分間遠心分離し、可溶性画分を保持した。TCEPを添加して最終濃度20mMのTCEPとし、試料を1時間室温でインキュベートし、その後、100μlのビオチン-NHS(1mg/ml濃度)を添加した。室温2時間のインキュベーション後に、100μlの1mg/mlストレプトアビジン(Sigma社)を添加し、混合物を2時間インキュベートした。

次に、少なくとも5容量の冷アセトンの添加によりライセートを沈殿させ、-20℃で一晩インキュベーションした。10,000rpmで30分間4℃の遠心分離により沈殿物を回収し、上清をデカントし、アセトンが蒸発するまでペレットを風乾させた。

次に、ペレットを600μlのPBSに再懸濁し、2×0.3mlアリコート(2回のワクチン接種用)に分割し、その後、-20℃で凍結した。

ワクチン接種当日に、1個のワクチンアリコートを解凍し、等容量のFIAと混合し、皮下投与した(0.6ml)。これを3週間後に反復した。

結果
イヌ安全性治験のために調製した自家ワクチンを、SDS-PAGE及びウエスタンブロットにより解析した(図8を参照)。

2011年3月にイヌ安全性治験を開始した。動物の多くが不健康状態で治験に参加したにもかかわらず、ワクチン接種部位に局在化した炎症以外に、ワクチンに対する有害反応は存在しなかった。およそ2013年4月までの治験の結果を、個々の動物の観点からTable 2(表2)に提示する。およそ2013年8月までの治験の結果を、がん型に基づいてグループ化した結果と共に図11に示す。ワクチンは、送達が安全であり、広範囲の化学療法、ステロイド及び他の薬物に有害反応がないことが判明した[Table 2(表2)]。異なる品種及び10種を超える異なる腫瘍型において安全であることも実証された。

本治験の腫瘍型及び生存データは、図11にも示される。予想される生存時間は、個々の腫瘍学報告又は公表された文献のいずれかから得て、外科手術単独又は腫瘍型の標準治療に基づいた。

本試験に含まれる25匹のイヌのうち、10匹は、生検、部分的切除術又は転移性疾患のいずれかの後に残存腫瘍を有していた。そのうち60パーセント(6/10)は、予想よりも長く生存した。

完全腫瘍切除術を行った他の15匹のうち、40%(6/15)は、予想よりも長く生存し、更に別の5匹は依然として、ワクチンの恩恵を受けたか判断するにはまだ早過ぎるステージである。更に別の9匹のイヌは、自身のワクチンを作製したが、用量を与える前に他の合併症により死亡した、或いは飼い主が先に進まないと決断した。

2回のワクチン接種を与えたイヌの90パーセント(16/18)は、その予想される生存時間を調査の日付において2週間〜22ヶ月間超えた。これらのイヌのうち、その予想される生存時間より前に死亡したものはない(無関係の原因を除外)。更に4匹のイヌは、生きているが、その予想される生存に達してなかった。アナフィラキシーの症例は起きておらず、記録された唯一の副作用は、ワクチン接種部位における皮下小結節であり、これは経時的に消散した。本安全性治験に登記したイヌのうち数匹には、化学療法[例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン(Doxirubicin)及びシクロホスファミド(cyclophosphomide)]及びステロイド(プレドニゾン)及び他の薬物[シプロフラキシン(Ciproflaxin)及びアロプリノール]を含む他の治療法も与えていた又は与えた。これらの結果は、臨床背景におけるワクチンの安全性及び有効性を実証する。腫瘍切除術又は生検からの時間までの早いターンは、治療までの遅延時間が最小であることも意味し、これは臨床背景においても重要である。

(実施例5)
がんワクチンによるヒト患者の処置
材料と方法
ワクチンの調製
肝臓、肺及び脊椎に転移した進行結腸直腸がんの63歳男性は、脊椎における腫瘍を除去するための外科手術を受けた。腫瘍(0.5g)を用いてワクチンを調製した。実施例4に記載されている通りに腫瘍ワクチンを調製した。

ワクチン接種
胃への皮下注射によりワクチンを投与した。2週間後に第2のワクチンを投与した。

ワクチン接種後モニタリング
第2のワクチン接種の18日後に血液を収集し、フローサイトメトリーにより解析した。結果をTable 3(表3)に提示する。

ナチュラルキラー(NK)細胞数が有意に上昇し、免疫学的応答を示す。患者を管理した臨床腫瘍学者は、血液解析の結果が、ワクチンが効果を有していることを示し、計画していた化学療法処置の停止を決断したことを報告した。

がんワクチンに関係する考察
本試験は、本明細書に記載されている方法を用いて開発したワクチンが、腫瘍を認識し、腫瘍成長を遅くする又は腫瘍拒絶を誘導するよう免疫系を刺激し得ることを実証した。9L神経膠腫ラットモデルの予防的同種間ワクチン接種は、100%のラットにおいて生存を倍加し、その33%において寛解をもたらした。寛解したラットの再曝露は、100%腫瘍拒絶を実証した。進行がんのイヌの臨床背景における自家ワクチン接種は、有効性の初期証拠を有する迅速な産生方法の安全性と共に「現実世界」の適用性を実証した。

本明細書に記載されている実験において、ストレプトアビジンは、腫瘍タンパク質の選択及び免疫系の刺激に有効である。タンパク質へのストレプトアビジンの結合は、フィブロネクチンのRGD細胞接着ドメインを模倣するそのRYDS配列を介して為される。RGD配列を含有し、ストレプトアビジンに結合する可能性がある60種を超える膜内在性タンパク質が存在する。インテグリン、VEGF-A、アンジオポエチン(angiopoientin)、オステオポンチン(osteopoientin)及びフィブロネクチン等、これらのタンパク質の多くは、がん発症における役割を有することが示されてきた。

しかし、ストレプト(strep)アビジン単独によるワクチン接種は、寛解を誘導せず、本発明者らは、これを、リフォールディングを予防するために変性条件下で還元した可溶性腫瘍タンパク質と組み合わせた。低い免疫原性を有する抗原を提示するための強力な仕方として最終沈殿工程を先に用いたが、他の大部分のワクチンは、エタノール固定又は放射線照射された細胞全体に由来するため、本明細書に記載されている可溶性タンパク質の利用は、本プロセス及びワクチンを際立たせる。本明細書に記載されている特異的な実施形態において、次に可溶性タンパク質は、TCEPにより還元され、これによりジスルフィド結合が永続的に切断され、タンパク質に安定的な環境をもたらす。

本明細書に例証されている組み合わせ(ストレプトアビジンプラス還元可溶性タンパク質);ワクチン(50)は、9L神経膠腫モデルにおいて腫瘍寛解及び拒絶を伴った。他の試験は、腫瘍成長を遅くするための自殺遺伝子移入又はナノ粒子等、異なる治療法を用いることに成功したが、本発明者らの知識によると、これは、この積極的モデルにおける完全寛解誘導の最初の報告である。注目すべきことに、9L神経膠腫モデルは、免疫原性であると報告されたが、この細胞株を用いた他の報告と一致して、本発明者らは、自発的寛解なしの100%生着を観察した。

本明細書に示す結果は、ワクチンが、優勢な抗体応答(ストレプトアビジンに対する)から細胞媒介性応答(還元腫瘍ライセートの添加を要求する)へと免疫応答をモジュレートすることを示唆する。B細胞は、ワクチン接種後にワクチン及び対照の両方において上昇し、アジュバントFIAが、以前に記載された通り末梢B細胞の増加を刺激することを実証した。しかし、生着21日後までに、ワクチン処置ラットのB細胞数は、正常レベルに戻り、腫瘍に対する細胞媒介性応答への切り換えを再度示した。CD8+T細胞数(本明細書において、T8とも称される)は、両群において腫瘍曝露21日後に有意に下落したが、ワクチン処置ラットCD8レベルは、21日目に対照よりも有意に高かった。この結果は、リンパ球産生がワクチンによって刺激され、生存延長に役立つことを示唆する。正常リンパ球レベル維持の重要性の支持において、がん患者における低レベルが、より不良な予後及びより高い腫瘍グレードを示すと報告されている。より高レベルの腫瘍浸潤リンパ球(CTL)を有するメラノーマ及び結腸直腸患者も、より優れた予後を有する。

観察された主要なサイトカイン応答は、抗腫瘍効果を有し、がん細胞アポトーシスを引き起こすことが公知のTNF-αの上方制御であった。ストレプトアビジンのみのワクチン接種ラットは、生存増加を示したが、ワクチン処置ラットに観察されたTNF-αの相当する上方制御を示さなかった。腫瘍成長及び転移に関与するサイトカインであるICAM1も同様に、ワクチン処置ラットにおいてのみ下方制御された。

サイトカイン解析は、ワクチン処置及び対照ラットの間のIL-4及びINF-γのレベルの差も同定した。腫瘍進行及び転移をモジュレートすることが示されたIL-4は、ワクチン処置ラットにおいて減少した。ワクチン処置ラットは、抗腫瘍応答の重大な意味を持つ免疫系成分であるINF-γの有意な増加も示した。INF-γは、リンパ球と共に、腫瘍発症から保護するのみならず、「がん免疫編集」プロセスとして提示するために腫瘍の免疫原性表現型の形を変える補助も行う。総合すると、サイトカイン結果は、ワクチンが、特異的且つ有効な免疫抗腫瘍応答を惹起することを示唆する。

ラットモデルは、ワクチン製剤の初期評価に有用であるが、イヌは、症状及び進行する時間の観点からヒトと一致する臨床症状及びシナリオを提供した。フェーズI安全性治験としてイヌを評価したところ、ワクチンを単独で又は種々の他の薬物療法と組み合わせて投与した場合に有害反応が観察されなかった。これらの結果は、自家ワクチンプロトコールの安全性を確認する。

本試験は、変動する程度の疾患(手術可能から転移性)及び腫瘍型を呈するイヌ患者による、この臨床背景におけるワクチンの有効性の初期証拠も提供する。残存又は転移性疾患を有するイヌは、多くの場合、予想よりも長く生存し、ワクチン接種が腫瘍成長を遅くすることができることを示す。数日間で自家ワクチンを産生する能力は、外科手術及び治療の間のほんの数日間の遅延時間による臨床状況へのその適用性を強調する。更に、前に凍結した新鮮腫瘍試料は、補助的背景において用いる場合、ワクチンが必要とされるまで無期限に貯蔵することができる。本明細書に提供される例は、ヒトがん患者の治療におけるワクチンの有効性の初期臨床証拠も提供する。

本明細書に記載されている本発明は、成長遅延及び寛解の両方の証拠を有する自家又は同種腫瘍ワクチンを作製するための特有のワクチンプロセスを提供する。本明細書に例証されている特異的な実施形態において、還元された腫瘍タンパク質と共に免疫刺激物質としてのストレプトアビジンの使用は、齧歯類及びイヌ患者において有効であり、安全であり且つ優れた耐容性があることを示し、これにより、本発明が、改善されたがんワクチンの開発のための新規プラットフォームを提供することを説明する。

(実施例6)
腫瘍の誘導に先立つ脂肪由来ラット細胞及びがんワクチンの組み合わせによるラットの処置
材料と方法
脂肪組織の処理
ラットから脂肪組織の10g試料を収集した。脂肪組織を生理食塩水でリンスした後、ハサミを用いて細かく刻み、20mlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Sigma社)と混合した。コラゲナーゼ(Sigma社)を添加して0.05%の最終濃度とし、試料を37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションの間、試料を15分間置きに手で穏やかに反転した。

コラゲナーゼ処理後に、ステンレススチールメッシュ(700μm孔径)を通して試料を無菌的に濾過し、50ml遠心管に移し、500gで15分間遠心分離した。浮遊細胞及び上清を廃棄し、ペレット化した細胞をパスツールピペットで穏やかに混合し、15ml遠心管に移した。

次に、DMEMにおいて細胞を洗浄して、コラゲナーゼを除去した。最終容量14mlとなるようDMEMを添加し、試料を500gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化した間質血管画分(SVF)細胞を4mlのDMEMにおいて穏やかに再懸濁し、パスツールピペットで混合した。

細胞の増大化
細胞懸濁液のアリコート(0.5ml)を、DMEMプラス20%ウシ胎仔血清を含有する組織培養フラスコに移し、コンフルエント細胞単層ができるまでCO2インキュベーター内で37℃にてインキュベートした(7〜10日間)。3mlのTrypLE Express(Invitrogen社)により細胞を剥ぎ取り、50ml遠心管へとデカントし、500×gで10分間遠心分離した。

細胞の凍結保存
ペレット化した細胞試料をいずれもウシ胎仔血清に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を2mlアリコートにおいてクライオバイアル(cryovial)に移した。

DMSOを各クライオバイアルに添加して10%の濃度とし、Mr Frosty緩慢凍結装置(Invitrogen社)の-80℃冷凍庫において24時間クライオバイアルを凍結し、次に長期貯蔵のために液体窒素ジュワー(dewar)に移した。

がんワクチンの投与
本明細書に記載されている通りに、がんワクチンを調製した。ワクチンをフロイント不完全アジュバント(FIA)と混合し、3匹のラットの2群に腹腔内投与した。ワクチンを3週間後に再度投与した。更に3匹のラットを対照群として用いて、単にFIAをワクチン接種した。

細胞の投与
細胞のバイアルを液体窒素から取り出し、室温で解凍させた。およそ1×10⁶個の幹細胞を1群の3匹のラットにワクチンと同時に同じ部位に皮下注射により投与した。

腫瘍曝露
最終ワクチン接種後に、全3群のラットを側腹部において9L腫瘍に曝露し、側腹部腫瘍の成長をモニターし、ラットの生存率を記録した。100日目に試験を完了し、まだ生きているラット全てに100日間の生存スコアを与えた。

結果
治験の結果の概要を図12及び図13に示す。ワクチンと組み合わせて幹細胞を与えた群は、腫瘍成長のほぼ完全な減速を示した。ワクチンと組み合わせて幹細胞を与えた群の平均生存時間は、ワクチン単独群及び対照群よりも相当に高かった。

(実施例7)
腫瘍の誘導に先立つ脂肪由来イヌ細胞及びがんワクチンの組み合わせによるラットの処置
材料と方法
脂肪由来細胞の調製
ルーチンの去勢(desex)手順の間に、雌ラブラドールから脂肪組織の10グラム試料を収集した。実施例6に詳述されている通りに脂肪組織を処理して、間質血管画分細胞の懸濁液を産生した。

細胞の増大化
間質血管細胞懸濁液のアリコート(0.5ml)を、DMEMプラス20%ウシ胎仔血清を含有する組織培養フラスコに移し、コンフルエント細胞単層ができるまでCO2インキュベーター内で37℃にてインキュベートした(7〜10日間)。3mlのTrypLE Express(Invitrogen社)により細胞を剥ぎ取り、50ml遠心管へとデカントし、500×gで10分間遠心分離した。この時点で細胞の半分を低温で貯蔵して、最小継代細胞懸濁液を産生した。実施例6に記載されている通り、低温貯蔵バイアルにおいて細胞を凍結した。これらのバイアルをD0とラベルした。

およそ10の累積的細胞倍加に達するまで細胞を継代し続けることにより、残りの細胞をより大規模に培養した。次に、細胞を剥ぎ取り、実施例6に記載されている通り低温貯蔵バイアルにおいて凍結した。これらのバイアルをD4とラベルした。

がんワクチンの投与
本明細書に記載されている通りに、がんワクチンを調製した。簡潔に記述すると、6匹のドナーラット由来の腫瘍を処理することにより、ワクチンを作製した。1%SDS、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.6緩衝液において腫瘍をホモジナイズし、10,000×gで30分間遠心分離して、不溶性物質をペレット化した。可溶性ライセートを収集した。次に、1ml容量のこのライセートを用いて、3匹のラットのためのワクチンを作製した。最終濃度20mMとなるよう0.0057gのTCEPで1mlのライセートを1時間処理した。次に、150μgのビオチン-NHS(Thermo社)を還元ライセートに2時間添加し、続いて150μgの組換えストレプトアビジン(genscript社)を添加した。2時間のインキュベーション後に、一晩-20℃で20mlの冷アセトンにより標識/還元ライセートを沈殿させた。翌日、試料を10,000×gで30分間遠心分離して、試料をペレット化した。アセトンをチップで除き(tipped off)、残渣アセトンを蒸発除去した。次に、ワクチンペレットを600μlの無菌PBSに再懸濁した。投与のための最終ワクチンを作製するために、600μlのフロイント不完全アジュバントを600μlのワクチンに添加し、混合して白色の濃いペーストとした。次に、各ラットの首の後ろにおよそ300μlのワクチンを投与した。

ワクチンを3週間後に再度投与した。更に3匹のラットを対照群として用い、単にフロイント不完全アジュバントをワクチン接種した。

細胞の投与
細胞のバイアルを液体窒素から取り出し、室温で解凍させた。

1群の3匹のラットに、ワクチン接種部位の隣にワクチン接種と同時に300μl(3×10⁶細胞)のD0細胞を与えた。3週間の時点で、第2のワクチン接種と共にD0細胞(3×10⁶細胞)の反復注射を投与した。

第2の群の3匹のラットに、ワクチン接種部位の隣にワクチン接種と同時に300μl(3×10⁶細胞)のD4細胞を与えた。3週間の時点で、第2のワクチン接種と共にD4細胞(3×10⁶細胞)の反復注射を投与した。

腫瘍曝露
最終ワクチン接種後に、D0及びD4ラット並びに対照群のラットを側腹部において9L腫瘍に曝露した。側腹部腫瘍の成長をモニターし、ラットの生存率を記録した。100日目に試験を完了し、まだ生きているラット全てに、100日間の生存スコアを与えた。

結果
治験の結果の概要を図14及び図15に示す。D0群のラット及びD4群のラットは両者共に、対照ラットよりも長く生存した。D4群のラットは、平均してD0群のラットよりも長く生存した。

(実施例8)
脂肪由来イヌ細胞及びがんワクチンの組み合わせによるラットの治療的処置
材料と方法
腫瘍の誘導
3匹のラットの2群を側腹部において9L腫瘍に曝露し、側腹部腫瘍の成長をモニターし、ラットの生存率を記録した。100日目に試験を完了し、まだ生きているラット全てに、100日間の生存スコアを与えた。

ワクチン接種及び細胞の送達
各ラットが、触知できる腫瘍を有したら(5日目)、3匹のラットに、ワクチン(実施例7に詳述されている通りに調製)を投与した。ラットには、ワクチン部位に5×10⁵個のイヌD4細胞と、腫瘍の隣に更に5×10⁵個のイヌD4細胞も与えた。26日目に、ワクチン接種及び細胞投与を反復した。

結果
治験の結果の概要を図16に示す。処置したラットにおける腫瘍サイズは、対照と比較して相当に低下した。

(実施例9)
腺疫ワクチンと組み合わせた脂肪由来ウマ細胞の投与
材料と方法
ウマ脂肪由来細胞の調製
ウマの尾基底からウマ脂肪組織を収集した。実施例6に詳述されている通りに脂肪組織を処理した。細胞を培養して1回継代し、実施例6に詳述されている通りに凍結した。投与直前に細胞を室温で解凍した。

ワクチン接種及び細胞の送達
2頭の4歳の雌ウマに、腺疫のための市販の(Pfizer社)ワクチンを筋肉内注射により投与した。同じ注射部位におよそ2×10⁶個の脂肪由来ウマ細胞を投与した。3週間後にワクチン及び細胞の注射を反復した。

血清学検査
ワクチン接種前、第2のワクチン接種の1週間後に血液を収集した。血清学検査は、IDEX Laboratories社によりELISA検査を用いて行われた。

結果
両方のウマが、ワクチン接種前に、1対200希釈において弱い陽性のベースライン血清学検査結果を示した。

ワクチン接種後に、ワクチン接種のみを与えたウマは、1対400希釈において弱い陽性の僅かに増加した血清学検査結果を示した。ワクチン接種及び脂肪由来細胞を与えたウマは、1対800希釈における中等度陽性まで、血清学検査結果のより大幅な増加を示した。

(実施例10)
ストレプトアビジンに対する抗体応答の増強
ラットの免疫化
実施例6に記載されている通り、ラットをがんワクチンにより免疫化し、腫瘍細胞に曝露した。本実験は、3匹のラットの3群で構成された;対照群、ワクチンを与えた群及びワクチンプラスラット脂肪由来幹細胞を与えた群。実施例6に記載されている通りに、幹細胞を調製及び投与した。

血清の解析
ラットから血清を収集し、ストレプトアビジンに対する抗体に関してELISAにより解析した。ストレプトアビジンは、がんワクチンの成分である。

結果
がんワクチンを与えた両群のラットは、ストレプトアビジンに対する抗体を発生した。がんワクチンプラス幹細胞を与えた群は、単にがんワクチンを与えた群よりも高いレベルのストレプトアビジンに対する抗体応答を示した(図17)。

Claims (24)

1. がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、
   ワクチンが、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含み、
   少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、イオン性界面活性剤、還元剤及び哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露して、前記がん細胞又はがん関連細胞由来の成分を含む可溶化生体試料と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドを産生する工程を含み、
   前記非哺乳類ポリペプチドが、ストレプトアビジンである、方法。
2. 生体試料が、ワクチンを与えるよう企図される対象に由来する、請求項1に記載の方法。
3. イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
4. イオン性界面活性剤がSDSである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
5. 生体試料が、0.5〜1.5%(w/v)の濃度のSDSに曝露される、請求項4に記載の方法。
6. 還元剤が、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエタノールアミン、システイン-HCl、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、トリブチルホスフィン(TBP)及びヨードアセトアミドからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
7. 還元剤が、TCEP又はDTTである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
8. 生体試料が、1mM〜100mMの濃度のTCEP又はDTTに曝露される、請求項7に記載の方法。
9. 哺乳類タンパク質に結合することができる前記非哺乳類ポリペプチドに曝露する前に、前記可溶化生体試料をビオチンに曝露する工程を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
10. 生体試料をアルキル化試薬に曝露する工程を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記可溶化生体試料又は可溶化生体試料の可溶性画分を溶媒沈殿し、続いて得られた沈殿物を適した液体に再懸濁する工程を更に含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
12. 溶媒が極性有機溶媒である、請求項11に記載の方法。
13. 極性有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノール、プロパノール及びジメチルホルムアミドからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
14. 極性有機溶媒がアセトンである、請求項13に記載の方法。
15. がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、
    a)少なくとも1個のがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、適した液体におけるイオン性界面活性剤に曝露して、可溶性物質及び不溶性物質を含む可溶化生体試料を産生する工程と、
    b)可溶化生体試料の可溶性及び不溶性物質を区分化して、可溶性画分及び不溶性画分を産生する工程と、
    c)可溶性画分を還元剤に曝露する工程と、
    d)可溶性画分を、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露する工程であって、前記非哺乳類ポリペプチドがストレプトアビジンである、工程と、
    e)可溶性画分の溶媒沈殿を行う工程と、
    f)沈殿物を適した液体に再懸濁する工程と
    を含み、場合によって、工程d)の前のいずれかの段階において、生体試料又は可溶性画分をビオチンに曝露する工程を更に含む方法。
16. がんの治療又は予防のためのワクチンを産生するための方法であって、
    a)少なくともがん細胞又はがん関連細胞を含む生体試料を、適した液体におけるイオン性界面活性剤及び還元剤に曝露して、可溶性物質及び不溶性物質を含む可溶化生体試料を産生する工程と、
    b)可溶化生体試料の可溶性及び不溶性物質を区分化して、可溶性画分及び不溶性画分を産生する工程と、
    c)可溶性画分を、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドに曝露する工程であって、前記非哺乳類ポリペプチドがストレプトアビジンである、工程と、
    d)可溶性画分の溶媒沈殿を行う工程と、
    e)沈殿物を適した液体に再懸濁する工程と
    を含み、場合によって、工程c)の前のいずれかの段階において、生体試料又は可溶性画分をビオチンに曝露する工程を更に含む方法。
17. 可溶性画分の前記溶媒沈殿を行う前のいずれかの段階において、前記可溶性画分をビオチンに曝露する工程を更に含む、請求項15又は16に記載の方法。
18. 可溶性画分の前記溶媒沈殿を行う前のいずれかの段階において、前記可溶性画分をアルキル化試薬に曝露する工程を更に含む、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
19. 医師若しくは医師の監督下に置かれた人物又はこれらの組み合わせによって行われる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
20. 対象におけるがんの治療又は予防のためのワクチンであって、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化及び還元された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含み、前記非哺乳類ポリペプチドがストレプトアビジンである、ワクチン。
21. 対象におけるがんの治療又は予防のためのワクチンであって、がん細胞又はがん関連細胞の可溶化、還元及びアルキル化された成分と、哺乳類タンパク質に結合することができる非哺乳類ポリペプチドとを含み、前記非哺乳類ポリペプチドがストレプトアビジンである、ワクチン。
22. がん細胞又はがん関連細胞が、前記対象に由来するがん細胞又はがん関連細胞である、請求項20又は21に記載のワクチン。
23. ビオチンを更に含む、請求項20から22のいずれか一項に記載のワクチン。
24. 請求項20から23のいずれか一項に記載のワクチンと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療又は予防のための医薬組成物。