KR20150092122A - 질환 치료용 동종 자가포식소체-강화된 조성물 - Google Patents

질환 치료용 동종 자가포식소체-강화된 조성물 Download PDF

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트래시 힐턴
산드라 웡
데 벤 리에네케 반
크리스토퍼 파우스티안
태르셈 마우드길
크리스토퍼 두배이
크리스토퍼 트위티
홍-밍 후
버나드 에이. 폭스
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프로비던스 헬스 앤드 서비시즈, 오레곤
유비백, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 비-소세포 폐 암종 세포주로부터 유래한, 강화된 집단의 자가포식소체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 강화된 집단의 자가포식소체는 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제; 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함한다. 이러한 방식에서, 기성 백신은 다양한 종양 유형을 앓고 있는 환자에서 표적 면역 반응을 자극하기 위해 투여하는데 이용될 수 있다.

Description

질환 치료용 동종 자가포식소체-강화된 조성물{Allogeneic Autophagosome-enriched composition for the treatment of disease}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 "질환 치료용 자가포식소체-강화된 조성물"을 발명의 명칭으로 하여 2012년 10월 23일자로 출원된 미국 가 특허 출원 번호 제61/717,585에 우선권을 주장하고 있으며, 이의 전문은 본원에 모든 목적을 위해 참고로 인용된다.
본 출원은 자가포식소체-강화된 조성물(autophagosome-enriched composition), 및 자가포식소체(autophagosome)-강화된 제품을 단독으로 또는 상보적인 치료법과 조합하여 투여함으로써 면역 반응을 자극, 강화 또는 용이하게 하는 방법에 관한 것이다.
숙주 전문항원전달세포(professional antigen-presenting cells, pAPC)에 의한 외인성 항원의 교차제시(cross-presentation)는 종양 세포로부터 유래한 자기항원(self-antigen) 또는 자기수식항원(modified self-antigen), 및 감염원으로부터 유래한 외부 항원을 포함하여 종양 관련 항원에 대한 T-세포 면역 반응의 개시 및 발달에 중요한 역할을 수행한다. 유망한 암 백신은 종양에 대해 특정 면역 반응을 이끌어낼 외인성 항원의 교차제시 활용을 시도하면서 개발되었다.
그러나 암 백신을 이용한 특정 활성 예방접종은 동물 모델 또는 임상 시험에서 상당히 효과적이지 않았다(Rosenberg et al., Nat. Med. 10:909-15, 2004.). 암 면역치료법의 성공에 있어서 주요한 문제점은 초기 넓은 확장 및 이후 종양-반응성 독성 T-림프구(cytotoxic T-lymphocytes, CTL)의 지속성을 유도하는데 있어서 백신을 사용할 수 없는 것이다(Rosenberg et al., Nat. Med. 10:909-15, 2004). 현재 이용 가능한 암 면역치료법의 다른 문제는 잠재적 종양 거부 항원이 흑색종을 제외하고는 대부분의 암에 대해 알려져 있지 않으며, 지배적 종양 거부 항원은 종양 또는 환자에 특이적이기 쉽다는 점이다.
앞서, 본 발명자들은 단백질분해효소복합체(proteasome) 억제제로 세포 단백질 분해를 감소 또는 억제하는 것이, 결함이 있는 리보솜 제품(DRiP) 및 단명 단백질(short lived protein: SLiP)뿐만 아니라 이의 면역성 단편의 "수포(bleb)"로의 세포 축적 및 분비를 가져올 수 있다고 판단하였다. 단백질분해효소복합체 억제제-유도된 자가 포식(autophagy)이 자가포식체에서 DRiP 및 SLiP 및 이의 단편을 축적시킬 수 있으며 크로스-프라이밍(cross-priming)을 통해 일예로 항 종양 또는 항-병원체와 같은 강한 면역을 유도한 후, DRibble(드리블)이 종양 또는 병원체 감염된 세포로부터 분비되거나 또는 세포 내에 함유되는 것임이 나타나 있다. 예를 들면, 종양-유래한 드리블, 뿐만 아니라 종양-유래한 드리블로 로딩된 수지상 세포(dendritic cells, DC)와 같은 항원전달세포(APC)는 종양-반응성 세포 독성 T-림프구(CTL) 및 헬퍼 T-림프구(HTL)을, 생존 또는 사멸된 종양 세포로 배양된 항원전달세포보다, 생체 외 및 생체 내에서 보다 효율적으로 활성화 시킬 수 있다. 특정 예에서, 드리블을 분리된 드리블 집단, 드리블을 생산하는 세포 집단, 또는 드리블-로딩된 수지상 세포 등의 대상체에 투여하는 것은 CD4 및 CD8 세포의 생산을 증가시키고 하나 이상의 IL-6, IL-12, 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인 또는 케모카인의 생산을 자극한다.
앞서 본 발명자들은 드리블(DRibble)을 생산하고 분리하는 방법을 개시한 바 있다 (미국공개특허 제2009/0220530호). 본 방법은 드리블을 생산하는데 충분한 환경으로 세포 내 단백질 분해를 실질적으로 억제하는 환경하에 충분한 양의 단백질분해효소복합체 억제제와 표적 세포를 접촉시키는 방법 등의 일예을 포함한다. 일부 예에서, 본 방법은 단백질분해효소복합체 억제제와 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안 또는 접촉시킨 후에 충분한 양의 자가포식 유도체와 표적 세포를 접촉시키는 방법을 추가로 포함한다. 또한, 세포는 단백질의 글리코실화(glycosylation)를 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉할 수 있다. 일예로, 세포는 세포에 의해 드리블의 생산을 촉진하는데 충분한 환경 하에 20 nM 벨카데(Velcade)와 같은 충분한 양의 단백질분해효소복합체 억제제, 라파마이신 또는 HBSS 등의 자가포식 유도제 및 염화암모늄과 접촉한다. 일예로, 상기 조건하에 생산된 드리블은 세포로부터 상기 드리블을 분리시킴으로써 수득한다. 일예의 방법에서, 세포는 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하는데 충분한 환경, 예를 들면 6 내지 24 시간 배양하에 단백질분해효소복합체 억제제를 포함할 수 있는 충분한 양의 조성물과 접촉할 수 있다. 이후 세포는 세포에서 자가포식을 유도하는데 충분한 환경, 예를 들면 자가포식 유도체를 포함하는 6 내지 24시간 배양하에 배양될 수 있다. 생성된 세포 및 드리블은, 세포가 펠렛화되고 드리블이 용액내에 잔류하게 되는 환경하에 원심분리될 수 있다. 이후, 드리블을 함유하는 상층액이 제거되고 드리블을 펠렛화하는데 충분한 환경하에 원심분리될 수 있다.
그러나 본 발명자들은 선행기술에 기재된 드리블의 생산 및 분리 방법이, 강화된 집단의 자가포식소체 및 이의 성분 물질을 생산하고 분리하여 추가로 유효한 백신으로서 활용하는데 불충분할 수 있음을 인식하였다. 본 발명은 유효한 백신을 생산할 수 있는 암 및 암이 아닌 세포주를 모두 포함하는 세포주를 스크리닝하는 신규한 방법을 기재한다. 세포주는 톨(toll)-유사 수용체(TLR) 리간드, 손상-관련 분자성 패턴(DAMP), DRiP, SLiP 외에 분자 샤페론(molecular chaperone) 및 단백질분해효소복합체 억제제 및 염화암모늄과 처리시 기타 종양 항원을 함유할 수 있는 자가포식소체를 생산할 수 있다. 또한, 드리블 내에 함유된 종양 항원의 교차제시는 일반적인 집단의 항원전달세포에 제시된 경우 종양에 대해 유효한 면역 반응을 생산하는데 불충분할 수 있다. 본 발명은 효율적인 면역 반응을 생산하는 CLEC9A를 표현하는 수지상 세포의 특정 부분 집합에 강화된 자가포식소체 조성물을 제공함으로써 강화된 자가포식소체내 함유된 항원의 유효한 교차제시 방법을 기재한다.
본 발명자들은 상기 문제점들을 인식하였고 이러한 문제점들을 적어도 일부라도 해결하기 위한 조성물 및 방법들을 개발하였다. 일예로, 본 발명은 비-소세포 폐 암종 세포주로부터 유래한 강화된 집단의 자가포식소체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 강화된 집단의 자가포식소체는 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제(agonist); 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함한다. 이러한 방식에서, 기성 백신은 다양한 종양 유형을 앓고 있는 환자에서 표적 면역 반응을 촉진하기 위해 투여하는데 이용될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명은 세포주로부터 유래한, 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제(agonist); 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함하는, 강화된 집단의 자가포식소체(enriched population of autophagosome)를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 포유동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이러한 방식에서 기성 백신은 환자 자신의 혈액 세포로부터 유래한 염증 유도 보조제(adjuvant)가 보충되어 다양한 종양 유형을 앓고 있는 환자에 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명은 세포를 단백질분해효소복합체 억제제와 접촉시키는 단계; 세포를 리소좀 억제제와 접촉시키는 단계; 생성된 자가포식소체를 수득하는 단계; 수득된 자가포식소체의 분자 시그니쳐(molecular signature)을 결정하는 단계; 및 하나 이상의 톨-유사 수용체 효능제 및/또는 하나 이상의 분자 샤페론(molecular chaperone)을 수득된 자가포식소체로 전환하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단 상에서 선택적 마커의 발현을 유도할 수 있는 동종 자가포식소체-강화된 조성물(allogeneic autophagosome-enriched composition, AAEC)을 생산하는 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방식에서, 톨-유사 수용체 효능제, 종양 항원, 및 손상-관련 분자성 패턴 분자는, 수많은 암 유형에 대한 특이적 면역 반응을 이끌어내는 능력을 가진 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 패키징(packaging)될 수 있다. 추가로, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 단핵구, 또는 수지상 세포를 배양하면, 생성된 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 BDCA3, 및/또는 CD80의 발현을 유도 또는 상향조절할 수 있고, 추가로, PBMC에 의해 IL-8의 분비 또는 기타 사이토카인을 유도할 수 있다.
도 1은 UbLT3 및 UbLT6 NSCLC 세포주에서 상위 최대 500개의 상향조절(upregulation)된 유전자의 상향조절을 공유하는 다양한 형태의 암 환자의 백분율을 도시한 그래프이다.
도 2A는 항원 GAPDH 및 EEF1A1의 분해에 대한 염화암모늄 보호의 존재를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시하는 디지털 이미지이다.
도 2B는 벨케이드(velcade) 처리된 세포로부터 생성된 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 유비퀴틴화된 단백질(ubiquitinated protein) 및 단명 항원의 비를 증가시키는 것을 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시하는 디지털 이미지이다.
도 3A는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 국립 암 연구소 우선순위 암 항원의 존재를 표로 나타내는 도표이다.
도 3B는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 국립 암 연구소 우선순위 암 항원의 존재를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시하는 디지털 이미지이다.
도 3C는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 국립 암 연구소 우선순위 암 항원의 존재를 표로 나타내는 추가 도표이다.
도 3D는 추가의 항원 및 다수의 제품(lot)에서 시간의 경과에 따른 검출의 일관성을 도시한다.
도 3E는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 함유된 잠재적 비-변이 항원을 요약한 표이다.
도 4A는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 손상-관련 분자성 패턴의 존재를 표로 나타내는 도표이다.
도 4B는 2개의 상이한 세포주로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 다양한 손상-관련 분자성 패턴의 존재를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시하는 디지털 이미지이다.
도 5A는 동종 자가포식소체-강화된 조성물이 높은 수준의 TLR 리간드를 함유함을 나타내는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 5B는 동종 자가포식소체-강화된 조성물이 손상-관련 분자성 패턴을 함유함을 나타내는 데이터를 도시하는 디지털 이미지이다.
도 6은 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 TLR 리간드의 존재를 나타내는 그래프이다.
도 7A는 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 처리한 후 BDCA3+ 세포의 백분율에서 용량 의존성 증가를 나타내는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 7B는 CD14+ 세포 및 BDCA3+ 세포의 유도가 상호관련이 있음을 나타내는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 7C는 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 처리한 후 IL-8 농도의 용량 의존성 증가를 나타내는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 8A는 UbLT3 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 처리한 후 인간 CD14+ 세포 내 BDCA3+ 세포의 백분율의 용량 의존성 증가를 나타내는 데이터를 도시하는 세포계측 플롯(cytometry plot)이다.
도 8B는 동종 자가포식소체-강화된 조성물이 비히클 또는 TLR4 효능제 MPL보다 더 나은 BDCA3+ 세포의 유도제임을 나타내는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 9A는 BDCA3+ 세포의 동종 자가포식소체-강화된 조성물 유도된 상향조절이 TLR 길항제에 의해 억제됨을 나타내는 데이터를 도시하는 세포계측 플롯이다.
도 9B는 TLR9 길항제 및 대조군 ODN의 적정 후 BDCA3+CD14+ 세포의 백분율을 나타내는 2개의 공여자(donor)의 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 9C는 다중 처리 후 공여자 PBMC에서 IL-8의 농도를 나타내는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 9D는 다양한 공-배양 처리된 동종 자가포식소체-강화된 조성물 탐식의 효율성을 암시하는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 9E는 단핵구 상에 CD80의 발현을 상향조절하는 동종 자가포식소체-강화된 조성물이 적어도 부분적으로 TLR9 통로를 통하도록 함을 암시하는 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 10은 다양한 치료에 반응하는 BDCA3+ 세포 유도의 백분율을 도시하는 그래프이다.
도 11A는 상이한 처리에 반응하는 2명의 공여 환자의 세포에서 IL-8의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 11B는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 접촉된 CD14+ 세포의 존재하에 CD4+ 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 11C는 CD4+ 세포 증식의 기능으로서 TNF-α 분비를 도시하는 그래프이다.
도 12A는 치료 후 일부 환자에서 항암 면역 반응을 검출하는 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 면역학적 모니터링 용도를 입증하는 도표이다.
도 12B는 백신 접종 후 환자에서 항암 면역 반응을 검출하는 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 면역학적 모니터링 용도를 입증하는 히스토그램(histogram)이다.
도 12C는 면역 반응의 특이성을 입증하는 히스토그램이다.
도 12D는 pp65에 대한 면역 반응의 특이성을 입증하는 히스토그램이다.
도 13은 동종 자가포식소체-강화된 조성물 처리에 반응하는 다양한 유형의 암 환자의 세포 내 IFN-γ의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 14A-I은 다양한 조합에서 MDA-CD80 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 배양된 공여자 세포로부터 CD80 발현의 LSR 분석을 나타내는 세포계측 플롯이다. 적색의 원은 동종 자가포식소체-강화된 조성물이 막 이동에서 보다 효율적임을 강조하고 있다.
도 15A-E는 엑소좀이 존재 및 부재하는 MDA-CD80 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 다양한 분획으로 배양된 공여자 세포로부터 CD80 발현의 LSR 분석을 나타내는 세포계측 플롯이다. 적색의 원은 엑소좀이 CD80 막 이동에 관여하는 것으로 나타나지 않음을 강조하고 있다.
도 16A-I은 자가포식소체 상에서 CD80이 발현됨을 입증하는 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 아리아 분석을 도시한다.
도 17A는 CD80가 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 다양한 유형의 세포로 이동함을 입증하는 막대 그래프를 도시한다.
도 17B는 CD80 또는 CD40L를 발현하도록 유전적으로 조작된 HEK-293 세포로부터 동종 자가포식소체-강화된 조성물이 또한 막 단백질 이동에 관여할 수 있음을 입증하는 유동 세포 계측법(flow cytometry plot)을 도시한다.
본 발명은 I/II 단계 임상 시험용 2개의 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 종양 세포주로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물(allogeneic Autophagosome-enriched compositions: AAECs)을 기재한다. 이들 세포주는 본원에 UbLT3(비-특이적 조직병리학) 및 UbLT6[선암(adenocarcinoma)-유사]로 언급된다. 흑색종, 전립선 및 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)를 앓고 있는 환자로부터 뮤린(murine) 유방 종양을 치료하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 면역 반응을 촉진하는데 사용되는 이들 조성물의 예를 아래에 제공한다. 또한, 유전자 프로파일링은 NSCLC 세포주 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 다수의 추가의 암에서 발견된 항원을 함유함을 나타내며, 단백질 분석으로 확인되고 있다. 예를 들면, 이들 암은 폐; 난소; 육종; 결장 및 직장 선암; 및 기타 암을 포함할 수 있다. 단일 변종의 세포주-유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 이러한 다양한 유용성에 대한 하나의 장점은 이들이 보다 저렴하게 생산될 수 있으며, 환자 환경에서 사용의 용이성을 증가시키는 다수의 암을 치료하는데 즉시 이용가능할 수 있다는 점이다. 암 백신에 있어서 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 활용성에 관한 실시 예는 기재하고 있지만, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 또한 추가적이고, 비연관된 질환 상태의 치료에서도 사용되어서 염증 반응을 유도하거나, 또는 아래 기재된 바와 같이, 표적화된 방식으로 자가포식소체로부터 수용체 세포 상에 공여자 막 단백질을 이동시킬 수 있다.
앞서, 드리블(DRibble) 백신은 단백질분해효소복합체 및 리소좀 억제제로 치료된 종양 세포로부터 유래할 수 있는 잠재적 암 치료제로서 기재되었다. 본 기재는 동종 자가포식소체-강화된 조성물(allogeneic Autophagosome-enriched composition)을 유도하는 세포주를 선택하는 신규한 방법을 활용하고, 또한 조성물 유도를 단순화하면서 치료의 잠재적 적용을 확대시킨다. 이하, NSCLC 세포주로부터 유래한 자가포식소체-강화된 조성물을 포함하는 예가 제시된다. 본 발명자들은 NSCLC 유래한 자가포식소체-강화된 조성물에서 넓은 다양한 암 유형에서 발견되는 수많은 항원의 존재를 입증하였다. 암 항원 외에, 자가포식소체-강화된 조성물은 손상-관련 분자성 패턴, 분자 샤페론 단백질, 다양한 사이토카인, 및 TLR 효능제를 함유할 수 있다. 자가포식소체-강화된 조성물에 존재할 수 있는 이들 추가적 성분은 항원을 보호하도록 작용하여서 효율적으로 교차제공될 수 있을 뿐만 아니라 항원 제공 세포의 기능적 활성을 증가시키고 환자에서 면역 반응을 촉진할 수 있다. 면역 반응의 효율적인 촉진은 암세포 또는 병원균-감염된 세포에 대한 효율적인 공격을 착수하는데 일조할 수 있다. 또한, 자가포식소체-강화된 조성물의 성분의 상세한 특징은 치료학적 목표에 대한 조성물의 추가 개선 및 표적화를 고려한다.
드리블 백신의 이전 양태들은 환자 유래한 종양 세포, 또는 동일한 유형의 이용가능한 암 세포주로부터 백신의 생산을 구상하였다. 이들 백신은 유도된 암에서 유망한 결과를 생산하였다. 그러나 일부 암 세포 유형은 체외에서 즉시 배양되지 않으며, 기존 방법을 이용하면, 이들 암 유형에 대한 백신의 유도는 어려울 수 있는 것으로 입증한다. 본 기재는 체외에서 배양하는 것으로 알려진 세포 또는 조직 유형을 선택하고 이들 세포 또는 조직 유형으로부터 유래할 수 있는 조성물 또는 제품을 생산하여, 생체검사 환자에서 유래한 세포를 배양할 필요 없이 안정한 조성물을 생산하도록 하는 방법을 기재한다. 일부 실시예에서, 조성물은 추가 항원 및/또는 기타 추가의 면역학적 반응성 분자를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포로부터 유래할 수 있다. 본 발명자들은 본 조성물이 광범위한 암 또는 전염성 질환에 걸쳐 이용가능할 수 있는 기성 백신, 제품, 또는 면역촉진제로서 구현될 수 있음을 인식하였다. 백신에 관하여 기술되었으나, 본 기재는 인간의 질환을 치료하기 위한 방법, 조성물 및 기타 조성물의 적용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 암 유형과 조직학에 대한 잠재적 암 치료제로서의 역할 외에도, 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 전-염증성 특성 및 기타 자가포식소체-강화된 조성물이 본원에 개시된다. 본 발명자들은 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 TLR-리간드, 손상-관련 분자성 패턴, 및 다양한 사이토카인을 포함할 수 있음을 입증하였다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 함유될 수 있는 이들 및 기타 분자들은 항원으로서 직접적인 역할을 하지는 않을 수 있으나, 적절한 항원전달세포에 의한 탐식(uptake)시, 사이토카인 생성 및 면역 반응을 촉진하는 기타 세포 신호를 유도함으로써 전-염증성 목적을 수행할 수 있으며, 선택된 자가포식소체-강화된 조성물이 목적할 수 있는 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
자가포식소체-강화된 조성물 및 이와 관련된 생산 방법 및 특징은 암 및 전염성 질환에 사용된 현재의 백신과 비교하여 상이하다. 예를 들면, 자가포식소체-강화된 조성물은 자가포식소체의 부재하에 교차 제공시 전형적으로 비효율적으로 교차 제공되는 SLiP 및 DRiP 둘 다를 포함할 수 있다. 정상적인 세포 조건에서는, 이들 분자의 교차제시는 비효율적일 수 있는데, 그 이유는 이들 분자가 단백질분해효소복합체 또는 리소좀에 의해 상당히 분해되기 때문이다. 이들 단백질 제품을 자가포식소체로 삽입하는 것은 효율적으로 교차 제공되는 환경을 생성하며, 자가포식소체-강화된 조성물에서 추가적 분자 샤페론 단백질의 존재가 이들 항원을 보존하며, 추가로 교차제시에 대한 효율성을 제공하는 역할을 수행할 수 있다.
또한, 자가포식소체-강화된 백신은 이들이 다양한 종양 관련 항원을 제시하기 때문에 표적화된 면역 반응의 유효한 촉진제가 될 수 있다. 또한, 이들 항원은, 자가포식소체가 HSP-90, HSP-70, 및 항원의 완전성을 보호하도록 역할을 할 수 있는 칼레티쿨린(calreticulin)과 같은 단백질 샤페론(protein chaperone) 분자를 함유하기 때문에 조성물에 독특하게 보존될 수 있다. 또한, 자가포식소체는 손상-관련 분자 패턴(DAMP)을 함유한다. 이들 손상-관련 분자 패턴은 괴사 세포 및 그외 장소에 존재하며, 백신 내에 함유된 천연 보조제로서 역할을 수행할 수 있다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 존재하는 손상-관련 분자 패턴은 HMGB1, S100 단백질, DNA 및 RNA를 포함할 수 있다. 자가포식소체-강화된 조성물은 톨-유사 수용체(TLR) 효능제를 함유할 수 있다. 이들 TLR 효능제는 선천성 면역 반응을 촉진시켜 나이, 암 치료, 또는 진보적인 종양 성장의 효과에 부차적인 감소된 면역 기능을 갖는 환자에게 도움이 될 수 있다.
또한, 동종 자가포식소체-강화된 조성물, 및 자가포식소체-강화된 조성물은 일반적으로 보조제로서 역할을 수행하는 분자 또는 기타와 공-투여하는데 적절한 후보자이다. 일예에서, 백신은 IFN-γ 및 TLR 효능제, 면역 반응을 유도하는 것으로 알려진 분자와 조합하여 수지상 세포에 투여되었다. 이러한 조합은 3LL 폐 암종 및 B16F10 흑생종에 대한 강력한 항-종양 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 백반, CpG, GM-CSF, Flt3L 또는 이의 조합과 같은 비-특이적 보조제는 자가포식소체-강화된 조성물과 조합하여 투여될 수 있다. 특이적 세포 또는 조직 유형에 대해 표적화되는 특이적 보조제 또는 치료제는 상기 세포 또는 조직 집단 내에 면역 반응을 위치시키기 위해서 자가포식소체-강화된 백신과 조합하여 투여될 수 있다.
보조제 또는 관련 화합물과의 공-투여에 추가하여, 백신은 비의존성 치료학적 유용성을 갖는 성분 또는 동종 자가포식소체-강화된 조성물 내에 화학적 성분을 보존할 수 있는 성분을 포함하는 추가의 화합물로 제형화 될 수 있다.
치료 과정은 많은 횟수의 백신 투여를 포함할 수 있다. 각 횟수의 백신 투여는 다양한 보조제 또는 보조제의 조합을 활용할 수 있다. 이러한 과정의 조치는 초기 백신 투여보다 앞서서 결정될 수 있거나, 또는 분자, 세포, 또는 조직적 검정, 이미징 절차 또는 환자 반응을 모니터하기 위한 기타 시험에 의해 평가되어, 백신 및 동봉된 보조제에 대한 환자 반응에 의해 통지될 수 있다. 아래 기재된 하나의 예에서, 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 사용하여 염증성 반응을 촉진하는 BDCA3+(혈액 수지상 세포 (DC) 항원 -3+) 단핵구의 생산을 촉진할 수 있다. 이들 단핵구는 이후 접종 횟수와 조합하여 보조제로서 분리되고 투여될 수 있다.
동종 자가포식소체-강화된 조성물 내로 DRiP 및 SLiP를 축적시키기 위해서, 벨케이드(velcade) 또는 유사 단백질분해효소복합체 억제제가 사용되어 왔으며, 이로써 DRiP 및 SLiP가 단백질분해효소복합체로 분해되는 것을 방지하였다. 또한, 단백질분해효소복합체 억제는 자가포식을 증가시키지만, 본 발명자들은 단백질분해효소복합체 억제가 자가포식을 증가시키는 가장 효율적인 방식이 아닐 수 있는 것으로 판단하였다.
본 기재의 자가포식소체-강화된 조성물은 다중 TLR 효능제 및 다중 종양 항원을 포함한다. 단백질분해효소복합체 억제는 전염성 질환에 대한 반응을 촉진하는데 필요한 항원에 대하여 조성물을 제한할 수 있으며, 막-단백질 이동을 촉진하는데 필요한 단백질에 대하여 조성물을 제한할 수 있다. 따라서, 자가포식소체-강화된 조성물은 당해 분야에 공지된 제제와의 접촉을 통해 생산되어, 염화암모늄, 클로로퀸, 라파마이신 또는 기타 자가포식 촉진제와 같이, 단백질분해효소복합체 억제 없이 자가포식소체를 강화할 수 있다. 자가포식은 또한 아사(starvation)를 통해 세포 또는 조직에 유도될 수 있다.
전문항원전달세포(pAPC)에 의한 항원 교차제시는 종양-관련 항원 또는 전문항원전달세포에 의한 직접적인 제시가 바이러스성 탈출 기작에 의해 전복되는 바이러스성 항원과 같이, 전문항원전달세포에 의해 합성되지 않는 항원에 대한 적응성 면역 반응의 발달에 대한 첫 번째 단계이다. 이러한 예에서, 교차제시에 이용가능한 항원은 사멸 또는 죽어가는 세포로부터 유래된다. 본 발명자들은 이들 항원에 대한 신규한 자가포식-지원 항원 교차제시 경로(AAAXP)를 규명하였다. 이 경로는 교차-제공하는 사멸 세포-관련 항원에서 매우 효율적인 수지상 세포의 부분집합 상에 CLEC9A 수용체를 통한 자가포식소체의 특이적 인식에 의한 항원 교차제시의 효율성을 조절할 수 있다. 본 발명자들은 종양-유래한 자가포식소체를 이용한 예방접종은 종양 문제로부터 이종 보호 및 다수 모델의 확립된 쥐 종양에서 높은 치료학적 효능을 부여하였음을 인식하였다.
동종 자가포식소체-강화된 조성물은 마우스 CLEC9A+PDCA-1dim 수지상 세포(본원에 xDC로서 지칭됨)에 의해 독점적으로 교차-제공될 수 있지만, CLEC9A-CD8α+ cDC 또는 CLEC9A-PDCA-1hi pDC에 의해서는 아니다. 유전자 어레이 분석으로 xDC가 CD8α- cDC 보다 pDC에 더욱 밀접하게 관련되어 있음을 밝혀냈다. 또한, 작용적 xDC는 pDC의 결핍 후 또는 Batf3 결핍성 BM으로 재구성 후에 키메라 마우스의 골수(BM)에서 발견할 수 있다. 그러나 xDC는 IRF8 결핍성 BM과 재구성되었던 키메라 마우스에서 결실된다. 또한, CLEC9A+CD11c- xDC 전구체(전-xDC)는 마우스의 골수와 비장에서 발견될 수 있으며, 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 식균작용시 작용적 교차-제공하는 수지상 세포(xDC)로 분화될 수 있다. 또한, CLEC9A 및 BDCA 발현으로 특징지어지는 인간 등가 마우스 xDC 및 전-xDC는 인간 PBMC 및 G-CSF 결집 혈액(mobilized blood)에서 존재할 수 있다.
실시예 1: 동종 자가포식소체-강화된 조성물 및 상기 조성물을 생산하는 방법
도 1은 UbLT3 및 UbLT6 세포주에서 최대 500개의 상향조절(upregulation)된 유전자들 중에서 이들 유전자 내 상향조절을 갖는 다양한 형태의 암 환자의 백분율을 도시한다. 다음은 괄호 안에 환자의 수를 표시한 암 유형에 관한 데이터이다. 난소암 (232 명), 전립선암 (85 명). 유방암 (451 명), 육종암 (149 명). 폐 편평암(178 명), 대장암 (193 명), 아교 모세포종 (122 명), 선암 (112 명), 신장 유두 (75 명), 자궁 (232 명), 신경 교종 (144 명), 신장 RCC (389 명). 도 1에 도시된 바와 같이, 벨케이드 및 염화암모늄 치료 후 NSCLC 세포주 UbLT3 및 UbLT6 (각각을 정상 폐 RNA와 비교함)의 마이크로어레이 분석에 의해, 이들 세포주에서 상향조절된 다수의 유전자가 암 게놈 아틀라스(the Cancer Genome Atlas: TCGA) 데이터세트에 있는 기타 암에서도 상향조절되는 것을 보여주고 있다. 상당히 상향조절된(SAM 엑셀) 상위 최대 500개 유전자를 TCGA (z 점수 >3)의 마이크로어레이 데이터와 비교하였다. 데이터는 UbLT3 및 UbLT6 처리된 종양 세포가 다양한 병인의 많은 환자의 종양과 공통적으로 적어도 하나의 유전자를 공유함을 보여준다. 특히, 많은 환자의 암은 난소암, 전립선암, 유방암, 육종, 폐 편평 세포 육종, 그리고 결장 및 직장 선암을 가진 환자를 포함하여, 체크된 500개 유전자의 UbLT3 및 UbLT6와 공통적으로 수백 개의 상향조절된 유전자를 갖는다. 마이크로어레이 데이터가 HNSCC에는 이용가능하지 않을지라도, 291 HNSCC 환자에 대한 RNASeq 데이터세트는 분석된 300개의 유전자 중 UbLT3와 비교하여 샘플당 평균 25개의 발현된 공통 유전자 및 UbLT6에 대해 평균 29개의 유전자를 나타낸다.
앞서, 본 발명자들은 드리블로서 공지된 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 변이체를 생산 및 분리하는 방법을 개시하였다 (미국 출원번호 제2009/0220530호). 본 기재의 목적을 위해, 용어 "동종 자가포식소체-강화된 조성물” 또는 “AAEC” 및 “DRibble(드리블)”는 상호교환가능하게 사용될 수 있지만, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 드리블의 특이적 부분집합을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 방법은 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 생산하는데 충분한 환경, 예를 들면, 세포 내 단백질 분해를 실질적으로 억제하는 환경하에 충분한 양의 단백질분해효소복합체 억제제와 표적 세포를 접촉시키는 방법을 포함한다. 일부 예에서, 본 방법은 단백질분해효소복합체 억제제와 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안 또는 접촉시킨 후에 충분한 양의 자가포식 유도체와 표적 세포를 접촉시키는 방법을 추가로 포함한다. 또한, 세포는 단백질의 글리코실화를 감소시키는 하나 이상의 제제와 접촉할 수 있다. 하나의 예에서, 세포는 세포에 의해 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 생산을 촉진하는데 충분한 환경 하에 충분한 양의 단백질분해효소복합체 억제제(예를 들면, 20 nM 벨카데(Velcade)), 자가포식 유도제(예를 들면, 라파마이신 또는 HBSS), 및 염화암모늄과 접촉한다. 일예에서, 상기 조건하에 생산된 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 세포로부터 상기 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 분리시킴으로써 수득한다. 하나의 예시적 방법에서 세포는 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하는데 충분한 환경, 예를 들면 6 내지 24 시간의 배양하에 단백질분해효소복합체 억제제를 포함할 수 있는 충분한 양의 조성물과 접촉할 수 있다. 이후, 세포는 세포에서 자가포식을 유도하는데 충분한 환경, 예를 들면, 자가포식 유도체를 포함하는 6 내지 24시간 배양하에 배양될 수 있다. 일부 실시예에서, 높은 기저 자가포식율을 갖는 세포주를 세포의 지속적인 자가포식을 활용하는데 충분한 조건하에서 배양할 수 있다. 생성된 세포 및 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 세포가 펠렛화되고 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 용액내에 잔류하게 되는 환경하에 원심분리될 수 있다. 이후, 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 함유하는 상층액이 제거되고 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 펠렛화하는데 충분한 환경하에 원심분리될 수 있다. 일부 실시예에서, 세포는 초음파처리되어 자가포식소체의 방출을 촉진할 수 있다. 생성물을 원심분리하여 세포 및 고밀도 세포파편을 제거하여, 투명한 상층액은 용액 속의 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 가진다. 이후, 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 함유한 용액을 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 펠렛화하는 조건하에 원심분리시킬 수 있다. 다음, 펠렛화된 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 세척하고 다운스트림 적용에 적합한 완충액에 현탁시킬 수 있다.
도 2A는 단백질 GAPDH 및 EEF1A1의 분해에 대한 염화암모늄 보호의 존재를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시하는 디지털 이미지이다. 이러한 방식에서, 펩타이드 항원은 분해로부터 보호될 수 있고 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 패키징 될 수 있다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 벨케이트 및 염화암모늄로 세포를 처리하는 것은, 처리 없이 생성된 동종 자가포식소체-강화된 조성물과 비교하여, 처리시 생성된 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 단백질 조성을 변경한다. 벨케이트 및 염화암모늄을 이용한 처리는 유비퀴틴화된 단백질(ubiquitinated protein) 및 단명 항원의 상대적 함량을 증가시켰다. 예를 들면, 처리된 세포로 생성된 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 베타-액틴에 대하여 증가한 비의 유비퀴틴화된 단백질을 갖는다. NPM1, p62, p53, 및 생존 유전자는 모두 비처리된 세포로부터 생산된 동종 자가포식소체-강화된 조성물보다 베타-액틴에 대해 높은 비로 존재한다.
동종 자가포식소체-강화된 조성물은 적어도 6개의 국립 암 연구소(NCI) 우선순위의 암 항원을 함유함에 따라 전도유망한 암치료제로 나타난다. 도 3A는 어피메트릭스(Affymetrix) 인간 유전자 1.0 ST 어레이 상에 수행되었던 정상 폐 RNA와 함께 Velcade 및 염화암모늄로 처리된 UbLT3 및 UbLT6 세포의 유전자 프로파일링을 도시한다. 국립 암 연구소 최고 암 항원 우선순위 리스트와 발현을 비교하였다. 유전자 프로파일링을 각 조건에 대해 3개의 비의존성 RNA 샘플에서 수행하였다. 모든 유전자에 대한 발현의 표준편차는 5% 미만으로 나타난다. 도 3B는 웨스턴 블롯으로 드리블에서 확인되었던 UbLT3 또는 UbLT6 세포에서 유전자 발현과 함께, 6개의 항원(WT1, p53, 서바이빈(Survivin), EphA2, 사이클린(Cyclin) B1, & XAGE1)의 단백질 발현을 도시한다. 도 3C는 UbLT3 및 UbLT6 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 국립 암 연구소 우선순위 항원의 존재의 추가적 확인을 나타낸다. 항원은 WT1, EGFRvIII, HER-2/neu, p53, 서바이빈, EphA2, 사이클린 B1, XAGE 1, 및 PDGFR-β를 포함한다. 도 3D는 웨스턴블롯으로 입증된, UbLT3 및 UbLT6 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 4개의 NSCLC 타겟의 존재를 도시한다. 타겟 단백질은 PKM2, LDHB, EIF4A1, 및 ENO1을 포함한다. UbLT3 및 UbLT6 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 포함되는 항원을 나타내는 요약표가 도 3E에 도시되어 있다.
또한, 손상-관련 분자 패턴은 마이크로어레이 데이터에서 나타난 바와 같이 처리된 UbLT3 및 UbLT6 세포에서, 및 SDS PAGE 겔 전기영동에서 보이는 바와 같이, 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 높게 발현될 수 있다. 손상-관련 분자 패턴은 비-감염성 염증 반응을 통해, 기본적으로 “위험” 신호를 면역 시스템에 보냄으로써 면역 반응을 개시하고 영속할 수 있다. 도 4A 내지 4B는 이들 데이터를 도시한다. 도 4A는 어피메트릭스(Affymetrix) 인간 유전자 1.0 ST 어레이 상에 수행되었던 정상 폐 RNA 및 Velcade 및 염화암모늄로 처리된 UbLT3 및 UbLT6 세포의 유전자 프로파일링을 도시한다. 국립 암 연구소 최고 암 항원 우선순위 리스트와 발현을 비교하였다 (Cheever, et al. Clin Cancer Res. 2009: 5323-5337). 유전자 프로파일링을 각 조건에 대해 3개의 비의존성 RNA 샘플에서 수행하였다. 모든 유전자에 대한 발현의 표준편차는 5% 미만으로 나타난다. 도 10B는 웨스턴 블롯으로 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 확인되었던 UbLT3 또는 UbLT6 세포에서 유전자 발현과 함께, 6개의 항원(WT1, p53, 서바이빈(Survivin), EphA2, Cyclin B1, & XAGE1)의 단백질 발현을 도시한다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 처리시 (예를 들면, 단백질분해효소복합체 억제제 및 염화암모늄으로 처리시), UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 높은 수준의 TLR 리간드 및 손상-관련 분자 패턴을 발현한다. 톨-유사 수용체는 대식세포 및 수지상 세포와 같은 세포의 표면상에 발현된 단백질의 클래스를 포함하고, 세포 스트레스 및/또는 병원체와 연관된 분자를 인식하여 결합할 수 있다. TLR-효능제에 결합시, TLR은 활성화되고, 염증성 사이토카인 및/또는 타입 1 인터페론의 생산을 생성하는 시그날 캐스케이드를 설정한다. 도 5A 및 5B는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 TLR 리간드의 발현에 대한 데이터를 도시한다. 도 5A에서, UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물 내 TLR-2, -4 또는 -9 효능제의 존재 및 효능은 단일 인간 TLR [인비트로겐(Invitrogen)]을 발현하도록 형질도입된 HEK-293 세포를 사용하여 평가하였다. 양성 및 음성(리간드 없음) 대조군과 효능을 비교하였다. 도 5B는 3개의 상이한 배치의 UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 손상-관련 분자 패턴의 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한다.
또한, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 다중 TLR 리간드를 함유할 수 있다. 이들 TLR 리간드는 미생물 항원을 모방하고 선천성 면역 반응을 촉진하여, 환자에게 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 투여시 유익하다. 도 6은 시각-분광기로 HEK-블루 세포에서 다양한 TLR 리간드의 활성에 의한 존재를 도시한다. 단일 인간 TLR로 형질감염된 HEK-블루 세포를 사용하여 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 TLR 효능제를 측정하였다 (인비트로겐). UbLT3 및 UbLT6 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 TLR 2,3,4,7 및 9에 대한 효능제를 함유한다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 50ug/ml로 가하였다. 모든 세포 조사된 종양을 105/ml로 가하였다. 양성 대조군은 다음과 같다: TLR2 (LTA)@500ng/ml, TLR3 (poly (I:C), LMW)@10μg/ml, TLR4 (LPS) @500pg/ml, TLR7 (CL097) @50μg/ml, TLR9 (ODN 2006) @ 10 μg/ml, NULL1 (TNFalpha@1000ng/ml).
본원 및 도 1 내지 6과 관련되어 기재된 데이터는 하나 이상의 조성물, 및 이들 조성물을 생산하는 세포를 스크리닝하는 하나 이상의 방법을 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 조성물은 비-소세포 폐 암종 세포주로부터 유래한, 강화된 집단의 자가포식소체(enriched population of autophagosome)를 포함하는 조성물로서, 여기서, 강화된 집단의 자가포식소체는 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제(agonist); 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함한다. 하나 이상의 톨-유사 수용체 효능제는 톨-유사 수용체 2, 톨-유사 수용체 3, 톨-유사 수용체 4, 톨-유사 수용체 7, 및/또는 톨-유사 수용체 9에 대한 효능제, 또는 이의 조합을 포함한다. 하나 이상의 종양 항원은 WT1, p53, 서바이빈(Survivin), EphA2, 사이클린(Cyclin) B1, 및/또는 XAGE1 또는 이의 조합을 포함한다. 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자는 칼레티쿨린(calreticulin), HMGB1, HSP70, HSP90, 및/또는 Grp94 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 강화된 집단의 자가포식소체는 UbLT3 세포주로부터 유래할 수 있다. 일부 실시예에서, 강화된 집단의 자가포식소체는 UbLT6 세포주로부터 유래할 수 있다. 상기 조성물은 강화된 집단의 자가포식소체를 포함하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키도록 구성된 분자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분자는 폴리이노신:폴리시티딜산(polyinosinic: polycytidylic acid)일 수 있다. 상기 조성물은 비-특이적 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 세포를 단백질분해효소복합체 억제제와 접촉시키는 단계; 세포를 리소좀 억제제와 접촉시키는 단계; 생성된 자가포식소체를 수득하는 단계; 수득된 자가포식소체의 분자 시그니쳐(molecular signature)를 결정하는 단계; 및 하나 이상의 톨-유사 수용체 효능제 및/또는 하나 이상의 분자 샤페론(molecular chaperone)을 자가포식소체로 전환하는 세포를 선택하는 단계를 포함하여, 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단 상에서 선택적 마커의 발현을 유도할 수 있는 동종 자가포식소체-강화된 조성물(allogeneic autophagosome-enriched composition)을 생산하는 세포를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 선택적 마커는 BDCA3이고, 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단은 수지상 세포를 포함할 수 있다. 선택적 마커는 CD80이고, 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단은 단핵구를 포함할 수 있다.
실시예 2: 인간 PBMC에서 전-염증성 BDCA3 발현 단핵구의 유도
제2 실시예는 인간 PBMC 및 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 사용하는 림프절(LN)으로부터의 단일 세포 현탁액에서 BDCA3 발현 단핵구의 증가를 유도할 수 있는 방법을 기재한다.
BDCA3 발현 수지상 세포(DC)는 톨-유사 수용체 3(TLR3)에 의한 자극시, 인터루킨-12(IL-12) 및 인터페론-β, T 헬터 타입 1 (TH1) 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 강화하는 것으로 알려진 사이토카인을 생산한다. BDCA3+ DC는 또한 CD8+ 세포에 대한 교차제시에 매우 중요하다. 이들 활성으로 인하여, BDCA3+ DC는 항-종양 면역 반응을 촉진에 있어서 중요할 수 있다.
상기한 바와 같이, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 프로테오좀 분해의 억제 및 리소좀-매개된 단백질 분해와 결합시 종양 세포에 의해 생산될 수 있고, 다양한 종양 항원 뿐만 아니라 손상-관련 분자 패턴 및 TLR 리간드를 함유할 수 있다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 쥐 CLEC9A+ 교차-제공 수지상 세포에 의해 효율적으로 탐식되고, 확립된 쥐 종양에 대해 치료학적 면역성을 이끌어낼 수 있다. 본 발명자들은 PBMC 및 림프절로부터 단일 세포 현탁액을 사용하여 인간의 골수 세포에 미칠 수 있는 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 상호작용 및 효과를 기재한다.
도 7은 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 혈액 CD14 + BDCA3-단핵구에 의해 효율적으로 탐식되는 예를 도시한다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물과의 상호 작용은 단핵구 상에서 혈액 DC 마커 BDCA3의 용량 의존적 유도를 가져온다. 단핵구 상의 BDCA3의 상향 조절은 올리고데옥시리보뉴클레오티드(ODN) 차단을 사용하는 TLR9 봉쇄에 의해 부분적으로 차단될 수 있다.
임상 샘플에서, GM-CSF 및 CpG의 조합으로 접종된 흑생종 환자는, 이들의 종양-배수 LN 내 증가한 수준의 CD14+BDCA3+ 세포를 나타내었다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물과 유사하게, GM-CSF 및 CpG, 또는 CpG 단독으로의 체외 자극은 단핵구 및 CD11c+CD14- DC 둘 다에서 BDCA3 유도를 이끌었다. 혈액 단핵구 외에도 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 또한 흑색종 환자의 LN 단일 세포 현탁액에 존재하는 CD14+CD11c+ 세포 상에서 BDCA3 발현을 증가시킬 수 있다. 이들 샘플에서, BDCA3 유도는 상층액 중 강화된 수준의 분비된 IL-8과 상호관련되어 있다 (r = 0.76, p<0.01). 사실, PBMC로부터 분류된 동종 자가포식소체-강화된 조성물-유도된 CD14+BDCA3+ 세포는, 동일한 배양 또는 분류된 비히클-처리된 BDCA3- 단핵구로부터의 CD14+BDCA3- 세포와 비교하여 높은 수준의 IL-8을 생산하였다. IL10-유도된 CD14+BDCA3+ 조직 DC가 면역관용성이며, T 세포 반응을 억제하는 것으로 기술되어 있으나, 본 발명자들은 동종 자가포식소체-강화된 조성물-유도된 CD14+BDCA3+ 단핵구가 항-CD3 항체의 차선 투여량의 존재하에 농도 의존적인 방식으로 CD4 및 CD8 T 세포의 증식을 촉진할 수 있음을 발견하였다. 이러한 공-배양에서 CD4 및 CD8 T 세포는 높은 수준의 Th1 사이토카인, IFN γ 및 TNFα를 생산할 수 있으며, 후자는 증식(R = 0.97, p <0.001)과 상관관계를 가지며, 동종 자가포식소체-강화된 조성물-활성화된 단핵구에 대한 가능한 전-염증성 역할을 암시한다.
LN에 존재하는 HLA-DR+ CD11c+ 세포 상에서 BDCA3 발현의 유도, 및 증가한 IL-8 분비는 배양물에 존재하는 CD14+ 세포의 빈도와 상관 관계에 있다. CD14+ 세포는 상이한 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 단핵구이다. BDCA3 발현의 유도와 관련된 증가한 빈도는 BDCA3 발현의 전-염증성 반응을 나타낸다. 도 7A 내지 7C는 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 특이적인 BDCA3의 용량 의존성 유도를 나타내는 데이터를 도시한 것으로, 이러한 유도는 CD14 + 세포 증가와 상관관계(R2= 0.99, p < 0.001)가 있다. 이러한 상관관계는 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 면역 반응의 유도에 유익할 수 있는 CD14+ 세포의 상향조절과 관련될 수 있음을 제안한다. 냉동보관된 흑색종 LN 단일 세포 현탁액을 해동한 다음, X-생체 내 15개의 배지에서 아무것도 없이(Ag 미포함) 공-배양하거나, 헤타 스타치(heta starch) (비히클), 6μg 또는 12μg UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물 (DRB)를 포함하여 20 시간 동안 (48-웰 플레이트에서 1 백만개 세포/ml) 공-배양하였다. FIG. 도 7A 및 7B는 CD11c, CD14, CD1a, HLA-DR, CD11b, CD80, CD86, CD103, BDCA3/CD141 및 CD83를 보는 12개-색상 유동 세포 계측법(flow cytometry)으로 특징화된 수득된 세포를 도시한다. 사멸 세포는 생존/사멸 얼룩에 의해 배제하였으며, 게이트(gate)는 형광 마이너스 원 (Fluorescence Minus One: FMO) 대조군을 기준으로 설정했다. 도 7B는 CD11c+DR+ 세포에서 동종 자가포식소체-강화된 조성물-유도된 BDCA3 발현 및 CD14+ 세포의 빈도 사이의 피어슨(Pearson) 상관관계를 도시한다. 도 7C는 수득하기 전에 제거되는 동일한 실험적 검정 상층액에서의 IL-8의 유도를 도시한다. 분비된 사이토카인은 사이토카인 비드 어레이로 평가되었다.
동종 자가포식소체-강화된 조성물은 CD14+ 인간 단핵구 상에 BDCA3의 발현을 유도할 수 있다. 도 8A 내지 8B는 BDCA3의 발현이 CD 14+ 인간 단핵구 상에 증가함을 나타내는 실험적 데이터를 도시한다. 실험을 위해, 건강한 공여자 PBMC(1 백만/ml)을 헤타 스타치(비히클)로 공-배양하였고, UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물 또는 TLR4 효능제 MPL (500ng/ml)의 농도를 증가시켜 처리하였다. 세포를 20시간 후 유동 세포 계측으로 표현하였다(phenotyped). 도 8A는 하나의 대표적 공여자로부터의 히스토그램 플롯을 도시한다. 음영그래프는 표본-특이적(형광 - 1) FMO 대조군을 도시한다. 오픈 그래프는 HLA-DR+ CD11c+ CD14+ 단핵구 상의 BDCA3-FITC 발현을 도시한다. 도 8B는 75μg 동종 자가포식소체-강화된 조성물 (DRb)를 사용하여, 2개의 건강한 공여자와 함께 3개의 별개의 실험을 나타내는 그래프를 도시한다. *** p<0.0001 튜키(Tukey)의 다중 비교 시험(프리즘: Prism)을 이용하는 일원 변량분석(Anova).
TLR-9 억제는 CD14+ 단핵구 상의 BDCA3 발현의 동종 자가포식소체-강화된 조성물-매개된 유도를 감소시키고 동종 자가포식소체-강화된 조성물-접촉된 PBMC 배양물에서 IL-8 분비를 감소시킨다. TLR-9는 특이적 ODN에 의해 차단될 수 있으며, 이러한 수용체의 차단은, 전반적으로 면역 반응의 활성을 유도하는 TLR-9 발현 세포 내에서 세포내 경로의 활성을 억제한다. 도 9A 내지 9D에 도시된 실험들은 TRL2, TRL4 또는 TRL9 길항제 또는 대조군을 함유하거나 또는 미함유하여 37℃에서 20분 동안 배양한 후, 비히클(vehicle), UbLT3 드리블 (75μg/ml)로 배양된 인간 PBMC(96-웰 플레이트에서 2x105 in 200μl)에서 수행되었다. 도 9A는 최고 농도의 항-TLR(T LR2/4에 대해 7.5μg/ml, TLR9에 대해 13.8μM)를 사용하여, BDCA3 발현(오픈) 및 FMO 대조군(음영)을 나타내는 히스토그램 플롯을 도시한다. 도 9B는 2개의 공여자에 대해 항-TLR9 및 대조군 ODN을 적정한 BDCA3+CD14+ 세포 %를 도시한다. 도 9C는 CBA에 의해 결정되는 PBMC 동종 자가포식소체-강화된 조성물-접촉된 배양물 +/- TLR 길항제에서의 IL-8 분비를 도시한다. 도 9D는 다양한 TLR 길항제에서 배양된 PBMC에 의한 동종 자가포식소체-강화된 조성물 탐식을 도시한다. UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 0.5μM 아득한 적색 지질 염료(far red lipid dye) (3 분 RT)로 로딩한 다음, 세척하고, TLR 길항제로 예비-배양된 2x105 PBMC로 두 시간 동안 공-배양하였다. UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 4℃에서 배양된 PBMC는 활성 탐식에 대한 대조군으로서 사용하였다 (n=1, 복제됨).
도 9E는 3개의 공여자로부터 PBMC에 가해진 UbLT3 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 이들 항원 제공 세포의 성숙과 관련된 공동자극 분자(costimulatory molecule), CD80을 발현하는 단핵구의 퍼센트를 증가시킴을 도시한다. 이러한 효과는 TLR9을 통한 신호차단에 의해 억제될 수 있지만, TLR9의 모의 억제제(mock-inhibitor)를 가함으로써 수행되는 것은 아니다.
도 10은 4개의 건강한 공여자로부터의 PBMC의 CD14+ 단핵구에 대한 다양한 처리에 반응하는 BDCA3+ 세포의 유도를 도시한다. 무자극(no stim), 5μg/ml CpG-A (ODN-2216), 5μg/ml CpG-B (ODN-7909) 또는 CpG- + 1000 IU/ml GM-CSF (CpG + GM)으로 48시간 동안 배양되었던 PBMC(IMDM + 10% FBS 내 48-웰 플레이트에서 5 백만/ml)에서 실험이 수행되었다. CD14+ 단핵구 상의 BDCA3+ 발현은 4개-색상 유동 세포 계측법(VUmc)에 의해 평가되었다.
동종 자가포식소체-강화된 조성물-접촉된 단핵구인 BDCA3- 및 BDCA3+ 둘 다는 높은 수준의 IL-8를 생산하고, 차선적 항-CD3 촉진과 조합하여 T 세포 증식을 촉진한다. T 세포 증식의 자극은 면역 반응의 유도의 표지로서 사용된다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 존재하에 CD4의 증가한 증식은, 표적된 암 항원, 감염, 또는 표적화된 면역 반응이 유익한 기타 질병을 향한 면역 반응을 촉진하기 위해서 조성물을 환자에게 투여할 수 있기 때문에 유익하다. 도 11A 및 11B는 IL-8 및 T-세포 증식의 상향조절을 나타내는 데이터를 도시한다. 실험을 위해서, 2개의 건강한 공여자의 PBMC를, 비히클 또는 75μg/ml UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 20시간 동안 공-배양하였다. CD4+CD25- 및 CD8+ T 세포 및 CD14+ (BDCA3-) 단핵구는 비히클 처리된 샘플로부터 분류하였다. CD14+ BDCA3- 및 CD14+ BDCA3+ 세포는 동종 자가포식소체-강화된 조성물-처리된 샘플로부터 분류하였다. 공여자-1로부터 분류된 CD14+ 세포를 공여자-2로부터 분류된 T 세포로 공-배양시키고, 반대로도 수행하였다. 도 11A는 RPMI+ 10% FBS에서 밤새 배양된 5000 분류된 CD14+ 세포로부터의 IL-8 농도를 도시한다. 상층액을 20시간 후 수득하였다 (샘플당 삼중) (유사한 결과를 갖는 2개의 실험). 도 11B는 분류된 비히클 또는 동종 자가포식소체-강화된 조성물-처리된 CD14+의 존재에서 2μg 플레이트-결합된 OKT3 (항-CD3)으로 촉진된 CD4 T 세포의 증식을 도시한다. 도 11C에서, TNF-α 농도는 3일째 및 5일째 둘 다에서 CD4의 증식과 상관관계에 있다.
UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 인간 흑색종 LN 샘플에서 CD11c+ HLA-DR+ 세포 상에서 BDCA3 발현을 유도하는 것으로 밝혀질 수 있다. 유도의 수준은 이들 샘플에서 CD14+ 세포의 존재와 상관관계에 있다. LN 샘플과 유사하게, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 건강한 공여자 단핵구 상에서 BDCA3 발현을 유도하였다. MPL, TLR4 효능제는 TRL4-비의존성 기작을 제시하면서, 인간인간구 상에 BDCA3 발현을 유도하지 않았다. UbiLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 다양한 TLR을 촉진하는 높은 수준의 리간드를 발현하는 것으로 밝혀질 수 있다. TLR2, TLR4 또는 TLR9 활성의 억제는 동종 자가포식소체-강화된 조성물-유도된 BDCA3 유도에서 TLR9의 기여를 나타내었다 (2개의 공여자에서 관찰됨). 흥미롭게는, CpG 또는 CpG+GM-CSF의 내피 주사로 처리된 흑색종 환자는 이를 감시하는 LN에서 BDCA3+ DC 부분집합의 강화된 빈도를 나타내었다 (제조시 Sluijter et al. 참조). CD14+ 단핵구 상에서 CpG 또는 CpG+GM-CSF 유도된 BDCA3로 체외 촉진한 PBMC에서, 단핵구 상의 TLR9 촉진 및 BDCA3 발현 사이의 연관성을 확인하였다. BDCA3 유도 외에, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 흑색종 LN 및 건강한 공여자 PBMC 배양 내 IL-8의 생산을 유도할 수 있다. 2/2 PBMC 공여자에서, TLR9 억제는 IL-8 생산을 감소시키는 반면, TLR4 억제는 1/2 공여자 (1개가 제외됨)에서 IL-8 수준을 감소시켰다. 분류된 동종 자가포식소체-강화된 조성물-유도된 BDCA3+ 세포는 대조군 단핵구(각각 2개의 공여자로 2개가 제외됨)보다 상당히 높은 수준의 IL-8을 생산시켰다. 비-처리된 단핵구와 대조적으로, 동종 자가포식소체-강화된 조성물-처리된 PBMC로부터 분류된 BDCA3+ 및 BDCA3- 단핵구는 CD4 T 세포 증식(+OKT3) 및 IFN-γ 생산(미도시함)을 촉진할 수 있다. 또한, 동종 자가포식소체-강화된 조성물-유도된 BDCA3+ 단핵구는 CD8 T 세포 증식(미도시함) 및 TNF-α 생산을 촉진시켰다. 이들 데이터는 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 인간 단핵구에서 전-염증성 변화를 유도할 수 있음을 제안하고 있다.
도 12A는 치료 후 일부 환자에서 항암 면역 반응을 검출하는데 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 사용을 치료학적 면역학적 모니터링 용도를 입증하는 도표를 도시하며, 종양-배수 림프절이 암으로 프라이밍된 세포를 함유하고 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 사용하여 검출할 수 있음을 문서화하고 있다. 암 환자로부터 분리된 PBMC는 동종 자가포식소체-강화된 조성물과의 처리 반응에서 IFN-γ의 생산을 검정하는 실험에서 분리되었으며 활용되었다. IFN-γ의 증가한 생산은 IFN-γ이 면역 기능의 중요한 증강제이기 때문에 암 백신의 치료에서 유익할 수 있다. IFN-γ는 자연살해(NK) 세포 활성을 촉진하고, 항원 제시를 증가시키며, 면역 반응을 활성화하는데 중요한 수많은 전사적 변경을 야기한다. HNSCC, 흑색종, 및 전립선암을 앓는 환자는 NSCLC 세포로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 촉진될 때 IFN-γ를 만든다. 도 12A는 HNSCC (n=4), 흑색종 (n=4), 또는 전립선암 (n=4)을 앓는 환자의 PBMC 또는 (림프절) LN으로부터 직접적인 생체 외 IFN-γ 생산을 도시한다. 세포는 5x106/ml에서 5% 인간 알부민을 갖는 완전 배지에 재현탁시키고, UbLT3 또는 UbLT6 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 36 내지 40시간 동안 노출시켰다. 상층액을 사이토카인 비드 어레이(Cytokine Bead Array) (BD Bioscience)로 분석하였다. 유전자 어레이 데이터를 기준으로, 신세포암 환자의 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 음성 대조군으로 사용하였다. 2개의 건강한 공여자의 PBMC를 시험하였으며, 둘 다는 IFN-γ 생산에 부정적이었다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 웨스턴 블롯으로 측정된 바와 같이 MHC 제1 클래스 분자를 포함하지 않는다. 이들 발견으로 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 항암 면역 반응의 개발을 확인하는데 유용하며, 항암 면역의 바이오마커로 유용할 수 있음을 제시하고 있다.
일부 실시예에서, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 NSCLC로부터 유래할 수 있다. 그러나 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 임의의 수 또는 다양한 암 세포 또는 비-암 세포로부터 유래할 수 있다. 이는 다음으로부터 유래한 세포주를 포함한다: 몇 개의 예를 들자면, BRCA-152, MDA-MB-231, MDA-MB-361, 또는 MDA-MB-468와 같은 유방 선암; HCT (116) 또는 T84와 같은 대장암; EL4와 같은 림프종; MEL-30, MEL-68, 및/또는 MEL-40과 같은 흑생종이다. 또한, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 환자 종양으로부터의 유래를 포함하여 동계 조직(syngeneic tissue)으로부터 유래할 수 있다. 상기한 바와 같이, 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 유래하고 투여하는 방법은 암 백신에만 적용될 필요가 있는 것이 아니라 세균, 진균, 바이러스, 또는 원생 동물 항원을 포함하는 자가포식소체 강화된 조성물을 개발하는데 적절할 수 있다.
도 12B는 접종 이후 면역 반응이 개발된 환자를 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 사용하여 검출할 수 있음을 입증하는 검정을 도시한다. 이 검정은 많은 암으로 공유된 넓은 집단의 비공지된 암 항원에 대한 면역 반응을 평가하는 방법을 기재한다. 일부 예에서, 이 검정은 혈액 내 항암 면역 반응을 평가 또는 채점하는데 유용할 수 있다.
도 12C는 접종된 환자에서 면역 반응이 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 사용하여 검출될 수 있음을 추가로 도시한다. 정상 신장으로부터의 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 촉진성은 아니었다.
도 12D는 pp65에 대한 면역 반응의 특이성을 입증하고, CMV에 대한 면역을 갖는 환자에서 pp65 작제를 함유하지 않는 UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물로 교차-반응하지 않음을 입증하는 히스토그램이다. 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 사용하여 접종 후 면역 반응이 발달한 환자에서 면역 반응을 검출하였다. 정상 신장으로부터의 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 촉진성은 아니었다. 면역 반응은 UbiLT3 (LT3.pp65DRb) 드리블(동종 자가포식소체-강화된 조성물s)에서 pp65에 대해 검출되지만, UbLT3 동종 자가포식소체-강화된 조성물s (LT3DRb) 또는 정상 신장 동종 자가포식소체-강화된 조성물s (NK DRb)에서는 검출되지 않는다.
상기한 실험의 데이터는 BDCA3을 발현하는 단핵구가, 환자 분리된 PBMC 뿐만 아니라 LN에서 유도될 수 있음을 나타낸다. 상기한 바와 같이, 이들 세포는 임상 환경에서 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 투여하는데 유익한 전-염증 반응을 가질 수 있다. 이들 세포 및 사이토카인의 존재에 대한 전-염증 반응은 나이 또는 이전 항암 치료에 부차적인 감소된 면역 기능을 갖는 환자에게 면역 시스템의 회복에 일조할 수 있다. 또한, 이러한 전-염증 반응은 특정 암 또는 감염성 제제를 표적할 수 있는 선천성 면역 반응의 빠른 확장을 제안한다. 이러한 반응은 체내에서 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 투여 후 발생할 수 있다(경피 내, 피하, 정맥 내 또는 비강 내 경로를 통함). 또한, 이러한 가능한 전-염증 활성으로 인하여, BDCA3+ DC는 환자 유래한 PBMC로부터 분리될 수 있고 백신용 보조제로서 사용될 수 있다.
본원 및 도 7 내지 12에 관하여 기재된 데이터는 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 방법을 가능하게 할 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명은 세포주로부터 유래한, 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제(agonist); 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함하는, 강화된 집단의 자가포식소체(enriched population of autophagosome)를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 포유동물의 말초 혈액(peripheral blood)으로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계; 분리된 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단을, 강화된 집단의 자가포식소체와 접촉시키는 단계; 및 분리된 말초 혈액 단핵 세포의 접촉된 부분모집단을 다시 포유동물에 주입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단은 전문적 항원 제공 세포 및 비-전문적 항원 제공 세포를 포함할 수 있다. 말초 혈액 단핵 세포는 GM-CSF, Flt3L, 및/또는 CpG의 투여 후 포유동물로부터 분리될 수 있다. 세포주는 CD80을 발현하도록 조작된다. 세포주는 사이토메갈로바이러스 단백질 pp 65를 발현하도록 조작된다. 상기 방법은 하나 이상의 종양 항원에 특이적인 하나 이상의 사이토카인의 분비를 감지함으로써 강화된 집단의 자가포식소체에 포함된 하나 이상의 종양 항원에 대한 특이적 면역 반응의 유도를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특이적 면역 반응의 유도를 스크리닝하는 단계는 ELISA, ELISPOT, 및/또는 세포내 염색 검정을 포함할 수 있다.
실시예 3: 비-소 폐암 세포주로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 이용한 추가적 암 치료.
다른 예에서, 실시예 1에 상기된 바와 유사한 방법은, 백신이 면역 촉진 인자 뿐만 아니라 다수의 공지된 암 항원을 함유할 수 있기 때문에 추가적인 암에 대해 가능한 치료제로서 세포주로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물을 활용한다.
본원에 기재된 바와 같이, 종양-유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 관련 암 항원 및 손상-관련 분자 패턴을 포함하는 복합 단백질 혼합물을 격리시킬 수 있다. 전임상 연구에서, 고유 지배적 종양 항원의 특이성이 단지 동족 종양에 대해서 보호하는 잘-정의된 MCA 육종 모델을 이용하여, 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 전체 종양 세포 백신이 하지 못했던 동계 종양에 대한 교차-보호를 제공할 수 있음을 나타내어 진다 (Twitty, et al.Clin Cancer Res. 2011:6467-6481). 또한, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 유래할 수 있는 온전한 종양과는 달리, 심지어 동종 종양 세포로부터 유래시에도 확립된 쥐 유방 종양에 대한 치료학적 면역성을 제공할 수 있다. 이는 단일 NSCLC 종양 세포주가 다양한 세트의 NSCLC 조직학 및 가능하게는 기타 암 유형에 대한 백신으로서 사용될 수 있음을 제안한다. 본 발명자들은 I/II 단계 임상 시험에 있는 2개의 NSCLC 종양 세포주, UbLT3 and UbLT6로부터 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 생산하였다. 상이한 유전자 발현 프로파일(19935 유전자 중 8213개가 2개의 세포주 사이에서 상이하게 발현된다)에도 불구하고, 본 발명자들은 UbLT3 및 UbLT6이 기타 암 유형에서 발견된 공통의 상향조절된 유전자를 공유함을 기재하고 있다.
보르테조밉(bortezomib) 및 염화암모늄로의 치료 전 후 UbLT3 및 UbLT6 종양 세포(드리블 백신 생산에 중요한 2개의 단백질 저하 억제제)의 마이크로어레이 분석을, 정상 폐 조직과 비교하여 수행하였다. 암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터세트에 대한 비교는 백신 세포주에서 상향조절된 다수의 유전자가 기타 암에서 상향조절됨을 나타내었다 (도 8). 또한, 웨스턴 블롯 분석은 국립 암 연구소 (NCI)의 우선순위의 암 항원 리스트 (Cheever, et al. Clin Cancer Res. 2009:5323-5337) 에서 적어도 6개의 암 항원이 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 함유될 수 있음을 도시한다 (도 3A 내지 3E). 일부 암에 대한 TCGA 데이터가 UbLT3 및 UbLT6 (HNSCC)과 상향조절된 유전자의 유사한 프로파일을 나타내는 반면, 기타 데이터는 유전자 발현에서 몇 가지 일반적인 변화를 갖는다. 따라서, NSCLC 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 기타 암 유형을 갖는 환자를 위해 좋은 백신으로서 역할을 수행할 수 있다. 관련 암 항원을 발현하는 것 외에도, 마이크로어레이 데이터는 일부 손상-관련 분자 패턴이 상향조절됨을 나타낸다 (도 4A). 웨스턴 블롯은 칼레티쿨린(calreticulin), HMGB1, HSP70, HSP90, 및 Grp94를 포함하는 손상-관련 분자 패턴이 UbLT3 및 UbLT6 드리블 백신에 존재함을 나타낸다 (도 4B).
마우스에서, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 동계 MCA 육종 집단에 대해 교차 보호를 제공할 수 있는 반면 조사된 세포 백신은 비효과적이었음을 나타내는 것으로 50년의 인식체계를 깨고 있다. 또한, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 동종 유방 종양 모델 내 전체 세포 백신과 비교하여 보호를 제공할 수 있다. 넓은 범위의 다양한 암을 치료하는데 있어서 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 사용은 다수의 현재 이용가능한 항암 치료제의 일부 부정적인 부작용을 경감시킬 뿐만 아니라 임상학적 결과의 관점에서 유익할 수 있다는 제시에 대한 증거가 존재한다. 인간 세포주를 활용하는 실험들은 이러한 목표를 지지하도록 수행되었다. NSCLC 종양 세포주, UbLT3 및 UbLT6는 다수의 기타 암 유형으로 발현된 유전자를 넘어 공통점을 공유한다. 이들 세포주, UbLT3 및 UbLT6는 국립 암 연구소의 암 항원의 상부리스트 및 다수의 손상-관련 분자 패턴을 인코딩하는 유전자상에 나열되는 발현된 유전자 이상이다. 이들 세포주 및 본원에 기재된 방법을 활용하여, 자가포식소체-강화된 백신을 생성할 수 있다. UbLT3 및 UbLT6로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 국립 암 연구소의 암 항원의 상부 리스트 및 적어도 5개의 손상-관련 분자 패턴에 나열된 적어도 6개 암 항원을 발현하고 5개의 TLR 수용체를 촉진할 수 있다. 생성된 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 두경부 편평 세포 암종(HNSCC), 흑색종, 및 전립선암을 앓고 있는 환자로부터 림프절 (LN) 또는 PBMC 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 IFN-γ 생산을 촉진할 수 있으며, NSCLC 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 다양한 세트의 암에서 IFN-γ 반응을 촉진할 수 있으며, 이들 및 기타 유형의 암 환자에 대한 유망한 치료제로서 제시됨을 제안하고 있다.
5 내지 9개의 확립된 종양 모델에서 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 치료학적 잠재력을 시험하기 위해서, 3개의 유방 종양 세포주를 3개의 상이한 H2 배경((H2b, H2d 및 H2q)에서 활용하여 크리스-크로스 실험 설계에서 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 치료학적 잠재력을 시험하였다. 조사된 “동종” 또는 “동계” 종양으로의 전체 세포 접종은, BALB/c, FVB/n 또는 C57BL/6 마우스 각각에서 5일, 9일, 또는 7일째 확립된 4T1, FAT 또는 C57MG 종양에 대해 상당한 치료학적 효능을 제공하는데 실패하였다 (9개의 비의존적 실험 데이터). 대조적으로, 동계 자가포식소체-강화된 조성물 또는 두 개의 동종 자가포식소체-강화된 조성물 중의 하나로의 면역치료는 연구된 모든 조합((p<0.05 n=15-65/그룹)에서 치료학적 효과를 제공할 수 있다. 도 13은 이러한 연구의 데이터를 도시하는 것으로, 흰색 박스는 보호가 없는 무 보호(no protection)이며, “X”는 수행되지 않았고, 음영 박스는 상당한 보호가 있음을 나타낸다. 이들 데이터는 동종 자가포식소체 강화된 조성물을 포함하는 면역치료가 상이한 암 집단에 대해 치료학적 영향을 제공할 수 있다는 개념을 강하게 뒷받침한다. 구체적으로, 인간 암에 대한 이러한 전략의 사용을 지지하는 것으로, 항암 면역 반응의 부재가 좋지 않은 결과와 연관된다는 강력한 증거로 존재한다(Friedman et al., Nature Reviews Cancer 2012).
실시예 4: 자가포식소체-강화된 조성물은 막 단백질 이동에서 유용할 수 있다.
다른 예에서, 본 발명자들은 자가포식소체-강화된 조성물이, "트로고시토시스(trogocytosis)"로서 공지된 세포 현상과 유사하게, 막 단백질 이동에서 유용할 수 있음을 나타내고 있다. 트로고시토시스는 수용 세포가 공여자 세포로부터 플라스마 막의 단편 및 표면 분자를 수득하는 과정이다. 본 발명자들은 또한, UbLT3 및 UbLT6 세포주에 의해 발현된 막관통 단백질이 이들 세포주로부터 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 사용하는 트로고시토시스-유사 과정에서 림프구 및 단핵구로 효율적으로 이동될 수 있음을 밝혀냈다. 예를 들면, 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 상기한 방법을 통해 MDA-CD80, UbLT3-CD80, 및/또는 HEK293 세포로부터 제조될 수 있다. CD80 또는 기타 표면 마커를 발현할 수 있는 이들 MDA-CD80, UbLT3-CD80, 또는 HEK293 유래한 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 종양 세포 또는 PBMC와 조합시, 막 단백질 이동이 발생할 수 있다. 도 14A 내지 14I는 이러한 막 단백질, 이 경우, CD-80의 이동을 입증한다. 또한, 도 14A, 14D, 및 14H는 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 함유하지 않는 치료보다 CD-80의 이동을 보다 즉시 유도할 수 있음을 입증한다. CD80 네거티브 백혈구의 플라즈마 막으로의 CD80의 이동은 유동 세포 계측법에 의해 검출되었다. 도 15A 내지 15E는 이러한 이동이 동종 자가포식소체-강화된 조성물에 특이적일 수 있으며, 엑소좀의 존재에서만 덜 효과적임을 입증한다. 또한, 도 16A 내지 16I는 MDA-CD80 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 발현된 대부분의 CD80이 자가포식소체-특이적 마커 LC3의 발현과 상응함을 나타낸다.
도 17A는 CD-80이 동종 자가포식소체-강화된 조성물에서 PBMCS로 이동될 수 있음을 나타내는 이들 발견의 일부를 요약하고 있다. 이동이 CD4+ cells 및 단핵구에 대해 가장 효과적인 반면, CD80은 또한, 대조군 실험보다 상당히 보다 효과적으로 CD8+ 세포 및 B 세포로 이동할 수 있다. 또한, 도 17B는 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 통한 분자적 이동이 MDA-CD80 종양 세포주에 고유하지 않으며, CD80 발현에 특이적인 분자적 이동이 아님을 입증한다. HEK-293 세포는 CD80 또는 CD40L 중의 하나를 발현하도록 일시적으로 형질감염되었다. 이후, 생성된 유전적으로 조작된 세포는 본원에 기재된 동종 자가포식소체-강화된 조성물를 생산하는데 사용되었다. 도 17에 도시된 바와 같이, HEK-293-CD80 동종 자가포식소체-강화된 조성물 및 HEK-293-CD40L 동종 자가포식소체-강화된 조성물 둘 다는 발현된 분자를 관련 PBMC로 효율적으로 이동시킬 수 있다.
이러한 데이터는 동종 자가포식소체-강화된 조성물가 막 단백질의 이동에 효율적임을 제시한다. 이는 유전자 요법 또는 전체 세포 치료를 요구하지 않고 조성물 수신자에서 막 단백질 발현의 유도를 허용하면서, 수용체 세포 상에서 면역조절하는 분자의 발현을 가능하게 하도록 사용될 수 있는 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 현상을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 데이터는 트로고시토시스-유사 현상이 자가포식소체-강화된 조성물 내에 함유된 자가포식소체으로부터의 단백질을 포함하며, 자가포식소체-강화된 조성물이 사이토킨, 항원, 또는 손상-관련 분자 패턴S의 단순한 방출을 넘어서 면역 반응을 자극하는 역할을 수행할 수 있는 것으로 제안할 수 있다. 또한, 상기 데이터는 세포가 효과적인 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 생산이 가능하도록 유전적으로 조작될 수 있음을 나타낸다. 이는 특이적 암 또는 감염성 질환을 표적하는 잠재적인 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 토대를 확대할 수 있다. 본원에 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, CD80을 포함하는 동종 자가포식소체-강화된 조성물은 CD80을 전문적인 및 비-전문적인 항원전달세포 둘 다로 이동시킬 수 있으며, 항암 면역을 기본으로 하여 상승시키는 능력을 증가시킬 수 있다. CD80 외에, CD86, CD40, CD40L와 같은 기타 분자, 및 기타 적절한 분자가 항원 제공 세포로 이동을 위해 동종 자가포식소체-강화된 조성물 내로 조작될 수 있다.
자가포식소체-강화된 조성물이 표적 질환을 향한 면역반응을 유도할 수 있는 다측면 특성은 암 보다 넓은 범위의 질환을 치료하는데 적절한 조성물들을 제조할 수 있다. 자가포식소체-강화된 조성물은 바이러스, 원생동물, 또는 바이러스 감염, 예를 들면, PRRSV (Porcine Reproductive Respiratory Syncitial Virus) 및 말라리아의 치료에 유용할 수 있다. 또한, 이러한 자가포식소체-강화된 조성물은 접종 이상의 활용성을 가질 수 있다. 본 발명자들은 자가포식소체-강화된 조성물이 기타 세포에서 자가포식소체에 함유된 막 단백질을 토로고시토시스 작용할 수 있음을 제안하는 데이터를 기재한다. 막 단백질, 예를 들면, 특정 세포 마커를 종양 세포, 또는 기타 세포, 추가로 표적 특이적 세포로 삽입하는 이러한 특성을 이용하는 것이 가능해질 수 있다.
추가의 세포주가 동종 자가포식소체-강화된 조성물의 생산에 사용됨에 따라, 유래한 백신은 상기한 바와 같은 유사한 유전학 및 단백질 유전 정보학 분석에 수행될 수 있다. 상기 분석은 각각의 백신 로트에 대한 프로파일을 결정할 수 있으며, 상기 프로파일은 공지된 종양 세포주(예를 들면, 도 7에 도시된 UbLT3 및 UbLT6 대한)의 프로파일을 따라 비교하여 어떠한 종양 유형이 각각의 백신 로트에 반응할 수 있는지를 결정할 수 있다. 이들 다양한 백신 로트는 원생동물, 바이러스, 또는 박테리아 감염에 반응할 뿐만 아니라 암 세포주로부터 유래할 수 있다.
본 발명이 특정 실시예를 포함할지라도, 다수의 변화가 가능하기 때문에 특정 실시예가 본 발명을 제한하는 의도로 간주되어서는 안 된다. 본 기재의 주제는 명세서에 개시된 다양한 요소, 특징, 기능 및/또는 특성의 모든 신규하고 비자명한 조합 및 하위 조합을 포함한다. 다음 특허청구범위는 특히 신규하고 비자명한 것으로 간주되는 특정 조합 및 하위조합을 지적하고 있다. 이러한 특허청구범위는 "하나의" 요소 또는 "제1" 요소 또는 이의 등가물을 지칭할 수 있다. 이러한 청구범위는 두 개 이상의 이러한 요소를 필수적으로 또는 배제하는 것 없이 하나 이상의 이러한 요소의 삽입을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 특징, 기능, 요소, 및/또는 특성의 기타 조합 및 하위 조합은 본 특허 청구 범위의 보정 또는 본 출원 또는 관련 출원의 신규 청구항의 제시를 통해 청구될 수 있다. 또한, 이러한 특허청구범위는 본래의 청구범위보다 넓거나 좁거나, 동일하거나 또는 상이할지라도 본 기재의 주제 내에 포함되는 것으로 간주된다.

Claims (20)

  1. 비-소세포 폐 암종 세포주로부터 유래한, 강화된 집단의 자가포식소체(enriched population of autophagosome)를 포함하는 조성물로서,
    상기 강화된 집단의 자가포식소체는 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제(agonist); 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 톨-유사 수용체 효능제는 톨-유사 수용체 2, 톨-유사 수용체 3, 톨-유사 수용체 4, 톨-유사 수용체 7, 및/또는 톨-유사 수용체 9에 대한 효능제, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 종양 항원은 WT1, p53, 서바이빈(Survivin), EphA2, 사이클린(Cyclin) B1, 및/또는 XAGE1 또는 이의 조합을 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자는 칼레티쿨린(calreticulin), HMGB1, HSP70, HSP90, 및/또는 Grp94 또는 이의 조합을 포함하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 비-소세포 폐 암종 세포주는 UbLT3 세포주인 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 비-소세포 폐 암종 세포주는 UbLT6 세포주인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 강화된 집단의 자가포식소체를 포함하는 하나 이상의 종양 항원에 대한 면역 반응을 증대시키도록 구성된 분자를 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 분자는 폴리이노신:폴리시티딜산(polyinosinic: polycytidylic acid)인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 비-특이적 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 비-특이적 보조제는 IFN-γ인 조성물.
  11. 세포주로부터 유래한, 하나 이상의 톨(toll)-유사 수용체 효능제(agonist); 하나 이상의 종양 항원; 및 하나 이상의 손상-관련 분자성 패턴 분자를 포함하는, 강화된 집단의 자가포식소체(enriched population of autophagosome)를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 포유동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 포유동물의 말초 혈액(peripheral blood)으로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계;
    분리된 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단을, 강화된 집단의 자가포식소체와 접촉시키는 단계; 및
    분리된 말초 혈액 단핵 세포의 접촉된 부분모집단을 다시 포유동물에 주입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분리된 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단은 전문항원전달세포(professional antigen presenting cell) 및 비-전문항원전달세포를 포함하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포는 GM-CSF, Flt3L, 및/또는 CpG를 투여한 후 포유동물로부터 분리되는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 세포주는 CD80을 발현하도록 조작되는 방법
  16. 제11항에 있어서, 세포주는 사이토메갈로스 단백질 pp65를 발현하도록 조작되는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 하나 이상의 종양 항원에 특이적인 하나 이상의 사이토카인의 분비를 감지함으로써 강화된 집단의 자가포식소체에 포함된 상기 하나 이상의 종양 항원에 대한 특이적 면역 반응의 유도를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 세포를 단백질분해효소복합체 억제제와 접촉시키는 단계;
    세포를 리소좀 억제제와 접촉시키는 단계;
    생성된 자가포식소체를 수득하는 단계;
    상기 수득된 자가포식소체의 분자 시그니쳐(molecular signature)을 결정하는 단계; 및
    하나 이상의 톨-유사 수용체 효능제 및/또는 하나 이상의 분자 샤페론(molecular chaperone)을 상기 수득된 자가포식소체로 전환하는 세포를 선택하는 단계를 포함하여,
    말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단 상에서 선택적 마커의 발현을 유도할 수 있는 동종 자가포식소체-강화된 조성물(allogeneic autophagosome-enriched composition)을 생산하는 세포를 스크리닝하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 선택적 마커는 BDCA3이고, 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단은 수지상 세포를 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 선택적 마커는 CD80이고, 말초 혈액 단핵 세포의 부분모집단은 단핵구를 포함하는 방법.
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