CN109891238A - 免疫治疗剂的剂量确定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定施用免疫治疗化合物的合适剂量的方法，在相同剂量下所述免疫治疗化合物的有效性和毒性可在个体之间存在差别，这是由于个体对象内的天然差异，例如免疫系统响应于施用这种免疫治疗化合物的反应的差异。

Description

免疫治疗剂的剂量确定
技术领域
本发明涉及用于确定免疫治疗化合物的合适剂量的方法，在相同剂量下所述免疫治疗化合物的有效性和毒性可在个体之间存在显著差别，这是由于个体对象内的天然差异，例如免疫系统响应于施用这种免疫治疗化合物的反应的差。
背景技术
通常，治疗化合物的治疗有效剂量很容易确定。为了确定治疗化合物(例如抗生素或镇痛药)的有效量，将增加量的治疗化合物给予一组对象直至观察到所需的治疗效果，预期剂量越大，则治疗效果越好。然而，限制可给予的治疗化合物剂量的一个因素是在施用更高量但仍是治疗量的化合物时所观察到的不希望的副作用的出现。通过简单地给予越来越大量的化合物直至观察到副作用，例如发烧、恶心或诸如器官衰竭、休克等更严重的影响，也可以容易地确定这样的量或毒性剂量。由于这样的治疗有效和毒性的剂量通常以每千克体重为基础确定，或针对相对于个体的某些其他变量进行归一化，因此对于任何患者，既有效且无毒的治疗化合物的剂量很容易外推。
然而，存在这样的情况：使用标准方法无法确定对所有个体的有效治疗和/或毒性剂量和/或它们的外推，例如在治疗剂不满足所施用的量越大所观察到的治疗效果越大的预期的情况下。本发明人观察到，在施用作为Toll样受体激动剂的免疫治疗剂的情况下，向不同个体施用相同剂量导致不同的结果，例如，不同水平的治疗效果和/或不同水平的副作用。本发明人还观察到，从不同个体分离的细胞，在通过细胞因子表达所测量的细胞活化方面，对相同量的免疫治疗剂的响应不同。本发明部分基于这些观察结果，这些结果表明免疫治疗剂的免疫反应在个体免疫系统中天然差异，以使得对于所有个体没有保证对特定免疫治疗剂具有可接受治疗效果，并且优选提供可接受的毒性谱的基于每单位基础(例如，重量、表面积)的通用剂量。
发明概述
本发明涉及用于确定免疫治疗剂的合适剂量的方法，所述免疫治疗剂的量优选对于该个体是治疗性且无毒的。不希望受限于特定机制，认为为了提供治疗效果，免疫治疗剂(例如基于RNA的分子)依赖于许多天然因子，这些因子的活性和量在个体之间存在差别，因此导致当相同药剂以相同剂量施用时，在不同个体中观察到不同的效果(治疗性的和不需要的)。
特别地，本发明涉及确定用于向个体施用的免疫治疗剂的合适剂量的方法，其包括：(a)分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触，以及(b)测量由多种不同剂量的免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应。在一个实施方案中，步骤(b)的特征在于，定性和/或定量测量至少一种免疫反应，优选定量测量至少一种免疫反应。用于本发明方法的剂量是免疫治疗剂的量。在其他单位系统中，剂量例如可以是以皮克、纳克、微克、毫克和克或其等同物的量。剂量或量可以是绝对量，即剂量不随个体的年龄、性别、体重，反映脂肪组织的量的体重指数、皮肤的表面积等而变化。或者，剂量可以考虑个体之间的差异，例如年龄、性别、体重、反映脂肪组织的量的体重指数、皮肤的表面积等。多种不同剂量代表不同量的单独剂量，优选地，不同的量以相同的方式定量(以相同的单位表示)，例如，所有的多种不同剂量以mg/kg体重为单位或者都是绝对量。在接触多种不同剂量的步骤在体外进行的实施方案中，剂量可以是绝对量或可以考虑免疫反应性物质的类型，例如，在免疫反应性物质包含免疫细胞的情况下，剂量可以考虑免疫细胞的数量或免疫细胞的亚型的数量。
出于本发明的目的，可以使用本领域已知的用于使免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触或用于测量免疫反应的任何方法。示例性实施方案包括其中免疫反应性物质是包含从个体分离的免疫细胞(例如从个体分离的全血或经纯化的免疫细胞群)的细胞组合物。在向个体施用多种不同剂量的免疫治疗剂的实施方案中，免疫反应性物质是免疫系统本身，并且测量了由个体体内的免疫细胞产生的免疫反应。例如，在施用免疫治疗剂之后，可以从个体中分离血液或淋巴，并测试所需的免疫反应，例如细胞因子的表达。在向个体施用免疫治疗剂的一个实施方案中，这种施用可以在皮肤上进行，即皮肤划痕或皮肤点刺测试。
在一个实施方案中，该方法在体内进行或在体外进行，或者至少一个步骤在体内进行，其他步骤在体外进行，例如，接触步骤在体内进行，通过例如从个体收集血液并测量血液中或从血液中分离的细胞中的免疫反应来测量免疫应答在体外进行。优选地，该方法中的所有步骤均在体外进行。
可用于本发明方法的免疫治疗剂是可以改变动物，优选人的免疫系统的至少一种组分的任何药剂、分子、化合物，组合物等。例如，免疫治疗剂可以活化特定类型的免疫细胞或可以使特定类型的免疫细胞静止，所述免疫细胞的活化或静止可以通过例如细胞因子表达的变化来测量。对免疫系统的至少一种组分的另一些作用可包括使免疫细胞增殖或分化，例如使血液中免疫细胞数量增加或减少。此外，免疫治疗剂可以诱导抗体的产生或者可以活化免疫细胞(例如细胞毒性T细胞)以诱导细胞毒性作用。尽管细胞因子表达的变化在如下所述的本发明方法的背景下可用作免疫反应，但在一个实施方案中，鉴于细胞因子产生免疫系统变化(引起免疫反应)的能力，其也可以是免疫治疗剂。以下讨论了可用于本发明方法的示例性免疫反应。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是这样的化合物，其是Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)激动剂，例如TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11、TLR12或TLR13激动剂。优选地，TLR是位于细胞内的TLR，例如TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9。还优选地，免疫治疗剂是Toll样受体-7(TLR-7)或Toll样受体-8(TLR-8)激动剂。TLR-7激动剂是已知的并且包括以下的化合物：例如单链RNA分子和咪唑并喹啉化合物(例如噻唑并喹诺酮)、抗病毒化合物咪喹莫特(imiquimod)和瑞喹莫德(resiquimod)。另一些TLR-7激动剂化合物包括N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H)-吡喃-4-基)乙酰胺、N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺、N-(4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺、聚(d胸苷)、鸟苷类似物洛索立宾(loxoribine)和溴匹立明(bropirimine)，以及其他核苷酸-碱基类似物。TLR-8激动剂还包括单链RNA分子以及2-乙基-1-(4-((2-甲基四氢呋喃-3-基)氨基)丁基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺和1-(4-(环己基氨基)丁基)-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。已经观察到，包含鱼精蛋白和RNA的颗粒在被例如浆细胞样树突细胞摄取时可以激活TLR-7，或在被例如单核细胞摄取时可以激活TLR-8(WO 2009/144230)。在一个实施方案中，免疫治疗剂可以是病毒，例如RNA病毒。免疫治疗剂优选地可以是核酸分子，例如单链RNA分子或其他基于RNA的分子，该核酸分子编码免疫反应性肽或蛋白质。更优选地，测量其免疫反应的免疫治疗剂是编码一种或更多种肽的单链RNA分子，每种肽包含在病变细胞或组织(例如肿瘤组织)上特异性表达的表位。来自RNA的这些肽(免疫反应性肽)的表达导致它们在与MHC分子的复合体中在细胞表面上呈递，并最终诱导针对表达表位的病变细胞或组织的免疫应答。在一个优选的实施方案中，RNA分子可以与阳离子脂质、阳离子聚合物和具有正电荷可以与带负电的核酸形成复合体的其他物质络合。以下描述了另外的示例性免疫治疗剂。
如本文所用，可用于本发明方法的免疫反应性物质包含当与免疫治疗剂接触时，可以测量某些特征的变化(免疫反应)的个体免疫系统的全部或部分。优选地，免疫反应性物质包含免疫系统的细胞，例如免疫细胞或免疫反应性细胞或包含免疫细胞或免疫反应性细胞的组合物，例如全血或淋巴液。免疫细胞也可以是基本上纯化的，例如纯度为80％、85％、90％、95％、99％。术语“免疫细胞”是指参与保护个体身体的免疫系统的细胞。术语“免疫细胞”包括特定类型的免疫细胞及其前体，包括白细胞(包括巨噬细胞)、单核细胞(巨噬细胞的前体)、粒细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、树突细胞、肥大细胞，和淋巴细胞(例如B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞)。巨噬细胞、单核细胞(巨噬细胞的前体)、嗜中性粒细胞、树突细胞和肥大细胞是吞噬细胞。在一个实施方案中，个体的免疫反应性物质包含从个体的血液中分离的细胞或者免疫反应性物质包含从个体分离的全血或者免疫反应性物质包含从个体分离的淋巴液。在该方法在体外进行的一个实施方案中，个体的免疫反应性物质包含外周血单核细胞(PBMC)或基本上由外周血单核细胞组成，或者在免疫反应性物质是全血的情况下，全血可以任选地补充有树突细胞，例如浆细胞样树突细胞(pDC)和/或单核细胞来源的未成熟树突细胞(iDC)。树突细胞可以来自异源或同源，或者可以是自体的，优选自体的。由于免疫治疗剂可以是免疫细胞，因此在本发明的一个实施方案中，免疫反应性物质和免疫治疗剂都可以是免疫细胞。
如本文所用，在本发明方法的背景下的免疫反应是免疫系统或免疫系统组分的可测量特征的变化，并且优选是已知表明了归因于施用免疫治疗剂的治疗效果的免疫反应。例如，免疫反应包括免疫细胞活性的变化，该活性可以是免疫细胞的分化表型的变化或免疫细胞的增殖能力的变化，或免疫细胞产生的一种或更多种细胞因子的表达或量在核酸或蛋白质水平上的变化。免疫反应可以是个体中特定类型免疫细胞(例如淋巴细胞或T细胞)的量的变化。免疫反应也可以是个体中血小板计数或血小板活化动力学的变化。免疫反应也可以是个体炎性状态的变化，例如皮肤上的炎性反应，例如接触性皮炎。免疫反应还可包括诱导针对靶抗原的免疫应答，例如诱导针对抗原的细胞毒性T细胞应答。优选地，测量的免疫反应是例如通过检测细胞因子本身或检测编码细胞因子的核酸来测量的免疫细胞所分泌的一种或更多种细胞因子的量/浓度的变化。
细胞因子是一类广泛的小蛋白质，其在细胞信号传导中的重要之处在于，它们被细胞释放并影响其他细胞的行为，尽管细胞因子也可能参与自分泌信号传导。细胞因子由广泛的细胞产生，包括广泛的免疫细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和多种基质细胞，并且给定的细胞因子可以由多于一种类型的细胞产生。示例性细胞因子包括单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、INF-α、INF-γ、GM-CSF。在一个实施方案中，细胞因子参与调节淋巴稳态，优选参与和优选诱导或增强T细胞的发育、致敏、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是白介素。在一个优选的实施方案中，细胞因子是以下的一种或更多种：白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)例如干扰素-α2a(IFN-α2a)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-γ诱导蛋白(IP10)、白介素1-β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素12p70(IL-12p70)。
白介素1-β(IL-1β)是细胞因子白介素1家族的成员，其由作为蛋白质原的活化的巨噬细胞产生，通过胱天蛋白酶1(CASP1/ICE)将其蛋白水解加工成其活性形式。该细胞因子是炎性反应的重要调节剂，其参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。发现在中枢神经系统(central nervous system，CNS)中通过该细胞因子诱导环氧合酶-2(PTGS2/COX2)有助于炎性疼痛超敏反应。
白介素-2(IL-2)是调节负责免疫的白血细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的活性的蛋白质。IL-2是对微生物感染的身体自然应答的一部分并区分外来(“非自身”)和“自身”。IL-2主要通过其对T细胞的直接作用在免疫系统的关键功能(例如耐受性和免疫性)中具有关键作用。在T细胞成熟的胸腺中，其通过促进某些未成熟T细胞分化为调节性T细胞来预防自身免疫病，所述调节性T细胞抑制在其他情况下致敏以攻击体内正常的健康细胞的其他T细胞。当初始T细胞也被抗原刺激时，IL-2还促进T细胞分化成效应T细胞和记忆T细胞，从而帮助身体抵抗感染。
白介素6(IL-6)既是促炎性细胞因子又是抗炎性肌细胞因子(myokine)，例如在感染期间和创伤(特别是烧伤或导致炎症的其他组织损伤)之后，由T细胞和巨噬细胞分泌以刺激免疫应答。IL-6也在抗感染中起作用，因为IL-6已经在小鼠中显示出是抵抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)所需的。IL-6作为抗炎细胞因子的作用是通过其对TNF-α和IL-1的抑制作用以及通过IL-1RA和IL-10的激活来介导的。
白介素12(IL-12)由响应于抗原刺激的树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和人B成淋巴细胞样细胞天然产生。IL-12是由两个独立基因IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码的异二聚体细胞因子。在蛋白质合成之后形成活性异二聚体(称为′p70′)和p40的同二聚体。IL-12参与稚T细胞向Th1细胞的分化，并且被称为T细胞刺激因子，其可以刺激T细胞的生长和功能。其刺激从T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，介导NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性的增强，并且还具有抗血管生成活性。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(恶质素(cachexin)或恶液质素(cachectin))参与全身性炎症，并且是构成急性期反应的细胞因子之一。其主要由活化的巨噬细胞产生，尽管其可以由许多其他细胞类型产生，例如树突细胞、单核细胞、CD4+淋巴细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和神经元。TNF-α的主要作用是调节免疫细胞。作为内源性热原，TNF-α能够诱发发热、凋亡性细胞死亡、恶病质、炎症并能够抑制肿瘤发生和病毒复制，并通过产生IL-1和IL-6的细胞对脓毒症作出响应。
人I型干扰素(IFN)属于干扰素蛋白的大亚组，其有助于调节免疫系统的活性。哺乳动物类型命名为IFN-α(alpha)，IFN-β(beta)，IFN-κ(kappa)，IFN-8(delta)，IFN-g(epsilon)，IFN-τ(tau)，IFN-ω(omega)和IFN-ζ(zeta，也称为限制素(1imitin))。它们主要参与针对病毒感染的先天免疫应答。负责它们合成的基因有13种亚型，称为IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。这些基因在染色体9上的簇中一起被发现。IFN-β蛋白具有抗病毒活性，其主要参与先天免疫应答。已经描述了两种类型的IFN-β，IFN-β1(IFNB1)和IFN-β3(IFNB3)。IFN-α和IFN-β由许多细胞类型分泌，包括树突细胞、淋巴细胞(NK细胞、B细胞和T细胞)、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞等。它们刺激巨噬细胞和NK细胞二者以引发抗病毒应答，并且还对肿瘤具有活性。浆细胞样树突细胞已经被鉴定为响应于Toll样受体(TLR)激活(例如TLR-7、8和/或9)的I型IFN的最有效的生产者，因此被称为天然IFN产生细胞。
干扰素γ(IFN-γ)是二聚化的可溶性细胞因子，是II型干扰素中唯一的成员。IFN-γ对于针对病毒、一些细菌和原生动物感染的先天性和适应性免疫是至关重要的。IFN-γ是巨噬细胞的重要激活剂和II类主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导物。异常的IFN-γ表达与许多自身炎性和自身免疫病相关。IFN-γ在免疫系统中的重要性部分源于其能够直接抑制病毒复制，最重要的是源于其的免疫刺激和免疫调节作用。IFN-γ主要由作为先天免疫应答的一部分的巨噬细胞、自然杀伤(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)产生，一旦抗原特异性免疫形成，则由CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞效应T细胞(CTL)产生。
干扰素-γ诱导的蛋白质10(IP-10)，也称为C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)或小诱导型细胞因子B10，是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，其由数种细胞类型分泌，例如，响应于IFN-γ。这些细胞类型包括巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。IP-10已被归因于数种作用，例如单核细胞/巨噬细胞、T细胞、NK细胞和树突细胞的化学吸引、促进T细胞与内皮细胞的黏附、抗肿瘤活性，以及抑制骨髓集落形成和血管生成。
在一个实施方案中，免疫反应的测量涉及使用与分子特异性结合的标记配体，例如与核酸杂交的标记核酸探针和/或与肽(例如细胞因子)特异性结合的标记抗体或其片段/衍生物。
根据本发明，可以使用已知的核酸检测方法，例如涉及杂交或核酸扩增技术的方法，来测量核酸的存在或量。在一个实施方案中，使用RT-PCR或Northern印迹分析来检测mRNA转录物或确定其量。此类核酸检测方法可涉及使用与核酸杂交的寡核苷酸。合适的寡核苷酸的长度通常在5至数百个核苷酸中变化，更通常长度为约20至70个核苷酸或更短，甚至更通常长度为约10至30个核苷酸。
根据本发明，测量肽(例如细胞因子)的存在或量可以以多种方式进行，包括但不限于使用与肽特异性结合的抗体进行免疫检测。使用抗体检测肽的方法是公知的，包括ELISA、竞争性结合测定等。通常，此类测定使用特异性结合肽的抗体或抗体片段，所述肽直接或间接与提供用于检测的标记结合，例如，指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。
根据本发明，在通过测量细胞生长或其缺乏或细胞分化状态的变化来检测免疫反应的情况下，这种测量可以以多种方式进行，包括但不限于细胞数量的计数，或测量摄入至细胞DNA内的3H以确定细胞增殖。可以通过观察与特定分化状态相关的细胞蛋白质的表达变化或通过观察与特定分化状态相关的细胞的视觉表型的变化来测量分化的变化。另外的方法是本领域已知的，并且可以容易地用于本文的方法中。
在该方法的一个实施方案中，测量至少一种免疫反应，或者测量两种或更多种免疫反应，或者测量三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种免疫反应。
在该方法的某些实施方案中，多种不同剂量的免疫治疗剂可以是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同的剂量。此外，多种不同剂量的免疫治疗剂可代表剂量递增，优选线性或对数剂量递增，例如1、2、3、4、5等，或1、3、9、27、81、243等，或0.1、1、10、100、1000等。在一个实施方案中，依次进行步骤(a)和(b)。优选地，步骤(b)在步骤(a)之后2至48小时进行，优选在步骤(a)之后4至24小时进行。
在一个优选的实施方案中，该方法的步骤(a)(分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触)在体内进行，其特征在于，在单独的施用步骤中使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质分别接触，每个单独的施用步骤的特征在于，向个体施用一种剂量的免疫治疗剂。单独的施用步骤可以相继进行，并且彼此分开2至30天，例如7至28天的时间间隔，优选相隔7天、14天、21天或28天，更优选相隔7天或14天。优选地，在每个单独的施用步骤之后分别进行对至少一种免疫反应的测量。在一个实施方案中，单独的施用步骤可以在基本相同的时间进行，例如，通过在基本相同的时间向皮肤施用多种不同剂量。在该实施方案中，测量的免疫反应例如可以是可目视检测的接触性皮炎。
已经向患者提供了许多类型的免疫治疗剂以提供治疗效果，并且鉴于这些知识，提供了治疗效果的这些类型的免疫治疗剂的标准剂量或标准剂量范围是已知的。在已知这样的标准剂量或剂量范围的情况下，步骤(a)中的接触的多种不同剂量优选包括低于标准剂量或范围的剂量，和/或在标准剂量范围内的剂量，和/或高于标准剂量或范围的剂量。例如，在作为癌症疫苗给予个体的RNA分子的标准剂量范围为5至100μg的情况下，那么步骤(a)中示例性的接触的多种不同剂量可以是2μg、10μg和150μg。在特定类型的免疫治疗剂的标准剂量或剂量范围未知的情况下，相似类型的免疫治疗剂的已知剂量或剂量范围可用于本发明的方法，或者标准剂量或剂量范围可以用经验确定然后根据本发明应用以确定对于个体的免疫治疗剂的合适剂量。
在一个实施方案中，多种不同剂量包含至少一种低于免疫治疗剂的标准剂量范围的剂量。在一个实施方案中，多种不同剂量包含位于免疫治疗剂的标准剂量范围内的至少一种剂量。在一个实施方案中，第一个单独的施用步骤的特征在于，施用低于免疫治疗剂的标准剂量的剂量的免疫治疗剂，并且其中在后续的单独施用步骤中施用的剂量任选地高于在第一个单独施用步骤中施用的剂量。
在接触步骤在体外进行的一个实施方案中，免疫治疗剂的标准剂量或剂量范围是已知等于同一免疫治疗剂在体内的标准剂量的剂量或剂量范围。这种等同性是本领域已知的，或者可以使用本领域已知的方法确定。在一个实施方案中，标准剂量可以与体内施用(接触)时的标准剂量相同，但是例如通过与体内接触相比体外使用的免疫反应性物质的量(例如，免疫细胞的数量)和/或通过免疫反应性物质的体积来调整。在一个实施方案中，体外接触的标准剂量与在向个体施用已知标准剂量时在个体中观察到的每毫升血液或淋巴或每个数量的特定类型的免疫细胞的免疫治疗剂的量/浓度相同。在一个实施方案中，标准“体外”剂量等于在向个体施用标准“体内”剂量时在全血中实现的免疫治疗剂的浓度。例如，当1mg/kg的标准剂量导致全血中免疫治疗剂浓度为10μg/ml时，那么在免疫反应性物质是全血的情况下，1mg/kg体内标准剂量的体外等同标准剂量为10μg/ml。
本发明的方法还可包括检测至少一种不需要的反应的存在或不存在的步骤，所述不需要的反应例如不需要的免疫反应，例如细胞因子的过高或过低水平的表达；或副作用或不利事件或反应，例如由免疫治疗剂与免疫反应性物质接触引起的器官毒性，例如，由向个体施用免疫治疗剂所引起的。该步骤可以在免疫治疗剂与免疫反应性物质接触的每个步骤之后进行，无论在体外还是体内。在一个实施方案中，在待实现的治疗效果是降低特定类型细胞的量的情况下，不需要的反应可以提高细胞因子的表达，已知该提高的表达会降低免疫治疗剂的治疗能力。副作用是不需要的反应的子集，其可以在体内进行接触步骤时检测到，并且是那些反映个体的一定程度的不适的不需要的反应，其可以在严重程度上有差别。更严重的副作用在本文中称为不可耐受的副作用。示例性的副作用包括但不限于感觉异常、疲劳、头痛、肌肉疼痛、胸部压力或胸部疼痛、战栗、温度升高或发热、耳鸣、关节疼痛、头晕、发汗、张力过低(hypotonia)和/或心动过速。示例性的不可耐受性副作用可以是对个体具有生命威胁的那些，例如最终可导致器官衰竭的全身性炎性应答综合征。
在一个实施方案中，在施用多种不同剂量中的一种后检测到至少一种副作用的情况下，所有后续剂量可以与至少一种抗毒性剂(antitoxic agent)一起施用。在一个实施方案中，在施用多种不同剂量中的一种后检测到至少一种不可耐受的副作用的情况下，所有后续剂量将与至少一种抗毒性剂一起施用。后续剂量可以等于或低于引起可耐受或不可耐受的副作用而引发施用至少一种抗毒性剂的剂量。如果剂量在不存在抗毒性剂的情况下引起可耐受或不可耐受的副作用，但在抗毒性剂存在下施用时可以耐受，则随后的剂量可以更高但仅可在抗毒性剂存在下施用。抗毒性剂优选为解热药，例如NSAID，例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利；阿司匹林及相关的水杨酸盐、例如水杨酸胆碱盐、水杨酸镁和水杨酸钠；对乙酰氨基酚(醋氨酚)；安乃近；萘丁美酮；和非那宗。
在施用不与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的一种后检测到至少一种副作用的实施方案中，待随后施用的免疫治疗剂的下一个剂量等于或小于在先前施用步骤中施用的剂量。优选地，在至少一种不需要的反应是不可耐受的副作用的情况下，待随后施用的免疫治疗剂的下一个剂量小于在先前施用步骤中施用的剂量。紧接着先前施用步骤之后的后续施用步骤之后可以进一步进行一个或更多个另外的施用步骤，其任选地代表步骤之间的剂量递增方案。
在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的一种后检测到至少一种副作用的实施方案中，待随后施用的免疫治疗剂的下一个剂量小于在先前施用步骤中施用的剂量。
在一个实施方案中，在施用多种不同剂量中的任一种后没有检测到副作用的情况下，这样的剂量反映了用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量：至少一种免疫反应表明可接受治疗效果。在确定多于一种剂量为合适剂量的实施方案中，至少一种免疫反应提供可接受治疗效果的最强指示的剂量是向个体施用的免疫治疗剂的剂量。可接受治疗效果的最强指示将取决于所测量的免疫反应。例如，最强指示可以是在施用的多种不同剂量中观察到细胞因子的表达最高或最低的情况。施用的提供可接受治疗效果的最高剂量不一定是提供可接受治疗效果的最强指示的相同剂量。
在施用多种不同剂量中的任一种后检测到至少一种副作用的实施方案中，这样的剂量反映了用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量：在后续施用步骤中与至少一种抗毒性剂一起施用，并且至少一种免疫反应指示对免疫治疗剂具有可接受治疗效果。在该实施方案的一个方面，在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的任一种后没有检测到副作用的情况下，至少一种免疫反应提供可接受治疗效果的最强指示的剂量是用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量。该方面涉及存在多种不同剂量作为合适剂量的情况，因为在与抗毒性剂一起施用的这些剂量下没有检测到副作用。可接受治疗效果的最强指示将取决于所测量的免疫反应。例如，最强指示可以是在与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中观察到细胞因子的表达最高或最低的情况。与至少一种抗毒性剂一起施用的最高剂量(其中未检测到副作用)不一定是提供可接受治疗效果的最强指示的相同剂量。在该实施方案的另一个方面，在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的任一种后检测到至少一种副作用的情况下，未检测到副作用或副作用最不严重或在其他方面根据疾病的严重程度被认为是可接受的最高剂量是用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量。该方面涉及这样的情况，其中与至少一种抗毒性剂一起施用的一些剂量导致副作用或在与至少一种抗毒性剂一起施用的所有剂量下检测到副作用。因此，合适的剂量是治疗有效的并且未检测到副作用或副作用最不严重或副作用在其他方面根据疾病的严重程度被认为是可接受的剂量。
根据本发明，确定为特定个体的特定免疫治疗剂的合适剂量的剂量是这样的剂量，其中这样的剂量反映了用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量：已知至少一种免疫反应在个体中表明对于该免疫治疗剂的可接受的(优选最佳的)治疗效果。优选地，合适剂量还导致个体中不需要的反应最少或副作用最小，无论是否与至少一种抗毒性剂一起施用。在免疫治疗剂与免疫反应性物质在体内接触的实施方案中，至少一种免疫反应表明可接受治疗效果的剂量直接反映了合适的剂量，即，向个体施用免疫治疗剂的合适剂量和与免疫反应性物质接触的多种不同剂量中的一种或更多种相同或相似。在免疫治疗剂与免疫反应性物质在体外接触的实施方案中，体外方法中使用的多种不同剂量不一定与向个体施用可提供可接受治疗效果的剂量相同。因此，其中至少一种免疫反应表明体外可接受治疗效果的剂量可间接反映出合适剂量。在体外接触的剂量与其等同的体内剂量之间的关系是已知的或可以使用本领域已知的方法确定。例如，在体外接触的免疫治疗剂的剂量是相对于接触的免疫细胞数量的量(例如，10ng/108个细胞)的情况下，等同的体内剂量是相对于相同数量的相同免疫细胞导致血液中相同或相似量的免疫治疗剂的剂量(10ng/108个相同细胞)。
治疗效果将取决于预期由免疫治疗剂提供的治疗效果。在一个实施方案中，可接受治疗效果包括但不限于阻止或减缓疾病的进展；抑制或减缓个体新疾病的发展；降低目前患有或先前患有疾病的个体中的症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长(即提高)个体的寿命。在一个实施方案中，示例性的最佳治疗效果是已经消除疾病使得不需要进一步治疗的效果。在疾病是癌症的实施方案中，可接受治疗效果是至少肿瘤的尺寸和/或数量不增加的效果，优选是肿瘤的尺寸和/或数量降低的效果，并且最佳的治疗效果是任何和所有肿瘤完全消失，并且不需要进一步施用免疫治疗剂。
在已经确定至少一种免疫反应或至少一种免疫反应的特定变化表明可接受治疗效果的情况下，导致相同反应或其变化的剂量表明该剂量是用于提供可接受治疗效果的合适剂量。此外，至少一种免疫反应的强弱或其变化也可表明该剂量下治疗效果的强弱。至少一种免疫反应与许多免疫治疗剂的治疗效果之间的相关性是已知的。此外，可以使用本领域已知的方法确定这种相关性。例如，可以在一个或更多个已经施用免疫治疗剂的个体中测量至少一种免疫反应，所述免疫治疗剂的剂量导致治疗效果，优选导致可接受治疗效果，并且在个体中一致观察到的至少一种免疫反应表明该免疫治疗剂的治疗效果，优选可接受治疗效果。例如，在免疫治疗剂的剂量导致可接受治疗效果始终与三种不同细胞因子的表达提高和某种类型的免疫细胞分化成更成熟的免疫细胞相关的情况下，三种不同细胞因子的表达提高和免疫细胞的分化是指示可接受治疗效果的免疫反应。以这种方式，可以确定指示针对任何免疫治疗剂的治疗效果的免疫反应组或“参数组”。在本发明的一个实施方案中，表明对免疫治疗剂具有可接受治疗效果的已知免疫反应组与在施用一定剂量的免疫治疗剂的个体中所观察到的相同或基本相同，所施用的剂量反映了向个体施用免疫治疗剂的合适剂量。
本发明的一些示例性实施方案包括但不限于：(i)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由特定细胞因子的最高表达水平来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致该特定细胞因子的最高表达水平的剂量反映，或(ii)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由特定细胞因子的最低表达水平来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致该特定细胞因子的最低表达水平的剂量反映，或(iii)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由诱导特定细胞因子的表达来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致诱导该特定细胞因子表达的剂量反映，或(iv)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由多种细胞因子的特定表达模式所表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致多种细胞因子的基本相同的特异性表达模式的剂量反映，或(v)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由诱导特定免疫细胞的分化来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致特定免疫细胞的分化的相同或相似的诱导的剂量反映，或(vi)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由诱导或增强免疫细胞(例如T细胞)的效应功能来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致免疫细胞的效应功能的相同或相似的诱导或增强的剂量反映。
本发明还涉及用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法，其包括向个体施用一定剂量的免疫治疗剂，所述剂量已根据本发明的方法确定为合适的。优选地，免疫治疗剂是TLR激动剂。在一个实施方案中，用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法包括(a)分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触，(b)测量由多种不同剂量的免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应，其中这样的剂量反映了用于向个体施用的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对免疫治疗剂具有可接受治疗效果，以及(c)以合适剂量向个体施用免疫治疗剂。在一个实施方案中，用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法包括以合适剂量向个体施用免疫治疗剂，其中合适剂量通过以下步骤来确定：(a)分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触，和(b)测量由多种不同剂量的免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应，其中这样的剂量反映了用于向个体施用的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对免疫治疗剂具有可接受治疗效果。
在一个实施方案中，免疫治疗剂的合适剂量与至少一种抗毒性剂一起施用。在该实施方案中，免疫治疗剂的合适剂量是在不施用至少一种抗毒性剂的情况下检测到至少一种副作用的剂量。
在一个优选的实施方案中，该方法是用于治疗癌症的免疫治疗方法，并且免疫治疗剂是核酸，优选编码在癌细胞上特异性表达的一个或更多个表位的单链RNA。优选地，一个或更多个表位是新表位。
从以下发明详述和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得明显。
发明详述
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
下文中，将描述本发明的要素。这些要素随具体实施方案列出，然而，应当理解，其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有指明，否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应当被认为通过本申请的说明书公开。
优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，和H.编辑，(1995)Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland中所述进行定义。
除非另外指出，否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见，例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第4版，M.R.Green，J.Sambrook等编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor 2012)。
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应被解释为涵盖一个/种或更多个/种。本文中数值范围的记载仅意在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独的值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。
除非本文中另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。
本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对以其他方式要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的语言都不应被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求保护的要素。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中不管是在上文还是下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中没有内容应被解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这些公开内容。
本发明设想通过施用合适剂量的免疫治疗剂来对疾病进行免疫治疗，该合适剂量通过本文所述的方法确定。由于免疫治疗剂的有效性将取决于个体之间相对于其免疫系统的天然变化，因此需要针对每个患者单独确定合适的治疗有效且优选无毒的剂量。在一个优选的实施方案中，免疫治疗剂用于治疗癌症。在一个优选的实施方案中，免疫疗法可以通过主动免疫治疗方法实现。
本发明特别涉及确定对于个体的免疫治疗剂的合适剂量。一旦鉴定出这样的合适剂量，就可以以该剂量向个体施用免疫治疗剂以诱导免疫反应，例如针对特定靶标的免疫应答。在一个优选的实施方案中，免疫应答是诱导和/或激活合适的效应细胞(例如T细胞)，其识别通过合适的抗原受体(例如T细胞受体或人工T细胞受体)在肿瘤细胞上表达的表位，导致表达该表位的病变细胞死亡。
本发明中所包括的免疫治疗方法包括用以下进行免疫：含有表位的肽或多肽，ii)编码含有表位的肽或多肽的核酸，和iii)编码含有表位的肽或多肽的重组病毒。
树突细胞(DC)是通过MHC II类和I类两种抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递于T细胞的白细胞群体。公知的是，树突细胞是免疫应答的有效诱导剂，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞常规被分类为“未成熟细胞”和“成熟细胞”，其可用作区分两种充分表征的表型的简单方式。然而，这种命名不应解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟树突细胞表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常以这些标志物的较低表达但是导致T细胞活化的细胞表面分子的高表达为特征，所述细胞表面分子例如I类和II类MHC、黏附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)。树突细胞成熟指这样的抗原呈递树突细胞导致T细胞致敏的树突细胞活化状态，而通过未成熟树突细胞的呈递导致耐受。树突细胞成熟主要由以下引起：具有被先天受体(模式识别受体)检测的微生物特征的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、树突细胞表面上的CD40被CD40L连接以及从正经受应激细胞死亡的细胞中释放的物质。树突细胞可通过在体外用细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4)培养骨髓细胞以及来源于血沉棕黄层或全血的细胞来获得。
优选的免疫治疗剂是免疫反应性肽或编码一种或更多种此类肽的核酸，该肽可包含表位，优选由疾病特异性突变产生的新表位。在本发明的上下文中，术语“疾病特异性突变”涉及体细胞突变，其存在于病变细胞的核酸中，但不存在于相应的正常而非病变细胞的核酸中。该疾病可以是癌症，因此，术语“肿瘤特异性突变”或“癌症特异性突变”涉及存在于肿瘤或癌细胞的核酸中但不存在于相应的正常(即非肿瘤或非癌)细胞的核酸中的体细胞突变。术语“肿瘤特异性突变”和“肿瘤突变”以及术语“癌症特异性突变”和“癌症突变”在本文中可互换使用。
在免疫治疗剂是抗原或编码所述抗原的核酸的实施方案中，“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“针对抗原的细胞应答”或类似术语意在包括针对以用I类或II类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞免疫应答。细胞应答涉及称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，其充当“辅助(helper)”或“杀手(killer)”。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用，杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤癌细胞等病变细胞，预防产生更多病变细胞。优选地，针对表达一种或更多种肿瘤表达的抗原并且优选用I类MHC呈递这种肿瘤表达的抗原的肿瘤细胞刺激抗肿瘤CTL应答。
根据本发明的“抗原”包括作为免疫应答的靶标和/或诱导免疫应答(例如与抗体或T淋巴细胞(T细胞)的特异性反应)的任何物质，优选肽或蛋白质。优选地，抗原包含至少一个表位，例如T细胞表位。优选地，本发明上下文中的抗原是这样的分子，其任选地在加工后诱导免疫反应，所述免疫反应优选对抗原(包括表达抗原的细胞)具有特异性。抗原或其T细胞表位优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递，所述抗原呈递细胞包括在MHC分子的背景下的病变细胞，特别是癌细胞，其导致针对抗原(包括表达抗原的细胞)的免疫应答。抗原优选地是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可以包括或可以来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生物以及其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可以对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白或其部分。在一些优选的实施方案中，抗原是表面多肽，即天然展示在细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生物、变应原或肿瘤的表面上的多肽。抗原可以引发针对细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生物、变应原或肿瘤的免疫应答。
术语“疾病相关抗原”或“疾病特异性抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关或对疾病具有特异性的任何抗原。这样的抗原是包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的抗原特异性细胞免疫应答和/或体液抗体应答的表位的分子。因此，疾病相关抗原可用于治疗目的。疾病相关抗原优选地与微生物感染(通常是微生物抗原)相关或与癌症(通常是肿瘤)相关。
术语“病原体”是指能够在生物体，优选脊椎动物生物体中引起疾病的致病性生物材料。病原体包括微生物，例如细菌、单细胞真核生物(原生动物)、真菌、以及病毒。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”指以下蛋白质，其在正常条件下在有限量的组织和/或器官中或在特定发育阶段特异性表达，例如肿瘤抗原可在正常条件下在胃组织中(优选地在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如在睾丸中)、在滋养层组织中(例如在胎盘中)、或在种系细胞中特异性表达；并且在一个或更多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在该情况下，“有限量”优选地意指不超过3，更优选不超过2。在本发明上下文中的肿瘤抗原包括例如分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在特定分化阶段在特定细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤抗原优选与癌细胞的细胞表面缔合，并且优选地在正常组织中不表达或仅很少表达。优选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中，由对象例如患有癌症疾病的患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原可以是自身蛋白或非自身蛋白。在一些优选实施方案中，在本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下特别是在癌组织中或者在非必需组织或器官(即当被免疫系统损害时不导致对象死亡的组织或器官)中或者在免疫系统不可及或仅很难可及或通过耐受机制(例如，通过存在高浓度的Treg细胞)进行保护的身体器官或结构中表达。肿瘤抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的肿瘤抗原和在癌组织中表达的肿瘤抗原之间可以是相同的，或者氨基酸序列可以是不同的，例如，仅在一个氨基酸处或在多于一个氨基酸处，优选在多于2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸处不同。术语“肿瘤抗原”、“肿瘤表达抗原”、“癌抗原”和“癌症表达抗原”是等同物，并且在本文中可互换使用。
术语“表位”、“抗原肽”、“抗原表位”、“免疫原性肽”和“MHC结合肽”在本文中可互换使用，并且指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即指免疫活性化合物中被免疫系统识别(例如，被T细胞识别，特别是当在MHC分子的情况下呈递时)的部分或片段。蛋白质的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续段，并且长度优选为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可以优选为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。根据本发明，表位可与MHC分子(例如细胞表面上的MHC分子)结合，并且因此可以是“MHC结合肽”或“抗原肽”。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且指存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子在免疫反应中对淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导具有重要意义，其中MHC蛋白或分子与肽结合并将其呈递以被T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并且向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)两者。优选的此类免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。如本文所用，如果使用本领域已知的任何测定可检测到这种结合，则称免疫原性部分与MHC I类或II类分子“结合”。术语“MHC结合肽”是指结合MHC I类和/或MHC II类分子的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为8至10个氨基酸，但是更长或更短的肽也可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为10至25个氨基酸，并且特别地长度为13至18个氨基酸，而更长和更短的肽也可以是有效的。
本文中使用的术语“新表位”指在参照细胞(例如正常的非癌细胞或种系细胞)中不存在但见于病变细胞(例如癌细胞)中的表位。这特别地包括以下情况，其中在正常的非癌细胞或种系细胞中发现对应的表位，然而由于癌细胞中的一个或更多个突变，该表位的序列改变而产生新表位。此外，新表位不仅可以对病变细胞具有特异性，而且可以对患有该疾病的患者具有特异性。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，表位或新表位是T细胞表位。如本文中使用的术语“T细胞表位”指以被T细胞受体识别的构型与MHC分子结合的肽。通常来说，T细胞表位呈递在抗原呈递细胞的表面上。
如本文所用，术语“预测免疫原性氨基酸修饰”是指预测包含此类氨基酸修饰的肽是否具有免疫原性并由此可用作疫苗接种中的表位，特别是T细胞表位。
根据本发明，T细胞表位可作为包含多于一个T细胞表位的较大实体例如疫苗序列和/或多肽的一部分存在于疫苗中。呈递的肽或T细胞表位在适当地加工之后产生。
T细胞表位可在对TCR识别或与MHC结合非必需的一个或更多个残基处被修饰。这样的经修饰T细胞表位可以被认为是免疫学上等同的。
优选地，T细胞表位当被MHC呈递并且被T细胞受体识别时能够在合适共刺激信号的存在下诱导携带特异性地识别肽/MHC复合物的T细胞受体的T细胞克隆扩增。
优选地，T细胞表位包含基本上对应于抗原片段的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，所述抗原片段是MHC I类和/或II类呈递的肽。
根据本发明的T细胞表位优选地指抗原的一段或片段，其能够刺激针对该抗原或者针对以表达该抗原为特征并且优选地以呈递该抗原为特征的细胞(例如病变细胞，特别是癌细胞)的免疫应答，优选细胞应答。优选地，T细胞表位能够刺激针对以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答，并且优选地能够刺激抗原响应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在一些实施方案中，抗原是自身抗原，特别是肿瘤抗原。肿瘤抗原及其测定是本领域技术人员已知的。
术语“免疫原性”指诱导优选地与治疗性治疗，例如针对癌症的治疗相关的免疫应答的相对功效。本文中使用的术语“免疫原性的”指具有免疫原性的特性。例如，当在肽、多肽或蛋白质的情况下使用时，术语“免疫原性修饰”指所述肽、多肽或蛋白质诱导由所述修饰引起和/或针对所述修饰的免疫应答的功效。优选地，未经修饰的肽、多肽或蛋白质不诱导免疫应答、诱导不同的免疫应答或诱导不同水平，优选较低水平的免疫应答。
根据本发明，术语“免疫原性”或“免疫原性的”优选地指诱导生物学相关免疫应答，特别是可用于疫苗接种的免疫应答的相对功效。因此，如果氨基酸修饰或经修饰肽在对象中诱导针对靶修饰的免疫应答，则其是免疫原性的，该免疫应答可对治疗或预防目的具有益处。
“抗原加工”或“加工”指多肽或抗原被降解成作为所述多肽或抗原的片段的加工产物(例如，多肽被降解成肽)，并且使这些片段中一个或更多个与MHC分子缔合(例如，通过结合)用于被细胞，优选抗原呈递细胞呈递于特定T细胞。
在一个实施方案中，免疫治疗剂可包含抗原呈递细胞(antigen presentingcell，APC)，其是呈递与其细胞表面上的MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可活化抗原特异性T细胞。专职抗原呈递细胞在通过吞噬、胞饮或通过受体介导的胞吞内化抗原并随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常有效。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与之相互作用。然后，抗原呈递细胞产生另外的共刺激信号，从而导致活化T细胞。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的限定特征。专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最宽范围的抗原呈递，并且可能是最重要的抗原呈递细胞；巨噬细胞；B细胞以及某些活化的上皮细胞。
非专职抗原呈递细胞不组成型地表达与天然CD4+T细胞相互作用所需的MHC II类蛋白；这些仅在非专职抗原呈递细胞被某些细胞因子(例如IFNγ)刺激之后表达。
通过用编码肽或包含待呈递的肽的多肽的核酸(优选RNA)(例如编码抗原的核酸)转导细胞，可以使抗原呈递细胞加载有MHC I类和II类呈递的肽。
在一些实施方案中，可以将包含靶向树突细胞或其他抗原呈递细胞的基因递送载体的本发明的免疫治疗剂向患者施用，导致在体内发生转染。例如，树突细胞的体内转染通常可以使用本领域已知的任何方法进行，例如WO 97/24447中描述的那些，或Mahvi等，Immunology and cell Biology 75：456-460，1997所描述的基因枪方法。
术语“抗原呈递细胞”还包括靶细胞。
“靶细胞”应意指为免疫应答(例如细胞免疫应答)靶标的细胞。靶细胞包括呈递抗原或抗原表位，即来源于抗原的肽片段的细胞，并且包括任何不期望的细胞，例如癌细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞是表达本文中所述的抗原并且优选地用I类MHC呈递所述抗原的细胞。
术语“段(portion)”指片段。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“段”可指所述结构的连续或不连续片段。优选地，氨基酸序列的一段包含所述氨基酸序列的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、优选至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％并且最优选至少90％的氨基酸。优选地，如果该段是不连续片段，则所述不连续片段由结构的2、3、4、5、6、7、8个或更多个部分构成，每个部分为该结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续片段可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8个或更多个，优选不超过4个部分构成，其中每个部分优选地包含该氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、优选至少20个连续氨基酸、优选至少30个连续氨基酸。
术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用，并且指连续元件。例如，例如氨基酸序列或蛋白质的结构的一部分指所述结构的连续元件。
结构的段、部分或片段优选地包含所述结构的一种或更多种功能特性。例如，表位、肽或蛋白质的段、部分或片段优选地与其所来源于的表位、肽或蛋白质免疫学等同。在本发明的上下文中，例如氨基酸序列的结构的“部分”优选地包含整体结构或氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％，优选地由其组成。
在一个实施方案中，免疫治疗剂可以是免疫反应性细胞。免疫反应性细胞与免疫反应性物质相关，这是由于其是在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。免疫反应性细胞优选地能够与抗原或者以呈递抗原或来源于抗原的抗原肽为特征的细胞结合，并且介导免疫应答。例如，这样的细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，分泌抗体，识别癌细胞并任选地消除这些细胞。例如，免疫反应性细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，免疫反应性细胞是T细胞，优选CD4+和/或CD8+T细胞。在本发明的一个实施方案中，个体的免疫反应性物质优选可包含免疫反应性细胞或包含免疫反应性细胞的组合物。
优选地，“免疫反应性细胞”还可以以一定程度的特异性识别抗原或来源于抗原的抗原肽，特别是如果在MHC分子情况下在例如抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上呈递的话。优选地，所述识别使得识别抗原或来源于所述抗原的抗原肽的细胞能够具有响应性或反应性。如果细胞是携带在MHC II类分子情况下识别抗原或来源于抗原的抗原肽的辅助T细胞(CD4+T细胞)，则这样的响应性或反应性可涉及释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞。如果细胞是CTL，则这样的响应性或反应性可涉及例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除在MHC I类分子情况下呈递的细胞，即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞。CTL响应性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)产生、活化标志物(例如CD44和CD69)上调、以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。CTL响应性还可使用精确地指示CTL响应性的人工报道子来确定。这样的识别抗原或来源于抗原的抗原肽并且具有响应性或反应性的CTL在本文中还称为“抗原响应性CTL”。如果细胞是B细胞，则这样的响应性可涉及释放免疫球蛋白。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。
T细胞属于已知为淋巴细胞的白细胞组，并且在细胞介导的免疫中起关键作用。其与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)的区别之处可在于在其细胞表面上存在称为T细胞受体(TCR)的特殊受体。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已发现T细胞的数个不同亚群，其各自均具有独特的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，除其他功能之外还包括使B细胞分化为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。这些细胞由于其在其表面上表达CD4蛋白而还被称为CD4+T细胞。在共刺激的背景下，辅助T细胞当抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHCII类分子向其呈递肽抗原时变得活化。一旦活化，其迅速分裂并分泌在活性免疫应答中起调节或辅助作用的称为细胞因子的小蛋白。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植物排斥。这些细胞由于其在其表面上表达CD8糖蛋白而还被称为CD8+T细胞。在共刺激的背景下，这些细胞通过结合与MHC I类缔合的抗原来识别其靶标，MHC I类存在于身体的每个具核细胞的表面上。
大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合体存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，这些肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且称为α-和β-TCR链。γδ T细胞(gamma delta T细胞)代表在其表面上具有独特T细胞受体(TCR)的一小部分T细胞。然而，在γδ T细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。与αβ T细胞相比，该T细胞组群较不常见(总T细胞的2％)。
根据本发明，术语“抗原受体”包括天然存在的受体，例如T细胞受体以及经改造受体，其向免疫效应细胞例如T细胞赋予任意特异性例如单克隆抗体的特异性。以这种方式，可以产生大量抗原特异性T细胞以用于过继细胞转移。因此，根据本发明的抗原受体可以存在于T细胞上，例如，作为T细胞自身的T细胞受体的替代或补充。这样的T细胞不一定需要对抗原经加工和呈递以识别靶细胞，而是可以优选地特异性地识别靶细胞上存在的任何抗原。优选地，所述抗原受体在细胞表面上表达。出于本发明的目的，包含抗原受体的T细胞包括在本文中使用的术语“T细胞”中。特别地，根据本发明，术语“抗原受体”包括包含以下单分子或分子复合物的人工受体，其识别(即结合)靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(例如，通过使抗原结合位点或抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合)，并且可以向在细胞表面上表达所述抗原受体的免疫效应细胞例如T细胞赋予特异性。优选地，抗原受体对靶结构的识别导致表达所述抗原受体的免疫效应细胞的活化。抗原受体可包含一个或更多个蛋白质单元，所述蛋白质单元包含一个或更多个如本文所述的结构域。如本文所用，“抗原受体”还可以是“嵌合抗原受体(CAR)”、“嵌合T细胞受体”或“人工T细胞受体”。
抗原可以通过任何能够形成抗原结合位点的抗原识别结构域(本文中也简称为“结构域”)例如通过可以存在于同一或不同肽链上的抗体和T细胞受体的抗原结合部分被抗原受体识别。在一个实施方案中，形成抗原结合位点的两个结构域来源于免疫球蛋白。在一个实施方案中，形成抗原结合位点的两个结构域来源于T细胞受体。特别优选的是抗体可变结构域，例如来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；和T细胞受体可变结构域，特别是TCR α和β单链。事实上，几乎任何以高亲和力结合给定靶标的物质都可以用作抗原识别结构域。
T细胞活化中的第一信号通过T细胞受体与另一细胞上由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)呈递的短肽结合来提供。这确保仅活化具有该肽特异性的TCR的T细胞。配偶体细胞通常是专职抗原呈递细胞(APC)，在稚应答(response)的情况下通常为树突细胞，但是B细胞和巨噬细胞也可以是重要的APC。由MHC I类分子呈递给CD8+T细胞的肽通常长度为8至10个氨基酸；由MHC II类分子呈递给CD4+T细胞的肽通常较长，因为MHC II类分子的结合槽的末端是开放的。
在本发明的背景下，如果分子对预定靶标具有显著亲和力并且在标准测定中与所述预定靶标结合，则其能够与所述靶标结合。通常通过平衡解离常数(KD)测量“亲和力”或“结合亲和力”。如果分子对靶标不具有显著亲和力并且在标准测定中不与所述靶标显著结合，则其(基本上)不能够与所述靶标结合。
细胞毒性T淋巴细胞可通过在体内向抗原呈递细胞中并入抗原或抗原肽来体内产生。抗原或抗原肽可作为蛋白质、作为DNA(例如在载体内)或作为RNA表示。抗原可被加工以产生MHC分子的肽配偶体，而其片段则无需进行进一步加工即可呈递。如果这些可以与MHC分子结合，则后者尤其如此。一般来说，可通过皮内注射来向患者施用。然而，注射也可以在节内进行进入淋巴结中(Maloy等，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98：3299-303)或静脉注射。其他施用方式可包括肌内和皮下施用。产生的细胞呈递目的复合物并被自体细胞毒性T淋巴细胞识别，其随后增殖。
CD4+或CD8+T细胞的特异性活化可以以多种方式来检测。用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如，淋巴因子)的产生或细胞裂解活性的产生。对于CD4+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的一种优选方法是检测T细胞增殖。对于CD8+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的一种优选方法是检测细胞裂解活性的产生。
“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或者类似表述意指在MHC分子、特别是MHC I类分子情况下呈递其表达的抗原或者例如通过加工抗原而呈递来源于所述抗原的片段的细胞，例如病变细胞，如癌细胞，或者抗原呈递细胞。类似地，术语“以呈递抗原为特征的疾病”表示涉及以呈递抗原，特别地以I类MHC呈递抗原为特征之细胞的疾病。细胞的抗原呈递可通过用编码抗原的核酸(例如RNA)转染细胞来实现。
“所呈递的抗原片段”或类似表述意指所述片段例如当直接添加至抗原呈递细胞时可由MHC I类或II类，优选MHC I类呈递。在一个实施方案中，所述片段是由表达抗原的细胞天然呈递的片段。
术语“免疫学等同的”意指免疫学等同分子(例如免疫学等同氨基酸序列)表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如对于免疫学作用的类型，例如诱导体液和/或细胞免疫应答、所诱导免疫反应的强度和/或持续时间、或者所诱导免疫反应的特异性。在本发明的上下文中，术语“免疫学等同的”可针对用于免疫接种的肽的免疫学作用或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参照氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参照氨基酸序列免疫学等同。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应功能”包含在本文所用的术语“免疫反应”中，并且包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤播散和转移。优选地，在本发明的上下文中，免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。这样的功能在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下包括抗原或来源于抗原的抗原肽在MHC II类分子情况下被T细胞受体识别、释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括抗原或来源于抗原的抗原肽在MHC I类分子情况下被T细胞受体识别、通过例如凋亡或穿孔素介导的细胞裂解消除在MHCI类分子情况下呈递的细胞(即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞)、产生细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。
术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及在所有脊椎动物中发生的基因复合物。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞和抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白质或分子结合肽并呈递它们以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)二者显示给T细胞。
MHC区分为三个亚组，I类，II类和III类。MHC I类蛋白含有α链和β2-微球蛋白(不是15号染色体编码的MHC的一部分)。它们将抗原片段呈递至细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上，特别是在抗原呈递细胞上，MHC II类蛋白含有α-链和β-链，它们将抗原片段呈递至T辅助细胞。MHC III类区域编码其他免疫组分，例如补体成分和一些编码细胞因子的成分。
MHC既是多基因的(具有数种MHC I类和MHC II类基因)又是多态的(每个基因聚有多个等位基因)。
如本文所用，术语“单体型”是指在一条染色体上发现的HLA等位基因和由其编码的蛋白质。单体型还可以指代存在于MHC内任何一个基因座的等位基因。每类MHC由数个基因座代表：例如，对于I类，HLA-A(人白细胞抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P和HLA-V；和对于II类，HLA-DRA、HLA-DRBl-9、HLA-DQAl、HLA-DQBl、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB。术语“HLA等位基因”和“MHC等位基因”在本文中可互换使用。
MHC表现出极端的多态性。在人群中，在每个遗传基因座处，存在包含不同等位基因的大量单体型。I类和II类的不同多态性MHC等位基因均具有不同的肽特异性，这是由于每个等位基因编码结合表现出特定序列模式的肽的蛋白质。
在本发明的上下文中，MHC分子优选是HLA分子。
在本发明的上下文中，术语“MHC结合肽”包括MHC I类和/或II类结合肽或可以进行加工以产生MHC I类和/或II类结合肽的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长度为8至12个氨基酸，优选长度为8至10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长度为9至30个氨基酸，优选长度为10至25个氨基酸，特别地长度为13至18个氨基酸，而更长和更短的肽可能是有效的。
在一个实施方案中，可用于本发明方法的免疫治疗剂可包含抗原肽或编码抗原肽的核酸。“抗原肽”优选涉及抗原的一部分或片段，其能够刺激免疫应答，优选针对抗原或以表达抗原(优选呈递抗原)为特征的细胞(例如病变细胞，特别是癌细胞)的细胞应答。优选地，抗原肽能够刺激针对以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答，并且优选能够刺激抗原反应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。优选地，抗原肽是MHC I类和/或II类呈递的肽，或者可以经加工以产生MHC I类和/或II类呈递的肽。优选地，抗原肽包含基本上对应于抗原片段的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，所述抗原片段是MHC I类和/或II类呈递的肽。优选地，抗原肽包含基本上对应于这种片段的氨基酸序列的氨基酸序列，并且经加工以产生这样的片段，即MHC I类和/或II类呈递的来源于抗原的肽。
如果要直接呈递肽，即没有加工，特别是没有切割，则其具有适合与MHC分子、特别是I类MHC分子结合的长度，并且优选长度为7至20个氨基酸，更优选长度为7至12个氨基酸，更优选长度为8至11个氨基酸，特别是长度为9或10个氨基酸。
如果肽是包含另外序列的较大实体(例如疫苗序列或多肽)的一部分，并且将在加工之后、特别是在切割之后被呈递，则通过加工产生的肽具有适于与MHC分子、特别是I类MHC分子结合的长度，并且优选地长度为7至20个氨基酸，更优选地长度为7至12个氨基酸，更优选地长度为8至11个氨基酸，特别地长度为9或10个氨基酸。优选地，将在加工之后被呈递的肽的序列来源于用于疫苗接种的抗原或多肽的氨基酸序列，即其序列与该抗原或多肽的片段基本上对应并且优选地完全相同。因此，MHC结合肽包含与抗原片段基本上对应且优选完全相同的序列。
具有基本上对应于由I类MHC呈递的肽序列的氨基酸序列的肽可以在一个或多个残基上不同，所述残基对于由I类MHC呈递的肽的TCR识别或对于肽与MHC结合不是必需的。这种基本上相应的肽也能够刺激抗原反应性CTL，并且可以认为是免疫学上等同的。在不影响TCR识别但改善与MHC结合的稳定性的残基处具有与呈递的肽不同的氨基酸序列的肽可以改善抗原肽的免疫原性，并且在本文中可称为“优化的肽”。使用关于哪些残基更可能影响与MHC或TCR的结合的现有知识，可以采用设计基本上对应的肽的合理方法。产生的功能性肽被认为是抗原肽。
当由MHC呈递时，抗原肽应该是T细胞受体可识别的。优选地，假定由T细胞受体识别的抗原肽能够在合适的共刺激信号存在下诱导携带特异性识别抗原肽的T细胞受体的T细胞的克隆扩增。优选地，抗原肽，特别是如果在MHC分子的背景下呈递，能够刺激免疫应答，优选针对其所来源的抗原或以表达该抗原为特征(优选以呈递该抗原为特征)的细胞的细胞应答。优选地，抗原肽能够刺激针对以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答，并且优选能够刺激抗原应答性CTL。这种细胞优选是靶细胞。
术语“基因组”指生物体或细胞的染色体中遗传信息的总量。
术语“外显子组”指生物体的基因组中由外显子形成的部分，其是所表达基因的编码部分。外显子组提供用于合成蛋白质及其他功能性基因产物的遗传蓝图。其是基因组中功能最相关的部分，因此，其最有可能促成生物体的表型。人基因组的外显子组估计占总基因组的1.5％(Ng等，2008，PLoS Gen.，4(8)：1-15)。
术语“转录物组”指一个细胞或细胞群中产生的所有RNA分子，包括mRNA、rRNA、tRNA以及其他非编码RNA的集合。在本发明的上下文中，转录物组意指给定个体的一个细胞、细胞群(优选癌细胞群)或所有细胞在给定时间点产生的所有RNA分子的集合。
“核酸”优选地是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、更优选RNA、最优选体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA，IVT RNA)或合成的RNA。核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的分子和化学合成的分子核酸可以作为单链或双链且线性或共价环状闭合的分子存在。核酸可以被分离。术语“分离的核酸”意指核酸(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)是纯化的，例如通过切割并通过凝胶电泳分离而纯化的；或(iv)是合成的，例如通过化学合成而合成的。核酸可用于引入细胞中，即转染细胞，特别是以RNA的形式，其可通过体外转录由DNA模板制备。此外，可在应用之前通过稳定化序列、加帽和聚腺苷酸化对RNA进行修饰。
术语“遗传物质”指分离的核酸(DNA或RNA)、双螺旋的部分、染色体的部分、或者生物体或细胞的整个基因组，特别是其外显子组或转录物组。
术语“突变”指与参照相比的核酸序列的变化或差异(核苷酸替换、添加或缺失)。除生殖细胞(精子和卵子)之外，身体的任何细胞都可能发生“体细胞突变”，因此不会传递给儿童。这些改变可(但不总是)引起癌症或其他疾病。优选地，突变是非同义突变。术语“非同义突变”指导致翻译产物中氨基酸改变(例如氨基酸替换)，优选导致新表位形成的突变，优选核苷酸替换。
术语“突变”包括点突变、插失(Indel)、融合、染色体碎裂(chromothripsis)和RNA编辑。
术语“插失”描述一种特殊的突变种类，其定义为导致共定位的插入和缺失以及核苷酸净增加或损失的突变。在基因组的编码区中，除非插失的长度为3的倍数，否则其产生移码突变。插失可与点突变形成对比，其中插失从序列中插入和缺失核苷酸，点突变是取代一个核苷酸的替换形式。
融合可产生由两个先前分离的基因形成的杂合基因。其可由于易位、中间缺失或染色体倒位而发生。通常，融合基因是癌基因。致癌性融合基因可导致具有新功能或不同于两个融合配偶体功能的基因产物。或者，原癌基因与强启动子融合，并且由此致癌功能被设定为通过由上游融合配偶体的强启动子引起的上调而起作用。致癌性融合转录物还可通过反式剪接或通读事件产生。
术语“染色体碎裂”指通过单个灾难性事件(devastating event)基因组的特定区域被破碎并随后拼接在一起的遗传现象。
术语“RNA编辑”指其中通过碱基组成的化学改变来改变RNA分子中的信息内容的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰，例如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基，以及非模板的核苷酸添加和插入。mRNA中的RNA编辑有效地改变所编码蛋白质的氨基酸序列，以使得其与由基因组DNA序列预测的不同。
术语“癌症突变标志”指与非癌性参照细胞相比时存在于癌细胞中的突变组。
在本发明的上下文中，“参照”可用于关联和比较来自肿瘤试样的结果。通常来说，“参照”可基于从患者或者一个或更多个不同个体，优选健康个体，特别是同一物种的个体获得的一个或更多个正常试样，特别是未受癌症疾病影响的试样来获得。“参照”可凭经验通过测试足够大量的正常试样来确定。
可通过任何合适的测序方法来确定疾病特异性突变，优选下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法在未来可能替代NGS技术以加速方法的测序步骤。为了说明目的，术语“下一代测序”或“NGS”在本发明的上下文中意指全部的新高通量测序技术，其与称为Sanger化学的“常规”测序方法形成对比，通过将整个基因组断裂成小碎片来沿着整个基因组平行地随机阅读核酸模板。这样的NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间段内，例如在1至2周内，优选地在1至7天内或者最优选地在不到24小时内递送整个基因组、外显子组、转录物组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息并且在原理上实现单细胞测序方法。在本发明的上下文中可使用可商购获得或文献中提及的多种NGS平台，例如Zhang等，2011，The impact of next-generationsequencing on genomics.J.Genet Genomics 38(3)：95-109中；或者Voelkerding等，2009，Next generation sequencing：From basic research to diagnostics.Clinicalchemistry 55：641-658中详细描述的那些。
优选地，DNA和RNA制备物充当NGS的起始物质。这样的核酸可容易地从例如生物材料的样品，例如从新鲜的、迅速冷冻的或福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织(FFPE)或者从新鲜分离的细胞或者从患者外周血中存在的CTC获得。可从正常的体细胞组织提取正常的未突变基因组DNA或RNA，然而在本发明的上下文中，种系细胞是优选的。种系DNA或RNA从患有非血液学恶性肿瘤的患者中的外周血单个核细胞(PBMC)提取。虽然从FFPE组织或新鲜分离的单细胞提取的核酸是高度片段化的，但是其适合NGS应用。
用于外显子组测序的数种靶向NGS方法在文献中进行了描述(有关综述，参见例如Teer和Mullikin，2010，Human Mol Genet 19(2)：R145-51)，其所有均可与本发明联合使用。这些方法(描述为例如基因组捕获、基因组分隔、基因组富集等)中有很多使用杂交技术并且包括基于阵列(例如，Hodges等，2007：Nat.Genet.39：1522-1527)和基于液体(例如，Choi等，2009，Proc.Natl.Acad.Sci USA 106：19096-19101)的杂交方法。用于DNA样品制备和后续外显子组捕获的市售试剂盒也是可以获得的：例如，Illumina Inc.(San Diego，California)提供TruSeqTMDNA样品制备试剂盒和外显子组富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
为了在将例如肿瘤样品的序列与参照样品的序列(例如种系样品的序列)进行比较时降低检测癌症特异性体细胞突变或序列差异中假阳性发现的数量，优选地重复测定这些样品类型中一种或两种的序列。因此，优选地将参照样品的序列(例如种系样品的序列)确定两次、三次或更多次。作为替代或补充，将肿瘤样品的序列确定两次、三次或更多次。还可如下多于一次地确定参照样品的序列(例如，种系样品的序列)和/或肿瘤样品的序列：将基因组DNA中的序列确定至少一次，并且将所述参照样品和/或所述肿瘤样品的RNA中的序列确定至少一次。例如，通过确定参照样品(例如种系样品)在重复之间的变化，可估计假阳性体细胞突变的预期比率(FDR)作为统计量。样品的技术重复应产生相同的结果，并且在该“相同间比较(same vs.same comparison)”中的任何检测到的突变均为假阳性。特别地，为了确定肿瘤样品相对于参照样品中体细胞突变检测的假发现率，可使用参照样品的技术重复作为参考来估计假阳性的数量。此外，可使用机器学习方法来将多个质量相关计量(例如，覆盖率或SNP质量)组合成单质量评分。对于给定的体细胞变异，可计数具有超标质量评分的所有其他变异，这使得能够对数据集中的所有变异进行排序。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含至少一个核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA例如通过一个或更多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然存在的RNA的经修饰的RNA。这样的改变可包括非核苷酸物质的添加，例如添加至RNA的末端或内部添加，例如添加在RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在RNA的类似物。
术语“RNA”包括并且优选地涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及可通过使用DNA模板产生且编码肽或多肽的“转录物”。通常来说，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在本发明的上下文中，mRNA可由DNA模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。
可根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，可通过具有稳定化效果和/或提高RNA翻译效率的一种或更多种修饰来稳定化RNA和提高其翻译。这样的修饰例如在PCT/EP2006/009448中进行了描述，其通过引用并入本文。为了提高在本发明的实施方案中使用的RNA的表达，可在编码区(即编码所表达肽或蛋白质的序列)内，优选地在不改变所表达肽或蛋白质的序列的情况下对其进行修饰以提高GC含量从而提高mRNA稳定性和进行密码子优化，并且由此增强在细胞中的翻译。
在本发明中使用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括对RNA的非天然存在于所述RNA中的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。去除这种未加帽的5’-三磷酸可以通过用磷酸酶处理RNA来实现。
根据本发明的RNA可以具有经修饰的核糖核苷酸，以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷被部分或完全，优选完全替换为胞苷。作为替代或补充，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷被部分或完全替换为尿苷。在一个优选的实施方案中，根据本发明的具有修饰的核糖核苷酸的RNA仍然具有充当Toll样受体激动剂的能力。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端上的帽结构，并且通常由通过不寻常的5’至5’三磷酸酯键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽，优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定化RNA和/或增强RNA翻译(如果连接于RNA的话，优选在体内和/或在细胞中)的能力的5’-帽类似物。
向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物可以通过在所述5’-帽或5’-帽类似物存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽共转录并入产生的RNA链中，或者可以例如通过体外转录产生RNA并且可以在转录后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)使5’-帽与RNA连接。
RNA可包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外修饰可为延伸或截短天然存在的poly(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如用来源于珠蛋白基因的3’-UTR交换已有的3’-UTR或者插入来源于球蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个，优选两个拷贝，所述球蛋白基因例如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白，优选β-球蛋白，更优选人β-球蛋白。
与具有经掩盖poly-A序列的RNA相比，具有未掩盖poly-A序列的RNA更有效地翻译。术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”指通常位于RNA分子的3’端的腺嘌呤基(A)残基的序列，并且“未掩盖poly-A序列”意指在RNA分子3’端的poly-A序列以poly-A序列的A结束，并且除位于poly-A序列3’端(即下游)的A之外，在此之后没有核苷酸。此外，约120个碱基对的长poly-A序列产生最佳的转录物稳定性和RNA翻译效率。
因此，为了提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以使其与poly-A序列联合存在，所述poly-A序列的长度优选为10至500，更优选30至300，甚至更优选65至200，尤其是100至150个腺苷残基。在一个尤其优选的实施方案中，poly-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，poly-A序列可以是未掩盖的。
此外，向RNA分子的3’-非翻译区中并入3’-非翻译区(UTR)可使得增强翻译效率。通过并入两个或更多个这样的3’-非翻译区可以实现协同效果。3’-非翻译区相对于并入其的RNA可以是自体或异源的。在一个具体实施方案中，3’-非翻译区来源于人-β球蛋白基因。
上述修饰的组合对RNA稳定性和翻译效率提高具有协同影响，所述修饰即并入poly-A序列、未掩盖poly-A序列以及并入一个或更多个3’-非翻译区。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间段。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可能影响RNA的“表达持续时间”。可以预期具有长半衰期的RNA将在延长的时间段内表达。
当然，如果期望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，则可以对RNA进行修饰以干扰如上所述提高RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。
术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽或多肽，例如，通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽或多肽。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。
术语表达还包括“异常表达“或“不正常表达”。“异常表达”或“不正常表达”意指与参照，例如未患有与某一蛋白质如肿瘤抗原的异常或不正常表达相关的疾病的对象的状态相比，表达改变，优选提高。表达提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％或更多。在一个实施方案中，只在病变组织中发现表达，而在健康组织中的表达被抑制。
术语“特异性表达”意指蛋白质基本上仅在特定组织或器官中表达。例如，在胃黏膜中特异性表达的肿瘤抗原意指所述蛋白质主要在胃黏膜中表达，而不在其他组织中表达或者在其他组织或器官类型中不在显著程度上表达。因此，仅在胃黏膜细胞中表达和在任何其他组织如睾丸中在显著较小的程度上表达的蛋白质在胃黏膜细胞中特异性表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原也可在正常条件下在多于一种组织类型或器官，例如2或3种组织类型或器官，但优选不超过3种不同的组织或器官类型中特异性表达。在这种情况下，肿瘤抗原然后在这些器官中特异性表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下，优选在肺和胃中在大致相等的程度上表达，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，可将RNA翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中优选使用合适的细胞提取物在无细胞系统中体外合成RNA，特别是mRNA的过程。优选地，克隆载体被应用于产生转录物。这些克隆载体通常被指定为转录载体并且被术语“载体”所涵盖。本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的逆转录获得。
术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，信使RNA的链指导氨基酸序列组装以产生肽或多肽。
在本发明的上下文中可与核酸功能性地连接的表达控制序列或调节序列相对于核酸可以是同源的或异源的。如果编码序列和调节序列共价结合在一起，使得编码序列的转录或翻译受到调节序列的控制或影响，则它们“功能性地”连接在一起。如果编码序列待被翻译成功能性蛋白质，则在调节序列与编码序列的功能性连接下，调节序列的诱导导致编码序列的转录，而不引起编码序列中的阅读框移位或编码序列不能翻译成期望的蛋白质或肽。
在本发明的上下文中，术语“表达控制序列”或“调节序列”包含控制核酸转录或所得RNA翻译的启动子、核糖体结合序列和其他控制元件。在一个些实施方案中，可以控制调节序列。调节序列的精确结构可以根据物种或根据细胞类型而变化，但通常包括参与启动转录或翻译的5’-未转录序列以及5’和3’非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。特别地，5’-未转录的调节序列包含启动子区，所述启动子区包含用于功能性结合基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可以包含增强子序列或上游活化子序列。
优选地，将待在细胞中表达的RNA引入到所述细胞中。在根据本发明方法的一个实施方案中，通过合适的DNA模板的体外转录获得待被引入到细胞中的RNA。
例如“能够表达……的RNA”和“编码……的RNA”的术语在本文中可互换使用，并且对于特定的肽或多肽意味着所述RNA如果存在于合适的环境中，优选在细胞中可以被表达以产生所述肽或多肽。优选地，RNA能够与细胞翻译机器相互作用以提供其能够表达的肽或多肽。
例如“转移”、“引入”或“转染”的术语在本文中可互换使用，并且涉及将核酸、特别是外源或异源核酸、特别是RNA引入到细胞中。根据本发明，细胞可以形成器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，核酸的施用以裸核酸实现或与施用试剂组合来实现。优选地，核酸的施用以裸核酸的形式进行。优选地，RNA与稳定化物质如RNA酶抑制剂组合施用。本发明还设想将核酸重复引入到细胞中以允许持续表达的时间段延长。
可以用可与RNA缔合的任何载体来转染细胞，例如，通过与RNA形成复合物或形成其中封装或包封RNA的囊泡，从而导致与裸RNA相比RNA的稳定性提高。可用的载体包括例如含脂质载体例如阳离子脂质、脂质体，特别是阳离子脂质体，以及胶束和纳米颗粒。阳离子脂质可与带负电荷的核酸形成复合物。可使用任何阳离子脂质。
优选地，将编码肽或多肽的RNA引入细胞，特别是在体内存在的细胞中，导致所述肽或多肽在细胞中表达。在一些具体实施方案中，优选将核酸靶向特定细胞。在这样的实施方案中，适用于将核酸施用于细胞的载体(例如，逆转录病毒或脂质体)展示靶向分子。例如，可以将分子例如对靶细胞上表面膜蛋白具有特异性的抗体或靶细胞上受体的配体并入到核酸载体中或可使其与核酸载体结合。在通过脂质体施用核酸的情况下，可将与和胞吞相关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入到脂质体制剂中，以能够靶向和/或摄取。这样的蛋白质包括对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内在化蛋白质的抗体、靶向细胞内位置的蛋白质等。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选是完整细胞，即未释放其正常细胞内组分如酶、细胞器或遗传物质的具有完整膜的细胞。完整细胞优选地是有生存力的细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，所述术语涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。术语“细胞”包括原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。外源核酸在细胞内可以如下存在：(i)本身自由分散、(ii)并入重组载体中或(iii)整合到宿主细胞基因组或线粒体DNA中。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞。细胞可来源于大量组织类型并且包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。在另一些实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或多肽。
术语“克隆扩增”是指其中使特定实体倍增的过程。在本发明的上下文中，该术语优选在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
例如“降低”或“抑制”的术语涉及引起在水平上优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，并且最优选75％或更大的总体降低的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全的抑制，即降低到零或基本上降低到零。
例如“提高”、“增强”、“促进”或“延长”的术语优选地涉及提高、增强、促进或延长约至少10％，优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少80％、优选至少100％、优选至少200％，并且特别是至少300％。这些术语还可涉及从零或者不可测量或不可检测的水平提高、增强、促进或延长至超过零的水平或者可测量或可检测的水平。
根据本发明，术语“肽”指这样的物质，其包含两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或更多个并且多至优选8、10、20、30、40或50个、特别是100个通过肽键共价连接的氨基酸。术语“多肽”或“蛋白质”指大的肽，优选指具有多于100个氨基酸残基的肽，但一般而言，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是同义词，并且在本文中可互换使用。根据本发明，与肽、多肽或蛋白质相关的术语“修饰”或“序列变化”指与亲本序列(例如野生型肽、多肽或蛋白质的序列)相比的肽、多肽或蛋白质的序列变化。该术语包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和氨基酸替换变体，优选氨基酸替换变体。根据本发明的所有这些序列变化都可潜在地产生新表位。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或者两个或更多个氨基酸。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、4或5个或者更多个氨基酸的氨基和/或羧基末端融合。
氨基酸缺失变体以从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如以去除1、2、3、4或5个或者更多个氨基酸为特征。
氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除并且在其位置插入另一个残基。
根据本发明，用于本发明方法中的测试的修饰或经修饰肽可来源于包含修饰的蛋白质。
根据本发明，术语“来源于”意指特定实体，特别是特定肽序列存在于其所来源于的物体中。在氨基酸序列，特别是特定序列区域的情况下，“来源于”特别地意指相关氨基酸序列来源于其所存在的氨基酸序列。
一旦通过本文所述的方法确定了合适的剂量，通过以合适剂量施用免疫治疗剂，免疫治疗剂可用于治疗患有疾病的对象，所述疾病例如以存在表达抗原和呈递抗原肽的病变细胞为特征的疾病。特别优选的疾病是癌症疾病。本文所述的免疫治疗剂还可用于免疫或疫苗接种以预防本文所述的疾病。
一种这样的免疫治疗剂是基于仅在癌细胞中表达的新表位设计的疫苗，例如癌症疫苗。
根据本发明，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答，特别是细胞免疫应答的药物制剂(药物组合物)或产品，所述免疫应答识别和攻击病原体或病变细胞如癌细胞。疫苗可用于预防或治疗疾病。术语“个性化癌症疫苗”或“个体化癌症疫苗”涉及特定癌症患者并且意味着癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
根据本发明提供的癌症疫苗在施用于患者时可提供适用于刺激、致敏和/或扩增对患者的肿瘤具有特异性的T细胞的一个或更多个T细胞表位。T细胞优选地针对表达T细胞表位所源自的抗原的细胞。因此，本文中描述的疫苗优选能够诱导或促进针对以用I类MHC呈递一种或更多种肿瘤相关新抗原为特征的癌症疾病的细胞应答，优选细胞毒性T细胞活性。由于本文提供的疫苗靶向癌症特异性突变，其将对患者的肿瘤具有特异性。
在本发明的一个实施方案中，疫苗涉及这样的疫苗，其在向患者施用时优选提供一个或更多个T细胞表位(新表位、合适的新表位、本文鉴定的合适的新表位的组合)，例如2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个且优选多至60个、多至55个、多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个T细胞表位，所述T细胞表位并入预测为合适表位的氨基酸修饰或修饰肽。通过患者的细胞，特别是抗原呈递细胞呈递这些表位优选地导致T细胞在与MHC结合时靶向所述表位并且因此靶向表达所述T细胞表位所源自的抗原和在肿瘤细胞表面上呈递相同表位的患者肿瘤，优选原发性肿瘤以及肿瘤转移瘤。
可以采取进一步的步骤来确定所鉴定的氨基酸修饰或含有表位用于癌症疫苗接种的修饰肽的可用性。因此，进一步的步骤可以包括以下中的一个或更多个：(i)评估修饰是否位于已知或预测的MHC呈递表位中；(ii)在体外和/或通过计算机(in silico)测试修饰是否位于MHC呈递表位中，例如，测试修饰是否是被加工成MHC呈递表位和/或呈现为MHC呈递表位的肽序列的一部分；以及(iii)在体外测试所设想的经修饰表位是否能够刺激具有期望特异性的T细胞，例如患者的T细胞，特别是当存在于其天然序列环境中时，例如当侧翼为在天然存在蛋白质中也侧接所述表位的氨基酸序列时，并且当在抗原呈递细胞中表达时。这样的侧翼序列各自可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。
根据本发明确定的经修饰肽可以按其作为用于癌症疫苗接种的表位的可用性来排序。因此，在一个方面，可以使用人工或基于计算机的分析方法，在所述分析方法中对所鉴定的经修饰肽进行分析并针对其在待提供的各种疫苗中的可用性进行选择。在一个优选的实施方案中，所述分析方法是基于计算算法的方法。优选地，所述分析方法包括确定表位和/或根据其具有免疫原性的能力的预测来对其进行排序。
根据本发明鉴定并在疫苗中提供的表位优选以包含所述表位的多肽(例如多表位多肽)或编码所述多肽的核酸(特别是RNA)的形式存在。此外，表位可以以疫苗序列的形式存在于多肽中，即存在于其天然序列环境中，例如侧翼为在天然存在的蛋白质中也侧接所述表位的氨基酸序列。这样的侧翼序列各自可包含5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。因此，疫苗序列可包含20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸。在一个实施方案中，表位和/或疫苗序列在多肽中头对尾排列。
在一个实施方案中，本文中鉴定的表位和/或疫苗序列通过接头，特别是中性接头隔开。在本发明的上下文中使用的术语“接头”涉及在两个肽结构域(例如表位或疫苗序列)之间添加的肽以连接所述肽结构域。关于接头序列没有特别限制。然而，优选地，接头序列减小了两个肽结构域之间的空间位阻，被很好地翻译并且支持或允许表位加工。此外，接头应当不具有或仅具有很少的免疫原性序列元件。接头优选地不应当产生非内源性表位，如由相邻表位之间的接合缝(junction suture)产生的那些，这可能产生不想要的免疫反应。因此，多表位疫苗应优选地包含能够降低不想要的MHC结合接合表位数目的接头序列。Hoyt等(EMBO J.25(8)，1720-9，2006)和Zhang等(J.Biol.Chem.，279(10)，8635-41，2004)已经表明，富含甘氨酸的序列会损害蛋白酶体加工，并且因此使用富含甘氨酸的接头序列可以最大限度地减少可由蛋白酶体加工的包含接头的肽的数量。此外，观察到甘氨酸抑制MHC结合沟位置中的强结合(Abastado等，1993，J.Immunol.151(7)：3569-75，1993)。Schlessinger等，2005，Proteins 61(1)：115-26，2005已发现氨基酸序列中包含的氨基酸甘氨酸和丝氨酸导致更有效地翻译和被蛋白酶体加工的更具柔性的蛋白质，从而使得能够更好地接近编码的表位。接头各自可包含3个或更多个、6个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸。优选地，接头富含甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。优选地，接头的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。在一个优选的实施方案中，接头基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e，其中a、b、c、d和e独立地为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数，并且其中a+b+c+d+e不为0且优选为2或更大、3或更大、4或更大或者5或更大。在一个实施方案中，接头包含如本文中描述的序列，包括实例中描述的接头序列，例如序列GGSGGGGSG。
在一个特别优选的实施方案中，并入一个或更多个新表位的多肽(例如多表位多肽)是能够以核酸，优选RNA例如体外转录或合成RNA的形式向患者施用的免疫治疗剂，该核酸可在患者的细胞例如抗原呈递细胞中表达以产生多肽。还设想施用一种或更多种多表位多肽，其出于本发明的目的被术语“多表位多肽”所包括，其优选以核酸，优选RNA如体外转录或合成RNA的形式，其可在患者的细胞如抗原呈递细胞中表达以产生一种或更多种多肽。在施用多于一种多表位多肽的情况下，由不同多表位多肽提供的合适的新表位可不同或部分重叠。一旦存在于患者的细胞如抗原呈递细胞中，根据本发明的多肽被加工以产生根据本发明鉴定的合适的新表位。施用根据本发明提供的疫苗可提供MHC II类呈递表位，所述表位能够引发针对表达MHC呈递表位所源自的抗原之细胞的CD4+辅助T细胞应答。作为替代或补充，施用根据本发明提供的疫苗可提供MHC I类呈递的新表位，所述新表位能够引发针对表达MHC呈递新表位所源自的抗原之细胞的CD8+T细胞应答。此外，施用根据本发明提供的疫苗可提供一个或更多个新表位(包括已知的新表位和根据本发明鉴定的合适的新表位)以及一个或更多个不包含癌症特异性体细胞突变但是由癌细胞表达并且优选诱导针对癌细胞的免疫应答，优选癌症特异性免疫应答的表位。在一个实施方案中，根据本发明提供的疫苗的施用提供了新表位，其是MHC II类呈递的表位和/或能够引发针对表达MHC呈递表位所来源的抗原的细胞的CD4+辅助T细胞应答，以及不含癌症特异性体细胞突变的表位，其是MHC I类呈递的表位和/或能够引发针对表达MHC呈递表位所来源的抗原的细胞的CD8+T细胞应答。在一个实施方案中，不含癌症特异性体细胞突变的表位来源于肿瘤抗原。在一个实施方案中，不含癌症特异性体细胞突变的新表位和表位在癌症治疗中具有协同作用。优选地，根据本发明提供的疫苗可用于细胞毒性和/或辅助T细胞应答的多表位刺激。
根据本发明提供的疫苗可以是重组疫苗。
本发明上下文中的术语“重组的”意指“通过遗传工程制备的”。优选地，在本发明的上下文中的“重组实体”(例如重组多肽)不是天然存在的，并且优选是不天然组合的实体(例如氨基酸或核酸序列)组合的结果。例如，在本发明的上下文中的重组多肽可包含来源于不同蛋白质或者同一蛋白质的不同部分的数个氨基酸序列如新表位或疫苗序列，其例如通过肽键或合适接头融合在一起。
本文使用的术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括癌症疾病，特别是本文所述的那些形式的癌症疾病。
术语“正常”是指健康状态，或者健康对象或组织中的状况，即非病理状况，其中“健康”优选意指非癌性的。
“涉及表达抗原的细胞的疾病”意指在病变组织或器官的细胞中检测到抗原的表达。与健康组织或器官中的状态相比，在病变组织或器官的细胞中的表达可提高。提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，只在病变组织中发现表达，而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明，涉及表达抗原的细胞或与之相关的疾病包括癌症疾病。
癌症(医学术语：恶性赘生物)是一类这样的疾病，其中一组细胞显示出不受控制的生长(分裂超出正常范围)、侵袭(侵入和破坏邻近组织)和有时转移(通过淋巴或血液扩散至身体的其他位置)。这三种癌症的恶性特征将它们与具有自限性且不会侵袭或转移的良性肿瘤区分开。大多数癌症形成肿瘤，但有些癌症(例如白血病)则不会。
恶性肿瘤基本上与癌症同义。恶性(malignancy)、恶性赘生物和恶性肿瘤基本上与癌症同义。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长，优选形成肿胀或病灶。“肿瘤细胞”意指通过快速的不受控制的细胞增殖生长并在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失，并且通常形成独特的组织团块，其可能是良性的、恶变前的或恶性的。
良性肿瘤是缺乏癌症的所有三种恶性特征的肿瘤。因此，根据定义，良性肿瘤不会以无限的，侵略性的方式生长，不侵袭周围组织，并且不会扩散至非相邻组织(转移)。
赘生物是瘤形成引起的异常组织块。瘤形成(neoplasia，希腊语的新生长)是细胞的异常增殖。细胞的生长超过其周围的正常组织的生长并且与之不协调。即使在刺激停止后，生长仍以同样过度的方式持续存在。这通常会导致肿块或肿瘤。赘生物可能是良性的，恶变前的或恶性的。
在本发明的上下文中，“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”涉及肿瘤增大其尺寸的趋势和/或肿瘤细胞增殖的趋势。
出于本发明的目的，术语“癌症”和“癌症疾病”与术语“肿瘤”和“肿瘤疾病”可互换使用。
癌症根据类似于肿瘤和因此被认为是肿瘤的起源的组织的细胞类型进行分类。这些分别是组织学和位置。
根据本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌，及其转移。其实例是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌，或上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移和癌症复发。
“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散至身体的另一部分。转移的形成是很复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离，侵袭细胞外基质，渗透内皮基底膜以进入体腔和血管，以及然后在通过血液转运后浸润靶器官。最终，在靶位点的新肿瘤，即继发性肿瘤或转移性肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后，也经常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可能保留并发展转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域性淋巴结系统的转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞与原始肿瘤中的细胞类似。这意味着，例如，如果卵巢癌转移至肝脏，则继发性肿瘤由异常卵巢细胞而不是异常肝细胞构成。肝中的肿瘤然后被称为转移性卵巢癌，而不是肝癌。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”涉及从原发性肿瘤或肿瘤转移瘤脱离并且在血流中循环的细胞。CTC可构成随后在不同组织中生长另外的肿瘤(转移)的种子。循环肿瘤细胞以约1至10个CTC/mL全血的频率存在于患有转移性疾病的患者中。已开发了研究方法来分离CTC。本领域中已描述了若干种研究方法来分离CTC，例如使用上皮细胞通常表达细胞黏附蛋白EpCAM(其在正常血细胞中不存在)的这一事实的技术。基于免疫磁珠的捕获涉及用已与磁性颗粒缀合的针对EpCAM的抗体处理血液试样，随后在磁场中分离标记的细胞。然后，将分离的细胞用针对另一上皮标志物细胞角蛋白和常见的白细胞标志物CD45的抗体染色，以使罕见的CTC与污染白细胞区分开来。这种稳健且半自动化的方法以平均产量为约1个CTC/mL且纯度为0.1％鉴定CTC(Allard等，2004，Clin Cancer Res10：6897-6904)。用于分离CTC的第二种方法使用基于微流体的CTC捕获装置，其涉及使全血流过嵌入有80,000个微柱的室，所述微柱通过用针对EpCAM的抗体包被而变得具有功能性。CTC然后用针对细胞角蛋白或组织特异性标志物(例如前列腺癌中的PSA或乳腺癌中的HER2)的二抗进行染色，并且通过沿着三维坐标在多个平面中自动化扫描微柱来可视化。CTC芯片能够以50个细胞/ml的中值产量和1％至80％的纯度来鉴定患者中的细胞角蛋白化阳性循环肿瘤细胞(Nagrath等，2007，Nature450：1235-1239)。用于分离CTC的另一种可能性是使用来自Veridex，LLC(Raritan，NJ)的CellSearchTM循环肿瘤细胞(CTC)测试，其对血管中的CTC进行捕获、鉴定和计数。CellSearchTM系统是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于全血中CTC计数的方法，其是基于免疫磁性标记和自动化数字显微术的组合。存在文献中描述的用于分离CTC的其他方法，所有这些方法均可以与本发明结合使用。
当个体再次受到过去影响其的病症影响时，出现复发或再现。例如，如果患者曾患有肿瘤疾病，已经接受所述疾病的成功治疗，并且再次发生所述疾病，则所述新发生的疾病可认为是复发或再现。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再现可以但不一定发生在原始肿瘤疾病的部位。因此，例如，如果患者曾患有卵巢肿瘤并且已接受了成功治疗，则复发或再现可为在与卵巢不同的部位处出现卵巢肿瘤或出现肿瘤。肿瘤的复发或再现还包括其中肿瘤出现在与原始肿瘤部位不同的部位和出现在原始肿瘤部位的情况。优选地，患者已经接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，并且在与原始肿瘤部位不同的部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病或病症。设计用于引发或扩大免疫应答的免疫治疗被分类为活化免疫治疗，而降低或抑制免疫应答的免疫治疗被分类为抑制免疫治疗。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种，或者肿瘤免疫接种或肿瘤疫苗接种。术语“免疫治疗”还涉及免疫应答的操纵，以使得在自身免疫病如风湿性关节炎、变态反应、糖尿病或多发性硬化的情况下，将不合适的免疫应答调节成更合适的免疫应答。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”捕述了向个体施用抗原以诱导免疫应答的过程，例如，出于治疗或预防的原因。
“治疗”是指向对象施用免疫治疗剂或包含如本文所述免疫治疗剂的组合物以预防或消除疾病，包括降低对象的肿瘤的尺寸或肿瘤的数量；遏止或减缓对象的疾病；抑制或减缓对象中新疾病的发展；降低目前患有或先前患有疾病的对象的症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长(即增加)对象的寿命。特别地，术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制进展或恶化，或预防或延迟疾病或其症状的发作。
“处于危险中”是指对象，即患者，与一般人群相比，被鉴定为具有高于正常的发生疾病，特别是癌症的机会。另外，曾经患有或当前患有疾病，特别是癌症的对象是具有提高的发生疾病的风险的对象，因为这样的对象可能继续发展疾病。目前患有或曾经患有癌症的对象也具有提高的癌症转移风险。
预防性施用免疫治疗，例如预防性施用免疫治疗剂或包含免疫治疗剂的组合物，优选保护接收者免于疾病的发展。治疗性施用免疫治疗，例如治疗性施用免疫治疗剂，可导致抑制疾病的进展/生长。这包括使疾病进展/生长减速，特别是破坏疾病进展，其优选地导致疾病的消除。
可以使用多种技术中的任一种进行免疫治疗，其中本文提供的试剂用于从患者去除病变细胞。这种去除可以由于在患者中增强或诱导对抗原或表达抗原的细胞具有特异性的免疫应答而发生。
免疫治疗剂和组合物可以单独使用或与常规治疗方案组合使用，例如手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或不相关的)。
术语“体内”涉及对象体内的情况。
术语“对象”、“个体”、“有机体”或“患者”涉及脊椎动物，特别是哺乳动物，并且在本文中可交换使用。例如，在本发明上下文中的哺乳动物是人；非人灵长类动物；家养动物，例如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等；实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等；以及圈养动物，例如动物园的动物。术语还涉及非哺乳动物脊椎动物，例如鸟类(特别是家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡)，并且涉及鱼类(特别是养殖鱼，例如鲑鱼或鲶鱼)。如本文所用的术语“动物”还包括人。
术语“自体”用于描述源自相同对象的任何事物。例如，“自体移植”是指源自相同对象的组织或器官的移植物。这些方法是有利的，因为它们克服了免疫屏障，否则会导致排斥。
术语“异源”用于描述由多种不同元素组成的某物。例如，将个体的骨髓转移至不同的个体构成了异源移植。异源基因是来源于不同于对象的来源的基因。
作为用于免疫或疫苗接种的组合物的一部分，优选将一种或更多种免疫治疗剂与一种或更多种佐剂一起施用，用于诱导免疫应答或用于提高免疫应答。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。本发明的组合物优选发挥其作用而无需添加佐剂。尽管如此，本申请的组合物可含有任何已知的佐剂。佐剂包括异质化合物组、例如油乳剂(例如弗氏佐剂)、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产物(例如百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)毒素)、脂质体和免疫刺激复合物。佐剂的实例是单磷酰基-脂质-A(MPLSmithKline Beecham)。皂苷例如QS21(SmithKline Beecham)，DQS21(SmithKlineBeecham；WO 96/33739)，QS7，QS17，QS18和QS-L1(So等，1997，Mol.Cell 7：178-186)，不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂，维生素E，montanid，明矾，CpG寡核苷酸(Krieg等，1995，Nature374：546-549)，以及由生物可降解油例如角鲨烯和/或生育酚制备的多种油包水乳液。
还可以施用刺激患者免疫应答的其他物质。例如，由于细胞因子对淋巴细胞的调节特性，因此可以在疫苗接种中使用细胞因子。这样的细胞因子包括例如白介素-12(IL-12)，其显示提高疫苗的保护作用(参见Hall，1995，IL-12at the crossroads，Science268：1432-1434)；GM-CSF和IL-18。
存在许多增强免疫应答因此可用于疫苗接种的化合物。所述化合物包含以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子，例如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)。
根据本发明，“肿瘤试样”是这样的样品，例如包含肿瘤或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))的身体样品，特别是包含体液的组织样品，和/或细胞样品。根据本发明，“非肿瘤试样”是这样的样品，例如不含肿瘤或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))的身体样品，特别是包含体液的组织样品，和/或细胞样品。这样的身体样品可以以常规方式获得，例如通过组织活检(包括穿孔活检)，以及通过采血、支气管抽吸物、痰、尿、粪便或其他体液。根据本发明，术语“样品”还包括经加工的样品，例如生物样品的级分或分离物，例如核酸或细胞分离物。
本文所述的免疫治疗剂及其组合物可通过任何常规途径施用，包括通过注射或输注施用。施用可以例如经口、经静脉内、经腹膜内、经肌内、经皮下或透皮进行。在一个实施方案中，施用经结内进行，例如通过注射至淋巴结中。其他形式的施用设想用本文所述的核酸体外转染抗原呈递细胞例如树突细胞，随后施用抗原呈递细胞。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
本发明的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂、载体和任选地其他治疗剂。优选地，本发明的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
术语“赋形剂”旨在表示在药物组合物中但不是活性成分的所有物质，例如黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释试剂和/或稀化剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮和/或混合介质中的任意一种或更多种。
术语“载体”涉及适用于向人施用的一种或更多种相容性固体或液体填充剂或稀释剂。术语“载体”涉及天然或合成的有机或无机组分，其与活性组分组合以促进活性组分的应用。优选地，载体组分是无菌液体，例如水或油，包括来源于矿物油、动物或植物的那些，例如花生油、大豆油、芝麻油、向日葵油等。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作水性载体化合物。
用于治疗用途的可药用载体或稀释剂在制药领域中是公知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.RGennaro编辑.1985)中。合适的载体的一些实例包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
可以根据预期的施用途径和标准药学实践选择药用载体、赋形剂或稀释剂。本发明的药物组合物可包含以下作为载体、赋形剂或稀释剂或者除载体、赋形剂或稀释剂之外还可以包含以下：任何合适的黏合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或增溶剂。合适的黏合剂的一些实例包括淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖(free-flowlactose)、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的一些实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至矫味剂。防腐剂的一些实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和助悬剂。
在一个实施方案中，所述组合物是水性组合物。水性组合物可任选地包含溶质，例如盐。在一个实施方案中，所述组合物是冻干组合物的形式。冻干组合物可通过冷冻干燥相应的水性组合物获得。
通过附图和实施例对本发明进行详细描述和说明，附图和实施例仅仅用于举例说明目的，并且不意味着是限制性的。由于描述和实施例，技术人员可理解同样包括在本发明中的另外的实施方案。
附图说明
图1a-1f是示出向15名个体患者施用不同剂量的四价RNA(LIP)疫苗之前(pre)和之后(2、6、24和48小时)，全身淋巴细胞计数(图1a)、全身血小板计数(图1b)和全身血清细胞因子水平(IFN-α、IL-6、IFN-γ、IP-10)(分别为图1c-1f)的直方图。描述的是重复的平均值。V＝就诊，而V2代表第1次施用，V3代表第2次施用，V4代表第3次施用，V5代表第4次施用，V6代表第5次施用，V7代表第6次施用，V8代表第7次施用，V9代表第八次施用。第I组患者仅接受6次施用(V2至V7)。根据标准方法进行血液取样和分析。
图2a-2h是示出分离的PBMC与RNA-脂质体制剂一起孵育6小时之后(实心点)和孵育24小时之后(空心点)的细胞因子表达量的直方图。单个数据点是一式三份实验的平均值。
图3a-3h是示出全血与RNA-脂质体制剂一起孵育6小时之后(实心点)和孵育24小时之后(空心点)的细胞因子表达量的直方图。单个数据点是来自一式三份实验的平均值。
图4a-4c是示出在全血(实心圆圈)、富含pDC(实心方块)和iDC(实心三角形)的全血中孵育RNA-脂质体制剂6小时之后细胞因子表达量的直方图。单个数据点是一式三份实验的平均值。
图5a-5c是示出在全血(实心圆圈)、富含pDC(实心方块)和pDC(实心三角形)的全血中孵育RNA-脂质体制剂24小时后细胞因子表达量的直方图。单个数据点是一式三份实验的平均值。
图6a-6j是示出在PBMC与TLR-7小分子激动剂一起孵育之后24小时之后，细胞因子表达量的直方图，实心圆圈：N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H)-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(SM1)；空心圆圈：N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(SM2)。
图7a-7j是示出在全血与TLR-7小分子激动剂一起孵育之后24小时之后，细胞因子表达量的直方图，实心圆圈：N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(SM1)；空心圆圈：N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(SM2)。
图8a-8e是示出通过在PBMC与TLR-7的小分子激动剂一起孵育之后24小时之后的相对CD69表达所测量的特定免疫细胞的活化水平的直方图，实心圆圈：N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(SM1)；空心圆圈：N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(SM2)。
图9a-9e是示出通过在全血与TLR-7的小分子激动剂一起孵育之后24小时之后的相对CD69表达所测量的特定免疫细胞的活化水平的直方图，实心圆圈：N-(4-(4-氨基)-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(SM1)；空心圆圈：N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(SM2)。
图10a-10kk是示出在静脉内施用小分子TLR-7激动剂N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(SM1)后的时间点雄性或雌性食蟹猴血液中的细胞因子分泌水平的图。
图11a-11m是示出在静脉内施用小分子TLR-7激动剂N-(4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(SM3)后的时间点雄性食蟹猴血液中的细胞因子分泌水平的图。
图12a-12f是示出分离自不同人个体的PBMC与TLR-8的小分子激动剂2-乙基-1-(4-((2-甲基四氢呋喃-3-基)氨基)丁基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(SM4)一起孵育24小时之后的细胞因子表达量的图。
图13a-13h是示出分离自不同人个体的PBMC与TLR-8的小分子激动剂1-(4-(环己基氨基)丁基)-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(SM5)一起孵育24小时之后的细胞因子表达量的图。
实施例1
在经批准的介入性I期临床试验(NCT02410733)中，在第1(V2)、8(V3)、15(V4)、22(V5)、29(V6)、36(V7)、50(V8)和64天(V9)(患者1、2和3仅在第1、8、15、22、29、43天)通过静脉内施用用增加量的纳米微粒脂质体配制的基于RNA的免疫治疗来治疗15名患有恶性黑素瘤的人患者。免疫治疗包含四种单独的RNA-lipoplex(RNA(LIP))产物，每种编码一种黑素瘤相关抗原，其在静脉内施用后产生有效的TLR7-触发的I型干扰素驱动的免疫活化和T细胞刺激。用增加的剂量水平治疗患者，对于首个疫苗接种周期，开始于7.2μg总RNA；对于第二个疫苗接种周期，14.4μg总RNA；对于剩余的疫苗接种周期，分别达29、50、75或100μg总RNA。
在每个疫苗接种周期之前和之后评估并报告生命体征和不利事件/严重不利事件(副作用)。在各个疫苗接种周期(在RNA(LIP)施用之后第0(接种前)、2、6、24和48小时(h))，获得血液样品用于血液学分析和全身性细胞因子测量。确定每位患者的淋巴细胞计数(图1a)、血小板计数(图1b)和血清细胞因子表达水平(图1c-1f)。
第一位患者(女性，1982年出生)在施用免疫治疗后数小时内经历了通常与免疫系统激活相关的症状，例如头痛、疲劳、战栗和发热。这些症状是剂量依赖性的，并且在14.4μg的剂量下(第二个疫苗接种周期)观察到。用29μg RNA处理(第3个接种周期)后，另外观察到中度发热相关的心动过速和低血压。通过施用对乙酰氨基酚可以容易地控制所观察到的症状，然而对于该患者的剩余疫苗接种周期，导致剂量降低至14.4μg总RNA。观察到的血液学变化包括全身淋巴细胞和凝血细胞的可逆剂量依赖性降低，以及全身IFN-α、IL-6、IFN-γ的轻微瞬时提高和IP-10的强烈分泌。这些观察结果与所认为的RNA(LIP)免疫治疗的作用模式一致，并证实了从广泛的临床前研究中观察到的结果。
第二名患者(女性，1947年出生)非常好地耐受所有三个剂量水平下的免疫治疗(疫苗接种)施用，没有观察到与免疫治疗有关的不利事件。此外，除了以剂量依赖性方式的IFN-γ和IL-6的轻微瞬时提高以及显著的IP-10分泌外，仅检测到轻微的血液学变化。然而，与第一名患者相比，总分泌细胞因子量显著降低，如图1c-1f所示。
在研究者的判断下，第三名患者(男性，1950年出生)在所有三种剂量水平下均非常好地耐受免疫治疗施用，其中在施用前和施用后共同施用对乙酰氨基酚。对于该患者，在第3个疫苗接种周期(29μg)之后的轻度发热(其在24小时内消退)是观察到的唯一临床症状。与第一名患者一样，观察到全身淋巴细胞的剂量依赖性瞬时降低(尽管程度较轻)和IFN-α、IFN-γ和IP-10的剂量依赖性瞬时增加，而全身IL-6的量显著高于第一和第二名患者，但也在24小时内完全逆转。
第四名患者(女性，1971年出生)在分别施用7.2μg或14.4μg总RNA之后数小时内经历了通常与免疫系统激活相关的症状，例如头痛、疲劳和寒战。在这两种剂量下，均检测到循环淋巴细胞的轻微瞬时降低，并且观察到与第一名患者相当的IFN-γ、IP-10和IFN-α的中度瞬时剂量依赖性细胞因子诱导，而IL-6增加在施用14.4μg之后略高，并且与第三名患者的细胞因子水平较为相当。
第五名患者(男性，1980年出生)非常好地耐受免疫治疗的施用，其中在第二个疫苗接种周期(14.4μg)之后体温轻微升高，在第三个疫苗接种周期(14.4μg)之后有轻微的关节疼痛。尽管血小板计数没有显著受到影响，但在使用14.4μg的第二个疫苗接种周期之后观察到中度但完全瞬时的淋巴细胞减少症。几乎没有观察到全身细胞因子的增加，除了在第二个疫苗接种周期之后的IP-10分泌的边际化和完全可逆的提高，其与其他五名患者相比是最低的。
第六名患者(女性，1974年出生)非常好地耐受免疫治疗的施用。对于该患者，寒战、头痛和四肢疼痛(皆为轻微的)是施用14.4μg(第二个疫苗接种周期)后报告的唯一临床观察到的不利事件。此外，观察到血小板和淋巴细胞的完全可逆的轻微剂量依赖性降低。此外，在第二个疫苗接种周期(14.4μg)之后检测到全身IFN-α和IFN-γ的轻微剂量依赖性提高，后者的强度与第一和第四名患者相当。
同样地，对于患者7、8、9、10、11、12、14、15和16(年龄范围27至75岁)观察到针对RNA(LIP)治疗的个体间敏感性。这通过不同的血液学变化强度和不同的全身细胞因子水平的瞬时诱导反映，特别是在剂量≥29μg总RNA和与重复RNA(LIP)给药相关的发散的不利事件谱时。尽管大多数患者在达75和100μg总RNA的剂量下也能够非常好地耐受重复RNA(LIP)，但所选的患者在用100μg RNA(LIP)治疗后经历严重发热(患者16)，或在7.2μg(患者11)、14.4μg(患者10)和75或100μg总RNA(LIP)(患者16)治疗后经历高血压恶化。
不仅基于15名患者中每种剂量下经历的观察到的不利事件之间的差异，还基于施用免疫治疗之后不同时间点时的血液学变化和血清细胞因子表达水平的个体间差异，数据清楚地表明在相同剂量下施用相同免疫治疗剂后，不同个体的诱导免疫反应的强度不同。
实施例2
以下研究的目的是通过测量细胞和与脂质体复合的编码某些肿瘤抗原的RNA分子(RNALIP)接触后某些细胞因子的表达，获得有关分离的外周血单核细胞(PBMC)或全血中的细胞的体外活化的信息。编码的抗原是NY-ESO1，在多种肿瘤中表达的癌抗原(RBL001.1)；酪氨酸酶(RBL002.2)；MAGE-A3，黑素瘤相关抗原(RBL003.1)；和TPTE，酪氨酸-蛋白磷酸酶(RBL004.1)。
在本研究的第一部分中，将从健康供体获得的人肝素化全血和PBMC(从肝素化全血中分离)的样品与脂质体配制的RBL001.1、RBL002.2、RBL003.1和RBL004.1的等份的混合物接触。为了获得关于树突细胞(DC)在全血中与细胞因子分泌相关的作用的信息，在该研究的第二部分中，使肝素化的全血富含浆细胞样DC(pDC)或单核细胞来源的未成熟DC(iDC)并随后与脂质体配制的RNA分子(RNA-LIP)一起孵育。
作为该研究的这两个部分中的主要终点，通过分析培养上清液中的细胞因子表达，在接触之后6小时和24小时确定这些细胞的活化。对于该研究的第一部分，已经分析了以下细胞因子：IP-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12和IFN-α2。在该研究的第二部分中，仅分析了IP-10、IL-6和IFN-α2。
在与四种不同RNA-LIP组合物接触的培养的PBMC中，观察到所有可检测细胞因子的剂量依赖性诱导(图2a-2h)。如图3a-3h所示，在能够检测其表达的全血中，细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-12的水平没有改变。而且，与稀释剂对照相比，IFN-α2在全血中在任何剂量下均没有显著增加。然而，观察到趋化因子IP-10(CXCL10)在全血中以剂量依赖性方式上调。在仅从四个供体中之一获得的细胞中并且仅在低水平下观察到全血中IL-6的诱导增加。
在使用富含树突细胞的全血的研究中，还观察到IP-10、IFN-α2和IL-6的剂量依赖性诱导。
从分离的PBMC观察到的结果显示出与全血相比的一些差异，表明具有分离的PBMC的测试系统具有更高的灵敏度。在分离的PBMC的情况下，观察到所测试的细胞因子的细胞因子水平提高，而在全血中的PBMC的情况下，细胞因子检测限于IFN-α2、IP-10和IL-6。在本研究的第二部分中，通过富含不同类型的DC来提高全血中的细胞因子分泌，表明DC是摄取RNA-脂质体复合物的主要细胞类型。基于该数据，可以假设pDC是全血中用于脂质体配制的RNA摄取的主要细胞类型，因为富含有新鲜pDC导致IFN-α2分泌提高。
此外，这些结果清楚地显示出响应于使免疫治疗剂(RNA-LIP)在相同剂量下与个体的免疫反应性物质(PBMC、全血和富含DC的全血)接触的多种免疫反应中的显著个体差异。
材料：
研究中使用的材料及其各自的来源如下：Customer 7-plex(Cat.：L5002JFHHC)，IFN-α2single Plex(Cat.：171-B6010M)，IP-10single Plex(Cat.：171-B5020M)，IL-6single Plex(Cat.：171-B5006M)，细胞因子标准品第II组(Cat.：171-D60001)，细胞因子标准品第I组(Cat.：171-D50001)，Bio-Plex Pro试剂盒(Cat.：171-304070M)，均获自Bio-Rad Laboratories GmbH；丙酮酸钠(Cat.：11360-039)，非必需氨基酸(Cat.：11140-035)，青霉素-链霉素(Cat.：15140-122)，HEPES(Cat.：15360-056)，RPMI-1640+GlutamaxTM(Cat.：61870-010)，均获自Invitrogen，人血清AB型获自LONZA；IL-4(Cat.No.：130-093-924)，CD14-珠(Cat.：130-050-201)，CD304-珠(Cat.：130-090-532)，均获自MiltenyiBiotech GmbH；Leucomax，莫拉司亭(Molgramostim)(rHuman GM-CSF)获自Novartis；以及Ficoll-Paque PLUS(Cat.：17-1440-03)获自GE Healthcare。方法：
将来自健康志愿者的全血收集至无菌注射器中。使用肝素作为抗凝剂。使用肝素化的全血通过在Ficoll-Paque上的密度离心来产生PBMC。通过使用从全血分离的新鲜制备的PBMC分离iDC，并通过基于磁珠的分离来分离CD14+单核细胞。通过使用从全血分离的新鲜制备的PBMC分离pDC，并通过基于磁珠的分离来分离pDC。
对于本研究的第一部分，从健康供体(n＝4)收集肝素化全血。一部分全血用于产生PBMC。随后，将PBMC重悬在培养基中并接种在96孔板中。详细地，以每孔180μL接种5×105个PBMC/每个剂量组。然后添加20μL含有脂质体复合的RNA(RNA-脂质体混合物)的溶液，以使最终体积达到200μL(1∶10稀释的每种溶液)，最终细胞密度为2.5×106个PBMC/mL。对于所有受测剂量，数据一式三份地产生。将从相同供体获得的剩余全血直接移液至96孔板的孔中。详细地，对于所有剂量组，将180μL全血一式三份接种，并添加20μL含有脂质体复合RNA的溶液，以达到200μL的最终体积和1∶10稀释的掺料溶液。下表1和表2总结了各个测试样品：
表1：该研究第一部分的剂量组(分离的PBMC)
剂量组 测试系统 测试项/IVT RNA 最终剂量(μg RNA/ml)
#1 PBMC RNA-脂质体混合物 3.33
#2 PBMC RNA-脂质体混合物 1.111
#3 PBMC RNA-脂质体混合物 0.370
#4 PBMC RNA-脂质体混合物 0.123
#5 PBMC RNA-脂质体混合物 0.041
#6 PBMC RNA-脂质体混合物 0.014
对照 PBMC 稀释剂/NaCl(0.9％) 0
表2：该研究的第一部分的剂量组(全血)
剂量组 测试系统 测试项/IVT RNA 最终剂量(μg RNA/ml)
#1 全血 RNA-脂质体混合物 3.33
#2 全血 RNA-脂质体混合物 1.111
#3 全血 RNA-脂质体混合物 0.370
#4 全血 RNA-脂质体混合物 0.123
#5 全血 RNA-脂质体混合物 0.041
#6 全血 RNA-脂质体混合物 0.014
对照 全血 稀释剂/NaCl(0.9％) 0
对于该研究的第二部分，从相同的供体(n＝2)收集肝素化的全血两次。第一次，肝素化全血用于产生PBMC，随后分离CD14+单核细胞。将分离的单核细胞培养5天以产生iDC。将细胞因子IL-4和GM-CSF(各1000U/ml)添加至培养基以刺激iDC的产生。三天后，用含有细胞因子的新鲜培养基喂养细胞。然后，第二次收集来自相同供体的肝素化全血。该血液的一部分用于产生PBMC并随后用于分离pDC。然后，如上所述将剩余的全血接种至孔中：在96孔板中每孔180μL。对于最高剂量组，移取100μL全血。如下添加自体pDC或iDC：如表3所示，向全血样品添加10,000个DC。添加DC后，添加20μL含有脂质体配制的RNA的溶液，以达到200μL的最终体积和1∶10稀释的溶液。
表3：该研究的第二部分的剂量组
实验时间线
该研究的第一部分：
第1天：收集肝素化全血(n＝4)
准备每个供体的PBMC
接种PBMC和全血
添加RNA-LIP溶液并孵育
在6小时时间点收获上清液/血浆并在-65至-85℃下冷冻
第2天：在24小时时间点收获上清液/血浆并在-65至-85℃下冷冻
在之后的任一天进行冷冻上清液的分析
该研究的第二部分：
第1天：收集全血(n＝2)
从每个供体准备PBMC
从PBMC分离CD14+单核细胞
培养分离的CD14+单核细胞以产生iDC
第4天：喂养iDC
第6天：收获iDC
收集全血(n＝2；同一供体)
准备每个供体的PBMC
从PBMC中分离pDC
接种全血
分别添加iDC或pDC
添加含有RNA-LIP的溶液
在6小时时间点收获上清液/血浆并在-65至-85℃下冷冻
第7天：在24小时时间点收获上清液/血浆并在-65至-85℃下冷冻
在之后的任一天进行上清液/血浆的分析
结果：
在PBMC与RNA-LIP混合物一起孵育24小时后，检测到所有细胞因子的剂量依赖性分泌。然而，观察到细胞因子浓度水平的高度变化(20至60,000pg/ml)。细胞因子应答由8种所选细胞因子中的5种主导，即IP-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6(参见表4)。此外，还观察到分泌时间点的差异：在孵育6小时之后(在高RNA浓度下)已经检测到IL-1β、IL-6和TNF-α，并且在24小时之后水平没有显著提高，表明来自不同供体的细胞响应于添加RNA-LIP组合物的能力的差异。
表4：分离的PBMC的结果总结
除了用分离的PBMC进行研究外，还进行了全血中的类似实验。在这些研究中，与RNA-LIP组合物孵育后，针对下列细胞因子没有检测到细胞因子分泌升高至显著浓度：IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-12(参见表图5和图3a-3h)。注意，在某些数据点，仅在3次重复中的1次中观察到的升高的水平被认为是异常值。关于IFN-α2，在四个供体中的三个的一些样品(包括稀释剂对照)中可检测到低水平的基线分泌。在24小时之后和受测的最高剂量下，检测到所有供体的IP-10分泌升高。在剂量#3(0.37μg/mL)下在四个供体中的两个中仍可检测到升高的水平。尽管处于非常低的水平，但在24小时之后和在最高受测剂量下，在四个供体中的两个中IL-6在添加RNA-LIP之后升高。
表5：全血的结果总结
为了测试DC对全血中活化和细胞因子分泌的作用，进行了该研究的第二部分。在此，将富含自体iDC或pDC的肝素化全血与剂量范围为0.016至50μg/mL的RNA-LIP组合物一起孵育。图4a-4c和图5a-5c中示出的结果显示IFN-α2、IP-10和IL-6的明显剂量依赖性诱导。关于IFN-α2，仅在受测的两个最高剂量(10和50μg/mL)下，在全血中与RNA-LIP组合物孵育24小时之后观察到升高的分泌。在剂量3(2μg/mL)下，检测不到分泌增加。然而，向肝素化全血添加pDC提高了2μg/mL剂量下IFN-α2的分泌。相反，与单独的全血相比，添加iDC不会导致该细胞因子的分泌增加。值得注意的是，在用0.4至50μg/mL RNA-LIP孵育24小时之后检测到升高的IP-10水平(在0.08μg/mL下具有略微升高)，这证实了该研究的第一部分的结果。尽管在富含iDC的全血中检测到最高水平，但与没有添加相比，添加任一种类型的DC导致检测到的细胞因子的甚至更高的分泌。关于IL-6，证实了该研究的第一部分的结果，即，用高于2μg/mL的剂量检测到提高的表达水平。在此，与单独的全血相比，向全血添加iDC也导致表达水平提高。
讨论和结论
关于该研究的第一部分，在两种测试系统即分离的人PBMC和全血中，在与RNA-LIP组合物孵育之后分泌几种细胞因子。然而，测试系统之间的差异表明PBMC作为测试系统具有更高的灵敏度。在一方面，可以检测到在分离的PBMC中针对所有八种受测细胞因子的细胞因子水平的提高。使用全血作为测试系统，细胞因子检测限于IFN-α2、IP-10和IL-6。不同的培养条件可能导致不同的结果，因为分离的PBMC用补充有血清(FCS)和抗生素的培养基培养，而全血培养意味着PBMC与人血浆和红细胞一起培养。
在该研究的第二部分中，示出了添加pDC可以提高全血中IFN-α2的分泌。已知pDC在TLR-7激活后分泌IFN-α(Kwissa等，2012，Distinct TLR adjuvants differentiallystimulate systemic and local innate immune responses in nonhuman primates，Blood 119：2044-2055；Schiller等，2006，Immune response modifiers--mode ofaction，Exp.Dermatol.15：331-341，Homung等，2005，Sequence-specific potentinduction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendriticcells through TLR7，Nat.Med.11(3)：263-270)。由于TLR-7被内体中的RNA激活，因此这表明pDC是用于摄取RNA的主要细胞类型。
这些实验的结果还表明，与相同浓度(相同剂量)下的相同免疫治疗剂接触的分离自不同个体的相同免疫反应性物质导致显著不同的免疫反应，因此进一步支持了结论，即相同剂量下的免疫治疗剂在这样的不同的个体中具有不同的效果，并且不存在在所有个体中的治疗有效和/或耐受的单一剂量。
实施例3
以下研究的目的是，通过细胞与不同浓度的小TLR-7激动剂化合物一起孵育之后测量某些细胞因子的分泌和一般活化标志物(CD69)的诱导，以获得关于分离的外周血单核细胞(PBMC)或新鲜全血中的细胞的体外活化的信息，所述小TLR-7激动剂化合物即N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(本文称为SM1)和N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(在本文中称为SM2)。如下面更详细讨论的，将获自健康供体的人肝素化全血和PBMC(从血沉棕黄层分离)与等摩尔量的激动剂化合物SM1或SM2一起孵育24小时。
通过在Ficoll-Paque上的密度离心从血沉棕黄层中分离用于实验的PBMC。随后，将PBMC重悬在细胞培养基中并接种在96孔板中。详细地，以每孔190μL接种5×105个PBMC/每个剂量组。然后添加10μL特定浓度的激动剂以使最终体积达到200μL(1∶20稀释的每种溶液)，最终细胞密度为2.5×106个PBMC/mL。将板在37℃和5％CO2下孵育24小时。随后，收获上清液并立即分析或冷冻并保持在-80℃下直至分析。对于所有剂量的受测激动剂，从10个个体(对于两个研究部分)产生数据，每个个体具有生物学的重复。
从健康志愿者中将全血收集至无菌注射器中。使用肝素作为抗凝剂。将新鲜的肝素化全血直接移液至96孔板中。详细地，对于所有剂量组，将来自不同个体的190μL全血(n＝10个供体用于CBA；n＝8用于流式细胞术)一式两份地接种，并且添加10μL测试项目溶液以达到200μL的最终体积和1∶20稀释的掺料溶液。将板在37℃和5％CO2下孵育24小时。随后，收获上清液并立即分析或冷冻并保持在-80℃直至分析。
为了通过CD69表达测量细胞活化，收获细胞沉淀并立即进行流式细胞术染色和测量。
每种激动剂用稀释剂DMSO(二甲基亚砜)以连续稀释制备：在8个步骤中5倍。与PBMC或全血一起孵育的激动剂化合物浓度为10μM、2μM、0.4μM、0.08μM、0.016μM、0.0032μM、0.0006μM和0.0001μM。
作为该研究的第一部分的主要终点，通过细胞计数珠测定(cytometric beadassay，CBA)分析细胞培养上清液(PBMC)和血浆(全血)中细胞因子分泌的诱导来确定细胞的活化。分析了以下细胞因子/趋化因子(IFN-α、IP-10、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70和IL-2)。对于该研究的第二部分，通过流式细胞术分析数种类型免疫细胞中的一般活化标志物CD69的表达来确定细胞活化。研究了以下类型的免疫细胞：浆细胞样树突细胞(pDC)、骨髓树突细胞(mDC)、单核细胞、B细胞和NK细胞。
特别地，为了确定细胞因子浓度，使用细胞计数珠测定(Multiplex-Kit，(ProcartaPlex；eBioscience)，其包括所有10种细胞因子/趋化因子(IFN-α、IP-10、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70和IL-2)。用系统进行分析。
对于流式细胞术，用组合了表面标志物CD3、CDl6、CD19、CDl4、BDCA2和BDCA3与活化标志物CD69的抗体混合物来染色细胞沉淀。利用该流程图，可以分析B细胞、NK细胞、单核细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)和骨髓树突细胞(mDC)的活化。使用BD FACSCanto IITM进行测量。
在与TLR7-激动剂一起孵育的培养的PBMC中，观察到十种测量细胞因子中八种的一致和剂量依赖性诱导(图6a-6h)。仅IL-12p70和IL-2没有一致地诱导，并且在少数情况下它们仅在一些供体的PBMC中以低水平表达(图6i-6j)。比较不同激动剂浓度下的不同供体的细胞因子水平显示出两种激动剂化合物的高度可变性，这归因于免疫系统对外部刺激的高个体间响应性，如通过在体外环境中TLR7激动剂与免疫细胞一起孵育所例证的。
在全血与每种激动剂化合物一起孵育之后(图7a-7j)，检测到的细胞因子的剂量-响应曲线几乎与使用PBMC进行的观察结果相当。然而，与PBMC相反，在孵育每种激动剂化合物后，还存在IL-12p70-分泌的一致且剂量依赖性诱导(图7j)。如在PBMC中观察到的，细胞因子分泌的剂量-响应曲线是高度个体化的并且取决于各献血者免疫系统的响应性。
还通过流式细胞术分析了PBMC和全血与TLR7-激动剂一起孵育之后的细胞活化(CD69的表达)。与用细胞因子分泌进行的观察相比，PBMC(图8a-8e)和全血(图9a-9e)存在针对两种激动剂化合物的所有分析的免疫细胞群(pDC、mDC、单核细胞、B细胞和NK细胞)的一致的剂量依赖性活化。此外，如通过细胞因子所见，免疫细胞活化的强度在来自不同供体的血液样品之间也是高度可变的。
上述结果清楚地表明，不同的个体在其响应于免疫治疗剂(在本案中是TLR7激动剂)的诱导细胞免疫反应强度方面显著不同。
实施例4
以下研究的目的是观察在食蟹猴模型中在体内施用不同量的TLR-7小分子激动剂对血液中多种细胞因子表达的影响，所述TLR-7小分子激动剂是N-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺(SM1)和N-(4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基)-N-(1，1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺(SM3)。确定其表达的多种细胞因子包括干扰素α；白介素1受体拮抗剂；白介素4、6、8、10、12、15、18；单核细胞趋化蛋白1；粒细胞集落刺激因子；巨噬细胞炎性蛋白1β；肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子。
在30分钟输注中，向食蟹猴静脉内施用限定的单一剂量的一种激动剂化合物。在开始施用之后的几个时间点，通过前臂头静脉(vena cephalica antebrachii)或隐静脉(vena saphena)血管从猴子收集血样(0.5mL，约0.25mL血浆)至K3EDTA管中。在离心之前将血液样品储存在碎冰上。通过在4℃和约1800g下离心10分钟获得血浆，并将其等分至标记的微管中并在70℃或更低温度下冷冻储存。在细胞因子测定之前，将冷冻的血浆样品解冻、稀释。
根据制造商的说明，使用干扰素αElisa试剂盒(例如，VeriKineTM Cynomolgus/Rhesus IFNαELISA试剂盒)和非人灵长类动物细胞因子/趋化因子试剂盒(例如，Milliplex非人灵长类动物细胞因子/趋化因子磁性预混合23Plex Panel)确定细胞因子水平。首先，向猴子施用低剂量的激动剂化合物(30[仅接受SM1的动物]、100[仅接受SM1的动物]或300μg/kg)。之后，在第14天，向同一猴子施用第二次、更高剂量的相同激动剂化合物(1、3或10mg/kg)。结果描绘于图10a-10kk(SM1)和图11a-11m(SM3)中，并显示出TLR-7激动剂的体内施用导致多种细胞因子以高度个体化的方式产生。
图10(SMl)：
向表示为个体P0101(雄性)、P0102(雄性)、P0501(雌性)、P0502(雌性)、P0201(雄性)、P0202(雄性)、P0601(雌性)、P0602(雌性)、P0301(雄性)、P0302(雌性)、P0701(雌性)、P0702(雌性)的食蟹猴通过静脉输注施用剂量为30μg/kg、100mg/kg、300μg/kg和1mg/kg、3mg/kg、和10mg/kg的激动剂化合物SM1，如下所述。在不同时间点测量分泌至血液中的细胞因子直至施用之后168小时。图中示出了在开始输注之后至12或24小时时的多种细胞因子的血浆浓度。
每只猴子被给予相同的激动剂两次。第一次施用是在低剂量30μg/kg、100μg/kg或300μg/kg中的一种之下，第二次施用是在更高剂量1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg中的一种之下。接受30μg/kg作为第一剂量的猴子被给予1mg/kg的第二剂量。接受100μg/kg作为第一剂量的猴子被给予3mg/kg的第二剂量。接受300μg/kg作为第一剂量的猴子被给予10mg/kg的第二剂量。
图10a：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的干扰素α分泌
图10b：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的干扰素α分泌
图10c：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的干扰素α分泌
图10d：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的白介素1受体激动剂分泌
图10e：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的白介素1受体激动剂分泌
图10f：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的白介素1受体激动剂分泌
图10g：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的白介素8分泌
图10h：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的白介素8分泌
图10i：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的白介素8分泌
图10j：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的白介素10分泌
图10k：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的白介素10分泌
图10l：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的白介素10分泌
图10m：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的单核细胞趋化蛋白1分泌
图10n：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的单核细胞趋化蛋白1分泌
图10o：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的单核细胞趋化蛋白1分泌
图10p：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的粒细胞集落刺激因子分泌
图10q：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的粒细胞集落刺激因子分泌
图10r：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的粒细胞集落刺激因子分泌
图10s：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的白介素4分泌
图10t：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的白介素4分泌
图10u：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的白介素4分泌
图10v：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的白介素6分泌
图10w：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的白介素6分泌
图10x：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的白介素6分泌
图10y：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的白介素18分泌
图10z：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的白介素18分泌
图10aa：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的白介素18分泌
图10bb：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的巨噬细胞炎性蛋白1β分泌
图10cc：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的巨噬细胞炎性蛋白1β分泌
图10dd：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的巨噬细胞炎性蛋白1β分泌
图10ee：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的肿瘤坏死因子α分泌
图10ff：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的肿瘤坏死因子α分泌
图10gg：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的肿瘤坏死因子α分泌
图10hh：在30μg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))和100μg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))的剂量下的血管内皮生长因子分泌
图10ii：在300μg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(i))和1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(ii))的剂量下的血管内皮生长因子分泌
图10jj：在3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(i))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(ii))的剂量下的血管内皮生长因子分泌
图10kk：在1mg/kg(对于动物P0101、P0102、P0501、P0502(i))、3mg/kg(对于动物P0201、P0202、P0601、P0602(ii))和10mg/kg(对于动物P0301、P0302、P0701、P0702(iii))的剂量下的白介素12分泌。
图11(SM3)：
向表示为个体16962、17477、17479、17607、16988、30018、16669、17613、14030、16216的雄性食蟹猴通过静脉内输注施用剂量为300μg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的激动剂化合物SM3。在不同时间点测量分泌至血液中的细胞因子直至施用之后168小时。图中示出了在开始输注之后至12或24小时时的多种细胞因子的血浆浓度。
图11a：在300μg/kg(对于动物16962、17477、17479、17607(i))
和1mg/kg(对于动物16962、16988、17479、30018(ii))的剂量下的干扰素α分泌
图11b：在3mg/kg(对于动物16669、17607、17613(i))和10mg/kg(对于动物14030、16216、17477(ii))的剂量下的干扰素α分泌
图11c：在10mg/kg(对于动物14030、16216、17477)的剂量下的粒细胞集落刺激因子分泌
图11d：在1mg/kg(对于动物16962、16988、17479、30018(i))和10mg/kg(对于动物14030、16216、17477(ii))的剂量下的白介素10分泌
图11e：在300μg/kg(对于动物16962、17477、17479、17607(i))和1mg/kg(对于动物16962、16988、17479、30018(ii))的剂量下的白介素15分泌
图11f：在3mg/kg(对于动物16669、17607、17613(i))和10mg/kg(对于动物14030、16216、17477(ii))的剂量下的白介素15分泌
图11g：在300μg/kg(对于动物16962、17477、17479、17607(i))和1mg/kg(对于动物16962、16988、17479、30018(ii))的剂量下的白介素1受体激动剂分泌
图11h：在3mg/kg(对于动物16669、17607、17613(i))和10mg/kg(对于动物14030、16216、17477(ii))的剂量下的白介素1受体激动剂分泌
图11i：在10mg/kg(对于动物14030、16216、17477)的剂量下的白介素10分泌
图11j：在300μg/kg(对于动物16962、17477、17479、17607(i))和1mg/kg(对于动物16962、16988、17479、30018(ii))的剂量下的单核细胞趋化蛋白1分泌
图11k：在3mg/kg(对于动物16669、17607、17613(i))和10mg/kg(对于动物14030、16216、17477(ii))的剂量下的单核细胞趋化蛋白1分泌
图11l：在10mg/kg(对于动物14030、16216、17477)的剂量下的肿瘤坏死因子α分泌
图11m：在10mg/kg(对于动物14030、16216、17477)的剂量下的巨噬细胞炎性蛋白1β分泌。
实施例5
以下研究的目的是观察两种TLR8小分子激动剂：2-乙基-1-(4-((2-甲基四氢呋喃-3-基)氨基)丁基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(SM4)和1-(4-(环己基氨基)丁基)-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(SM5)在体外对人PBMC的细胞因子分泌的作用。确定其表达的多种细胞因子包括肿瘤坏死因子α；白介素1β；白介素6、8、10和12p70；干扰素γ；白介素10和干扰素γ诱导蛋白10。
从四个人自愿献血者中提取的新鲜血液样品中分离PBMC。根据标准方案分离PBMC，将其以2×106/mL的细胞计数重悬在含有10％胎牛血清的细胞培养基中，以每孔100μL接种于96孔板中，随后在37℃下孵育6小时。通过将激动剂化合物溶解在DMSO中，随后在一个或数个步骤中用DMSO稀释至最终测试浓度的1000倍的浓度，来制备每种激动剂化合物的合适储备溶液。用培养基制备合适的激动剂预稀释液；在第一步中，将激动剂以1∶100稀释，并且在第二步中，将25μL预稀释液和125μL培养基添加至孔中的100μL细胞。将细胞在37℃下孵育24小时，然后收获上清液，并根据制造商的说明用对特定人细胞因子具有特异性的珠测定或ELISA测定进行分析。
图12和13中描绘的结果显示出人PBMC暴露于TLR8激动剂导致所测量的细胞因子以高度个体化的方式进行分泌。
图12(SM4)：
在体外测定中，将激动剂化合物SM4以多种浓度(即0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、和30μM)添加至来自表示为个体130325、100621、110126、110125的四个献血者的新鲜制备的人PBMC。添加激动剂化合物之后24小时，如上所述测量分泌至上清液中的细胞因子。显示了与不同量的激动剂一起孵育24小时之后上清液中的多种细胞因子的浓度。
图12a：24小时之后来自个体130325、100621、110126、110125的PBMC的肿瘤坏死因子α分泌
图12b：24小时之后来自个体130325、100621、110126、110125的PBMC的白介素1β分泌
图12c：24小时之后来自个体130325、100621、110126、110125的PBMC的白介素6分泌
图12d：24小时之后来自个体130325、100621、110126、110125的PBMC的干扰素γ分泌
图12e：24小时之后来自个体130325、100621、110126、1101252的PBMC的白介素10分泌
图12f：24小时之后来自个体130325、110126、110125的PBMC的干扰素γ诱导蛋白10分泌。
图13(SM5)：
在体外测定中将激动剂化合物SM5以0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM和30μM的不同浓度添加至来自表示为个体131105、130618、130325、131120的四个献血者的新鲜制备的人PBMC。添加激动剂化合物之后24小时，如上所述测量分泌至上清液中的细胞因子。显示了与不同量的激动剂一起孵育24小时之后上清液中的多种细胞因子的浓度。
图13a：24小时之后来自个体131105、130618、130325、131120的PBMC的肿瘤坏死因子α分泌
图13b：24小时之后来自个体131105、130618、130325、131120的PBMC的白介素1β分泌
图13c：24小时之后来自个体131105、130618、130325、131120的PBMC的白介素6分泌
图13d：24小时之后来自个体131105、131120的PBMC的白介素8分泌
图13e：24小时之后来自个体131105、130618、130325、131120的PBMC的干扰素γ分泌
图13f：24小时之后来自个体131105、130618、130325、131120的PBMC的白介素10分泌
图13g：24小时之后来自131105、130618、130325、131120的PBMC的干扰素γ诱导蛋白10分泌
图13h：24小时之后来自个体131105、131120的PBMC的白介素12p70分泌。
序列表
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH
<120> 免疫治疗剂的剂量确定
<130> 674-171 PCT2
<140>
<141>
<150> PCT/EP2016/075647
<151> 2016-10-25
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(3)
<223> 序列的一部分重复a次, 其中a是独立地选自
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> a + b + c + d + e不为0，优选为2或更多，3或更多，4或更多或者5或更多
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(6)
<223> 序列的一部分重复b次, 其中b是独立地选自
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> REPEAT
<222> (7)..(9)
<223> 序列的一部分重复c次, 其中c是独立地选自
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> REPEAT
<222> (10)..(12)
<223> 序列的一部分重复d次, 其中d是独立地选自
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> REPEAT
<222> (13)..(15)
<223> 序列的一部分重复e次, 其中e是独立地选自
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5

Claims (46)

1.用于确定向个体施用的免疫治疗剂的合适剂量的方法，其包括：
(a)分别使多种不同剂量的所述免疫治疗剂与所述个体的免疫反应性物质接触，
以及
(b)测量由所述多种不同剂量的所述免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的特征在于，定性和/或定量测量至少一种免疫反应，优选定量测量至少一种免疫反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多种不同剂量的所述免疫治疗剂为两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同剂量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述多种不同剂量的所述免疫治疗剂代表剂量递增，优选线性或对数剂量递增。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗剂是Toll样受体(TLR)激动剂，优选TLR-7或TLR-8激动剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗剂包含至少一种免疫反应性肽或蛋白质或者编码至少一种免疫反应性肽或蛋白质的核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸包含RNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫治疗剂包含RNA和至少一种脂质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫治疗剂包含RNA lipoplex制剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述多种不同剂量包括至少一种低于所述免疫治疗剂的标准剂量范围的剂量。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述多种不同剂量包括至少一种位于所述免疫治疗剂的标准剂量范围内的剂量。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)依次进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之后2至48小时，优选在步骤(a)之后4至24小时进行。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种免疫反应包括产生至少一种细胞因子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种细胞因子选自白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)和白介素-12p70(IL-12p70)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种细胞因子是干扰素-α(IFN-α)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其是体外方法。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述个体的所述免疫反应性物质包含从所述个体分离的血细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述免疫反应性物质包含从所述个体分离的全血。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述全血富含来自所述个体的自体树突细胞，优选浆细胞样树突细胞(pDC)和/或单核细胞来源的未成熟树突细胞(iDC)。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述个体的所述免疫反应性物质基本上由外周血单核细胞(PBMC)组成或包含外周血单核细胞。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中这样的剂量反映了用于向所述个体施用所述免疫治疗剂的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对所述免疫治疗剂具有可接受治疗效果。
23.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中步骤(a)在体内进行，其特征在于，在单独的施用步骤中分别使多种不同剂量的所述免疫治疗剂与所述个体的免疫反应性物质接触，每个单独的施用步骤的特征在于，向所述个体施用一种剂量的所述免疫治疗剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述单独的施用步骤随后进行并且彼此分开2至30天，例如7至28天，优选7天、14天、21天或28天，更优选7天或14天的时间间隔。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中在每个单独的施用步骤之后分别进行对至少一种免疫反应的测量。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中第一个所述单独的施用步骤的特征在于，施用低于所述免疫治疗剂的标准剂量范围的剂量的所述免疫治疗剂，并且其中在后续的所述单独的施用步骤中施用的剂量任选地高于在第一个所述单独的施用步骤中施用的剂量。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其还包括(c)检测至少一种副作用的存在或不存在。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种副作用是不可耐受的副作用。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中步骤(c)在每个单独的施用步骤之后进行。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中在施用所述多种不同剂量中的一种之后检测到至少一种副作用的情况下，所有后续剂量与至少一种抗毒性剂一起施用。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在施用不与至少一种抗毒性剂一起施用的所述多种不同剂量中的一种之后检测到至少一种副作用的情况下，待随后施用的所述免疫治疗剂的下一个剂量等于或小于先前施用步骤中施用的剂量。
32.根据权利要求31所述的方法，其中紧接着所述先前施用步骤之后的后续施用步骤之后还进行一个或更多个任选地代表步骤之间的剂量递增方案的另外的施用步骤。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的所述多种不同剂量中的一种之后检测到至少一种副作用的情况下，待随后施用的所述免疫治疗剂的下一个剂量小于所述先前施用步骤中施用的剂量。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述抗毒性剂包含解热药，优选对乙酰氨基酚(醋氨酚)。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其中所述副作用选自感觉异常、疲劳、头痛、肌肉疼痛、胸部压力或胸部疼痛、战栗、温度升高或发热、耳鸣、关节疼痛、头晕、发汗、张力过低和心动过速中的一种或更多种。
36.根据权利要求23至35中任一项所述的方法，其中在施用所述多种不同剂量中的任一种之后未检测到副作用的情况下，这样的剂量反映了用于向所述个体施用所述免疫治疗剂的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对所述免疫治疗剂具有可接受治疗效果。
37.根据权利要求23至35中任一项所述的方法，其中在施用所述多种不同剂量中的任一种之后检测到至少一种副作用的情况下，这样的剂量反映了用于向所述个体施用所述免疫治疗剂的合适剂量：在后续施用步骤中与至少一种抗毒性剂一起施用，并且所述至少一种免疫反应表明对所述免疫治疗剂具有可接受治疗效果。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的所述多种不同剂量中的任一种之后没有检测到副作用的情况下，所述至少一种免疫反应提供可接受治疗效果的最强指示的剂量是用于向所述个体施用所述免疫治疗剂的合适剂量。
39.根据权利要求37所述的方法，其中在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的所述多种不同剂量中的任一种之后检测到至少一种副作用的情况下，未检测到所述副作用或副作用最不严重或在其他方面根据疾病的严重程度被认为是可接受的最高剂量是用于向所述个体施用所述免疫治疗剂的合适剂量。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述合适剂量用于与至少一种抗毒性剂一起施用。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述个体是人对象。
42.用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法，其包括：
(a)分别使多种不同剂量的所述免疫治疗剂与所述个体的免疫反应性物质接触，
(b)测量由所述多种不同剂量的所述免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应，其中这样的剂量反映了用于向所述个体施用的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对所述免疫治疗剂具有可接受治疗效果，以及
(c)以所述合适剂量向所述个体施用所述免疫治疗剂。
43.用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求1至41中任一项所述的方法已确定为合适的剂量的所述免疫治疗剂。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述合适剂量的免疫治疗剂与至少一种抗毒性剂一起施用。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗剂是编码一种或更多种新表位的核酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述核酸是单链RNA。
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