本発明を以下に詳述するが、方法、プロトコル及び試薬は変動し得るため、本発明は本明細書中に記載の特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。別段に定義しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下に本発明の要素を記載する。これらの要素は具体的な実施形態を用いて記載するが、これらを任意の様式及び任意の数で組み合わせて追加の実施形態を作製し得ることを理解されたい。様々に記載した好ましい実施形態は、本発明を明白に記載した実施形態のみに限定すると解釈されるべきでない。この記載は、明白に記載した実施形態を任意の数の開示した及び/又は好ましい要素と組み合わせる実施形態を支援及び包含すると理解されたい。更に、内容により別段に示される場合以外は、本出願中の全ての記載した要素の任意の順列及び組合せが、本出願の説明によって開示されているとみなされるべきである。
好ましくは、本明細書中で使用する用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H. G. W. Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、(1995) Helvetica Chimica Acta、CH-4010、スイス、Baselに記載されている通りに定義する。
別段に指定しない限りは、本発明の実施には当分野の文献(例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第4版、M.R. Green、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 2012を参照)に記載されている生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えDNA技法の慣用方法を用いる。
内容により別段に要する場合以外は、本明細書全体及び続く特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含むこと(comprising)」等の変形は、記述したメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群の包含を暗示するが、任意の他のメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群を排除せず、但し、一部の実施形態では、そのような他のメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群を排除し得る、即ち、対象が記述したメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群の包含からなると理解されたい。用語「a」及び「an」及び「the」並びに本発明の記載との関連で(特に特許請求の範囲との関連で)で使用する同様の言及は、本明細書中に別段に指定しない又は内容により明らかに矛盾しない限りは、単数形及び複数形をどちらもカバーすると解釈されたい。本明細書中の値の範囲の列挙は、範囲内のそれぞれの別々の値を個々に言及する省略方法としての役割を果たすことのみを意図する。本明細書中で別段に指定しない限りは、それぞれの個々の値は、本明細書中で個々に列挙されているかのように、本明細書中に組み込まれている。
本明細書中に記載の全ての方法は、本明細書中で別段に指定しない又は内容により明らかに矛盾しない限りは、任意の適切な順序で行うことができる。
本明細書中で提供する任意且つ全ての例、又は例示的な言葉(例えば「等(such as)」)の使用は、本発明をより良好に例示することのみを意図し、他の箇所で特許請求の範囲に記載した本発明の範囲に対する限定を提示しない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に必須である任意の非特許請求要素を示すと解釈されるべきでない。
いくつかの文書が本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書中で引用した文書のそれぞれ(全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、指示書等が含まれる)は、上記であるか下記であるかにかかわらず、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。本明細書中にいかなるものも、先行発明に基づいて本発明がそのような開示に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきでない。
本発明は、免疫療法剤の適した用量を投与することによる疾患の免疫療法を想定し、この適した用量は、本明細書に記載されている方法によって決定される。免疫療法剤の有効性は、その免疫系に関して個体間の天然の変動に依存するであろうから、適した治療有効で、好ましくは無毒性の用量は、患者毎に個々に決定される必要がある。好まれる実施形態では、免疫療法剤は、がんを処置するためのものである。好まれる実施形態では、免疫療法は、活性な免疫療法の方法によってもたらされ得る。
本発明は、特に、個体に適した用量の免疫療法剤の決定を対象にする。斯かる適した用量が同定されたら、特異的標的に対する免疫応答等、免疫学的反応を誘導するために、該用量で免疫療法剤を個体に投与することができる。好まれる実施形態では、免疫応答は、エピトープを発現する罹患細胞の死をもたらす、T細胞受容体又は人工T細胞受容体等の適切な抗原受容体を介して腫瘍細胞において発現されたエピトープを認識するT細胞等の適切なエフェクター細胞の誘導及び/又は活性化である。
本発明内に包含される免疫療法アプローチは、エピトープを含有するペプチド又はポリペプチド、ii)エピトープを含有するペプチド又はポリペプチドをコードする核酸、及びiii)エピトープを含有するペプチド又はポリペプチドをコードする組換えウイルスによる免疫化を含む。
樹状細胞(DC)は、MHCクラスII及びI抗原提示経路の両方を介して、T細胞に対して末梢組織において捕捉された抗原を提示する白血球集団である。DCは、免疫応答の強力な誘導因子であり、このような細胞の活性化は、抗腫瘍免疫の誘導に重大な意味を持つ工程であることが周知である。樹状細胞は、2種の十分に特徴付けされた表現型の間を判別する単純な方法として使用することができる、「未成熟」及び「成熟」細胞として簡便にカテゴリー化される。しかし、この命名法は、分化のあらゆる可能な中間ステージを除外するものと解釈するべきではない。未成熟樹状細胞は、Fcγ受容体及びマンノース受容体の高発現と相関する、抗原取り込み及びプロセシングのための高い能力を有する抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は典型的に、これらのマーカーのより低い発現、但し、クラスI及びクラスII MHC、接着分子(例えば、CD54及びCD11)並びに共刺激分子(例えば、CD40、CD80、CD86及び4-1 BB)等、T細胞活性化の原因となる細胞表面分子の高発現によって特徴付けられる。DC成熟は、斯かる抗原提示DCがT細胞プライミングをもたらす、DC活性化の状態と称されるが、未成熟DCによるその提示は、寛容をもたらす。DC成熟は主に、自然受容体(パターン認識受容体)炎症誘発性サイトカイン(TNF、IL-1、IFN)によって検出される微生物特色(細菌DNA、ウイルスRNA、エンドトキシン等)を有する生体分子、CD40LによるDC表面におけるCD40のライゲーション、及びストレス性細胞死を起こす細胞から放出される物質に起因する。DCは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)及びIL-4等のサイトカインと共に、in vitroで骨髄細胞、及びバフィーコート又は全血に由来する細胞を培養することによって得ることができる。
好まれる免疫療法剤は、免疫反応性ペプチド又は1種若しくは複数の斯かるペプチドをコードする核酸であり、このペプチドは、疾患特異的突然変異に起因するエピトープ、好ましくは、ネオエピトープを含むことができる。用語「疾患特異的突然変異」は、本発明の文脈において、罹患細胞の核酸に存在するが、対応する正常な罹患していない細胞の核酸には存在しない体細胞突然変異に関する。疾患は癌であり得るため、用語「腫瘍特異的突然変異」又は「癌特異的突然変異」は、腫瘍又は癌細胞の核酸に存在するが、対応する正常な、即ち、非腫瘍性又は非癌性細胞の核酸には存在しない体細胞突然変異に関する。用語「腫瘍特異的突然変異」及び「腫瘍突然変異」並びに用語「癌特異的突然変異」及び「癌突然変異」は、本明細書において互換的に使用される。
免疫療法剤が抗原又は前記抗原をコードする核酸である実施形態では、「細胞免疫応答」、「細胞応答」、「抗原に対する細胞応答」又は同様の用語は、クラスI又はクラスII MHCを有する抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する細胞免疫学的応答を含むことを意味する。細胞性応答は、「ヘルパー」又は「キラー」のいずれかとして作用するT細胞又はTリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーT細胞(CD4+T細胞とも呼ばれる)は免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞(細胞毒性T細胞、細胞溶解性T細胞、CD8+T細胞又はCTLとも呼ばれる)は癌細胞等の疾患細胞を死滅させ、更なる疾患細胞の産生を防止する。好ましくは、抗腫瘍CTL応答は、1種又は複数の腫瘍発現抗原を発現し、好ましくは、クラスI MHCを有する腫瘍発現抗原を提示する腫瘍細胞に対し刺激される。
本発明による「抗原」は、抗体若しくはTリンパ球(T細胞)との特異的反応等、免疫応答の標的である、及び/又はこれを誘導するいずれかの物質、好ましくは、ペプチド又はタンパク質をカバーする。好ましくは、抗原は、T細胞エピトープ等、少なくとも1つのエピトープを含む。好ましくは、本抗原は、発明との関連において、任意選択でプロセシング後に、好ましくは抗原(抗原を発現する細胞が含まれる)に特異的である免疫反応を誘導する分子である。抗原又はそのT細胞エピトープは、抗原(抗原を発現する細胞を含む)に対する免疫応答をもたらす、MHC分子の文脈において、疾患細胞、特に癌細胞を含む、好ましくは細胞、好ましくは抗原提示細胞によって提示される。抗原は、好ましくは、天然起源の抗原に対応する又はこれに由来する産物である。斯かる天然起源の抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物並びに他の感染病原体及び病原体を含むことができる若しくはこれに由来することができる、又は抗原は、腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は、天然起源の産物、例えば、ウイルスタンパク質又はその部分に対応することができる。好ましい実施形態では、抗原は、表面ポリペプチド、即ち、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン又は腫瘍の表面に天然にディスプレイされるポリペプチドである。抗原は、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン又は腫瘍に対する免疫応答を誘発することができる。
用語「疾患関連抗原」又は「疾患特異的抗原」は、疾患に関連する又はこれに特異的ないずれかの抗原を指すようにその最も広義で使用される。斯かる抗原は、宿主の免疫系を刺激して、疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答及び/又は液性抗体応答を生じるであろうエピトープを含有する分子である。したがって、疾患関連抗原を治療目的で使用することができる。疾患関連抗原は、好ましくは、微生物による感染、典型的には微生物抗原に関連する、又は癌、典型的には腫瘍に関連する。
用語「病原体」は、生物、好ましくは、脊椎動物の生物において疾患を引き起こすことができる病原性生物学的材料を指す。病原体は、細菌、単細胞性真核生物(原生動物)、真菌等の微生物と共にウイルスを含む。
本発明の文脈において、用語「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」は、正常条件下で、限定された数の組織及び/又は器官において、又は特異的発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば、腫瘍抗原は、正常条件下で、胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤又は生殖系列細胞において特異的に発現され得、1種又は複数の腫瘍又は癌組織において発現又は異常に発現される。この関連において、「限定された数」とは、好ましくは3つ以下、より好ましくは2つ以下を意味する。本発明との関連において、腫瘍抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞種特異的分化抗原、即ち正常状態下では特定の細胞種中で特定の分化段階において特異的に発現されるタンパク質、癌/精巣抗原、即ち正常状態下では精巣中及び場合によっては胎盤中で特異的に発現されるタンパク質、並びに生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、好ましくは、癌細胞の細胞表面に関連し、好ましくは、正常組織において発現されない又はごく稀にしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異常な発現が癌細胞を同定する。本発明の文脈において、対象、例えば、がん疾患を患う患者におけるがん細胞によって発現される腫瘍抗原は、自己タンパク質又は非自己タンパク質であり得る。好まれる実施形態では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常条件下で特異的にがん性組織において、又は非必須の組織若しくは臓器、即ち、免疫系によって損傷されても対象の死亡をもたらさない組織若しくは臓器において、又は免疫系が到達不能な若しくはほぼ到達不能な、若しくは寛容機構により、例えば高濃度のTreg細胞の存在により保護されている臓器若しくは身体構造において発現される。腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織において発現される腫瘍抗原と、がん組織において発現される腫瘍抗原との間で同一であり得る、又はアミノ酸配列は、例えば、単一アミノ酸のみが、又は2個以上のアミノ酸が、好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個を超えるアミノ酸が異なり得る。用語「腫瘍抗原」、「腫瘍発現抗原」、「癌抗原」及び「癌で発現される抗原」は均等物であり、本明細書中で互換性があるように使用される。
用語「エピトープ」、「抗原ペプチド」、「抗原エピトープ」、「免疫原性ペプチド」及び「MHC結合ペプチド」は、本明細書において互換的に使用されており、抗原等の分子における抗原決定基、即ち、免疫系によって認識される、例えば、特に、MHC分子の文脈で提示されたときにT細胞によって認識される免疫学的に活性な化合物の部分又は断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続的又は不連続的な一部分を含み、好ましくは5〜100、好ましくは5〜50、より好ましくは8〜30、最も好ましくは10〜25個のアミノ酸の長さである。例えば、エピトープは、好ましくは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸の長さであり得る。本発明によれば、エピトープは、細胞の表面におけるMHC分子等、MHC分子に結合することができるため、「MHC結合ペプチド」又は「抗原ペプチド」であり得る。用語「主要組織適合抗原複合体」及び略語「MHC」は、MHCクラスI及びMHCクラスII分子を含み、あらゆる脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。MHCタンパク質又は分子は、免疫反応におけるリンパ球及び抗原提示細胞又は罹患細胞の間のシグナリングに重要であり、MHCタンパク質又は分子は、ペプチドに結合し、これをT細胞受容体による認識のために提示する。MHCによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、T細胞に対して自己抗原(細胞それ自体に由来するペプチド断片)及び非自己抗原(例えば、侵入微生物の断片)の両方をディスプレイする。好ましい斯かる免疫原性部分は、MHCクラスI又はクラスII分子に結合する。本明細書中で使用する場合、当該技術分野で公知のいずれかのアッセイを使用して結合が検出可能である場合、免疫原性部分は、MHCクラスI又はクラスII分子「に結合する」と言われる。用語「MHC結合ペプチド」は、MHCクラスI及び/又はMHCクラスII分子に結合するペプチドに関する。クラスI MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的に8〜10アミノ酸長であるが、より長い又は短いペプチドが有効となる場合もある。クラスII MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的に10〜25アミノ酸長、特に13〜18アミノ酸長であるが、より長い及び短いペプチドが有効な場合もある。
本明細書中で使用する場合、用語「ネオエピトープ」は、正常非癌性又は生殖系列細胞等の参照には存在しないが、癌細胞等の罹患細胞に見出されるエピトープを指す。これには、特に、正常な非癌細胞又は生殖系列細胞中に対応するエピトープが見つかるが、癌細胞中の1つ又は複数の突然変異が原因でエピトープの配列が変化することよってネオエピトープを生じるような状況が含まれる。更に、ネオエピトープは、罹患細胞に対して特異的であるのみならず、疾患を有する患者に対して特異的であってもよい。
本発明の特に好ましい一実施形態では、エピトープ又はネオエピトープは、T細胞エピトープである。本明細書中で使用する場合、用語「T細胞エピトープ」は、T細胞受容体によって認識される立体配置におけるMHC分子に結合するペプチドをいう。典型的には、T細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面に提示される。
本明細書中で使用する場合、用語「免疫原性アミノ酸修飾の予測」は、斯かるアミノ酸修飾を含むペプチドが、ワクチン接種において免疫原性となるか、したがって、エピトープ、特にT細胞エピトープとして有用となるかに関する予測をいう。
本発明によれば、T細胞エピトープは、2つ以上のT細胞エピトープを含むワクチン配列及び/又はポリペプチド等、より大きな実体の一部としてワクチン中に存在することができる。提示されたペプチド又はT細胞エピトープは、適したプロセシング後に産生される。
T細胞エピトープは、TCR認識又はMHCへの結合に必須ではない1つ又は複数の残基において修飾することができる。斯かる修飾されたT細胞エピトープは、免疫学的に均等と考慮することができる。
好ましくは、T細胞エピトープは、MHCによって提示され、T細胞受容体によって認識されると、適切な共刺激シグナルの存在下で、ペプチド/MHC複合体を特異的に認識するT細胞受容体を保有するT細胞のクローン増大を誘導することができる。
好ましくは、T細胞エピトープは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、MHCクラスI及び/又はクラスII提示ペプチドである。
本発明によるT細胞エピトープは、好ましくは、抗原、又は疾患細胞、特に癌細胞等、抗原の発現によって、好ましくは抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激することができる抗原の部分又は断片に関する。好ましくは、T細胞エピトープは、クラスI MHCを有する抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する細胞性応答を刺激することができ、好ましくは、抗原応答性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を刺激することができる。
一部の実施形態では、抗原は、自己抗原、特に、腫瘍抗原である。腫瘍抗原及びその決定は、当業者に知られている。
用語「免疫原性」は、好ましくは、癌に対する処置等、治療的処置に関連する免疫応答を誘導するための相対的有効性に関する。本明細書中で使用する場合、用語「免疫原性(である)」は、免疫原性を有するという特性に関する。例えば、用語「免疫原性修飾」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の文脈で使用する場合、前記修飾に起因する及び/又はこれに対して向ける免疫応答を誘導するための、前記ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の有効性に関する。好ましくは、修飾されていないペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、免疫応答を誘導しない、異なる免疫応答を誘導する、又は異なるレベル、好ましくはより低レベルの免疫応答を誘導する。
本発明によれば、用語「免疫原性」又は「免疫原性である」は、好ましくは、生物学的に関連性がある免疫応答、特に、ワクチン接種に有用な免疫応答を誘導するための相対的有効性に関する。よって、アミノ酸修飾又は修飾されたペプチドは、対象における標的修飾に対する免疫応答を誘導する場合、免疫原性であり、この免疫応答は、治療又は予防目的に有益となることができる。
「抗原プロセシング」又は「プロセシング」とは、ポリペプチド又は抗原の、前記ポリペプチド又は抗原の断片のプロセシング産物への分解(例えばポリペプチドのペプチドへの分解)、及び、細胞、好ましくは抗原提示細胞による、特異的T細胞に対する提示のための、これらの断片のうちの1つ又は複数とMHC分子との会合(例えば結合による)をいう。
ある実施形態では、免疫療法剤は、その細胞表面においてMHC分子と会合してタンパク質抗原のペプチド断片を提示する細胞である抗原提示細胞(APC)を含むことができる。一部のAPCは抗原特異的T細胞を活性化し得る。プロフェッショナル抗原提示細胞は、貪食、飲作用によるか、又は受容体媒介エンドサイトーシスによるかのどちらかで抗原を内部移行し、その後、クラスII MHC分子と結合した抗原の断片をその膜上に表示することに、非常に効率的である。T細胞は抗原提示細胞の膜上の抗原-クラスII MHC分子複合体を認識してそれと相互作用する。その後、更なる共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、T細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現はプロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特長である。プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、最も広範囲の抗原提示を有しており恐らく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、B-細胞、及び特定の活性上皮細胞である。
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブCD4+T細胞との相互作用に必要なMHCクラスIIタンパク質を構成的に発現しない。これらは、IFNγ等の特定のサイトカインによる非プロフェッショナル抗原提示細胞の刺激の際にのみ発現される。
抗原提示細胞は、提示しようとするペプチドを含むペプチド又はポリペプチドをコードする核酸、好ましくはRNA、例えば、抗原をコードする核酸を細胞に形質導入することにより、MHCクラスI及びクラスII提示ペプチドを負荷することができる。
一部の実施形態では、樹状又は他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達媒体を含む本発明の免疫療法剤を患者に投与し、in vivoで起こるトランスフェクションをもたらすことができる。例えば、樹状細胞のインビボ形質移入は、一般に、WO 97/24447号に記載のもの、又はMahviら、Immunology and cell Biology 75:456〜460頁、1997によって記載されている遺伝子銃手法等の、当技術分野で知られている任意の方法を使用して行い得る。
用語「抗原提示細胞」には標的細胞も含まれる。
「標的細胞」とは、細胞性免疫応答等の免疫応答の標的である細胞を意味するものとする。標的細胞には、抗原又は抗原エピトープ、即ち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれ、癌細胞等の全ての望ましくない細胞が含まれる。好ましい実施形態では、標的細胞とは、本明細書中に記載の抗原を発現しており、好ましくはクラスI MHCを用いて前記抗原を提示している細胞である。
用語「一部分」とは画分をいう。アミノ酸配列又はタンパク質等の特定の構造に関して、用語、その「一部分」は、前記構造の連続的又は不連続的な画分を指定し得る。好ましくは、アミノ酸配列の一部分は、前記アミノ酸配列のアミノ酸のうちの少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%を含む。好ましくは、一部分が不連続的な画分である場合、前記不連続的な画分は構造の2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、又はそれより多くの部分から構成され、それぞれの部分は構造の連続的な要素である。例えば、アミノ酸配列の不連続的な画分は、前記アミノ酸配列の2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、又はそれより多く、好ましくは4個以下の部分から構成されていてよく、それぞれの部分は、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも5個の連続的なアミノ酸、少なくとも10個の連続的なアミノ酸、好ましくは少なくとも20個の連続的なアミノ酸、好ましくは少なくとも30個の連続的なアミノ酸を含む。
用語「部分」及び「断片」は本明細書中で互換性があるように使用され、連続的な要素をいう。例えば、アミノ酸配列又はタンパク質等の構造の一部とは、前記構造の連続的な要素をいう。
構造の一部分、一部又は断片は、好ましくは前記構造の1つ又は複数の機能的特性を含む。例えば、エピトープ、ペプチド又はタンパク質の一部分、一部又は断片は、好ましくはそれが由来するエピトープ、ペプチド又はタンパク質に免疫学的に均等である。本発明との関連において、アミノ酸配列等の構造の「一部」は、構造又はアミノ酸配列全体の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%を好ましくは含み、好ましくはそれからなる。
ある実施形態では、免疫療法剤は、免疫反応性細胞であり得る。免疫反応性細胞は、免疫反応においてエフェクター機能を果たす細胞であるという点において、免疫反応性材料に関する。免疫反応性細胞は、好ましくは、抗原、又は抗原若しくは抗原に由来する抗原ペプチドの提示によって特徴付けられる細胞に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカイン及び/又はケモカインを分泌し、抗体を分泌し、癌細胞を認識し、任意選択でそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞は、T細胞(細胞毒性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤性T細胞)、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の関連において、「免疫反応性細胞」はT細胞、好ましくはCD4+及び/又はCD8+T細胞である。本発明のある実施形態では、個体の免疫反応性材料は、好ましくは、免疫反応性細胞又は免疫反応性細胞を含む組成物を含むことができる。
「免疫反応性細胞」は、特にMHC分子の文脈で抗原提示細胞又は癌細胞等の疾患細胞の表面上等に提示された場合に、抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドもある程度の特異性で認識することができる。好ましくは、前記認識は、抗原又は前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する細胞が応答性又は反応性となることを可能にする。細胞が、MHCクラスII分子の文脈において抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドを認識する受容体を保有するヘルパーT細胞(CD4+T細胞)である場合、そのような応答性又は反応性は、サイトカインの放出並びに/又はCD8+リンパ球(CTL)及び/若しくはB細胞の活性化を含み得る。細胞がCTLである場合、そのような応答性又は反応性は、例えばアポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞溶解による、MHCクラスI分子の文脈において提示された細胞、即ちクラスI MHCを用いた抗原の提示によって特徴付けられる細胞の排除を含み得るCTL応答性には、持続的なカルシウム流、細胞分裂、IFN-γ及びTNF-α等のサイトカインの産生、CD44及びCD69等の活性化マーカーの上方制御、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。また、CTL応答性は、CTL応答性を正確に示す人工レポーターを使用しても決定し得る。抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドを認識し、応答性又は反応性であるようなCTLは、本明細書中で「抗原応答性CTL」とも呼ばれる。細胞がB細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
用語「T細胞」及び「Tリンパ球」は、本明細書中で互換性があるように使用され、Tヘルパー細胞(CD4+T細胞)及び細胞溶解性T細胞を含む細胞毒性T細胞(CTL、CD8+T細胞)が含まれる。
T細胞はリンパ球として知られる白血球の群に属しており、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、T細胞受容体(TCR)と呼ばれる特別な受容体がその細胞表面上に存在することによって、B細胞及びナチュラルキラー細胞等の他のリンパ球種から識別することができる。胸腺はT細胞の成熟を司っている主要な器官である。T細胞のいくつかの異なる部分組が発見されており、それぞれが明白に異なる機能を有する。
Tヘルパー細胞は、他の機能のなかでとりわけB細胞の形質細胞への分化並びに細胞毒性T細胞及びマクロファージの活性化を含めた免疫プロセスにおいて、他の白血球を援助する。これらの細胞は、その表面上にCD4タンパク質を発現するため、CD4+T細胞としても知られる。ヘルパーT細胞は、共刺激の文脈における抗原提示細胞(APC)の表面上に発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原が提示された際に活性化される。活性化された後、これらは迅速に分裂し、活性免疫応答を調節又は援助するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。
細胞毒性T細胞はウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、また移植片拒絶にも関連付けられている。これらの細胞は、その表面上にCD8糖タンパク質を発現するため、CD8+T細胞としても知られる。このような細胞は、身体の全有核細胞の表面に存在する、共刺激の文脈におけるMHCクラスIに会合した抗原に結合することによりその標的を認識する。
大多数のT細胞では、T細胞受容体(TCR)がいくつかのタンパク質の複合体として存在する。実際のT細胞受容体は、独立したT細胞受容体アルファ及びベータ(TCRα及びTCRβ)遺伝子から産生される2つの別々のペプチド鎖から構成されており、α-及びβ-TCR鎖と呼ばれている。γδT細胞(ガンマデルタT細胞)は、その表面上に明白に異なるT細胞受容体(TCR)を保有するT細胞の小さな部分組を表す。しかし、γδT細胞中では、TCRは1本のγ-鎖及び1本のδ-鎖からなっている。このT細胞の群はαβT細胞よりもはるかに稀である(全T細胞の2%)。
本発明によれば、用語「抗原受容体」は、T細胞等の免疫エフェクター細胞におけるモノクローナル抗体の特異性等の任意の特異性を付与する、T細胞受容体及び操作された受容体等の天然起源の受容体を含む。このようにして、多数の抗原特異的T細胞を養子細胞移入のために生成することができる。よって、本発明に従った抗原受容体は、例えば、T細胞自身のT細胞受容体の代わりに又はこれに加えて、T細胞に存在し得る。斯かるT細胞は、標的細胞の認識のために抗原のプロセシング及び提示を必ずしも要求しないが、寧ろ、好ましくは特異性により、標的細胞に存在するいずれかの抗原を認識することができる。好ましくは、前記抗原受容体は、細胞の表面に発現される。本発明の目的のため、抗原受容体を含むT細胞は、本明細書中で使用する場合、用語「T細胞」によって含まれる。特に、本発明によれば、用語「抗原受容体」は、癌細胞等の標的細胞における標的構造(例えば、抗原)を認識する、即ち、これに結合し(例えば、標的細胞の表面に発現された抗原への抗原結合部位又は抗原結合ドメインの結合により)、細胞表面に前記抗原受容体を発現するT細胞等の免疫エフェクター細胞に特異性を付与することができる、単一分子又は分子の複合体を含む人工的受容体を含む。好ましくは、抗原受容体による標的構造の認識は、前記抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす。抗原受容体は、1個又は複数のタンパク質単位を含むことができ、前記タンパク質単位は、本明細書に記載されている1個又は複数のドメインを含む。本明細書中で使用する場合、「抗原受容体」は、「キメラ抗原受容体(CAR)」、「キメラT細胞受容体」又は「人工的T細胞受容体」であってもよい。
抗原は、同じ又は異なるペプチド鎖に存することができる、抗体及びT細胞受容体の抗原結合部分を介する等、抗原結合部位を形成することができるいずれかの抗原認識ドメイン(本明細書において単に「ドメイン」とも称される)を介して抗原受容体によって認識され得る。一実施形態では、抗原結合部位を形成する2個のドメインは、免疫グロブリンに由来する。一実施形態では、抗原結合部位を形成する2個のドメインは、T細胞受容体に由来する。モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片(scFv)並びにT細胞受容体可変ドメイン、特にTCRアルファ及びベータ単鎖等、抗体可変ドメインが特に好ましい。高い親和性で所与の標的に結合する実際にほぼ全てのものを抗原認識ドメインとして使用することができる。
T細胞の活性化における第1のシグナルは、別の細胞における主要組織適合抗原複合体(MHC)によって提示される短いペプチドへのT細胞受容体の結合によってもたらされる。これは、該ペプチドに特異的なTCRを有するT細胞のみが活性化されることを確実にする。パートナー細胞は通常、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)、通常、ナイーブ応答の場合は樹状細胞であるが、B細胞及びマクロファージが重要なAPCとなる場合もある。MHCクラスI分子によってCD8+ T細胞に提示されるペプチドは典型的に、8〜10アミノ酸の長さである;MHCクラスII分子の結合間隙の端は開いているため、MHCクラスII分子によってCD4+ T細胞に提示されるペプチドは典型的により長い。
本発明の文脈において、分子は、標準のアッセイにおいて標的に対して有意な親和性を有しており、前記事前に決定された標的と結合する場合に、前記事前に決定された標的と結合することができる。「親和性」又は「結合親和性」は多くの場合、平衡解離定数(KD)によって測定する。分子は、標準のアッセイにおいて標的に対して有意な親和性を有しておらず、前記標的と有意に結合しない場合に、前記標的と(実質的に)結合することができない。
細胞毒性Tリンパ球は、抗原又は抗原ペプチドを抗原提示細胞内にインビボで取り込ませることによって、インビボで産生し得る。抗原又は抗原ペプチドはタンパク質として、DNA(例えばベクター内)として、又はRNAとして表し得る。抗原はプロセシングされてMHC分子のペプチドパートナーを生じ得る一方で、その断片は更なるプロセシングを必要とせずに提示され得る。特にこれらがMHC分子と結合できる場合は後者の状況である。一般に、皮内注射による患者への投与が可能である。しかし、注射は、リンパ節に結節内(intranodally)で実行することもできる(Maloyら、2001、Proc Natl Acad Sci USA 98:3299〜303頁)、又は静脈内注射することもできる。他の投与機序は、筋肉内及び皮下投与を含むことができる。生じる細胞は目的の複合体を提示し、自己細胞毒性Tリンパ球によって認識され、これはその後に増殖する。
CD4+又はCD8+T細胞の特異的活性化は様々な方法で検出し得る。特異的T細胞活性化を検出する方法には、T細胞の増殖、サイトカイン(例えばリンホカイン)の産生、又は細胞溶解活性の発生を検出することが含まれる。CD4+T細胞では、特異的T細胞活性化を検出する好ましい方法はT細胞の増殖の検出である。CD8+T細胞では、特異的T細胞活性化を検出する好ましい方法は細胞溶解活性の発生の検出である。
「抗原の提示によって特徴付けられる細胞」若しくは「抗原を提示する細胞」又は同様の表現とは、MHC分子、特にMHCクラスI分子の文脈において、それが発現する抗原又は前記抗原に由来する断片を、例えば抗原のプロセシングによって提示する疾患細胞、例えば癌細胞、又は抗原提示細胞等の細胞を意味する。同様に、用語「抗原の提示によって特徴付けられる疾患」とは、特にクラスI MHCを用いた抗原の提示によって特徴付けられる細胞を含む疾患を示す。細胞による抗原の提示は、細胞に、抗原をコードしているRNA等の核酸を形質移入させることによって達成し得る。
「提示されている抗原の断片」又は同様の表現とは、例えば抗原提示細胞に直接加えた場合に、MHCクラスI又はクラスII、好ましくはMHCクラスIによって提示され得る断片を意味する。一実施形態では、断片は、抗原を発現する細胞によって天然に提示される断片である。
用語「免疫学的に均等」とは、免疫学的に均等なアミノ酸配列等の免疫学的に均等な分子が、例えば液性及び/若しくは細胞性免疫応答の誘導等の免疫学的効果の種類、誘導された免疫反応の強度及び/若しくは持続期間、又は誘導された免疫反応の特異性に関して、同じ若しくは本質的に同じ免疫学的特性を示す及び/又は同じ若しくは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明の文脈において、用語「免疫学的に均等」は、好ましくは、免疫化に使用するペプチドの免疫学的効果又は特性に関して使用することができる。例えば、アミノ酸配列が対象の免疫系に曝された際に参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合に、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列に免疫学的に均等である。
用語「免疫エフェクター機能」は、本発明の文脈において、本明細書中で使用する用語「免疫学的反応」によって包含され、例えば、腫瘍細胞の死滅、又は腫瘍播種及び転移の阻害を含む腫瘍成長の阻害及び/又は腫瘍発生の阻害をもたらす、免疫系の成分によって媒介されるいずれかの機能を含む。好ましくは、本発明の文脈における免疫エフェクター機能はT細胞に媒介されるエフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーT細胞(CD4+T細胞)の場合は、MHCクラスII分子の文脈におけるT細胞受容体による抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドの認識、サイトカインの放出並びに/又はCD8+リンパ球(CTL)及び/若しくはB細胞の活性化、CTLの場合は、MHCクラスI分子の文脈におけるT細胞受容体による抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドの認識、例えばアポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞溶解による、MHCクラスI分子の文脈において提示された細胞、即ちクラスI MHCを用いた抗原の提示によって特徴付けられる細胞の排除、IFN-γ及びTNF-α等のサイトカインの産生、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
用語「主要組織適合抗原複合体」及び略語「MHC」は、MHCクラスI及びMHCクラスII分子を含み、あらゆる脊椎動物に発生する遺伝子の複合体に関する。MHCタンパク質又は分子は、免疫反応におけるリンパ球及び抗原提示細胞又は罹患細胞の間のシグナリングに重要であり、MHCタンパク質又は分子は、ペプチドに結合し、これをT細胞受容体による認識のために提示する。MHCによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、T細胞に自己抗原(細胞自身に由来するペプチド断片)及び非自己抗原(例えば、侵入微生物の断片)の両方をディスプレイする。
MHC領域は、3つのサブグループのクラスI、クラスII及びクラスIIIに分けられる。MHCクラスIタンパク質は、α鎖及びβ2ミクログロブリン(第15染色体によってコードされるMHCの部分ではない)を含有する。これらは、細胞傷害性T細胞に抗原断片を提示する。大部分の免疫系細胞、特に、抗原提示細胞において、MHCクラスIIタンパク質は、α及びβ鎖を含有し、これらは、Tヘルパー細胞に抗原断片を提示する。MHCクラスIII領域は、補体成分等の他の免疫成分をコードし、そのいくつかはサイトカインをコードする。
MHCは、多遺伝子性(いくつかのMHCクラスI及びMHCクラスII遺伝子が存在する)及び多型(各遺伝子の複数のアレルが存在する)の両方である。
本明細書中で使用する場合、用語「ハプロタイプ」は、1本の染色体に見出されるHLAアレル及びそれにコードされるタンパク質を指す。ハプロタイプは、MHC内のいずれか1個の遺伝子座に存在するアレルを指すこともできる。MHCの各クラスは、いくつかの遺伝子座によって表される:例えば、クラスIはHLA-A(ヒト白血球抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P及びHLA-V、並びにクラスIIはHLA-DRA、HLA-DRB1-9、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA及びHLA-DOB。用語「HLAアレル」及び「MHCアレル」は、本明細書において互換的に使用される。
MHCは、極度の多型を呈する。ヒト集団内において、各遺伝子座において、別個のアレルを含む多数のハプロタイプが存在する。各アレルが、特定の配列パターンを呈するペプチドに結合するタンパク質をコードするという点において、クラスI及びクラスIIの両方の異なる多型MHCアレルは、異なるペプチド特異性を有する。
本発明の文脈において、MHC分子は、好ましくは、HLA分子である。
本発明の文脈において、用語「MHC結合ペプチド」は、MHCクラスI及び/又はクラスII結合ペプチド、又はプロセシングされてMHCクラスI及び/又はクラスII結合ペプチドを産生することができるペプチドを含む。クラスI MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的に、8〜12、好ましくは8〜10アミノ酸長であるが、より長い又は短いペプチドが有効な場合もある。クラスII MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的に、9〜30、好ましくは10〜25アミノ酸長、特に13〜18アミノ酸長であるが、より長い及び短いペプチドが有効な場合もある。
ある実施形態では、本発明の方法において有用な免疫療法剤は、抗原ペプチド又は抗原ペプチドをコードする核酸を含むことができる。「抗原ペプチド」は、好ましくは、抗原、又は罹患細胞、特に癌細胞等、抗原の発現、好ましくは抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激することができる、抗原の部分又は断片に関する。好ましくは、抗原ペプチドは、クラスI MHCを有する抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する細胞性応答を刺激することができ、好ましくは、抗原応答性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を刺激することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、MHCクラスI及び/又はクラスII提示ペプチドである、又はプロセシングして、MHCクラスI及び/又はクラスII提示ペプチドを産生することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、MHCクラスI及び/又はクラスII提示ペプチドである。好ましくは、抗原ペプチドは、斯かる断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、プロセシングされて、斯かる断片、即ち、抗原に由来するMHCクラスI及び/又はクラスII提示ペプチドを産生する。
ペプチドは、直接的に、即ち、プロセシングなしで、特に、切断なしで提示される必要がある場合、MHC分子、特にクラスI MHC分子への結合に適した長さを有し、好ましくは、7〜20アミノ酸の長さ、より好ましくは7〜12アミノ酸の長さ、より好ましくは8〜11アミノ酸の長さ、特に9又は10アミノ酸の長さである。
ペプチドが、追加的な配列、例えば、ワクチン配列の又はポリペプチドを含むより大きい実体の部分であり、プロセシング後に、特に、切断後に提示される必要がある場合、プロセシングによって産生されるペプチドは、MHC分子、特に、クラスI MHC分子への結合に適した長さを有し、好ましくは、7〜20アミノ酸の長さ、より好ましくは7〜12アミノ酸の長さ、より好ましくは8〜11アミノ酸の長さ、特に9又は10アミノ酸の長さである。好ましくは、プロセシング後に提示される必要があるペプチドの配列は、抗原のアミノ酸配列に由来する、即ち、その配列は、抗原の断片に実質的に対応し、好ましくはこれと完全に同一である。よって、MHC結合ペプチドは、抗原の断片に実質的に対応し、好ましくはこれと完全に同一である配列を含む。
クラスI MHCによって提示されるペプチドの配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、クラスI MHCによって提示されるペプチドのTCR認識に、又はMHCへのペプチドの結合に必須ではない1個又は複数の残基が異なり得る。斯かる実質的に対応するペプチドも、抗原応答性CTLを刺激することができ、免疫学的に同等であると考慮することができる。TCR認識に影響を与えないが、MHCへの結合の安定性を改善する残基が提示されるペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を改善することができ、本明細書において、「最適化されたペプチド」と称することができる。これらの残基のいずれが、MHC又はTCRのいずれかに結合に影響を与える可能性が高くなり得るかに関する現存知識を使用して、実質的に対応するペプチドの設計のための合理的アプローチを用いることができる。機能的なその結果得られるペプチドは、抗原ペプチドとして考慮される。
抗原ペプチドは、MHCによって提示されると、T細胞受容体によって認識可能となるべきである。好ましくは、抗原ペプチドは、T細胞受容体によって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在、抗原ペプチドを特異的に認識するT細胞受容体を保有するT細胞のクローナル増大を誘導することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、特に、MHC分子の文脈で提示される場合、これが由来する抗原、又は抗原の発現によって特徴付けられ、好ましくは、抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する免疫応答、好ましくは、細胞性応答を刺激することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、クラスI MHCを有する抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する細胞性応答を刺激することができ、好ましくは、抗原応答性CTLを刺激することができる。斯かる細胞は、好ましくは、標的細胞である。
用語「ゲノム」とは、生物又は細胞の染色体中の遺伝情報の総量に関する。
用語「エクソーム」は、発現される遺伝子のコード部分であるエクソンによって形成された、生物のゲノムの一部をいう。エクソームはタンパク質及び他の機能的遺伝子産物の合成において使用される遺伝的青写真を提供する。これはゲノムの最も機能的に関連性のある部分であり、したがって生物の表現型に寄与する可能性が最も高い。ヒトゲノムのエクソームは全ゲノムの1.5%を構成すると推定されている(Ngら、2008、PLoS Gen.、4(8):1〜15頁)。
用語「トランスクリプトーム」は、1個の細胞又は細胞の集団において産生されるmRNA、rRNA、tRNA及び他の非コードRNAを含むあらゆるRNA分子のセットに関する。本発明の文脈において、トランスクリプトームは、1個の細胞、細胞の集団、好ましくは、癌細胞の集団、又はある時点における所定の個体のあらゆる細胞において産生されるあらゆるRNA分子のセットを意味する。
「核酸」とは、好ましくはデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)、より好ましくはRNA、最も好ましくはインビトロ転写RNA(IVT RNA)又は合成RNAである。核酸にはゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換え産生及び化学合成の分子が含まれる。核酸は一本鎖又は二本鎖の直鎖状又は共有結合の環状閉鎖分子として存在し得る。核酸は単離することができる。用語「単離した核酸」とは、核酸が、(i)インビトロ、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅された、(ii)クローニングによって組換え産生された、(iii)例えば切断及びゲル電気泳動による分離によって精製された、又は(iv)例えば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸(nucleic)は細胞内への導入、即ち形質移入のために、特にDNA鋳型からのインビトロ転写によって調製することができるRNAの形態で用いることができる。RNAは、施用前に配列の安定化、キャッピング、及びポリアデニル化によって更に修飾することができる。
用語「遺伝物質」とは、DNA若しくはRNAのどちらかの単離した核酸、二重らせんの一区間、染色体の一区間、又は生物若しくは細胞のゲノム全体、特にそのエクソーム若しくはトランスクリプトームをいう。
用語「突然変異」は、参照と比較した、核酸配列の変化又は差(ヌクレオチド置換、付加又は欠失)を指す。「体細胞突然変異」は生殖細胞(精子及び卵子)以外の身体の細胞のうちの任意のもので起こる場合があり、したがって子供には伝わらない。これらの変更は(必ずしもではないが)癌又は他の疾患を引き起こす場合がある。好ましくは、突然変異は非同義突然変異である。用語「非同義突然変異」は、ネオエピトープの形成を好ましくはもたらす、翻訳産物におけるアミノ酸置換等のアミノ酸変化をもたらす突然変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。
用語「突然変異」には点突然変異、インデル、融合、クロモスリプシス及びRNA編集が含まれる。
用語「インデル」とは、共存する挿入及び欠失並びにヌクレオチドの正味増加又は減少をもたらす突然変異として定義される、特別な突然変異クラスを説明する。ゲノムのコード領域では、インデルの長さが3の倍数でない限り、これらはフレームシフト突然変異を生じる。インデルは点突然変異と対照させることができる。インデルが配列からヌクレオチドを挿入及び欠失させる場合には、点突然変異はヌクレオチドのうちの1つを置き換える置換の一形態である。
融合は、2つの以前は別々の遺伝子から形成されたハイブリッド遺伝子を生じることができる。これは転座、中間部欠失、又は染色体逆位の結果として生じることができる。多くの場合、融合遺伝子は癌遺伝子である。発癌性融合遺伝子は、新しい又は2つの融合パートナーからの異なる機能を有する遺伝子産物をもたらし得る。或いは、原癌遺伝子は強力なプロモーターと融合しており、したがって、発癌性機能は上流融合パートナーの強力なプロモーターによって引き起こされる上方制御によって機能し始める。また、発癌性融合転写物は、トランス-スプライシング又はリードスルー事象によっても引き起こされ得る。
用語「クロモスリプシス」とは、単一の破壊事象によってゲノムの特異的領域が砕かれ、その後に縫合される遺伝的現象をいう。
用語「RNA編集」又は「RNA編集する」とは、塩基構成中の化学的変化によってRNA分子中の情報内容が変更される分子プロセスをいう。RNA編集には、シチジン(C)からウリジン(U)及びアデノシン(A)からイノシン(I)等のヌクレオシド改変、脱アミノ化、並びに非鋳型のヌクレオチド付加及び挿入が含まれる。mRNAのRNA編集は、ゲノムDNA配列によって予測されているものと異なるように、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を有効に変更する。
用語「癌突然変異シグネチャ」とは、非癌性の参照細胞と比較した場合に癌細胞中に存在する一組の突然変異をいう。
本発明の文脈における「参照」を使用して、腫瘍検体から得られる結果を相関及び比較することができる。典型的には、「参照」は、患者又は1つ若しくは複数の異なる個体、好ましくは健康な個体、特に同じ種の個体のどちらかから得られた、1つ又は複数の正常検体、特に癌疾患によって影響を受けていない検体に基づいて入手し得る。「参照」は、十分に多数の正常検体を試験することによって経験的に決定することができる。
疾患特異的突然変異は、いずれか適した配列決定方法によって決定することができ、次世代配列決定(NGS)技術が好まれる。方法のシーケンシングステップの速度を上げるために、将来は第三世代シーケンシング方法がNGS技術を置き換える可能性がある。明確にする目的のために、本発明の文脈における用語「次世代シーケンシング」又は「NGS」とは、ゲノム全体を小片に切断することによって核酸鋳型をゲノム全体に沿ってランダムに並行して読み取る、サンガー化学として知られる「従来の」シーケンシング方法とは対照的に、全ての新規高スループットシーケンシング技術を意味する。そのようなNGS技術(超並列シーケンシング技術としても知られる)は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム(ゲノムの全ての転写された配列)又はメチローム(ゲノムの全てのメチル化された配列)の核酸配列情報を非常に短期間、例えば、1〜2週間以内、好ましくは1〜7日間以内、又は最も好ましくは24時間未満以内に送達することができ、原理上は単一細胞シーケンシング手法を可能にする。市販されている又は文献中例えば、Zhangら、2011、The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38(3): 95〜109頁又はVoelkerdingら、2009、Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55: 641〜658頁に詳述されているものに言及されている複数のNGSプラットフォームを、本発明の文脈において使用することができる。
好ましくは、DNA及びRNA調製物はNGSの出発物質として役割を果たす。そのような核酸は、生体物質等の試料から、例えば、新鮮な、フラッシュ凍結した若しくはホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍組織(FFPE)から又は新たに単離した細胞から又は患者の末梢血中に存在するCTCから、容易に得ることができる。正常な突然変異していないゲノムDNA又はRNAは正常な体性組織から抽出することができるが、本発明の文脈においては生殖系列細胞が好ましい。生殖系列DNA又はRNAを、非血液学的悪性腫瘍に罹患している患者における末梢血単核細胞(PBMC)から抽出する。FFPE組織又は新鮮に単離した単一細胞から抽出した核酸は非常に断片化されているが、これらはNGSの応用には適している。
エクソームシーケンシングのためのいくつかの標的NGS方法が文献(総説には、例えばTeer及びMullikin、2010、Human Mol Genet 19(2): R145〜51頁を参照)に記載されており、これらの全てを本発明と併せて使用することができる。これらの方法の多く(例えばゲノム捕捉、ゲノム分配、ゲノム濃縮等として記載)はハイブリダイゼーション技法を使用し、アレイに基づく(例えばHodgesら、2007、Nat. Genet. 39: 1522〜1527頁)及び液体に基づく(例えばChoiら、2009、Proc. Natl. Acad. Sci USA 106: 19096〜19101頁)ハイブリダイゼーション手法が含まれる。また、DNA試料の調製及び続くエクソームの捕捉のための市販のキットも入手可能であり、例えば、Illumina Inc.社(カリフォルニア州San Diego)は、TruSeq(商標)DNA試料の調製キット(DNA Sample Preparation Kit)及びTruSeq(商標)エクソーム濃縮キット(Exome Enrichment Kit)を提供している。
例えば腫瘍試料の配列を生殖系列試料の配列等の参照試料の配列と比較する際に癌特異的体細胞突然変異又は配列相違の検出において偽陽性の発見数を減らすために、これらの試料種のうちの一方又は両方の複製中の配列を決定することが好ましい。したがって、生殖系列試料の配列等の参照試料の配列を2回、3回又はそれより多く決定することが好ましい。或いは又はそれに加えて、腫瘍試料の配列を2回、3回又はそれより多く決定する。また、生殖系列試料の配列等の参照試料の配列及び/又は腫瘍試料の配列はまた、ゲノムDNA中の配列を少なくとも1回決定し、前記参照試料及び/又は前記腫瘍試料のRNA中の配列を少なくとも1回決定することによって、複数回決定することも可能であり得る。例えば、生殖系列試料等の参照試料の複製間の変異を決定することによって、予想される体細胞突然変異の偽陽性率(FDR)を統計的量として推定することができる。1つの試料の技術的反復は同一の結果を生じるはずであり、この「対同一物比較」中に検出された全ての突然変異は偽陽性である。特に、参照試料に対する腫瘍試料における体細胞突然変異検出の偽発見率を決定するために、参照試料の技術的反復を、偽陽性の数を推定するための参照として使用することができる。更に、様々な品質関連の測定基準(例えばカバレッジ又はSNP品質)を、機械学習手法を使用して単一の品質スコアへと合わせ得る。所定の体性変異について、上回る品質スコアを有する全ての他の変異を計数してよく、これによりデータセット中の全ての変異の順位付けが可能となる。
本発明の文脈において、用語「RNA」とは、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」とは、β-D-リボフラノシル基の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語「RNA」は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的又は完全に精製したRNA等の単離したRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、並びに1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は変更によって天然に存在するRNAと異なる修飾RNA等の組換え産生したRNAを含む。そのような変更には、例えば、RNAの末端への又は内部での、例えばRNAの1つ若しくは複数のヌクレオチドでの非ヌクレオチド物質の付加を含めることができる。また、RNA分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又は化学合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド等の非標準のヌクレオチドも含むことができる。これらの変更されたRNAは、類似体又は天然に存在するRNAの類似体と呼ぶことができる。
用語「RNA」には「mRNA」が含まれ、好ましくはそれに関する。用語「mRNA」とは「メッセンジャーRNA」を意味し、DNA鋳型を使用することによって作製され得、ペプチド又はポリペプチドをコードしている「転写物」に関する。典型的には、mRNAは、5'-UTR、タンパク質コード領域、及び3'-UTRを含む。mRNAは細胞中及びインビトロにおいて限定された半減期しか持たない。本発明の文脈において、mRNAはDNA鋳型からインビトロ転写によって作製し得る。インビトロ転写方法は当業者に知られている。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
RNAの安定性及び翻訳効率は必要に応じて改変し得る。例えば、RNAの安定化効果を有する及び/又は翻訳効率を増加させる1つ又は複数の修飾によって、RNAを安定化させ、その翻訳を増加させ得る。そのような修飾は、例えば、本明細書中に参考として組み込まれているPCT/EP2006/009448号に記載されている。本発明の実施形態で使用するRNAの発現を増加させるために、コード領域、即ち発現されるペプチド又はタンパク質をコードしている配列内で、好ましくは発現されるペプチド又はタンパク質の配列を変更させずに修飾することによって、GC含有率を増加させてmRNAの安定性を増加させ、コドン最適化を行い、したがって細胞内の翻訳を亢進させ得る。
本発明で使用するRNAの文脈における用語「修飾」には、前記RNA中に天然で存在しない、RNAの任意の修飾が含まれる。
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用するRNAは非キャップ5'-三リン酸を有さない。そのような非キャップ5'-三リン酸の除去は、RNAをホスファターゼで処理することによって達成することができる。
本発明によるRNAは、その安定性を増加する及び/又は細胞毒性を低下するために、修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態では、本発明に従って使用するRNA中で、シチジンを5-メチルシチジンで部分的又は完全に、好ましくは完全に置換する。或いは又はそれに加えて、一実施形態では、本発明に従って使用するRNA中で、ウリジンをプソイドウリジンで部分的又は完全に置換する。好まれる実施形態では、修飾リボヌクレオチドを有する本発明に係るRNAは依然として、Toll様受容体アゴニストとして作用する能力を有する。
一実施形態では、用語「修飾」とは、RNAに5'-cap又は5'-cap類似体を提供することに関する。用語「5'-cap」とは、mRNA分子の5'末端上に見つかるcap構造をいい、一般に、普通ではない5'から5'の三リン酸結合を介してmRNAと連結したグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは7位でメチル化されている。用語「従来の5'-cap」とは、天然に存在するRNA5'-cap、好ましくは7-メチルグアノシンキャップ(m7G)をいう。本発明の文脈において、用語「5'-cap」には、RNAcap構造に似ており、好ましくはインビボ及び/又は細胞内でそれと付着している場合にRNAを安定化させる及び/又はRNAの翻訳を亢進させる能力を有するように修飾されている、5'-cap類似体が含まれる。
RNAに5'-cap又は5'-cap類似体を提供することは、前記5'-cap又は5'cap類似体の存在下におけるDNA鋳型のインビトロ転写によって達成してよく、前記5'-capが作製されたRNA鎖内に同時転写的に取り込まれるか、又は、RNAは、例えばインビトロ転写によって作製されてよく、5'-capは、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にRNAに付着させてよい。
RNAは更なる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用するRNAの更なる修飾は、天然に存在するポリ(A)テイルの伸長若しくは切断、又は、前記RNAのコード領域に関連していないUTRの導入、例えば、グロビン遺伝子、例えばアルファ2-グロビン、アルファ1-グロビン、ベータ-グロビン、好ましくはベータ-グロビン、より好ましくはヒトベータ-グロビンに由来する1つ若しくは複数、好ましくは2コピーの3'-UTRによる既存の3'-UTRの交換若しくはその挿入等の、5'-若しくは3'-非翻訳領域(UTR)の変更であり得る。
マスキングされていないポリ-A配列を有するRNAは、マスキングされたポリ-A配列を有するRNAよりも効率的に翻訳される。用語「ポリ(A)テイル」又は「ポリ-A配列」とは、典型的にはRNA分子の3'末端上に位置するアデニル(A)残基の配列に関し、「マスキングされていないポリ-A配列」とは、RNA分子の3'末端のポリ-A配列がポリ-A配列のAで終了し、ポリ-A配列の3'末端、即ち下流に位置するA以外のヌクレオチドが続かないことを意味する。更に、約120塩基対の長いポリ-A配列は、RNAの最適な転写安定性及び翻訳効率をもたらす。
したがって、本発明に従って使用するRNAの安定性及び/又は発現を増加させるために、好ましくは10〜500、より好ましくは30〜300、更により好ましくは65〜200、特に100〜150個のアデノシン残基の長さを有するポリ-A配列と共に存在するようにこれを修飾し得る。特に好ましい実施形態では、ポリ-A配列は約120個のアデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用するRNAの安定性及び/又は発現を更に増加させるために、ポリ-A配列をマスキングしないことができる。
更に、RNA分子の3'-非翻訳領域内への3'-非翻訳領域(UTR)の取り込みは、翻訳効率の亢進をもたらすことができる。2個以上のそのような3'-非翻訳領域を取り込ませることによって、相乗効果を達成し得る。3'-非翻訳領域は、それらが導入されるRNAに対して自己又は異種であり得る。特定の一実施形態では、3'-非翻訳領域はヒトβ-グロビン遺伝子に由来する。
上述の修飾の組合せ、即ちポリ-A配列の取り込み、ポリ-A配列の脱マスキング及び1つ又は複数の3'-非翻訳領域の取り込みは、RNAの安定性及び翻訳効率の増加に対して相乗的な影響を有する。
用語、RNAの「安定性」とは、RNAの「半減期」に関連する。「半減期」とは、分子の活性、量、又は数の半分を排除するために必要な期間に関する。本発明の文脈において、RNAの半減期は前記RNAの安定性の指標である。RNAの半減期は、RNAの「発現の持続期間」に影響を与え得る。長い半減期を有するRNAは長期間の間発現されることを予測することができる。
もちろん、RNAの安定性及び/又は翻訳効率を減少させることが望ましい場合は、RNAの安定性及び/又は翻訳効率を増加させる上述の要素の機能を妨害するようにRNAを修飾することが可能である。
用語「発現」とは、最も一般的な意味で使用され、例えば転写及び/又は翻訳による、RNA及び/又はペプチド若しくはポリペプチドの産生を含む。RNAに関して、用語「発現」又は「翻訳」とは、特にペプチド又はポリペプチドの産生に関する。また、これは核酸の部分的発現も含む。更に、発現は一過性又は安定であることができる。
用語発現には、「異常な発現」又は「異常発現」も含まれる。「異常な発現」又は「異常発現」とは、参照、例えば、特定のタンパク質、例えば腫瘍抗原の異常な発現又は異常発現に関連している疾患に罹患していない対象の状態と比較して、発現が変更されている、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加とは、少なくとも10%、特に少なくとも20%、少なくとも50%若しくは少なくとも100%、又はそれより多くの増加をいう。一実施形態では、発現は患部組織中でのみ見つかり、健康な組織中の発現は抑制されている。
用語「特異的に発現される」とは、タンパク質が本質的に特異的組織又は器官中でのみ発現されることを意味する。例えば、胃粘膜中で特異的に発現される腫瘍抗原とは、前記タンパク質が主に胃粘膜中で発現され、他の組織中では発現されない又は他の組織若しくは器官種中では有意な程度には発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞中で排他的に発現され、精巣等の任意の他の組織中では有意により少ない程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞中で特異的に発現される。一部の実施形態では、腫瘍抗原はまた、正常状態下では、複数の組織型又は器官、例えば2つ又は3つの組織型又は器官であるが、好ましくは3つ以下の異なる組織又は器官種中で特異的に発現され得る。この場合、腫瘍抗原はこれらの器官中で特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が正常状態下で肺及び胃中で好ましくはほぼ同程度に発現される場合、前記腫瘍抗原は肺及び胃中で特異的に発現される。
本発明の文脈において、用語「転写」とは、DNA配列の遺伝暗号がRNAへと転写されるプロセスに関する。続いて、RNAはタンパク質へと翻訳され得る。本発明によれば、用語「転写」は「インビトロ転写」を含み、用語「インビトロ転写」とは、RNA、特にmRNAが、無細胞系中で、好ましくは適切な細胞抽出物を使用してインビトロ合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターを転写物の作製に応用する。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと命名され、用語「ベクター」によって包含される。本発明で使用するRNAは好ましくはインビトロ転写RNA(IVT-RNA)であり、適切なDNA鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモーターは、任意のRNAポリメラーゼの任意のプロモーターであることができる。RNAポリメラーゼの具体的な例は、T7、T3、及びSP6 RNAポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写は、T7又はSP6プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのDNA鋳型は、核酸、特にcDNAをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクター内に導入することによって得られ得る。cDNAはRNAの逆転写によって得られ得る。
用語「翻訳」とは、メッセンジャーRNAの鎖がアミノ酸の配列のアセンブリを指示してペプチド又はポリペプチドを作製する、細胞のリボソーム中のプロセスに関する。
本発明の文脈において核酸と機能的に連結することができる発現制御配列又は調節配列は、該核酸に関して相同又は異種であり得る。コード配列及び調節配列は、コード配列の転写又は翻訳が調節配列の制御下又は影響下となるように一緒に共有結合されている場合に、「機能的に」一緒に連結されている。調節配列とコード配列との機能的連結を用いてコード配列を機能的タンパク質へと翻訳させる場合は、調節配列の誘導は、コード配列の読み枠のシフト又はコード配列が所望のタンパク質若しくはペプチドへと翻訳されないことを引き起こさずに、コード配列の転写をもたらす。
本発明との関連において、用語「発現制御配列」又は「調節配列」とは、核酸の転写又は誘導されたRNAの翻訳を制御する、プロモーター、リボソーム結合配列及び他の制御要素を含む。ある実施形態では、調節配列を制御することができる。調節配列の正確な構造は種又は細胞種応じて変動する可能性があるが、一般に、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等の転写又は翻訳の開始に関与している5'-非転写並びに5'-及び3'-非翻訳配列を含む。特に、5'-非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のプロモーター配列が含まれるプロモーター領域を含む。また、調節配列は、エンハンサー配列又は上流の活性化配列も含むことができる。
好ましくは、細胞中で発現させるRNAを前記細胞内に導入する。本発明による方法の一実施形態では、細胞内に導入するRNAは適切なDNA鋳型のインビトロ転写によって得られる。
「発現することができるRNA」及び「コードしているRNA」等の用語は本明細書中で互換性があるように使用され、特定のペプチド又はポリペプチドに関しては、RNAは、適切な環境中で、好ましくは細胞内に存在する場合、発現させて前記ペプチド又はポリペプチドを産生することができることを意味する。好ましくは、RNAは、細胞の翻訳機構と相互作用して、それが発現することができるペプチド又はポリペプチドを提供することができる。
「移す」、「導入する」又は「形質移入する」等の用語は本明細書中で互換性があるように使用され、核酸、特に外因性又は異種の核酸、特にRNAを細胞内に導入することに関する。本発明によれば、細胞は、器官、組織及び/又は生物の一部を形成することができる。本発明によれば、核酸の投与は、裸の核酸として達成する、又は投与試薬と組み合わせて達成するのいずれかである。ある。好ましくは、核酸の投与は裸核酸の形態である。好ましくは、RNAはRNase阻害剤等の安定化物質と組み合わせて投与する。また、本発明は、長期間の持続的発現を可能にするために核酸を細胞内に繰返し導入することも想定している。
細胞は、例えばRNAと複合体を形成すること又はRNAを封入若しくはカプセル封入する小胞を形成することによってRNAと会合させ、裸RNAと比較して増加したRNAの安定性をもたらすことができる、任意の担体を用いて形質移入することができる。有用な担体には、例えば、カチオン性脂質、リポソーム、特に陽イオン性リポソーム、及びミセル等の脂質含有担体、並びにナノ粒子が含まれる。カチオン性脂質は負荷電の核酸と複合体を形成し得る。任意のカチオン性脂質を使用し得る。
好ましくは、細胞、特にインビボで存在する細胞内へのペプチド又はポリペプチドをコードしているRNAの導入は、細胞中での前記ペプチド又はポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に標的化することが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために適用する担体(例えばレトロウイルス又はリポソーム)は、標的化分子を示す。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質又は標的細胞上の受容体のリガンドに特異的な抗体等の分子を、核酸担体内に取り込ませ得る、又はそれと結合させ得る。核酸をリポソームによって投与する場合、標的化及び/又は取り込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連している表面膜タンパク質と結合するタンパク質をリポソーム配合物内に取り込ませ得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞種、内部移行されるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的とするタンパク質等に特異的なカプシドタンパク質又はその断片を包含する。
用語「細胞」又は「宿主細胞」は、好ましくは、無処置の細胞、即ち、酵素、オルガネラ、又は遺伝物質等のその正常な細胞内成分を放出していない無処置の膜を有する細胞である。無処置の細胞は、好ましくは、生細胞、即ちどの正常な代謝機能を実施することができる生細胞である。好ましくは、前記用語は、外因性の核酸を用いて形質転換又は形質移入することができる任意の細胞に関する。用語「細胞」には、原核細胞(例えば大腸菌(E.coli))又は真核細胞(例えば、樹状細胞、B細胞、CHO細胞、COS細胞、K562細胞、HEK293細胞、HELA細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞)が含まれる。外因性の核酸は、細胞内に(i)それ自体で自由に分散して、(ii)組換えベクター内に組み込まれて、又は(iii)宿主細胞ゲノム若しくはミトコンドリアDNA内に組み込まれて見つかり得る。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類からの細胞等の哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は多数の組織型に由来していてよく、初代細胞及び細胞系が含まれる。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、及び胚性幹細胞が含まれる。更なる実施形態では、細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、又はマクロファージである。
核酸分子を含む細胞は、好ましくは核酸によってコードされているペプチド又はポリペプチドを発現する。
用語「クローン増殖」とは、特定の実体が増えるプロセスをいう。本発明の文脈において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特異的リンパ球が増幅される免疫学的応答との関連で使用される。好ましくは、クローン増殖はリンパ球の分化をもたらす。
「低下させる」又は「阻害する」等の用語は、好ましくは5%以上、10%以上、20%以上、より好ましくは50%以上、最も好ましくは75%以上の全体的なレベルの減少を引き起こす能力に関する。用語「阻害する」又は同様の語句には、完全な又は本質的に完全な阻害、即ちゼロ又は本質的にゼロまでの低下が含まれる。
「増加させる」、「亢進させる」、「促進する」又は「延長する」等の用語は、好ましくは、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも100%、好ましくは少なくとも200%、特に少なくとも300%の増加、亢進、促進又は延長に関する。また、これらの用語は、ゼロ又は測定不可能又は検出不可能なレベルからゼロより高いレベル又は測定可能若しくは検出可能なレベルへの増加、亢進、促進又は延長にも関し得る。
本発明によれば、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって共有結合した、2個以上、好ましくは3個以上、好ましくは4個以上、好ましくは6個以上、好ましくは8個以上、好ましくは10個以上、好ましくは13個以上、好ましくは16個以上、好ましくは21個以上、且つ好ましくは8、10、20、30、40又は50個まで、特に100個のアミノ酸を含む物質をいう。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、大きなペプチド、好ましくは100個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドをいうが、一般に、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同義語であり、本明細書中で互換性があるように使用される。本発明によれば、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関する用語「修飾」又は「配列変化」は、野生型ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列等、親配列と比較した、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質における配列変化に関する。この用語は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体及びアミノ酸置換変異体、好ましくはアミノ酸置換変異体を含む。本発明によるこれらの配列変化は全て、新たなエピトープを潜在的に生じ得る。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に1個若しくは2個又はそれより多くのアミノ酸の挿入を含む。
アミノ酸付加変異体は、1、2、3、4若しくは5個、又はそれより多くのアミノ酸等の1つ又は複数のアミノ酸のアミノ及び/又はカルボキシ末端融合を含む。
アミノ酸欠失変異体は、配列からの1個又は複数のアミノ酸の除去、例えば、1、2、3、4若しくは5個又はそれ以上のアミノ酸の除去を特徴付けられる。
アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、別の残基がその代わりに挿入されることによって特徴付けられる。
本発明によれば、本発明の方法における検査に使用される修飾又は修飾されたペプチドは、修飾を含むタンパク質に由来することができる。
本発明によれば、用語「由来する」とは、特定の実体、特に特定のペプチド配列が、それが由来する物体に存在することを意味する。アミノ酸配列、特に特定の配列領域の場合、「由来する」とは、特に、関連するアミノ酸配列が、それが存在するアミノ酸配列に由来することを意味する。
免疫療法剤は、本明細書に記載されている方法によって適した用量が決定されたら、適した用量で免疫療法剤を投与することにより、疾患、例えば、抗原を発現し、抗原ペプチドを提示する罹患細胞の存在によって特徴付けられる疾患を有する対象の処置に使用することができる。特に好ましい疾患は、癌疾患である。本明細書に記載されている免疫療法剤を免疫化又はワクチン接種に使用して、本明細書に記載されている疾患を予防することもできる。
斯かる免疫療法剤の1つは、がん細胞においてのみ発現されるネオエピトープに基づいて設計されたがんワクチン等、ワクチンである。
本発明によれば、用語「ワクチン」とは、投与の際に、病原体又は癌細胞等の疾患細胞を認識して攻撃する免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘導する、医薬調製物(医薬組成物)又は生成物に関する。ワクチンは、疾患の防止又は処置に使用し得る。用語「個人化癌ワクチン」又は「個別化癌ワクチン」は、特定の癌患者に関わり、癌ワクチンが、個々の癌患者の必要又は特殊な状況に適応されることを意味する。
本発明に従って提供される癌ワクチンは、患者に投与した場合に、患者の腫瘍に特異的なT細胞の刺激、プライミング及び/又は増大用の1つ又は複数のT細胞エピトープを提供することができる。T細胞は、好ましくは、T細胞エピトープが由来する抗原を発現している細胞に対して方向付けられる。よって、本明細書中に記載されているワクチンは、好ましくは、クラスI MHCによる1つ又は複数の腫瘍関連ネオ抗原の提示によって特徴付けられる癌疾患に対する細胞性応答、好ましくは、細胞傷害性T細胞活性を誘導又は促進することができる。本明細書において提供されたワクチンは癌特異的突然変異を標的とするため、これは患者の腫瘍に特異的となる。
本発明の一実施形態では、ワクチンは、患者に投与されると、適したエピトープであると予測されるアミノ酸修飾又は修飾ペプチドを取り込む、2種以上、5種以上、10種以上、15種以上、20種以上、25種以上、30種以上、好ましくは最大60種、最大55種、最大50種、最大45種、最大40種、最大35種又は最大30種のT細胞エピトープ等、1種又は複数のT細胞エピトープ(ネオエピトープ、適したネオエピトープ、本明細書で同定される適したネオエピトープの組合せ)を好ましくは提供するワクチンに関する。患者の細胞、特に抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示は、好ましくは、MHCに結合した際にT細胞がエピトープを標的化すること、したがって、患者の腫瘍、好ましくは原発性腫瘍及び腫瘍転移が、MHCに提示されたT細胞エピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面上に同じエピトープを提示することをもたらす。
更に別の工程を行って、がんワクチン接種のためのエピトープを含有する同定されたアミノ酸修飾又は修飾ペプチドの有用性を決定することができる。したがって、更なる工程は以下のうちの1つ又は複数を含むことができる:(i) 修飾が既知の又は予測されたMHCに提示されたエピトープ中に位置するかどうかの評価、(ii)修飾がMHCに提示されたエピトープ中に位置するかどうかのインビトロ及び/又はin silico試験、例えば、修飾が、MHCに提示されたエピトープへとプロセシングされる及び/又はそれとして提示されるペプチド配列の一部であるかどうかの試験、並びに(iii)想定された修飾されたエピトープが、特にその天然の配列構成で存在する場合、例えば天然に存在するタンパク質中で前記エピトープにも隣接するアミノ酸配列に隣接している場合、及び抗原提示細胞中で発現された場合に、所望の特異性を有する患者のT細胞等、T細胞を刺激することができるかどうかのインビトロ試験。そのような隣接配列は、それぞれ3個以上、5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含んでいてよく、N末端及び/又はC末端でエピトープ配列に隣接していてよい。
本発明に従って決定される修飾されたペプチドは、癌ワクチン接種用のエピトープとしてその有用性について順位付けし得る。したがって、一態様では、同定された修飾されたペプチドが、提供するそれぞれのワクチンにおけるその有用性について分析及び選択される、手動又はコンピュータベースの分析処理が使用され得る。好ましい実施形態では、前記分析処理はコンピュータアルゴリズムベースの処理である。好ましくは、前記分析処理は、以下の工程のうちの1つ又は複数、好ましくは、前記分析方法は、免疫原性となるその能力の予測に従ってエピトープを決定及び/又はランク付けする工程を含む。
本発明に従って同定され、ワクチン中に提供されるエピトープは、好ましくは、ポリエピトープポリペプチド又は前記ポリペプチドをコードする核酸、特にRNA等、前記エピトープを含むポリペプチドの形態で存在する。更に、エピトープは、ワクチン配列の形態でポリペプチド中に存在し得る、即ち、その天然配列の文脈で、例えば、天然起源のタンパク質において前記エピトープに同様に隣接するアミノ酸配列に隣接して存在し得る。そのような隣接配列は、それぞれ5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含んでいてよく、N末端及び/又はC末端でエピトープ配列に隣接していてよい。したがって、ワクチン配列は、20個以上、25個以上、30個以上、35個以上、40個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含み得る。一実施形態では、エピトープ及び/又はワクチン配列はポリペプチド中で頭-尾で並んでいる。
一実施形態では、本明細書で同定されるエピトープ及び/又はワクチン配列はリンカー、特に中性リンカーによって離間されている。本発明との関連において使用される用語「リンカー」とは、エピトープ又はワクチン配列等の2つのペプチドドメインの間に付加して前記ペプチドドメインを接続するペプチドに関する。リンカー配列に関して特に制限はない。しかし、リンカー配列は2つのペプチドドメイン間の立体障害を減らし、良好に翻訳され、エピトープのプロセシングを支援又は許可することが好ましい。更に、リンカーは免疫原性の配列要素を有さない、又は僅かしか有さないべきである。リンカーは、好ましくは、所望しない免疫反応を生じ得る、近接エピトープ間の接合部縫合から生じたもの等の非内在性エピトープを作成するべきではない。したがって、ポリエピトープワクチンは、好ましくは、所望しないMHC結合性接合部エピトープの数を減らすことができるリンカー配列を含有するべきである。Hoytら(EMBO J. 25(8)、1720〜9頁、2006)及びZhangら(J. Biol. Chem.、279(10)、8635〜41頁、2004)は、グリシンに富んだ配列はプロテアソームプロセシングを損なわせ、したがって、グリシンに富んだリンカー配列の使用は、プロテアソームによるプロセシングが可能なリンカーに含有されるペプチドの数を最小限にする働きを持つことを示している。更に、グリシンは、MHC結合溝位置で強力な結合を阻害することが観察された(Abastadoら、1993、J. Immunol. 151(7): 3569〜75頁)。Schlessingerら、2005、Proteins、61(1): 115〜26頁は、アミノ酸配列中に含められたアミノ酸グリシン及びセリンは、プロテアソームによってより効率的に翻訳及びプロセシングされ、コードされているエピトープへのより良好な接近を可能にする、より柔軟なタンパク質をもたらすことを発見した。リンカーは、それぞれ3個以上、6個以上、9個以上、10個以上、15個以上、20個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーはグリシン及び/又はセリンアミノ酸に富んでいる。好ましくは、リンカーのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%はグリシン及び/又はセリンである。好ましい一実施形態では、リンカーはアミノ酸グリシン及びセリンから実質的に構成される。一実施形態では、リンカーはアミノ酸配列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)eを含み、式中、a、b、c、d及びeは独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20から選択される数字であり、a+b+c+d+eは0とは異なり、好ましくは2以上、3以上、4以上又は5以上である。一実施形態では、リンカーは、配列GGSGGGGSG等の、実施例中に記載のリンカー配列を含めた本明細書中に記載の配列を含む。
特に好まれる一実施形態では、ポリエピトープポリペプチド等、1種又は複数のネオエピトープが組み込まれているポリペプチドは、核酸、好ましくは、in vitro転写された又は合成RNA等のRNAの形態で患者に投与され得る免疫療法剤であり、この核酸は、抗原提示細胞等の患者の細胞において発現されて、ポリペプチドを産生することができる。本発明の目的のため、用語「ポリエピトープポリペプチド」によって含まれ、好ましくは、抗原提示細胞等の患者の細胞において発現されて、1種又は複数のポリペプチドを産生することができる、核酸、好ましくは、in vitro転写された又は合成RNA等のRNAの形態の、1種又は複数のマルチエピトープポリペプチドの投与も想定される。複数のマルチエピトープポリペプチドを投与する場合、異なるマルチエピトープポリペプチドによって提供される適したネオエピトープは異なる又は部分的に重複していてよい。ひとたび抗原提示細胞等の患者の細胞中に存在すると、本発明によるポリペプチドはプロセシングされ、本発明に従って同定された適したネオエピトープを産生する。本発明に従って提供されるワクチンの投与は、MHCに提示されたエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD4+ヘルパーT細胞応答を誘発することができる、MHCクラスIIに提示されたエピトープを好ましくは提供し得る。代替的に又はその上、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、MHCに提示されたネオエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD8+T細胞応答を誘発することができる、MHCクラスIに提示されたネオエピトープを提供し得る。更に、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、1つ又は複数のネオエピトープ(既知のネオエピトープ及び本発明に従って同定された適したネオエピトープが含まれる)、並びに癌特異的体細胞突然変異を含有しないが、癌細胞によって発現され、好ましくは癌細胞に対する免疫応答、好ましくは癌特異的免疫応答を誘導する1つ又は複数のエピトープを提供し得る。一実施形態では、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、MHCクラスIIに提示されたエピトープである及び/又はMHCに提示されたエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD4+ヘルパーT細胞応答を誘発することができるネオエピトープ、並びに癌特異的体細胞突然
変異を含有せず、MHCクラスIに提示されたエピトープである及び/又はMHCに提示されたエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD8+T細胞応答を誘発することができるエピトープを提供する。一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を含有しないエピトープは腫瘍抗原に由来する。一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を含有しないネオエピトープ及びエピトープは癌の処置において相乗効果を有する。好ましくは、本発明に従って提供されるワクチンは細胞毒性及び/又はヘルパーT細胞応答のポリエピトープ刺激に有用である。
本発明に従って提供されるワクチンは組換えワクチンであり得る。
用語「組換え」とは、本発明との関連において、「遺伝子操作によって作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明との関連での組換えポリペプチド等の「組換え実体」は天然に存在せず、好ましくは、天然では組み合わされないアミノ酸又は核酸配列等の実体の組合せの結果である。例えば、組換えポリペプチドは、本発明との関連において、ネオエピトープ、又は異なるタンパク質若しくは同じタンパク質の異なる部分が例えばペプチド結合若しくは適切なリンカーによって一緒に融合されたものに由来するワクチン配列等の、いくつかのアミノ酸配列を含有し得る。
本明細書中で使用する用語「天然に存在する」とは、物体を自然で見つけることができることをいう。例えば、生物(ウイルスを含めて)中に存在し、天然源から単離することができ、人によって実験室内で意図的に改変されていないペプチド又は核酸は、天然に存在する。
本発明によれば、用語「疾患」とは、癌疾患、特に本明細書中に記載の癌疾患の形態を含めた任意の病理状態をいう。
用語「正常な」とは、健康な状態又は健康な対象若しくは組織、即ち非病的状態における状態をいい、「健康な」とは、好ましくは非癌性であることを意味する。
「抗原を発現する細胞を含む疾患」とは、患部組織又は器官の細胞において抗原の発現が検出されることを意味する。患部組織又は器官の細胞中の発現は、健康な組織又は器官の状態と比較して増加していてよい。増加とは、少なくとも10%、特に少なくとも20%。少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、少なくとも1000%、少なくとも10000%又は更にそれより多くの増加をいう。一実施形態では、発現は患部組織中でのみ見つかり、健康な組織中の発現は抑制される。本発明によれば、抗原を発現する細胞を含む又はそれに関連する疾患には癌疾患が含まれる。
癌(医学用語は悪性新生物)とは、細胞の群が非制御の成長(正常な限界を超えた分裂)、侵襲(近接組織の侵入及び破壊)、並びに場合によっては転移(リンパ又は血液を介した身体内の他の位置への拡散)を示す疾患のクラスである。これら3つの癌の悪性特性により、これらが自己限定的であり浸潤又は転移しない良性腫瘍から区別される。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、白血病等の一部のものは形成しない。
悪性腫瘍は、癌と本質的に同義である。悪性疾患、悪性新生物、及び悪性腫瘍は癌と本質的に同義である。
本発明によれば、用語「腫瘍」又は「腫瘍疾患」とは、好ましくは腫脹又は病変を形成する、細胞の異常成長(新生細胞、腫瘍形成性細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる)をいう。「腫瘍細胞」とは、迅速な非制御の細胞増殖によって成長し、新しい成長を開始した刺激が終わった後に成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は構造的組織化及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常は、良性、前悪性又は悪性のいずれかであり得る明確な組織塊を形成する。
良性腫瘍は、癌の悪性特性のうち全3種を欠如する腫瘍である。よって、定義によると、良性腫瘍は、無制限の侵襲性様式で成長せず、周囲の組織に侵入せず、非隣接性組織に拡散(転移)しない。
新生物とは、新形成の結果としての異常な組織塊である。新形成(ギリシャ語で新しい成長)とは、細胞の異常増殖である。細胞の成長は、その周りの正常組織の成長を上回り、協調的でない。成長は刺激が終わった後さえも同じ過剰な様式で持続する。これは通常は塊又は腫瘍を引き起こす。新生物は良性、前悪性又は悪性であり得る。
本発明との関連による「腫瘍の成長」又は「腫瘍成長」とは、腫瘍の大きさが大きくなる傾向及び/又は腫瘍細胞が増殖する傾向に関する。
本発明の目的のために、用語「癌」及び「癌疾患」は、用語「腫瘍」及び「腫瘍疾患」と互換性があるように使用される。
癌は腫瘍に似ている細胞の種類、したがって腫瘍の起源であると推定される組織の種類によって分類される。これらはそれぞれ組織学及び位置である。
本発明による用語「癌」は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳癌、子宮頸癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸管癌、頭頸部癌、胃腸癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳、鼻及び咽頭(ENT)癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌及び肺癌並びにその転移を含む。その例は、肺癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、又は上述の癌種若しくは腫瘍の転移である。また、本発明によれば、用語癌は癌の転移及び癌の再発(relapse)も含む。
「転移」とは、その元の部位から身体の別の部分への癌細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外基質の侵襲、体腔及び血管に入るための内皮基底膜の貫通、その後、血液によって輸送された後に、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位での新しい腫瘍、即ち二次腫瘍又は転移性腫瘍の成長は血管形成に依存する。腫瘍転移は、多くの場合、原発性腫瘍の除去後にも起こり、これは腫瘍細胞又は構成要素が残って転移能を発生し得るためである。一実施形態では、本発明による用語「転移」とは、原発性腫瘍及び所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
二次又は転移性腫瘍の細胞は元の腫瘍のものに似ている。これは、例えば卵巣癌が肝臓に転移する場合、二次腫瘍は異常肝細胞ではなく異常卵巣細胞から構成されていることを意味する。この場合、肝臓中の腫瘍は肝臓癌ではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
用語「循環腫瘍細胞」又は「CTC」とは、原発性腫瘍又は腫瘍転移から脱離して血流中に循環する細胞に関する。CTCは、続く様々な組織中の更なる腫瘍(転移)の成長の種子を構成し得る。循環腫瘍細胞は、転移性疾患に罹患している患者の全血1mLあたり約1〜10個のCTCの頻度で見つかる。CTCを単離するための研究方法が開発されている。当技術分野においてCTCを単離するためのいくつかの研究方法、例えば、上皮細胞が正常な血液細胞中では存在しない細胞接着タンパク質EpCAMを一般的に発現することを使用する技法が記載されている。免疫磁気ビーズに基づく捕捉は、血液検体を、磁気粒子とコンジュゲートさせたEpCAMに対する抗体で処理し、続いて、タグ付けされた細胞を磁場中で分離することを含む。その後、単離した細胞を別の上皮マーカー、サイトケラチン、及び一般的な白血球マーカーCD45に対する抗体で染色することによって、稀なCTCを汚染白血球から識別する。この頑強且つ半自動的な手法は、CTCを約1個のCTC/mLの平均収率及び0.1%の純度で同定する(Allardら、2004、Clin Cancer Res 10: 6897〜6904頁)。CTCを単離するための第2の方法は、EpCAMに対する抗体でコーティングすることによって機能的にした80,000個のマイクロポストを包埋したチャンバに全血を流すことを含む、マイクロ流体に基づくCTC捕捉装置を使用する。その後、CTCをサイトケラチン又は前立腺癌におけるPSA若しくは乳癌におけるHER2等の組織特異的マーカーのいずれかに対する二次抗体で染色し、マイクロポストを複数の平面で三次元座標に沿って自動走査することによって可視化する。CTC-チップは、患者中のサイトケラチン(cytokerating)陽性循環腫瘍細胞を、収率の中央値が50個の細胞/ml、純度の範囲が1〜80%で同定することができる(Nagrathら、2007、Nature 450: 1235〜1239頁)。CTCを単離するための別の可能性は、血液の管中のCTCを捕捉、同定、及び計数するVeridex,LLC社(ニュージャージー州Raritan)のCellSearch(商標)循環腫瘍細胞(CTC)試験を使用することである。CellSearch(商標)システムは、全血中のCTCを数え上げるための米国食品医薬品局(FDA)に認可された方法であり、免疫磁気標識及び自動デジタル顕微鏡観察の組合せに基づく。CTCを単離するための他の方法が文献中に記載されており、その全てを本発明と併せて使用することができる。
再発(relapse又はrecurrence)は、人が、過去に影響を受けていた状態によって再度影響を受ける場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患を患い、前記疾患の処置を受けて成功し、前記疾患を再度発症する場合、前記新しく発症した疾患は再発(relapse又はrecurrence)としてみなされ得る。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再発(relapse又はrecurrence)は、元の腫瘍の部位疾患で起こってもよいが、必ずしもそうである必要はない。したがって、例えば、患者が卵巣腫瘍を患っており、受けた処置が成功した場合、再発(relapse又はrecurrence)は、卵巣腫瘍の発生又は卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生であり得る。また、腫瘍の再発(relapse又はrecurrence)には、腫瘍が元の腫瘍の部位とは異なる部位で発生する状況及び元の腫瘍の部位で発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が処置を受けた元の腫瘍は原発性腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位での腫瘍は二次又は転移性腫瘍である。
用語「免疫療法」は、免疫応答の誘導、増強又は抑制による、疾患又は状態の処置に関する。免疫応答を誘発又は増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類されるが、免疫応答を低下又は抑制する免疫療法は、抑制免疫療法として分類される。用語「免疫療法」は、抗原免疫化若しくは抗原ワクチン接種又は腫瘍免疫化若しくは腫瘍ワクチン接種を含む。用語「免疫療法」は、また、不適切な免疫応答が、リウマチ性関節炎、アレルギー、糖尿病又は多発性硬化症等の自己免疫性疾患の文脈で、より適切な応答にモジュレートされるような免疫応答の操作に関する。
用語「免疫化」又は「ワクチン接種」は、例えば治療上又は予防上の理由から、免疫応答を誘導する目的で、個体に抗原を投与するプロセスを表す。
「処置する」とは、対象における腫瘍の大きさ若しくは腫瘍の数の低下;対象における疾患の抑止若しくは緩徐化;対象における新たな疾患の発症の阻害若しくは緩徐化;疾患に現在罹患している若しくは以前に罹患していた対象において症状及び/若しくは再発の頻度若しくは重篤度を減少させること;及び/又は対象の寿命の延長、即ち、増加を含む、疾患を予防又は排除するために、本明細書に記載されている免疫療法剤又は免疫療法剤を含む組成物を対象に投与することを意味する。特に、用語「疾患の処置」には、疾患の発症又はその症状を治癒すること、持続期間を短縮すること、進行若しくは悪化を寛解、防止、遅延若しくは阻害すること、又は防止若しくは遅延させることが含まれる。
「危険性がある」とは、一般集団と比較して疾患、特に癌を発症する可能性が正常よりも高いと同定された対象、即ち患者を意味する。更に、疾患、特に癌を患っていた、又は現在患っている対象とは、そのような対象は疾患を発症し続け得るため、疾患を発症する危険性が増加した対象である。また、癌を現在患っている、又は患っていた対象も癌の転移の危険性が増加している。
免疫療法の予防的投与、例えば免疫療法剤又は免疫療法剤を含む組成物の予防的投与は、好ましくはレシピエントを疾患の発症から保護する。免疫療法の治療的投与、例えば免疫療法剤の治療的投与は、疾患の進行/成長の阻害をもたらし得る。これは、好ましくは疾患の排除をもたらす疾患の進行/成長の減速、特に疾患の進行の破壊を含む。
免疫療法は、本明細書中に提供する薬物が疾患細胞を患者から除去するように機能する、様々な技法のうちの任意のものを使用して行い得る。そのような除去は、患者において抗原又は抗原を発現する細胞に特異的な免疫応答を亢進又は誘導することの結果として起こり得る。
免疫療法剤及び組成物は、単独で、又は手術、照射法、化学療法及び/若しくは骨髄移植(自己、同系の、アロジェネイック又は非関連)等の従来の治療レジメンと組み合わせて使用し得る。
用語「インビボ」とは、対象内の状況に関する。
用語「対象」、「個体」、「生物」又は「患者」は、脊椎動物、特に、哺乳類に関し、本明細書において互換的に使用されている。例えば、本発明の文脈における哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等の飼い慣らされた哺乳類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等の実験動物と共に、動物園の動物等の檻に入れられた動物である。これらの用語は、また、鳥類(特に、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ等の飼い慣らされた鳥類)及び魚類(特に、養殖魚類、例えば、サケ又はナマズ)等の非哺乳類脊椎動物に関する。また、本明細書中で使用する用語「動物」にはヒトも含まれる。
用語「自己」とは、同じ対象に由来する全てのものを記載するために使用する。例えば、「自己移植」とは、同じ対象に由来する組織又は器官の移植をいう。そのような手順は、そうでなければ拒絶をもたらす免疫学的障壁を克服するため有利である。
用語「異種」とは、複数の異なる要素からなるものを記載するために使用する。一例として、1つの個体の骨髄を別の個体内に移入することは異種移植を構成する。異種遺伝子とは、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
免疫化又はワクチン接種のための組成物の一部として、好ましくは1種又は複数の免疫療法剤を、免疫応答を誘導する又は免疫応答を増加させるための1種又は複数のアジュバントと一緒に投与する。用語「アジュバント」とは、免疫応答を延長又は亢進又は加速する化合物に関する。本発明の組成物は、好ましくはアジュバントを加えずにその効果を発揮する。それでも、本出願の組成物は任意の既知のアジュバントを含有し得る。アジュバントは油乳濁液(例えばフロイントアジュバント)、無機化合物(ミョウバン等)、細菌産物(百日咳菌(Bordetella pertussis)毒素等)、リポソーム、及び免疫刺激複合体等の化合物の異種群を含む。アジュバントの例は、モノホスホリル-脂質-A(MPL SmithKline Beecham)、QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham、WO96/33739号)、QS7、QS17、QS18、及びQS-L1等のサポニン(Soら、1997、Mol. Cells 7:178〜186頁)、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンE、モンタナイド(montanid)、ミョウバン、CpGオリゴヌクレオチド(Kriegら、1995、Nature 374:546〜549頁)、並びにスクワレン及び/又はトコフェロール等の生分解性の油から調製される様々な油中水乳濁液である。
また、患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与し得る。例えば、リンパ球に対するその調節特性のおかげで、ワクチン接種中でサイトカインを使用することが可能である。そのようなサイトカインは、例えば、ワクチンの保護作用を増加させることが示されたインターロイキン-12(IL-12)(Hall、1995、IL-12 at the crossroads、Science 268:1432〜1434頁を参照)、GM-CSF及びIL-18を含む。
免疫応答を亢進し、したがってワクチン接種において使用し得るいくつかの化合物が存在する。前記化合物は、B7-1及びB7-2(それぞれCD80及びCD86)等のタンパク質又は核酸の形態で提供される同時刺激分子を含む。
本発明によれば、「腫瘍検体」は、循環腫瘍細胞(CTC)等の腫瘍又は癌細胞を含有する身体試料、特に、体液を含む組織試料及び/又は細胞性試料等の試料である。本発明によれば、「非腫瘍性検体」は、循環腫瘍細胞(CTC)等の腫瘍又は癌細胞を含有しない身体試料、特に、体液を含む組織試料及び/又は細胞性試料等の試料である。そのような身体試料は、パンチ生検を含めた組織生検によって、及び血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便又は他の体液を採取することによって等の従来の様式で得られ得る。本発明によれば、用語「試料」には、生体試料の画分又は単離物、例えば核酸若しくは細胞の単離物等の加工試料も含まれる。
本明細書に記載されている免疫療法剤及びその組成物は、注射又は注入によるものを含むいずれか従来の経路により投与することができる。投与は、例えば、経口的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に又は経皮に実施し得る。一実施形態では、投与はリンパ節内への注射によって等の結節内で実施する。他の投与形態は、本明細書中に記載の核酸を用いた樹状細胞等の抗原提示細胞のインビトロ形質移入、次いで抗原提示細胞の投与を想定している。
用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない材料の無毒性を指す。
本発明の医薬組成物は、塩、バッファー、保存剤、担体及び任意選択で他の治療剤を含有することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、1種又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む。
用語「賦形剤」は、結合剤、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存料、乳化剤、バッファー、調味料又は着色料等、活性成分ではない、医薬組成物中のあらゆる物質を示すことが意図される。
用語「希釈剤」は、希釈及び/又は菲薄化用の薬剤に関する。更に、用語「希釈剤」は、流体、液体又は固体懸濁液及び/又は混合培地のうちいずれか1種又は複数を含む。
用語「担体」は、ヒトへの投与に適した、1種又は複数の適合性固体又は液体フィラー又は希釈剤に関する。用語「担体」は、活性成分の適用を容易にするために活性成分と組み合わされる、天然又は合成の有機又は無機成分に関する。好ましくは、担体成分は、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、ヒマワリ油等、鉱物油、動物又は植物に由来するものを含む、水又は油等の無菌液体である。塩溶液並びに水性デキストロース及びグリセリン溶液を水性担体化合物として使用することもできる。
治療用途のための薬学的に許容される担体又は希釈剤は、医薬品技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A. R Gennaro編、1985)に記載されている。適した担体の例として、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース・ナトリウム、低融点ワックス、カカオバターその他が挙げられる。適した希釈剤の例として、エタノール、グリセロール及び水が挙げられる。
医薬品担体、賦形剤又は希釈剤は、意図される投与経路及び標準薬務に関して選択することができる。本発明の医薬組成物は、担体、賦形剤若しくは希釈剤として又はこれに加えて、いずれか適した結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤及び/又は可溶化剤を含むことができる。適した結合剤の例として、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータ-ラクトース、トウモロコシ甘味料等の天然の糖、アカシア、トラガント等の天然及び合成のガム、又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールが挙げられる。適した潤滑剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムその他が挙げられる。保存料、安定剤、色素及び更には調味料が、医薬組成物中に提供されて良い。保存料の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤が使用されてもよい。
一実施形態では、組成物は、水性組成物である。水性組成物は、溶質、例えば、塩を任意選択で含むことができる。一実施形態では、組成物は、フリーズドライされた組成物の形態である。フリーズドライされた組成物は、それぞれの水性組成物をフリーズドライすることによって得ることができる。
本発明を、図及び実施例によって詳述し説明し、これらは例示目的でのみ使用し、限定することを意図しない。説明及び実施例のおかげで、同様に本発明に含まれる更なる実施形態が当業者によって利用可能である。
図1aは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性リンパ球数を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1aは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性リンパ球数を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1bは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血小板数を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1bは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血小板数を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1cは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IFN-α)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1cは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IFN-α)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1dは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IL-6)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1dは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IL-6)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1eは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IFN-γ、)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1eは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IFN-γ、)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1fは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IP-10)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図1fは、15名の個々の患者への異なる用量の四価RNA(LIP)ワクチンの投与前(プレ)及び後(2、6、24及び48時間)の、全身性血清サイトカインレベル(IP-10)を示すヒストグラムである。2回複製の平均値が描写されている。V=来診、一方、それぞれV2は第1の投与を表し、V3は第2の投与を表し、V4は第3の投与を表し、V5は第4の投与を表し、V6は第5の投与を表し、V7は第6の投与を表し、V8は第7の投与を表し、V9は第8の投与を表す。コホートI患者は、6回の投与(V2〜V7)のみを受けた。血液試料採取及び解析を標準方法に従って行った。
図2a〜図2hは、RNA-リポソーム製剤と単離されたPBMCとの6時間インキュベーション後(黒ドット)及び24時間インキュベーション後(白ドット)の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。単一データ点は、3回複製した実験の平均値である。
図3a〜図3hは、RNA-リポソーム製剤と全血との6時間インキュベーション後(黒ドット)及び24時間インキュベーション後(白ドット)の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。単一データ点は、3回複製した実験の平均値である。
図4a〜図4cは、全血(黒丸)、pDCを富化された全血(黒四角)及びiDC(黒三角)におけるRNA-リポソーム製剤の6時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。単一データ点は、3回複製した実験の平均値である。
図5a〜図5cは、全血(黒丸)、pDCを富化された全血(黒四角)及びpDC(黒三角)におけるRNA-リポソーム製剤の24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。単一データ点は、3回複製した実験の平均値である。
図6aは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6bは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6cは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6dは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6eは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6fは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6gは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6hは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6iは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図6jは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7aは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7bは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7cは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7dは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7eは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7fは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7gは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7hは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7iは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図7jは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、サイトカイン発現の量を示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図8aは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図8bは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図8cは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図8dは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図8eは、TLR-7の小分子アゴニストとPBMCとのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図9aは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図9bは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図9cは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図9dは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図9eは、TLR-7の小分子アゴニストと全血とのインキュベーション後の、24時間後の、相対的CD69発現によって測定される特定の免疫細胞の活性化のレベルを示すヒストグラムである。黒い丸、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)、白丸、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N-(1,1-ジオキソチエタン-3-イル)アセトアミド(SM2)。
図10aは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10bは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10cは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10dは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10eは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10fは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10gは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10hは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10iは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10jは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10kは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10lは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10mは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10nは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10oは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10pは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10qは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10rは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10sは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10tは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10uは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10vは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10wは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10xは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10yは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10zは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10aaは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10bbは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10ccは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10ddは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10eeは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10ffは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10ggは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10hhは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10iiは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10jjは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図10kkは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アセトアミド(SM1)の静脈内投与後の時点における、雄又は雌カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11aは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11bは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11cは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11dは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11eは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11fは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11gは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11hは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11iは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11jは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11kは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11lは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図11mは、小分子TLR-7アゴニスト、N-(4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル)-N-(1,1-ジオキシドチエタン-3-イル)アセトアミド(SM3)の静脈内投与後の時点における、雄カニクイザルの血液中のサイトカイン分泌のレベルを示すグラフである。
図12aは、TLR-8の小分子アゴニスト、2-エチル-1-(4-((2-メチルテトラヒドロフラン-3-イル)アミノ)ブチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM4)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図12bは、TLR-8の小分子アゴニスト、2-エチル-1-(4-((2-メチルテトラヒドロフラン-3-イル)アミノ)ブチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM4)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図12cは、TLR-8の小分子アゴニスト、2-エチル-1-(4-((2-メチルテトラヒドロフラン-3-イル)アミノ)ブチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM4)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図12dは、TLR-8の小分子アゴニスト、2-エチル-1-(4-((2-メチルテトラヒドロフラン-3-イル)アミノ)ブチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM4)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図12eは、TLR-8の小分子アゴニスト、2-エチル-1-(4-((2-メチルテトラヒドロフラン-3-イル)アミノ)ブチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM4)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図12fは、TLR-8の小分子アゴニスト、2-エチル-1-(4-((2-メチルテトラヒドロフラン-3-イル)アミノ)ブチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM4)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13aは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13bは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13cは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13dは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13eは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13fは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13gは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。
図13hは、TLR-8の小分子アゴニスト、1-(4-(シクロヘキシルアミノ)ブチル)-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(SM5)と異なるヒト個体から単離されたPBMCとの24時間インキュベーション後の、サイトカイン発現の量を示すグラフである。