WO2016159286A1 - 癌ワクチンの製造方法、及び癌ワクチン - Google Patents

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大野　典也
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株式会社細胞治療技術研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cancer vaccine containing cells presenting a cancer antigen peptide as an active ingredient.
  • Dendritic cells are one of professional antigen-presenting cells, and there are immature types and mature types. Immature dendritic cells have a high phagocytic ability of antigens. When antigens are taken up by peripheral tissues, they differentiate into mature forms while processing them. The processed peptide of about 9 amino acids is presented on the surface of mature dendritic cells when it binds to major histocompatibility antigen (MHC) class I molecules in the endoplasmic reticulum of dendritic cells.
  • MHC major histocompatibility antigen
  • mature dendritic cells presenting the antigen-derived peptide on their surface migrate to the lymph nodes and activate CD8-positive T cells, also called naive T cells, to form cytotoxic T cells (CTL). This CTL specifically recognizes and destroys cells expressing the antigen.
  • Cancer vaccines using dendritic cells utilize such characteristics of dendritic cells, and many of them activate dendritic cells using peptides derived from cancer antigens.
  • searching for a peptide that binds to an MHC class I molecule and activates CTL requires synthesis and screening of a large number of peptides, and is not easy.
  • repeated administration of a cancer vaccine may cause cancer cells to learn and not express a cancer antigen that is a target of the cancer vaccine. In such a case, it is very difficult to find an antigen-derived peptide that succeeds again.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for producing a cancer vaccine, which is reduced in work process and cost as compared with conventional methods, and has high safety.
  • the present inventors conducted extensive research on the expression of tumor antigen presentation ability by introducing nucleic acid of tumor tissue into dendritic cells. .
  • nucleic acid of tumor tissue instead of separating and purifying specific nucleic acids from nucleic acids extracted from cancer cells, if the extracted nucleic acids are introduced as they are into cells that have antigen-presenting ability, they will become proteins specific to cancer cells.
  • certain cancer antigens are preferentially expressed and processed and displayed on the cell surface in association with MHC class I molecules. And when such cells were administered as a cancer vaccine, it was confirmed that CTLs that stimulate CTLs and specifically destroy cancer cells were obtained, and the present invention was completed.
  • the present invention is [1] a method for producing a cancer vaccine, A method comprising a step of introducing a nucleic acid extracted from a cancer cell as it is into an antigen-presenting cell and expressing and presenting a plurality of types of cancer antigen peptides on the antigen-presenting cell. [2] The method according to [1], wherein the nucleic acid is total DNA and / or total RNA. [3] The method according to [1] or [2], further comprising a step of co-culturing the antigen-presenting cell into which the nucleic acid has been introduced and a naive T cell to obtain a cytotoxic T cell.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the cancer cell is an autologous cancer cell or an allogeneic cancer cell.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the cancer cell is derived from any of the following (a) to (d): (A) tumor tissue obtained by surgery or biopsy; (B) a tissue sample; (C) circulating tumor cells in the blood; (D) An established cell line.
  • the nucleic acid introduction step is performed by a method using a lipofection method or by electroporation.
  • the antigen-presenting cell is a dendritic cell
  • the antigen-presenting cell into which the nucleic acid has been introduced and / or the cytotoxic T according to any one of [1] to [6] A cancer vaccine containing cells as an active ingredient.
  • a method for treating cancer comprising a step of administering the cancer vaccine according to [8] or [9] to a human.
  • the method according to the present invention requires a long-term culture to identify cancer antigens expressed by cancer cells and cancer antigen peptides that bind to HLA class I molecules and / or obtain proliferative tumor cells.
  • cells presenting multiple types of cancer antigen peptides can be obtained. Therefore, according to the method of the present invention, cells capable of inducing CTLs that attack cancer cells can be efficiently produced in vitro, and cancer vaccines containing such cells or CTLs as active ingredients can be obtained.
  • the start of treatment for a malignant tumor by a patient-specific dendritic cell vaccine is greatly improved, and the work process is reduced as compared with the conventional method, and the safety is increased. Cost reduction can also be expected.
  • FIG. 1 shows the results of comparing the cytotoxic activity of dendritic cells into which tumor cell nucleic acids have been introduced by electroporation and dendritic cells fused with tumor cells.
  • One aspect of the method for producing a cancer vaccine according to the present invention is a method for producing a cancer vaccine, comprising a step of extracting a nucleic acid from a cancer cell and a cell having an antigen-presenting ability (hereinafter also referred to as “antigen-presenting cell”). And introducing the nucleic acid to express and present the cancer antigen peptide in an antigen-presenting cell.
  • cancer vaccine means a medicine used for the treatment or prevention of cancer using immunity against cancer antigens.
  • cancer antigen refers to a protein that is specifically expressed in cancer cells and not expressed in normal cells. As long as it is dominant and cancer immunotherapy targeting the protein is possible, it should be a cancer antigen.
  • cancer antigen peptide means a peptide consisting of a partial amino acid sequence of a cancer antigen protein.
  • prevention or treatment of cancer refers to inhibition of cancer development (delay or stop), reduction of tumor size (delay or stop), inhibition of tumor metastasis (delay or stop), inhibition of tumor growth (delay). Or cessation) and alleviation of one or more symptoms associated with cancer.
  • the subject of administration of the cancer vaccine according to the present invention can be mammals including humans, for example, humans, mice, rats, rabbits, cats, dogs, monkeys, sheep, horses, cows and the like. It is not limited to these.
  • the administration subject is typically a human.
  • cell having antigen-presenting ability or “antigen-presenting cell” means that when a nucleic acid extracted from a cancer cell is introduced, a cancer antigen peptide is expressed and can be presented on the cell surface. Means a cell.
  • the cell which has antigen presentation ability is not specifically limited, For example, a dendritic cell, a macrophage, a monocyte, a B cell, Preferably a dendritic cell is mentioned.
  • the “cell that presents a cancer antigen peptide” means a cell in which a complex of a cancer antigen peptide and an MHC class I molecule is presented on the surface in vitro.
  • cancer antigens present in cells are processed and fragmented into cancer antigen peptides.
  • Cancer antigenic peptides are presented on the cell surface upon binding to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules of antigen presenting cells.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Human MHC is called human leukocyte type antigen (HLA).
  • naive T cells that recognize a complex of MHC class I molecules and cancer antigen peptides are activated to become cytotoxic T cells (CTL). , It will destroy cells expressing the same cancer antigen.
  • CTL cytotoxic T cells
  • “naive T cells” are CD8 positive T cells that have no cytotoxic activity before being stimulated by a complex of an MHC class I molecule of an antigen presenting cell and an antigen peptide.
  • a step of extracting nucleic acid from cancer cells may be first performed before the step of introducing nucleic acid.
  • nucleic acids that have already been prepared may be obtained and introduced.
  • the cancer cell may be a cancer cell to which a cancer vaccine is administered, but may be a cell derived from another cancer type. Further, it may be a cancer cell obtained from an individual subject to administration of a cancer vaccine or a cancer cell obtained from another individual.
  • the autologous cancer cells of the individual are cancers that are presented on dendritic cells included in the cancer vaccine and recognized by CTL. Since there is a high possibility that the antigen is expressed, a cytotoxic effect by CTL is expected.
  • cancer cells used in the present invention include head and neck cancer, lung cancer, esophageal cancer, breast cancer, stomach cancer, liver cancer, kidney cancer, colon cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, uterine cancer, prostate cancer, Examples include, but are not limited to, bladder cancer, skin cancer, brain tumor, osteosarcoma, or thyroid cancer cells.
  • the cancer cell used in the present invention may be a living cell or a dead cell.
  • a cancer cell of a tissue obtained by surgery or needle biopsy (biopsy) Tissue samples can be used.
  • the tissue sample may be a sliced tissue section or a tissue block in which the tissue is embedded in an embedding agent such as paraffin. It is also possible to use a tissue sample that has been subjected to treatment such as staining or formalin fixation.
  • circulating tumor cells (CTC) in the blood may be used as cancer cells. Since CTC can be obtained from blood, the burden on the patient is small.
  • established cell lines can also be used as cancer cells. “Established cell line” means a cancer cell line that can be passaged in vitro.
  • nucleic acid may be DNA or RNA.
  • the nucleic acid to be extracted can be, for example, total DNA and / or total RNA.
  • total mRNA may be extracted, and total cDNA may be obtained therefrom and introduced into antigen-presenting cells.
  • Nucleic acid extraction can be appropriately performed by those skilled in the art according to a known method or a method analogous thereto.
  • a TNE buffer for example, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 25 mM EDTA
  • SDS is added, and the protein is purified with Proteinase K.
  • a method of adding and removing phenolase and the protein that could not be digested and Proteinase K is exemplified.
  • DNase-free RNase is added to degrade RNA, and Proteinase K is added to remove this RNase, whereby only DNA can be obtained.
  • RNA When RNA is extracted, the guanidine-acidic phenol method (Chomczynski, P. and Sacchi, N .: Anal. Biochm., 162: 156-159, 1987) can be used. Commercially available kits may be used for either DNA or RNA extraction. For example, total DNA and total RNA can be purified using DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) or RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the instruction manual.
  • Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit
  • Qiagen RNeasy Mini Kit
  • Dendritic cells as antigen-presenting cells may be immature dendritic cells or mature dendritic cells, and can be prepared by a known method. For example, mature dendritic cells can be separated from peripheral blood by specific gravity centrifugation.
  • the antigen-presenting cell used in the present invention may be obtained by inducing differentiation from a more undifferentiated cell.
  • dendritic cells can be derived from CD14 positive monocytes or CD34 positive cells derived from peripheral blood or bone marrow, skin Langerhans cells, and the like. Differentiation from these cells into dendritic cells can be performed according to a known method. For example, a method for inducing differentiation by adding GM-CSF, IL4, TNF- ⁇ , IFN, IL15, etc. to the medium is known. In particular, a method of inducing dendritic cells from peripheral blood monocytes by adding GM-CSF and IL4 is widely used.
  • dendritic cells can be proliferated according to a known method.
  • a method is known in which Flt3L, SCF, TPO, GM-CSF, G-CSF, IL3 and the like are appropriately added to a medium and cultured.
  • a method for introducing a nucleic acid into an antigen-presenting cell is not particularly limited, and a known method can be used. Examples thereof include a lipofection method, an electroporation method, and a phosphate-calcium method.
  • the lipofection method is a method of incorporating a liposome-DNA complex made from phospholipid or the like into a cell, and can be performed using a commercially available reagent such as Lipofectin (registered trademark) (Life Technologies). From the viewpoint of efficiently introducing nucleic acids, electroporation is preferred. It has been confirmed that the efficiency of nucleic acid introduction by electroporation is several tens of times higher than that of lipofection.
  • the dendritic cell After introducing the nucleic acid into the antigen-presenting cell, the dendritic cell is cultured for a desired period, for example, about 1 to 3 days to express the cancer antigen from the nucleic acid.
  • This step can be appropriately performed by those skilled in the art by a known method or a method analogous thereto.
  • cancer antigens when nucleic acid extracted from cancer cells is expressed in dendritic cells, cancer antigens are preferentially expressed, and the expressed cancer antigens are processed by dendritic cells.
  • the resulting cancer antigen peptide binds to the MHC class I molecule of the dendritic cell and is presented on the surface of the dendritic cell. Therefore, according to the method of the present invention, a cancer vaccine comparable to conventional cancer vaccines can be obtained without identifying cancer antigens and without requiring long-term culture to obtain proliferative tumor cells. It becomes possible to obtain.
  • the dendritic cell may be matured in order to enhance the CTL inducing ability.
  • Maturation of dendritic cells can be performed according to known methods. For example, microbial components (OK432, BCG-CWS, etc.) and synthetic compounds (CpG-DNA, polyIC derivatives, imidazololine, anti-CD40) are added to the medium. Can be performed by culturing.
  • Dendritic cells presenting the cancer antigen peptide obtained by the above method are administered to the subject by intradermal injection, intravenous injection, intratumoral injection, or intralymphatic injection. be able to.
  • the dose and the administration interval can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the age, sex, weight, severity, etc. of the administration subject. For example, 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 8 at 1 to 4 week intervals. Or 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 dendritic cells may be administered.
  • a microbial component (OK432, BCG-CWS, etc.) or a synthetic compound (CpG-DNA, polyIC derivative, imidazololine, anti-CD40) may be administered simultaneously as an adjuvant, and cytokines that mature and activate dendritic cells ( For example, TNF- ⁇ , IFN, IL1, IL12, IL15, IL18, PGE2, CD40L, etc.) may be administered simultaneously.
  • IL12 is preferable as the cytokine used in combination with the active ingredient.
  • the present invention also includes a cancer vaccine comprising, as an active ingredient, cells presenting a plurality of types of cancer antigen peptides obtained by the above-described method, preferably dendritic cells.
  • cancer vaccines include cells that present multiple types of cancer antigen peptides obtained by expressing nucleic acids derived from cancer cells, preferably dendritic cells, and therefore specifically attack cancer cells that express such cancer antigens. To induce CTL.
  • Another aspect of the method for producing a cancer vaccine according to the present invention is to obtain cells that present a plurality of types of cancer antigen peptides by the above-described method, and then co-culture these cells and naive T cells to obtain naive T Activating the cells into cytotoxic T cells.
  • the naive T cells become CTLs that specifically attack cancer cells that express the cancer antigen.
  • CTL destroys target cells by releasing perforin, granzyme, TNF, etc., or stimulating Fas of target cells to induce apoptosis.
  • the present invention also includes a cancer vaccine containing CTL obtained by such a method as an active ingredient.
  • the cancer vaccine may contain both cells that present multiple types of cancer antigen peptides and CTLs. It may also contain other substances that activate anti-tumor immunity.
  • the present invention also includes a method for preventing or treating cancer, which comprises administering the above-described cancer vaccine according to the present invention to a subject.
  • the method for preventing or treating cancer according to the present invention may be combined with other treatment methods (for example, administration of various anticancer agents, irradiation, surgical treatment).
  • MIaPaCa2 Human pancreatic cancer cell line obtained from ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures) was disrupted and dissolved with guanidine-HCL. Total DNA was extracted using DNeasy Blood and Tissue (QIAGEN) according to the instruction manual. More specifically, after cell lysis, ATL-buffer (manufactured by QIAGEN) was added (ATL was 1/10 volume of PBS as a guide) and mixed, and the mixture was reacted at 55 ° C. with occasional stirring for 20 minutes.
  • MIaPaCa2 Human pancreatic cancer cell line obtained from ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures) was disrupted and dissolved with guanidine-HCL. Total DNA was extracted using DNeasy Blood and Tissue (QIAGEN) according to the instruction manual. More specifically, after cell lysis, ATL-buffer (manufactured by QIAGEN) was added (ATL was 1/10 volume of PBS as a guide) and mixed,
  • Proteinase-K (manufactured by QIAGEN) was added to digest the protein bound to DNA, and the enzyme reaction was carried out for 60 minutes in a 55 ° C. heat block. It was confirmed that the protein was completely dissolved by proteinase-K digestion (change from cloudy color to transparent).
  • DNA was purified by removing the protein with phenol (manufactured by sigma). After adding an equivalent amount of phenol, the mixture was vigorously mixed by inversion, centrifuged at 5000 rpm for 2 minutes, and the upper layer was collected in a new tube. When the purification was insufficient, the proteinase-K treatment was performed again. The mixture was heated at 70 ° C. for 30 minutes, and an equivalent amount of phenol was added to the tube. After vigorous inversion, the mixture was centrifuged at 5000 rpm for 2 minutes, and the upper layer was collected in a new tube. After adding 100% ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) twice the amount of the collected sample, it was mixed vigorously.
  • phenol manufactured by sigma
  • the solution was allowed to stand at 20 ° C. to precipitate DNA. After centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, and the extracted and purified DNA was dissolved in TE-buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The DNA concentration was measured using a spectrophotometer (GENESYS 10S UV-Vis).
  • nucleic acid into antigen-presenting cells
  • the nucleic acid purified as described above was introduced into dendritic cells derived from peripheral blood mononuclear cells of healthy individuals.
  • Nucleic acid was introduced by electroporation using Neon Transfection System (Thermo Scientific. MPK5000) and Neon Transfection system 10ul kit (Thermo Scientific. MPK1025). The electroporation conditions were determined according to the instructions for use. The results are shown in the table below
  • dendritic cell culture medium 2% autologous plasma, in this case healthy human plasma used to induce dendritic cells, AIMV medium containing 10 ng / ml human recombinant GM-CSF
  • AIMV medium containing 10 ng / ml human recombinant GM-CSF
  • T cells were mixed at a ratio of 1:10.
  • the mixed cells were cultured for 10 days in 24-well plates (Thermo Scientific) containing 50 units / ml human recombinant IL2 (Milteny Biotec) and OpTmizer CTS T-Cell Expansion SFM medium (Gibco) containing 5% autologous plasma.
  • the antigen presenting ability of dendritic cells into which nucleic acid had been introduced was examined by determining the ratio of induced cytotoxic T cells based on cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity test was used by modifying the method of DS, Heo et al. (Cancer Reserch 1990, 50: 3681-3690).
  • Target cells tumor cells
  • RPMI 1640 medium Gibco
  • the cells were seeded at 100 ⁇ l / well in a 96-well plate and cultured for 24 hours until the cells adhered.
  • the effector cell was collected and washed.
  • the number of Effector cells was adjusted so that the ratios of Target cells: Effecter cells were 1:10, 1: 5, and 1: 2.5, and 100 ⁇ l / well was added to the wells containing Target cells, and cultured for 48 hours.
  • Target cells were measured using an MTT (3- (4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay.
  • MTT 4- (4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide
  • Fusion cells of human pancreatic cancer cell line (MIaPaCa2) and dendritic cells derived from healthy human peripheral blood mononuclear cells dendritic cells derived from the same Lot. Using. Fusion cells were prepared according to the method described in WO2002 / 032378.
  • Fusion cells were prepared by the following method. First, in order to suppress the growth of human pancreatic cancer cell line (MIaPaCa2), mitomycin C treatment was performed. Mitamycin C (sigma) was added to the medium at a concentration of 100 ⁇ g / ml for MIaPaCa2 cells cultured in RPMI1640 medium (Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (Sigma). After the addition, the cells were cultured for 2 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After completion of the culture, the cells were washed 3 times with PBS (Gibco) to remove mitomycin C. After washing, the tumor cells were detached using 0.05% trypsin solution (Gibco), resuspended in the above medium, and the number of cells was calculated.
  • Mitamycin C sigma
  • the number of tumor cells was adjusted to be one third of the number of dendritic cells. Dendritic cells and tumor cells were mixed and washed once with PBS. After completely removing the supernatant, polyethyren glycol (PEG, Sigma) was added to 500 ⁇ l cells to start the fusion reaction. One minute after adding polyethyren glycol, RPMI1640 medium gradually heated to 37 ° C. was added, and after 15 minutes, RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum was added to stop the reaction. After centrifuging the medium containing the cells, the cells were returned to the dendritic cell medium and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • PEG polyethyren glycol
  • AIMV medium As a medium for dendritic cells, AIMV medium (Gibco) supplemented with 2% autologous plasma and 10 ng / ml human recombinant GM-CSF (Milteny Biotec) was used. Using the thus obtained Fusion cells, cytotoxic T lymphocytes were induced in the same manner as dendritic cells into which the above-described nucleic acid had been introduced, and the T lymphocytes were subjected to a cytotoxic activity test.
  • % Lysis 100-(Average of OD value of well added with effecter cell / Average of OD value of well of target cell only) X100

Abstract

　本発明は、癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法であって、癌細胞から核酸を抽出する工程と、抗原提示能を有する細胞に前記核酸を導入して、癌抗原ペプチドを該細胞に発現及び提示させる工程と、含む方法を提供する。

Description

癌ワクチンの製造方法、及び癌ワクチン
　本発明は、癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法等に関する。
　近年、生体に本来備わる免疫を増強して癌を排除しようとする種々の癌免疫療法が開発されており、中でも、樹状細胞を用いる方法が活発に検討されている。
　樹状細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞の一つであり、未成熟型と成熟型とが存在する。未成熟樹状細胞は抗原の貪食能が高く、抹消組織で抗原を取り込むと、これをプロセシングしながら成熟型に分化する。そして、プロセシングされたアミノ酸９個前後のペプチドは、樹状細胞の小胞体で主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合すると、成熟樹状細胞の表面に提示される。こうして抗原由来ペプチドを表面に提示した成熟樹状細胞はリンパ節に移動し、ナイーブＴ細胞とも呼ばれるＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）にする。このＣＴＬは、当該抗原を発現する細胞を特異的に認識して破壊する。
　樹状細胞を利用した癌ワクチンは、このような樹状細胞の特徴を利用するものであり、その多くにおいて、癌抗原に由来するペプチドを用いて樹状細胞を活性化する。しかしながら、ＭＨＣクラスＩ分子と結合してＣＴＬを活性化させるペプチドの探索は、多数のペプチドを合成してスクリーニングを行う必要があり、容易ではない。また、癌ワクチンを繰り返し投与すると、癌細胞が学習し、癌ワクチンの標的となる癌抗原を発現しなくなることもある。このような場合、再度奏功する抗原由来ペプチドを見出すのは非常に難しい。
　また、現在の腫瘍細胞を用いた抗原提示細胞作製には、増殖可能な腫瘍細胞を得るために長期間（数ヶ月から１年）にわたる培養を必要とするスケースが存在する。そのため患者の治療開始までに時間がかかり、早期の治療を必要とする患者への対応に問題があった。
　本発明は、従来方法と比較して作業工程や費用が節減され、且つ安全性が高い新規な癌ワクチンの製造方法等を提供することを課題とする。
　本発明者らは、患者特有の腫瘍抗原の多様性を保存した形での新たな腫瘍抗原提示方法として、樹状細胞への腫瘍組織の核酸導入による腫瘍抗原提示能発現について鋭意研究を重ねた。その結果、癌細胞から抽出した核酸から特定の核酸を分離精製して使用するのではなく、抽出した核酸をそのまま抗原提示能を有する細胞に導入すると、該細胞内で癌細胞特異的なタンパク質である癌抗原が優先的に発現し、これがプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ分子と結合して細胞表面に提示されることを見出した。そして、かかる細胞を癌ワクチンとして投与すると、ＣＴＬを刺激して、癌細胞を特異的に破壊するＣＴＬが得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は
［１］癌ワクチンの製造方法であって、
　癌細胞から抽出した核酸をそのまま抗原提示細胞に導入して、複数種類の癌抗原ペプチドを該抗原提示細胞に発現及び提示させる工程を含む方法。
［２］前記核酸はトータルDNA及び／又はトータルRNAである、［１］に記載の方法。
［３］前記核酸が導入された抗原提示細胞とナイーブＴ細胞とを共培養して細胞傷害性Ｔ細胞を得る工程をさらに含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記癌細胞は自家癌細胞又は他家癌細胞である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記癌細胞は、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに由来する、［１］から［４］のいずれか１項に記載の方法：
　（ａ）手術又は生検で得られた腫瘍組織；
　（ｂ）組織サンプル；
　（ｃ）血中循環腫瘍細胞；
　（ｄ）樹立細胞系。
［６］前記核酸の導入工程は、リポフェクション法を使用する方法又はエレクトロポレーションにより行う、［１］から［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記抗原提示細胞は、樹状細胞である、［１］から［６］のいずれか１項に記載の
［８］前記核酸が導入された抗原提示細胞及び／又は前記細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含む癌ワクチン。
［９］［１］から［７］のいずれか１項に記載の製造方法で製造された癌ワクチン。
［１０］［８］又は［９］に記載の癌ワクチンをヒトに投与する工程を含む癌の治療方法。
　本発明に係る方法では、癌細胞が発現する癌抗原やＨＬＡクラスＩ分子に結合する癌抗原ペプチドを同定し、そして／あるいは増殖可能な腫瘍細胞を得るための長期間の培養を必要とすることなく、複数種類の癌抗原ペプチドを提示した細胞を得ることができる。したがって、本発明に係る方法によれば、癌細胞を攻撃するＣＴＬを誘導できる細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで効率よく産生することができ、かかる細胞やＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンを得ることができる。特に、本発明の方法によれば、患者特異的樹状細胞ワクチンによる悪性腫瘍に対する治療開始が、大幅に改善すると考えられ、従来方法と比較して作業工程の節減となり、より安全性をたかめると共に費用の削減も期待できる。
図１は、エレクトロポレーションで腫瘍細胞の核酸が導入された樹状細胞と、腫瘍細胞と融合された樹状細胞の細胞障害活性を比較した結果を示す。
　本発明に係る癌ワクチンの製造方法の一態様は、癌ワクチンの製造方法であって、癌細胞から核酸を抽出する工程と、抗原提示能を有する細胞（以下「抗原提示細胞」ともいう。）に前記核酸を導入して、癌抗原ペプチドを抗原提示細胞に発現及び提示させる工程と、を含む。
　本明細書において「癌ワクチン」は、癌抗原に対する免疫を利用して癌の治療又は予防に用いられる医薬を意味する。本明細書において「癌抗原」は、癌細胞に特異的に発現し、正常細胞には発現しないタンパク質をいうが、正常細胞に多少の発現が見られるタンパク質であっても、癌細胞における発現が優勢で、当該タンパク質を標的とした癌免疫療法が可能である限り癌抗原に当たるものとする。本明細書において「癌抗原ペプチド」は、癌抗原タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。
　本明細書において癌の予防又は治療とは、癌の発生の阻害（遅延又は停止）、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせることをいう。
　本発明に係る癌ワクチンの投与対象は、ヒトを含む哺乳動物とすることができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ等とすることができるがこれらに限定されない。投与対象は典型的にはヒトである。
　本明細書において、「抗原提示能を有する細胞」又は「抗原提示細胞」とは、癌細胞から抽出された核酸を導入すると、癌抗原ペプチドを発現させ、これを細胞表面に提示させることができる細胞を意味する。抗原提示能を有する細胞は特に限定されないが、それらの例として、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、好ましくは樹状細胞が挙げられる。
　本明細書において「癌抗原ペプチドを提示する細胞」は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体を表面に提示させた細胞を意味する。上述のとおり、細胞内に存在する癌抗原は、プロセシングを受けて断片化され、癌抗原ペプチドとなる。癌抗原ペプチドは抗原提示細胞の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合すると細胞表面に提示される。ヒトのＭＨＣはヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。
　また、癌抗原ペプチドを提示する細胞を含む癌ワクチンを対象に投与すると、ＭＨＣクラスＩ分子と癌抗原ペプチドの複合体を認識したナイーブＴ細胞が活性化されて細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）となり、同じ癌抗原を発現している細胞を破壊するようになる。
　本明細書において「ナイーブＴ細胞」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞であって、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子と抗原ペプチドとの複合体による刺激を受ける前の、細胞傷害活性を有しないＴ細胞をいう。
　本発明に係る癌ワクチンの製造方法の一態様では、核酸の導入工程の前に、まず、癌細胞から核酸を抽出する工程を行ってもよい。あるいは、核酸は既に調製済みのものを入手して導入してもよい。癌細胞は、癌ワクチンを投与する対象となる癌細胞としてもよいが、別の癌種に由来する細胞であってもよい。また、癌ワクチンの投与対象個体から得た癌細胞であっても、別の個体から得た癌細胞であってもよい。例えば、投与対象個体から得た自家癌細胞又は他家癌細胞を用いることも好ましく、その場合、当該個体の自家癌細胞は、癌ワクチンに含まれる樹状細胞に提示され且つＣＴＬが認識する癌抗原を発現している可能性が高いので、ＣＴＬによる細胞傷害効果が期待される。
　本発明に用いられる癌細胞の具体例としては、頭頸部癌、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、大腸癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、骨肉腫、又は甲状腺癌の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明に用いられる癌細胞は、核酸を抽出できる限り、生きた細胞であっても死んだ細胞であってもよく、例えば、手術や針生検（バイオプシー）で得られた組織の癌細胞や、組織サンプルを用いることができる。組織サンプルは、切片状の組織切片であってもよく、組織をパラフィン等の包埋剤に埋めた組織ブロックであってもよい。染色や、ホルマリン固定などの処理をされた組織サンプルを用いることもできる。
　また、癌細胞として、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を用いてもよい。ＣＴＣは、血液から得ることができるので、患者の負担が小さい。あるいは、癌細胞として、樹立細胞系を使用することもできる。「樹立細胞系」とは、in vitro培養で継代可能ながん細胞系を意味する。
　本明細書において「核酸」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。抽出する核酸は、例えば、トータルＤＮＡ及び／又はトータルＲＮＡとすることができる。例えば、トータルｍＲＮＡを抽出し、これからトータルｃＤＮＡを得て、抗原提示細胞に導入してもよい。
　核酸の抽出は、公知の方法又はそれに準ずる方法にしたがって当業者が適宜行うことができる。
　例えばＤＮＡの場合、細かく刻んだ臓器・組織や培養細胞をＴＮＥ緩衝液（例えば、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ）で懸濁し、ＳＤＳを加え、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫでタンパク質を分解した後、フェノールを加えて消化しきれなかったタンパク質とＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを変性させて除く方法が挙げられる。さらにＤＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ＲＮａｓｅを加えてＲＮＡを分解し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えてこのＲＮａｓｅを除くことにより、ＤＮＡのみを得ることができる。
　ＲＮＡを抽出する場合、グアニジン・酸性フェノール法（Chomczynski, P. and Sacchi, N.:Anal. Biochm., 162:156-159,1987）を用いることができる。
　ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれの抽出においても、市販のキットを用いてもよい。例えば、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）や、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用い、使用説明書に従って、それぞれトータルＤＮＡ及びトータルＲＮＡを精製することが可能である。
　本発明に係る癌ワクチンの製造方法の一態様では、次に、癌細胞から抽出した核酸を分離・精製することなくそのまま樹状細胞に導入して癌抗原ペプチドを抗原提示細胞に提示させる工程を行う。
　抗原提示細胞としての樹状細胞は、未成熟樹状細胞であっても成熟樹状細胞であってもよく、公知の方法で調製することができる。例えば、成熟樹状細胞は、末梢血から比重遠心法により分離することができる。
　また、本発明に用いる抗原提示細胞は、より未分化な細胞から分化誘導して得てもよい。例えば、樹状細胞の場合、末梢血や骨髄に由来するＣＤ１４陽性単球又はＣＤ３４陽性細胞、皮膚ランゲルハンス細胞などから誘導することができる。これらの細胞から樹状細胞への分化は公知の方法に従って行うことができ、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ４、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ、ＩＬ１５等を培地に加えて分化誘導する方法が知られており、中でもＧＭ－ＣＳＦとＩＬ４を加えて末梢血単球から樹状細胞を誘導する方法が広く用いられている。また、樹状細胞は公知の方法にしたがって増殖させることができ、例えば、Ｆｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ３等を適宜培地に加えて培養する方法が知られている。
　核酸を抗原提示細胞に導入する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができるが、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸－カルシウム法が挙げられる。リポフェクション法は、リン脂質などから作られたリポソームとＤＮＡの複合体を細胞に取り込ませる方法であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）など市販の試薬を用いて行うことができる。核酸を効率よく導入する観点から、エレクトロポレーション法が好ましい。エレクトロポレーション法による核酸導入の効率はリポフェクション法との比較で数十倍以上高いことが確認されている。
　抗原提示細胞に核酸を導入させた後、樹状細胞を所望の期間、例えば１～３日程度培養して核酸から癌抗原を発現させる。この工程は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって当業者が適宜行うことができる。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、癌細胞から抽出した核酸を樹状細胞で発現させると、癌抗原が優先的に発現し、発現された癌抗原が樹状細胞によるプロセシングを受け、その結果生じた癌抗原ペプチドが樹状細胞のＭＨＣクラスＩ分子と結合して、樹状細胞表面に提示される。
　したがって、本発明の方法によれば、癌抗原を同定することなく、また、増殖可能な腫瘍細胞を得るための長期間の培養を必要とすることなく、従来の癌ワクチンに匹敵する癌ワクチンを得ることが可能になる。
　核酸を導入する工程から、樹状細胞表面に癌抗原ペプチドが提示される工程の全部又は一部において、ＣＴＬ誘導能を高めるために樹状細胞の成熟化を行ってもよい。樹状細胞の成熟化は、公知の方法にしたがって行うことができ、例えば、微生物成分（ＯＫ４３２、ＢＣＧ－ＣＷＳ等）や合成化合物（ＣｐＧ－ＤＮＡ、ｐｏｌｙＩＣ誘導体、Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、抗ＣＤ４０）を培地に加えて培養することによって行うことができる。
　また、樹状細胞の培地にサイトカインを加えて成熟化させる方法も知られており、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１５、ＰＧＥ２、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ等を培地に加える方法が挙げられる。
　上述の方法で得られた癌抗原ペプチドを表面に提示した樹状細胞は、皮内への注射投与、静脈注射、腫瘍内への注射投与、リンパ節内への注射投与により、対象に投与することができる。投与量や投与間隔は、投与対象の年齢、性別、体重、重篤度等によって当業者が適宜決定することができるが、例えば、１～４週間間隔で、１×１０６～１×１０８個、又は１×１０４～１×１０６個の樹状細胞を投与してもよい。この際、微生物成分（ＯＫ４３２、ＢＣＧ－ＣＷＳ等）や合成化合物（ＣｐＧ－ＤＮＡ、ｐｏｌｙＩＣ誘導体、Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、抗ＣＤ４０）をアジュバントとして同時に投与してもよく、樹状細胞を成熟・活性化させるサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ、ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＰＧＥ２、ＣＤ４０Ｌ等）を同時に投与してもよい。有効成分と併用されるサイトカインはＩＬ１２が好ましい。
　本発明は、上述の方法で得られた複数種類の癌抗原ペプチドを提示する細胞、好ましくは樹状細胞を有効成分として含む癌ワクチンも包含する。かかる癌ワクチンは、癌細胞由来の核酸を発現させることによって得た複数種類の癌抗原ペプチドを提示する細胞、好ましくは樹状細胞を含むので、かかる癌抗原を発現する癌細胞を特異的に攻撃するＣＴＬを誘導する。
　本発明に係る癌ワクチンの製造方法の別の一態様は、上述の方法で複数種類の癌抗原ペプチドを提示する細胞を得た後、この細胞とナイーブＴ細胞を共培養することで、ナイーブＴ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞へと活性化する工程を含む。
　このように、ナイーブＴ細胞と、複数種類の癌抗原ペプチドを提示する細胞とを共培養することにより、ナイーブＴ細胞は、その癌抗原を発現する癌細胞を特異的に攻撃するＣＴＬとなる。ＣＴＬは、パーフォリン、グランザイム、ＴＮＦ等を放出したり、標的細胞のＦａｓを刺激してアポトーシスを誘導するなどして、標的細胞を破壊する。
　本発明は、かかる方法で得られたＣＴＬを有効成分として含むがんワクチンも包含する。がんワクチンには、複数種類の癌抗原ペプチドを提示する細胞とＣＴＬの双方が含まれていてもよい。また、抗腫瘍免疫を活性化する他の物質を含んでいてもよい。
　本発明は、上述した本発明に係る癌ワクチンを対象に投与することを含む癌の予防又は治療方法も包含する。本発明に係る癌の予防又は治療方法は、他の治療方法（例えば、各種の抗がん剤の投与、放射線照射、外科的治療）と組合せてもよい。
　本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
１．腫瘍細胞からのDNA 抽出・精製
　ECACC(European Collection of Authenticated Cell Cultures) より入手したヒト膵臓癌セルライン (MIaPaCa2)をグアニジン－HCLで破壊、溶解した。DNeasy Blood and Tissue(QIAGEN社製)を用い使用説明書に従って、トータルDNAを抽出した。より具体的には、細胞溶解後ATL-buffer(QIAGEN社製)を加えた後（ATLは、PBS の1/10量が目安）混和し、55℃で時々撹拌しながら２０分間反応させた。DNAに結合しているタンパク質を消化するため、Proteinase-K（QIAGEN社製）を加え、55℃ヒートブロックにて６０分間酵素反応した。Proteinase-K消化でタンパク質が、完全に溶解した事を（白濁色から透明に変化）確認した。
　続いて、フェノール（sigma社製）によりタンパク質を除いてDNAを精製した。当量のフェノールを添加した後、激しく転倒混和し、5000r.p.m.で２分遠心後、新しいチューブに上層部を回収した。精製が不十分な場合再度Proteinase-K処理を行った。７０℃３０分加温し、チューブに当量のフェノールを添加した。激しく転倒混和後、5000r.p.m.で２分遠心し新しいチューブに上層部を回収した。回収したサンプルの２倍量の１００％エタノール（和光純薬社製）を加えた後、激しく混和した。?２０℃で静置し、DNAを析出させた。４℃で14000r.p.m. 5分遠心後上清を除去し、TE-buffer（和光純薬社製）にて抽出精製DNAを溶解した。分光光度計（GENESYS 10S UV-Vis）を用いてDNA濃度を測定した。
 
２．抗原提示細胞への核酸の導入
　上記で精製した核酸を、健常人の末梢血単核球より誘導した樹状細胞に導入した。核酸の導入は、Neon Transfection System (Thermo Scientific. MPK5000)及びNeon Transfection system 10ul kit (Thermo Scientific. MPK1025)を用いたエレクトロポレーション法で行った。使用説明書に従って、エレクトロポレーションの条件を決定した。
結果を下表に示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　R-bufferを用いて1300Vで行うと16～18％の導入効率を示す結果が得られた。さらに、R-bufferを用いて、パルスの電圧と時間を変動させた結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　R-bufferを用いて、1300V, 30msのパルス１回で、ヒト樹状細胞に平均14%の導入率が得られることを確認した。
４．CTLの活性化
　エレクトロポレーション終了後、樹状細胞用培地（２％自己血漿、この場合は樹状細胞の誘導に用いた健常人の血漿、10ng/mlヒトリコンビナントGM-CSF 含有AIMV培地）で４８時間培養した。続いて、核酸を導入した培養後の樹状細胞とT細胞とを1 : 10の割合で混合した。混合した細胞は、ヒト リコンビナントIL2(Milteny Biotec) 50 ユニット/ml及び自己血漿５％含有OpTmizer CTS T-Cell Expansion SFM培地(Gibco)を含む２４ウェル・プレート(Thermo Scientific)中で10日間培養した。誘導された細胞障害性T細胞の割合を細胞障害活性で求めることにより、核酸を導入した樹状細胞の抗原提示能を調べた。
　細胞障害活性試験は、 DS, Heo等（Cancer Reserch 1990,50:3681-3690）の方法を改変して用いた。Target cell（腫瘍細胞）を１０％牛胎児血清(Sigma)含有RPMI1640培地（Gibco）で1x105 cell/mlに調整する。96well plateに100μl/wellで播種し、細胞が接着するまで24時間培養した。
　Target cell の接着状態を確認後、Effecter cell を回収、洗浄した。Target cell : Effecter cell の比が1:10, 1:5, 1:2.5になる様にEffecter cellの数を調整し、Target cellの入ったwellに100μl/well加え、48時間培養した。
　培養後、浮遊細胞をピペットで除去し、残存Target cell をMTT（3-（4, 5-ジメチル-チアゾール-2-イル）-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイを用いて計測した。コントロールとして、ヒト膵臓癌セルライン (MIaPaCa2)と健常人末梢血単核球より誘導した樹状細胞(核酸導入に用いた樹状細胞と同時に誘導した同一Lot.の樹状細胞)のFusion細胞を用いた。Fusion細胞はWO2002/032378に記載の方法に従い調製した。
　より具体的には、以下の方法によりFusion細胞を調製した。まず、ヒト膵臓癌セルライン (MIaPaCa2)の増殖を抑えるため、マイトマイシンC処理を行った。10%牛胎児血清(Sigma) 添加RPMI1640培地(Gibco)中で培養しているMIaPaCa2細胞に対し、マイトマイシンC(sigma)を100μg/mlになる様に、培地に添加した。添加後、37℃・5％CO2インキュベーターで２時間培養した。培養終了後、マイトマイシンC除去のためPBS(Gibco)で３回洗浄した。洗浄後0.05% トリプシン溶液(Gibco)を用いて腫瘍細胞を剥離し、上記培地に再浮遊させ、細胞数を算出した。
　樹状細胞数の３分の１の量となるよう腫瘍細胞の数を調整した。樹状細胞と腫瘍細胞を混合しPBSで１回洗浄した。上清を完全に除去後、Polyethyren glycol(PEG, Sigma)を500μl細胞に加えることで融合反応を開始した。Polyethyren glycolを添加してから１分後より徐々に37℃に加温したRPMI1640培地を添加し、１５分経過後に10% 牛胎児血清含有RPMI1640培地を加えて反応を停止させた。細胞を含む培地を遠心した後、細胞を樹状細胞用培地に戻し、37℃・5％CO2インキュベーターで培養した。樹状細胞用培地は、自己血漿２％及び10ng/ml ヒトリコンビナントGM-CSF(Milteny Biotec)添加AIMV培地(Gibco)を使用した。このようにして得られたFusion細胞を用いて、上記の核酸を導入した樹状細胞と同様に、細胞障害性Tリンパ球を誘導し、そのTリンパ球を細胞障害活性試験にかけた。
　以下の計算式を用いて細胞障害率を算出した。
％ Lysis =100 - (Effecter cell 添加well のOD値の平均/ Target cell のみのwellのOD値の平均）X100
　その結果、核酸導入した樹状細胞を用いたCTLは、抗原を負荷していない樹状細胞に比較して、細胞障害活性が7.0～12.7%高く、また、Fusion細胞で誘導したCTLの細胞障害活性に匹敵する事が判明した。結果を図１に示す。

Claims (10)

  1. 　癌ワクチンの製造方法であって、
    　癌細胞から抽出した核酸をそのまま抗原提示細胞に導入して、複数種類の癌抗原ペプチドを該抗原提示細胞に発現及び提示させる工程を含む方法。
  2. 　前記核酸はトータルDNA及び／又はトータルRNAである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記核酸が導入された抗原提示細胞とナイーブＴ細胞とを共培養して細胞傷害性Ｔ細胞を得る工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記癌細胞は自家癌細胞又は他家癌細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記癌細胞は、以下の（ａ）～（d）のいずれかに由来する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法：
    　（ａ）手術又は生検で得られた腫瘍組織；
    　（ｂ）組織サンプル；
    　（ｃ）血中循環腫瘍細胞；及び
    　（ｄ）樹立細胞系。
  6. 　前記核酸の導入工程は、リポフェクション法を使用する方法又はエレクトロポレーションにより行う、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記抗原提示細胞は、樹状細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記核酸が導入された抗原提示細胞及び／又は前記細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含む癌ワクチン。
  9. 　請求項１から７のいずれか１項に記載の製造方法で製造された癌ワクチン。
  10. 　請求項８又は９に記載の癌ワクチンをヒトに投与する工程を含む癌の治療方法。
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